WO2009096196A1 - 抗がん剤感受性の判定方法 - Google Patents

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Yusuke Tanigawara
Sayo Suzuki
Shinji Sugimoto
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Yakult Honsha Co Ltd
Keio University
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Definitions

  • the present invention relates to an anticancer drug sensitivity determination marker used for determining whether or not a cancer of a target patient has therapeutic reactivity to an anticancer drug to be used, and its application.
  • anticancer agents such as alkylating agents, platinum preparations, antimetabolites, anticancer antibiotics, and anticancer plant alkaloids. These anticancer agents may or may not be effective depending on the type of cancer. However, it is known that some types of cancer that are recognized as effective may or may not be effective depending on the individual patient. Whether or not an anticancer drug shows an effect on such individual patient's cancer is called anticancer drug sensitivity.
  • Oxaliplatin (SP-4-2)-[(1R, 2R) -cyclohexane-1,2-diamine- ⁇ N, ⁇ N ′] [ethanedioato (2-)- ⁇ O 1 , ⁇ O 2 ] platinum (IUPAC) is the third It is a next generation platinum complex antineoplastic agent.
  • the drug price was listed in combination with the continuous intravenous administration of levofolinate and fluorouracil (FOLFOX4 method) for advanced / recurrent colorectal cancer.
  • FOLFOX4 method for advanced recurrent colorectal cancer, the survival rate with 5-FU / LV therapy, which was performed until the early 1990s, was 10 to 12 months, whereas the survival period with FOLFOX therapy with oxaliplatin was It has almost doubled in 19.5 months.
  • stage II / III cases the usefulness of FOLFOX therapy compared to 5-FU / LV therapy in postoperative adjuvant therapy has been reported. It is a drug that can be expected to expand and benefit patients.
  • Factors related to oxaliplatin's therapeutic response are mainly: 1) Enhanced ability to remove and repair damaged DNA caused by oxaliplatin 2) Inactivation of oxaliplatin (activated) in cells (detoxification) 3) It is thought to be related to a decrease in the intracellular accumulation of oxaliplatin, and as a therapeutic response and prognostic factor in oxaliplatin + 5-FU combination therapy for colorectal cancer patients 1) -3 ) Related clinical studies are being conducted.
  • ERCC1 Exclusion repair cross-complementing group 1
  • NER nucleotide excision repair
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Non-patent Documents 2 and 3 In base excision repair (BER), an X-ray repair cross that encodes a protein that is thought to be involved in efficient repair of DNA single-strand breaks formed by exposure to an alkylating agent or the like. -The relationship between genetic polymorphism of the complementing group 1 (XRCC1) with an Arg399Gln amino acid mutation and tumor reduction effect was reported (Non-patent Document 4). It has been reported that there is no effect (Non-Patent Document 2). DNA mismatch repair (MMR) is thought to be involved in the decrease in sensitivity to cisplatin, but in vitro studies report that MMR is not involved in the repair of DNA damage sites by oxaliplatin. (Non-Patent Document 5).
  • MMR DNA mismatch repair
  • Glutathione-S-transferase is one of the enzymes responsible for the phase II reaction of detoxification and metabolism, and catalyzes the formation of a conjugate between a DNA platinum adduct and glutathione. Activate.
  • GSTP1 has a high expression level in colorectal cancer and is associated with a genetic polymorphism accompanied by amino acid mutation of Ile105Val and survival time (median survival time: Ile / Ile 7.9 months, Ile / Val 13.3 months and Val / Val 24.9 months) (non-patent document 6).
  • Non-patent Document 7 organic cation transporters (OCTs) are involved in the transport and sensitivity of oxaliplatin into cells
  • OCTs organic cation transporters
  • ATP7A A relationship between transporters involved in transport of copper and heavy metals such as ATP7B and sensitivity has also been reported (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • clinical studies have not been conducted on the relationship between these expressions and oxaliplatin treatment response.
  • Non-Patent Documents 11 and 12 Non-Patent Documents 11 and 12
  • oxaliplatin has a different therapeutic response depending on the type of cancer than cisplatin.
  • the cellular response of cancer cells to platinum DNA adducts responsible for the cytotoxic activity of oxaliplatin has not been elucidated.
  • a clear biomarker that can predict treatment responsiveness to chemotherapy with platin has not yet been established.
  • An object of the present invention is to provide an anticancer drug sensitivity determination marker capable of discriminating treatment responsiveness of individual patients and a new cancer treatment means using the same.
  • the present inventors cultured human cancer cell lines, and determined their sensitivity to anticancer agents using surface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF MS) for these intracellular proteins.
  • SELDI-TOF MS surface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • a protein whose expression level increases with a decrease in sensitivity to an anticancer agent was found, and the protein was detected as a peak at m / z 10,800 to 11,400 in a mass spectrometer. It was found that these are three types of proteins.
  • the proteins were further examined, they were found to be calcium binding proteins S100A7, S100A8 and S100A10, which are known as members of the S100 protein family having a calcium binding EF-hand motif.
  • this invention provides the anticancer agent sensitivity determination marker containing calcium binding protein S100A7, S100A8, or S100A10.
  • the present invention also provides an anticancer drug sensitivity determination method characterized by measuring S100A7, S100A8 or S100A10 in a specimen.
  • the present invention also provides a kit for carrying out a method for determining sensitivity to an anticancer drug, comprising a protocol for measuring the S100A7, S100A8 or S100A10 in a specimen.
  • the present invention provides a method for screening an anticancer agent sensitivity enhancer using the suppression of expression of S100A7, S100A8 or S100A10 as an index.
  • this invention provides the anticancer agent sensitivity enhancer obtained by said screening method.
  • this invention provides the composition for cancer treatment which combines said anticancer agent sensitivity enhancer and the anticancer agent used as the object of sensitivity enhancement. Furthermore, the present invention provides use of a combination of the above anticancer drug sensitivity-enhancing agent and an anticancer agent targeted for sensitivity enhancement for the production of a therapeutic drug for cancer. Furthermore, the present invention provides a method for treating cancer, characterized by administering the anticancer agent sensitivity-enhancing agent described above and an anticancer agent that is an object of sensitivity enhancement.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker of the present invention By using the anticancer drug sensitivity determination marker of the present invention, the anticancer drug sensitivity of individual patients can be accurately determined before the start of treatment, so that an anticancer drug having a high therapeutic effect can be selected. Furthermore, unnecessary side effects can be avoided because it is possible to avoid the use of anticancer agents that are not effective. In addition, because treatment schedules using anticancer drugs are long-term, the sensitivity of anticancer drugs to cancer over time can be determined by determining anticancer drug sensitivity for each treatment cycle even during treatment. Evaluation is possible and it is possible to determine whether or not to continue treatment.
  • Two-dimensional electrophoretic development views of two types of colon cancer cell lines HT-29 (protein A1 highly expressed) and COLO320 (protein A1 low expressed) and spot selection for LC / MS / MS analysis are shown. It is a figure which shows the correlation with the peak intensity of protein A2, and the oxaliplatin sensitivity in each cancer cell line. Is a diagram showing a relationship between sensitivity to oxaliplatin in each cancer cell line and the peak intensity of the protein A3 (IC 50 values for oxaliplatin, classified into two groups 5.0 ⁇ M as a cut-off value comparison).
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention includes S100A7, S100A8, or S100A10. These proteins are obtained on a surface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer (SELDI-TOF MS) at m / z 10,800-10,900 (S100A8), m / z 11,000-11,100. Proteins detected as peaks of (S100A10) and m / z 11,300 to 11,400 (S100A7).
  • SELDI-TOF MS surface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer
  • Protein A proteins S100A7, S100A8, and S100A10 (hereinafter also referred to as Protein A) were examined for the expression of intracellular proteins in cultured cancer cells using SELDI TOF MS, as shown in Examples below.
  • IC 50 value cisplatin sensitivity
  • IC 50 value irinotecan sensitivity or SN-38 sensitivity
  • the expression level of protein A is low in cancer cells sensitive to oxaliplatin, cisplatin, irinotecan or SN-38
  • the expression level of protein A is low in cancer cells sensitive to oxaliplatin, cisplatin, irinotecan or SN-38. it was high.
  • protein A is an anticancer agent sensitivity determination marker, and further a platinum complex anticancer agent or plant alkaloid anticancer agent sensitivity determination marker, particularly oxaliplatin, cisplatin, irinotecan, SN-38 or a salt thereof. It is useful as a susceptibility determination marker.
  • S100A8 and S100A7 may bind to S100A10 (Journal of Proteome Research 2005; 4: 1717-1721). There is also a possibility that these conjugates can also be used as sensitivity markers for anticancer agents.
  • S100A10 is composed of its own dimer and annexin A2 (Annexin-2, Annexin II, Lipocortin II, Calpactin I heavy chain, Chromabindin-8, p36, Protein I, Prandial anti-AP Since it is also known to form a tetramer, annexin A2 may be used as a determination marker for anticancer drug sensitivity, similar to S100A10.
  • an anticancer agent used as the target of the anticancer agent sensitivity determination marker of this invention for example, oxaliplatin, cyclophosphamide (ifosfamide), thiotepa (thiotepa), melphalan ( melphalan, busulfan, nimustine, ranimustine, dacarbazine (da), procarbazine, templatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin, cisplatin methotrexate , Pemetrexed, fluorouracil, tegafur / uracil (tegaful erac), doxyfluridine, tegafur / gimeracil / citabin, tegafur / citabin enocitabine, gemcitabine, 6-mercaptopurine, fludarabine, pentostatin, cladribine, hydroxyurea, hydroxyurea
  • protein A in a sample may be measured.
  • a biological sample derived from a subject having cancer such as blood, serum, plasma, a cancer tissue biopsy specimen, a cancer excision surgical specimen, stool, urine, ascites, pleural effusion, Although cerebrospinal fluid, sputum, etc. are mentioned, serum is particularly preferable.
  • lip, oral and pharyngeal cancer typified by pharyngeal cancer
  • digestive organ cancer typified by esophageal cancer
  • stomach cancer colon / rectal cancer
  • lung cancer Respiratory and intrathoracic organ cancer, bone and joint cartilage cancer, cutaneous malignant melanoma, squamous cell carcinoma and other skin cancers, mesothelioma and mesothelioma Tissue cancer, breast cancer, uterine cancer, female genital cancer represented by ovarian cancer, male genital cancer represented by prostate cancer, urinary tract cancer represented by bladder cancer, brain tumor Representative eye, brain and central nervous system cancer, thyroid and other endocrine adenocarcinoma, non-Hodgkin lymphoma, lymphoid leukemia, lymphoid tissue, hematopoietic tissue and related tissue cancer, and these as the primary focus Cancer of metastatic tissue that does, especially gastric cancer and colorectal cancer
  • the measuring means of protein A in the specimen can be measured by, for example, SELDI-TOF MS, immunological measurement method or the like.
  • an immunoassay using an anti-protein A antibody is preferable.
  • the anti-protein A antibody used may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. More specifically, for example, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation method, immunoturbidimetric method, Western blot, immunostaining, immunodiffusion method, etc. can be mentioned, preferably Western blot
  • an enzyme immunoassay is particularly preferred, such as Western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (for example, sandwich ELISA).
  • the protein A concentration in a biological sample derived from a cancer patient before administration of the anticancer agent is measured, and the concentration of protein A is higher than a predetermined standard concentration If it has the determined concentration, it can be determined that the cancer is not sensitive to the anticancer agent of interest.
  • the sensitivity of the cancer to the target anticancer agent over time is measured. Therefore, it can be a marker for determining whether or not to continue treatment.
  • the determination marker can also be used as a marker for avoiding the development of unnecessary side effects or the progression of cancer and the increase in side effects associated with continued invalid treatment.
  • concentration of protein A is determined to be lower than a predetermined standard concentration, it can be determined that the cancer is sensitive to the target anticancer agent, and thus a therapeutic effect can be expected. It can also be used as a marker for actively selecting patients.
  • anti-cancer drugs can be screened using protein A as an index. That is, in vitro, for example, if a cell killing effect appears after exposure of various cancer cell lines having a high protein A concentration with a substance, the substance may be a platinum complex anticancer agent such as oxaliplatin, irinotecan, etc. It is also an effective anticancer agent for cancers with low sensitivity to plant alkaloid anticancer agents and the aforementioned existing anticancer agents. In vivo, for example, if a tumor reduction effect appears after administration of a substance in a cancer-bearing animal that has a high concentration of protein A in its biological sample, the substance is a platinum complex such as oxaliplatin.
  • plant alkaloid anticancer agents such as irinotecan
  • cancers having low sensitivity to the existing anticancer agents By performing screening using protein A as an index using various cancer cell lines with a high concentration of protein A, or animals bearing cancer that have a high concentration of protein A in their biological samples, Anti-tumor effects even against platinum complex anticancer agents such as oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents such as irinotecan, and cancers with low sensitivity to the above existing anticancer agents Whether it is useful as an agent can be determined. A significant effect can be expected from the viewpoint of reducing labor and costs associated with the development of anticancer drugs.
  • kits including a protocol for measuring protein A in a specimen.
  • the kit includes a protein A measurement reagent, a method for using the measurement reagent, a standard for determining the presence or absence of anticancer drug sensitivity, and the like.
  • the standard includes the standard concentration of protein A, the concentration judged to be high, the concentration judged to be low, the factors affecting the measurement results, the degree of the influence, and the like. It can be set for each cancer drug. Using the reference, it can be determined as described above.
  • an anticancer drug sensitivity enhancer can be screened. That is, a substance that suppresses the expression of protein A in vitro or in vivo enhances anticancer drug sensitivity.
  • a substance that decreases the concentration of protein A in various cancer cell lines in the absence or presence of an anticancer drug is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (an anticancer drug).
  • Sensitizer In vivo, a substance that enhances the decrease in protein A concentration before or during administration of an anticancer drug in a cancer-bearing animal is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (anticancer drug sensitivity). Enhancer).
  • the combined form of the anticancer agent sensitivity-enhancing agent and the anticancer agent targeted for sensitivity enhancement may be a single composition containing both of these components. There may be. In addition, these components may be different administration routes.
  • Anticancer agents to be used here are the same as described above, and are oxaliplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, thiotepa, melphalan, busulfan.
  • Example 1 (1) Method (a) Cells used 11 types of human colorectal cancer cell lines (COLO201, COLO205, COLO320, DLD-1, HCT-15, HT-29, LS174T, SW480, SW620, SW1116, WiDR) are as follows (Table) Obtained from 1). For culture, adherent cells were ⁇ 100 mm / Tissue Culture Dish (IWAKI), and floating cells were ⁇ 100 mm / Non-Treated Dish (IWAKI), medium (RPMI 1640, 2 mM Glutamine, 10% Fetal Bovine Serum), 37 ° C., 5%. Performed under CO 2 conditions.
  • IWAKI Tissue Culture Dish
  • IWAKI Non-Treated Dish
  • medium RPMI 1640, 2 mM Glutamine, 10% Fetal Bovine Serum
  • Example 2 (1) Method Seven types of human colon cancer cell lines (DLD-1, HCT-15, HT-29, LS174T, SW480, SW620, WiDR) are used, and the drug is cisplatinum (II) dichloride (SIGMA). The cell viability after 48 hours exposure at 0 to 1000 ⁇ mol / L was evaluated by MTS assay in the same manner as in Example 1, and the IC 50 value was calculated. Intracellular protein extraction, protein expression analysis, and correlation analysis with cisplatin (CDDP) sensitivity were performed in the same manner as in Example 1.
  • DLD-1, HCT-15, HT-29, LS174T, SW480, SW620, WiDR cisplatinum (II) dichloride
  • Example 3 (1) Method The cells used are 5 types of human colorectal cancer cell lines (COLO320, HCT-15, HT-29, LS174T, HCT116 (the bank from which HCT116 was obtained is ECACC)), and the drug is irinotecan active metabolite (SN-38, The cell viability after exposure for 72 hours at 0 to 1000 nmol / L was evaluated by MTS assay in the same manner as in Example 1, and the IC 50 value was calculated. Intracellular protein extraction, sample preparation, and protein chip preparation were performed in the same manner as in Example 1. Analysis was performed using ProteinChip TM Reader (Model PCS4000 Personal Edition, Bio-Rad), and Mass Range 0 to 70,000 Daltons, Focus. Analysis was performed under the conditions of Mass 11,000 Dalton, Energy 3000 nJ, and a total of 265 shots per sample. Protein expression comparison analysis was performed using Ciphergen Express TM Data Manager 3.0.
  • Example 4 In Example 1, in order to investigate the property of the protein (protein A1) detected as a peak at m / z 11,000 to 11,100, the change in peak intensity with a change in pH and the CM10 chip array are different. The presence or absence of detection in a protein chip array in which chemical modification was applied to the chip surface was examined.
  • Example 2 Results In Example 1, the candidate proteins detected as peaks at m / z 11,000 to 11,100 under the analysis conditions of pH 4.5 using the CM10 chip array were the CM10 chip array and the Q10 chip array. In any case, a remarkable peak decrease was observed at pH 7.0 to 7.5, and the isoelectric point (pI) of this candidate protein was estimated to be pI 7.0 to 7.5. The detection was also confirmed in the IMAC30 chip array whose chip surface was activated with NiSO 4 .
  • Example 5 (identification of candidate protein A1) (1) Estimation of Molecular Weight of Candidate Protein A1 For intracellular protein extraction samples, protein expression using SELDI-TOF MS using bovine insulin (5733.51 Da) and equine cytochrome c (123360.96 Da) of known molecular weight as Calibrant Internal calibration was performed under the same analysis conditions as in the analysis (CM10 chip array and 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.5). As a result, the molecular weight of the candidate protein A1 peak was estimated to be 11072 Da (FIG. 7).
  • IEF lysis buffer (6M urea, 2M thiourea, 3% CHAPS, 1% Triton X-100, DeStrike reagent, GE Healthcare Bioscience) was added to the precipitate, followed by stirring and sonication at room temperature.
  • the prepared IEF sample solution is centrifuged, and the supernatant is applied to Immobiline DryStripe gel (pH 3 to 10 non-linear, 13 cm, GE Healthcare Bioscience), and the gel is swollen and then subjected to isoelectric focusing. (5000V, 15hr).
  • Immobiline DryStripe gel was equilibrated in sample buffer (6Murea, 20% glycerol, 2% DTT, 2% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 8.8) for two-dimensional electrophoresis.
  • Immobiline Dry Strip gel was converted to an electrophoretic sample at a constant current of 25 mA.
  • the gel was 10-18%, 16 ⁇ 16 cm polyacrylamide gradient gel (Biocraft), and the gel after electrophoresis was stained with CBB G-250 and decolorized with 5% acetic acid.
  • GS-800 calibrated Imaging Densitometer Bio-Rad
  • PDQuest software Bio-Rad
  • protein A1 (molecular weight 11,072, pI 7.3) identified in spot 4 shown in FIG. 8 was obtained by SELDI-TOF MS analysis using a protein chip array. Consistent with the results (molecular weight 11072, pI 7.0-7.5).
  • the candidate protein A1 detected as a peak at m / z 11,000 to 11,100 showing a correlation with oxaliplatin sensitivity is S100A10 (S100 calcium-binding protein A10, Calpactin-1 light chain, Calpactin I light. chain, p10 protein, p11, Cellular ligand of annexin II).
  • Example 6 Intracellular protein extraction samples of cancer cell lines were analyzed under the same conditions as in (1) method (e) of Example 1 using a CM10 protein chip array and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). As a result, two protein peaks, protein A2 and protein A3, showing an association with oxaliplatin sensitivity were found. The peak intensity of protein A2 showed a significant correlation with oxaliplatin (L-OHP) sensitivity (IC 50 value) of each cancer cell line (FIG. 9).
  • L-OHP oxaliplatin
  • the cancer cell line is highly sensitive and low sensitive with a cut-off value of 5.0 ⁇ M, which corresponds to the peak blood concentration at the time of clinical use of oxaliplatin.
  • the peak intensity of protein A3 was significantly increased in the low sensitivity group (FIG. 10).
  • the cell line LS174T was excluded from the analysis target because the S / N ratio was less than 5.
  • protein A2 and protein A3 exist in the vicinity of S100A10.
  • protein A2 is 10835 Da
  • protein A3 was estimated to be 11340 Da.
  • Example 2 15 types of buffers of pH 3.0 to 10.0 were used for each of the CM10 chip array and the Q10 chip array, and the change in each peak intensity was analyzed by SELDI-TOF MS. As a result, 10835 Da The peak indicating pH markedly decreased at pH 6.5 to 7.0, and the peak indicating 11340 Da increased sharply from pH 6.0 to 6.5. It was estimated to be 7.0 and 6.0 to 6.5.
  • Example 7 1) Method After extracting intracellular protein by the same method as in Example 1 using the high expression cell HT-29 and the low expression cell COLO320 with peaks detected at 11,000 to 11,100 as m / z. Then, a protein amount of 10 ⁇ g per lane was applied to a 16.5% polyacrylamide gel, and SDS-PAGE was performed at a constant voltage of 100V. After electrophoresis, the protein was blotted on a PVDF membrane using a drive blotting system (iBlot TM , invitrogen), blocked, and then anti-S100A10 monoclonal antibody (Purified Mouse Anti-Annexin II monoclonal chain, S100A10).
  • iBlot TM drive blotting system
  • a primary antibody reaction was performed using BD Transaction Laboratories) and an endogenous protein using an anti-GAPDH monoclonal antibody (anti-GAPDH monoclonal antibody, Ambion).
  • an anti-GAPDH monoclonal antibody anti-GAPDH monoclonal antibody, Ambion.
  • CDP-Star TM chemiluminescent substrate was added as a reaction substrate to emit light, and detection was performed with a lumino image analyzer (LAS-4000mini, FUJIFILM).
  • Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit was used as the blocking reagent, secondary antibody, and reaction substrate.

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Abstract

　個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供する。 　カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０を含有する抗がん剤感受性判定マーカー。

Description

抗がん剤感受性の判定方法
　本発明は、対象となる患者のがんが、使用しようとする抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその応用に関する。
　抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤にはがんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。
　オキサリプラチン（ＳＰ－４－２）－［（１Ｒ，２Ｒ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ－κＮ，κＮ’］［ｅｔｈａｎｅｄｉｏａｔｏ（２－）－κＯ１，κＯ２］ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＵＰＡＣ）は第三世代白金錯体系抗悪性腫瘍薬である。作用機序は先行薬剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）やカルボプラチン（ＣＢＣＤＡ）と同様、ＤＮＡ塩基との架橋形成によるＤＮＡ合成阻害、蛋白合成阻害と考えられているが、ＣＤＤＰやＣＢＣＤＡが無効な大腸癌に対してもオキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）は抗腫瘍効果を示し、従来の白金錯体系抗悪性腫瘍薬とは異なる抗腫瘍スペクトルを示す。アメリカでは２００４年１月にフルオロウラシル（５－ＦＵ）／レボホリナート（ＬＶ）との併用で転移性結腸・直腸癌のファーストライン治療として承認されており、日本においても２００５年４月、治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌に対するレボホリナート及びフルオロウラシルの静脈内持続投与法との併用（ＦＯＬＦＯＸ４法）にて薬価収載された。進行再発大腸癌の治療は、１９９０年代前半まで行なわれていた５－ＦＵ／ＬＶ療法での生存率は１０～１２ヶ月であったのに対し、オキサリプラチンを加えたＦＯＬＦＯＸ療法での生存期間は１９．５ヶ月とほぼ２倍にまで到達している。また、ｓｔａｇｅＩＩ／ＩＩＩ症例を対象とした試験において、術後補助療法における５－ＦＵ／ＬＶ療法と比較したＦＯＬＦＯＸ療法の有用性も報告されており、まだ未承認ながら今後の大腸癌術後補助療法への拡大と患者への有益性が期待できる薬剤である。
　しかし、それでもなお進行再発大腸癌に対するＦＯＬＦＯＸ療法の奏効率は５０％程度であり、換言すれば治療を受けた患者の半数は効果が得られていないことを意味する。また、オキサリプラチンの使用により好中球減少症のほか高頻度の末梢神経障害を呈し、これは致死的副作用ではないものの治療継続を困難にする因子ともなっている。したがって、治療開始前に効果の期待できる患者（レスポンダー）と、効果の期待できない患者（ノンレスポンダー）を予測・診断できれば、有効性と安全性の高い化学療法が実現する。さらに、一般にがん化学療法の治療スケジュールは長期に渡るため、治療継続中における抗がん剤に対する感受性の経時的モニターは治療継続の是非の判定を可能とし、患者負担や副作用軽減につながるのみならず医療経済の観点からも有用であると考えられる。個々の患者における治療反応性を予測して適切な治療を選択する“Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”のための治療反応性予測バイオマーカーの確立は急務である。
　オキサリプラチンの治療反応性に関連する因子としては、主に、
１）オキサリプラチンによりもたらされる損傷ＤＮＡの除去・修復能の亢進
２）細胞内におけるオキサリプラチン（活性化体）の不活化（解毒）
３）オキサリプラチンの細胞内蓄積量の低下
などが関与していると考えられており、大腸癌患者を対象にしたオキサリプラチン＋５－ＦＵ併用療法における治療反応性や予後予測因子として１）～３）と関連する臨床研究が行われている。
　１）に関しては、ヌクレオチド除去修復（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ　ｒｅｐａｉｒ：ＮＥＲ）に重要な役割を果たすＥｘｃｉｓｉｏｎ　ｒｅｐａｉｒ　ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　１（ＥＲＣＣ１）について、腫瘍内ＥＲＣＣ１遺伝子発現量が予後因子であるとする報告（非特許文献１）や、ＥＲＣＣ１の一塩基多型（ＳＮＰ）の一つであるＣ１１８ＴについてＣ／Ｃホモ接合体を有する患者では、少なくとも１つ以上のＴアレルを有する患者よりも良好な生存率が報告されている（非特許文献２）。Ｘｅｒｏｄｅｒｍａ　ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ　Ｄ（ＸＰＤ、ＥＲＣＣ２としても知られている）ではＬｙｓ７５１Ｇｌｎのアミノ酸変異を伴う遺伝多型が腫瘍縮小率や生存期間に関与するとの報告がなされている（非特許文献２、３）。塩基除去修復（ｂａｓｅ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ　ｒｅｐａｉｒ：ＢＥＲ）においては、アルキル化剤への曝露などにより形成されるＤＮＡ一本鎖切断の効率的な修復に関わると考えられているタンパク質をコードするＸ－ｒａｙ　ｒｅｐａｉｒ　ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　１（ＸＲＣＣ１）のＡｒｇ３９９Ｇｌｎのアミノ酸変異を伴う遺伝多型と腫瘍縮小効果との関係が報告されたが（非特許文献４）、同じ患者を対象としたその後の解析により臨床予後には影響しないことが報告されている（非特許文献２）。シスプラチンへの感受性低下にはＤＮＡミスマッチ修復（ＤＮＡ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　ｒｅｐａｉｒ：ＭＭＲ）も関与していると考えられているが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの検討ではオキサリプラチンによるＤＮＡ損傷部位の修復にＭＭＲは関与しないことが報告されている（非特許文献５）。
　２）に関して、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）は解毒・代謝の第ＩＩ相反応を担う酵素の一つであり、ＤＮＡ白金付加体とｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅとの抱合体形成を触媒することで、薬剤を不活化する。ＧＳＴサブタイプのうち、ＧＳＴＰ１は大腸癌での発現量が高く、Ｉｌｅ１０５Ｖａｌのアミノ酸変異を伴う遺伝多型と生存期間が関連する（生存期間の中央値：Ｉｌｅ／Ｉｌｅ　７．９ヶ月、Ｉｌｅ／Ｖａｌ　１３．３ヶ月、Ｖａｌ／Ｖａｌ　２４．９ヶ月）ことが報告されている（非特許文献６）。
　３）に関しては、培養細胞を用いた検討では、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴｓ）がオキサリプラチンの細胞内への輸送と感受性に関与することが報告されている他（非特許文献７）、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂなどの銅や重金属の輸送に関与するトランスポーターと感受性との関連についても報告されている（非特許文献８、９）。ただし、これらの発現とオキサリプラチン治療反応性との関連について臨床的検討は行なわれていない。
　ＦＯＬＦＯＸ療法を受けた進行大腸癌患者を対象とした最近の臨床研究においては、ＥＲＣＣ１の遺伝多型（Ａｓｎ１１８Ａｓｎ）とＸＰＤの遺伝多型（Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ）が独立して無増悪期間（ＰＦＳ）と関連することが報告されているが、ＧＳＴＰ１（Ｉｌｅ１０５Ｖａｌ）についてはＰＦＳとの関連は見出されず、オキサリプラチン誘発神経毒性と関連する傾向が認められている（非特許文献１０）。
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏの検討では、白金錯体系の先行薬剤であるシスプラチンの耐性関連因子については数多くの報告がなされており、オキサリプラチンについてもＦＡＳ／ＦＡＳＬ、Ｂｃｌ－ｘＬなどのアポトーシス関連因子との関連も報告されている（非特許文献１１、１２）。しかし、オキサリプラチンはシスプラチンとはがん種により異なる治療反応性を示すことに加え、オキサリプラチンの細胞障害活性を担う白金ＤＮＡ付加体に対するがん細胞の細胞応答はほとんど解明されておらず、オキサリプラチンを用いた化学療法に対する治療反応性を予測し得る明確なバイオマーカーは未だ確立されていない。
先行技術文献
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９，４２９８－４３０４（２００１） Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　９１，３４４－３５４（２００４） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　６１，８６５４－８６５８（２００１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２１，３０７５－３０７９（２００１） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６，４８８１－４８８６（１９９６） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．９４，９３６－９４２（２００２） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．６６，８８４７－８８５７（２００６） Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６６，２５－３２（２００４） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１０，４６６１－４６６９（２００４） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５，１２４７－１２５４（２００７） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１１，４７７０－４７７４（２００５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４６１１３－４６１２１（２００４）
　本発明の目的は、個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供することにある。
　そこで本発明者らは、ヒトがん細胞株を培養し、それらの細胞内タンパク質について表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）を用いて抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行ったところ、抗がん剤に対する感受性の低下に伴い発現量が上昇するタンパク質を見出し、そのタンパク質が、質量分析計において、ｍ／ｚ　１０，８００～１１，４００のピークとして検出される３種類のタンパク質であることを見出した。そして、さらに当該タンパク質について検討したところ、それらは、カルシウム結合ＥＦ－ｈａｎｄモチーフをもつＳ１００タンパク質ファミリーの一員として知られているカルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ１０であることを見出した。
　かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが抗がん剤に対する感受性を有するか否かを判定できること、また、この物質の発現抑制を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０を含有する抗がん剤感受性判定マーカーを提供するものである。
　また、本発明は、検体中の前記Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０を測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、検体中の前記Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
　さらに本発明は、前記Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０の発現抑制を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
　さらにまた本発明は、上記のスクリーニング方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤を提供するものである。
　さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物を提供するものである。
　さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤との組み合せの、がん治療薬製造のための使用を提供するものである。
　さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを投与することを特徴とするがん治療方法を提供するものである。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤感受性を治療開始前に適確に判定できる結果、治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となる。さらに効果が得られない抗がん剤の使用を回避できるため不必要な副作用を回避できる。また、抗がん剤を用いた治療スケジュールは長期に及ぶため、治療継続中においても治療サイクルごとに抗がん剤感受性を判定することにより、そのがんにおける抗がん剤に対する感受性の経時的評価が可能となり、治療を継続すべきか否かの判定ができる。その結果、治療効果の得られない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、患者の負担軽減、医療費の削減にもつながる。
　さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。
各がん細胞株におけるオキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）感受性を示す図である。 各がん細胞株におけるオキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）に対する感受性とタンパク質Ａ１のピーク強度の変化を示す図である。 タンパク質Ａ１のピーク強度と各がん細胞株におけるオキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）感受性との相関を示す図である。 タンパク質Ａ１のピーク強度と各がん細胞株におけるシスプラチン（ＣＤＤＰ）感受性との相関を示す図である。 タンパク質Ａ１のピーク強度と各がん細胞株におけるシスプラチン（ＣＤＤＰ）感受性との関係を示す図である（シスプラチンに対するＩＣ５０値を、１０μＭをカットオフ値として２群に分類して比較）。 タンパク質Ａ１のピーク強度と各がん細胞株におけるＳＮ－３８感受性との関係を示す図である（ＳＮ－３８に対するＩＣ５０値を、２０ｎＭをカットオフ値として２群に分類して比較）。 プロテインチップアレイを用いたＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ分析によるタンパク質Ａ１の分子量を示す図である。 ２種類の大腸癌細胞株ＨＴ－２９（タンパク質Ａ１が高発現）及びＣＯＬＯ３２０（タンパク質Ａ１が低発現）の２次元電気泳動展開図とＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のためのスポット選択を示す。 タンパク質Ａ２のピーク強度と各がん細胞株におけるオキサリプラチン感受性との相関を示す図である。 タンパク質Ａ３のピーク強度と各がん細胞株におけるオキサリプラチン感受性との関係を示す図である（オキサリプラチンに対するＩＣ５０値を、５．０μＭをカットオフ値として２群に分類して比較）。 プロテインチップアレイを用いたＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ分析によるタンパク質Ａ２（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ１００－Ａ８、Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ８）及びタンパク質Ａ３（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ１００－Ａ７、Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ７）を示す図である。 Ｓ１００Ａ９のピーク強度と各がん細胞株におけるオキサリプラチン感受性との関係を示す図である（オキサリプラチンに対するＩＣ５０値を、５．０μＭをカットオフ値として２群に分類して比較）。 ＨＴ－２９（Ｓ１００Ａ１０が高発現）及びＣＯＬＯ３２０（Ｓ１００Ａ１０が低発現）における、ウエスタンブロット法を用いたＳ１００Ａ１０の検出を示す図である。
発明を実施するための形態
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０を含むものである。これらのタンパク質は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）において、ｍ／ｚ　１０，８００～１０，９００（Ｓ１００Ａ８）、ｍ／ｚ　１１，０００～１１，１００（Ｓ１００Ａ１０）及びｍ／ｚ　１１，３００～１１，４００（Ｓ１００Ａ７）のピークとしてそれぞれ検出されるタンパク質である。
　これらのタンパク質Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ１０（以下タンパク質Ａともいう）は、後記実施例に示すように、培養がん細胞の細胞内タンパク質の発現をＳＥＬＤＩ　ＴＯＦ　ＭＳを用いて検討した結果、オキサリプラチン感受性（ＩＣ５０値）、シスプラチン感受性（ＩＣ５０値）、イリノテカン感受性又はＳＮ－３８感受性（ＩＣ５０値）と有意な相関性を有していた。すなわち、オキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン又はＳＮ－３８高感受性のがん細胞ではタンパク質Ａの発現量は低く、オキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン又はＳＮ－３８低感受性のがん細胞ではタンパク質Ａの発現量は高かった。従って、タンパク質Ａは、抗がん剤感受性判定マーカー、さらに白金錯体系抗がん剤又は植物アルカロイド系抗がん剤の感受性判定マーカー、特にオキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン、ＳＮ－３８又はそれらの塩の感受性判定マーカーとして有用である。
　ここで、Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ７は、Ｓ１００Ａ１０と結合する可能性があることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００５；４：１７１７－１７２１）ことから、抗がん剤感受性に対してこれらが何らかの相互作用を有する可能性もあり、また、これらの結合体も抗がん剤の感受性マーカーとして使用できる可能性がある。さらに、Ｓ１００Ａ１０は、自身のダイマーと、アネキシンＡ２（Ａｎｎｅｘｉｎ－２、Ａｎｎｅｘｉｎ　ＩＩ、Ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ　ＩＩ、Ｃａｌｐａｃｔｉｎ　Ｉ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、Ｃｈｒｏｍｏｂｉｎｄｉｎ－８、ｐ３６、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉ、Ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＶ、ＰＡＰ－ＩＶ）のダイマーによりヘテロテトラマーを形成することも知られていることから、アネキシンＡ２もＳ１００Ａ１０と同様に、抗がん剤感受性の判定マーカーとして使用できる可能性がある。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては特に限定されないが、例えばオキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ－３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち白金錯体系抗がん剤及び植物アルカロイド系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン、ＳＮ－３８又はそれらの塩が好ましい。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、検体中のタンパク質Ａを測定すればよい。ここで、検体としては、がんを有する被験者（がん患者）由来の生体試料、例えば血液、血清、血漿、がん組織生検検体、がん摘出手術標本、便、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
　また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に胃がんや結腸・直腸がんに対して好適に利用できる。
　検体中のタンパク質Ａの測定手段は、例えばＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ、免疫学的測定法等により測定可能である。
　ここでＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳによる測定は後記実施例に記載の方法によって行うことができる。また、免疫学的測定法においては、抗タンパク質Ａ抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。用いる抗タンパク質Ａ抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。より具体的には、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはウエスタンブロット又はエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ）である。
　対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前のがん患者由来の生体試料中のタンパク質Ａ濃度を測定し、タンパク質Ａの濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。また、抗がん剤投与中のがん患者由来の生体試料中のタンパク質Ａ濃度を治療サイクルごとに測定しモニタリングしていくことにより、そのがんにおける対象とする抗がん剤に対する感受性を経時的に評価できるため、治療を継続すべきか否かの判定マーカーとなる。
　対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、抗がん剤による副作用のみが発現すると考えられるため、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、不必要な副作用の発現もしくは無効な治療継続に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
　また、タンパク質Ａの濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者を積極的に選出するためのマーカーとしても使用できる。
　さらに、タンパク質Ａを指標とすれば、抗がん剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、例えば、タンパク質Ａの濃度が高い各種がん細胞株をある物質で曝露後に殺細胞効果が現れれば、その物質はオキサリプラチン等の白金錯体系抗がん剤、イリノテカン等の植物アルカロイド系抗がん剤や前記の既存の抗がん剤に対する感受性が低いがんに対しても有効な抗がん剤である。また、ｉｎ　ｖｉｖｏでは、例えば、担癌動物であってその生体試料中のタンパク質Ａの濃度が高い動物にある物質を投与した後、腫瘍縮小効果が現れれば、その物質はオキサリプラチン等の白金錯体系抗がん剤、イリノテカン等の植物アルカロイド系抗がん剤や前記の既存の抗がん剤に対する感受性が低いがんに対しても有効な抗がん剤である。タンパク質Ａが高濃度である各種がん細胞株や、担癌動物であってその生体試料中のタンパク質Ａの濃度が高い動物を用いてタンパク質Ａを指標としたスクリーニングを行なうことにより、当該物質が、オキサリプラチン等の白金錯体系抗がん剤、イリノテカン等の植物アルカロイド系抗がん剤や前記の既存の抗がん剤に対する感受性が低いがんに対しても抗腫瘍効果を示す抗がん剤として有用であるかどうかを判定することができる。抗がん剤開発に伴う労力や費用の削減という面からも大きな効果が期待できる。
　本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のタンパク質Ａを測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、タンパク質Ａ測定試薬、測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等が含まれる。当該基準には、タンパク質Ａの標準濃度、高いと判断される濃度、低いと判断される濃度、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。
　タンパク質Ａの発現抑制を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいてタンパク質Ａの発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の非存在下或いは存在下でタンパク質Ａの濃度を低下させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ　ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前、もしくは投与中において、タンパク質Ａの濃度の低下を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。
　ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ－３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち、白金錯体系抗がん剤及び植物アルカロイド系抗がん剤が好ましく、特にオキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン、ＳＮ－３８又はそれらの塩が好ましい。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
（１）方法
（ａ）使用細胞
　ヒト大腸癌細胞株１１種類（ＣＯＬＯ２０１、ＣＯＬＯ２０５、ＣＯＬＯ３２０、ＤＬＤ－１、ＨＣＴ－１５、ＨＴ－２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＷ１１１６、ＷｉＤＲ）は、以下（表１）より入手した。
　培養は、接着細胞はφ１００ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）、浮遊細胞はφ１００ｍｍ／Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｅｄ　Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）にて、培地（ＲＰＭＩ　１６４０、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて行なった。
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（ｂ）薬剤
　オキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）原末は、株式会社ヤクルト本社より入手した。
（ｃ）オキサリプラチンに対する感受性の評価
　各細胞において、オキサリプラチン０～１０００μｍｏｌ／Ｌにて４８時間曝露後の細胞生存率をＭＴＳ　ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＴＭＡＱｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価し、ＩＣ５０値（オキサリプラチン未処理ｗｅｌｌに対して細胞数を５０％抑制する濃度）を算出して各細胞におけるオキサリプラチン感受性とした。感受性の評価は異なる継代数の細胞にて４回行い、その平均値と標準偏差を算出した。
（ｄ）細胞内タンパク質の抽出
　接着細胞はｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、ラバーポリスマンにて剥がしてかき集め、浮遊細胞は細胞浮遊液をＰＢＳにて再懸濁して遠心する形で３回洗浄後の細胞懸濁液を１．５ｍＬマイクロチューブに移した。４℃にて１，２００×ｇ、１０分間遠心して細胞を集め、上清を除いた後に細胞溶解バッファー（９ｍｏｌ／Ｌ　Ｕｒｅａ、２％　ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ　ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ））４００μＬを加え、氷冷下で超音波破砕処理を行なった後、４℃にて１６，０００×ｇ、２０分間遠心し、上清を液体窒素にて急速凍結後、分析するまで－８０℃にて保存した。上清の一部を用いてタンパク質定量（ＤＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を行なった。
（ｅ）タンパク質発現解析のためのサンプル調整及びプロテインチップの作成、細胞内タンパク質の発現解析
　細胞溶解バッファー（プロテアーゼインヒビターを除く）にて５ｍｇ／ｍＬに調整し、さらに、ｐＨ４．５の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）（以下、バッファー）にて１ｍｇ／ｍＬに調整したサンプル１００μＬを、同バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、１時間インキュベートして反応させた後、バッファーにて３回ｗａｓｈ、ｍｉｌｌｉＱ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙ　ａｂｓｏｒｂｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＡＭ：５０％　ＡＣＮ／０．５％　ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃ　ａｃｉｄの飽和溶液）を、１．０μＬを０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行なった。
　タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）にて行なった。分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＴＭ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ　ＰＢＳＩＩＣ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、ｍａｓｓ－ｔｏ－ｃｈａｒｇｅ　ｒａｔｉｏ（ｍ／ｚ）のｏｐｉｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ　２，０００～３０，０００　Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｌａｓｅｒ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　２２０、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　８、１サンプルあたり合計１０４　ｓｈｏｔｓの条件にて分析を行った。ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ　ｒａｔｉｏ（Ｓ／Ｎ比）５以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓＴＭ　Ｄａｔａ　Ｍａｎａｇｅｒ　３．０を用いて行なった。
（ｆ）タンパク質発現とオキサリプラチン感受性との相関分析
　ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより検出されたすべてのタンパク質ピークについて、各細胞のＩＣ５０値とピーク強度の関係について相関分析を行なった。ＩＣ５０値の対数値とピーク強度の関係について線形回帰分析を行い、Ｐ値＜０．０５、決定係数（ｒ２；ｒ，Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数）＞０．５を満たすピークをオキサリプラチン感受性関連候補タンパク質として選出した。相関分析及び線形回帰分析は、ＳＰＳＳ　１５．０Ｊ　ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（バージョン１５．０．１）にて行なった。
（２）結果
（ａ）１１種類のヒト大腸癌細胞株におけるオキサリプラチン感受性の評価
　各細胞におけるＩＣ５０値は０．８４±０．２０～２９．７±１３．６μＭであり、その感受性には大きな幅が認められた（図１）。
（ｂ）タンパク質発現解析
　ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた前述の分析条件による発現解析により、全部で４２個のピークを検出した。
（ｃ）タンパク質発現とオキサリプラチン感受性との相関分析
　相関分析及び線形回帰分析により、ｍ／ｚとして１１，０００～１１，１００に検出されたピークがオキサリプラチン感受性（ＩＣ５０値）と有意な相関性をもつことを見出した（図２、図３）。
実施例２
（１）方法
　使用細胞はヒト大腸癌細胞株７種類（ＤＬＤ－１、ＨＣＴ－１５、ＨＴ－２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＷｉＤＲ）、薬剤はシスプラチン（ｃｉｓ－Ｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ｄｉｃｈｒｏｌｉｄｅ、ＳＩＧＭＡ）を使用し、０～１０００μｍｏｌ／Ｌにて４８時間曝露後の細胞生存率を実施例１と同様にＭＴＳ　ａｓｓａｙにて評価し、ＩＣ５０値を算出した。細胞内タンパク質の抽出、タンパク質発現解析およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）感受性との相関分析は実施例１と同様に行なった。
（２）結果
（ａ）７種類のヒト大腸癌細胞株におけるシスプラチン感受性の評価
　各細胞におけるＩＣ５０値は３．３３±０．８０～２６．９±１１．６μＭであり、その感受性には大きな幅が認められた。
（ｂ）タンパク質発現とシスプラチン感受性との相関分析
　相関分析及び線形回帰分析により、ｍ／ｚとして１１，０００～１１，１００に検出されたピークがシスプラチン感受性（ＩＣ５０値）と相関を示す傾向を認めた（図４）。さらに、シスプラチン投与時における総プラチナの薬物動態学的パラメータ（ブリプラチンＴＭ注インタビューフォームより）にもとづくと、シスプラチン臨床使用における１回あたりの最高投与量（１００ｍｇ／ｍ２）を投与した際のピーク血中濃度（Ｃｍａｘ）は、およそ９．５～１１．０μＭ（日本人の体表面積を１．５０～１．７３ｍ２として計算）と計算されることから、各がん細胞株のシスプラチンに対するＩＣ５０値について１０μＭをカットオフ値として、高感受性及び低感受性の２群に分類した。その結果、ｍ／ｚとして１１，０００～１１，１００に検出されたピークのピーク強度は低感受性群において有意な上昇を認めた（図５）。
実施例３
（１）方法
　使用細胞はヒト大腸癌細胞株５種類（ＣＯＬＯ３２０、ＨＣＴ－１５、ＨＴ－２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６（ＨＣＴ１１６の入手元バンクはＥＣＡＣＣ））、薬剤はイリノテカン活性代謝物（ＳＮ－３８、株式会社ヤクルト本社より入手）を使用し、０～１０００ｎｍｏｌ／Ｌにて７２時間曝露後の細胞生存率を実施例１と同様にＭＴＳ　ａｓｓａｙにて評価し、ＩＣ５０値を算出した。細胞内タンパク質の抽出、サンプル調整およびプロテインチップの作成は実施例１と同様に行い、分析はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＴＭ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ　ＰＣＳ４０００　Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、Ｍａｓｓ　Ｒａｎｇｅ　０～７０，０００　Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ　Ｍａｓｓ　１１，０００　Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ　３０００　ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓの条件にて分析を行なった。タンパク質発現比較解析は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓＴＭ　Ｄａｔａ　Ｍａｎａｇｅｒ　３．０を用いて行なった。
（２）結果
（ａ）５種類のヒト大腸癌細胞株におけるＳＮ－３８感受性の評価
　各細胞におけるＩＣ５０値は３．３９～３３．７ｎＭであり、その感受性には大きな幅が認められた。
（ｂ）タンパク質発現とＳＮ－３８感受性との相関分析
　ＳＮ－３８の薬物動態学的パラメータ（カンプトＴＭインタビューフォームより）にもとづくと、大腸癌治療レジメン（１８０ｍｇ／ｍ２／日）によるイリノテカン投与１回目に得られるＳＮ－３８の血中濃度曲線下面積（ＡＵＣＳＮ－３８）は１４４９ｎｍｏｌ．ｈ／Ｌと計算され、本検討で用いた７２時間薬剤曝露により同等の曝露量が得られるＳＮ３８の濃度は２０ｎＭと算出されることから、各がん細胞株のＳＮ－３８に対するＩＣ５０値について２０ｎＭをカットオフ値として、高感受性及び低感受性の２群に分類した。その結果、ｍ／ｚとして１１，０００～１１，１００に検出されたピークのピーク強度は低感受性群において有意な上昇を認めた（図６）。
実施例４
　実施例１において、ｍ／ｚ　１１，０００～１１，１００のピークとして検出されたタンパク質（タンパク質Ａ１）の性質を調べるために、ｐＨの変化に伴うピーク強度の変化、およびＣＭ１０チップアレイとは異なる化学修飾がチップ表面に施されたプロテインチップアレイにおける検出の有無について検討を行った。
（１）方法
（ａ）検討に用いたプロテインチップアレイとバッファー条件
　陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及び陰イオン交換チップアレイ（Ｑ１０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に対しては、ｐＨ３．０（５０ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ３．５（５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ４．０（５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ４．５（５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ５．０（５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ５．５（５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ６．０（５０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ６．５（５０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ７．０（５０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ７．５（５０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．０（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．５（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．０（５０ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．５（５０ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ　ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ１０．０（５０ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ　ｂｕｆｆｅｒ）の１５種類のバッファーを用い、金属修飾（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ）チップアレイ（ＩＭＡＣ３０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に対してはｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を用いた。
（ｂ）ＣＭ１０及びＱ１０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調整及びプロテインチップの作成と分析条件
　ＣＭ１０及びＱ１０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調整及びプロテインチップの作成は、（ａ）の各バッファーを用いて実施例１の（１）方法前記（ｅ）に準じて実施した。ただし分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＴＭ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ　ＰＣＳ４０００　Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、Ｍａｓｓ　Ｒａｎｇｅ　０～７０，０００　Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ　Ｍａｓｓ　１１，０００　Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ　３０００　ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓ　の条件にて分析を行なった。
（ｃ）ＩＭＡＣ３０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調整及びプロテインチップの作成と分析条件
　ＩＭＡＣ３０チップアレイは５０ｍＭ　ＮｉＳＯ４にてスポット表面の活性化を行い、ｍｉｌｌｉＱ水により１回リンスした後、ＰＢＳにて前処理を行った。サンプル調整及びチップへのサンプルａｐｐｌｙ以降の作業は、バッファーとして上記（ａ）のＰＢＳを用い、実施例１の（１）方法前記（ｅ）に準じて実施した。ただし分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＴＭ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ　ＰＣＳ４０００　Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、Ｍａｓｓ　Ｒａｎｇｅ　０～７０，０００　Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ　Ｍａｓｓ　１１，０００　Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ　６０００ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓ　の条件にて分析を行なった。
（２）結果
　実施例１で、ＣＭ１０チップアレイを用いたｐＨ４．５の分析条件においてｍ／ｚ　１１，０００～１１，１００のピークとして検出された上記候補タンパク質は、ＣＭ１０チップアレイ及びＱ１０チップアレイいずれにおいてもｐＨ７．０～７．５において顕著なピークの低下を認め、この候補タンパク質の等電点（ｐＩ）は、ｐＩ　７．０～７．５と推定された。また、チップ表面をＮｉＳＯ４により活性化したＩＭＡＣ３０チップアレイにても検出が確認された。
実施例５（候補タンパク質Ａ１の同定）
（１）候補タンパク質Ａ１の分子量の推定
　細胞内タンパク質抽出サンプルについて、分子量既知のｂｏｖｉｎｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ（５７３３．５１Ｄａ）及びｅｑｕｉｎｅ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ（１２３６０．９６Ｄａ）をＣａｌｉｂｒａｎｔとして用い、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いてタンパク質発現解析時と同じ分析条件（ＣＭ１０チップアレイ及び５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．５）にてＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎを行なった。その結果、候補タンパク質Ａ１ピークの分子量は１１０７２Ｄａと推定された（図７）。
（２）候補タンパク質Ａ１の精製と同定
（精製）
　候補タンパク質Ａ１の精製及び同定を目的として、タンパク質発現解析において候補タンパク質が高発現を示した細胞株ＨＴ－２９及び低発現を示した細胞株ＣＯＬＯ３２０の２細胞株より発現解析時と同様の方法により細胞内タンパク質を抽出した。タンパク質定量の結果にもとづき両サンプルより等量を分取し、ＴＣＡ沈殿を行なった後、回収した沈殿を冷エタノール／エーテル溶媒にて洗浄し室温にて乾燥した。この沈殿にＩＥＦ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（６Ｍ　ｕｒｅａ，２Ｍ　ｔｈｉｏｕｒｅａ，３％　ＣＨＡＰＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ＤｅＳｔｒｅａｋ　ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス）を加え、室温で攪拌及び超音波処理を行なった。
　調整したＩＥＦサンプル溶液を遠心し、上清をＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　ｇｅｌ（ｐＨ３～１０　ｎｏｎ－ｌｉｎｅａｒ，１３ｃｍ，ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス）にａｐｐｌｙし、ゲルの膨潤を行なった後、等電点電気泳動を行なった（５０００Ｖ，１５ｈｒ）。
　等電点電気泳動終了後、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　ｇｅｌを二次元電気泳動用のｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（６Ｍ　ｕｒｅａ，２０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％　ＤＴＴ，２％　ＳＤＳ，１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．８）中で平衡化し、平衡化の終了したＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ　ｇｅｌを２５ｍＡの定電流にて電気泳動を行なった。ゲルは１０～１８％、１６×１６ｃｍポリアクリルアミドグラジェントゲル（バイオクラフト）を用い、電気泳動後のゲルはＣＢＢ　Ｇ－２５０により染色後、５％酢酸にて脱色を行なった。
　二次元電気泳動の画像取得にはＧＳ－８００　ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、画像解析はＰＤＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い比較解析を行った。
（同定）
　プロテインチップを用いたＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ分析により得られた候補タンパク質Ａ１に関する情報（分子量　１１０７２、ｐＩ　７．０～７．５）に基づき、２次元電気泳動にて展開したゲル上の分子量１０～１５ｋＤａ及び、およそｐＩ　６．５～８．０の範囲（中性付近）に分離されたスポットを対象とし、これらの中からＣＯＬＯ３２０と比較してＨＴ－２９において高い発現を示していた４スポットを選択した（図８）。これらのスポットを切り出し、公知の方法に従ってタンパク質のゲル内トリプシン消化を行った後、ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（液体クロマトグラフ質量分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて分析（ＭＳ／ＭＳ測定）を行い、得られた結果についてＭＡＳＣＯＴデータベース検索を行なった。
　分析を行なった４スポットのうち、図８に示すスポット４にて同定されたタンパク質Ａ１（分子量１１，０７２、ｐＩ　７．３）は、プロテインチップアレイを用いたＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ分析により得られた結果（分子量　１１０７２、ｐＩ　７．０～７．５）と一致した。これにより、オキサリプラチン感受性と相関を示したｍ／ｚ　１１，０００～１１，１００のピークとして検出された候補タンパク質Ａ１は、Ｓ１００Ａ１０（Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ１０、Ｃａｌｐａｃｔｉｎ－１　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、Ｃａｌｐａｃｔｉｎ　Ｉ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、ｐ１０　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｐ１１、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｉｇａｎｄ　ｏｆ　ａｎｎｅｘｉｎ　ＩＩ）と同定された。
実施例６（Ｓ１００Ａ７及びＳ１００Ａ８）
　がん細胞株の細胞内タンパク質抽出サンプルを、ＣＭ１０プロテインチップアレイ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて、実施例１の（１）方法前記（ｅ）と同様の条件にて分析した結果、オキサリプラチン感受性との関連を示す２つのタンパク質ピーク、タンパク質Ａ２及びタンパク質Ａ３を見出した。
　タンパク質Ａ２のピーク強度は各がん細胞株のオキサリプラチン（Ｌ－ＯＨＰ）感受性（ＩＣ５０値）と有意な相関性を示した（図９）。
　また、各がん細胞株のオキサリプラチンに対するＩＣ５０値にもとづき、オキサリプラチン臨床使用時のピーク血中濃度にほぼ相当する５．０μＭをカットオフ値としてがん細胞株を高感受性及び低感受性の２群に分類すると、タンパク質Ａ３のピーク強度は低感受性群において有意な上昇を認めた（図１０）。なお、細胞株ＬＳ１７４Ｔは、Ｓ／Ｎ比が５未満であったため、解析対象から除外した。
　タンパク質Ａ２及びタンパク質Ａ３のピークはＳ１００Ａ１０の近傍に存在しており、Ｃａｌｉｂｒａｎｔとしてｂｏｖｉｎｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ（５７３３．５１Ｄａ）及びｅｑｕｉｎｅ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ（１２３６０．９６Ｄａ）を用いてＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎを行った結果、タンパク質Ａ２は１０８３５Ｄａ、タンパク質Ａ３は１１３４０Ｄａと推定された。
　さらに実施例２と同様に、ＣＭ１０チップアレイ及びＱ１０チップアレイ各々に対してｐＨ３．０～ｐＨ１０．０の１５種類のバッファーを用い、各ピーク強度の変化をＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより分析した結果、１０８３５Ｄａを示すピークはｐＨ６．５～７．０において顕著なピークの低下を、１１３４０Ｄａを示すピークはｐＨ６．０～６．５にかけて急激なピークの上昇を認めたことから、各々ｐＩは６．５～７．０、６．０～６．５と推定された。
　これらの結果にもとづきデータベース（Ｅｘｐａｓｙ　ＴａｇＩｄｅｎｔ　ｔｏｏｌ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）検索した結果、１０８３５Ｄａで示されるピークはＳ１００Ａ８（Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ８、Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ－Ａ、Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　８、ＭＲＰ－８、ｐ８など）、１１３４０Ｄａで示されるピークはＳ１００Ａ７（Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ７、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）であることが示された（図１１）。
比較例１
　実施例６と同様にして、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより分子量１３，２４２のＳ１００Ａ９と推定されるピークについて、オキサリプラチン感受性との関連について検討した。その結果、Ｓ１００Ａ９発現量とオキサリプラチン感受性との間に有意な関連は認められなかった（図１２）。従って、Ｓ１００Ａ９には抗がん剤感受性との間に関連性はないことが判明した。
実施例７
１）方法
　ｍ／ｚとして１１，０００～１１，１００に検出されたピークの高発現細胞ＨＴ－２９、および低発現細胞ＣＯＬＯ３２０を用いて、実施例１と同様の方法により細胞内タンパク質を抽出後、１６．５％ポリアクリルアミドゲルに１レーンあたりタンパク量１０μｇをａｐｐｌｙし、１００Ｖ定電圧にてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行なった。泳動後、ドライブロッティングシステム（ｉＢｌｏｔＴＭ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロットし、ブロッキングを行なった後、Ｓ１００Ａ１０に対しては抗Ｓ１００Ａ１０モノクローナル抗体（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ａｎｎｅｘｉｎ　ＩＩ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢＤ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、内在性タンパク質については抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて一次抗体反応を行なった。アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と二次抗体反応をさせた後、反応基質としてＣＤＰ－ＳｔａｒＴＭ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加して発光させ、ルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ）により検出した。ブロッキング試薬、二次抗体および反応基質はＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅＴＭ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
（２）結果
　プロテインチップアレイを用いたタンパク質発現解析（実施例１）において、ｍ／ｚとして１１，０００～１１，１００に検出されたピークの高発現細胞ＨＴ－２９、および低発現細胞ＣＯＬＯ３２０におけるＳ１００Ａ１０の発現は、抗Ｓ１００Ａ１０モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された（図１３）。

Claims (14)

  1. 　カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ１０を含有する抗がん剤感受性判定マーカー。
  2. 　抗がん剤が、白金錯体系抗がん剤又は植物アルカロイド系抗がん剤である請求項１記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  3. 　抗がん剤が、オキサリプラチン、シスプラチン、イリノテカン、ＳＮ－３８又はそれらの塩である請求項１又は２記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  4. 　検体中の請求項１～３のいずれか１項記載の抗がん剤感受性判定マーカーを測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法。
  5. 　検体が、がんを有する被験者由来の生体試料であることを特徴とする請求項４記載の判定方法。
  6. 　検体が、抗がん剤を投与された、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項４又は５記載の判定方法。
  7. 　検体中の請求項１～３のいずれか１項記載の抗がん剤感受性判定マーカーを測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項４～６のいずれか１項記載の判定方法を実施するためのキット。
  8. 　検体が、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項７記載のキット。
  9. 　検体が、抗がん剤を投与された、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項７又は８記載のキット。
  10. 　請求項１～３のいずれか１項記載の抗がん剤感受性判定マーカーの発現抑制を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
  11. 　請求項１０記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
  12. 　請求項１１記載の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物。
  13. 　請求項１１記載の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤との組み合せの、がん治療薬製造のための使用。
  14. 　請求項１１記載の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを投与することを特徴とするがん治療方法。
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