WO2009034204A1 - Método de conservación de péptidos o proteínas - Google Patents

Método de conservación de péptidos o proteínas Download PDF

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WO2009034204A1
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peptides
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protein
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Angel Cebolla Ramirez
Moisés ALVAREZ MAQUEDA
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/04—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre

Definitions

  • the sector of the technique in which the present invention is framed is biotechnology, and its scope is the conservation and transport of peptides or proteins of sanitary, diagnostic, pharmaceutical, agronomic or industrial interest. He is also of interest in the field of life science research.
  • Peptides or proteins are generally unstable when stored at room temperature (about 25 0 C) in liquid media or aqueous solutions, and in a few hours begin to degradation phenomena, denaturation and / or growth of microbial contaminants (Jaenicke, appear R. , (2000). J Biotechnol, 79, 193-203; Meyer, JD, et al (2002). Pharm Biotechnol, 13, 85-107).
  • various methods of conservation of peptides and proteins are used, the most common ones can be summarized in: (i) refrigerated temperature preservation; (ii) addition of stabilizing agents; and, (iii) dehydration or lyophilization.
  • Peptides or proteins traditionally have been preserved in aqueous solution at refrigerated temperature, either liquid form at 4 0 C or frozen at -20 so 0 C. Thus the rate of degradation reactions is reduced. However, repeated freeze-thaw processes cause alterations in the structure and / or activity of peptides and proteins (Tang, XC, et al (2005). Pharm Res, 22, 1167-1175). Likewise, peptides and proteins preserved in this way do not prevent the occurrence of degradation, denaturation and / or microbial contamination phenomena.
  • Stabilizing agents are inert substances that modify the physicochemical characteristics of aqueous solutions used to preserve peptides or proteins, thus reducing the risk of degradation.
  • examples of such agents are: glycerol, sugars (glucose, galactose, sucrose, trehalose), polyethylene glycols, amino acids (methionine, histidine), detergents (Triton X-100, Tween-20), and other proteins (albumin) (Arakawa , T., (1991). Pharm Res, 8, 285-291; Crowe, JH, et al (1987). Biochem J, 242, 1-10; Levine, RL (1983). JBiol Chem, 258, 11828-11833).
  • Glycerol is a traditional stabilizing agent that reduces the freezing point of the aqueous solution with the peptides or proteins, allowing them to be kept in a liquid state without freezing at a low temperature (-2O 0 C) (Scharnagl, C, et al (2005). Biochim Biophys Acta, 1749, 187-213). Stabilizing agents are often used in conjunction with other methods of preservation of peptides or proteins (Carpenter, JF et al (1987). Biochim Biophys Acta, 923, 109-115).
  • stabilizing agents can often interfere with the activity or subsequent application of the peptide or protein of interest, and must be eliminated using dialysis systems or other more aggressive procedures (saline or acid precipitation) that alter said peptide or protein (Prive, GG (2007) Methods, 41, 388-397).
  • Lyophilization is a dehydration process in which water molecules are removed from a frozen sample inside a vacuum system. This method of preservation requires that the peptide or protein, dissolved in an aqueous medium or solution, be preferably frozen quickly. A procedure used to quickly freeze the solution with the peptide or protein consists in its immersion in liquid nitrogen. A vacuum system is then applied to the frozen sample, which causes the sublimation or vaporization of the frozen phase at temperatures below zero (primary dehydration). Residual moisture can be subsequently removed allowing gradual temperature rise (secondary dehydration). The result of the lyophilization process is a dry and crystalline powder or substance that contains the peptide or protein to be preserved (Randolph, TW, (1997).
  • Affinity tags have become a common system of purifying proteins and native protein complexes for obvious reasons: they allow purifying or enriching said peptides or proteins hundreds of thousands of times from raw extracts in a single step, without the need of previously removing nucleic acids or other cellular materials; and, above all, they allow the use of general purification protocols with a great diversity of proteins, in contrast to the design and development of specific protocols for each peptide material that conventional chromatography needs (Waugh, DS, (2005). Trenas Biotechnol, 23, 316-320; Esposito, D. et al (2006). Curr Opin Biotechnol, 17, 353-358).
  • affinity tags have made it easier for researchers to produce a multitude of recombinant proteins of interest in research and diagnosis, being the procedure typically used in high performance projects (Braun, P., et al . (2002) PNAS; 99, 2654-2659). .
  • any delay in transport time causes the material to reach its destination at room temperature, motivating its return or checking the integrity of the material sent by the receiver. Therefore, new methods are needed to solve the problem of conservation and transport of peptides or proteins at room temperature.
  • the present invention describes a simple, economical and versatile method aimed at solving this problem, as well as the tools necessary to carry it out.
  • the object of the invention relates to a method for preserving labeled peptides or proteins for several days, and even months, which avoids the use of refrigeration, and its application in the storage and transport of peptides or proteins of interest to the health sectors, diagnostic, pharmaceutical, agronomic or industrial.
  • the present invention describes a more convenient and safe alternative method than existing ones, such as preservation and / or transport of peptides or proteins in aqueous solution at refrigerated temperature or lyophilization. (Tang, XC, et al (2005). Pharm Res, 22, 1167-1175; Webb, SD, et al (2003). J Pharm Sci, 92, 715-729).
  • the object of the invention comprises the use of solid or semi-solid matrices derivatized with compounds having affinity for specific sequences or tags (tags) present in the peptides or proteins to be preserved.
  • the method of preserving peptides or proteins object of the invention includes the following steps:
  • the present invention specifically describes the use of solid or semi-solid matrices composed of any porous, fibrous or reticular material that allows the passage of liquids, preferably any of the following materials or their derivatives: celluloses, agarose, polyacrylates, polymethacrylates, polyvinyl, Chitosans, polystyrenes and any natural or derivatizable synthesis polymer with porous or fibrous structure.
  • any polymer characterized by having a high surface / volume ratio and which are usually used as solid or semi-solid purification carriers in affinity chromatography for peptide or protein purification can be used.
  • said matrices would be derivatized with compounds that have affinity for specific sequences or tags (tags) present in the peptides or proteins to be conserved. Specifically, matrix binding occurs through an area of the peptide or protein that would not affect its activity or functionality, since the tags or tags usually merge to the amino or carboxyl end of the peptide or protein, maintaining a distance with Enough active sites so that both domains or regions do not interact.
  • tags sequences or tags
  • derivatized matrices with any of the following compounds would be used: iminodiacetic acid (IDA) or nitrilotriacetic acid (NTA) bonded to dicationic metals such as nickel (Ni), cobalt (Co) or copper (Cu); tertiary or quaternary amines such as diethylaminoethanol (DEAE) or trimethylammonium (QAE); glutathione; annulled; avidin or streptavidin; calmodulin; protein A; G protein; or any other compound that allows purification by affinity chromatography of peptides or proteins known to those skilled in the art.
  • IDA iminodiacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • dicationic metals such as nickel (Ni), cobalt (Co) or copper (Cu)
  • tertiary or quaternary amines such as diethylaminoethanol (DEAE) or trimethylammonium (QAE)
  • glutathione annulled
  • the tags or tags that allow affinity binding to the functional groups present in the matrices may preferably be histidine tails (Histag), choline binding domains (Lytag), glutathione S-transferase (GST-tag), maltose binding protein (MBP-tag), biotin or Streptag, calmodulin binding domain (CBD-tag) or calmodulin binding protein (CBP-tag) or calmodulin regulated proteins, total or partial sequences of immunoglobulin heavy chains, or any other type of label that allows the affinity chromatography purification of peptides or proteins known to those skilled in the art.
  • Histag histidine tails
  • Lytag choline binding domains
  • GST-tag glutathione S-transferase
  • MBP-tag maltose binding protein
  • CBD-tag calmodulin binding domain
  • CBP-tag calmodulin binding protein
  • calmodulin regulated proteins total or partial sequences of immunoglobulin heavy chains, or any
  • the peptides or proteins conserved in the matrices can be recovered to aqueous solution by passing through the matrix of a solution with specific compounds that interrupt the affinity binding between the tag (tag) of the peptide or protein and the functional groups of said solid or semi-solid derivatized matrix.
  • specific compounds that interrupt the affinity binding between the tag (tag) of the peptide or protein and the functional groups of said solid or semi-solid derivatized matrix Preferably, one of the following compounds would be used: imidazole; hill; glutathione; maltose; biotin; calcium chelating agents; acid solutions; or any other compound that allows elution of affinity bound peptides or proteins to chromatographic supports known to those skilled in the art.
  • derivatized solid or semi-solid matrices allows to directly preserve labeled peptides or proteins that have been previously purified, or are contained in cell extracts that express them or any other soluble, unpurified format.
  • the described method has the advantage that it can be performed in a short period of time and does not require expensive or bulky instruments. 4.
  • the described method avoids the processes of freezing-thawing, which can cause alterations in the structure and / or activity of the peptides and proteins to be conserved, as well as the physical-chemical changes and the hygroscopicity phenomena that appeared during the lyophilization processes 5.
  • the described method can also avoid the use of stabilizing agents, which may interfere with the subsequent application of the peptide or protein.
  • kits or devices that allow the method to conserve labeled peptides or proteins, characterized in that they include:
  • a support to contain the matrix and pass through it the different fluids or solutions used, with the appropriate dimensions and tightness so that the matrix fits and all the flow necessarily passes through its derivatized surface.
  • tubes or syringes attachable to the support to introduce the fluid or solution containing the tagged peptide or protein, the wash solution of the matrix, and the recovery solution with specific components that disrupt affinity binding between the tag (tag ) of the peptide or protein and the functional groups of the solid or semi-solid derivatized matrix.
  • a device that allows to exert the necessary pressure so that the different fluids or solutions used pass through the matrix which can be, for example: an embolus coupled to the syringe (Figure la); an outlet of the support attachable to a vacuum system ( Figure Ib); a tube attachable to the support compatible with centrifugation systems (Figure Ic).
  • the object of the invention comprises the use of this method, by means of said kits or devices, to conserve and / or transport peptides or proteins of sanitary, diagnostic, pharmaceutical, agronomic, industrial interest or in the field of research in science of life, without the need for refrigeration in order to: 1. conserve peptides or proteins that will be used for study as samples or controls in biological, immunological, biochemical or analytical tests.
  • Example 1 Conservation and recovery of a fluorescent protein (GFP) labeled with histidine tails in derivatized membranes.
  • GFP fluorescent protein
  • the present example describes how to store histidine tails (Histag) labeled proteins in membranes derivatized with functional groups that have affinity for said label at room temperature for prolonged periods of time.
  • Histag histidine tails
  • the membranes used in this example are in the form of 2.5 cm diameter and 0.65 mm thick discs, and are derivatized with IDA-Ni.
  • the protein to be conserved 1 mg of green fluorescent protein (GFP) fused at its carboxyl end to a Histag (GFP-Histag), is dissolved in 10 ml of the wash solution and passed twice through the support with the membrane discs, using the attached syringe. The membrane discs are then washed with 25 ml of the wash solution. Then the membrane discs are removed from the support and dried at room temperature for at least 30-60 min in a clean environment (laminar flow hood, petri dish, etc). These membrane discs with the immobilized protein are introduced in a petri dish and sent to another laboratory, by conventional mail-messaging systems at room temperature, where after 15 days it is used by a different user in the next phase of the test.
  • GFP green fluorescent protein
  • Histag GFP-Histag
  • Example 2 Immobilization, storage and release of protein A labeled with choline binding domains in derivatized membranes.
  • the present example describes how to store proteins labeled with choline-binding domains (Lytag) in membranes derivatized with functional groups that have affinity for said label at room temperature for prolonged periods of time.
  • Lytag choline-binding domains
  • the membranes used in this example are in the form of 2.5 cm diameter and 0.2 mm thick discs, and are derivatized with DEAE (diethylaminoethyl).
  • DEAE diethylaminoethyl
  • six membrane discs are placed inside a propylene support for filtration with the appropriate dimensions (filter support swinnex polypropylene, Millipore) and washed with 10 ml of a wash solution consisting of 20 mM phosphate buffer potassium pH 7.0, 300 mM NaCl and 5 mM choline chloride, using a syringe attached to the support.
  • the protein to conserve 1 mg of protein A fused at its amino terminal end to a Lytag (Lytag-protein A) using a commercial Biomedal kit, is dissolved in 10 ml of the wash solution and passed twice through the support with the membrane discs, using the attached syringe. The membrane discs are then washed with 25 ml of the wash solution. Then the membrane discs are removed from the support and dried at room temperature for at least 30-60 min in a clean environment (laminar flow hood, petri dish, etc). These membrane discs with the immobilized protein are introduced in a petri dish and sent to another laboratory, by conventional courier systems at room temperature, where after 15 days it is used by a different user in the next phase of the test.
  • Example 3 Activity of fluorescent proteins labeled with choline binding domains conserved and recovered from derivatized membranes.
  • the present example describes how proteins labeled with choline binding domains (Lytag) maintain their structure and / or activity when they are stored immobilized at room temperature for prolonged periods of time in membranes derivatized with functional groups that have affinity for said tag, and also when they are recovered again to aqueous solution.
  • Lytag choline binding domains
  • Lytag-GFPmut3 Lytag-GFPmut3
  • Lytag-ECFP Lytag-ECFP
  • Lytag-EYFP Lytag-EYFP
  • Lytag-EGFP expressed in E. coli using the system
  • the membranes used in this example are in the form of discs 2.5 cm in diameter and 0.2 mm thick, and are derivatized with
  • the membrane discs are removed from the support and dried at room temperature for at least 30-60 min in a clean environment (laminar flow hood, petri dish, etc). These membrane discs with the different immobilized fluorescent proteins are stored at room temperature for 24 hours. After this period of time the fluorescence of these proteins is analyzed by observing them under an ultraviolet light lamp. These membrane discs are then placed with the different fluorescent proteins immobilized inside the support and washed with 10 ml of the wash solution, using a syringe attached to the support.
  • the present example describes how to store antibodies or immunoglobulins in membranes derivatized with immobilized protein A at room temperature for prolonged periods of time.
  • the membranes used in this example are in the form of 2.5 cm diameter and 0.2 mm thick discs, and are derivatized with DEAE (diethylaminoethyl).
  • DEAE diethylaminoethyl
  • three membrane discs are placed inside a propylene support for filtration with the appropriate dimensions (filter support swinnex polypropylene, Millipore) and washed with 10 ml of an immobilization solution composed of 20 mM phosphate buffer potassium pH 7.0, 300 mM NaCl and 5 mM choline chloride, using a syringe attached to the support.
  • Lytag-protein A 1 mg of protein A fused at its amino terminal end to a Lytag (Lytag-protein A) is dissolved in 10 ml of the immobilization solution and passed twice through the support with the membrane discs, using the syringe coupled. The membrane discs are then washed with 25 ml of the immobilization solution. These membrane discs with immobilized Lytag-protein A are used to preserve antibodies or immunoglobulins.
  • the monoclonal antibody to be conserved 2.5 mg of mouse IgG 23 immunoglobulin, is dissolved in 10 ml of a wash solution consisting of 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 and passed four times through the support with the membrane discs with Lytag - immobilized protein A, using the attached syringe. The membrane disks are then washed three times with 20 ml of the wash solution. Then the membrane discs are removed from the support and dried at room temperature for at least 30-60 min in a clean environment (laminar flow hood, petri dish, etc). These membrane discs with the immobilized antibody or immunoglobulin are stored at room temperature for 24 hours.
  • the LYTAG-protein A protein could previously be immobilized to the membrane by activation of a covalent membrane binding by agents that conjugate it and are known to those skilled in the art. In this way, the antibody can be detached from the membrane without said protein, using an acidic pH solution and disappointing the immunoglobulin in a buffered solution.
  • Example 5 Stability of histidine-labeled ⁇ -galactosidase conserved in derivatized membranes.
  • the present example describes proteins labeled with histidine tails.
  • Histag maintain their structure and / or activity when they are stored immobilized at room temperature for prolonged periods of time in derivatized membranes with functional groups that have affinity for said label.
  • the membranes used in this example are in the form of sheets adaptable to Vacuum Manifold equipment to make Dot-Blot, and are derivatized with EDA-Ni.
  • the membrane sheets are incubated for 10 min at room temperature in a wash solution composed of 50 mM potassium phosphate buffer pH 8.0, 300 mM NaCl and 10 mM imidazole.
  • the membrane sheets are placed inside a Vacuum Manifold device with adapter to make Dot-Blot connected to a vacuum system, and 0.2 ml of E.coli crop extracts are passed through each of the wells which superexpress fused ⁇ -galactosidase at its amino terminal end to a Histag (Histag- ⁇ -galactosidase).
  • Figure 1 Scheme reflecting different ways of passing through the derivatized matrix the fluid or solution containing the labeled peptide or protein. It can be used: a support with the matrix inside, to which a syringe with plunger is attached to introduce the fluid or solution and exert the necessary pressure (a); a support with the matrix inside and with an outlet to a vacuum system to exert the necessary pressure, to which a syringe is attached to introduce the fluid or solution (b); or, a support with the matrix inside adaptable to a tube compatible with centrifugation systems to exert the necessary pressure (c).
  • the black arrow shows where the matrix is arranged in each of the examples.
  • Figure 2 General scheme of the method of conservation and recovery of proteins labeled in derivatized membranes.
  • FIG. 1 Activity of fluorescent proteins conserved and recovered in membranes derivatized with DEAE. Fluorescent proteins: control without proteins (1); Lytag-GFPmut3 (2); Lytag-ECFP (3); Lytag-EYFP (4); and Lytag-EGFP (5). Membrane discs with the different immobilized fluorescent proteins (A). Aqueous solutions with the different fluorescent proteins recovered from the membrane discs (B). Membrane discs after recovering the different fluorescent proteins (C) from aqueous solution.
  • FIG. 6 Conservation and recovery of an antibody or immunoglobulin in membranes derivatized with immobilized protein A.
  • Molecular weight marker M
  • Lytag-protein A solution before passing through the membrane discs (1) and after passing through the membrane discs (2)
  • antibody or immunoglobulin (IgG) solution before passing through the membrane discs with immobilized protein A (4) and after passing through the membrane discs with immobilized protein A (5)

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Abstract

El objeto de la presente invención es un método de conservación de péptidos o proteínas durante periodos de tiempo prolongados. Constituye igualmente un objeto de la presente invención la utilización de dicho método de conservación para el transporte de péptidos o proteínas etiquetadas sin necesidad de refrigeración, así como el conjunto de útiles para la puesta en práctica de dicho método.

Description

MÉTODO DE CONSERVACIÓN DE PEPTIDOS O PROTEÍNAS
SECTOR DE LA TÉCNICA
El sector de la técnica en el que se encuadra la presente invención es el biotecnológico, y su ámbito de aplicación es la conservación y el transporte de péptidos o proteínas de interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico o industrial. También es de interés en el campo de la investigación en ciencias de la vida.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los péptidos o proteínas generalmente son inestables cuando son conservados a temperatura ambiente (aproximadamente 250C) en medios líquidos o soluciones acuosas, así en pocas horas comienzan a aparecer fenómenos de degradación, desnaturalización y/o crecimiento de contaminantes microbianos (Jaenicke, R., (2000). J Biotechnol, 79, 193-203; Meyer, J.D., et al (2002). Pharm Biotechnol, 13, 85-107). Con objeto de evitar dichos fenómenos se utilizan diversos métodos de conservación de péptidos y proteínas, los más habituales pueden ser resumidos en: (i) conservación a temperatura refrigerada; (ii) adición de agentes estabilizantes; y, (iii) deshidratación o liofilización.
Tradicionalmente los péptidos o proteínas han sido conservados en solución acuosa a temperatura refrigerada, bien de forma líquida a 40C ó bien de forma congelada a -200C. De esta forma se reduce la velocidad de las reacciones de degradación. No obstante, los procesos de congelación-descongelación repetida provocan alteraciones en la estructura y/o actividad de los péptidos y proteínas (Tang, X.C., et al (2005). Pharm Res, 22, 1167-1175). Asimismo, los péptidos y proteínas conservados de esta forma no evitan la aparición de los fenómenos de degradación, desnaturalización y/o contaminación microbiana.
Los agentes estabilizantes son sustancias inertes que modifican las características físico-químicas de las soluciones acuosas empleadas para conservar péptidos o proteínas, reduciendo así el riesgo de degradación. Ejemplos de tales agentes son: glicerol, azúcares (glucosa, galactosa, sacarosa, trealosa), polietilenglicoles, amino-ácidos (metionina, histidina), detergentes (Tritón X-100, Tween-20), y otras proteínas (albúmina) (Arakawa, T., (1991). Pharm Res, 8, 285-291; Crowe, J.H., et al (1987). Biochem J, 242, 1-10; Levine, R.L. (1983). JBiol Chem, 258, 11828-11833). El glicerol es un agente estabilizante tradicional que reduce el punto de congelación de la solución acuosa con los péptidos o proteínas, permitiendo conservarlos en estado líquido sin congelar a baja temperatura (-2O0C) (Scharnagl, C, et al (2005). Biochim Biophys Acta, 1749, 187-213). Los agentes estabilizantes suelen utilizarse conjuntamente a otros métodos de conservación de péptidos o proteínas (Carpenter, J.F. et al (1987). Biochim Biophys Acta, 923, 109-115). Sin embargo a menudo los agentes estabilizantes pueden interferir en la actividad o aplicación posterior del péptido o proteína de interés, y deben ser eliminados utilizando sistemas de diálisis u otros procedimientos más agresivos (precipitación salina o acida) que alteran dicho péptido o proteína (Prive, G.G. (2007) Methods, 41, 388-397).
La liofilización es un proceso de deshidratación en el cual las moléculas de agua son eliminadas de una muestra congelada en el interior de un sistema de vacío. Este método de conservación requiere que el péptido o proteína, disuelto en un medio o solución acuosa, sea congelado preferentemente de forma rápida. Un procedimiento utilizado para congelar rápidamente la solución con el péptido o proteína consiste en su inmersión en nitrógeno líquido. Entonces se aplica a la muestra congelada un sistema de vació, que provoca la sublimación o vaporización de la fase helada a temperaturas bajo cero (deshidratación primaria). La humedad residual puede ser posteriormente eliminada permitiendo la elevación gradual de la temperatura (deshidratación secundaria). El resultado del proceso de liofilización es un polvo o sustancia seca y cristalina que contiene el péptido o proteína a conservar (Randolph, T. W., (1997). J Pharm Sci, 86, 1198-1203; Wang, W. (2000). Int J Pharm, 203, 1-60). En la liofilización, durante las fases de deshidratación primaria y secundaria los péptidos o proteínas sufren cambios físicos y químicos, como incremento de la concentración salina, agregación/precipitación, estrés físico, pH extremos, que producen alteraciones en su estructura y/o actividad. Adicionalmente, los péptidos o proteínas liofilizados usualmente son muy higroscópicos, y tienen tendencia a absorber la humedad ambiental, lo que también ocasiona fenómenos de degradación y descenso de la actividad de dichos péptidos o proteínas (Webb, S.D., et al (2003). J Pharm Sci, 92, 715-729).
Las etiquetas de afinidad (tags) se han convertido en un sistema habitual de purificar proteínas y complejos proteicos nativos por evidentes razones: permiten purificar o enriquecer de cientos a miles de veces dichos péptidos o proteínas desde extractos crudos en un solo paso, sin la necesidad de eliminar previamente ácidos nucleicos u otros materiales celulares; y, sobre todo, permiten utilizar protocolos generales de purificación con una gran diversidad proteínas, en contraste con el diseño y puesta a punto de protocolos específicos para cada material peptídico que necesita la cromatografía convencional (Waugh, D. S., (2005). Trenas Biotechnol, 23, 316-320; Esposito, D. et al (2006). Curr Opin Biotechnol, 17, 353-358). Gracias a estas ventajas, la purificación usando etiquetas de afinidad ha facilitado a los investigadores la producción de multitud de proteínas recombinantes de interés en investigación y en diagnóstico, siendo el procedimiento típicamente usado en los proyectos de alto rendimiento (Braun, P., et al. (2002) PNAS; 99, 2654-2659). .
Actualmente, las colaboraciones científicas o los servicios especializados cliente- proveedor requieren el intercambio o envío de péptidos o proteínas, de interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico, industrial o en el campo de la investigación en ciencias de la vida, entre laboratorios de centros públicos o empresas privadas localizados en el mismo país o países diferentes. Uno de los problemas del envío de estos materiales, consiste en evitar los fenómenos de degradación, desnaturalización y/o crecimiento de contaminantes microbianos referidos anteriormente. El sistema de transporte más habitual consiste en usar cajas voluminosas que contienen hielo, nieve carbónica o acumuladores de frío para garantizar que los péptidos o proteínas se conservan una temperatura refrigerada durante el tiempo establecido para el transporte (de 24 horas a 4-5 días para este tipo de envíos). Estos sistemas son engorrosos y suponen un elevado coste económico. Además, cualquier retraso en el tiempo de transporte (retención en aduanas, retrasos por la empresa de mensajería, etc) provoca que el material llegue a su destino a temperatura ambiente, motivando su devolución o la comprobación de la integridad del material enviado por parte del receptor. Por ello son necesarios nuevos métodos que permitan resolver el problema de conservación y transporte de péptidos o proteínas a temperatura ambiente. La presente invención describe un método sencillo, económico y versátil orientado a resolver este problema, así como los útiles necesarios para realizarlo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención se refiere un método para conservar péptidos o proteínas etiquetados durante varios días, e incluso meses, que evita el uso de refrigeración, y su aplicación en el almacenamiento y el transporte de péptidos o proteínas de interés para los sectores sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico o industrial. La presente invención describe un método alternativo más cómodo y seguro que los ya existentes, tales como la conservación y/o transporte de péptidos o proteínas en solución acuosa a temperatura refrigerada o la liofílización. (Tang, X.C., et al (2005). Pharm Res, 22, 1167-1175; Webb, S.D., et al (2003). J Pharm Sci, 92, 715-729). Así, el objeto de la invención comprende el uso de matrices sólidas o semi-sólidas derivatizadas con compuestos que tienen afinidad por secuencias específicas o etiquetas (tags) presentes en los péptidos o proteínas a conservar.
El método para conservar péptidos o proteínas objeto de la invención incluye las siguientes etapas:
(a) paso de un fluido o solución que contenga el péptido o proteína etiquetado a través de una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada, en condiciones tales que la etiqueta (tag) del péptido o proteína se une por afinidad a los grupos funcionales presentes en dicha matriz.
(b) paso de una solución de lavado a través de la matriz para eliminar el material biológico, péptidos o proteínas, u otras sustancias del fluido o solución no unidos a la matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada. (c) secado parcial o total de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado a temperatura moderada (a partir de 15°y no superior a temperaturas desnaturalizantes, preferentemente de 18 a 420C), preferentemente a temperatura ambiente.
(d) conservación de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado en un envoltorio limpio y aséptico durante el tiempo necesario hasta su uso.
(e) recuperación del péptido o proteína inmovilizado mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
La presente invención describe concretamente el uso de matrices sólidas o semi- sólidas compuestas por cualquier material poroso, fibroso o reticular que permita el paso de líquidos, preferentemente alguno de los siguientes materiales o sus derivados: celulosas, agarosas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polivinilos, chitosanos, poliestirenos y cualquier polímero natural o de síntesis derivatizable con estructura porosa o fibrosa. En general, puede usarse cualquier polímero caracterizado por tener una alta relación superficie/volumen y que suelen ser utilizados como soportes de purificación sólidos o semi-sólidos en cromatografía de afinidad para purificación de péptidos o proteínas. Asimismo se describe que dichas matrices estarían derivatizadas con compuestos que tienen afinidad por secuencias específicas o etiquetas (tags) presentes en los péptidos o proteínas a conservar. Concretamente, la unión a la matriz se produce por medio de una zona del péptido o proteína que no afectaría a su actividad o funcionalidad, ya que las etiquetas o tags suelen fusionarse al extremo amino o carboxilo terminal del péptido o proteína, manteniendo una distancia con los sitios activos suficiente para que ambos dominios o regiones no interaccionen.
Preferentemente se utilizarían matrices derivatizadas con alguno de los siguientes compuestos: ácido iminodiacético (IDA) o ácido nitrilotriacético (NTA) unidos a metales dicatiónicos como el níquel (Ni), el cobalto (Co) o el cobre (Cu); aminas terciarias o cuaternarias como el dietilaminoetanol (DEAE) o el trimetilamonio (QAE); glutation; anulosa; avidina o estreptavidina; calmodulina; proteína A; proteína G; o cualquier otro compuesto que permita la purificación por cromatografía de afinidad de péptidos o proteínas conocidos por los expertos en dicha materia. Las etiquetas o tags que permiten la unión por afinidad a los grupos funcionales presentes en las matrices pueden ser preferentemente colas de histidinas (Histag), dominios de unión a colina (Lytag), glutation S-transferasa (GST-tag), maltose binding protein (MBP-tag), biotina o Streptag, calmodulin binding domain (CBD-tag) o calmodulin binding protein (CBP-tag) o calmodulin regulated proteins, secuencias totales o parciales de cadenas pesadas de inmunoglobulinas, o cualquier otro tipo de etiqueta que permita la purificación por cromatografía de afinidad de péptidos o proteínas conocidas por los expertos en dicha materia.
También se describe en la presente invención que los péptidos o proteínas conservados en las matrices, pueden ser recuperados a solución acuosa mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz sólida o semi-sólida derivatizada. Preferentemente se utilizarían alguno de los siguientes compuestos: imidazol; colina; glutation; maltosa; biotina; agentes quelantes del calcio; soluciones acidas; o cualquier otro compuesto que permita la elución de péptidos o proteínas unidas por afinidad a soportes cromatográficos conocidos por los expertos en la materia.
A partir del método para conservar péptidos o proteínas y de la variedad de compuestos descritos anteriormente, puede utilizarse alguna de las configuraciones descritas en la siguiente tabla:
Figure imgf000007_0001
* secuencias específicas o etiquetas (tags) presentes en el péptido o proteína.
** compuestos utilizados para derivatizar Ia matriz.
*** compuestos que interrumpen Ia unión del péptido o proteína y Ia matriz.
Las características más novedosas y ventajosas del objeto de la presente invención se pueden resumir en los siguientes puntos:
1. La inmovilización de péptidos o proteínas en matrices sólidas o semi-sólidas que son deshidratadas parcial o totalmente permite conservar dichos péptidos o proteínas por periodos de tiempo desde varias horas a varios meses a temperatura ambiente (aproximadamente 18-25°C) sin necesidad de refrigeración. De la misma forma se podrían conservar una gran proporción de péptidos o proteínas por periodos de tiempo superiores a menor temperatura.
2. El uso de matrices sólidas o semi-sólidas derivatizadas permite conservar directamente péptidos o proteínas etiquetados que hayan sido purificados previamente, o estén contenidos en extractos de células que los expresen o cualquier otro formato soluble no purificado.
3. Frente a otros métodos de conservación péptidos o proteínas, el método descrito tiene la ventaja de que puede realizarse en un periodo de tiempo corto y no requiere instrumentos costosos ni voluminosos. 4. El método descrito evita los procesos de congelación-descongelación, que pueden provocan alteraciones en la estructura y/o actividad de los péptidos y proteínas a conservar, así como los cambios físico-químicos y los fenómenos de higroscopicidad aparecidos durante los procesos de liofilización 5. El método descrito también puede evitar el uso de agentes estabilizantes, que pueden interferir con la aplicación posterior del péptido o proteína.
Mediante el empleo de técnicas habituales en laboratorios bioquímicos, la presente invención comprende también el uso de un conjunto de útiles (kits) o dispositivos que permitan realizar el método para conservar péptidos o proteínas etiquetados, caracterizados porque incluyen:
(a) una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada en forma de membrana para la inmovilización del péptido o proteína etiquetado.
(b) un soporte para contener la matriz y pasar a través de ella los distintos fluidos o soluciones utilizados, con las dimensiones y estanqueidad apropiadas para que encaje la matriz y todo el flujo pase necesariamente a través de su superficie derivatizada.
(c) tubos o jeringas acoplables al soporte para introducir el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado, la solución de lavado de la matriz, y la solución de recuperación con componentes específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
(d) un dispositivo que permita ejercer la presión necesaria para que los distintos fluidos o soluciones utilizados pasen a través de la matriz, que puede ser por ejemplo: un embolo acoplado a la jeringa (Figura la); una salida del soporte acoplable a un sistema de vacío (Figura Ib); un tubo acoplable al soporte compatible con sistemas de centrifugación (Figura Ic).
(e) envoltorio para la conservación y/o envío de matriz con el péptido o proteína inmovilizado. (f) solución de lavado de la matriz.
(g) solución de recuperación con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
Asimismo, el objeto de la invención comprende la utilización de este método, mediante dichos kits o dispositivos, para conservar y/o transportar péptidos o proteínas de interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico, industrial o en el campo de la investigación en ciencias de la vida, sin necesidad de refrigeración con objeto de: 1. conservar péptidos o proteínas que serán utilizadas para estudio como muestras o controles en ensayos biológicos, inmunológicos, bioquímicos o analíticos.
2. intercambiar péptidos o proteínas de interés entre laboratorios de centros públicos o empresas privadas. 3. envío péptidos o proteínas para inmunizar animales de laboratorio con el fin de obtener anticuerpos contra dichos péptidos o para investigación sobre vacunas.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1. Conservación y recuperación de una proteína fluorescente (GFP) etiquetada con colas de histidinas en membranas derivatizadas.
El presente ejemplo describe como conservar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado proteínas etiquetadas con colas de histidinas (Histag) en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.65 mm de grosor, y están derivatizadas con IDA-Ni. En primer lugar, se colocan cuatro discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de lavado compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 10 mM imidazol, utilizando una jeringa acoplada al soporte.
La proteína a conservar, 1 mg de green fluorescen protein (GFP) fusionada en su extremo carboxilo terminal a un Histag (GFP-Histag), se disuelve en 10 mi de la solución de lavado y se pasa dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con la proteína inmovilizada se introducen en una placa de petri y se envían a otro laboratorio, por sistemas de correo-mensajería convencionales a temperatura ambiente, donde tras 15 días es utilizada por un usuario distinto en la siguiente fase del ensayo.
Para recuperar la proteína inmovilizada en los discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 5 mi de una solución de recuperación compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 250 mM imidazol, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en un tubo limpio. La figura 2 muestra un esquema general del procedimiento y los materiales empleados. La figura 3 muestra los resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse, la casi totalidad de la GFP-Histag es inmovilizada a su paso a través de los discos de membrana, y puede recuperarse fácilmente a solución pasando a través de los discos de membrana la solución de recuperación.
Ejemplo 2. Inmovilización, almacenaje y liberación de proteína A etiquetada con dominios de unión a colina en membranas derivatizadas.
El presente ejemplo describe como conservar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado proteínas etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag) en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con DEAE (dietilaminoetilo). En primer lugar, se colocan seis discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al soporte.
La proteína a conservar, 1 mg de proteína A fusionada en su extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-proteína A) usando un kit comercial de Biomedal, se disuelve en 10 mi de la solución de lavado y se pasa dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con la proteína inmovilizada se introducen en una placa de petri y se envían a otro laboratorio, por sistemas de correo- mensajería convencionales a temperatura ambiente, donde tras 15 días es utilizada por un usuario distinto en la siguiente fase del ensayo. Para recuperar la proteína inmovilizada en los discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 5 mi de una solución de recuperación compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 250 mM cloruro de colina, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en un tubo limpio. La figura 4 muestra los resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse, la casi totalidad del polipéptido de fusión Lytag-proteína A es inmovilizado a su paso a través de los discos de membrana, y puede recuperarse fácilmente a solución pasando a través de los discos de membrana la solución de recuperación.
Ejemplo 3. Actividad de proteínas fluorescentes etiquetadas con dominios de unión a colina conservadas y recuperadas desde membranas derivatizadas.
El presente ejemplo describe como proteínas etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag) mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas inmovilizadas a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta, y también cuando son recuperadas nuevamente a solución acuosa.
Las proteínas fluorescentes utilizadas, GFPmut3, ECFP, EYFP y EGFP (Cormack, B.P., et al (1996). Gene, 173, 33-38; Heim, R., et al (1994) Proc Nati Acad Sci, 91, 12501-
12504; Ormδ, M. et al (1996) Science, 273, 1392-1395; Prasher, D. C, et al (1992) Gene,
111, 229-233), fueron fusionadas en su extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-GFPmut3;
Lytag-ECFP; Lytag-EYFP; y Lytag-EGFP) y expresadas en E. coli usando el sistema
CASCADE-LYTAG comercial de Biomedal. Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con
DEAE. En primer lugar, se colocan cuatro discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Extractos de cultivos de E.coli que superexpresan las distintas proteínas fluorescentes fusionadas a Lytag, se pasan dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes inmovilizadas se conservan a temperatura ambiente durante 24 horas. Tras este periodo de tiempo se analiza la fluorescencia de dichas proteínas observándolas bajo una lámpara de luz ultravioleta. Después, se colocan estos discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes inmovilizadas en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Seguidamente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 2 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 250 mM cloruro de colina, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo los resultados en tubos limpios. Estos tubos, con las distintas proteínas fluorescentes en solución acuosa, así como los discos de membrana utilizados son analizados bajo una lámpara de luz ultravioleta. La figura 5 muestra los resultados de este ejemplo. Como puede observarse, las distintas proteínas fluorescentes mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas en las membranas derivatizadas, y también cuando son recuperadas nuevamente a solución acuosa.
Ejemplo 4. Conservación y recuperación de un anticuerpo o inmunoglobulina en membranas derivatizadas con proteína A inmovilizada.
El presente ejemplo describe como conservar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado anticuerpos o inmunoglobulinas en membranas derivatizadas con proteína A inmovilizada.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con DEAE (dietilaminoetilo). En primer lugar, se colocan tres discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de inmovilización compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Seguidamente, se disuelve 1 mg de proteína A fusionada en su extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-proteína A) en 10 mi de la solución de inmovilización y se pasa dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de inmovilización. Estos discos de membrana con Lytag-proteína A inmovilizada se utilizan para conservar anticuerpos o inmunoglobulinas.
El anticuerpo monoclonal a conservar, 2.5 mg de inmunoglobulina IgG23 de ratón, se disuelve en 10 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0 y se pasa cuatro veces a través del soporte con los discos de membrana con Lytag- proteína A inmovilizada, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana tres veces con 20 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con el anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado se conservan a temperatura ambiente durante 24 horas.
Para recuperar anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado en los discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 6 mi de una solución de recuperación compuesta por 1 M Tris- HCl pH 9.0, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en fracciones de 2 mi. La figura 6 muestra los resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 10% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse: (i) en la primera fase del ensayo se consigue saturar los discos de membrana con Lytag-proteína A, para evitar interacciones inespecíficas entre el anticuerpo y los discos de membrana; (ii) una porción importante del anticuerpo o inmunoglobulina es inmovilizado a su paso a través de los discos de membrana con Lytag-proteína A; (iii) dicho anticuerpo o inmunoglobulina puede recuperarse a solución pasando a través de los discos de membrana la solución de recuperación.
La proteína LYTAG-proteína A podría previamente ser inmovilizada a la membrana por activación de una unión covalente a la membrana por agentes que lo conjuguen y que son conocidos por expertos en la materia. De esta forma, el anticuerpo puede ser despegado de la membrana sin dicha proteína, usando una solución de pH ácido y decepcionando la inmunoglobulina en una solución tamponada.
Ejemplo 5. Estabilidad de la β-galactosidasa etiquetada con colas de histidinas conservada en membranas derivatizadas.
El presente ejemplo describe como proteínas etiquetadas con colas de histidinas
(Histag) mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas inmovilizadas a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de láminas adaptables a equipos de Vacuum Manifold para hacer Dot-Blot, y están derivatizadas con EDA-Ni. En primer lugar, se incuban las láminas de membrana durante 10 min a temperatura ambiente en una solución de lavado compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 10 mM imidazol. Seguidamente, se colocan las láminas de membrana en el interior de un equipo de Vacuum Manifold con adaptador para hacer Dot-Blot conectado a un sistema de vacío, y por cada uno de los pocilios se pasan 0.2 mi de extractos de cultivos de E.coli que superexpresan β-galactosidasa fusionada en su extremo amino terminal a un Histag (Histag-β- galactosidasa). Después se lavan los pocilios con 4 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen las láminas de membrana del equipo de Vacuum Manifold y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar). Cada uno de los puntos (dots) se recortan en segmentos de igual tamaño y se conservan a temperatura ambiente hasta su utilización en el ensayo de actividad β-galactosidasa. La figura
7 muestra que la Histag-β-galactosidasa conservada en láminas de membrana mantiene al menos un 50% de su actividad inicial después de 15 días a temperatura ambiente.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema reflejando distintas formas de hacer pasar a través de la matriz derivatizada el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado. Puede utilizarse: un soporte con la matriz en su interior, al que se le acopla una jeringa con émbolo para introducir el fluido o solución y ejercer la presión necesaria (a); un soporte con la matriz en su interior y con una salida a un sistema de vacío para ejercer la presión necesaria, al que se le acopla una jeringa para introducir el fluido o solución (b); o bien, un soporte con la matriz en su interior adaptable a un tubo compatible con sistemas de centrifugación para ejercer la presión necesaria (c). La flecha negra muestra donde se dispone la matriz en cada uno de los ejemplos.
Figura 2. Esquema general del método de conservación y recuperación de proteínas etiquetadas en membranas derivatizadas.
Figura 3. Conservación y recuperación de GFP-Histag en membranas derivatizadas con IDA- Ni. Marcador de pesos moleculares (M); solución de GFP-Histag antes de su paso por los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2); solución de GFP-Histag recuperada de los discos de membrana (3).
Figura 4. Conservación y recuperación de Lytag-proteína A en membranas derivatizadas con DEAE. Marcador de pesos moleculares (M); solución de Lytag-proteína A antes de su paso por los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2); solución de Lytag-proteína A recuperada de los discos de membrana (3).
Figura 5. Actividad de proteínas fluorescentes conservadas y recuperadas en membranas derivatizadas con DEAE. Proteínas fluorescentes: control sin proteínas (1); Lytag-GFPmut3 (2); Lytag-ECFP (3); Lytag-EYFP (4); y Lytag-EGFP (5). Discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes inmovilizadas (A). Soluciones acuosas con las distintas proteínas fluorescentes recuperadas de los discos de membrana (B). Discos de membrana tras recuperar a solución acuosa las distintas proteínas fluorescentes (C).
Figura 6. Conservación y recuperación de un anticuerpo o inmunoglobulina en membranas derivatizadas con proteína A inmovilizada. Marcador de pesos moleculares (M); solución de Lytag-proteína A antes de su paso por los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2); lavado de los discos de membrana con proteína A inmovilizada (3); solución de anticuerpo o inmunoglobulina (IgG) antes de su paso por los discos de membrana con proteína A inmovilizada (4) y después de su paso por los discos de membrana con proteína A inmovilizada (5); 1er, 2o y 3er lavado de los discos de membrana con el anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado (6-8); distintas fracciones con el anticuerpo o inmunoglobulina recuperado de los discos de membrana (9-11).
Figura 7. Estabilidad de Histag-β-galactosidasa conservada en membranas derivatizadas.

Claims

REIVINDICACIONES
L- Método para conservar o almacenar péptidos o proteínas etiquetados mediante su unión reversible a matrices sólidas o semi-sólidas derivatizadas que incluye las siguientes etapas:
(a) paso de un fluido o solución que contenga el péptido o proteína etiquetado a través de una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada, en condiciones tales que la etiqueta (tag) del péptido o proteína se une por afinidad a los grupos funcionales presentes en dicha matriz.
(b) paso de una solución de lavado a través de la matriz para eliminar el resto de material biológico, péptidos o proteínas, u otras sustancias del fluido o solución no unidos a la matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
(c) secado parcial o total de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado a temperatura moderada (desde 12° a 6O0C), preferentemente a temperatura ambiente.
(d) conservación de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado en un envoltorio limpio y aséptico durante el tiempo necesario hasta su uso.
(e) recuperación del péptido o proteína inmovilizado mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
2.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según la reivindicación 1, caracterizado porque las matrices están derivatizadas con compuestos que tienen afinidad por las etiquetas (tags) presentes en dichos péptidos o proteínas.
3.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque la matriz está compuesta por cualquier material poroso, fibroso o reticular que permita el paso de líquidos.
4.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la matriz está compuesta por cualquier polímero caracterizado por tener una alta relación superficie/volumen y que suelen ser utilizados como soportes de purificación sólidos o semi-sólidos en cromatografía de afinidad para purificación de péptidos o proteínas.
5.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la matriz está compuesta por alguno de los siguientes materiales o sus derivados: celulosas, agarosas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polivinilos, chitosanos, poliestirenos y cualquier polímero natural o de síntesis derivatizable con estructura porosa o fibrosa.
6.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la matriz está compuesta por celulosa o cualquiera de sus derivados.
7.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque la matriz está derivatizada con alguno de los siguientes compuestos: ácido iminodiacético (IDA) o ácido nitrilotriacético (NTA) unidos a metales dicatiónicos como el niquel (Ni), el cobalto (Co) o el cobre (Cu); aminas terciarias o cuaternarias como el dietilaminoetanol (DEAE) o el trimetilamonio (QAE); glutation; amilosa; avidina o estreptavidina; calmodulina; proteína A; proteína G; o cualquier otro compuesto que permita la purificación por cromatografía de afinidad de péptidos o proteínas conocidos por los expertos en dicha materia.
8.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque la matriz está derivatizada con ácido iminodiacético (IDA) o ácido nitrilotriacético (NTA) unidos a metales dicatiónicos como el niquel (Ni), el cobalto (Co) o el cobre (Cu).
9.- Método para conservar péptidos o proteínas etiquetados según las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque la matriz está derivatizada con aminas terciarias o cuaternarias como el dietilaminoetanol (DEAE) o el trimetilamonio (QAE).
10.- Utilización del método para conservar péptidos o proteínas etiquetados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para conservar péptidos o proteínas con alguna de las siguientes etiquetas o tags: colas de histidinas (Histag), dominios de unión a colina (Lytag), glutation S- transferasa (GST-tag), maltose binding protein (MBP-tag), biotina o Streptag, calmodulin binding domain (CBD-tag) o calmodulin binding protein (CBP-tag) o calmodulin regulated proteins, secuencias totales o parciales de cadenas pesadas de inmunoglobulinas, o cualquier otro tipo de etiqueta que permita la purificación por cromatografía de afinidad de péptidos o proteínas conocidas por los expertos en dicha materia.
11.- Utilización del método para conservar péptidos o proteínas etiquetados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para conservar péptidos o proteínas etiquetados con colas de histidinas (Histag).
12.- Utilización del método para conservar péptidos o proteínas etiquetados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para conservar péptidos o proteínas etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag).
13.- Utilización del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para transportar sin necesidad de refrigeración péptidos o proteínas etiquetados a otro laboratorio o centro técnico.
14.- Utilización del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para transportar sin necesidad de refrigeración péptidos o proteínas etiquetados con colas de histidinas (Histag) a otro laboratorio o centro técnico.
15.- Utilización del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para transportar sin necesidad de refrigeración péptidos o proteínas etiquetados con dominios de unión a colina (Lytag) a otro laboratorio o centro técnico.
16.- Conjunto de útiles (kit) para realizar el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque comprende al menos tres de los siguientes componentes:
(a) una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada en forma de membrana para la inmovilización del péptido o proteína etiquetado. (b) un soporte para contener la matriz y pasar a través de ella los distintos fluidos o soluciones utilizados, con las dimensiones y estanqueidad apropiadas para que encaje la matriz y todo el flujo pase necesariamente a través de su superficie derivatizada.
(c) tubos o jeringas acoplables al soporte para introducir el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado, la solución de lavado de la matriz, y la solución de recuperación con componentes específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
(d) un dispositivo que permita ejercer la presión necesaria para que los distintos fluidos o soluciones utilizados pasen a través de la matriz, que puede ser por ejemplo: un embolo acoplado a la jeringa (Figura la); una salida del soporte acoplable a un sistema de vacío (Figura Ib); un tubo acoplable al soporte compatible con sistemas de centrifugación (Figura Ic).
(e) envoltorio para la conservación y/o envío de matriz con el péptido o proteína inmovilizado.
(f) solución de lavado de la matriz.
(g) solución de recuperación con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
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