WO2009072676A1

WO2009072676A1 - 成長が促進された形質転換植物

Info

Publication number: WO2009072676A1
Application number: PCT/JP2008/072595
Authority: WO
Inventors: Shinya Takahashi; Takanari Ichikawa; Minami Matsui; Tomoko Kuriyama; Yukako Hasegawa; Hirohiko Hirochika; Masaki Mori
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; RIKEN
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; RIKEN
Priority date: 2007-12-06
Filing date: 2008-12-05
Publication date: 2009-06-11
Anticipated expiration: 2010-06-06
Also published as: EP2241620A4; US20110023189A1; BRPI0821153A2; EP2241620A1; US8859852B2; CN101952431A; AU2008332262A1; JPWO2009072676A1

Abstract

この発明は、植物の成長に関与する遺伝子を解明し、当該遺伝子を利用して成長が促進された形質転換植物を提供する。

Description

成長が促進された形質転換植物技術分野

本発明は、成長が促進された形質転換植物およびその作出方法に関する。背景技術明

植物の根は、栄養吸収、植物体直立の維持などで重要な役割を担っている。しかし、そのような生理現象に関わる因子は、未知なものが多い。

童

近年、 D N A配列は決定されているが機能は未知の遺伝子を総合的に解析できる、 Fox hunting system と呼ばれる方法が開発された（特許文献 1)。この方法は、完全長 c DNAを高発現型ベクターにつないでシロイヌナズナにベクターを導入し、完全長 c DNAを高発現させたシロイヌナズナを作製するというものである。この Fox hunting systemは、様々な遺伝子解析に適用可能である。

一方、植物の成長に関する特許出願がいくつかなされており、例えば、植物の根の伸長を制御する遺伝子（特許文献 2)、植物の成長を促進させる方法（特許文献 3)、植物の成長および収穫量を増大させる方法（特許文献 4) などが挙げられる。特許文献 2には、シロイヌナズナ T一 DNAタグラインを利用して、根端で特異的に発現するシロイヌナズナ遺伝子（A t GCN20_ 3) が同定されたことが開示されている。特許文献 3には、植物由来のサイクリン B 2遺伝子を過剰発現させることにより、根などの成長器官の伸長を促進させることが開示されている。特許文献 4には、調節配列に結合されたサイクリンタンパク質をコードする核酸を植物に形質転換し、根やシュートの成長の増大を示す形質転換植物を作出することが開示されている。

特許文献 1 再公表 2003Z0 1 8808号公報

特許文献 2 特開 2004— 1 8 7564号公報

特許文献 3 特開 2004— 30505 1号公報

特許文献 4 特表 2002— 5 3 1 08 3号公報発明の開示

本発明の課題は、植物の成長に関与する遺伝子を解明し、当該遺伝子を利用して成長が促進された形質転換植物およびその作出方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、イネの完全長 c DNAを 1つずつ高発現させた、イネ完全長 c DNA高発現シロイヌナズナライン（イネ FOXラインという）を作製し、 Root bending assayを行い、野生型と比較して根の伸長に変化のあったシロイヌナズナを単離し、該シロイヌナズナに導入されたイネ完全長 c DNAの塩基配列を決定することにより、植物の成長に関与する DNAを同定し、本発明を完成した。

本発明は、要約すると以下の通りである。

[1] 以下の（a) 〜（g) のいずれかの DNAが導入された、形質転換植物。

(a) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる D N A

(b) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

(c) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列に対して 90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

(d) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる DN Aに相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

(e) 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DN A

( f ) 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

(g) 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

[2] 植物の成長を促進させる活性が、根の伸長を促進させる活性である、 [1] に記載の形質転換植物。

[3] 植物の成長を促進させる活性が、葉面積を増大させる活性である、 [1] または [2] に記載の形質転換植物。

[4] 単子葉植物または双子葉植物である、 [1] 〜 [3] のいずれかに記載の形質転換植物。

[5] 植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、 [1] 〜 [4] のいずれかに記載の形質転換植物。

[6] 以下の（a) 〜（g) のいずれかの DNAを含む組換えベクター。

(c) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列に対して 90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DN A

(d) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる DN Aに相捕的な塩基配列からなる DN Aとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

(e) 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA

[7] 以下の（a) 〜（g) のいずれかの DNAを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換体植物の作出方法。

(d) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる DNAに相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

( f ) 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA

[8] [6] に記載の組換えベクターを用いて前記 DNAが導入される、 [7] に記載の方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-315953号の明細書およびまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、 Root bending assayの概略を示す。

図 2は、再形質転換されたイネ FOXラインの根の伸長を示す。パネル Aはィネ FOXライン 1 (配列番号 1、 2)、パネル Bはイネ FOXライン 2 (配列番号 3、 4) を示す。

図 3は、再形質転換されたイネ FOXラインの根の伸長を示す。パネル Cはィネ FOXライン 3 (配列番号 5、 6)、パネル Dはイネ FOXライン 4 (配列番号 7、 8) を示す。

図 4は、再形質転換されたイネ FOXラインの葉面積の増大を示す。パネル A はイネ FOXライン 1 (配列番号 1、 2)、パネル Bはイネ FOXライン 2 (配列番号 3、 4) を示す。発明を実施するための最良の形態

(1) 植物の成長の促進に関与する DN A

本発明に用いる植物の成長の促進に関与する DN Aは、配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5、配列番号 7に示す DN Aであり、該 DN Aによりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8 である。これらの配歹 IJ情報は、 National Center for Biotechnology Information (NCB I ) において報告されている。配列番号 1〜8に対応する NCB Iのァクセッションナンバーを以下に示す。

表 1 イネ FOXライン Accession No.

1 (配列番号 1,2) AK069726

2 (配列番号 3， 4) AK070346

3 (配列番号 5， 6) AK067987

4 (配列番号 7, 8) AK066897 上記植物の成長の促進に関与する D N Aは、 Fox hunting systemと Root bending assayを用いてイネの遺伝子について探索した結果、見出された。

Fox hunting system (Full-length cDNA Over-expressor ene Hunting System) は、完全長 c DNAを植物に導入して高発現させることによりもたらされる形質の変化から DNAの機能を明らかにする方法である（特許文献 1参照）。本発明では、植物に導入する完全長 c DNAとして、イネ完全長 c DNAを用い、完全長 c DNAを導入する植物として、シロイヌナズナを用いた。

具体的には、イネの完全長 c DNA約 1 3， 0 0 0種類を c DNAの等量比のプールとして調製し（標準化という）、この c DN Aをプロモーター、ェンハンサ一、ターミネータ一等の制御領域、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを持った T— DN Aベクターに組み込む。該 T— DN Aベクターをァグロバクテリゥムに導入してイネ完全長 c DN A発現ライブラリー（イネ F OXライブラリーとレヽう）を作製する。該ァグロバクテリゥムを用いてフローラルディッビング法によりシロイヌナズナの形質転換を行い、シロイヌナズナの形質転換ライン（イネ F OX ライン）を作製する。 Fox hunting systemでは、植物を何億クローンものライブラリーに感染させても、 1植物に 1〜2クローンしか導入されないので、植物に別々のクローンが導入された形質転換ラインを作製することができる。上記の形質転換されたシロイヌナズナから T 1種子を回収し、 T 1種子を播種して、さらに T 2世代の種子を回収する。 T 2種子は、スクリーニングを行ゲため Root bending assayに供する。

Root bending assayは、 Britt ら (1993) , A UV-sensitive mutant of Arabiaopsis defective in the repair of pyrimidine-pyrimidinone (6-4) dimers. Science 261:， 1571-1574の文献に記載されている方法であり、本発明では、具体的に以下のようにして行う。

イネ F OXラインの T 2種子と野生型種子を MS寒天培地に播種し、暗処理、春化処理をした後、根が寒天培地表面上を這って伸長するように培地を立てて連続白色光下で生育させ、次に寒天培地を水平に置き、暗所下で UV— Bを照射し、その後、立てたプレートを 9 0度回転させて、根の伸長方向を変え、再び連続白色光下で生育させる。そして、 UV— B照射後に伸長した根の長さを野生型とイネ FOXライン T 2植物とで比較し、野生型よりも長く根が伸長したラインを UV— B耐性候補として単離する。

単離された候補のイネ FOXラインについて、導入されたイネ完全長 c DNA の塩基配列を決定し、該ィネ完全長 c DNAをシロイヌナズナに再度形質転換し、得られた再形質転換体において根の伸長が促進される表現型が再現されるかを確認する（図 1参照）。

このようにして同定された DNAは、具体的には、配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる DN Aである。

上記 DNAは、植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする。ここで「植物の成長を促進させる活性」は、野生型に比べて植物の成長を促進させる活性であれば特に限定されず、例えば、根の伸長を促進させる活性およびノまたは葉面積を増大させる活性が挙げられる。植物の成長の促進の程度は、野生型と比べて統計学的に有意であれば限定されない。例えば、本発明の形質転換植物の根の長さが、野生型の根の長さに対して、 5%以上、 1 0%以上、 1 5%以上、 20%以上、 25%以上、 30%以上、 35%以上、 40 %以上、 45 %以上、 50%以上長いことが好ましい。また、本発明の形質転換植物の葉面積が、野生型の葉面積に対して、 5%以上、 1 0%以上、 1 5%以上、 20%以上、 2 5%以上、 30%以上、 35%以上、 40%以上、 45 %以上、 50%以上大きいことが好ましい。

本発明に用いる DNAは、その DNAによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる DN Aでもよい。

本明細書において「配列番号 1に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、配列番号 1に示す塩基配列の 1〜 1 0個、好ましくは 1〜 5個の塩基が欠失してもよく、配列番号 1 に示す塩基配列に 1〜 1 0個、好ましくは 1〜 5個の塩基が付加してもよく、あるいは配列番号 1に示す塩基配列の 1〜 1 0個、好ましくは 1〜 5個の塩基が他の塩基に置換してもよいことを意味する。

また、本発明に用いる DNAは、その DNAによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列に対して 90%以上の同一性を有する塩基配列からなる DNAでもよい。

本明細書において「配列番号 1に示す塩基配列に対して 90%以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、 90%以上、好ましくは 9 5%以上、より好ましくは 98%以上、さらに好ましくは 99%以上である。

本明細書で使用される塩基配列の「同一性」とは、 2つの塩基配列のァラインメントにおいて、同一の塩基数が最大となるように該 2つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には総塩基数に対する同一塩基数のパーセンテージ（％) で表される。％同一性は、公知の B LAST、 FASTAなどのアルゴリズムを用いて決定することができる。 FASTAのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総塩基数に加算する。

さらに、本発明に用いる DNAは、その DNAによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列からなる DNAに相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DN Aでもよレヽ。

本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイプリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号 1に示す塩基配列と 90%以上、好ましくは 95 %以上、より好ましくは 98 %以上、さらに好ましくは 99 %以上の同一性を有する塩基配列からなる D N Aの相補鎖がハイブリダィズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダィズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリゥム塩濃度が 1 5〜 750 mM、好ましくは 50〜 750 m

M、より好ましくは 300〜750mM、温度が 25〜70。C、好ましくは 50

〜 70°C、より好ましくは 5 5〜 6 5°C、ホルムァミド濃度が 0〜 50 %、好ましくは 20〜 50%、より好ましくは 35〜45%での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリゥム塩濃度が 1 5〜60 OmM、好ましくは 50〜600 mM、より好ましくは 300〜 600 mM、温度が 50〜 70 °C、好ましくは 55〜 7 0°C、より好ましくは 60〜65°Cである。

あるいは、ストリンジェントな条件は、 2〜6 X塩化ナトリウム/タエン酸ナトリウム（S S C、 1 X S S Cは 1 50 mM塩化ナトリウム、 1 5mMクェン酸ナトリウム、 pH7. 0である。）、室温〜 40°Cでハイブリダィゼーシヨンを行い、 0. 1〜： 1 X S S C (好ましくは 0. ：!〜 0. 2 X S S C)、 0. 1 % S D S 、 50〜68°Cにて 1回または複数回の洗浄を行う条件でもよい。

本発明に用いられる DN Aは、配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNAであってもよい。配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、それぞれ、配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる DN Aにより、コードされる。

また、本発明に用いられる DNAは、その DNAによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DN Aであってもよい。

また、該アミノ酸配列に保存的アミノ酸置換が含まれてもよい。このような置換は、例えば、構造的又は電気的性質の類似するアミノ酸間で起こる。そのようなアミノ酸グループは、（1)酸性アミノ酸：ァスパラギン酸、グルタミン酸；（2) 塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3') 非極性アミノ酸：ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエニノレアラニン、メチォニン、トリブトファン；（4) 非荷電極性アミノ酸：グリシン、ァスパラギン、グルタミン、システィン、セリン、トレオニン、チロシン；及び（5) 芳香族アミノ酸：フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファンを含む。

本明細書において「配列番号 2に示すァミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、配列番号 2に示すアミノ酸配列の 1〜1 0個、好ましくは 1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号 2に示すアミノ酸配列に 1〜1 0個、好ましくは 1〜5個のァミノ酸が付加してもよく、あるいは配列番号 2に示すァミノ酸配列の 1〜 1 0 個、好ましくは 1〜 5個のァミノ酸が他のァミノ酸に置換してもよいことを意味する。

さらに、本発明に用いられる DNAは、その DNAによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示すアミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DN Aであってもよい。

本明細書において「配列番号 2に示すアミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列」の「同一性」は、 90 %以上、好ましくは 95 %以上、より好ましくは 98%以上、さらに好ましくは 99%以上である。

本明細書で使用されるアミノ酸配列の「同一性」とは、 2つのアミノ酸配列（または塩基配列）のアラインメントにおいて、同一のアミノ酸残基数が最大となるように該 2つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には総アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基数のパーセンテージ（％) で表される。％同一性は、公知の B LAST、 F A S T Aなどのアルゴリズムを用いて決定することができる。 FAS TAのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総アミノ酸残基数に加算する。

本発明に用いる DN Aは、配列番号 1〜 8のいずれかの配列に基づいて設計したプライマーを用いて、 c DNAライブラリ一またはゲノム DN Aライブラリ一等由来の核酸を铸型とした P C R増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、該 DNAは、上記ライブラリ一等由来の核酸を铸型とし、該 DN Aの一部である DN A断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは該 DNAは、化学合成法等の当該技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよレ、。

上記 DNAまたはアミノ酸の欠失、付加および置換は、上記タンパク質をコードする DNAを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。 DN Aに変異を導入するには、例えば Kunkel 法または Gapped duplex法等により行うことができ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan- K (タカラバイオ株式会社）、 LA PCR in vitro mutagenesis kit (タカラバイオ株式会社））等を用いて変異を導入できる。

上記 PCR、ハイブリダィゼーシヨン、組換えなどの慣用 ¾術ぼ例えば、 SambrooKり (1989) , Molecu丄 ar Cloning: Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Ausubel ら (1995) ， Short Protocols In Molecular Biology, third edition, John Wiley & Sons, Inc. tこ g己載れてレヽる。

(2) 組換えベクター

植物形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、上記（a) 〜（g) のいずれかの DN Aを適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクタ一として、ァグロパクテリゥムを介して植物に目的 DNAを導入することができる p B I系、 p PZ P系、 p SMA系のベクター等が好適に用いられる。特に p B I系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ、例えば ρ Β Ι 1 2 1、 ρ Β Ι 1 0 1、 ρ Β Ι Ι Ο Ι . 2、 ρ Β Ι Ι Ο Ι . 3、 p B I G 2 1 1 3等が挙げられる。バイナリーベクターとは、大腸菌（Escherichia coli) およびァグロパクテリゥムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するァグロバクテリゥムを植物に感染させると、ベクター上にある L B配列と RB配列よりなるボーダー配列で囲まれた部分の DN Aを植物核 D NAに組み込むことができる。また、その他のベクターとして、植物に DNAを直接導入することができる p UC系のベクター、例えば p UC 1 8、 p UC 1 9、 pUC 9等が挙げられる。さらに、カリフラワーモザイクウィルス（C aMV)、インゲンマメモザイクウィ^ /ス（BGMV)、タバコモザイクウイ^^ス（TMV) 等の植物ウィルスベクターが挙げられる。

バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記バイナリーベクターの境界配列（LB、 RB間）に、目的 DNAを挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増殖する。次いで、増幅した組換えベクターをァグロバクテリウム · ッメファシエンス GV3 1 0 1、 C 58、 LBA4404、 EHA 1 0 1、 EHA 1 0 5あるいはァグロパクテリゥム · リゾゲネス LBA 1 334等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該ァグロバクテリゥムを用いて植物への目的 DN Aの導入を行う。ベクターに目的 DNAを挿入するには、まず、精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。

また、目的 DNAは、その DNAの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには目的 DNAの上流、内部あるいは下流に、プロモーター、ェンハンサー、ターミネータ一、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（T iまたは R iプラスミド由来の複製開始点等）、選択マーカー遺伝子等を連結することができる。

プロモーターとしては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできる DNAであれば、植物由来のものでなくてもよレ、。具体的には、カリフラワーモザイクウィルス（C aMV) 35 Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来ュビキチンプロモーター、イネ由来ァクチンプロモーター、タバコ由来 PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。

ェンハンサ一としては、例えば、目的 DNAの発現効率を高めるために用いられ、 C a MV 35 Sプロモーター内の上流側の配列を含むェンハンサー領域、転写ェンハンサー E 1 2、オメガ配列等が挙げられる。

ターミネータ一としては、プロモーターにより転写された DN Aの転写を終結できる配列であればよく、例えばノパリン合成酵素（NOS) 遺伝子のターミネ一ター、ォクトピン合成酵素（OC S) 遺伝子のターミネータ一、 C a MV 35 S RNA遺伝子のターミネータ一等が挙げられる。

選択マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げられる。

(3) 形質転換植物およびその作出方法

本発明の形質転換植物は、上記（a) 〜（g) のいずれかの DNAまたは上記組換えベクターを対象植物に導入することによって作出することができる。本発明において「DNAの導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的方法により、目的

DN Aを上記宿主植物の細胞内に発現可能な形で導入することを意味する。ここで導入された D N Aは、宿主植物のゲノム D N Aに組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。

D N Aまたは組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばァグロバクテリウム法、 P E G—リン酸カノレシゥム法、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。ァグロパクテリゥム法では、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合（in planta 法）がある。プロトプラストを用いる場合は、 T iプラスミドまたは R i プラスミドをもつァグロパクテリゥム（それぞれ Agrobacterium tumefaciensまたは Agrobacterium rhizogenes) と共存培褒する方法、スフエロプラスト化したァグロパクテリゥムと融合する方法（スフエロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、種子あるいは植物体を用いる in planta法を適用する場合、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物等へのァグロパクテリゥムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「新版モデル植物の実験プロトコ一ル遺伝学的手法からゲノム解析まで（監修島本功岡田清孝、秀潤社、 2001年）」等の記載に従って行うことができる。

D N Aが植物体に組み込まれたか否かの確認は、 P C R法、サザンハイブリダィゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物から D N Aを調製し、目的 D N Aに特異的なプライマーを設計して P C Rを行う。 P C Rを行った後は、増幅産物についてァガロース電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキヤピラリー電気泳動等を行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、増幅産物を 1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて P C Rを行い、増幅産物を検出することもできる。さらにマイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。

あるいは、種々のレポータ一遺伝子、例えばべ一タダルクロニダーゼ（ G U S )、ノレシフェラーゼ（L U C )、 Green fluorescent protein ( G F P )、クロラムフエ二コールァセチルトランスフェラーゼ（ C A T )、ベータガラグトシダーゼ ( L a c Z ) 等の遺伝子を目的 D N Aの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクタ一を導入したァグロパクテリゥムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポータ一遺伝子の発現を測定することによつても確認できる。

本発明において形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれでもよく、例えばアブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ等）、イネ科（イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ等）、ナス科（ナス、タパコ、トマト、ジャガイモ等）等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。

本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官 ·植物組織、これらの切片、未分化のカルス、これを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。また、 in planta 法の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。

植物培養細胞を形質転換の対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには、既知の組織培養法により器官または個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば以下のように行うことができる。まず、 '形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「力ルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。

カルス誘導は寒天等の固形培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率よくかつ大量に行うことができる。次に継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、さらに完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（たとえばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵等を行うこともできる。

本発明の形質転換植物は、上記（a) 〜（g) のいずれかの DN Aを導入した植物体全体、植物体の一部（例えば葉、花弁、茎、根、花粉等）、植物培養細胞（例えばカルス、プロトプラスト等）、種子のいずれをも包含するものである。また、該植物体の有性生殖または無性生殖により得られる子孫の植物体、およびその子孫植物体の一部、培養細胞、種子も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、形質転換植物から種子、プロドプラスト等の繁殖材料を取得し、それを栽培または培養することによって量産することができる。

上記のようにして得られる形質転換植物は、上記（a) 〜（g) のいずれかの DNAの高発現により、植物の成長、特に根の伸長および Zまたは葉面積の増大が促進される。その結果、地中で根が伸長して、耐倒性の増加、耐乾燥性の増大、貧栄養下での植物育成が可能となる。また、葉の成長も促進され、光合成活性の増加が可能となり、最終的に植物体全体の生育を促進し得る。

実施例 1

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

(1) Fox hunting systemによるイネ F O Xラインの作製

本実施例では、恒常発現型ベクター p B I G 2 1 1 3 N (Taji，T. ら Plant J. , 2002.24(4)： p. p.417-426 及び Becker, D. ら Nucleic Acid Res. , 1990.18(1)： p.203)に S f i Iクローニングサイトを導入した p B I G 2 1 1 3 S Fを用いて、イネ完全長 c DNAのスクリ一二ングを行った。

(i)標準化イネ完全長 c DNAミックスの作製

イネから完全長 c DNAを CAP t r a p p e r法によって作製した。この c DNAをL a mb d a Z A P、あるいは L a m b d a p L C— 1 — Bの S f i I制限酵素部位によって挟まれる部位にクローニングした（参考文献： Seki M. et al. Plant J. , 15, 707-720 (1998))。ベクター配列を用いて c D N Aの 5 ' 末端と 3 ' 末端の配列を読み、 c DNAのグルーピングを行い、独立の 2 0， 0 0 0 種クローンを同定した（参考文献： Seki M. et al. Plant Physiol. Biochem. 39, 211- 220 (2001))。次に、 5 0 n g μ 1に調製した各クローンから 0. 5 1を分取して 1本のチューブに混ぜた。この混合液 Ι μ ΐ分取し、 2 0 1の£ 1 6 c t r i c c o m p e t e n t c e l l DH 1 0 B (G i b c o B R L) に形質転換した。 Am pが含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約 2 0 0 , 0 0 0個混合し、そこからプラスミドを回収した。これを標準化イネ完全長 c DNAミックスとした。

(ii)イネ F OXライブラリ一の作製

2 μ gの標準化イネ完全長 c DNAミックスと、 7 0 0 /z gの p B I G 2 1 1 3 S Fを混ぜてから同時に S f i Iで完全に切断した。切断後、イソプロパノール沈殿により濃縮し、 8 μ 1 の水に溶かし 1 μ 1 の 1 0 Xバッファーと 1 1 の Τ 4リガーゼを混ぜ、 1 6°Cで 1昼夜反応させた。 2 μ 1 の反応液を 4 0 1の E l e c t r i c c o m p e t e n t c e l l DH 1 0 Bに混ぜて形質転換した。

カナマイシン（Km) が含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約 1 5 0， 0 0 0個混合し、そこからプラスミド回収をした。回収した 2 μ 1のプラスミド液を、 4 0 μ 1 の E l e c t r i c c o m p e t e n t A g r o b a c t e r i urn c e l l G V 3 1 0 1に混ぜて形質転換した。 Kmが含まれる寒天培地上で生育した独立のコロニーを約 1 5 0， 0 0 0個 L B液体培地に懸濁し、 1 5 %になるようグリセロールを加え、一 8 0°Cにて保存した。このグリセ口一ル溶液をイネ F OXライブラリーとした。

(iii)イネ F OXラインの作製

上記イネ F OXライブラリーを約 2 0 0 , 0 0 0コロニー生育させ、ディツビング溶液に懸濁させた後、野生型シロイヌナズナ（ェコタイプ：コロンビア）のフローラルデイツビングを行った。種（T 1種子）を収穫し、ハイグロマイシンを含む貧栄養培地 BAM上で発芽させ、ハイグロマイシン耐性を示す約 2 3, 0 0 0ラインの植物のみを土に移植した。

( 2) イネ F OXライン T 2世代の Root bending assayによるスクリ一二ング上記（1 ) (iii)で土に移植した植物から種（T 2種子）を収穫し、 T 2種子と野生型の種子を滅菌の後、 1. 2 %寒天培地（MS培地、 B 5ビタミンを含有）上に播種した。播種後、アルミホイルで包んで喑処理し約 1週間 4 °Cに置いて春化処理をした後に、根が寒天培地表面上を這って伸長するように培地を立てて、 2 2°C、連続白色光下で 3日間成育させた。根を成育させた寒天培地を水平に置き、暗所下で約 2. 3Wm— ²の UV— B (約 8 k j m_²) を照射した。その後、立てたプレートを 9 0度回転させて根の伸長方向を変え、再び 2 2°C、連続白色光下で 3日間成育させた（図 1)。

UV— B照射後の 3日間で伸長した根の長さを評価した。画像解析ソフト（ I m a g e J、 N a t i o n a l I n s t i t u t e f o r H e a l t h、 U S A) にて根長を定量的に測定することにより、 UV— B耐性の有無を判別した。その結果、 Root bending assay に供した 7 0 3 4のイネ F O Xラインから、 4 9ラインを UV— B耐性ライン候補として単離した。

( 3 ) c DN Aの再クローニングとイネ F OXラインに揷入されたイネ完全長 c DN Aの塩基配列決定

上記（2) でスクリーニングされた候補のイネ F OXラインからロゼッタ葉約 2枚（約 2 0 O m g f w) を回収し、ゲノム DN Aを抽出した。この DNAに対して P C R反応を行った。 P C R反応液は以下の組成のもの用い、 9 4¾で0. 5分、 5 5でで0. 5分及び 7 2 °Cで 4分を 1サイクルとして 4 0サイクルの条件で反応させた。

反応液組成：

プライマー（1 0 0 pM) 2 X 0. 2 5 μ I

d NT P ( 2 0 0 ^ M) 4 μ 1

バッファー（X 2) 2 5 ^ 1

ポリメラーゼ 0. 5 /i 1

ゲノム DNA 1 0 μ 1 蒸留水 1 0 / 1

合計 50 μ 1

Ρ CRのためのプライマーは以下の通りである。

GTACGT ATTTTT AC AAC AATT AC C AAC AAC (配列番号 9) GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAA (配列番号 1 0)

P CR産物をァガロースゲル上で回収した後に、 p B I G2 1 1 3 S Fと混ぜ、 S f i Iによって完全切断した後にイソプロパノールを用いて沈殿させ、 T4リガーゼを処理後、大腸菌に形質転換した。 PCR断片が挿入されたプラスミドを選抜して、上記プライマーを用いて挿入されている c DNA断片の塩基配列を同定した。

(4) 根の伸長促進の表現型の確認

上記（3) で得られたイネ完全長 c DNAを再度導入したシロイヌナズナ形質転換体の T 2種子と野生型の種子各 20粒前後を滅菌の後、 1. 2%寒天培地上に播種した。播種後、アルミホイルで包んで喑処理し約 1週間 4 °Cに置いて春化処理をした後に、根が寒天培地表面上を這って伸長するように培地を立てて 2 2°C、連続白色光下で 7日間成育させた。その後、植物体の写真を撮り、胚軸と根の境界から根端までの長さを上記画像解析ソフトにより測定した。

根の伸長促進の表現型は、再形質転換体においても再現された。イネ FOXライン 1〜4の写真および根長のグラフを図 2、図 3に示す。図 2のパネル Aにおいて、野生型の根長は 1 5. 49 mm (平均）、イネ F O Xライン 1の根長は 1 8. 3 6 mm (平均）であった。図 2のパネル Bにおいて、野生型の根長は 1 3. 3 7 mm (平均）、イネ FOXライン 2の根長は 1 8. 76 mm (平均）であった。図 3のパネル Cにおいて、野生型の根長は 1 6. 98 mm (平均）、イネ FOXライン 3の根長は 22. 25 mm (平均）であった。図 3のパネル Dにおいて、野生型の根長は 1 3. 9 7 mm (平均）、イネ F OXライン 4の根長は 1 6. 78m m (平均）であった。

また、これらのイネ FOXラインに導入されたイネ完全長 c DNAの配列を配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5、配列番号 7に示し、アミノ酸配列を配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8に示す。

(5) 葉面積の増大の表現型の確認

上記（3) で得られたイネ完全長 c DN Aを再度導入したシロイヌナズナ形質転換体の T 2種子と野生型の種子を培養土に各々 2 0〜 3 0粒播種し、 4日間 4°Cに置いて春化処理を行った。その後、 22°C、 1 6時間明期で栽培し、明条件での栽培開始後 1 5日目に植物体の写真撮影を行い、葉面積を上記画像解析ソフトにより測定した。

葉面積の増大の表現型は、再形質転換体においても再現された。イネ FOXライン 1および 2の写真ならびに葉面積のグラフを図 4に示す。図 4のパネル Aにおいて、野生型の葉面積は 3. 3 Omm² (平均）、イネ F O Xライン 1の葉面積は 5. 2 2mm² (平均）であった。図 4のパネル Bにおいて、野生型の葉面積は 3. 3 1 mm² (平均）、イネ F O Xライン 2の葉面積は 5. 1 1mm² (平均）であった。産業上の利用可能性

本発明で機能が解明された遺伝子は、植物の成長、特に根の伸長に関与し、該遺伝子を植物で高発現させることにより、植物の栄養吸収能の増大、すなわち貧栄養条件下で育成することができ、また、耐倒性を増加させ、耐乾燥性を増大させることができる。特に根菜などのように根を主とする作物の食用となる部分を肥大させることで、食用作物としての商品価値を付加することができる。

また該遺伝子は、葉面積の増大にも関与し、該遺伝子を植物で高発現させることにより、地上部での成長を促進することができる。特に葉野菜において地上部の組織量を増加させ、食用部分を増加させることで、食用植物としての商品価値を付加することができる。

このように、形質転換により根の伸長、葉面積の増大に関与する遺伝子を高発現させれば、最終的に植物体全体の生育を促進させた植物を作出できる。形質転換技術が確立されている植物であれば、扱う植物を選ばずに本発明を適用できる。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) 〜（g) のいずれかの DNAが導入された、形質転換植物。

(b) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする D N A

( f ) 配列番号 2、配列番号 4、配列番号 6または配列番号 8に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DN A

2. 植物の成長を促進させる活性が、根の伸長を促進させる活性である、請求項 1に記載の形質転換植物。

3. 植物の成長を促進させる活性が、葉面積を増大させる活性である、請求項 1または 2に記載の形質転換植物。

4. 単子葉植物または双子葉植物である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の形質転換植物。

5. 植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、請求項 1〜4 のいずれか 1項に記載の形質転換植物。

6. 以下の（a) 〜（g) のいずれかの DNAを含む組換えベクター。

(d) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる DNAに相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする DNA

7. 以下の（a) 〜（g) のいずれかの DNAを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換体植物の作出方法。

(a) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列からなる D N A (b) 配列番号 1、配列番号 3、配列番号 5または配列番号 7に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする D N A

8. 請求項 6に記載の組換えベクターを用いて前記 DNAが導入される、請求項 7に記載の方法。 -