WO2009079921A1

WO2009079921A1 - Saponines triterpénoïdes de cucurbitane, composition pharmaceutique de celles-ci, leur préparation et leur utilisation

Info

Publication number: WO2009079921A1
Application number: PCT/CN2008/001955
Authority: WO
Inventors: Yang Ye; David E. James; Ying Leng; Minjia Tan; Jiming Ye; Xiao Liu; Changqiang Ke; Ying Feng; Tong Chen; Xiqiang Li
Original assignee: Garvan Institute of Medical Research; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Garvan Institute of Medical Research; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-12-01
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2010-05-30
Also published as: CN101450963B; CN101450963A

Description

葫芦烷型三萜皂苷化合物、其药物组合物

及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，更具体而言，涉及一类从苦瓜中提取的葫芦烷型三萜皂苷化合物、其药物组合物及其制备方法和在预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂中的应用。

背景技术

世界上糖尿病患者已超过 1.5亿，预计到 2025年将达 3亿。而其中主要为 II型糖尿病患者（ T2D )。由于 II型糖尿病的主要代谢异常表现为胰岛素抵抗，因此，胰岛素增敏剂，即通过改善胰岛素抵抗而达到治疗糖尿病药物，是目前糖尿病药物研究的热点之一。现有两条药理学途径可以改善胰岛素抵抗：一是通过过氧化物酶体增生物激活受体（PPARs ), 或者通过一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活剂（ AMPK )。目前常用的两类药物为噻唑烷二酮类（ TZDs ) 和双胍类药物。噻唑烷二酮类虽被广泛使用但是有许多不良反应，如肥胖、液体渚留和心衰等。双胍类的二甲双胍不引起肥胖，但因其主要作用于肝脏，而不是肌肉，所以它并不是一个令人满意的治疗糖尿病的方法。寻找更理想的胰岛素增敏剂是当前世界上糖尿病药物研究的热点。

目前，世界上有超过 10亿的成人超重，其中的 3亿人为肥胖患者，而且呈急剧上升的趋势，同时也导致肥胖相关疾病（如 II型糖尿病、心脏病、中风和高血压等）发病率的不断升高。造成超重和肥胖的主要原因是高脂高热饮食、缺乏运动和城市化进程地加快。目前市场上只有两个批准上市可长期使用的减肥药物：一是奥利司他，为特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，但其具有非常普遍的胃肠道不良反应；二是西布曲明，为单胺再摄取的抑制剂，但其会升高血压和加快心率。因此，寻找安全和有效的减肥药物是当前迫切需要解决的问题。

苦瓜（Moworafca L. ) 为葫芦科苦瓜属植物。长期以来，我国民间将苦瓜广泛应用于清热解毒、明目解毒、健胃消渴、緩泻、驱虫等疾病。苦瓜中化学成分包括三萜皂苷、脑苷、蛋白质等。关于苦瓜降血糖作用的报道非常广泛。

国际专利申请 WO0061619报道了苦瓜多肽 K具有降低血糖、降低血脂、緩解疼痛和炎症、降低血压以及增加免疫力的作用。 W09843484报道了苦瓜多肽 MC6及其衍生物具有口服降糖作用。它们报道的均是苦瓜中所含多肽化合物的活性。

中国专利 CN1069534C《天然苦瓜素降糖药及其制备方法》中没有说明天然苦瓜素降糖药的化学成分，并且没有明确其胰岛素增敏作用； CN1098858C《苦瓜素的提取工艺》中没有确定苦瓜素的结构，并且没有明确其对于 I、 II型糖尿病的活性。中国专利申请 CN1528785A《一种苦瓜降血糖提取物（KGE )的树脂制备方法》中所获得的提取物 KGE成分复杂，而没有阐明其化学成分。中国专利申请 CN1520838A《苦瓜提取物植物胰岛素；苦瓜皂甙的新用途》中所述制作工艺复杂，并且所获得的提取物成分多而杂，同时也没有明确该提取物的组成。中国专利 CN1209155C《含降血糖活性成分的苦瓜制品的制备》中所述用苦瓜汁做成的不同剂型的苦瓜制品，其所含成分极为复杂，同时专利中提供的多酚氧化酶、蛋白质电泳检测、薄层层析等方法也不足以说明其活性成分以及进行相应的质量控制。

综上所述，在现有技术中都没有涉及具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂生物活性的从苦瓜中提取的葫芦烷型三萜皂苷具体化合物、其化学结构及其药理学数据。发明内容

针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的一个目的是提供一类从苦瓜中提取的具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性的葫芦烷型三萜皂苷化合物。

本发明的又一目的是提供一种含有治疗有效量的上述三萜皂苷类化合物的药物组合物。

本发明的还一目的是提供一种从苦瓜中提取和分离上述三皂苷类化合物及其药物组合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述三萜皂苷类化合物及其药物组合物在制备预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂药物中的应用。

上述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防和治疗糖尿病药物的应用中为肌肉和脂肪细胞葡萄糖摄取促进剂、胰岛素增敏剂、葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜促进剂、一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活剂、脂肪酸氧化代谢促进剂或胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性改善剂。

上述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防和治疗肥胖药物的应用中为一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活剂或脂肪酸氧化代谢促进剂。

上述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防和治疗高血脂药物的应用中为血浆甘油三酯和游离脂肪酸水平降低剂或脂代谢紊乱状态下的脂耐量改善剂。

本发明提供的一类具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性的从苦瓜中提取的三萜皂苷类化合物，其具有如下结构式 I所示的结构：

其中，为氢、 β-D-葡萄吡喃糖基、 β-D-阿洛吡喃糖基、 β-D- 葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) _ β - D -葡萄吡喃糖基或 β - D -木吡喃糖基（ 1→4 ) - [β- D-葡萄吡喃糖基 ( 1→6) ] - β- D-葡萄吡喃糖基；

R₂为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₃为羟基或氢；

R₄为羟基、氢、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或 β- D-阿洛吡喃糖氧基； R₅为羟基或氢；

R₆为羟基、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或氢；

R₇为甲基或醛基；

或可选择地， C5和 C6、 C6和 C7、 C22和 C23、 C23和 C24、 C24和 C25、 C25和 C27形成双键；

且在 R₃、 R₄、 R₅为羟基的情况下， C22、 C23、 C24的手性为 S、 S、构型；

在 R₄、 R₅为羟基以及 R₃为氢的情况下， C23、 C24的手性为 8、 S构型；在 R₃为羟基， R₄为 β- D-葡萄吡喃糖氧基情况下， C22和 C23为 S, S 构型；

在 R₇为甲基的情况下， C5和 C19可以由氧桥相连；

且当为氢、 β- D-葡萄吡喃糖基（ 1→6) - β- D-葡萄吡喃糖基或 β- D-木吡喃糖基（ 1→4) - [β- D -葡萄吡喃糖基（ 1→6) ] - β- D -葡萄吡喃糖基， R₂为氢， R₃、 R₄、 R₅、 R₆为羟基， C5和 C6形成双键时， R₇不为甲基;

当 R₂、 R₆为羟基，、 R₃、 R₄、 R₅为氢，且 C5和 C6、 C23和 C24形成双键时， R₇不为醛基；

当为 β - D -葡萄吡喃糖基或 β - D -阿洛吡喃糖基， R₂、 R₅、 R₆为氢， R₃为羟基， R₇为甲基，且 C6和 C7、 C24和 C25形成双键， C5和 C19由氧桥相连时， R₄不为 β - D -阿洛吡喃糖氧基。

本发明提供的一种预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的上述结构式 I所示的从苦瓜中分离得到的三萜皂苷化合物中的一种或多种。此外，该组合物可进一步包含已知化合物大豆脑苷 I ( soya-cerebroside I )、苦瓜脑苷 ( momor-cerebroside )、三 3, 7,25-三^:基葫芦烷 -5,23 ( E ) -二烯 - 19-醛、 22 ( S ) ,23 ( R ) ,24 ( R ) ,25-四羟基葫芦烷 -5- 玲、三急苷 momordicoside A、 momordicoside B、 momordicoside M 或 momordicoside N ( Magnetic Resonance In Chemistry, 2007, 63, 615-621 ) 中的一种或多种，它们的具体结构式分别为：

大豆脑苷 I 苦瓜脑苷

3,7,25-三羟基葫芦烷 -5,23 ( E ) -二烯 -19-酪

22 ( S) ,23 (R ) ,24 (R ) ,25-四羟基葫芦烷 -5-烯苷 momordicoside B

momordicoside M momordicoside N。本发明提供的上述预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂的药物组合物，所述的化合物来自苦瓜活性部位的提取物，该提取物通过如下步骤制得（制备流程图如图 1所示）：

(a)用醇、水或其混合物浸泡苦瓜样品，过滤后得到提取液；其中所述的醇为甲醇或乙醇；

(b)将得到的提取液中的溶剂蒸发形成浆状物；

(c)将水加入到该浆状物中，得到总提取物的水混悬液；

(d)用氯仿、二氯甲烷或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到氯仿、二氯甲烷或其混合物的萃取物；然后，进一步用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取物；

(e)将正丁醇萃取物浓缩后，进行大孔树脂层析，分别用纯水、体积比为 30:70醇 /纯水混合物、体积比为 95:5醇 /纯水混合物进行洗脱；其中所述的醇为甲醇或乙醇；

(f)将体积比为 95:5醇 /纯水混合物洗脱得到的洗脱液蒸发至干，即得活性部位提取物 KG8。上述得到的苦瓜活性部位提取物 KG8, 经过层析分离后，可以制得本发明的三萜皂苷类化合物。

上述三萜皂苷类化合物在制备肌肉和脂肪细胞葡萄糖摄取、促进葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜、增加一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK )活性、促进脂肪酸氧化代谢、改善胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性、降低血浆甘油三酯和游离脂肪酸水平或改善脂代谢紊乱状态下脂耐量药物中的应用。上述三萜皂苷类化合物具有促进肌肉和脂肪细胞葡萄糖摄取和胰岛素增敏作用，对于 I型和 II型糖尿病均具有稳定的降血糖活性，并能够预防 /治疗肥胖和高血脂。因此，本发明的上述的葫芦烷型三萜皂苷化合物及其药物组合物为肌肉和脂肪细胞葡萄糖摄取促进剂、促进葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜激动剂、一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK ) 激活剂、促进脂肪酸氧化代谢、改善胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性、降低血浆甘油三酯和游离脂肪酸水平、改善脂代谢紊乱状态下脂耐量的药物。

3T3-L1脂肪细胞实验中， KG8对脂肪细胞短期和长期都有刺激葡萄糖摄取的作用，说明 KG8能够增加胰岛素的敏感性。在 I型糖尿病模型四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠中， KG8在 25mg/kg的给药水平即有明显的降血糖效果。在 Ob/Ob小鼠糖尿病模型中， KG8能长期稳定的降低小鼠血糖。实验证明 KG8 具有明显的胰岛素增敏的作用，并且对 I型和 II型糖尿病均有较好的降血糖作用。在胰岛素抵抗状态下的小鼠葡萄糖耐受性实验中， KG8和化合物 F能明显改善葡萄糖不耐受。在化合物对葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜活性测试实验中，化合物能显著促进肌肉和脂肪细胞内葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜。在一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK ) 活性实验中，化合物 A和 F能显著增强 AMPK激酶活性。在小鼠葡萄糖利用实验中，化合物 F 能显著促进小鼠葡萄糖利用。本发明的化合物具有促进肌肉和脂肪细胞葡萄糖摄取和胰岛素增敏作用而降低血糖的活性。在小鼠能量消耗和脂肪酸氧化代谢急性影响中， KG8和化合物 F能显著促进小鼠急性脂肪酸氧化代谢和整体能量消耗而具有治疗肥胖的效果。

对高脂饮食诱导肥胖（DIO )小鼠胰岛素敏感性和脂代谢的影响实验中， KG8能明显改善 DIO小鼠的脂耐量，降低血浆甘油三酯、游离脂肪酸水平。 KG8对 Ob/Ob小鼠的糖尿病治疗作用， KG8能够显著降低小鼠血浆和肝脏甘油三酯水平。本发明化合物的组合物能够通过降低甘油三酯、游离脂肪酸水平从而治疗高脂血症。

附图说明

图 1是 KG8的制备流程图。

图 2是化合物 A - I的分离流程图。

图 3是 KG8对 3T3 - L1细胞葡萄糖摄取的影响图。

图 4是 KG8对 Ob/Ob小鼠血浆甘油三酯的影响图。

图 5是 KG8对 Ob/Ob小鼠肝脏甘油三脂的影响图。

图 6 是 KG8改善胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性实验图。

图 7 是 KG8 对 HF小鼠脂肪酸氧化代谢影响图。

图 8是 KG8对 DIO小鼠脂耐量的影响图。

图 9是 KG8对 DIO小鼠血浆甘油三酯的影响图。

图 10是 KG8对 DIO小鼠血浆游离脂肪酸的影响图。

图 11是 KG8对 DIO小鼠口服糖耐量的影响图（血浆葡萄糖浓度）。图 12是 KG8对 DIO小鼠口服糖耐量的影响图（血浆胰岛素浓度）。图 13是 KG8对 DIO小鼠胰岛素耐量的影响图（血浆葡萄糖浓度）。图 14是 KG8对 DIO小鼠胰岛素耐量的影响图（血糖下降百分率）。图 15是化合物对葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜活性测试图。图 16是化合物 A、 F对一磷酸腺苷激活蛋白激酶（ AMPK )活性测试图。图 17是化合物 F对小鼠能量消耗和脂肪酸氧化代谢急性影响图。

图 18是化合物 F对小鼠葡萄糖利用图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

I、概要

本发明提供从苦瓜中分离获得的三萜皂苷类化合物及其药物组合物，其制备方法以及在糖尿病、肥胖和高血脂的预防和治疗中的应用。

本发明所述的预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性指的是能够促进肌肉及脂肪细胞葡萄糖吸收、抵抗及降低空腹和餐后高血糖浓度、具有胰岛素类似物样作用以及胰岛素增敏作用、促进葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )上膜、增加一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK ) 活性、促进脂肪酸氧化代谢、改善胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性、降低血浆甘油三酯和游离脂肪酸水平和改善脂代谢紊乱状态下脂耐量。

Π、化合物

本发明提供一类从苦瓜中提取的具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性的三萜皂苷类化合物。本领域技术人员不难理解，本发明涉及拥有不对称碳原子（手性中心）或双键的一些化合物，以及含有这些化合物的消旋物，这些化合物的非对映体、对映体、几何异构体。

本发明的三萜皂苷类化合物具有如下结构式 I所示的结构：

其中，为氢、 β-D-葡萄吡喃糖基、 β-D-阿洛吡喃糖基、 β-D- 葡萄吡喃糖基 ( 1→6) _β- D-葡萄吡喃糖基或 β- D-木吡喃糖基（ 1→4) - [β- D-葡萄吡喃糖基 ( 1→6) ] - β- D-葡萄吡喃糖基；

R₂为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₃为羟基或氢；

R₆为羟基、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或氢；

R₇为甲基或醛基；

且在 R₃、 R₄、 R₅为羟基的情况下， C22、 C23、 C24的手性为 S、 S、 R 构型；

在 R₇为甲基的情况下， C5和 C19可以由氧桥相连；

且当为氢、 β- D-葡萄吡喃糖基（ 1→6) - β- D-葡萄吡喃糖基或 β- D-木吡喃糖基（1→4) - [β- D-葡萄吡喃糖基（1→6) ]- β- D-葡萄吡喃糖基， R₂为氢， R₃、 R₄、 R₅、 R₆为羟基， C5和 C6形成双键时， R₇不为甲基;

本发明的化合物为天然产物，在一个优选的实施方案中，通式 I的化合物为具有如下结构式 la的化合物：

其中， Ri为 β - D -葡萄吡喃糖基或 β - D -阿洛吡喃糖基或氢；

R₃为羟基或氢；

R₄为羟基、氢、 β - D -葡萄吡喃糖氧基或 β - D -阿洛吡喃糖氧基；

R₅为羟基或氢；

R₆为羟基、 β - D -葡萄吡喃糖氧基或氢；

或可选择地， C22和 C23、 C23和 C24、 C24和 C25、 C25和 C27形成双键；且在 R₃、 R₄、 R₅为羟基的情况下， C22、 C23、 C24的手性为 S、 S、 R构型；在 R₄、 R₅为羟基以及 R₃为氢的情况下， C23、 C24的手性为 8、 S构型；且当为 β - D -葡萄吡喃糖基或 β - D -阿洛吡喃糖基， R₅、 R₆为氢， R₃ 为羟基，且 C24和 C25形成双键时， R₄不为 β - D -阿洛吡喃糖氧基。

在本发明又一优选的实施方案中，通式 I的化合物为具有如下结构式 lb 的化合物：

其中，为氢、 β- D-葡萄吡喃糖基、 β- D-阿洛吡喃糖基、 β- D-葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) - β - D -葡萄吡喃糖基或 β - D -木吡喃糖基 ( 1→4 ) - [β - D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6) ]- β- D -葡萄吡喃糖基；

R₂为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₃为羟基或氢；

R₄为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₅为羟基或氢；

R₆为羟基、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或氢；

R₇为甲基或醛基；

或可选择地， C22和 C23、 C23和 C24、 C24和 C25、 C25和 C27形成双键；且在 R₃、 R₄、 R₅为羟基的情况下， C22、 C23、 C24的手性为 S、 S、 R构型；且在 R₃为羟基， R₄为 β - D -葡萄吡喃糖氧基的情况下， C22和 C23为 S, S 构型；

且当 Ri为氢、 β- D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) - β - D -葡萄吡喃糖基或 β - D -木吡喃糖基 ( 1→4 ) - [β - D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) ] - β - D -葡萄吡喃糖基， R₂为氢， R₃、 R₄、 R₅、 R₆为羟基时， R₇不为甲基；

当 R₂、 R₆为羟基，、 R₃、 R₄、 R₅为氢，且 C23和 C24形成双键时， R₇不为醛基。

下述的表 1中列出了本发明最优选的具体化合物，即化合物、 B、 C、 D、 F、 G、 H、 I。

表 1 化合物 A、 B、 C、 D、 F、 G、 H、 I结构式合化物

结构结构式

R 为 β - D -木吡喃糖基（ 1→4 ) - [β - D -葡

萄吡喃糖基（ 1→6 ) ] - β - D -葡萄吡喃糖基；

R₂为氢；

为羟基;

为 β - D -葡萄吡喃糖氧基;

为氢；

R₆为氢；

R₇为曱基;

下面具体地描述本发明上述化合物的制备方法，由上述得到的苦瓜活性部位提取物 KG8 , 经过层析分离后，可以制得上述化合物 A、 B、 C、 D、 F、 G、 H、 I和化合物 momordicoside M、 momordicoside N , 该方法包括：

将活性部位提取物 KG8用 100-200目硅胶进行柱层析，依次用体积比为 40:3:1、 20:3:1、 10:3:1和 65:35: 10的氯仿:甲醇:水的下层液体洗脱，通过 TLC 板检测，展开剂可用体积比为 10: 1、 6: 1、 4: 1的氯仿：甲醇的下层液体或者体积比为 10:3: 1、 65:35: 10的氯仿:甲醇:水的下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，根据 TLC板显示，将相似组分合并并浓缩，根据 Rf值在 0.6~0.2之间从大到小获得 1-9九个组分；

将组分 3进行硅胶柱层析，用体积比为 10:1的氯仿：甲醇洗脱，通过 TLC 板检测，展开剂为体积比为 8:1的氯仿:甲醇， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 I；

将组分 4用 MCI柱层析，体积比为 50:50~90: 10甲醇:水洗脱剂进行梯度洗脱，所得 70:30甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，用体积比为 9:1氯仿:甲醇进行洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 5:1的氯仿:甲醇， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值分别约等于 0.3、 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 A 以及化合物 B;

将组分 5用 MCI柱层析，体积比为 30:70~80:20的甲醇：水洗脱剂梯度洗脱，所得 60:40的甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，体积比为 20:3: 1的氯仿:甲醇:水下层液体洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 4:1的氯仿:甲醇， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值分别约等于 0.3的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 momordicoside M;

将组分 6用 MCI柱层析，体积比为 30:70~80:20的甲醇：水洗脱剂梯度洗脱，所得 60:40的甲醇:水洗脱液组分再进行 RP _ 18柱层析，体积比为

40:60-60:40的甲醇:水梯度洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 10:3:1 的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 momordicoside N;

将组分 7用 MCI柱层析，体积比为 30:70~80:20的甲醇：水洗脱剂梯度洗脱，所得 50:50的甲醇:水洗脱液组分再进行 RP - 18柱层析，体积比为

40:60~60:40的甲醇:水梯度洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 8:3: 1 的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 C;

将组分 8用 MCI柱层析，体积比为 30:70~70:30的甲醇：水洗脱剂梯度洗脱，所得 40:60的甲醇:水洗脱液组分再进行 RP - 18柱层析，体积比为

30:70~60:40的甲醇:水梯度洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 8:3: 1 的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.3的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 H;

将组分 9用 MCI柱层析，体积比为 20:80~60:40的甲醇：水洗脱剂梯度洗脱，所得 40:60的甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，体积比为 10:3: 1的氯仿:甲醇:水下层液体洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比 65:45:1的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值分别约等于 0.3、 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 F以及化合物 G; 将化合物 A在室温 0.5M盐酸水溶液下水解 7天，将所得反应物进行制备薄层层析，展开剂为氯仿：甲醇 6: 1 , 收集 Rf值 0.5-0.6部分并用氯仿：甲醇 8:2洗脱、浓缩即为化合物 D。

III、药物组合物

本发明提供一种预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的上述结构式 I所示的从苦瓜中分离得到的三萜皂苷化合物中的一种或多种。另外，该组合物可进一步包含从苦瓜中提取的已知化合物大豆脑苷 I ( soya-cerebroside I )、苦瓜脑苷 ( momor-cerebroside )、三

3,7,25-三羟基葫芦烷 -5,23 ( E ) -二烯 -19-醛、 22 ( S ) ,23 ( R ) ,24 ( R ) ,25- 四^:基葫声烷 -5-婦、三急苷 momordicoside A、 momordicoside B、

momordicoside M或 momordicoside N中的一种或多种。此夕卜 , 该组合物还可包含药学上常规的辅料，例如药学上常用的各种溶剂。所述的组合物可采用药学上常规的制备方法制得。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂的药物组合物，所述的化合物来自苦瓜活性部位的提取物。在上述制备方法中，所述的苦瓜植物为葫芦科 ( Cucurbitaceae )苦瓜属（ Momordica ) 植物，或者更具体的说为葫芦科苦瓜属植物苦瓜 ( Momordica charantia )。

所述苦瓜活性部位提取物可包括三萜皂苷的天然产物，例如具有结构式 Ia、 lb的化合物、大豆脑苷 I ( soya-cerebroside I )、苦瓜脑苷

( momor-cerebroside )、三萜 3,7,25-三羟基葫芦烷 -5,23 ( ） -二烯 -19-醛、 22 ( S ) ,23 ( R ) ,24 ( R ) ,25-四羟基葫芦烷 -5-烯、三萜皂苷 momordicoside A、 momordicoside B、 momordicoside M和 momordicoside N中任意一个或多个化合物的混合物，更具体的，是表 1中描述的化合物中任意一个或多个化合物的混合物。具体实施例

使用仪器：样品在甲醇溶液中的旋光度用 Perkin-Elmer 341旋光计测定。 ESI-MS (电喷雾质谱 )用 Finnegan LCQ-DECA仪器测定。和 ¹³C NMR核磁共振（在氘代吡啶中测量 ) 由 Varian INOVA 500型和 Bruker AM-400型核磁共振仪测定。化学位移 δ ( ppm ) 以 TMS为内标，耦合常数（J ) 以 Hz给出。

薄层层析（TLC )硅胶板及柱层析用硅胶（ 200 ~ 300目 ) 由青岛海洋化工厂生产；薄层层析斑点用硫酸香兰醛乙醇溶液喷雾显色。

在本文中，除非特别说明，涉及溶剂比例均为体积比。实施例 1

如图 1所示，取鲜苦瓜 850kg, 低温冷冻干燥后称重得 85kg, 粉碎，用体积比为 90%乙醇水溶液常温下浸泡三次，每次 3天，乙醇水溶液用量为生药重的 10倍。将三次所得乙醇溶液合并后减压蒸镏，浓缩，获得乙醇总提物。将乙醇总提物加水（50L )稀释后与二氯甲烷（20L )液液分配，得二氯甲烷部位和水溶液。再将其水溶液与正丁醇（20L )进行液液分配，得正丁醇部位 800g。将 800g正丁醇部位与 500g AB _ 8型大孔树脂（来自天津骨胶厂 )拌样，将拌有样品的树脂加入装有 3kg AB-8树脂的层析柱上。分别用 12L纯水、 30:70醇 /纯水（体积比）、 95:5醇 /纯水（体积比）洗脱，分别得到部位 KG6 600g, KG7 60g, KG8 80g。实施例 2

图 2说明了采用层析分离化合物 A _ I。

将上述实施例 1得到的活性部位提取物 KG8 80g用 2kg 100-200目硅胶进行柱层析，依次用体积比为 40:3:1、 20:3: 1、 10:3:1和 65:35: 10的氯仿:甲醇: 水的下层液体 10L洗脱，每 500ml浓集为一镏分，通过 TLC板检测，展开剂可用体积比为 10: 1、 6: 1、 4:1的氯仿：甲醇的下层液体或者体积比为 10:3: 1、 65:35: 10的氯仿:甲醇:水的下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，根据 TLC板显示，将相似组分合并并浓缩，根据 Rf值在 0.6~0.2之间从大到小获得 1-9九个组分；

将组分 3进行硅胶柱层析，用体积比为 10:1的氯仿：甲醇 1L洗脱，每 20ml 浓集为一镏分，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 8:1的氯仿:甲醇， 5% 硫酸 -香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 I 9mg;

将组分 4用 MCI柱层析，体积比为 50:50~90: 10甲醇:水洗脱剂各 1L进行梯度洗脱，所得 70:30甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，用体积比为 9:1氯仿:甲醇进行洗脱，每 10ml浓集为一镏分，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 5:1的氯仿:甲醇， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf 值分别约等于 0.3、 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 A 180mg以及化合物 B 90mg;

将组分 5用 MCI柱层析，体积比为 30:70~80:20的甲醇：水洗脱剂各 1L 梯度洗脱，所得 60:40的甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，体积比为 20:3:1的氯仿:甲醇:水下层液体 1.5L洗脱，每 20ml浓集为一镏分，通过 TLC 板检测，展开剂为体积比为 4:1的氯仿：甲醇， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值分别约等于 0.3的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 momordicoside M 230mg;

将组分 6用 MCI柱层析，体积比为 30:70~80:20的甲醇：水洗脱剂各 1L 梯度洗脱，所得 60:40的甲醇:水洗脱液组分再进行 RP - 18柱层析，体积比为 40:60-60:40的甲醇:水各 500ml梯度洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比为 10:3:1的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 momordicoside N 21mg;

将组分 7用 MCI柱层析，体积比为 30:70~80:20的甲醇：水洗脱剂各 1L 梯度洗脱，所得 50:50的甲醇:水洗脱液组分再进行 RP - 18柱层析，体积比为 40:60~60:40的甲醇：水各 500ml梯度洗脱，每 20ml浓集为一镏分，通过 TLC 板检测，展开剂为体积比为 8:3:1的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 C 25mg;

将组分 8用 MCI柱层析，体积比为 30:70~70:30的甲醇：水洗脱剂各 1L 梯度洗脱，所得 40:60的甲醇:水洗脱液组分再进行 RP - 18柱层析，体积比为 30:70~60:40的甲醇：水各 500ml梯度洗脱，每 20ml浓集为一镏分，通过 TLC 板检测，展开剂为体积比为 8:3:1的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值约等于 0.3的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 H 30mg;

将组分 9用 MCI柱层析，体积比为 20:80~60:40的甲醇：水洗脱剂各 1L梯度洗脱，所得 40:60的甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，体积比为 10:3: 1 的氯仿:甲醇:水下层液体 500ml洗脱，每 20ml浓集为一镏分，通过 TLC板检测，展开剂为体积比 65 :45： 1的氯仿：甲醇:水下层液体， 5%硫酸 -香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值分别约等于 0.3、 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 F 60mg以及化合物 G HOmg;

将化合物 A在室温 0.5M盐酸水溶液下水解 7天，将所得反应物进行制备薄层层析，展开剂为氯仿：甲醇 6: 1 , 收集 Rf值 0.5-0.6部分并用氯仿：甲醇 8:2洗脱、浓缩即得化合物 D 10mg。

化合物 A、 B、 C、 D、 F、 G、 H、 I的特性如下：

化合物 A无定形粉末； = -75 ( c 0.094, MeOH ); IR v_max ( KBr ) 3421, 2949, 2873, 1637, 1470, 1377, 1153, 1086, 1032 cm"¹; ^NMR和 ¹³C NMR数据见表 2 和表 3; HRESIMS m/z 675.4064 (计算值 C₃₆H₆。0₁₍)Na [M+Na]⁺, 675.4084 )。

化合物 B 无定形粉末； =-76 (c 0.1600, MeOH )； IR v_max ( KBr ) 3396, 3165, 2935, 2783, 1612, 1514, 1454, 1417, 1277, 1263, 1223, 1165, 1122, 1039, 814, 689 cm"¹; ^lR NMR和 ¹³C NMR数据见表 2和表 3; HRESIMS m/z 675.4113 (计算值 C₃₆H₆。0₁₍)Na [M+Na]+, 675· 4084 )。

化合物 C 无定形粉末； [α] = -64 ( c 0.188, MeOH )； IR v_max ( KBr ) 3415, 2928, 2874, 1643, 1466, 1377, 1155, 1082, 1032 cm"¹; ^!H NMR和 ¹³C NMR数据见表 2 和表 3; HRESIMS m/z 6837.4632 (计算值 C₄₂H₇。0₁₅Na [M+Na] +, 837.4612)。

化合物 D 无定形粉末； NMR 和 ¹³C NMR 数据见表 2 和表 3; LRESIMS m/z 513 ( [M+Na]⁺ )。

化合物 F 无定形粉末； [α] = -8 (c 0.2245, MeOH) ； IR v_max (KBr) 3406, 2933, 2873, 1646, 1551, 1452, 1383, 1306, 1076, 1038, 534 cm"¹; ^ NMR 和 ¹³C NMR 数据见表 2 和表 3; HRESIMS m/z 1001.5253 (计算值 C₄₈H₈₂0₂oNa [M+Na]⁺, 1001.5297 )»

化合物 G 无定形粉末； [α] = -1 ( c 0.1385, MeOH )； IR v_max ( KBr ) 3408, 2931, 2857, 1639, 1468, 1381, 1308, 1163, 1076, 1039 cm"¹; ifiNMR和 ¹³C NMR数据见表 2 和表 3; HRESIMS m/z 1113.6025 (计算值 C₅4H₉₄0₂₃Na [M+Na] +, 1113.6048)。

化合物 H无定形粉末； = -5.0 ( c 0.3425, MeOH )； IR v_max ( KBr ) 3415, 2931, 2874, 1637, 1551, 1460, 1381, 1306, 1163, 1076, 1040, 534 cm"¹; ^{U NMR和 ¹³C NMR数据见表 2和表 3; HRESIMS m/z 1099.5618 (计算值 C₅₃H₈₈0₂₂Na [M+Na]⁺, 1099.5665 )» 化合物 I无定形粉末； = +39.8 ( c 0.3425, MeOH )； IR v_max ( KBr ) 3404, 2928, 2875, 1709, 1662, 1454, 1385, 1306, 1076, 1041, 966, 534 cm"¹; ^ιΥί NMR和 ¹³C NMR数据见表 2和表 3。 HRESIMS m/z 639.3816 (计算值

C₃₆H₅₆0₈Na [M+Na]⁺, 639.3873 )»

表 2 本发明化合物的 ¹³C NMR谱（ C₅D₅N , ppm )

A B C D F G H I

1 18.9 18.9 18.5 18.9 22.6 22.5 22.7 21.8

2 27.5 27.6 27.2 27.5 29.1 29.0 28.9 29.8

3 85.1 85.4 85.2 75.6 87.3 87.3 87.5 75.5

4 38.9 39.1 38.6 38.9 41.6 41.6 41.7 41.9

5 85.9 85.8 85.8 85.9 143.2 143.1 143.1 147.6

6 134.1 134.2 133.8 134.1 118.6 118.7 118.8 122.2

7 130.0 130.0 130.1 130.0 24.5 24.5 24.6 71.6

8 52.2 52.3 51.9 52.2 43.7 43.7 43.8 45.0

9 45.3 45.3 44.9 45.3 34.6 34.6 34.7 50.3

10 40.1 40.1 39.7 40.1 38.4 38.3 38.4 36.7

11 23.8 23.9 23.5 23.8 32.4 32.4 32.5 22.6

12 31.2 31.2 30.7 31.2 30.7 30.6 30.8 29.2

13 45.6 45.6 45.2 45.6 46.7 47.3 46.6 45.7

14 48.9 48.9 48.6 48.9 49.0 49.1 49.2 48.1

15 33.3 33.3 32.9 33.3 35.2 35.2 35.2 34.9

16 28.5 28.5 28.1 28.5 27.6 27.7 28.0 27.7

17 51.6 51.6 51.2 51.6 47.8 47.7 46.6 50.5

18 15.0 15.0 14.6 15.0 15.4 15.3 15.1 14.6

19 80.1 80.1 79.8 80.1 28.1 28.0 28.1 207.4

20 32.7 32.7 32.3 32.7 42.8 42.8 40.8 36.8

21 18.9 18.9 18.5 18.9 14.9 14.9 15.0 19.0

22 43.2 43.3 42.3 43.2 71.3 71.3 76.9 40.0

23 67.7 67.7 66.6 67.7 71.4 71.3 81.5 129.8

24 79.8 79.9 79.7 79.8 74.1 74.1 124.5 135.0

25 73.6 73.6 81.0 73.6 81.5 81.5 135.4 142.5

26 28.5 28.0 23.0 28.5 23.2 23.3 18.7 114.7

27 26.9 27.0 24.6 26.9 24.0 24.1 26.2 18.9

28 21.1 21.1 20.5 21.1 25.8 25.7 25.8 27.3

29 25.6 25.6 25.2 25.6 28.4 28.4 28.2 26.2

30 20.2 20.2 19.8 20.2 18.1 18.0 17.9 18.2

1' 103.8 106.7 104.0 106.9 106.8 106.9 101.7

2, 73.1 75.8 72.7 75.2 76.2 75.9 75.0

3' 72.4 78.3 72.3 78.4 74.8 74.9 78.8

4, 69.2 71.9 68.9 71.5 80.0 80.1 71.8

5, 76.1 78.4 75.8 77.3 75.0 75.1 78.7

6, 63.2 63.1 62.9 70.1 68.4 68.5 62.9

1" 98.5 105.1 105.1 105.2

2" 75.0 75.2 75.0 74.9 zz

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4' 4.19 4.25 4.14 4.05 4.28 4.30 4.26

5' 4.46 4.026 4.44 4.02 4.00 4.00 4.28

& 4.39, 4.52 4.45,4.58 4.32, 4.50 4.24, 4.76 4.62, 4.84 4.63, 4.80 4.42, 4.64

5.21 d 5.29 d 5.34 d

1"

( 7.8 ) ( 6.6 ) ( 7.8 )

2" 3.96 3.98 4.00 3.79

3" 4.22 3.90 3.96 3.94

4" 4.16 4.18 4.14 4.18

5" 3.93 4.18 4.18 4.20

6" 4.32, 4.52 4.30, 4.47 4.34, 4.54 4.30,4.46

5.09 d 5.30 d 5.37 d

V"

( 7.3 ) ( 7.2 ) ( 7.8 )

2'" 4.00 3.94 4.38

^fff 3.79 4.24 4.22

4"' 3.91 4.16 4.13

5'" 4.10 3.85, 4.17 3.84, 4.16

4.2 ^0, 4.40

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、

( 7.8 )

4.00 4.06

^ 3.84 3.88

4"" 4.14 4.22

5"" 4.16 4.22

6"" 4.28, 4.46 4.32, 4.46 试验实施例

试验实施例 1

测试 KG8对 3T3 - L1细胞葡萄糖摄取的影响（图 3 )

3T3-L1细胞完全分化为脂肪细胞后，换以含 0.5%BSA的无血清 DMEM 培养 16小时后，加入 KG8 (终浓度 2(^g/ml )处理 4天，空白对照组加入等体积的 DMS0, 然后用 37°C预温的 I xPBS清洗细胞两遍，加入不含或含胰岛素的 0.5%BSA的 Krebs緩冲液（NaCl 140mM, KC1 5mM, MgS0₄ 2.5mM, CaCl₂ ImM, HEPES 20mM, pH7.4 ), 37°C孵育 40分钟后，加入 2 - [1,2-3H( N )]- 脱氧 -D-葡萄糖溶液（终浓度为 0.5μα/ιη1 ), 37°C作用 5分钟，用冰浴的 I xPBS 洗 3遍终止反应，之后加入 0.15ml 0.1%Triton裂解细胞，液闪计数，用蛋白量校正 CPM值后计算 3T3-L1细胞的葡萄糖摄取量。

结果显示： KG8对 3T3 - L1细胞处理 4天后（图 3 ), 可使细胞在基础水平和 InM及 ΙΟΟηΜ胰岛素刺激的葡萄糖摄取明显增加。数据表示为平均值士标准误（X士 SE )( n=3 )。与相应条件下的空白对照组比较： *P<0.05 , **P<0.01 ; 与各自基础水平下的葡萄糖摄取比较： †P<0.05 , ††P<0.01 , 忖†P<0.001。

试验实施例 2

KG8对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠空腹血糖的影响（表 4 )

将 ICR 雄性小鼠（ 30-35 克）经尾静脉注射现配制的四氧嘧啶溶液 60mg/kg, 于 7天后，禁食 6小时，眼眦取血，分离血浆，采用葡萄糖氧化酶法测定其血糖。选取预测血糖值在 l l. l-30.0mmol/L 的小鼠为实验糖尿病小鼠。将选出的糖尿病小鼠禁食 6小时后测空腹血糖，每组 8只。给药组小鼠口服给予 25mg/kg的 KG8, 阳性对照组给予 150mg/kg盐酸二甲双胍，空白对照组给予 1%CMC。各组小鼠连续给药 21天，于给药后第 7天、 14天和 21天测定小鼠空腹血糖。

结果显示： ICR 小鼠在四氧嘧啶注射后，小鼠空腹血糖值显著升高，说明造模成功。 KG8组的空腹血糖值较模型对照组都明显下降，说明 KG8有降低四氧嘧啶小鼠模型血糖的作用。

表 4 KG8对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠空腹血糖的影响

组别剂量给药前血糖给药后血糖 ( mmol/1 )

mg/kg ( mmol/1 ) 第 7天第 14天第 21天空白对照一 4.61±1.63*** 4.72±0.30*** 4.83±0.19*** 4.72±0.16*** 才莫型对月 —— 28.20±1.70 26.67±0.68 30.84±1.63 30.54±0.95 二甲双胍 150 27.90±1.82 17.45±1.61 ** 18.86±1.91 *** 18.98±1.52**

KG8 25 27.90±0.34 21.20±1.60** 27.39±1.66 21.74±1.37* 注：数据以平均值士标准误（ X±SE )表示（ n=8 )。与空白对照组比较： *Ρ<0.05 , **Ρ<0.01 ,

*** Ρ<0.001。试验实施例 3

KG8对 Ob/Ob小鼠的糖尿病治疗作用（表 5 , 图 4、 5 )。 Ob/Ob小鼠适应性喂养二周后，称体重并测随机血糖，禁食 5小时后测空腹血糖。同时考虑随机血糖的标准，将 Ob/Ob小鼠分为 3组，每组 8只，雌雄各半，分别给予 50mg/kg KG8、 1 %CMC和 150mg/kg二甲双胍。同时以同窝的 C57小鼠作为正常对照。各组小鼠连续给药 21天，于给药后第 7、 14 和 21天测定空腹血糖。于给药后最后一天，取血测定血浆甘油三酯和肝脏甘油三酯含量。与 Ob/Ob小鼠比较， *P<0.05 , **P<0.01 , ***P<0.001。

结果显示： Ob/Ob小鼠在给予 50mg/kg KG8后，血糖水平较给药前明显下降；给药 21天后，小鼠血浆（图 4 )和肝脏（图 5 )甘油三酯水平与对照组相比显著下降。剂量给药前血糖给药后血糖（mmol/1 ) mg/kg ( mmol/1 ) 7天 14天 21天

C57对照 4.96±0.30 5.70±0.45 5.40±0.21 Ob/Ob对照 9.06±1.63 9.80±0.88 8.14±1.38 Ob/Ob-二甲双胍 6.38±0.48*** 6.40±0.31 *** 6.34±0.36*** 0b/0b-KG8 8.13±0.87 7.03±0.34*** 6.93±0.50*** 注：数据以平均值 ±标准误（X±SE ) ( n=8 )表示。与给药前血糖水平比较， *P<0.05，

**P<0.01 , ***P<0.001 , 试验实施例 4

KG8改善胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性实验（图 6 ) C57BL/6J雄性小鼠（8-10周龄）, 高脂饲料喂养 8周，使小鼠产生胰岛素抵抗（表现出葡萄糖不耐受）。最后二周，将高脂饲料加入 KG8 (每日 100 mg/kg )或者降糖药二甲双胍（Met, 每日 200 mg/kg )。通过测定禁食 5-7小时后的葡萄糖耐量（腹腔注射 2.0 g/kg葡萄糖）来评价胰岛素敏感性。正常对照组：普通饲料喂食的葡萄糖耐量正常小鼠（对胰岛素敏感）。高脂模型组: 高脂饲料喂食（未加药物）的葡萄糖耐量受损的对照小鼠。高脂二甲双胍组：加入二甲双胍的高脂饮食小鼠。高脂 KG8组：加入 KG8的高脂饮食小鼠。数据以平均值士标准误（X士 SE )表示（n=6-9只 /组）， *Ρ<0.05 , **Ρ<0·01。实验结果显示： KG8能明显改善葡萄糖不耐受，进而可以治疗糖尿病。试验实施例 5

KG8 对 HF小鼠脂肪酸氧化代谢影响（图 7 )。

高脂饮食（ HF )小鼠长期口服 KG8后能通过减少呼吸交换率（ RER ) 来影响小鼠脂肪酸氧化代谢。从上午 10点整开始，将小鼠放置在代谢笼中 24 小时。测定前的 2个星期，将 KG8 ( 100mg/kg )加入食物中。食物本身作为溶剂对照（Veh )。数据以平均值 ±标准误（X±SE ) ( n=5-6 )表示。与 KG8溶剂故对照： *P<0.05 , **P<0.01。

实验结果：图 A表明 KG8能显著促进小鼠脂肪酸氧化代谢；图 B表明 KG8在白天（ 10点至 18点）能显著促进小鼠脂肪酸氧化代谢。实验表明： KG8可以治疗肥胖疾病。试验实施例 6

KG8对高脂饮食诱导肥胖（DIO ) 小鼠胰岛素敏感性和脂代谢的影响。 (图 8, 9, 10, 11 , 12 , 13 , 14 )

C57BL/6J雄性小鼠（3 - 4周龄），高脂饲料喂养 12-16周后，形成饮食诱导肥胖（DIO ) 小鼠模型，该模型同时呈现明显胰岛素抵抗和脂代谢紊乱状态。 DIO小鼠根据体重和血糖分为 4组，分别每日给予 KG8( 50、 100 mg/kg )、二甲双胍（Met, 250 mg/kg )或模型对照（ 1%CMC ), 连续给药 32天。给药后第 20 天，进行禁食过夜后小鼠口服脂耐量试验（口服中长链脂肪酸 10ml/kg); 给药后 32天，测定小鼠禁食 6小时后的血浆甘油三酯、游离脂肪酸水平，以此评价 KG8对脂代谢的调节作用。给药后第 24天，进行禁食 6 小时后小鼠胰岛素耐量试验（腹腔注射胰岛素 0.5U/kg); 给药后第 28天，进行禁食 6小时后小鼠口服糖耐量试验（口服 2.5g/kg葡萄糖），以此评价 KG8 对胰岛素抵抗的改善作用。

实验结果显示： KG8能明显改善 DIO小鼠的脂耐量（图 8), 降低血浆甘油三酯（图 9)、游离脂肪酸水平（图 10)。 KG8能明显改善 DIO小鼠的口服糖耐量（图 11, 12)和胰岛素耐量（图 13, 14), 提示其对 DIO小鼠的胰岛素抵抗状态有明显的改善作用，进而可以治疗糖尿病。数据以平均值士标准误（ X士 SE )表示（ n=9 )。与模型对照比较： *Ρ<0.05, ** Ρ<0.01, ***Ρ<0·001。试验实施例 7

化合物对葡萄糖转运子 GLUT4转位活性测试（图 15)

化合物对 GLUT4从细胞浆到细胞膜（ ΡΜ )转位的影响。图 15A表示对 L6肌肉细胞的影响（ η=3 ); 图 15B表示对 3T3-L脂肪细胞的影响（ η=3 )。胰岛素组： ΙΟΟΉΜ的胰岛素（阳性对照）。各化合物 ΙΟμΜ 处理细胞 2小时。未标示标准误时，标准误在柱状图内。数据以平均值士标准误（ X±SE )表示 (n=3)。与溶剂对照组比较： *Ρ<0.05, **Ρ<0·01。

实验表明：化合物能够促进葡萄糖转运蛋白 4 ( GLUT4 )转移到细胞膜上，从而使葡萄糖被细胞摄取。试验实施例 8

化合物 A、 F对一磷酸腺苷激活蛋白激酶（ΑΜΡΚ)活性测试（图 16)。化合物对 ΑΜΡΚ通路的影响。 3T3-L1 脂肪细胞在 ΙΟμΜ化合物 A、 F, ImM 5—氨基 -4-咪唑甲酰胺核苷酸（ AICAR, 阳性对照）或 DMSO溶剂对照（ Veh ) 条件下孵浴 60min, ΙΟΟηΜ 胰岛素处理 2min或 25min, 然后通过相应的抗体来测定细胞裂解液中的蛋白 pAS160, pACC和 pAMPK。用 14-3-3总蛋白量作为上样量质控。结果显示：化合物 A和 F能明显激活 AMPK信号通路，进一步对糖尿病和肥胖有治疗作用。试验实施例 9

化合物 F对小鼠能量消耗和脂肪酸氧化代谢急性影响（图 17 )。化合物 F 对普通饮食老鼠急性作用后，可影响机体能量消耗（V0₂ )和脂肪氧化（可由减少呼吸交换率 RER测定）。小鼠在上午九点整放置在代谢笼中，两小时后，分别给小鼠皮下注射化合物 F ( 100mg/kg )、 5-氨基 -4-咪唑甲酰胺核苷酸 ( AICAR ) ( 250mg/kg, 阳性对照药）和生理盐水溶剂对照组。数据以平均值士标准误（ X士 SE )表示（ n=6-8 )。与溶剂对照组比较： * Ρ<0· 05 , ** Ρ<0.01 ; F与溶剂对照组比较： †P<0.05 , ††P<0.01。

实验表明：化合物 F通过促进小鼠急性脂肪酸氧化代谢和机体能量消耗而具有治疗肥胖的效果。试验实施例 10

化合物 F对小鼠葡萄糖利用（图 18 )

化合物 F对正常饮食小鼠血糖的急性影响。小鼠腹腔注射化合物 F或者生理盐水（对照组） 60分钟后，再给小鼠注入葡萄糖，然后在给定时间测定血糖。数据以平均值士标准误（X±SE )表示（n=6 )。 * P<0.05 , ** P<0.01。实验表明：化合物 F能显著促进糖耐量小鼠的葡萄糖利用。

Claims

权利要求

1、一类葫芦烷型三萜皂苷类化合物，其具有如下结构式 I所示的结构:

其中，为氢、 β- D-葡萄吡喃糖基、 β- D-阿洛吡喃糖基、 β-D- 葡萄吡喃糖基 ( 1→6) - β- D -葡萄吡喃糖基或 β - D -木吡喃糖基 ( 1→4) - [β - D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) ] - β - D -葡萄吡喃糖基；

R₂为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₃为羟基或氢；

R₄为羟基、氢、 β- D-葡萄吡喃糖氧基或 β- D-阿洛吡喃糖氧基； R₅为羟基或氢；

R₆为羟基、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或氢；

R₇为甲基或醛基；

在 R₄、 R₅为羟基以及 R₃为氢的情况下， C23、 C24的手性为 8、 S构型；在 R₃为羟基， R₄为 β- D -葡萄吡喃糖氧基情况下， C22和 C23为 S、 S构型；

在 R₇为甲基的情况下， C5和 C19可以由氧桥相连；且当为氢、 β- D-葡萄吡喃糖基（ 1→6) - β- D-葡萄吡喃糖基或 β-D-木吡喃糖基 ( 1→4 ) - [β - D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) ] - β - D -葡萄吡喃糖基， R₂为氢， R₃、 R₄、 R₅、 R₆为羟基， C5和 C6形成双键时， R₇不为甲基；

2、根据权利要求 1所述的化合物，其特征是，所述的化合物具有如下结构式 I a所示的结构：

R₃为羟基或氢；

R₄为羟基、氢、 β- D-葡萄吡喃糖氧基或 β- D-阿洛吡喃糖氧基；

R₅为羟基或氢；

R₆为羟基、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或氢；

或可选择地， C22和 C23、 C23和 C24、 C24和 C25、 C25和 C27形成双键；且在 R₃、 R₄、 R₅为羟基的情况下， C22、 C23、 C24的手性为 S、 S、 R构型；在 R₄、 R₅为羟基以及 R₃为氢的情况下， C23、 C24的手性为 8、 S构型。

3、根据权利要求 2所述的化合物，其特征是，所述的化合物为具有如下取代基和构型的化合物 A:

为 β - D -阿洛吡喃糖基；

R₃为氢；

R₄为羟基；

为羟基；

R₆为羟基；

C23, C24的手性为 S, S构型；

或所述的化合物为具有如下取代基和构型的化合物 B: 为 β- D -葡萄吡喃糖基；

R₃为氢；

R₄为羟基；

为羟基；

R₆为羟基；

C23, C24的手性为 S, S构型；

或所述的化合物为具有如下取代基和构型的化合物 C: 为 β - D -阿洛吡喃糖基；

R₃为氢；

R₄为羟基；

为羟基；

R₆为 β- D -葡萄吡喃糖氧基；

C23, C24的手性为 S, S构型；

或所述的化合物为具有如下取代基和构型的化合物 D: 为氢;

R₃为氢；

R₄为羟基；为羟基；

R₆为羟基；

C23, C24的手性为 S, S构型。

4、根据权利要求 1所述的化合物，其特征是，所述的化合物具有如下结构式 lb所示的结构：

R₂为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₃为羟基或氢；

R₄为羟基、氢或 β-D-葡萄吡喃糖氧基；

R₅为羟基或氢；

R₆为羟基、 β-D-葡萄吡喃糖氧基或氢；

R₇为甲基或醛基；

或可选择地， C22和 C23、 C23和 C24、 C24和 C25、 C25和 C27形成双键；且在 R₃、 R₄、 R₅为羟基的情况下， C22、 C23、 C24的手性为 S、 S、 R构型；在 R₃为羟基， R₄为 β - D -葡萄吡喃糖氧基情况下， C22和 C23为 S, S构型。

5、根据权利要求 4所述的化合物，其特征是，所述的化合物为具有如下取代基和构型的化合物 F:

为 β - D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) - β - D -葡萄吡喃糖基； R₂为氢；

R₃为羟基；

R₄为羟基；

为羟基；

R₆为 β- D -葡萄吡喃糖氧基；

R₇为甲基；

C22, C23, C24的手性为 S, S, R构型；

或所述的化合物为具有如下取代基和构型的化合物 G:

为 β - D -木吡喃糖基 ( 1→4 ) - [β - D -葡萄吡喃糖基 ( 1→6 ) ] - β - D -葡萄吡喃糖基；

R₂为氢；

为羟基；

R₄为羟基；

为羟基；

R₆为 β- D -葡萄吡喃糖氧基；

R₇为甲基；

C22, C23, C24的手性为 S, S, R构型；

或所述的化合物为具有如下取代基、双键和构型的化合物 H:

R₂为氢；

为羟基；

R₄为 β- D -葡萄吡喃糖氧基；

R₅为氢；

R₆为氢； R₇为甲基；

C24和 C25形成双键；

C22和 C23为 S, S构型；

或所述的化合物为具有如下取代基和双键的化合物 I：

为氢;

R₂为 β - D -葡萄吡喃糖氧基；

R₃为氢；

R₄为氢；

R₅为氢；

R₆为氢；

R₇为醛基；

C23和 C24, C25和 C27之间形成双键。

6、一种权利要求 3或 5所述化合物的制备方法，其特征是，该方法包括：用醇、水或其混合物浸泡苦瓜样品，过滤后得到提取液，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将得到的提取液中的溶剂蒸发形成浆状物；将水加入到该浆状物中，得到总提取物的水混悬液；用氯仿、二氯甲烷或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到氯仿、二氯甲烷或其混合物的萃取物；然后，进一步用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取物；将正丁醇萃取物浓缩后，进行大孔树脂层析，分别用纯水、体积比为 30:70醇 /纯水混合物、体积比为 95:5醇 /纯水混合物进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将体积比为 95:5 醇 /纯水混合物洗脱得到的洗脱液蒸发至干，得活性部位提取物 KG8;

将活性部位提取物 KG8用 100-200目硅胶进行柱层析，依次用体积比为 40:3:1、 20:3:1、 10:3:1和 65:35: 10的氯仿:甲醇:水的下层液体洗脱，通过 TLC 板检测，展开剂可用体积比为 10: 1、 6: 1、 4: 1的氯仿：甲醇的下层液体或者体积比为 10:3: 1、 65:35: 10的氯仿:甲醇:水的下层液体， 5%^£酸-香兰醛显色，根据 TLC板显示，将相似组分合并并浓缩，根据 Rf值在 0.6~0.2之间从大到小获得 1-9九个组分；

将组分 9用 MCI柱层析，体积比为 20:80~60:40的甲醇：水洗脱剂梯度洗脱，所得 40:60的甲醇:水洗脱液组分再进行硅胶柱层析，体积比为 10:3: 1的氯仿:甲醇:水下层液体洗脱，通过 TLC板检测，展开剂为体积比 65:45: 1的氯仿:甲醇:水下层液体， 5%硫酸-香兰醛显色，将根据 TLC板显示 Rf值分别约等于 0.3、 0.4的斑点的洗脱液合并并浓缩，得化合物 F以及化合物 G; 将化合物 A在室温 0.5M盐酸水溶液下水解，将所得反应物进行制备薄层层析，展开剂为氯仿：甲醇 6:1, 收集 Rf值 0.5-0.6部分并用氯仿：甲醇 8:2 洗脱、浓缩即得化合物0。

7、一种具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性的药物组合物，其特征是，所述的组合物包含治疗有效量的权利要求 1至 5中任意一项所述的化合物中的一种或多种。

8、根据权利要求 7所述的具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性的药物组合物，其特征是，所述的化合物来自苦瓜活性部位提取物，该提取物通过如下步骤制得：

(b )将得到的提取液中的溶剂蒸发形成浆状物；

( c )将水加入到该浆状物中，得到总提取物的水混悬液；

( d)用氯仿、二氯甲烷或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到氯仿、二氯甲烷或其混合物的萃取物；然后，进一步用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取物；

(f)将体积比为 95:5醇 /纯水混合物洗脱得到的洗脱液蒸发至干，即得活性部位提取物 KG8。

9、根据权利要求 8所述的具有预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂活性的药物组合物，其特征是，所述的苦瓜为葫芦科苦瓜属植物苦瓜（ wwriZca charantia )。

10、权利要求 1至 5中任意一项所述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防 /治疗糖尿病、肥胖和高血脂药物中的应用。

11、根据权利要求 10所述的应用，其特征是，所述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防和治疗糖尿病药物的应用中为肌肉和脂肪细胞葡萄糖摄取促进剂、胰岛素增敏剂、葡萄糖转运蛋白 4上膜促进剂、一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活剂、脂肪酸氧化代谢促进剂或胰岛素抵抗状态下的葡萄糖耐受性改善剂。

12、根据权利要求 10所述的应用，其特征是，所述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防和治疗肥胖药物的应用中为一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活剂或脂肪酸氧化代谢促进剂。

13、根据权利要求 10所述的应用，其特征是，所述的葫芦烷型三萜皂苷类化合物在制备预防和治疗高血脂药物的应用中为血浆甘油三酯和游离脂肪酸水平降低剂或脂代谢紊乱状态下的脂耐量改善剂。