WO2009073908A1 - Reverses protein - Google Patents

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WO2009073908A1
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necrosis factor
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Bernhard Fischer
Rudolf Lucas
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Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a reverse protein, namely a tumor necrosis factor protein (polypeptide), N-terminally of one or more C-terminal parts of the amino acid sequence of the mature tumor necrosis factor (TNF), and C-terminal of one or more N-terminal parts of the amino acid sequence of the TNF is composed, wherein the protein can be used as a medicament, eg to activate epithelial ion channels, to improve lung function and to treat edema, such as pulmonary edema.
  • a tumor necrosis factor protein polypeptide
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • Liquid transport through cell layers and tissue relies primarily on an osmotic gradient through active vectorial ion transport, e.g. Sodium transport. This is mainly due to tightly regulated and vitally important ion channels, e.g. the epithelial sodium channel complex (ENaC). Water follows this gradient passively, among other things through special water channels, such as the water channel aquaporin V.
  • active vectorial ion transport e.g. Sodium transport.
  • EaC epithelial sodium channel complex
  • Water follows this gradient passively, among other things through special water channels, such as the water channel aquaporin V.
  • Na + / K + ATPases operate the vectorial transport of sodium into the interstitium and finally the ions into the lymph and blood vessels. This transport is thus active and takes place independently of the transpulmonary pressure and the alveolar protein concentration.
  • Edema is a pathological fluid accumulation in an organ, e.g. the lungs, but also the brain or the skin. Edema in the lung is called pulmonary edema. Pulmonary edema is mostly based on the imbalance between fluid extravasation and fluid resorption. Very often, the permeability of the lung tissue is damaged, so that increased fluid intake takes place, and the fluid accumulates in the pulmonary alveoli.
  • permeability disorder also plays a role in other lung diseases, such as respiratory-induced lung injury, lung transplantation, transfusion-associated lung injury, therapeutic administration of IL-2 or asthma.
  • TNF tumor necrosis factor
  • bovine, rabbit and mouse TNF gene has been described (Goeddel D.V. et al., Colard Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).
  • TNF Besides its cytotoxic properties, TNF is mainly involved in inflammatory reactions (J.W. Larrick et al., Pharmac. Res. Vol. 5, No. 3, 129-139, 1988). In the animal model, the involvement of TNF in septic shock (Torti FM et al, Science 229, 867-869, 1985) and graft versus host disease (Piguet, PF et al., J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) has been demonstrated. to be shown.
  • a disadvantage of the peptide described in WO 00/09149 is that this peptide contains artificial amino acid sequences which are not so contained in TNF. Such, provided with artificial structures, peptide is recognized by the human immune system as foreign. Repeated or prolonged administration of such a peptide in drug form can cause life-threatening immune responses.
  • a protein composed of parts of the amino acid sequence of the mature tumor necrosis factor (TNF) has interesting biological properties, such a protein containing no artificial amino acid sequences.
  • the present invention provides a reverse tumor necrosis factor protein, eg a protein which is N-terminal of one or more C-terminal parts, preferably of one part, the amino acid sequence of the mature tumor necrosis factor, and C-terminal of one or more N-terminal parts, preferably one part, of the amino acid sequence of mature tumor necrosis factor is composed, for example, in the form of a fusion protein.
  • a reverse tumor necrosis factor protein eg a protein which is N-terminal of one or more C-terminal parts, preferably of one part, the amino acid sequence of the mature tumor necrosis factor, and C-terminal of one or more N-terminal parts, preferably one part, of the amino acid sequence of mature tumor necrosis factor is composed, for example, in the form of a fusion protein.
  • the mature tumor necrosis factor (TNF) as used herein is preferably the human mature tumor necrosis factor.
  • a protein provided in accordance with the present invention is also referred to herein as "protein according to (the present invention)".
  • TNF tumor necrosis factor
  • the present invention provides a protein according to the present invention which is N-terminally selected from one or more C-terminal structural elements of the mature tumor necrosis factor and C-terminal from one or more N-terminal structural elements of the mature tumor Necrosis factor is composed, eg in the form of a fusion protein.
  • a protein according to the present invention includes a fusion protein composed of parts of the amino acid sequence of human TNF as defined above, e.g. from structural elements of the TNF.
  • a protein according to the present invention is N-terminal from the C-terminal structural elements ⁇ -beach 6 to ⁇ -beach 10, or ⁇ -beach 8 to ⁇ -beach 9 TNF, and is derived C-terminal from the N-terminal structural elements ⁇ -strand 2 to ⁇ -strand 3, or ⁇ -strand 3 of the TNF, eg with the proviso that at least two cysteine residues are contained.
  • particularly suitable proteins with the amino acid sequences are particularly suitable proteins with the amino acid sequences
  • the present invention provides a protein of the invention having the amino acid sequence of SEQ ID: NO: 1, SEQ ID: NO: 2 or SEQ ID: NO: 3.
  • the N-terminal portion of the protein Ala (96) to Lys (l 12) is derived from the C-terminal structural elements ⁇ -strand 6 to ⁇ -strand 9 of human TNF , and the C-terminal portion Gly (68) to Val (74) from the N-terminal structural element ⁇ -strand 2 and ⁇ -strand 3 of the human TNF.
  • Numerals (96), (112), (68) and (74) indicate the positions of the amino acids in human TNF.
  • the N-terminal portion of the protein Lys (98) to Lys (l 12) is derived from the C-terminal structural elements ⁇ -strand 7 to ⁇ -strand 9 of the human TNF, and the C-terminal portion of the reverse fusion protein Gly (68) to Ser (71) from the N-terminal structural element ⁇ -strand 3 of human TNF.
  • Numerals (98), (112), (68) and (71) indicate the positions of the amino acids in human TNF.
  • the N-terminal portion of the protein Cys (l ⁇ l) to Lys (112) is derived from the C-terminal structural elements ⁇ -strand 7 to ⁇ -strand 9 of human TNF, and the C-terminal portion Gly (68) to Cys (69) from the N-terminal structural element ⁇ -strand 3 of human TNF.
  • a ring closure by binding between two cysteine residues is possible, for example, is present, e.g. a ring closure by binding between a cysteine residue derived from the N-terminal amino acid sequence of the TNF with a cysteine residue derived from the C-terminal amino acid sequence of the TNF; e.g. a ring closure by a disulfide bond between the respective sulfur molecules of the two cysteine residues.
  • the present invention provides a protein according to the present invention, wherein ring closure by binding between two cysteine residues is possible, e.g. the protein is a cyclic protein by binding between two cysteine residues.
  • a disulfide bond may e.g. hydrolytically or enzymatically, and whether a protein of the present invention is in cyclic or non-cyclic form depends on the environmental conditions, for example, a protein of the present invention may be present in biological environment in cyclic or non-cyclic form.
  • a protein according to the present invention may be present both in cyclic form as described herein and in non-cyclic form (no disfill binding) and is preferably in pure, isolated form in cyclic form.
  • no ring closure is formed by disulfide bonding between the respective sulfur molecules of two cysteine residues.
  • a protein of the present invention may be in free form or in the form of a salt, e.g. in the form of an acid addition salt, such as an acetate salt, or a trifluoroacetic acid salt, and in another aspect, the present invention provides a protein according to the invention in the form of a salt.
  • a protein according to the present invention can be conveniently prepared, e.g. analogous to a known method, such as by chemical synthesis by means of peptide chemistry or by microbial methods, for example as described herein.
  • a protein according to the present invention exhibits interesting biological activity and therefore can be used as a medicament.
  • the present invention provides a protein according to the present invention
  • Invention for use as a medicament e.g.
  • a protein according to the present invention in contrast to (human) TNF, have virtually no inflammatory or toxic properties.
  • human immune cells from the blood are mixed and incubated with protein according to the present invention in a low concentration and incubated in the usual way in the laboratory.
  • marker proteins for inflammation are determined by conventional methods.
  • a protein according to the invention e.g. a protein of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, such inflammatory proteins, such as. the inflammatory marker interleukin-6 (IL-6), can not be detected.
  • IL-6 interleukin-6
  • the present invention provides a method of preventing inflammation, eg, to avoid the formation of inflammatory markers such as IL-6 the medical use of proteins derived from the tumor necrosis factor, eg from the human tumor necrosis factor, which is characterized in that a protein according to the present invention is used.
  • a protein according to the present invention such as a protein of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, activates the epithelial ion channels, which is due to the change of the electrical voltage vs , Amperage is detectable.
  • a protein according to the present invention e.g. a protein of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 injected as a mist or in aqueous solution, it comes within 3 to 5 hours to a significant improvement in lung function, indicated by increased oxygen content in arterial blood.
  • a protein of the present invention can be used to treat edema, such as pulmonary edema.
  • the present invention provides a protein according to the present invention
  • the treatment of diseases associated with pulmonary function includes e.g. the activation of epithelial ion channels, the improvement of lung function and / or the treatment of edema, such as pulmonary edema, the treatment
  • ARDS - Acute Respiratory Distress Syndrome
  • SARS severe acute respiratory distress syndrome
  • IL-2 in respiratory-induced lung injury, lung transplantation, transfusion-associated lung injury, therapeutic administration of IL-2 or asthma, e.g. the activation of epithelial ion channels, the improvement of lung function and / or the treatment of edema, such as pulmonary edema.
  • the present invention provides a method for the treatment of diseases associated with pulmonary function, characterized in that a patient in need of such treatment is administered a sufficient amount of a protein according to the present invention ,
  • a patient as used herein includes mammals, e.g. People.
  • a protein of the present invention may be administered in the form of a pharmaceutical preparation.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation characterized in that it comprises a protein according to the present invention, eg in association with at least one pharmaceutically acceptable excipient, such as carriers or diluents, for example fillers, binders, improvers flow properties, lubricants, flavorings, sugars or sweeteners, perfumes, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, solubilizers, salts for regulating osmotic pressure and / or buffers (mixtures).
  • carriers or diluents for example fillers, binders, improvers flow properties, lubricants, flavorings, sugars or sweeteners, perfumes, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, solubilizers, salts for regulating osmotic pressure and / or buffers (mixtures).
  • a protein of the present invention for the treatment of diseases will depend very much on various parameters, such as the chemical nature and pharmacokinetics of the protein used, the individual patient, the disease to be treated, the mode of administration, but a successful daily dose in larger mammals, for example, an amount of 0.0001 g to 1.5 g, eg 0.001 mg / kg body weight to about 20 mg / kg body weight, a.
  • the application may be enteral or parenteral and is preferably parenteral.
  • a pharmaceutical preparation according to the present invention can be conveniently prepared, e.g. analogous to a known method, e.g. by mixing, granulation, coating, solution, lyophilization process.
  • FIG. 1A shows the HPLC chromatogram of the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. Units: y axis: absorption in mV; x-axis: time in minutes.
  • FIG. 1B shows the HPLC chromatogram of the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2. Units: y-axis: absorption in mAU x-axis: time in minutes.
  • Fig. 1C shows the HPLC chromatogram of the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 3. Units: y-axis: absorption in mAU x-axis: time in minutes.
  • Figure 2A right panel, shows the activation of sodium ion channels by a protein of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (shown as "Sequence 1" in the figure). designated) detected by patch clamp.
  • SEQ ID NO: 1 shown as "Sequence 1" in the figure. designated
  • Figure 2B right panel, shows the activation of sodium ion channels by a protein of the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 (referred to in the figure as "Sequence 2") detected by Patch Clamp Left Figure in Figure 2B in comparison without Protein Units: y-axis: current in pA, x-axis: time in seconds.
  • Figure 2C left panel, shows activation of sodium ion channels by a protein of amino acid sequence SEQ ID NO: 3 detected by Patch Clamp, compared to inhibition of ion channels by 10 ⁇ M amiloride (right panel).
  • Fig. 3A shows the increase of the oxygen content in the arterial blood after administration of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Fig. 3B shows the increase of the oxygen content in the arterial blood after administration of a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • Fig. 3C shows the increase of the oxygen content in the arterial blood after administration of a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 3. Units: y-axis: oxygen content in%; x-axis: measuring time in minutes.
  • a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 was synthesized fully automatically by means of Fmoc solid-phase synthesis in the following steps:
  • Cyclization was achieved by formation of a disulfide bridge between the side chains of the amino acids cysteine (position 6) and cysts (position 20). This is done, for example, by oxygen oxidation of the sulfur atoms in the side chains of the cysteine (position 6) and the cyst (position 20) to form a disulfide bridge, which leads to ring closure.
  • a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 was synthesized fully automatically in concluding steps by means of Fmoc solid-phase synthesis:
  • Cyclization was achieved by formation of a disulfide bridge between the side chains of the amino acids cysteine (position 4) and cysts (position 18). This is done, for example, by oxygen oxidation of the sulfur atoms in the side chains of the cysteine (position 4) and the cyst (position 18) to form a disulfide bridge, which leads to ring closure.
  • Example 3 Synthesis of a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 3
  • a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 was synthesized fully automatically by means of Fmoc solid-phase synthesis in the following steps:
  • the cyclization was achieved by forming a disulfide bridge between the side chains of the amino acids cysteine (position 1) and cysts (position 15). This is done, for example, by oxygen oxidation of the sulfur atoms in the side chains of the cysteine (position 1) and the cyst (position 15) to form a disulfide bridge, which leads to ring closure.
  • A549 cells are human lung epithelial cells involved in the diffusion of water and electrolytes in the lungs.
  • the cells were suspended in DMEM-F-12 medium containing 1% penicillin-streptomycin and 10% fetal calf serum, transferred to plastic cell culture vessels and cultured in incubator at 95% air and 5% CO 2 at 37 ° C.
  • the medium was changed 2 to 3 times a week.
  • the cells double in about 22 hours and a cell concentration of more than 7 x 10 4 cells per cm 2 was not exceeded.
  • Macroscopic currents and single channel currents were generated from A549 cells in the whole cell and cell-attached configuration of the patch-clamp technique (Hamill et al, Pflugers Arch.
  • Bath solution 135 mM sodium methanesulfonate, 10 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5.5 mM glucose, and 10 mM HEPES, pH 7.4.
  • Electrode solution 120 mM potassium methyl sulfonate, 15 mM KCl, 6 mM NaCl, 1 mM
  • the coverslips with the cells cultured thereon were transferred to a 1 ml test bath, fixed on the microscope stage (Axiovert 100, 400x magnification), and the Cells were superfused with the bath solution described above. The current was then removed from a suitable cell (which adheres to the coverslip).
  • a filled with an electrolyte solution microelectrode (glass capillary with a defined, heat polished Spitzenöffhung of about 1-3 microns, corresponds to a resistance of the electrode tip of 3-5 ⁇ ) placed on the cell and sucked the membrane, so that a "Gigaohm seal "between the membrane and the electrode to minimize leakage.”
  • electrolyte solution microelectrode glass capillary with a defined, heat polished Spitzenöffhung of about 1-3 microns
  • the derivation of the macroscopic currents can also be carried out using the "perforated patch clamp" technique
  • the ionophore amphotericin was added to the pipette solution, whereby the membrane became permeable under the peak opening and streams in the "whole cell”
  • a defined membrane holding potential was applied via a preamplifier (CV-4 Headstage, Axon Instruments) and amplifier (Axopatch ID, Axon Instr.) And the current flowing through the ion channels was measured ,
  • the pulse protocol consisted of hyperpolarization at -100 mV for 1 s at intervals of 5 s. Subsequently, the membrane was depolarized up to +100 mV in steps of 20 mV.
  • This protocol was carried out with addition of synthetic proteins having the amino acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, as well as with the sodium channel inhibitor amiloride.
  • the resulting current derivatives were stored and analyzed using the program PCLAMP 6.0. For this purpose, the current derivatives obtained in the presence of amiloride were subtracted from the previously registered currents, so that the amiloride-sensitive sodium current could be determined by the epithelial sodium channels.
  • Example 6 Experimental Animal Study Pulmonary Edema Male Wistar rats (weight 250 g to 350 g) are anesthetized with Rompun® (0.02 ml / 100 g) and Ketavet® (0.1 ml / 100 g). Ventilation takes place with a cycle of 72
  • the body temperature averages 37 ° C to 39 ° C. in the
  • Normal state PaO2 (arterial oxygen partial pressure) is 500 to 550 mm Hg.
  • arterial blood is taken from the animals (0.1 ml) and the percentage of oxygen in the standard value is determined.
  • a protein according to the invention e.g. a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO:
  • Pulmonary edema is induced.
  • the experimental procedure is described in Example 6. To objectify the measured values, 5 animals are used.
  • the oxygen content of the arterial blood becomes immediately before the lavage of the lungs, 60 minutes after the lavage of the lungs and 180 minutes after the lavage
  • the oxygen content immediately before lung irrigation is set at 100%.
  • FIG. 3A for a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, FIG.
  • FIG. 3B for a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, FIG.
  • FIG. 3C for a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • Fresh human blood is very sensitive to pro-inflammatory molecules, i.a. with the release of the inflammatory marker interleukin-6 (IL-6).
  • IL-6 interleukin-6
  • human fresh blood samples were incubated with different concentrations of the protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 in the following concentrations: 10 ⁇ g / ml, 3 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml. After incubation for 24 hours at 37 ° C., the inflammatory marker Interleukin-6 was quantified in the solution by ELISA. The positive control used was LPS.

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Abstract

Protein, das N-terminal aus einem oder mehreren C-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors, und C-terminal aus einem oder mehreren N-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors zusammengesetzt ist, das epitheliale Ionenkanäle aktiviert und die Lungenfunktion verbessert, und das zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Krankheiten, die mit der Lungenfunktion assoziiert sind, wie Ödeme, verwendet werden kann.

Description

Reverses Protein
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reverses Protein, nämlich ein Tumor Nekrose Faktor- Protein (Polypeptid), das N-terminal aus einem oder mehreren C-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors (TNF), und C-terminal aus einem oder mehreren N-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des TNF zusammengesetzt ist, wobei das Protein als Medikament verwendet werden kann, z.B. zum Aktivieren epithelialer Ionenkanäle, zur Verbesserung der Lungenfunktion, sowie zur Behandlung von Ödemen, wie Lungenödemen.
Der Flüssigkeitstransport durch Zellschichten und Gewebe beruht primär auf einem osmotischen Gradienten durch einen aktiven vektoriellen Ionentransport, z.B. Natriumtransport. Dieser wird hauptsächlich durch streng regulierten und vital bedeutenden Ionenkanäle, wie z.B. dem Epithelial Natrium- Kanal Komplex (ENaC), bewerkstelligt. Wasser folgt diesem Gradienten passiv, unter anderem durch spezielle- Wasserkanäle, wie dem Wasserkanal Aquaporin V. Für das Lungengewebe ist bekannt, dass basolateral an den pumpenden Zellen Na+/K+ ATPasen den vektoriellen Transport von Natrium ins Interstitium betreiben und schließlich die Ionen in die Lymph- und Blutgefässe an. Dieser Transport ist also aktiv und erfolgt unabhängig vom transpulmonalen Druck und der alveolären Proteinkonzentration.
Ein Ödem ist eine pathologische Flüssigkeitsansammlung in einem Organ, wie z.B. der Lunge, aber auch dem Gehirn oder der Haut. Bei einem Ödem in der Lunge spricht man von einem Lungenödem. Das Lungenödem basiert meist auf dem Ungleichgewicht zwischen Flüssigkeitsextravasation und Flüssigkeitsrückresorption. Sehr oft ist auch die Permeabilität des Lungengewebes geschädigt, sodass eine vermehrte Flüssigkeitszufuhr stattfindet, und sich die Flüssigkeit in den Lungenblässchen (Alveolen) ansammelt..
Eine solche Permeabilitätsstörung als Folge eines fehlenden Rücktransportes von Flüssigkeit aus den Lungenbläschen in das Interstitium ist besonders bedeutsam bei der Akuten Lungen Verletzung (engl. Acute Lung Injury, ALI) oder beim Akuten Respiratorischem Distress Syndrom (engl. Acute Respiatory Distress Syndrome, ARDS) oder beim schweren akuten Atemnotsyndrom (SARS), bei der Pneumonie und beim Multiorganversagen. Die Permeabilitätsstörung spielt aber auch eine Rolle bei anderen Lungenerkrankungen, wie Beatmung-induzierter Lungenschäden, Lungentransplantationen, Transfusion-assoziierten Lungenschäden, therapeutischer Gabe von IL-2 oder Asthma.
Als Ergebnis einer erhöhten Flüssigkeitsansammlung im Gewebe oder Organ, z.B. der Lunge, wird der notwendige Gasaustausch behindert oder völlig eingeschränkt. Es kommt kein Sauerstoff aus der Atemluft in das Blut, sodass durch Sauerstoffmangel lebensgefährliche Organschäden auftreten können.
Es gibt keine generelle Standardtherapie zur Behandlung für das Permeabilitätsödem. Allgemein bemüht man sich Patienten mit einem Lungenödem künstlich zu beatmen, um die Zufuhr von Sauerstoff ins Blut und somit zu den Organen zu gewährleisten.
Aus der DE 38 41 759 sind einzelne, vom TNF abgeleitete Peptide bekannt.
Von Carswell et al. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3666, 1975 wurde berichtet, dass das Serum von Endotoxin-behandelten Tieren, die zuvor mit dem Mycobacterien-Stamm Calmette-Guerin (BCG) infiziert worden waren, eine hämorrhagische Nekrose bei verschiedenen Tumoren in der Maus bewirkte. Diese Aktivität wurde dem Tumor Nekrose Faktor (TNF) zugeschrieben. TNF zeigt auch eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung gegenüber einer Vielzahl von transformierten Zelllinien in vitro, während normale menschliche und tierische Zelllinien davon nicht betroffen werden (M. R. Ruff et al, Lymphognes, Vol. II, Academic Press Inc., New York, 1981, pp 235-275). Die biochemische Charakterisierung und das Gen für menschlichen TNF wurde bereits beschrieben (D Pennica et al, Nature 312, 724, 1984; Aggarwal, B. B. et al, J. Biol. Chem. 260, 2334-2345, 1985; Nedwin, G.E. et al, Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Aus diesen Daten konnte die folgende Proteinstruktur für den humanen reifen Tumor Nekrose Faktor (TNF) abgeleitet werden: (NH2)VaI Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro VaI AIa His VaI VaI AIa Asn Pro GIn AIa GIu GIy GIn Leu GIn Tip Leu Asn Arg Arg AIa Asn AIa Leu Leu AIa Asn GIy VaI GIu Leu Arg Asp Asn GIn Leu VaI VaI Pro Ser GIu GIy Leu Tyr Leu He Tyr Ser GIn VaI Leu Phe Lys GIy GIn GIy Cys Pro Ser Thr His VaI Leu Leu Thr His Thr He Ser Arg He AIa VaI Ser Tyr GIn Thr Lys VaI Asn Leu Leu Ser AIa He Lys Ser Pro Cys GIn Arg GIu Thr Pro GIu GIy AIa GIu AIa Lys Pro Trp Tyr GIu Pro He Tyr Leu GIy GIy VaI Phe GIn Leu GIu Lys GIy Asp Arg Leu Ser AIa GIu He Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe AIa GIu Ser GIy GIn VaI Tyr Phe GIy He He AIa Leu(COOH)
Weiterhin wurde das TNF-Gen von Rind, Kaninchen und Maus beschrieben (Goeddel D. V. et al., CoId Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).
Neben seinen zytotoxischen Eigenschaften ist TNF mit hauptbeteiligt an entzündlichen Reaktionen (J.W. Larrick et al, Pharmac. Res. Vol. 5, No. 3, 129-139, 1988). Im Tiermodell konnte die Beteiligung von TNF beim septischen Schock (Torti F. M. et al, Science 229, 867-869, 1985) und der Graft versus Host Disease (Piguet, P F et al, J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) gezeigt werden.
Aus biochemischen Untersuchungen ist bekannt, dass das humane TNF aus verschiedenen strukturellen Elementen besteht, wie in TABELLE 1 aufgelistet:
TABELLE 1
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In Lucas R et al, Science (1994) Vol. 263. no. 5148, pp. 814 - 817 ist ein Peptid beschrieben, das von der Region Ser(99) bis GIu(116) des TNF abgeleitet wurde, und welches zur Behandlung von Ödemen vorgeschlagen wird. Dieses Peptid ist auch Gegenstand von WO 00/09149. Um dieses Peptid der WO 00/09149 jedoch nutzbar zu machen, musste artifiziell die Position Pro(lOO) durch die Aminosäure Cystein und die Position Cys(lθl) durch die Aminosäure Glycin ersetzt werden. Da das lineare Peptid Ser(99) bis GIu(116) keine erfindungsgemäße Wirkung hatte (Hribar M. et al., Eur. J. Immunol. (1999), Vol.29, 3105-3111; Braun C, J. Immunol. (2005), 175: 3402-3408; Fukuda N. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2001) 280: L1258-L1265), musste zusätzlich die Position GIu(116) durch die Aminosäure Cystein ersetzt werden, um die Struktur zu erhalten und um einen Ringschluss zwischen den beiden Aminosäuren Cystein zu ermöglichen.
Ein Nachteil des, in WO00/09149 beschriebenen, Peptides besteht darin, dass dieses Peptid artifizielle, nämlich so nicht in TNF enthaltende Aminosäuresequenzen enthält. Ein solches, mit artifiziellen Strukturen versehenes, Peptid wird durch das menschliche Immunsystem als körperfremd erkannt. Eine wiederholte oder andauernde Verabreichung eines solchen Peptides in medikamentöser Form kann lebensbedrohende Immunreaktionen hervorrufen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass sich ein Protein, das aus Teilen der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors (TNF) zusammengesetzt ist interessante biologische Eigenschaften aufweist, wobei ein solches Protein keine artifizielle Aminosäuresequenzen enthält.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reverses Tumor Nekrose Faktor- Protein zur Verfugung, z.B. ein Protein, das N-terminal aus einem oder mehreren C-terminalen Teilen, bevorzugt aus einem Teil, der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors, und C-terminal aus einem oder mehreren N-terminalen Teilen, bevorzugt aus einem Teil, der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors zusammengesetzt ist, z.B. in der Form eines Fusionsproteins.
Der reife Tumor Nekrose Faktor (TNF) wie hierin verwendet, ist bevorzugt der humane reife Tumor Nekrose Faktor.
Ein Protein, das gemäß vorliegender Erfindung zur Verfügung gestellt wird, wird hierin auch als „Protein gemäß (nach) vorliegender Erfindung" bezeichnet.
Teile der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors (TNF) werden hierin auch als „strukturellen Elementen des Tumor Nekrose Faktor (TNF)" bezeichnet.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein gemäß vorliegender Erfindung zur Verfügung, das N-terminal aus einem oder mehreren C-terminalen strukturellen Elementen des reifen Tumor Nekrose Faktor und C-terminal aus einem oder mehreren N-terminalen strukturellen Elementen des reifen Tumor Nekrose Faktor zusammengesetzt ist, z.B. in der Form eines Fusionsproteins.
Strukturellen Elemente des reifen Tumor Nekrose Faktor sind in TABELLE 1 definiert.
Ein Protein gemäß vorliegender Erfindung schliesst ein Fusionsprotein ein, zusammengesetzt aus Teilen der Aminosäuresequenz des humanen TNF wie oben definiert, z.B. aus strukturellen Elementen des TNF.
Es wurde weiterhin gefunden, dass es besonders vorteilhaft ist es, wenn ein Protein gemäß vorliegender Erfindung N-terminal aus den C-terminalen strukturellen Elementen ß-Strand 6 bis ß-Strand 10, oder ß-Strand 8 bis ß-Strand 9. des TNF, und C-terminal aus den N- terminalen strukturellen Elementen ß-Strand 2 bis ß-Strand 3, oder ß-Strand 3 des TNF abgeleitet ist, z.B. mit der Maßgabe, dass zumindest zwei Cysteinreste enthalten sind. Gemäß vorliegender Erfindung wurden besonders geeignete Proteine mit den Aminosäuresequenzen
SEQ ID:NO:1
(NH2)AIa-IIe-LyS-SCr-PrO-CyS-GIn-ATg-GIu-ThT-PrO-GIu-GIy-AIa-GIu-AIa-LyS-GIy-GIy- Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val(COOH);
SEQ ID:NO:2
(NH2)LyS-SCr-PrO-CyS-GIn-ATg-GIu-ThT-PrO-GIu-GIy-AIa-GIu-AIa-LyS-GIy-GIy-CyS-PrO- Ser(COOH), und
SEQ ID:NO:3
(NH2)CyS-GIn-ATg-GIU-ThT-PrO-GIU-GIy-AIa-GIU-AIa-LyS-GIy-GIy-CyS(COOH)
gefunden.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein gemäß vorliegender Erfindung mit der Aminosäuresequenz SEQ ID:NO:1, SEQ ID:NO:2 oder SEQ ID:NO:3 zur Verfügung.
In einem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID:NO 1 leitet sich der N-terminale Anteil des Proteins Ala(96) bis Lys(l 12) aus den C-terminalen strukturellen Elementen ß- Strand 6 bis ß-Strand 9 des humanen TNF ab, und der C-terminale Anteil Gly(68) bis Val(74) aus dem N-termialen strukturellen Element ß-Strand 2 und ß-Strand 3 des humanen TNF ab. Die Ziffern (96), (112), (68) und (74) bezeichnen die Positionen der Aminosäuren im humanen TNF.
In einem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID:NO 2 leitet sich der N-terminale Anteil des Proteins Lys(98) bis Lys(l 12) aus den C-terminalen strukturellen Elementen ß- Strand 7 bis ß-Strand 9 des humanen TNF, und der C-terminale Anteil des reversen Fusionsproteins Gly(68) bis Ser(71) aus dem N-termialen strukturellen Element ß-Strand 3 des humanen TNF ab. Die Ziffern (98), (112), (68) und (71) bezeichnen die Positionen der Aminosäuren im humanen TNF.
In einem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID:NO 3 leitet sich der N-terminale Anteil des Proteins Cys(lθl) bis Lys(112) aus den C-terminalen strukturellen Elementen ß- Strand 7 bis ß-Strand 9 des humanen TNF, und der C-terminale Anteil Gly(68) bis Cys(69) aus dem N-termialen strukturellen Element ß-Strand 3 des humanen TNF ab.
Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, dass in einem Protein gemäß vorliegender Erfindung ein Ringschluss durch Bindung zwischen zwei Cysteinresten ermöglicht ist, beispielsweise vorliegt, z.B. ein Ringschluss durch Bindung zwischen einem Cysteinrest, der aus der N-terminalen Aminosäuresequenz des TNF stammt, mit einem Cysteinrest, der aus der C- terminalen Aminosäuresequenz des TNF stammt; z.B. ein Ringschluss durch eine Disulfidbindung zwischen den jeweiligen Schwefelmolekülen der beiden Cysteinreste.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein gemäß vorliegender Erfindung zur Verfügung, worin ein Ringschluss durch Bindung zwischen zwei Cysteinresten ermöglicht ist, z.B. ist das Protein durch Bindung zwischen zwei Cysteinresten ein zyklisches Protein.
In den Proteinen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO:9 kommt es zwischen den beiden Cysteinen, die den Cysteinen Cys(lθl) und Cys(69) im humanen TNF entsprechen, zu einem Ringschluss.
Eine Disulfidbindung kann z.B. hydrolytisch oder enzymatisch aufgespaltet werden, und ob ein Protein gemäß vorliegender Erfindung in zyklischer oder nicht-zyklischer Form vorliegt, hängt von den Umgebungsbedingungen ab, beispielsweise kann ein Protein gemäß vorliegender Erfindung in biologischer Umgebung in zyklischer oder nicht-zyklischer Form vorliegen.
Ein Protein gemäß vorliegender Erfindung kann sowohl in zyklischer Form, wie hierin beschrieben, als auch in nicht-.zyklischer Form (keine Disfuldbindung) vorliegen und liegt bevorzugt in reiner, isolierter Form in zyklischer Form vor. In der Struktur des humanen TNF ist kein Ringschluss durch Disulfidbindung zwischen den jeweiligen Schwefelmolekülen zweier Cysteinreste ausgebildet.
Ein Protein gemäß vorliegender Erfindung kann in freier Form vorliegen, oder in der Form eines Salzes, z.B. in der Form eines Säureadditionssalzes, wie ein Acetatsalz, oder ein Trifluoressigsäuresalz und in einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein gemäß vorliegender Erfindung in der Form eines Salzes zur Verfügung.
Ein Protein gemäß vorliegender Erfindung kann in geeigneter Weise hergestellt werden, z.B. analog zu einem bekannten Verfahren, wie durch chemische Synthese mittels Peptidchemie oder mittels mikrobieller Verfahren, beispielsweise wie hierin beschrieben.
Es hat sich gezeigt, dass ein Protein gemäß vorliegender Erfindung interessante biologische Aktivität zeigt und daher als Medikament verwendet werden kann.
hi einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein gemäß vorliegender
Erfindung zur Verwendung als ein Medikament zur Verfügung, z.B.
Die Verwendung eines Proteins gemäß vorliegender Erfindung als ein Medikament.
Beispielsweise zeigen biologische Untersuchungen an humanen Zellen, dass ein Protein gemäß vorliegender Erfindung, auch im Unterschied zum (humanen) TNF, praktisch keine entzündlichen oder toxischen Eigenschaften aufweisen. Zur Untersuchung werden in laborüblicher Weise humane Immunzellen aus dem Blut mit Protein gemäß vorliegender Erfindung in geringer Konzentration gemischt und inkubiert. Anschließend werden mittels üblichen Methoden Markerproteine für Entzündungen bestimmt. Trotz Zugabe eines Proteins gemäß vorliegender Erfindung, z.B. ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3, können solche Entzündungsproteine, wie z.B. der Entzündungsmarker Interleukin-6 (IL-6), nicht nachgewiesen werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermeidung von Entzündungen, z.B. zu Vermeidung der Bildung von Entzündungsmarkern, wie IL-6, bei der medizinischen Anwendung von Proteinen, die vom Tumor Nekrosis Faktor, z.B. vom humanen Tumor Nekrosis Faktor, abgeleitet sind , zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Protein gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird.
Es ist weiterhin eine laborübliche Methode und zum Beispiel in Clunes M.T. et al, J Physiol Volume 557, Number 3, 809-819 (June 15, 2004) beschrieben, die Aktivierung von Ionenkanälen mittels Patch-Clamp Experimenten nachzuweisen. Für Patch-Clamp Untersuchungen von Ionenkanälen wird eine Glaskanüle dünn ausgezogene und mit neutraler Pufferlösung gefüllt. Die Glaskanüle (Patch-Clamp-Pipette) wird vorsichtig auf eine intakte epitheliale Zelle gedrückt. Unterhalb der Pipette befindet sich ein Stück Membran. Zwischen dem Inneren der Pipette und der Außenlösung entsteht dadurch ein elektrischer Widerstand. In die Pipettenlösung taucht eine Elektrode, die an einen empfindlichen Verstärker angeschlossen ist.
Es ist nun überraschend zu finden, dass ein Protein gemäß vorliegender Erfindung, wie ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3, die epithelialen Ionenkanäle aktiviert, was durch die Veränderung der elektrischen Spannung vs. Stromstärke nachweisbar ist.
Zur Simulation eines Akuten Lungenschadens und zur Bildung eines Lungenödems kann in laborüblicher Weise die Lunge von Versuchstieren, z.B. Mäusen oder Ratten, mehrmals mit angesäuerter Kochsalzlösung gespült werden (zum Beispiel gemäß Isik F. et al., Eur J Cardiothorac Surg (2005); 28: 301-305). Dadurch kommt es zur Herabsetzung der Lungenfunktion. Wird nun in die Lunge der Versuchstiere ein Protein gemäß vorliegender Erfindung, z.B. ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 als Nebel oder in wässriger Lösung injiziert, so kommt es innerhalb von 3 bis 5 Stunden zu einer deutlichen Verbesserung der Lungenfunktion, angezeigt durch gestiegenen Sauerstoffgehalt im arteriellen Blut.
Somit kann ein Protein gemäß vorliegender Erfindung zur Behandlung von Ödemen, wie Lungenödemen, verwendet werden. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein gemäß vorliegender
Erfindung zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Lungenfunktion assoziiert sind, zur
Verfügung, z. .B. die Verwendung eines Proteins gemäß vorliegender Erfindung zur Herstellung eines
Medikamentes zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Lungenfunktion assoziiert sind.
Die Behandlung von Krankheiten, die mit der Lungenfunktion assoziiert sind, schließt z.B. die Aktivierung epithelialer Ionenkanäle, die Verbesserung der Lungenfunktion und/oder die Behandlung von Ödemen, wie Lungenödemen, die Behandlung
- der Akuter Lungen Verletzung (engl. Acute Lung Injury, ALI),
- des Akuter Respiratorischen Distress Syndrom (engl. Acute Respiatory Distress Syndrome, ARDS),
- des schweren akuten Atemnotsyndrom (SARS),
- der Pneumonie,
- bei Multiorganversagen,
- bei Beatmung-induzierter Lungenschäden, bei Lungentransplantationen, Transfusion- assoziierterLungenschäden, therapeutischer Gabe von IL-2 oder Asthma ein, z.B. die Aktivierung epithelialer Ionenkanäle, die Verbesserung der Lungenfunktion und/oder die Behandlung von Ödemen, wie Lungenödemen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Lungenfunktion assoziiert sind, zur Verfugung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, eine ausreichende Menge eines Proteins gemäß vorliegender Erfindung verabreicht wird.
Ein Patient, wie hierin verwendet, schließt Säugetiere, z.B. Menschen ein.
Ein Protein gemäß vorliegender Erfindung kann in der Form einer pharmazeutischen Zubereitung verabreicht werden. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein e pharmazeutischen Zubereitung zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Protein gemäß vorliegender Erfindung umfasst, z.B. in Verbindung mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff, wie Träger oder Verdünnungsmittel, beispielsweise Füllstoffe, Bindemittel, Verbesserer der Fließeigenschaften, Gleitmittel, Geschmacksstoffe, Zucker oder Süßstoffe, Geruchsstoffe, Konservierungsstoffe, stabilisierend wirkende Stoffe, Netzmittel, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer(mischungen).
Die geeignete Menge eines Proteins gemäß vorliegender Erfindung zur Behandlung von Krankheiten wird natürlich sehr von verschiedenen Parametern abhängen, beispielsweise der chemischen Natur und der Pharmakokinetik des verwendeten Proteins, dem individiuellen Patienten, der zu behandelnden Krankheit, der Art der Anwendung, aber eine erfolgreiche tägliche Dosis in größeren Säugetieren schließt beispielsweise eine Menge von 0.0001 g bis 1.5 g ein, z.B. 0.001 mg/kg Körpergewicht bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht, ein. Die Anwendung kann enteral oder parenteral erfolgen und erfolgt bevorzugt parenteral. Eine pharmazeutische Zubereitung gemäß vorliegender Erfindung kann in geeigneter Weise hergestellt werden, z.B. analog einer bekannten Methode, z.B. durch Misch-, Granulier-, Beschichtungs-, Lösungs-, Lyophilisierungsverfahren.
Beschreibung der Abbildungen
Fig. IA zeigt das HPLC Chromatogramm des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1. Einheiten: y- Achse: Absorption in mV; x- Achse: Zeit in Minuten.
Fig. IB zeigt das HPLC Chromatogramm des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2. Einheiten: y-Achse: Absorption in mAU x-Achse: Zeit in Minuten.
Fig. IC zeigt das HPLC Chromatogramm des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3. Einheiten: y-Achse: Absorption in mAU x-Achse: Zeit in Minuten.
Fig. 2A, rechte Abbildung, zeigt die Aktivierung von Natrium Ionenkanälen durch ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 (in der Abbildung als „Sequenz 1" bezeichnet), detektiert durch Patch Clamp. Linke Abbildung in der Fig. 2A im Vergleich, ohne Protein. Einheiten: y-Achse: Stromstärke in pA; x-Achse: Zeit in Sekunden.
Fig. 2B, rechte Abbildung, zeigt die Aktivierung von Natrium Ionenkanälen durch ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 (in der Abbildung als „Sequenz 2" bezeichnet), detektiert durch Patch Clamp. Linke Abbildung in der Fig. 2B im Vergleich ohne Protein. Einheiten: y-Achse: Stromstärke in pA; x-Achse: Zeit in Sekunden.
Fig. 2C, linke Abbildung zeigt die Aktivierung von Natrium Ionenkanälen durch ein Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3, detektiert durch Patch Clamp, im Vergleich zur Hemmung der Ionenkanäle durch 10 μM Amilorid (rechte Abbildung). Einheiten: y-Achse: Stromstärke in pA; x-Achse: Zeit in Sekunden.
Fig. 3A zeigt die Erhöhung des Sauerstoffgehalts im arteriellen Blut nach Verabreichung eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1. Einheiten: y-Achse: Sauerstoffegehalt in %; x-Achse: Messzeitpunkt in Minuten.
Fig. 3B zeigt die Erhöhung des Sauerstoffgehalts im arteriellen Blut nach Verabreichung eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2. Einheiten: y-Achse: Sauerstoffegehalt in %; x-Achse: Messzeitpunkt in Minuten.
Fig. 3C zeigt die Erhöhung des Sauerstoffgehalts im arteriellen Blut nach Verabreichung eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3. Einheiten: y-Achse: Sauerstoffegehalt in %; x-Achse: Messzeitpunkt in Minuten.
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:
TFA Salz Salz der Trifluoressigsäure Beispiel 1: Synthese eines Proteins mit der mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO :1
Ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 wurde mittels Fmoc- Festphasensynthese vollautomatisch in folgenden Schritten synthetisiert:
Figure imgf000014_0001
Die Zyklisierung wurde durch Herausbildung einer Disulfidbrücke zwischen den Seitenketten der Aminosäuren Cystein (Position 6) und Cysten (Position 20) erreicht. Dies erfolgt zum Beispiel durch Sauerstoffoxidation der Schwefelatome in den Seitenketten des Cysteins (Position 6) und des Cystens (Position 20) unter Herausbildung einer Disulfidbrücke, was zum Ringschluss führt.
Anschließend wurde das Protein mittels Reverser HPLC untersucht, wobei das Ergebnis, wie in Fig. IA gezeigt, erhalten wurde.
Beispiel 2: Synthese eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO :2
Ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 wurde mittels Fmoc- Festphasensynthese vollautomatisch in folgernden Schritten synthetisiert:
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Die Zyklisierung wurde durch Herausbildung einer Disulfidbrücke zwischen den Seitenketten der Aminosäuren Cystein (Position 4) und Cysten (Position 18) erreicht. Dies erfolgt zum Beispiel durch Sauerstoffoxidation der Schwefelatome in den Seitenketten des Cysteins (Position 4) und des Cystens (Position 18) unter Herausbildung einer Disulfidbrücke, was zum Ringschluss führt.
Anschließend wurde das Protein mittels Reverser HPLC untersucht, wobei das Ergebnis, wie in Fig. IB gezeigt, erhalten wurde:
Beispiel 3: Synthese eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3
Ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3 wurde mittels Fmoc- Festphasensynthese vollautomatisch in folgenden Schritten synthetisiert:
Figure imgf000015_0002
Die Zyklisierung wurde durch Herausbildung einer Disulfidbrücke zwischen den Seitenketten der Aminosäuren Cystein (Position 1) und Cysten (Position 15) erreicht. Dies erfolgt zum Beispiel durch Sauerstoffoxidation der Schwefelatome in den Seitenketten des Cysteins (Position 1) und des Cystens (Position 15) unter Herausbildung einer Disulfidbrücke, was zum Ringschluss führt.
Anschließend wurde das Protein mittels Reverser HPLC untersucht , wobei das Ergebnis, wie in Fig. IC gezeigt, erhalten wurde:
Beispiel 4: Zellkultur
Die elektrophysiologischen Experimente wurden an humanen A549 Zellen (ATTC Nr. CCL- 185) durchgeführt. A549 Zellen sind humane Lungenepithelzellen, die an der Diffusion von Wasser und Elektrolyten in der Lunge beteiligt sind.
Die Zellen wurden in DMEM-F- 12 Medium mit 1% Penicillin-Streptomycin und 10% fötalem Kälberserum suspendiert, in Plastizellkulturgefäße überführt und im Inkubator bei 95% Luft und 5% CO2 bei 37°C kultiviert. Das Medium wurde 2- bis 3-mal in der Woche gewechselt. Die Zellen verdoppeln sich in ca. 22 Stunden und eine Zellkonzentration von über 7 x 104 Zellen pro cm2 wurde nicht überschritten.
Beispiel 5: Aktivierung von Ionenkanälen humaner Epithelzellen durch Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 odeer SEQ ID NO:3
Makroskopische Ströme und Einzelkanalströme wurden von A549 Zellen in der "whole cell" und "cell-attached" Konfiguration der"Patch-clamp" Technik (Hamill et al, Pflugers Arch.
1981, 391(2):85-100., 1981) abgeleitet. Für die Stromableitungen in der "whole cell"
Konfiguration wurden folgende Bad- und Elektrodenlösungen verwendet:
Badlösung: 135 mM Natrium Methansulfonat, 10 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaC12, 2 mM MgC12, 5.5 mM Glucose, und 10 mM HEPES, pH 7.4.
Elektrodenlösung: 120 mM Kaliummethylsulfonat, 15 mM KCl, 6 mM NaCl, 1 mM
Mg2ATP, 2 mM Na3ATP, 10 mM HEPES, and 0.5 mM EGTA (pH 7.2).
Die Deckgläser mit den darauf kultivierten Zellen wurden in ein 1 ml fassendes Versuchsbad transferiert, auf dem Mikroskoptisch (Axiovert 100, 400-fache Vergrößerung) fixiert und die Zellen mit der oben beschriebenen Badlösung superfundiert. Sodann wurde von einer geeigneten Zelle (welche am Deckglas haftet) der Strom abgeleitet. Dazu wurde eine mit einer Elektrolytlösung gefüllte Mikroelektrode (Glaskapillare mit einer definierten, Hitzepolierten Spitzenöffhung von ca. 1-3 μm, entspricht einen Widerstand der Elektrodenspitze von 3-5 Ω) auf die Zelle aufgesetzt und die Membran angesaugt, sodass ein „Gigaohm-Seal" zwischen Membran und Elektrode gebildet wurde, um den Leckstrom zu minimieren. In der „cell-attached"-Konfiguration kann der Strom durch einzelne Ionenkanäle unter der Elektrodenspitze gemessen werden. Bei der „whole celF'-Konfϊguration wurde die Membran unter der Elektrodenspitze durchbrochen, damit der Strom, der durch alle Ionenkanäle der Zelle fließt, gemessen werden kann. Die Ableitung der makroskopischen Ströme kann auch mit Hilfe der „perforated patch clamp" Technik durchgeführt werden. Bei der „whole cell" Ableitung wurde der Ionophor Amphotericin der Pipettenlösung zugesetzt, wodurch die Membran unter der Spitzenöffhung durchlässig wurde und Ströme in der „whole cell" Konfiguration abgeleitet werden können. Bei Erhalt eines Gigaohm-Seals wurde über einen Vorverstärker (CV-4 Headstage, Axon Instruments) und Verstärker (Axopatch ID, Axon Instr.) ein definiertes Membranhaltepotential angelegt und der Strom, der dabei durch die Ionenkanäle fließt, gemessen.
Das Pulsprotokoll bestand aus einer Hyperpolarisation auf -100 mV für 1 s im Abstand von 5 s. In weiterer Folge wurde dann in Schritten von 20 mV schließlich die Membran bis zu +100 mV depolarisiert. Dieses Protokoll wurde unter Zugabe von synthetischen Proteinen mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3, sowie mit dem Natriumkanal-Inhibitor Amilorid durchgeführt. Die so erhaltenen Stromableitungen wurden gespeichert und mit Hilfe des Programms PCLAMP 6.0 analysiert. Dazu wurden die, unter Anwesenheit von Amilorid erhaltenen, Stromableitungen von den vorher registrierten Strömen subtrahiert, sodass der Amilorid-sensitive Natriumstrom durch die epithelialen Natriumkanäle ermittelt werden konnte.
Die Resultate, in denen die Aktivierung der Natrium Ionenkanäle durch die Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 gezeigt wird, sind aus Fig. 2A, Fig. 2B und Fig. 2C ersichtlich.
Beispiel 6: Experimentelle Tierstudie Lungenödem Männliche Wistar Ratten (Gewicht 250 g bis 350 g) werden mit Rompun® (0,02 ml/100g) und Ketavet® (0,1 ml/ 100g) anästhesiert. Die Beatmung erfolgt mit einem Zyklus von 72
Stößen / Minute, bei einer Einatmungszeit von 0,2 Sekunden und einer Ausatmungszeit von
0,5 Sekunden. Die Körpertemperatur beträgt durchschnittlich 37°C bis 39°C. Im
Normalzustand beträgt der PaO2 (arterieller Sauerstoffpartialdruck) 500 bis 550 mm Hg.
Zur Simulation eines Akuten Lungenschadens und zur Bildung eines Lungenödems wird die
Lunge 7 bis 9 mal mit angesäuerter Kochsalzlösung (pH 5) gespült.
Nach einer Stunde werden jeweils die Proteine mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3, gelöst in steriler Kochsalzlösung, intratracheal als Nebel verabreicht (Maximales verabreichtes Volumen 0,5 ml).
In einem Abstand von jeweils 60 Minuten wird den Tieren arterielles Blut entnommen (0,1 ml) und der Sauerstoffgehalt in % zum Normalwert bestimmt.
Nach Verabreichung eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO:2 oder SEQ ID NO:3 ist der Sauerstoffanteil im Blut erhöht, wie aus Fig. 3 A, Fig.3B oder Fig.3C ersichtlich, siehe auch Beispiel 7.
Beispiel 7: Verbesserung der Lungenfunktion
Der Nachweis der stimulierenden Wirkung eines Proteins gemäß vorliegender Erfindung, z.B. eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 oder SEQ ID
NO:3, auf die Lungenfunktion erfolgt mittels tierexperimentellen Studien, in welchem ein
Lungenödem induziert wird. Die experimentelle Vorgehensweise ist im Beispiel 6 beschrieben. Zur Objektivierung der Messwerte werden jeweils 5 Tiere verwendet.
Zur intratrachealen Inhalation werden jeweils 125 μg Protein in 150 mM Kochsalzlösung pH
7,3 aufgelöst. Der Sauerstoffgehalt des arteriellen Blutes wird unmittelbar vor der Spülung der Lungen, 60 Minuten nach der Spülung der Lungen und 180 Minuten nach Spülen der
Lunge gemessen.
Der Sauerstoffgehalt unmittelbar vor dem Lungenspülen wird mit 100% festgelegt. 60
Minuten nach dem jeweils letzen Lungenspülen beträgt der Sauerstoffgehalt im Blut durchschnittlich nur 20%. Innerhalb von 3 Stunden erhöhte sich der prozentuale
Sauerstoffgehalt aufwerte von
60% bei Behandlung mit einem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, 63% bei Behandlung mit einem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2, bzw. 70% bei Behandlung mit einem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3. Ohne Zugabe von Protein kommt es innerhalb von 180 Minuten nach Lungenspülung zu keiner Verbesserung der Lungenfunktion (Sauerstoffgehalt 20%). Die Resultate sind dargestellt in
- Fig. 3 A für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 ,
- Fig. 3B für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2,
- Fig. 3 C für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3.
Beispiel 8: Bestimmung von Entzündungsparametern
Frisches menschliches Blut reagiert sehr empfindlich auf pro-entzündliche Moleküle, u.a. mit der Freisetzung des Entzündungsmarkers Interleukin-6 (IL-6). Zur Bestimmung der proentzündlichen Reaktion, wurden menschliche Frischblutproben mit unterschiedlichen Konzentrationen des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3 in folgender Konzentrationen inkubiert: 10 μg/ml, 3 μg/ml, 1 μg/ml. Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 37°C wurde in der Lösung der Entzündungsmarker Interleukin-6 mittels ELISA quantitativ bestimmt. Als Positivkontrolle diente LPS.
Dabei wurden die Messdaten, die in TABELLE 2 angegeben sind und die den Einfluss des Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3 im Vergleich mit LPS zeigen, erhalten.
TABELLE 2
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Die Messdaten in TABELLE 2 zeigen, dass durch eine Inkubation von menschlichem Frischblut mit einem Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3 praktisch kein Entzündungsmarker IL-6 freigesetzt und somit keine Entzündungsreaktion ausgelöst wird. Demgegenüber bewirkt eine Inkubation mit LPS als Positivkontrolle eine starke Freisetzung des Entzündungsmarkers Interleukin-6.

Claims

Patentansprüche
1. Protein, das N-terminal aus einem oder mehreren C-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors, und C-terminal aus einem oder mehreren N-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des reifen Tumor Nekrose Faktors zusammengesetzt ist.
2. Protein nach Anspruch 1, das N-terminal aus einem oder mehreren C-terminalen strukturellen Elementen des reifen Tumor Nekrose Faktor und C-terminal aus einem oder mehreren N-terminalen strukturellen Elementen des reifen Tumor Nekrose Faktor zusammengesetzt ist, mit der Maßgabe, dass zumindest zwei Cysteinreste enthalten sind.
3. Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das N-terminal aus den C-terminalen strukturellen Elementen ß-Strand 6 bis ß-Strand 10, oder ß-Strand 8 bis ß-Strand 9, des des reifen Tumor Nekrose Faktor, und C-terminal aus den N-terminalen strukturellen Elementen ß-Strand 2 bis ß-Strand 3, oder ß-Strand 3 des des reifen Tumor Nekrose Faktor abgeleitet ist.
4. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID:NO:1
(NH2)Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly- Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His- VaI(COOH);
SEQ ID:NO:2
(NH2)LyS-SCr-PrO-CyS-GIn-ATg-GIU-ThT-PrO-GIu-GIy-AIa-GIu-AIa-LyS-GIy-GIy-CyS- Pro-Ser(COOH); und SEQ ID:NO:3 (NH2)Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-Gly-Cys(COOH).
5. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin ein Ringschluss durch Bindung zwischen zwei Cysteinresten ermöglicht ist..
6. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Verwendung als Medikament.
7. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Behandlung von Krankheiten die mit der Lungenfunktion assoziiert sind.
8. Protein gemäß Anspruch 7, zur Verbesserung der Lungenfunktion und/oder zur Behandlung von Ödemen, wie Lungenödemen.
9. Verfahren zur Behandlung von Krankheiten die mit der Lungenfunktion assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, eine ausreichende Menge eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 verabreicht wird.
10. Pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5umfasst.
11. Verfahren zur Vermeidung von Entzündungen bei der medizinischen Anwendung von Proteinen, die vom Tumor Nekrosis Faktorabgeleitet sind, dadurch gekennzeichnet, dass ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 verwendet wird.
PCT/AT2008/000447 2007-12-12 2008-12-12 Reverses protein Ceased WO2009073908A1 (de)

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