WO2009125877A1 - 平滑筋幹細胞の単離方法 - Google Patents

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smooth muscle
stem cells
antibody
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丸山哲夫
小野政徳
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    • G01N2333/70589—CD45

Definitions

  • the present invention relates to a smooth muscle-derived tissue stem cell having a specific surface marker, a novel isolation method and culture method thereof, and use thereof.
  • Intrinsic organisms present in various organs and tissues
  • stem cells present in various organs and tissues
  • stem cells derived from various tissues have been reported, and stem cells have been isolated.
  • stem cells isolated so far include skeletal muscle stem cells, cardiac muscle stem cells, liver stem cells, neural stem cells, knee stem cells, epidermal stem cells, adipose tissue stem cells, and the like.
  • the isolation method the side population (SP) method is often used, and the present inventor previously isolated smooth muscle stem cells of human uterus using the SP method (see Patent Document 1).
  • Regenerative medicine is currently attracting a great deal of attention as a medical treatment that restores and restores the function of human cells and tissues that have been damaged or lost due to diseases or trauma. If it becomes possible to isolate and identify the above-mentioned tissue stem cells and replicate and proliferate, it is considered that regenerative medicine will be possible.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-202435 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide smooth muscle stem cells, particularly uterine muscle stem cells, and to provide utilization of these stem cells.
  • hypotrophy and an increase in the number of cells (hyperplasia) can occur, and that dramatic change can be repeated more than 20 times in a woman's lifetime. Conspicuous during pregnancy and delivery It is a very unique tissue that shows an increase in cell numbers and is known to undergo rapid apoptosis during the postpartum period.
  • the present inventor focused on a series of events such as an increase in the number of cells and apoptosis during pregnancy and postpartum, and considered the possibility that tissue stem cells exist in uterine smooth muscle, which is the main constituent tissue of myometrium. It was.
  • the present inventor previously invented a method for isolating human uterine smooth muscle stem cells by the SP method (Japanese Patent Laid-Open No. 2007-202435).
  • the SP method undergoes a process of screening by irradiating with a UV laser after reaction with a DNA dye, the safety and sterility of isolated stem cells, including cell damage, cannot be guaranteed.
  • the present inventor attempted isolation using a surface marker as a method that can ensure the safety and sterility of isolated cells with little damage to the cells. Specifically, normal myometrium was collected, dispersed cells were obtained by enzyme treatment, and Lin (CD31, CD45, Glycophorin A) negative cells were selected by flow cytometry, and then CD34 positive / CD49f positive cells (Double Positive Cells were sorted into DP / Lin-) and other cells (nonDP).
  • double positive cells characterized in that CD31, CD45 and Glycophorin A are negative and CD34 and CD49f are positive from the dispersed cells; DP / Lin- is used as the eclampsia DP / Lin- (DP / Lin- ) As FACS.
  • double positive cells DP characterized by being positive for CD34 and CD49f can be isolated as eclamptic muscle DP using the expression of only CD34 and CD49f as an index.
  • double positive cells DP, which is characterized by positive CD34 and CD49f, were selected from cells negative for CD45, and DP could be isolated as myometrium DP.
  • DP / Lin- and DP can be induced to differentiate into bone, fat, and chondrocytes in vitro, and when DP / Lin- and DP are transplanted into an immunodeficient mouse, myometrial tissue is reconstructed.
  • the isolated cells were confirmed to be uterine smooth muscle stem cells.
  • the present invention is as follows.
  • a method for isolating mammalian smooth muscle-derived smooth muscle stem cells comprising anti-CD31 antibody, anti-CD45 antibody, anti-Glycophorin A anti-antibody wherein mammalian smooth muscle cells are labeled with a fluorescent dye.
  • a method for isolating smooth muscle stem cells comprising anti-CD31 antibody, anti-CD45 antibody, anti-Glycophorin A anti-antibody wherein mammalian smooth muscle cells are labeled with a fluorescent dye.
  • a method for isolating mammalian smooth muscle-derived smooth muscle stem cells comprising contacting mammalian smooth muscle cells with an anti-CD34 antibody and an anti-CD49f antibody labeled with a fluorescent dye, and anti-CD34 antibody and anti-CD49f
  • a method for isolating smooth muscle stem cells comprising isolating cells that bind to an antibody.
  • [3] A method for isolating smooth muscle stem cells derived from mammalian smooth muscle, wherein the mammalian smooth muscle cells are contacted with an anti-CD45 antibody, an anti-CD34 antibody and an anti-CD49f antibody labeled with a fluorescent dye.
  • [4] A method for isolating smooth muscle stem cells according to any one of [1:] to [3], wherein cells are sorted using flow cytometry.
  • Mammalian smooth muscle cells are sorted into Lin (CD31, CD45, Glycophorin A) positive cells (Lin +) and Lin negative cells (Lin-) by flow cytometry, and Lin negative cells are collected.
  • Lin CD31, CD45, Glycophorin A
  • Lin- Lin negative cells
  • [9] A method for isolating smooth muscle stem cells according to any one of [1] to [8], wherein the mammal is human.
  • [1 2] A smooth muscle stem cell that is negative for CD45 and positive for CD34 and CD49f isolated by any of the methods of [1] to [9].
  • the smooth muscle stem cell derived from uterine muscle having the ability to differentiate into uterine muscle when transplanted into uterine muscle.
  • composition for smooth muscle tissue regeneration comprising the smooth muscle stem cells according to any one of [10] to [15].
  • Fig. 11 shows the results of flow cytometric analysis of myometrial dispersed cells stained with fluorescently labeled antibodies.
  • FIG 1-2 shows the results of RT-PCR expression analysis of ABCG2 in DP / Lin_, nonDP / Lin-, and Lin +.
  • Tissue refers to the eclamptic muscle cells when dispersed by mechanical and enzymatic treatment (DP / Lin_, nonDP / Lin-and Lin +), and NC uses distilled water as a template. Indicates a negative control.
  • Fig. 2 is a graph showing cell proliferation activity as an index for the growth of DP / Lin- and other fractions cultured under a normal oxygen concentration of 20% or a low oxygen concentration of 2%.
  • Fig. 3 is a photograph showing Al force phosphatase staining microscopic images of DP / Lin- (Fig. 3A) and nonDP / Lin- (Fig. 3B) cultured in a bone cell induction medium.
  • FIG. 4 is a photograph showing oil red 0 stained microscopic images of DP / Lin ⁇ (FIG. 4A) and nonDP / Lin ⁇ (FIG. 4B) cultured in an adipocyte induction medium.
  • FIG. 5 is a photograph showing a microscopic image of DP / Lin- toluidine blue stained in a chondrocyte induction medium.
  • Fig. 6 is a photograph showing fluorescent immunostaining images of the uterus of N0G pregnant mice transplanted with DP / Lin- is there.
  • FIG. 7 is a photograph showing a fluorescent immunostained image of an estrogen (E 2 ) sustained-release pellet transplanted NOG mouse uterus transplanted with nonDP / Lin_.
  • Figure 8 is a graph showing the percentage of human cells due to pregnancy and estrogen (E 2 ) sustained-release pellet transplantation in the uterus of NOG mice transplanted with DP / Lin ⁇ , DP / Lin_, and Lin +.
  • FIG. 9 shows the results of flow cytometric analysis of myometrial dispersed cells that were stained with fluorescently labeled antibody and were not pre-selected using the Lin marker.
  • FIG. 10 is a diagram showing the cell distribution of the cell subfractions using CD31 expression in the DP (Double positiye; CD49f (+) CD34 (+)) fraction as an index.
  • FIG. 11 shows the results of differentiation marker gene expression analysis in the DP fraction, CD49f ( ⁇ ) CD34 (+) fraction and CD34 (_) fraction.
  • Fig. 12 is a photograph showing the state of colony formation of cells in the DP fraction.
  • Figure 13 shows the DP fraction, CD49f (-) CD34 (+) fraction, CD34 (-) fraction, CD31 (+) subfraction (DP 31+) and DP fraction in DP fraction.
  • FIG. 3 shows colony forming ability of CD31 ( ⁇ ) subfraction (DP 31-).
  • Fig. 14 is a photograph showing the result of transplanting the DP fraction into the uterus of a severely immunodeficient mouse.
  • the stem cells of the present invention are smooth muscle-derived tissue stem cells isolated from smooth muscle.
  • Smooth muscles from which the stem cells of the present invention are derived include uterine smooth muscles, visceral smooth muscles, and vascular smooth muscles, preferably uterine smooth muscles. These tissue pieces can be collected, and the cells can be dispersed, and stem cells can be isolated from the dispersed cells.
  • uterine fibroids can be used.
  • the animal species from which smooth muscles are collected is not limited, and mammals such as mice, rats, monolemots, hamsters, magpies, cats, inu, hidges, pigs, sushi, horses, goats, monkeys, humans, etc. Can be used.
  • the “stem cell” refers to a cell having self-replicating ability and pluripotency. Stem cells are usually able to regenerate the tissue when the tissue is damaged. Unlike embryonic stem cells, tissue stem cells are cells that have a limited direction of differentiation, exist in specific locations in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Therefore, tissue stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have a high nucleocytoplasm ratio and poor organelles. Tissue stem cells are generally pluripotent, have a slow cell cycle, and remain proliferative for the life of the individual. In the present invention, the term “stem cell” refers to a cell population containing at least a certain amount of stem cells, for example, a cell population containing 90% or more, preferably 95% or more of stem cells.
  • the smooth muscle stem cells of the present invention are Lin-, CD34-positive and CD49f-positive cells.
  • Lin-cells are cells that are negative for differentiation antigen and do not have surface antigens that appear in response to differentiation from stem cells to cells of a specific lineage, that is, these surface antigens are not expressed on the cell surface.
  • CD31 is an antigen expressed on almost all monocytes, platelets and granulocytes
  • CD45 is found on all leukocytes including peripheral blood lymphocytes, monocytes, granulocytes, eosinophils and basophils.
  • GPA is an antigen that is expressed and is associated with red blood cells.
  • CD34 is expressed in undifferentiated stem cells, and CD49f is expressed in platelets and megakaryocytes.
  • CD34 positive and CD49f positive cells are called double positive (DP) cells, Lin-, and CD34 positive and CD49f positive cells are called DP / Lin- cells.
  • the smooth muscle stem cell of the present invention further expresses ABCG2 (ATP-binding cassette transporter G2) which is a stem cell marker.
  • the smooth muscle stem cells of the present invention are CD34 positive and CD49f positive cells.
  • CD45, CD31 and Glycophorin A may be negative or positive.
  • the cells are also referred to as double positive (DP) cells.
  • the stem cells of the present invention can be isolated based on the antigenic properties of the smooth muscle cell surface. That is, cells that are Lin-, CD34-positive and CD49f-positive may be isolated from smooth muscle cells.
  • the stem cells of the present invention may be isolated from smooth muscle cells using CD34 and CD49f expression alone as an indicator. At this time, CD45-negative cells are selected in advance, and CD34-positive and CD49f-positive are selected from them. Certain cells may be isolated.
  • Cells can be dispersed by chopping tissue pieces and treating them with an enzyme such as collagenase. It is desirable to disperse the dispersed cells to the state of a single cell. For example, the cells are passed through a cell strainer, and further subjected to density gradient centrifugation using a specific gravity solution such as Ficoll-Paque (registered trademark), and then trypsinized. Etc. can be dispersed as a single cell.
  • a specific gravity solution such as Ficoll-Paque (registered trademark)
  • CD31, CD45, Glycophorin A, CD34, and CD49f labeled with different fluorescent dyes, or further antibodies against ABCG2 are contacted with dispersed smooth muscle cells to stain smooth muscle cells with surface antigens, and then flow cytometry or FACS
  • the smooth muscle stem cells of the present invention can be isolated by sorting DP / Lin_ cells using.
  • the cells may be isolated directly from smooth muscle cells by flow cytometry, or the antibodies against one or more of the differentiation antigens consisting of CD31, CD45 and Glycophorin A are bound before sorting by flow cytometry.
  • the cells having the differentiation antigen may be removed using the magnetic beads, and the cells of the present invention may be isolated from the remaining cells using FACS.
  • CD34 and CD49f labeled with different fluorescent dyes, or antibodies against CD45, CD3 and CD49f are contacted with dispersed smooth muscle cells to stain smooth muscle cells with surface antigens, and flow cytometry or FACS is used. Then, the smooth muscle stem cells of the present invention can be isolated by sorting DP cells. At this time, CD34 and CD49f-positive cells may be isolated directly from smooth muscle cells by flow cytometry, or have CD45 by using magnetic beads to which an antibody against CD45 is bound before sorting by flow cytometry. The cells of the present invention may be isolated from the remaining cells using FACS.
  • Cy As fluorescent dyes used for labeling, Cy (trademark) 3, Cy5, Texas Red (trademark),
  • APC allophycocyanin PE (phycoerythrin), PE-Cy5, FITC (fluorescein isothiocyanate), PerCP, and the like.
  • FACS vantage manufactured by Becton Dickinson
  • FACS Calibur manufactured by Becton Dickinson
  • the isolated stem cell of the present invention can be grown by culture.
  • the medium to be used is not limited, and a known medium (for example, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium) can be used.
  • DMEM Denbecco's modified Eagle's medium
  • mesenchymal stem cel l basal medium (MSCBM)) (Cambrex Bio Science, present Poietics)
  • MSCGM mesenchymal stem cel l growth medium
  • Etc. can be used.
  • serum such as urine fetal serum
  • antibiotics such as penicillin and streptomycin
  • various physiologically active substances may be added as appropriate.
  • the culturing oxygen concentration should be lower than 20% of the normal culturing. Preferably it is 5% or less, more preferably 2.5% or less, particularly preferably 2%.
  • stem cells can be proliferated. Cells may be seeded and cultured in a tissue culture culture dish.
  • the isolated stem cells of the present invention can be induced to differentiate into specific tissue cells in vitro. Since the stem cells of the present invention have pluripotency, they can basically be induced to differentiate into any tissue cell. Differentiation-inducing media for various tissues are commercially available, and differentiation can be induced using these commercially available media. For example, when inducing differentiation into bone cells, a bullet kit osteoblast differentiation medium (Cambrex Bioscience, currently Poietics) may be used. When inducing differentiation into adipocytes, a bullet kit fat cell differentiation medium is used.
  • the smooth muscle stem cells of the present invention can be induced to differentiate into smooth muscle tissue cells such as uterine muscle tissue cells.
  • the oxygen concentration is the normal cell culture condition, that is, about 20%. Cells differentiated into these tissue cells can be further cultured to construct a tissue.
  • stem cells have been induced to differentiate into tissue cells can be determined by examining the expression of markers specific to each tissue cell. For example, differentiation into bone cells can be examined by the presence or absence of Al force phosphatase staining positive cells, and differentiation into adipocytes can be examined by the presence or absence of oil red 0 staining positive cells. Furthermore, differentiation into chondrocytes can be examined by the presence or absence of toluidine blue staining positive cartilage pellets.
  • the present invention includes cell lines in which the smooth muscle stem cells of the present invention are immortalized.
  • the Cell lines have both proliferative and pluripotency, and can be used by growing as many times as necessary.
  • the established cell line can be used as a research tool for smooth muscle differentiation and development.
  • Human cells become immortalized by radiation, mutagens, and viruses (in some cases, cancer cells), but more recently, compared to original cell characteristics without causing oncogenesis or chromosomal abnormalities.
  • hTERT human telomerase reverse transcriptase gene
  • SV40T gene a human telomerase reverse transcriptase gene
  • the smooth muscle stem cells of the present invention can be used for regenerative medicine and the like. For example, by transplanting and administering the smooth muscle stem cells of the present invention to a damaged smooth muscle site by injection using a syringe, the stem cells are differentiated into smooth muscle cells, and the damaged smooth muscle can be regenerated. Further, as described above, the stem cell of the present invention may be induced to differentiate in vitro, a tissue is constructed, and the tissue may be transplanted. In these regenerative medicine, in order to avoid rejection by the recipient of the transplanted cells or tissues, a tissue piece is collected from a patient who is going to receive regenerative medicine, and the smooth muscle stem cells of the present invention are isolated from the tissue piece. It is desirable to use it separately.
  • a tissue piece is collected from the remaining myometrium of a patient whose part of the uterus has been removed due to a disease such as uterine sarcoma, and myometrial stem cells are isolated from the tissue piece. It can be used for playback.
  • the smooth muscle stem cells of the present invention can be differentiated into other tissues. For example, by removing a piece of tissue from a smooth muscle such as myometrium from a patient who has damaged a specific tissue other than smooth muscle, isolating smooth muscle stem cells and inducing differentiation of the smooth muscle stem cells into damaged tissue. It can be used for regenerative medicine of tissues other than smooth muscle.
  • the present invention also includes a composition for regenerative medicine containing the stem cells of the present invention, that is, a preparation for regenerative medicine.
  • the stem cells of the present invention derived from humans into animals other than humans and immunodeficient animals, it is possible to obtain model animals partially having human smooth muscle tissue.
  • the smooth muscle stem cells of the present invention into the smooth muscle of an immunodeficient animal, the stem cells of the present invention differentiate into smooth muscle, and a human smooth muscle tissue is partially constructed in the animal body.
  • human smooth muscle tissue is constructed in the animal body, it is necessary to measure the protein specific to human smooth muscle expressed by cells and confirm that it has the characteristics of smooth muscle morphologically. Good.
  • smooth muscle is myometrium
  • vimentin is positive It is only necessary to confirm that it is derived from human (red) and a SMA positive cell (green) morphologically uterine smooth muscle.
  • the animal partially having human smooth muscle tissue thus obtained can be used as a model animal having human smooth muscle tissue.
  • the smooth muscle when the smooth muscle is a uterine muscle, it can be used for screening for drugs that contract the uterus or relax the uterus.
  • the smooth muscle stem cells of the present invention when transformed into cancer and transplanted, a model animal having human uterine cancer or the like can be produced and used for screening for therapeutic agents.
  • immunodeficient animals include immunodeficient mice such as scid mice and NOG mice.
  • a fibroid isolated from a human uterus is cut into small pieces of approximately 2 mm 3 with scissors, 0.2% (w / v) collagenase (Wako Pure Chemicals, Osaka), 0.05% (w / v) DNasel (GIBC0, Reformia, USA) containing DMEM medium (1% antibiotic monoantifungal [GIBC0], 10% urchin fetal serum [BioWest, Florida, USA] In Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Missouri, USA)) at a rate of 10 ml per lg of tissue pieces and shaken at 37 ° C for 16 hours for enzymatic cell dispersion Processed. Subsequently, after filtering through a 400 jum pore size polyethylene mesh, an additional 40 ⁇ pore size cell strainer
  • the above dispersed single myometrial cell population was added to Hank's equilibration buffer (free of calcium and magnesium, containing 2% fetal urine serum, 10 raM HEPES, and 1% pecillin and streptomycin. HBSS +) suspended at a concentration of 2 X 10 6 The antibody was added and reacted at 4 ° C for 30 minutes. Subsequently, after centrifugation at 4 ° C, the suspension was suspended in 2 ml of the above Hanks solution and stained with Propidium Iodide (PI) for selection of dead cells.
  • PI Propidium Iodide
  • the fluorescence-labeled antibodies used were PE-conjugated anti-CD31 antibody (IgGl, BD Biosciences), PE-conjugated anti-CD45 antibody (IgGl, BD Biosciences), PE-conjugated anti-Glycohporin A antibody (IgG2b, BD Biosciences), APC-conjugated anti-CD34 antibody ( IgGl, BD Biosciences) and FITC-conjugated anti-CD49f antibody (IgG2a, BD Biosciences).
  • cell populations were developed in two dimensions by flow cytometry.
  • the stained dispersed cells were analyzed using flow cytometry (FACS Vantage SE, Becton Dickinson) and analysis software (Cell-Quest, Becton Dickinson).
  • Figure 1 shows the cell distribution.
  • 1 x 10 5 cells were collected in a two-dimensional manner, and Lin (CD31, CD45, Glycophorin A) positive cells (Lin +) and negative cells (Lin-) were selected (Fig. 1 _ 1
  • the cells were sorted into CD34 positive / CD49f positive cells (Double Positive cells; DP / Lin-) and other cells (nonDP / Lin-) (Fig. 1-1C).
  • Double Pos itive cells; DP / Lin- fractions were collected and used as eclampsia DP / Lin- cells.
  • Figure 1-2 shows the result. The expression level of the internal standard GAPDH was not different between the two. This indicates that DP / Lin_ expresses the stem cell marker ABCG2 higher than other fractions and is in an immature stage with a lower degree of differentiation.DP / Lin- It has properties that match the characteristics.
  • Example 2 Myometrial Double Pos i tive cells; DP / Lin-cell culture
  • DP / Lin- has pluripotency, which is one of the stem cell characteristics
  • DP / Lin- under a medium that can induce differentiation into adipocytes, bone cells, and chondrocytes, respectively. And examined whether they can differentiate into different cell lineages.
  • Pre-kit adipocyte differentiation medium (Cambrex Bio Science, Sanko Junyaku Co., Ltd., product number PT-3002) is used as a differentiation-inducing medium for bone cells.
  • the medium (Cambrex Bio Science, Sanko Junyaku, product number PT-3004) was used.
  • Prech chondrocyte differentiation medium (manufactured by Cambrex Bio Science, Sanko Junyaku Co., Ltd., product number PT-4121) was used.
  • NOG mice (N0D / SCID / ⁇ c nu11 ) mice (Laboratory of Laboratory Animal Research, Kawasaki City) were injected intraperitoneally with 350 IX 1 phosphate buffer (Sigma) containing 10% pentobarbital (Dainippon Pharmaceutical). Anesthetized. About 5 ⁇ 10 4 DP / Lin ⁇ and DP / Lin ⁇ separated as described above were injected into each uterine horn of a NOG mouse using a 29 gauge needle, and then reared for about 4 to 5 weeks. From 4 to 5 weeks after the transplantation, NOG mice after transplantation were divided into three groups and the kinetic analysis of stem cells in vivo was performed.
  • the first group transplanted two tablets of Estrogen (E 2 ) sustained-release Perez® (Innovative Research of America, Florida, USA) to create a highly estrogenic environment. Then the second group did nothing. Finally, the third group was mated with male mice and analyzed for 18.5 days of gestation.
  • Estrogen E 2
  • Perez® Innovative Research of America, Florida, USA
  • the uterus was removed, embedded in Tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetech, Calif., USA), frozen, and then sliced continuously at a thickness of 6 m using a cryostat (Leica Microsystems, Germany, Wetzlar). For the frozen section obtained,
  • the cells were permeabilized with a phosphate buffer containing 0.2% Triton®-100 for 10 minutes and then immersed in a 10% ushi serum albumin solution for 30 minutes for blocking treatment. Subsequently, the sections subjected to these treatments are a-smooth muscle, which is a marker of uterine smooth muscle. After reacting with an antibody against act in (a SMA) (clone 1A4, 200-fold dilution, DAKO Cytomatio, Denmark) at 4 ° C overnight, Alexa Fluor 488 (for green fluorescence) labeled secondary antibody (Molecular Primary antibodies were detected using Probes, Oregon, USA (1000-fold dilution, 37 ° C, 1 hour).
  • a viraentin antibody (clone V9) that reacts only with human cells directly labeled with Cy3 (Sigma_Aldrich), a red fluorescent dye, and fluorescent double staining was performed. Furthermore, the sections were counterstained with the nuclear stain TOTO-3 (Molecular Probes). The sections after each staining were examined with a TCS SP2 confocal microscope (Leica Microsystems).
  • the eclampsia transplanted with DP / Lin_ is derived from vimentin-positive, ie, human (red), and a SMA-positive cell (green) morphologically. A muscle tissue (yellow) appeared.
  • the human-derived tissue seen in the above-mentioned DP / Lin- is not observed, and there are human-derived cells as shown in Fig. 7. (Red), they were distributed in the interstices of mouse smooth muscle tissue (green).
  • each isolated cell fraction was cultured in a culture dish at a low cell density of 200 cel ls / cm 2 and analyzed for colony forming ability.
  • the culture dish was scraped with a 29G needle so that the behavior of each cultured cell could be grasped.
  • a fibroid isolated from a human uterus is cut into small pieces of approximately 2 mm 3 with scissors.
  • the above dispersed single myometrial cell population was mixed with Hank's equilibration buffer containing 2% fetal urine serum, 10 mM HEPES, and 1% penicillin and streptomycin (without lucium and magnesium, HBSS + ) was suspended at a concentration of 2 ⁇ 10 6 , a fluorescent-labeled antibody was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the mixture was centrifuged at 4 ° C, suspended in 2 ml of the above Hanks solution, and stained with Propidium lodide (PI) for selection of dead cells. The fluorescently labeled antibody used in Example 1 was used.
  • Hank's equilibration buffer containing 2% fetal urine serum, 10 mM HEPES, and 1% penicillin and streptomycin (without lucium and magnesium, HBSS + ) was suspended at a concentration of 2 ⁇ 10 6 , a fluorescent-labeled antibody was added, and
  • PI live cells
  • CD45 negative and FSC Forward scatter; indicating cell size
  • 150-500 cells can be divided into two-dimensional cell populations by flow cytometry based on fluorescence intensity Expanded to.
  • the stained dispersed cells were analyzed using flow cytometry (FACS Vantage SE, Becton Dickinson) and analysis software (Cel-Quest, Becton Dickinson). Expression analysis of the differentiation marker gene of the fractionated cells was performed in the same manner as in Example 1. Further examples
  • Figure 9 shows the cell distribution.
  • Fig. 9A shows the cell distribution of the entire cell population.
  • Fig. 9 B, C and D show DP (Double positive; CD49f (+) CD34 (+)) fractions, respectively.
  • CD49f (-) CD34 (+) The cell distribution of each fraction and CD34 (_) fraction is shown.
  • the horizontal axis shows the strength of CD49f, and the vertical axis shows the strength of CD34.
  • DP (Double positive) fraction was 9.8%
  • 49f (-) 34 (+) fraction was 13.7%
  • 34 (-) fraction was 43.8%. From this, the DP (CD49f (+) CD34 (+)) fraction was collected.
  • Fig. 10 shows the cell distribution of the cell subfractions using CD31 expression in the DP fraction as an index.
  • the DP fraction could be further divided into two subfractions (DP 31+ and DP 31-) depending on the presence or absence of CD31 expression.
  • Fig. 1 OA shows the cell distribution of the entire cell population
  • Fig. 10B shows the cell fraction of the DP fraction.
  • FIG. 10C shows the expression pattern of CD31 in the DP fraction
  • FIG. 10D shows the cell distribution in the CD31 (+) fraction
  • FIG. 10E shows the cell distribution in the CD31 (_) fraction.
  • PI (-) cells in the single myometrial cell population 3.6% of CD31 positive cells were present and 3.7% of CD31 negative cells were present.
  • Figure 11 shows the results of differential marker gene expression analysis in the DP fraction, CD49f (-) CD34 (+) fraction, and CD34 (-) fraction.
  • the DP fraction had lower expression levels of ERa, ER / 3 and smooth muscle differentiation markers than the other fractions.
  • ABCG2 was strongly expressed.
  • Figure 12 shows the state of colony formation on day 1 (A), day 7 (B), day 14 (C), and day 21 (D) of cells in the DP fraction.
  • Figure 12 2E and F show the state of the growing colonies.
  • Figure 13 shows DP fraction, CD49f (-) CD34 (+) fraction, CD34 (_) fraction, CD31 (+) sub-fraction (DP 31+) and DP fraction in DP fraction. Shows the colony-forming ability of the CD31 (-) subfraction (DP 31_). As shown in the figure, the DP fraction had higher colony-forming ability compared to other fractions (CD49f ( ⁇ ) CD34 (+) fraction, CD34 (_) fraction). In addition, there was no difference in colony forming ability between the CD31 (+) subfraction and the CD31 ( ⁇ ) subfraction in the DP fraction.
  • Figure 14 shows the results of transplanting the DP fraction into the uterus of severely immunodeficient mice.
  • tissue that is vimentin-positive, ie, human-derived (red) and c SMA-positive cells (green) and morphologically uterine smooth muscle (yellow) Appeared As shown in the figure, in the uterus transplanted with the DP fraction, tissue that is vimentin-positive, ie, human-derived (red) and c SMA-positive cells (green) and morphologically uterine smooth muscle (yellow) Appeared. This indicates that the cells of the DP fraction have the ability to build myometrial tissue.
  • DP / Lin- and CD45 which are negative for CD31, CD45 and G1 ycophor in A of the present invention, and positive for CD34 and CD49f, are negative for CD34 and DP / Lin- and DP are uterine muscles because DP, which is positive for CD49f, has tissue stem cell characteristics such as 1) undifferentiated state, 2) pluripotency, 3) self-organization ability. This was the first in the world to succeed in the isolation of myometrial tissue stem cells.
  • the isolated DP / Lin- and DP can be used to analyze the pathogenesis of the myometrium, the cell mechanism responsible for the growth / retraction of the myometrium during pregnancy / parturition, and the function of the myometrium, as well as the pathogenesis It will be a useful biological resource for drug development.
  • DP / Lin- cells and DP cells are also expected to be clinically applied as cell materials in the treatment of other organs.

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Abstract

本発明は、哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗CD45抗体、抗CD34抗体および抗CD49f抗体と接触させ、抗CD45抗体と結合せず、抗CD34抗体および抗CD49f抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細胞を単離する方法である。

Description

明 細 書 平滑筋幹細胞の単離方法 技術分野
本発明は、 特定の表面マーカーを有する平滑筋由来の組織幹細胞、 その新しい 単離方法および培養方法ならびにその利用に関する。 背景技術
様々な器官 ·組織に存在する固有の生体 （組織） 幹細胞が、 それぞれの器官 - 組織の維持と再生を担っていること力 近年明らかになってきた。現在までに種々 の組織由来の幹細胞について報告され、 また幹細胞が単離されている。
現在までに単離された幹細胞として、 例えば、 骨格筋幹細胞、 心筋幹細胞、 肝 臓幹細胞、 神経幹細胞、 膝臓幹細胞、 表皮幹細胞、 脂肪組織幹細胞等が挙げられ る。 その単離方法として、 side population (SP) 法が用いられることが多く、 本 発明者は以前に SP法を用いてヒ ト子宮の平滑筋幹細胞を単離した（特許文献 1を 参照）。
再生医療は、 疾患や外傷などで損傷し、 または喪失した人体の細胞や組織を修 復し、 その機能を回復させる医療として現在大きな注目を受けている。 上記の組 織幹細胞を単離同定し、 複製増殖させることが可能になれば、 再生医療が可能に なると考えられている。
特許文献 1 特開 2007-202435号公報 発明の開示
本発明は、 平滑筋幹細胞、 特に子宮筋幹細胞の提供を目的とし、 さらにそれら の幹細胞の利用の提供を目的とする。
平滑筋の 1種である子宮筋は年の単位で、 妊娠による著明な細胞サイズの増大
(hypertrophy)と細胞数の増加（hyperplasia)を起こすことが可能であり、 その劇 的な変化を女性の一生において 20回以上も反復し得る。妊娠 ·分娩時には著明な 増大と細胞数の増加を示し、 産褥期には急激にアポトーシスを起こすことが知ら れている非常にユニークな組織である。
本発明者は、 妊娠から産褥期における細胞数の増加およびアポトーシスという 一連のイベントに着目し、 子宮筋の主な構成組織である子宮平滑筋において、 組 織幹細胞が存在している可能性を考えた。本発明者は以前に SP法でヒ ト子宮の平 滑筋幹細胞を単離する方法を発明した （特開 2007-202435 号公報）。 しかし、 SP 法では、 DNA色素との反応後に UV レーザーを照射し選別する過程を経るため、 細 胞のダメージも含め、 単離した幹細胞の安全性 ·無菌性が担保されない。
そこで、 本発明者は、 細胞のダメージが少なく、 且つ単離細胞の安全性や無菌 性が担保できる方法として、 表面マーカーを用いた単離を試みた。 すなわち、 正 常子宮筋層を採取し、 酵素処理により分散細胞を得て、 フローサイ トメ トリーに より Lin (CD31, CD45, Glycophorin A)陰性細胞を選別した後， CD34陽性 / CD49f 陽性細胞 (Double Positive 細胞； DP/Lin- ) とそれ以外の細胞 (nonDP) に分別 した。 最終的に該分散細胞から CD31、 CD45および Glycophorin Aが陰性であり、 CD34および CD49fが陽性であることを特徴とする Double Positive細胞； DP/Lin- を子宫筋 DP/Lin- (DP/Lin-)として、 FACSにより単離した。
一方、 本発明者は、 CD34および CD49f のみの発現を指標として、 CD34および CD49f が陽性であることを特徴とする Double Positive細胞； DPを子宫筋 DPとし て単離できることを見出した。 この際あらかじめ、 CD45 が陰性の細胞を選択し、 その中から CD34および CD49f が陽性であることを特徴とする Double Positive 細胞； DPを子宮筋 DPとして単離できることも見出した。
次いで、 DP/Lin -、 DPおよび DP/Lin-以外の子宮筋細胞の発現遺伝子を解析し、 幹細胞の特徴を有していることを確認した。さらに、 DP/Lin-および DPが in vitro で骨 ·脂肪 ·軟骨細胞へ分化誘導され得ること、 DP/Lin-および DPを免疫不全マ ウスに移植した場合に、 子宮筋様組織を再構築し得ることを見出し、 単離した細 胞が子宮平滑筋幹細胞であることを確認した。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[ 1 ] 哺乳動物平滑筋由来 滑筋幹細胞を単離する方法であって、 哺乳動物平 滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗 CD31抗体、 抗 CD45抗体、 抗 Glycophorin A抗 体、抗 CD34抗体おょぴ抗 CD49f抗体と接 させ、抗 CD31抗体、抗 CD45抗体およ び抗 Glycophorin A抗体と結合せず、抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と結合する 細胞を単離することを含む、 平滑筋幹細胞を単離する方法。
[2] 哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、 哺乳動物平 滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗 CD34抗体および抗 CD49f 抗体と接触させ、 抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細 胞を単離する方法。
[3] 哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、 哺乳動物平 滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗 CD45抗体、 抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と 接触させ、 抗 CD45抗体と結合せず、 抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と結合する 細胞を単離することを含む、 [2]の平滑筋幹細胞を単離する方法。
[4] フローサイ トメ トリーを用いて、 細胞をソーティングする、 [1：]〜 [3]の いずれかの平滑筋幹細胞を単離する方法。
[5] 哺乳動物平滑筋細胞をフローサイ トメ トリーにより Lin (CD31, CD45, Glycophorin A)陽性細胞（Lin+)と Lin陰性細胞（Lin-)に選別し Lin陰性細胞を採 取し、 さらに CD34陽性かつ CD49f 陽性細胞を採取することを含む、 [1]の平滑筋 幹細胞を単離する方法。
[6] 哺乳動物平滑筋細胞からフローサイ トメ トリーにより CD34陽性かつ CD49f 陽性細胞を採取することを含む、 [ 2 ]の平滑筋幹細胞を単離する方法。
[7] 哺乳動物平滑筋細胞からフローサイ トメ トリーにより CD45 陰性細胞を採 取し、 さらに CD34陽性かつ CD49f 陽性細胞を採取することを含む、 [3]の平滑筋 幹細胞を単離する方法。
[ 8 ] 平滑筋が子宮筋である [ 1 ]〜[ 7 ]のいずれかの平滑筋幹細胞を単離する方 法。
[9] 哺乳動物がヒ トである [1]〜[8]のいずれかの平滑筋幹細胞を単離する方 法。
[ 1 0] [ 1 ]〜[ 9]のいずれかの方法により単離された CD31、 CD45 および
Glycophorin Aが陰性であり、 CD3 よび CD49f が陽性である平滑筋幹細胞。
[1 1] [ 1 ]〜[9]のいずれかの方法により単離された、 CD34および CD49f が陽 性である平滑筋幹細胞。
[1 2] [1 ]〜[9]のいずれかの方法により単離された CD45が陰性であり、 CD34 および CD49f が陽性である平滑筋幹細胞。
[1 3] さらに、 ABCG2が陽性である [1 0]〜[1 2 ]のいずれかの平滑筋幹細胞。
[1 4] 平滑筋に移植することにより平滑筋に分化する能力を有する [1 0]〜 [1 3]の平滑筋幹細胞。
[1 5] 子宮筋に移植することにより子宮筋に分化する能力を有する子宮筋由来 の [14]の平滑筋幹細胞。
[1 6] [1 0]〜[1 5]のいずれかの平滑筋幹細胞を含む平滑筋組織再生用組成 物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2008-103867号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1一 1は、 蛍光標識された抗体による染色を施した子宮筋分散細胞のフロー サイ トメ トリー解析の結果を示した図である。
図 1— 2は、 DP/Lin_ 、 nonDP/Lin-および Lin+における ABCG2の RT- PCRによ る発現解析の結果を示す図である。 図中、 Tissueとは、 機械的 ·酵素的処理によ り分散した時点での子宫筋細胞のことをいい（DP/Lin_ 、 nonDP/Lin -および Lin+)、 NCは蒸留水をテンプレートにしたもので陰性コントロールを示す。
図 2は、 通常酸素濃度 20%または低酸素濃度 2%下で培養した DP/Lin-および それ以外の分画の増殖に関して細胞増殖活性を指標に表したグラフである。
図 3は、 骨細胞誘導培地下で培養した DP/Lin- (図 3 A) および nonDP/Lin- (図 3B)のアル力リホスファターゼ染色顕微鏡像を示す写真である。
図 4は、脂肪細胞誘導培地下で培養した DP/Lin- (図 4 A)および nonDP/Lin- (図 4 B)のオイルレツド 0染色顕微鏡像を示す写真である。
図 5は、 軟骨細胞誘導培地下で培養した DP/Lin-のトルイジンブルー染色顕微 鏡像を示す写真である。
図 6は、 DP/Lin-を移植した N0G妊娠マウス子宮の蛍光免疫染色像を示す写真で ある。
図 7は、 nonDP/Lin_を移植したエス トロゲン （E 2 ) 徐放ペレツ ト移植 NOG マ ウス子宮の蛍光免疫染色像を示す写真である。
図 8は、 DP/Lin -、 DP/Lin_および Lin+を移植した NOGマウス子宮のエストロゲ ン （E 2 ) 徐放ペレット移植、 妊娠によるヒ ト細胞の割合を表現したグラフであ る。
図 9は、 蛍光標識された抗体による染色を施した、 Lin マーカーを用いた前選 別をしない子宮筋分散細胞のフローサイトメ トリー解析の結果を示した図である。 図 1 0は、 DP (Double positiye ; CD49f (+) CD34 (+) )分画中の CD31の発現を指標 にした細胞亜分画の細胞分布を示す図である。
図 1 1は、 DP分画、 CD49f (-) CD34 (+)分画おょぴ CD34 (_)分画における分化マー カー遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
図 1 2は、 DP分画の細胞のコロニー形成の状態を示す写真である。
図 1 3は、 DP分画、 CD49f (-) CD34 (+)分画、 CD34 (- )分画、 DP分画中の CD31 (+) 亜分画（DP 31+)および DP分画中の CD31 (- )亜分画（DP 31- )のコロニー形成能を示 す図である。
図 1 4は、 DP分画を重度免疫不全マウス子宮内へ移植した結果を示す写真であ る。 発明を実施するための最良の形態
本発明の幹細胞は、 平滑筋から単離される平滑筋由来組織幹細胞である。 本発 明の幹細胞が由来する平滑筋として、 子宮平滑筋、 内臓平滑筋、 血管平滑筋が挙 げられ、.好ましくは子宮平滑筋である。 これらの組織片を採取し、 細胞を分散さ せ、 分散させた細胞から幹細胞を単離することができ、 例えば、 子宮筋腫片を用 いることができる。 平滑筋を採取する動物種は限定されず、 マウス、 ラット、 モ ノレモット、 ハムスター、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ャギ、 サル、 ヒ ト等の哺乳動物を用いることができる。
本発明において、 「幹細胞」 とは、 自己複製能を有し、 多能性を有する細胞をい う。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。 組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、 組織中の特定の位置に存在し、 未分化な細胞内構造をしている。 従って、 組織幹 細胞は多能性のレベルが低い。 組織幹細胞は、 核ノ細胞質比が高く、 細胞内小器 官が乏しい。 組織幹細胞は、 概して、 多分化能を有し、 細胞周期が遅く、 個体の 一生以上に増殖能を維持する。 本発明において、 幹細胞というときは、 幹細胞を 少なくとも一定量含む細胞集団をいい、 例えば、 幹細胞を 90%以上、 好ましくは 95%以上含む細胞集団が含まれる。
本発明の平滑筋幹細胞は、 Lin-であり、CD34陽性かつ CD49f陽性の細胞である。 Lin-細胞とは、 分化抗原が陰性であり幹細胞から特定系統の細胞への分化に対応 して出現する表面抗原を有していない細胞、 すなわちこれらの表面抗原を細胞表 面に発現していない細胞をいう。 本発明においては、 CD31、 CD45 および Glycophorin A (GPA)が陰性である細胞をいう。 CD31 はほとんど全ての単球、 血 小板および顆粒球に発現している抗原であり、 CD45 は末梢血のリンパ球、 単球、 顆粒球、 好酸球、 好塩基球を含むすべての白血球に発現している抗原であり、 GPA は赤血球と関連を有する抗原である。 CD34は未分化の幹細胞に発現する細胞であ り、 CD49f は血小板や巨核球に発現する細胞である。 本発明において、 CD34陽性 かつ CD49f 陽性の細胞をダブルポジティブ （DP)細胞と呼ぴ、 Lin-であり、 CD34 陽性かつ CD49f 陽性の細胞を DP/Lin-細胞と呼ぶ。 本発明の平滑筋幹細胞は、 さ らに幹細胞マーカーである ABCG2 (ATP- binding cassette transporter G2) を発 現している。
さらに、 本発明の平滑筋幹細胞は、 CD34陽性かつ CD49f 陽性の細胞である。 該 細胞においては、 CD45、 CD31および Glycophorin Aは陰性であっても、 陽性であ つてもよい。 本発明においては、 該細胞をもダブルポジティブ （DP)細胞と呼ぶ。 本発明の幹細胞は、 平滑筋細胞の細胞表面の抗原特性に基づいて単離すること ができる。 すなわち、 平滑筋細胞から Lin-であり、 CD34陽性かつ CD49f 陽性であ る細胞を単離すればよい。
一方、 本発明の幹細胞は、 平滑筋細胞から、 CD34および CD49f のみの発現を指 標として、 CD34陽性かつ CD49f 陽性でぁる細胞を単離してもょぃ。 さらに、 この 際、 あらかじめ CD45陰性細胞を選択し、 その中から CD34陽性かつ CD49f 陽性で ある細胞を単離してもよい。
最初に平滑筋から細胞を分散させる。 細胞の分散は、 組織片を細切し、 コラゲ ナーゼ等の酵素で処理することにより行うことができる。 分散した細胞は、 単一 細胞の状態まで分散させることが望ましく、 例えば、 セルス トレーナ等を通し、 さらに Ficoll-Paque (登録商標） 等の比重液を用いて密度勾配遠心分離し、 さら にトリプシン処理等を行うことにより単一細胞として分散させるごとができる。 次いで、 それぞれ異なる蛍光色素で標識した CD31、 CD45、 Glycophorin A, CD34 および CD49f あるいはさらに ABCG2に対する抗体を、 分散した平滑筋細胞と接触 させ表面抗原を有する平滑筋細胞を染色し、フローサイ トメ トリーや FACSを用い て、 DP/Lin_細胞をソーティングすることにより本発明の平滑筋幹細胞を単離する ことができる。 この際、 平滑筋細胞から直接フローサイ トメ トリーで単離しても よいし、 フローサイ トメ トリ一でソーティングする前に CD31、 CD45 および Glycophorin A からなる分化抗原のうちの 1種類以上の抗原に対する抗体を結合 させた磁気ビーズを用いて、 分化抗原を有する細胞を除去し、 残った細胞から FACSを用いて本発明の細胞を単離してもよい。
また、 それぞれ異なる蛍光色素で標識した CD34および CD49f、 あるいは CD45、 CD3 および CD49f に対する抗体を、分散した平滑筋細胞と接触させ表面抗原を有 する平滑筋細胞を染色し、 フローサイ トメ トリーや FACSを用いて、 DP細胞をソ ーティングすることにより本発明の平滑筋幹細胞を単離することができる。 この 際、平滑筋細胞から直接フローサイ トメ トリーで CD34および CD49f 陽性細胞を単 離してもよいし、フローサイ トメ トリーでソーティングする前に CD45に対する抗 体を結合させた磁気ビーズを用いて、 CD45を有する細胞を除去し、 残った細胞か ら FACSを用いて本発明の細胞を単離してもよい。
標識に用いる蛍光色素としては、 Cy (商標） 3、 Cy5、 Texas Red (登録商標）、
APC allophycocyanin) 、 PE (phycoerythrin) 、 PE- Cy5 、 FITC (fluorescein isothiocyanate)、 PerCP等が挙げられる。 フローサイ トメ トリー、 FACSとしては 例えば FACS vantage (べク トン 'ディッキンソン社製）、 FACS Cal ibur (べク トン · ディッキンソン社製）等を用いることができる。
単離した本発明の幹細胞は、 培養により増殖させることができる。 この際、 用 いる培地は限定されず、 公知の培地 （例えば、 DMEM (Dulbecco' s modified Eagle' s medium)培地） を用いることができる。 特に、 公知の幹細胞培養用培地を用いるこ とが望ましい。 例えば、 間葉系幹細胞培養用培地 mesenchymal stem cel l basal medium (MSCBM) ) (Cambrex Bio Science个土、現 Poietics社)、 mesenchymal stem cel l growth medium (MSCGM) (Carabrex Bio Science社、 現 Poietics社）、 等を用レヽる ことができる。 培地には、 適宜ゥシ胎児血清等の血清やペニシリン、 ストレプト マイシン等の抗生物質および種々の生理活性物質を添加してもよい。 また、 本発 明の幹細胞を培養する場合、 培養酸素濃度が通常の培養時の 20%より低い条件下 で行う。好ましくは 5 %以下、さらに好ましくは、 2. 5%以下、特に好ましくは 2 % で行う。 この方法で培養することにより、 幹細胞を増殖させることができる。 組 織培養用培養皿に細胞を播種して培養すればよい。
さらに、単離した本発明の幹細胞を in vitroで特定の組織細胞へ分化誘導する ことができる。 本発明の幹細胞は多能性を有するため、 基本的には任意の組織細 胞に分化誘導することができる。種々の組織への分化誘導培地が市販されており、 これらの市販培地を用いて分化誘導することができる。 例えば、 骨細胞へ分化誘 導する場合、 ブレツ トキッ ト骨芽細胞分化培地（Cambrex Bio Sci ence 社、 現 Poietics 社）を用いればよく、 脂肪細胞へ分化誘導する場合、 ブレッ トキット脂 肪細胞分化培地（Cambrex Bio Science社、 現 Poiet ics社） を用いればよく、 軟 骨細胞へ分化誘導する場合、 ブレツ トキッ ト軟骨細胞分化培地（Cambrex Bio Science 社） を用いて培養を行えばよい。 また、 本発明の平滑筋幹細胞を子宮筋 組織細胞等の平滑筋組織細胞に分化誘導することもできる。 この際、 酸素濃度は 通常の細胞培養条件、 すなわち約 20%で行う。 これらの組織細胞へと分化した細 胞をさらに培養し、 組織を構築させることができる。
幹細胞が組織細胞へ分化誘導したか否かは、 各組織細胞に特有なマーカーの発 現を調べることにより決定することができる。 例えば、 骨細胞への分化はアル力 リフォスファターゼ染色陽性細胞の有無で調べることができ、 脂肪細胞への分化 はオイルレツド 0染色陽性細胞の有無で調べればよい。 さらに軟骨細胞への分化 はトルイジンブルー染色陽性軟骨ペレツ トの有無で調べることができる。
さらに、 本発明は本発明の平滑筋幹細胞の不死化させた株細胞を包含する。 該 株細胞は増殖能および多能性を併せ持ち、 必要な数だけ増殖させて、 利用するこ とができる。 樹立した株細胞は、 平滑筋の分化、 発生等の研究用ツールとして利 用することが可能である。 ヒ トの細胞では放射線や突然変異誘発物質やウィルス で不死化細胞 （ある場合はがん細胞） になるが、 特に最近は、 腫瘍化や染色体異 常を引き起こすことなく、 オリジナルの細胞特性を比較的保持させたまま不死化 させる方法として、 ヒ トテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子 （hTERT) や SV40T遺伝子 などを細胞に導入することが行われている。
本発明の平滑筋幹細胞は再生医療等に用いることができる。 例えば、 本発明の 平滑筋幹細胞を損傷した平滑筋部位にシリンジを用いた注入により移植投与する ことにより、 幹細胞が平滑筋細胞に分化し、 損傷した平滑筋を再生することがで きる。 また、 上記のように本発明の幹細胞を in vitroで分化誘導し、 組織を構築 させ、 該組織を移植してもよい。 これらの再生医療において、 移植した細胞また は組織のレシピエントによる拒絶を避けるためには、 再生医療を受けようとする 患者から組織片を採取し、 該組織片から本発明の平滑筋幹細胞を単離し、 利用す ることが望ましい。 例えば、 子宮肉腫等の疾患により、 子宮の一部を切除した患 者の残存している部分の子宮筋から組織片を採取し、 該組織片から子宮筋幹細胞 を単離し、 前記患者の子宮の再生に利用することが可能である。 また、 上述のよ うに、 本発明の平滑筋幹細胞は他の組織へと分化させることもできる。 例えば、 平滑筋以外の特定の組織を損傷した患者から、 子宮筋等の平滑筋から組織片を取 り出し、 平滑筋幹細胞を単離し、 該平滑筋幹細胞を損傷した組織に分化誘導する ことにより、 平滑筋以外の組織の再生医療に用いることが可能である。 本発明は 本発明の幹細胞を含む再生医療用組成物、すなわち再生医療用製剤をも包含する。
さらに、 ヒ ト由来の本発明の幹細胞をヒ ト以外の動物であって免疫不全動物に 移植することにより、 ヒ トの平滑筋組織を部分的に有するモデル動物を得ること ができる。 例えば、 免疫不全動物の平滑筋に本発明の平滑筋幹細胞を移植するこ とにより、 本発明の幹細胞が平滑筋に分化し、 動物体内に部分的にヒ ト平滑筋組 織が構築される。 動物体内にヒ ト平滑筋組織が構築されたことは、 細胞が発現す るヒ ト平滑筋に特有なタンパク質.を測定し、 形態的に平滑筋の特徴を有している ことを確認すればよい。 例えば、 平滑筋が子宮筋の場合、 vimentin陽性すなわち ヒ ト由来であり （赤色）、 かつ a SMA陽性細胞 （緑色） で形態的にも子宮平滑筋で あることを確認すればよい。 このようにして得られた部分的にヒ ト平滑筋組織を 有する動物は、ヒ ト平滑筋組織を有するモデル動物として利用することができる。 例えば、 平滑筋が子宮筋の場合、 子宮を収縮させ、 または子宮を弛緩させる薬剤 のスクリーニングに用いることができる。 また、 本発明の平滑筋幹細胞を癌化さ せて移植した場合、 ヒ ト子宮癌等を有するモデル動物を作出することができ、 治 療剤のスクリーニングに用いることができる。免疫不全動物として、 scidマウス、 NOGマウス等の免疫不全マウスが挙げられる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。
実施例 1 子宮筋 Double Posi tive細胞； DP/Lin-細胞の調製
( 1 ) 単一分散子宮筋細胞の調製
ヒ ト子宮から単離された子宮筋腫片を、ハサミで約 2 mm3の小片にまで細切し、 0. 2% (w/v)のコラゲナーゼ （和光純薬、 大阪）、 0. 05% (w/v)の DNasel (GIBC0、 米国力リフォルニァ州）を含有する DMEM培地（1 %の抗生物質一抗真菌剤 [GIBC0]、 10%のゥシ胎児血清 [BioWest、米国フロリダ州]を含有するダルベッコ変法ィーグ ル培地 [DMEM, Sigma- Aldrich、米国ミズーリ州] ) 中に、組織片 l gに対して 10 ml の割合で移し、 37°Cにて 16時間振盪して酵素的に細胞分散処理を行った。続いて、 400 ju m孔径のポリエチレンメッシュで濾過後、 さらに 40 μ ηι孔径セルストレーナ
(BD Biosciences, 米国マサチューセッツ州） に細胞を通すことにより、 単一細 胞の状態にまで分散させた。 続いて、 これら分散した細胞を Ficol l-Paque PLUS
(Amersham Biosc iences, 米国ニュージャージー州） 上に重層して 780 X g にて 15分間の密度勾配遠心を実施し、 界面層から単一細胞の分散液を回収した。 これ を、 0. 05% (w/v) トリプシン- EDTA (Sigma-Aldrich) · 0. 05% (w/v) DNasel 溶液に よる酵素処理とピペッティングにより完全に分散した細胞集団にした。
( 2 ) 蛍光標識抗体による細胞染色
上記の分散した単一子宮筋細胞集団を、 2%胎児ゥシ血清、 10 raM HEPES、 およ び 1 %ぺ シリン並びにス トレプトマイシン含有のハンクス平衡化緩衝液 （カル シゥムおよびマグネシウム無含有、 HBSS+) に 2 X 106の濃度で浮遊させ、 蛍光標 識抗体を加えて、 4°Cで 30分間反応させた。 続いて 4°Cで遠心した後、 2 mlの上 記のハンクス液に浮遊させ、 死細胞の選別のため Propidium Iodide (PI)で染色し た。
用いた蛍光標識抗体は、 PE結合抗 CD31抗体（IgGl、 BD Biosciences) , PE結合 抗 CD45抗体（IgGl、 BD Biosciences)、 PE結合抗 Glycohporin A抗体（IgG2b、 BD Biosciences) , APC結合抗 CD34抗体（IgGl、 BD Biosciences)および FITC結合抗 CD49f抗体（IgG2a、 BD Biosciences)であった。
( 3 ) 子宫筋 Double Posit ive細胞； DP/Lin_の分離
蛍光強度に基づいてフローサイ トメ トリ一により細胞集団を 2次元に展開した。 上記の染色した分散細胞を、 フローサイ トメ トリー （FACS Vantage SE， Becton Dickinson社） および解析ソフトウェア （Cel l- Quest, Becton Dickinson社） を用 いて解析した。
図 1にその細胞分布図を示す。 このように 2次元展開をしながら 1 X 105の細胞 を収集して、 Lin (CD31 , CD45, Glycophorin A)陽性細胞（Lin+)と陰性細胞 (Lin-) を選別した後 (図 1 _ 1八ぉょび8)、 CD34陽性/ CD49f 陽性細胞 (Double Positive 細胞； DP/Lin-) とそれ以外の細胞 （nonDP/Lin-) に分別した （図 1 - 1 C)。 最終 的に Double Pos it ive細胞； DP/Lin-分画を分取し、 子宫筋 DP/Lin-細胞とした。
( 4 ) 分化マーカー遺伝子の発現解析
上記の分離した DP/Lin- 、 nonDP/Lin-および Lin+からトリゾール（Invitrogen, 力リフォルニァ州）を用いて全 RNAを抽出し、 ABCG2のメッセンジャー RNAの発現 ¾r reverse - transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)によつ 角军析し た。 図 1 - 2がその結果である。 なお、 内部標準である GAPDHの発現レベルは両者 で差が無かった。 これは、 DP/Lin_が他の分画に比べて幹細胞マーカーである ABCG2 を高発現しており分化度がより低い未熟な段階にあることを示しており、 DP/Lin-は組織幹細胞の特性に合致した性質を有している。 実施例 2 子宮筋 Double Pos i tive細胞； DP/Lin-細胞の培養
通常の培養の酸素濃度である 20%ではなく、 2%という低酸素濃度下において マルチガスインキュベーター （アステック社、 福岡） で培養した。 その結果、 20%酸素濃度下で培養した場合は、 3 週間しても細胞は他の分画に 比較して増殖しなかったのに対して、 2%の低酸素濃度下では培養 1週間の時点で、 細胞コロニーが形成され、 2 週間の時点で、 ほぼコンフルェントになるまで細胞 が増殖した （図 2 )。 実施例 3 子宫筋 Double Pos itive細胞； DP/Lin-細胞の分化誘導アツセィ
上記の培養 DP/Lin-が、 幹細胞特性のひとつである多分化能を有しているかに ついて検討するため、 DP/Lin-を脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞にそれぞれ分化 誘導可能な培地下で培養し、 異なる細胞系譜へ分化しうるかを調べた。
骨細胞への分化誘導培地としてプレキッ ト骨芽細胞分化培地 （Cambrex Bio Science社製、 三光純薬販売、 製品番号 PT- 3002) を用い、 脂肪細胞への分化誘導 培地として、 プレキッ ト脂肪細胞分化培地 （Cambrex Bio Science 社製、 三光純 薬販売、 製品番号 PT-3004) を使用した。 軟骨細胞への分化誘導培地として、 プ レキッ ト軟骨細胞分化培地 （Cambrex Bio Science 社製、 三光純薬販売、 製品番 号 PT-4121) を使用した。 上記培養した DP/Lin-と DP/Lin nonDP/Lin-を 96wel l プレートに約 5 X 103/wel l の濃度で蒔き、 MSCGM培地下でコンフルェントになる まで 2% (低酸素濃度） の酸素濃度下で約 2〜3週間培養した。 以下の分化誘導の ための培養開始に際しては、 酸素濃度を通常の 20%に戻して分化誘導を行った。 骨への分化
上記の培養 DP/Lin-の骨細胞への分化誘導を行った。上記の骨細胞誘導培地を 3 〜4日毎に交換して、 2〜3週間培養した。 骨細胞への分化はアルカリフォスファ ターゼ染色陽性細胞の出現で評価した。その結果、 DP/Lin-ではアル力リフォスフ ァターゼ染色陽性細胞 （紫色） が多数出現したのに対して （図 3 A)、 non DP/Lin- ではほとんど認められなかった （図 3 B)。
脂肪への分化
上記の培養 DP/Lin-の脂肪細胞への分化誘導を行った。 まず、 上記の脂肪細胞 基礎培地で 3 日間培養してから、脂肪細胞分化誘導培地で 1〜3 日間培養した。 こ れを 1サイクルとして 3サイクル行い、 最後は、 基礎培地で最大 1週間培養して から、 洗浄 '固定して、 脂肪滴を染色するためにオイルレッ ド O染色を行った。 その結果、 DP/Lin-ではオイルレツ ド O染色陽性細胞 （赤色） が出現したのに対し て （図 4 A)、 nonDP/Lin -では、 ほとんど全く認められなかった （図 4 B)。
軟骨への分化
上記の培養 DP/Lin-の軟骨細胞への分化誘導を行った。 上記の軟骨細胞誘導培 地を 3〜4 日毎に交換して、 2〜3週間 15 ml遠心管内において 3次元培養した。 軟骨細胞への分化はトルイジンブルー染色陽性軟骨ペレツトの出現で評価した。 その結果、 DP/Lin-ではトルイジンブルー染色陽性軟骨ペレツ ト （紫色） が出現し たのに対して （図 5 )、 non DP/Lin_では軟骨ペレッ トが認められなかった。 実施例 4 重度免疫不全マウスへの子宫筋 Double Positive細胞； DP/Lin-細胞の 移植実験
NOG (N0D/SCID/ γ c nu11) マウス （財団法人 実験動物中央研究所、 川崎市） に 10%ペントバルビタール （大日本薬品製） 含有リン酸緩衝液 （Sigma) を 350 IX 1 腹腔内注射して麻酔した。 上記の分離した約 5 X 104個の DP/Lin-および DP/Lin-を、 NOGマウスのそれぞれの子宮角に 29ゲージの注射針を用いて注入し、 その後約 4〜5週間飼育した。 上記の移植をしてから 4〜5週間後より移植後 NOG マウスを 3つのグループに分けて幹細胞の生体内での動態解析を行った。 まず、 1 つ目のグループは高エス トロゲン環境にするために、 エス トロゲン （E 2 ) 徐放 ペレツ 卜 （Innovative Research of America, 米国フロリダ州） を 2錠皮下移植 した。 次に、 2つ目のグループには何もしなかった。 最後に、 3つ目のグループは 雄マウスと交配させ妊娠 18. 5 日目に解析に供した。
蛍光組織染色
子宮を摘出し、 Tissue - Tek OCT compound (Sakura Finetech, 米国カリフォノレ ニァ州） に包埋して凍結し、 クライオスタツト （Leica Microsystems ドイツ ' ウェツラー市）を用いて 6 m厚にて連続薄切した。得られた凍結切片については、
4%パラホルムアルデヒ ドにて室温で 20分間固定後、 リン酸緩衝液で洗浄した。
0. 2% Triton Χ-100 含有リン酸緩衝液で 10分間細胞膜透過処理を行った後、 10% ゥシ血清アルブミン溶液中に 30分間浸漬してブロッキング処理を施行した。続い て、 これらの処理をした切片を、 子宮平滑筋マーカーである a - smooth muscle act in ( a SMA) に対する抗体 （clone 1A4， 200倍希釈、 DAKO Cytomatio, デンマ ーク） と 4°Cオーバーナイ トで反応させてから、 Alexa Fluor 488 (緑色蛍光用） 標識二次抗体 （Molecular Probes , 米国オレゴン州） （1000 倍希釈， 37°C, 1 時 間） を用いて一次抗体を検出 した。 続いて、 赤色蛍光色素であ る Cy3 (S igma_Aldrich)によって直接標識された、 ヒ トの細胞にのみ反応する viraentin抗体（clone V9)と反応させて、 蛍光二重染色を行った。 さらに切片は核 染色剤 TOTO-3 (Molecular Probes)で対比染色した。 各染色後の切片を、 TCS SP2 共焦点顕微鏡 （Leica Microsystems) で検鏡した。
その結果、 図 6に示すように、 DP/Lin_を移植した子宫では、 vimentin 陽性す なわちヒ ト由来であり （赤色）、 かつ a SMA陽性細胞 （緑色） で形態的にも子宮平 滑筋である組織 （黄色） が出現した。 一方、 nonDP/Lin-および Lin+を移植した子 宫では、 上記の DP/Lin-でみられたヒ ト由来の組織は認められず、 図 7に示すよ うに、 ヒ ト由来の細胞は存在するが （赤色）、 それらはマウス平滑筋組織 （緑色） の間隙に分布した。
また、 DP/Lin_の増殖はエストロゲンペレツトゃ妊娠により刺激され、定量的に ヒ ト由来細胞の割合が高くなつていることがわかる （図 8 )。
以上は、 DP/Lin-が子宮平滑筋を構築する能力を有している一方、 nonDP/Lin- および Lin+はその能力を持っていないことを示しており、 DP/Lin-は子宮筋の組 織幹細胞特性を特異的に有している。 また、 DP/Lin_の増殖はエストロゲン（E 2 ) 徐放ペレツ トゃ妊娠により刺激されることが判明した。 実施例 5 子宮筋 CD34陽性/ CD49f 陽性細胞の調製（Linマーカーによる前選別が ない場合）
さらに単離した各々の細胞分画について 200 cel ls/cm2という低細胞密度で培 養皿で培養し、 コロニー形成能について解析した。 解析するにあたり、 培養皿に 29G針にて擦過し、 一つ一つの培養細胞の挙動を把握できるようにした。
( 1 ) 単一分散子宮筋細胞の調整
ヒ ト子宮から単離された子宮筋腫片を、ハサミで約 2 mm3の小片にまで細切し、
0. 2% (w/v)のコラゲナーゼ （和光純薬、 大阪）、 0. 05% (w/v)の DNasel (GIBC0、 米国力リフォルニァ州）を含有する DMEM培地（1 %の抗生物質一抗真菌剤 [GIBC0]、 10%のゥシ胎児血清 [BioWest、米国フロリダ州]を含有するダルベッコ変法ィーグ ル培地 [DMEM, Sigma-Aldrich,米国ミズーリ州] ) 中に、組織片 l gに対して 10 ml の割合で移し、 37°Cにて 16時間振盪して酵素的に細胞分散処理を行った。続いて、 400 μ ηι孔径のポリエチレンメッシュで濾過後、 さらに 40 /x m孔径セルストレーナ
(BD Biosciences, 米国マサチューセッツ州） に細胞を通すことにより、 単一細 胞の状態にまで分散させた。 続いて、 これら分散した細胞を Ficol l-Paque PLUS
(Amershara Biosciences、 米国ニュージャージー州） 上に重層して 780 X g にて 15分間の密度勾配遠心を実施し、 界面層から単一細胞の分散液を回収した。 これ を、 0. 05% (w/v) トリプシン- EDTA (Sigma- Aldrich) - 0. 05% (w/v) DNasel 溶液に よる酵素処理とピベッティングにより完全に分散した細胞集団にさせた。
( 2 ) 蛍光標識抗体による細胞染色
上記の分散した単一子宮筋細胞集団を、 2%胎児ゥシ血清、 10 mM HEPES、 なら びに 1 %ペニシリンおよびス トレプトマイシン含有のハンクス平衡化緩衝液 （力 ルシゥムおよびマグネシウム無含有、 HBSS + ) に 2 X 106の濃度で浮遊させ、 蛍光 標識抗体を加えて、 4°Cで 30分間反応させた。 続いて 4°Cで遠心した後、 2 mlの 上記のハンクス液に浮遊させ、 死細胞の選別のため Propidium lodide (PI)で染色 した。 蛍光標識抗体は、 実施例 1で用いたものを用いた。
( 3 ) 子宮筋 CD34陽性/ CD49f 陽性細胞の分離
PI (- ) (生細胞） 、 CD45陰性および FSC (Forward scatter (前方散乱光) ；細胞 の大きさを示す） 150〜500の細胞について、 蛍光強度に基づいてフローサイ トメ トリーにより細胞集団を 2次元に展開した。 上記の染色した分散細胞を、 フロー サイ トメ トリー （FACS Vantage SE, Becton Dickinson 社） および解析ソフトウ エア （Cel l- Quest, Becton Dickinson 社） を用いて解析した。 分画した細胞の分 化マーカー遺伝子の発現解析は実施例 1と同様の方法で行った。 さらに、 実施例
2と同様の方法でコロニー形成能を調べた。 さらに、 実施例 4と同様の方法で重 度免疫不全マゥスに移植した。
図 9に細胞分布を示す。 図 9 Aに細胞集団全体の細胞分布を示し、 図 9 B、 Cお よび Dにそれぞれ DP (Double pos itive ; CD49f (+) CD34 (+) )分画、— CD49f (-) CD34 (+) 分画および CD34(_)分画の各画分の細胞分布を示す。 横軸が CD49f の強度を、 縦 軸が CD34 の強度を示す。 PI(-)の生細胞のうちの DP(Double positive)分画は 9.8%、 49f (-)34(+)分画は 13.7%、 34(-)分画は 43.8%であった。 この中から、 DP (CD49f (+) CD34(+)) 分画を分取した。
図 1 0に DP分画中の CD31の発現を指標にした細胞亜分画の細胞分布を示す。 図に示すように、 DP分画は CD31の発現の有無でさらに 2つの亜分画 （DP 31+お よび DP 31-)に分けることができた。 図 1 OAは細胞集団全体の細胞分布を、 図 1 0Bは DP分画の細胞分画を示す。 図 1 0Cは DP分画の CD31の発現パターンを示 し、 図 1 0Dは CD31(+)分画の細胞分布を、 図 1 0Eは CD31(_)分画の細胞分布を 示す。 単一子宮筋細胞集団の PI(-)の細胞の中に CD31陽性細胞は 3.6%存在し、 CD31陰性細胞は 3.7%存在した。
図 1 1に DP分画、 CD49f (-) CD34(+)分画および CD34 (-)分画における分化マー カー遺伝子の発現解析の結果を示す。 図 1 1に示すように、 DP分画は他の分画に 比べて、 ERa、 ER/3および平滑筋分化マーカーの発現レベルが低かった。 その一 方で、 ABCG2は強発現していた。
図 1 2に DP分画の細胞の 1日目 （A)、 7日目 （B)、 1 4日目 （C)および 2 1日 目 （D)のコロニー形成の状態を示す。 図 1 2Eおよび Fは増殖中のコロニーの状 態を示す。 また、 図 1 3に DP分画、 CD49f (-) CD34(+)分画、 CD34(_)分画、 DP分 画中の CD31(+)亜分画（DP 31+)および DP分画中の CD31(-)亜分画（DP 31_)のコロ ニー形成能を示す。図に示すように、 DP分画は他の分画（CD49f (-) CD34(+)分画、 CD34(_)分画） と比較したコロニー形成能が高かった。 また、 DP分画中の CD31(+) 亜分画と CD31 (-)亜分画の間ではコロニー形成能に差は認められなかった。
図 1 4に DP分画を重度免疫不全マウス子宮内へ移植した結果を示す。図に示す ように、 DP分画を移植した子宮では、 vimentin陽性すなわちヒ ト由来であり （赤 色）、 かつ c SMA陽性細胞 （緑色） で形態的にも子宮平滑筋である組織 （黄色） が 出現した。 このことは、 DP分画の細胞が子宮筋様組織を構築する能力を有してい ることを示す。
以上より、 lineageマーカーによる選別をせずに、 CD34および CD49f の発現を 指標にして子宮平滑筋幹細胞を単離し得ることがわかった。 産業上の利用可能性
実施例に示すように、本発明の CD31、 CD45および G 1 ycophor i n Aが陰性であり、 CD34および CD49fが陽性であることを特徴とする DP/Lin-および CD45が陰性であ り、 CD34および CD49f が陽性であることを特徴とする DPが、 1 ) 未分化状態、 2 )多分化能、 3 ) 自己組織構築能、 といった組織幹細胞特性を有することから、 DP/Lin-および DPは子宮筋の組織幹細胞であり、 本法により世界で初めて子宮筋 の組織幹細胞の単離に成功した。 単離した DP/Lin-および DPは、 子宮筋の発生機 構、 妊娠 ·分娩における子宮筋の増殖 ·退縮 ·機能発現を担う細胞メカニズム、 更に子宮筋腫などの子宮筋由来疾患の病因解析やそれに対する薬剤開発をするう えで、 有用な生物資源となる。 また DP/Lin-細胞および DP細胞は他臓器治療にお ける細胞マテリアルとしても臨床応用が期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、 哺乳動物 平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗 CD31抗体、 抗 CD45抗体、 抗 Glycophorin A 抗体、抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と接触させ、抗 CD31抗体、抗 CD45抗体お よび抗 Glycophorin A抗体と結合せず、抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と結合す る細胞を単離することを含む、 平滑筋幹細胞を単離する方法。
2 . 哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、 哺乳動物 平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗 CD34抗体およぴ抗 CD49f抗体と接触させ、抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細 胞を単離する方法。
3 . 哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、 哺乳動物 平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗 CD45抗体、 抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体 と接触させ、 抗 CD45抗体と結合せず、 抗 CD34抗体および抗 CD49f抗体と結合す る細胞を単離することを含む、 請求項 2記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
4 . フローサイ トメ トリーを用いて、 細胞をソーティングする、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
5 . 哺乳動物平滑筋細胞をフローサイ トメ トリーにより Lin (CD31, CD45, Glycophorin A)陽性細胞（Lin+)と Lin陰性細胞（Lin-)に選別し Lin陰性細胞を採 取し、 さらに CD34陽性かつ CD49f 陽性細胞を採取することを含む、請求項 1記載 の平滑筋幹細胞を単離する方法。
6 . 哺乳動物平滑筋細胞からフローサイ トメ トリーにより CD34 陽性かつ CD49f 陽性細胞を採取することを含む、 請求項 2記載の平滑筋幹細胞を単離する 方法。
7 . 哺乳動物平滑筋細胞からフローサイ トメ トリーにより CD45陰性細胞を採 取し、 さらに CD34陽性かつ CD49f 陽性細胞を採取することを含む、請求項 3記載 の平滑筋幹細胞を単離する方法。
8 . 平滑筋が子宮筋である請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の平滑筋幹細 胞を単離する方法。
9 . 哺乳動物がヒ トである請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の平滑筋幹細 胞を単離する方法。
1 0 . 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法により単離された CD31、 CD45および Glycophorin Aが陰性であり、 CD34および CD49f が陽性である平滑筋 幹細胞。
1 1 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の方法により単離された、 CD34お よび CD49f が陽性である平滑筋幹細胞。
1 2 . 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法により単離された CD45が陰 性であり、 CD34および CD49f が陽性である平滑筋幹細胞。
1 3 . さらに、 ABCG2 が陽性である請求項 1 0〜1 2のいずれか 1項に記載 の平滑筋幹細胞。
1 4 . 平滑筋に移植することにより平滑筋に分化する能力を有する請求項 1 0〜 1 3のいずれか 1項に記載の平滑筋幹細胞。
1 5 . 子宮筋に移植することにより子宮筋に分化する能力を有する子宮筋由 来の請求項 1 4記載の平滑筋幹細胞。
1 6 . 請求項 1 0〜 1 5のいずれか 1項に記載の平滑筋幹細胞を含む平滑筋 組織再生用組成物。
PCT/JP2009/057809 2008-04-11 2009-04-13 平滑筋幹細胞の単離方法 Ceased WO2009125877A1 (ja)

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