WO2009140887A1 - 一种灯盏花乙素衍生物及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

一种灯盏花乙素衍生物及其制备方法、药物组合物和用途 Download PDF

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朱华结
金毅
徐树光
杨兆祥
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    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids

Definitions

  • the present invention relates to a novel scutellarin derivative, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition containing the same, and their use in cardiovascular and cerebrovascular diseases, inflammation and/or tumors and the like.
  • the scorpion flower is also known as the scorpion scorpion, which belongs to the peafowl family.
  • Breviscapine is a mixture (effective part) containing scutellarin (>90%) and a small amount of scutellarin, which is also isolated from the whole plant of Erigeron breviscapus. Yellow musk. Breviscapine has the effects of promoting blood circulation, dispelling cold, dissolving cold, relaxing phlegm and relieving phlegm and dehumidification. It is commonly used in the treatment of cardiovascular diseases.
  • the active constituents of breviscapine preparations used in clinical practice are generally scutellarin-containing preparations extracted by using ethanol and ethyl acetate, and scutellarin has been reported in many inventions for the treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases.
  • Clinical application shows that scutellarin has an effect of increasing cardiovascular and blood flow, reducing vascular resistance, anti-platelet, erythrocyte aggregation, and reducing blood viscosity.
  • a large number of studies have confirmed that scutellarin has anti-inflammatory, anti-oxidant, protein kinase inhibitors, diabetes, kidney disease, rheumatism, rheumatoid and other diseases.
  • Breviscapine is widely used in the treatment of cerebral thrombosis, cerebral infarction, and type of undetermined post-stroke sputum, hypertension, cerebral embolism, polyneuritis, chronic arachnoid and other cerebrovascular accidents, as well as coronary heart disease, angina pectoris, Treatment of gouty arthritis embolism.
  • the existing scutellarin or its derivatives have poor solubility, low bioavailability, and unsatisfactory therapeutic effects.
  • the present inventors have found that a novel structure of scutellarin derivative can be obtained by introducing a thiol group onto the phenolic hydroxyl group of the scutellarin flavonoid structure and further introducing an acetyl group onto the sugar hydroxyl group.
  • An object of the present invention is to provide a novel scutellarin derivative having the following structure
  • the scutellarin derivative represented by the formula (II) may also be present in the form of a salt thereof, especially a pharmaceutically acceptable salt, including a salt formed with an inorganic base or an organic base.
  • the inorganic base is, for example, an alkali metal or alkaline earth metal basic compound, particularly sodium hydroxide (NaOH), potassium hydroxide (KOH), calcium hydroxide (Ca(OH) 2 ) or the like.
  • the organic base is, for example, an amine, especially lysine, arginine, triethylamine or the like.
  • the salt can be obtained using any conventional method known in the art.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a scutellarin derivative of the formula (II) according to the present invention, comprising the steps of:
  • the breviscapine is dissolved in an organic solvent, and the hydrazine etherification reagent and the base are added, and the mixture is stirred at 0 to 40 C, preferably at room temperature;
  • Step a) The product obtained by the reaction is isolated and extracted to obtain the compound of the formula (I):
  • the product obtained by the reaction of the step c) is isolated and extracted to obtain the scutellarin derivative of the formula (II).
  • room temperature refers to any temperature in the range of 15-25 °C.
  • the compounds of the formula (I), and the process for their preparation and use are described in detail in the Applicant's International Patent Application, filed on the same date as the present application, the entire disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the compound of the formula (I) below (that is, the product obtained after introducing a mercapto group on the phenolic hydroxyl group of the scutellarin flavonoid structure, 4,5,6-trimethoxyoxy phthalocyanine) may also be used.
  • Abbreviated as Al a compound of formula (II) (ie, product 4,5,6-trimethoxy-8-(3,4,5-triacetyl-glucuronic acid) obtained after further introduction of acetyl group - Astragalus can also be referred to as A2 for short.
  • a further object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating cardiovascular and cerebrovascular diseases, inflammation and/or tumor, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of the present invention
  • the scutellarin derivative of the formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient, further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a further object of the present invention is to provide a medicament for preventing, ameliorating or treating cardiovascular and cerebrovascular diseases, inflammation and/or tumors of the scutellarin derivative of the formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention. Use in.
  • the compound A2 of the present invention has good solubility, high bioavailability and high curative effect, and therefore the compound A2 of the present invention or the pharmaceutical composition containing the compound A2 can be effectively used in place of the existing scutellarin or its derivative. Prevention, improvement and treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases, inflammation and/or tumors.
  • the compound A2 of the present invention can be obtained by a two-step chemical reaction synthesis which is easy to industrialize. Therefore, the preparation method of the scutellarin derivative (A2) of the present invention is simple, and has the advantages of mild reaction conditions, low cost, easy operation, and industrial production, and the economic benefit is particularly remarkable.
  • a novel scutellarin derivative having the structure shown in formula (II):
  • the scutellarin derivative represented by the formula (II) may also be present in the form of a salt thereof, especially a pharmaceutically acceptable salt, including a salt formed with an inorganic base or an organic base.
  • the inorganic base is, for example, an alkali metal or alkaline earth metal basic compound, particularly sodium hydroxide (NaOH), potassium hydroxide (KOH), calcium hydroxide (Ca(OH) 2 ) or the like.
  • the organic base is, for example, an amine, especially lysine, arginine, triethylamine or the like.
  • the salt can be obtained using any conventional method known in the art.
  • a method for preparing the scutellarin derivative (A2) of the formula (II) according to the present invention comprising the steps of: a) dissolving breviscapine in an organic solvent, Adding a hydrazine etherification reagent and a base, and stirring at 0 to 40, preferably at room temperature;
  • Step a) The product obtained by the reaction is isolated and extracted to obtain the compound of the formula (I):
  • the compound of the formula (I) is dissolved in an organic solvent, an acetylating agent and a base are added, and the mixture is stirred at 0 to 40, preferably at room temperature;
  • the product obtained by the reaction of the step c) is isolated and extracted to obtain the scutellarin derivative of the formula (II).
  • the organic solvent described in the step a) may be a single solvent or a mixed solvent of two or more solvents.
  • the organic solvent may be selected from the group consisting of N,N-dimercaptophthalamide, dimercaptosulfoxide, dichlorodecane, dichloroethane, and any combination thereof.
  • the amount of the organic solvent is also not particularly limited as long as the brevisin can be sufficiently dissolved, and it is preferably calculated in terms of the amount of the solvent required per gram of breviscapine, and the solvent is used in an amount of 10 to 100 ml per gram.
  • Breviscapine more preferably 20 - 80 ml per gram of breviscapine, most preferably 30 - 50 ml per gram of breviscapine.
  • step a) is by dissolving breviscapine in a mixed solvent of N,N-dimercaptophthalamide (DMF) and dichlorodecane, more preferably N,N-dimercaptoamide ( DMF) and dichloromethane are carried out in a mixed solvent obtained in a volume ratio of 10:1 to 10:5, preferably 10:2 to 10:4, more preferably 10:3.
  • DMF N,N-dimercaptoamide
  • DMSO dimercaptosulfoxide
  • dichloroethane can be replaced by dichloroethane.
  • Other similar alternatives are also Yes.
  • the oxime etherification reaction reagent described in the step a) is not particularly limited, and for example, may be selected from the group consisting of a halogenated decane, a dinonyl sulfate, and a dinonyl carbonate, preferably a halogenated decane.
  • a halogenated decane for example, iodonane, bromodecane, etc., most preferably iodonane.
  • the oxime etherification reagent is used in an amount of from 1 to 10:1, preferably from 3 to 5:1, more preferably 4:1, in terms of a molar ratio to the reaction substrate.
  • the base described in the step a) is not particularly limited, and is preferably M 2 C0 3 or MHC0 3 , wherein M is sodium Na, K or Li, and the molar ratio is relative to the reaction bottom.
  • the amount is from 1 to 15:1, preferably from 3 to 10:1, more preferably from 5 to 8:1.
  • step b) the separation extraction described in step b) can be carried out by chromatography, for example by chromatography on silica gel or alumina columns, with chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, Sterols, petroleum ethers or mixtures thereof are eluents.
  • step b) is a product obtained by reacting step a) in a volume ratio of from 1 to 15:1, preferably from 3 to 10:1, more preferably from 6 to 8:1 of ethyl acetate/sterol Al was obtained by separating and extracting the eluent from a silica gel column.
  • the organic solvent described in the step c) is not particularly limited, and may be a single solvent or a mixed solvent of two or more solvents, for example, may be selected from ethyl acetate. Dichlorodecane and combinations thereof.
  • the organic solvent is a mixed solvent of ethyl acetate and dichlorosilane, more preferably ethyl acetate and dichlorosilane are 10:1 to 10:5, preferably 10:2 to 10:4 by volume.
  • a mixed solvent of 10:3 is more preferable.
  • the amount of the solvent is not particularly limited as long as it can sufficiently dissolve the compound of the formula (I), and is preferably calculated in an amount of from 10 to 100 per ml of the mixed solvent of the compound of the formula (I). Mg per gram of the compound of formula (I), more preferably 20 to 80 ml per gram of the compound of formula (I), most preferably 30 to 50 ml per gram of the compound of formula (I).
  • the acetylating agent described in the step c) is not particularly limited, and may be, for example, selected from the group consisting of acetic anhydride, acetyl chloride, acetic acid, ethyl acetate or vinyl acetate, preferably acetic anhydride, Acetyl chloride or acetic acid, more preferably acetic anhydride or acetyl chloride.
  • the oxime etherification reaction agent is used in an amount of from 1 to 10:1, preferably from 3 to 5:1, more preferably 4:1, based on the reaction substrate.
  • the base described in the step c) is not particularly limited and may be the same as or different from the base described in the step a).
  • the base used in step c) is pyridine, triethylamine, diisopropylethylamine or any combination thereof in an amount of from 1 to 15:1, preferably from 3 to 10, based on the molar ratio of the reaction substrate. 1, more preferably 5-8:1.
  • the separation and extraction method described in the step d) and the separation and extraction method described in the step b) may be the same or different, for example, by chromatography, in particular It can be chromatographed, for example, in a silica gel or alumina column using chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, decyl alcohol, petroleum ether or a mixture thereof as an eluent.
  • step d) is an ethyl acetate/petroleum ether obtained by reacting the product obtained in step c) in a volume ratio of 1:1 to 15, preferably 1:3 to 10, more preferably 1:6 to 8. Separation and extraction of the eluent on a silica gel column gave A2.
  • the compound A2 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be formulated into a pharmaceutical composition and administered in various forms suitable for the selected route of administration such as oral or parenteral, intravenous, intramuscular, topical or subcutaneous routes. In mammals such as human patients.
  • a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating cardiovascular and cerebrovascular diseases, inflammation and/or tumor characterized in that said pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount
  • the scutellarin derivative of the formula (II) according to Claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier means a pharmaceutical carrier conventionally used in the pharmaceutical field, such as an excipient, a filler, a binder, a disintegrant, a lubricant, an antioxidant, a coating agent, a coloring agent. , fragrances, surfactants, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared into a conventional preparation including an oral preparation, an injection preparation or a spray (e.g., a nasal spray) in accordance with a conventional preparation method of the preparation.
  • the respective carriers can be selected depending on the different dosage forms of the pharmaceutical composition, and the preparation of the respective dosage forms can be carried out according to the conventional techniques in the preparation of the preparation, and if necessary, coating can also be carried out.
  • the compound A2 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be administered systemically, for example, orally, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier such as an inert diluent. They can be enclosed in hard or soft shell gelatin capsules, compressed into tablets or added directly to the diet of the patient's diet.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as an inert diluent.
  • the active compound may be combined with one or more carriers in the form of tablets, buccal tablets, lozenges, capsules, elixirs, suspensions, syrups, glutinous rice bran Used in the form of a dose or the like.
  • Tablets, troches, pills, capsules and the like may also contain the following ingredients: binders such as tragacanth, gum arabic, corn starch or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; disintegrants such as corn starch , potato starch, alginic acid, etc.; a lubricant such as magnesium stearate; and a sweetener such as sucrose, fructose, lactose or aspartame; or a flavoring agent such as peppermint, wintergreen oil; or other flavoring agents may be added.
  • a liquid carrier such as vegetable oil or polyethylene glycol.
  • a variety of other materials may be present as coatings or to modify the physical form of the solid unit dosage form.
  • tablets, pills or capsules It can be coated with gelatin, wax, shellac or sugar.
  • a syrup or elixir may contain the active compound, sucrose or fructose as a sweetening agent, decyl hydroxybenzoate and propyl p-hydroxybenzoate as a preservative, a dye and a flavoring such as cherry or orange flavor.
  • any material used in the preparation of any unit dosage form should be pharmaceutically acceptable and substantially non-toxic in the amounts employed.
  • the active compounds can be incorporated into sustained release formulations and devices.
  • the active compound can also be administered intravenously or intraperitoneally by infusion or injection.
  • a solution of the active compound or a salt thereof can be prepared in water, optionally mixed with a non-toxic surfactant.
  • Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycol, triacetin, and mixtures thereof, as well as in oils. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
  • compositions suitable for injectable or infusion may comprise sterile aqueous solutions or dispersions or dispersions containing the active ingredient, which are suitable for the preparation of a sterile injectable or infusible solution or dispersion, optionally encapsulated In the liposome.
  • the final dosage form should be sterile, fluid and stable under the conditions of manufacture and storage.
  • the liquid carrier or vehicle can be a solvent or a liquid dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (e.g., glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like), vegetable oil, non-toxic glyceride, and suitable mixtures thereof.
  • the proper fluidity can be maintained, for example, by the formation of liposomes, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersions or by the use of surfactants.
  • the action of microorganisms can be prevented by various antibacterial and antifungal agents (e.g., parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, etc.).
  • an isotonic agent such as a sugar, a buffer or sodium chloride.
  • the absorption of the composition can be extended by the use of a delayed absorbent such as aluminum monostearate and gelatin in the injectable compositions.
  • Sterile injectable solutions are prepared by admixing the required amount of active compound in a suitable solvent with various other ingredients as listed above, followed by filter sterilization.
  • the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze drying techniques yielding the active ingredient plus any additional desired ingredients present in the sterile filtration solution described above powder.
  • the compounds of the invention may be administered in neat form, i.e., when they are liquid.
  • a dermatologically acceptable carrier for administration to the skin as a composition or formulation which may be a solid or a liquid.
  • Useful solid carriers include finely divided solids such as talc, clay, microcrystalline cellulose, silica, alumina, and the like.
  • Useful liquid carriers include water, dimethyl sulfoxide (DMSO), alcohols or glycols or water-alcohol/diol blends, the compounds of the invention may be dissolved therein or optionally Helps the non-toxic surfactant to be dispersed in an effective level.
  • Adjuvants such as fragrances and additional antimicrobial agents may be added to optimize performance for a given use.
  • the resulting liquid composition can be applied by an absorbent pad, used to impregnate bandages and other dressings, or sprayed to the affected area using a pump spray or aerosol spray. It is preferably used in the form of a nasal spray.
  • Thickeners such as synthetic polymers, fatty acids, salts and esters of fatty acids, fatty alcohols, modified celluloses or modified minerals may also be used with the liquid carrier to form a coating for direct application to the skin of the user.
  • compositions and formulations of the present invention preferably comprise at least 0.1 wt%, preferably 0.5 wt% to 99.5 wt%, more preferably 1.0 wt% to 90.0 wt%, based on the total weight of the pharmaceutical composition and formulation.
  • the percentage of the pharmaceutical compositions and formulations may vary and may advantageously range from about 2% to about 60% by weight of a given unit dosage form.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used according to a conventional method of various preparation types, and the dosage can be varied depending on the route of administration, the age of the patient, the body weight, the type and severity of the disease to be treated, and the like, such as the mouth J!
  • the active compound is administered at a dose of from 10 mg to 100 mg per day, and the active compound is administered at a dose of from 20 mg to 300 m per day; 5 mg to 80 mg of the active compound per injection, 1-2 times a day.
  • the injection dose is 20 mg-100 mg of the active compound
  • the oral administration is 15 mg-60 mg of the active compound.
  • the scutellarin derivative of the formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is provided for the preparation of a prophylactic, ameliorating or treating cardiovascular and cerebrovascular disease, inflammation and/or The use of drugs in tumors.
  • cardiovascular and cerebrovascular diseases such as cerebral thrombosis, cerebral infarction, and undetermined post-stroke sputum, high blood pressure, cerebral embolism, chronic arachnoid and other cerebrovascular accidents, as well as coronary heart disease, angina pectoris and the like.
  • the inflammation is, for example, polyneuritis, treatment of gouty arthritis, and the like.
  • the tumor includes benign tumors and malignant tumors such as adenoma, lipoma, osteoma, skin cancer, gastric cancer, intestinal cancer, and lung cancer.
  • the inventors used two animal models similar to human diseases to determine various pharmacodynamic indicators and comprehensively evaluated the effect of A2 on acute cardiac and cerebral ischemia.
  • Animal experiments showed that A2 had obvious protective effect on myocardial ischemia under the experimental conditions.
  • A2 high dose group 40mg/kg showed better than 40mg/kg breviscapine tablets and 50mg/kg nimodipine tablets. effect.
  • a large dose of a compound of the invention No toxic side effects of the compound were found, which proved that the drug was safe.
  • breviscapine has dilated cerebral blood vessels, reducing cerebral vascular resistance, and increasing Add cerebral blood flow, improve microcirculation, improve blood-brain barrier permeability, enhance phagocytic immunity of macrophages, fight cerebral ischemia and hypoxia, and fight against adenosine diphosphate (ADP) Caused by platelet aggregation.
  • Breviscapine is widely used in the treatment of cerebral thrombosis, cerebral infarction, and type of undetermined post-stroke sputum, hypertension, cerebral embolism, polyneuritis, chronic arachnoid and other cerebrovascular accidents, as well as coronary heart disease, angina pectoris, Treatment of gouty arthritis embolism.
  • the activity of the compound A2 of the present invention is explained below by an animal pharmacological experiment, and its remarkable therapeutic effect is demonstrated by a comparative study with breviscapine and nimodipine.
  • Red tetrazolium (TTC), imported, AMRESCO packaging, batch number 0765, produced by Shanghai Shenggong.
  • AST serum aspartate aminotransferase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • CK-MB myocardial creatine kinase isozyme
  • TT thrombin time
  • PT prothrombin time
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • FIB FIB (fibrinogen)
  • results are expressed as ⁇ SD, the normal distribution data is t-tested, and the skewed distribution data is tested by rank sum.
  • mice Male SD rats, 330 ⁇ 385g, were randomly divided into the blank group, the model group, the breviscapine tablets 40mg/k group, the A2 20mg/k group and the A2 40mg/k group. Each group of animals was intragastrically administered once daily for 5 consecutive days. The blank group and the model group were given an equal volume of 0.5% CMC-Na 10 ml/kg body weight. At 30 minutes after the last administration, 350 mg/k anesthetized animals were intraperitoneally injected with 12% chloral hydrate. The heart was exposed by thoracotomy. The left anterior descending coronary artery was found in the pulmonary artery cone and left heart chamber, and ligated 2 to 3 mm from the root. A quick cardiac reset closes the chest. The sham operation group only placed the thread without ligating.
  • the electrocardiograms of the limb II lead before and after ligation were recorded at 5, 30, lh, 2h, 4h and 24h, respectively, and the changes in the S-T segment (point J) were measured.
  • two blood samples were taken from the carotid cannula: one separated serum was assayed for AST, LDH and CK-MB activity according to the kit method; one portion was anticoagulated with 3.8% sodium citrate at 1:9.
  • Platelet-rich plasma (PRP) was prepared by centrifugation at 100 rpm for 5 min, and platelet-poor plasma (PPP) was prepared by centrifugation at 3500 rpm for 10 min.
  • the platelet aggregation rate induced by ADP-2Na was determined by turbidimetry, and the final concentration of ADP was 6 mol L; TT, ⁇ , ⁇ and FIB were determined by kit method.
  • the blood is pumped out of the heart water, the atrial and adipose tissue are removed, the water is weighed and weighed, and then cut into 5 pieces in the crown, protected from light in 1% TTC solution. Incubate for 10 min at 37 °C. After staining, the normal myocardial tissue was red, and the infarcted tissue was white. The infarcted site was cut and weighed, and the percentage of the necrotic part to the ventricular weight was calculated as the myocardial infarction range.
  • the hole, exposed to the MCA, is provoked by a needle between the inferior cerebral vein and the olfactory tract, and the cotton ball is pressed to stop bleeding, and the muscle and skin are layered and sutured.
  • the sham operation group has the same steps except that it does not pick up the MCA.
  • the rat tail is about one foot away from the ground.
  • the wrist has flexion of the wrist in the contralateral forelimb, 1 - 4 flexion of the elbow, internal rotation of the shoulder or wrist, elbow flexion and internal rotation.
  • the nerve function was scored, the carotid artery was intubated to take blood, and one separated serum was tested for the activity of AST and LDH according to the kit method; one was centrifuged with 3.8% sodium citrate at 1:9, and centrifuged at 1000 rpm.
  • Platelet-rich plasma (PRP) was prepared at 5 min, and platelet-poor plasma (PPP) was prepared by centrifugation at 3500 rpm for 10 min.
  • the platelet aggregation rate induced by ADP-2Na was determined by turbidimetry.
  • the final concentration of ADP was 6 mol/L.
  • TT, ⁇ , ⁇ and FIB were determined according to the kit method.
  • the brain After taking blood, the brain was quickly decapitated, and the olfactory bulb, cerebellum and low brainstem were removed in water physiological saline. The brain was weighed and dried, and cut into 5 pieces along the coronal shape. 5 ml of TTC and 1 mol of LK 2 were placed. In a 0.1 ml solution of HPO 4 , incubate at 37 ° C for 30 min in the dark, and then flip every 7-8 min. After staining, the normal brain tissue is rose red, and the infarct tissue is white, and the infarct is cut off. The weight of the infarct tissue accounted for the percentage of bilateral cerebral hemisphere weight as the cerebral infarction range.
  • the serum AST and LDH activities of the model group were significantly increased and the body weight decreased significantly at 24 hours after surgery. Both groups could significantly reduce the release of LDH. A2 also significantly reduced AST activity, which could significantly reduce the weight loss of model rats. It is shown that the two samples have a significant effect on reducing brain tissue damage. The results are shown in Table 6.
  • ⁇ 2 can not only reduce the range of cerebral infarction in MCAO rats, but also significantly improve the degree of behavioral disorders, significantly reduce the activity of LDH and AST in serum, and also significantly inhibit ADP-induced platelet aggregation, and have a certain anticoagulation tendency, thus inhibiting Thrombosis.
  • the results show that A2 has a significant protective effect on heart and brain ischemia.
  • A2 has a significant protective effect on myocardial ischemia under experimental conditions, and the A2 high-dose group showed a ratio of 40 mg/kg breviscapine tablets and 50 mg/kg.
  • the nimodipine tablets work well.
  • the filtrate is sent to the filling machine, filled with 2.0ml/support, half-plug, sent to the freezing vacuum dryer, quickly cooled to minus 40 ° C, kept for 2 hours, vacuumed to below about 1Pa, gradually warmed to 31 °C, hold for 2 hours. Press the plug, take out the product, tie it, pack it, and pass the inspection to obtain 1000 finished products.
  • the preparation method is as follows:

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Description

一种灯盏花乙素衍生物及其制备方法、 药物组合物和用途 技术领域
本发明涉及一种新的灯盏花乙素衍生物、 其制备方法及含有该化合物的 药物组合物， 以及它们在心脑血管疾病、 炎症和 /或肿瘤等方面的应用。
背景技术
灯盏花又名灯盏细辛， 属菊豆科短亭飞蓬类植物。 灯盏花素是从灯盏花 全株植物中分离提取出的以含灯盏花乙素为主（>90% )、 还含有少量灯盏花 曱素的混合物（有效部位）， 灯盏花乙素又称野黄芩香。 灯盏花素具有活血化 瘀、 散寒解表、 舒筋活络、 祛风除湿之功效， 临床上常用于治疗心血管疾病。 目前临床中使用的灯盏花制剂， 其有效成分一般都是利用乙醇和乙酸乙酯进 行提取的主要含灯盏花乙素的制剂， 灯盏花乙素在心脑血管疾病治疗发明已 有许多文献报道。 临床应用表明灯盏花乙素具有增加心脑血管血流量， 降低 血管阻力， 抗血小板、 红细胞凝聚， 降低血液粘稠度等作用， 疗效确切。 还 有大量的研究证实灯盏花乙素具有抗炎、 抗氧化、 蛋白激酶抑制剂、 糖尿病、 肾病、 风湿、 类风湿等疾病的治疗作用等。 灯盏花素在临床上广泛用于治疗 脑血栓、 脑梗塞以及类型未定的中风后瘫痪、 高血压、 脑栓塞、 多发性神经 炎、 慢性蛛网膜等脑血管意外所致瘫痪以及冠心病、 心绞痛、 治疗痛风性关 节炎等症。
由于灯盏花乙素难溶于水， 口服生物半衰期短， 绝对生物利用度低， 限 制了它在医药领域中的应用。 为了改善灯盏花乙素上述缺点以及扩大其应用 范围， 人们对其进行改造， 旨在寻找新型的活性化合物。 文献报道（ irn . Pharm. Sci, 2006, 29, 5， 385-393 )， 在灯盏花乙素糖甙羧基上进行乙酯、 苄酯 和羟乙酰胺酯的前药合成，发现灯盏花乙素羟乙酰胺酯在緩冲溶液（ PH=4.2 ) 和水中的溶解度比灯盏花乙素分别提高了近 10倍和 35倍。
然而， 现有的灯盏花乙素或其衍生物的溶解性能不好， 生物利用度不高， 治疗效果也不够理想。
发明内容
本发明人发现， 通过在灯盏花乙素黄酮结构的酚羟基上引入曱基后， 进 一步在糖羟基上引入乙酰基， 可以获得一种新结构的灯盏花乙素衍生物。 本发明的一个目的是提供一种新的灯盏花乙素衍生物， 其结构如下列式
(II)所示：
Figure imgf000003_0001
式（II)所示的灯盏花乙素衍生物还可以以其盐、尤其是药学上可接受的 盐的形式出现， 包括与无机碱或有机碱形成的盐。 所述无机碱例如碱金属或 碱土金属的碱性化合物， 尤其是氢氧化钠 （NaOH)、 氢氧化钾（KOH)、 氢 氧化钙（Ca (OH) 2)等。 所述有机碱例如胺， 尤其是 赖氨酸、 精氨酸、 三乙胺等。 可以使用本领域公知的任何常规方法得到所述盐。
本发明的另一个目的是提供本发明所述的式（ II )灯盏花乙素衍生物的制 备方法， 包括如下步骤：
a)、 将灯盏花素溶于有机溶剂中， 加入曱醚化反应试剂和碱， 于 0~40 C、 优选室温下搅拌；
b、 步骤 a)反应得到的产物经分离提取得到式（I)化合物：
Figure imgf000003_0002
c)、 将式（I)化合物溶解于有机溶剂中， 加入乙酰化试剂和碱， 于 0~
40 、 优选室温下搅拌；
d)、将步骤 c)反应得到的产物经分离提取得到式（II)的灯盏花乙素衍生 物。
在本发明的上下文中， 室温是指 15-25°C范围内的任意温度。 式（I )化合物及其制备方法和用途在与本申请同一天提交的本申请人的 国际专利申请中进行了详细具体的描述， 该专利申请的全部内容通过引用并 入本文。
为了描述上的便利， 下文中式（I )化合物（即在灯盏花乙素黄酮结构的 酚羟基上引入曱基后得到的产物 4，，5，6-三曱氧基灯盏花乙素）也可简称为 Al， 式（II )化合物（即在进一步引入乙酰基后得到的产物 4，，5，6-三曱氧基 -8-(3，4，5- 三乙酰基 -葡萄醛酸) -黄芩素 )也可简称为 A2。
本发明的又一个目的是提供一种用于预防、 改善或治疗心脑血管疾病、 炎症和 /或肿瘤的药物组合物， 其特征在于所述药物组合物包含治疗有效量的 本发明所述的式 ( II )灯盏花乙素衍生物或其药学上可接受的盐作为活性组分， 还包含药学上可接受的载体。
本发明的再一个目的是提供本发明所述的式（ II )灯盏花乙素衍生物或其 药学上可接受的盐在制备预防、 改善或治疗心脑血管疾病、 炎症和 /或肿瘤的 药物中的用途。
本发明的化合物 A2溶解性能好， 生物利用度高， 疗效确切， 因此本发明 的化合物 A2或含有该化合物 A2的药物组合物可以取代现有的灯盏花乙素或 其衍生物而有效地用于心脑血管疾病、炎症和 /或肿瘤等的预防、改善和治疗。
此外， 通过采用工业化植物提取原料灯盏花素作为起始原料， 经过两步 易于工业化的化学反应合成即可得到本发明的化合物 A2。 因此， 本发明的灯 盏花乙素衍生物（A2 )制备方法简便， 具有反应条件温和、 成本较低、 易于 操作及适宜于工业化生产等优点， 经济效益尤其显著。
具体实施方式
在本发明的一些实施方案中， 提供一种新的灯盏花乙素衍生物， 其结构 如式（II )所示：
Figure imgf000004_0001
式（II)所示的灯盏花乙素衍生物还可以以其盐、尤其是药学上可接受的 盐的形式出现， 包括与无机碱或有机碱形成的盐。 所述无机碱例如碱金属或 碱土金属的碱性化合物， 尤其是氢氧化钠 （NaOH)、 氢氧化钾（KOH)、 氢 氧化钙（Ca (OH) 2)等。 所述有机碱例如胺， 尤其是 赖氨酸、 精氨酸、 三乙胺等。 可以使用本领域公知的任何常规方法得到所述盐。
在本发明的另一些实施方案中，提供本发明所述的式（ II )灯盏花乙素衍 生物（A2) 的制备方法， 包括如下步骤： a)、 将灯盏花素溶于有机溶剂中， 加入曱醚化反应试剂和碱， 于 0~40 、 优选室温下搅拌；
b、 步骤 a)反应得到的产物经分离提取得到式（I)化合物：
Figure imgf000005_0001
c)、 将式（I)化合物溶解于有机溶剂中， 加入乙酰化试剂和碱， 于 0~ 40 、 优选室温下搅拌；
d)、将步骤 c)反应得到的产物经分离提取得到式（II)的灯盏花乙素衍生 物。
在本发明的一些优选实施方案中，步骤 a)中所述的有机溶剂可以是单一 溶剂， 也可以是两种或更多种溶剂的混合溶剂。 例如， 所述有机溶剂可以选 自 N，N-二曱基曱酰胺、 二曱基亚砜、 二氯曱烷、 二氯乙烷及其任意组合。 所 述有机溶剂的量也没有特别的限制， 只要能够充分溶解灯盏花素即可， 优选 按照每克灯盏花素所需要的溶剂的毫升量计算， 所述溶剂的用量为 10-100 毫升每克灯盏花素， 更优选 20 - 80毫升每克灯盏花素， 最优选 30 - 50毫升 每克灯盏花素。
在一些具体实施方案中， 步骤 a)通过将灯盏花素溶于 N，N-二曱基曱酰 胺（DMF)和二氯曱烷的混合溶剂， 更优选 N，N-二曱基曱酰胺 (DMF)和 二氯曱烷按体积比 10:1 - 10:5、 优选 10:2 - 10:4、 更优选 10:3得到的混合溶 剂中来进行。 作为替代方案， 可以用二曱基亚砜（DMSO)替代 N，N-二曱基 曱酰胺（DMF)， 以及 /或者用二氯乙烷替代二氯曱烷， 其它类似的替换也是 可以的。
在本发明的一些优选实施方案中， 步骤 a)中所述的曱醚化反应试剂没有 特殊限制， 例如可以选自卤代曱烷、 硫酸二曱酯和碳酸二曱酯， 优选卤代曱 烷， 例如碘曱烷、 溴曱烷等， 最优选碘曱烷。 所述曱醚化反应试剂的用量按 摩尔比相对于反应底物为 1-10:1， 优选 3- 5:1， 更优选 4:1。
在本发明的一些优选实施方案中， 步骤 a)中所述的碱没有特殊限制， 优 选为 M2C03或 MHC03， 其中 M为钠 Na、 K或 Li， 用量按摩尔比相对于反 应底物为 1-15:1， 优选 3- 10:1， 更优选 5- 8:1。
在本发明的一些优选实施方案中， 步骤 b)中所述的分离提取可以通过色 谱法进行， 例如在硅胶或氧化铝柱中进行色谱分离， 其中以氯仿、 二氯曱烷、 乙酸乙酯、 曱醇、 石油醚或它们的混合物为洗脱剂。 在一些具体实施方案中， 步骤 b)为将步骤 a)反应得到的产物以体积比为 1-15:1、 优选 3- 10:1、 更优 选 6- 8:1的乙酸乙酯 /曱醇为洗脱剂用硅胶柱分离提取得到 Al。
在本发明的一些优选实施方案中， 步骤 c)中所述的有机溶剂没有特殊限 制， 可以是单一溶剂， 也可以是两种或更多种溶剂的混合溶剂， 例如可以选 自乙酸乙酯、 二氯曱烷及其组合。 优选地， 所述有机溶剂是乙酸乙酯和二氯 曱烷的混合溶剂，更优选乙酸乙酯和二氯曱烷按体积比 10:1 - 10:5、优选 10:2 -10:4、 更优选 10:3得到的混合溶剂。 所述溶剂的量没有特别的限制， 只要 能够充分溶解式（I)化合物即可， 优选按照每克式（I)化合物所需要的混合 溶剂的毫升量计算， 所述溶剂的用量为 10- 100毫升每克式（I)化合物， 更 优选 20 - 80毫升每克式（ I )化合物，最优选 30 - 50毫升每克式（ I )化合物。
在本发明的一些优选实施方案中， 步骤 c)中所述的乙酰化试剂没有特殊 限制， 例如可以选自醋酸酐、 乙酰氯、 水醋酸、 乙酸乙酯或醋酸乙烯酯等， 优选醋酸酐、 乙酰氯或水醋酸， 更优选醋酸酐或乙酰氯。 所述曱醚化反应试 剂的用量按摩尔比相对于反应底物为 1-10:1， 优选 3- 5:1， 更优选 4:1。
其中， 步骤 c)中所述的碱没有特殊限制， 并且可以与步骤 a)中所述的碱 相同或不同。 优选地， 步骤 c)中所用的碱为吡啶、 三乙胺、 二异丙基乙基胺 或其任意组合， 用量按摩尔比相对于反应底物为 1-15:1， 优选 3-10:1， 更 优选 5-8:1。
在本发明的一些优选实施方案中， 步骤 d)中所述的分离提取方法与步骤 b)中所述的分离提取方法可以相同或不同， 例如， 可以通过色谱法进行， 尤 其是例如可以在硅胶或氧化铝柱中进行色谱分离， 其中以氯仿、 二氯曱烷、 乙酸乙酯、 曱醇、 石油醚或它们的混合物为洗脱剂。 在一些具体实施方案中， 步骤 d)为将步骤 c)反应得到的产物以体积比为 1:1 - 15、 优选 1:3 - 10、 更优 选 1:6 - 8的乙酸乙酯 /石油醚为洗脱剂用硅胶柱分离提取得到 A2。
本发明的化合物 A2或其药学上可接受的盐可以配制为药物组合物并以 适合于所选择的给药途径例如口服或肠胃外、 静脉内、 肌肉内、 局部或皮下 途径的各种形式施用于哺乳动物例如人患者。
因此， 在本发明的又一些实施方案中， 提供一种用于预防、 改善或治疗 心脑血管疾病、 炎症和 /或肿瘤的药物组合物， 其特征在于所述药物组合物包 含治疗有效量的权利要求 1所述的式（II )灯盏花乙素衍生物或其药学上可接 受的盐作为活性组分， 还包含药学上可接受的载体。
在本发明中， 所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体， 如赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 抗氧化剂、 包衣剂、 着色剂、 芳香剂、 表面活性剂等。
本发明的药物组合物可以按照制剂的常规制备方法制成包括口服剂、 注 射制剂或喷雾剂 （例如鼻喷雾剂）的常规制剂。 根据药物组合物的不同剂型 可选择相应的载体， 根据制剂制备方面的现有常规技术可以实现相应剂型的 制备， 必要时还可进行包衣。
例如， 本发明的化合物 A2或其药学上可接受的盐可以与药学上可接 受的载体 (例如惰性稀释剂）组合进行全身性施用， 例如口服。 可以将它们 封入硬壳或软壳明胶胶嚢中、 可以压成片或者可以直接加入到患者饮食的 食物中。 对于口服治疗给药， 可以使所述活性化合物与一种或更多种载体 组合并以片剂、 口含片剂、 锭剂、 胶嚢、 酏剂、 混悬剂、 糖浆剂、 糯米纸 嚢剂等形式使用。
片剂、 锭剂、 丸剂、 胶嚢等也可以含有下列成分： 粘合剂， 例如黄蓍 胶、 阿拉伯树胶、 玉米淀粉或明胶； 赋形剂， 例如磷酸二钙； 崩解剂， 例 如玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 藻酸等； 润滑剂， 例如硬脂酸镁； 以及甜味剂， 例如蔗糖、 果糖、 乳糖或阿斯巴甜； 或者调味剂， 例如薄荷、 冬青油； 或 者可以加入其它香料。 当单位剂型是胶嚢时， 除了上述类型的物质之外， 还可以含有液体载体， 例如植物油或聚乙二醇。 可以存在多种其它物质作 为包衣或者用以改变固体单位剂型的物理形式。 例如， 片剂、 丸剂或胶嚢 可以包覆有明胶、 蜡、 虫胶或糖等。 糖浆剂或酏剂可以含有活性化合物、 作为甜味剂的蔗糖或果糖、 作为防腐剂的对羟基苯曱酸曱酯和对羟基苯曱 酸丙酯、 染料和例如樱桃香料或桔子香料的调味剂。 应当注意， 在制备任 意单位剂型中使用的任何物质应该是药学可接受的并且在所使用的量内 基本上是无毒的。此外，可以将活性化合物加入到持续释放制剂和装置中。
也可以通过输注或注射来静脉内或腹膜内施用活性化合物。 可以在水 中制备活性化合物或其盐的溶液， 任选地与无毒表面活性剂混合。 还可以 在丙三醇、 液态聚乙二醇、 三醋精及其混合物中以及在油中制备分散体。 在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以预防微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可包括含有活性成分的无菌水溶液或分 散体或无菌粉末， 其适合于临时制备无菌的可注射或可输注溶液或分散 体， 任选地包封在脂质体内。 在所有情况下， 最终的剂型在制备和储存的 条件下应该是无菌的、 流动的和稳定的。 液体载体或媒介物可以是溶剂或 包含例如水、 乙醇、 多元醇 (例如丙三醇、 丙二醇、 液态聚乙二醇等）、 植 物油、 无毒甘油酯及其合适的混合物的液态分散介质。 例如可以通过形成 脂质体、 在分散体情况下保持所需的粒径或使用表面活性剂维持适当的流 动性。 可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂 (例如对羟基苯曱酸酯、 氯代丁醇、 酚、 山梨酸、 硫柳汞等)来预防微生物的作用。 在许多情况下， 优选包含等 渗剂， 例如糖、 緩冲剂或氯化钠。 可以通过在可注射组合物中使用延迟吸 收剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长该组合物的吸收。
通过根据需要在合适溶剂中使所需量的活性化合物与如上列举的多 种其它成分混合， 随后过滤杀菌， 来制备无菌可注射溶液。 在用于制备无 菌可注射溶液的无菌粉末的情况下， 优选的制备方法是真空干燥和冷冻干 燥技术， 得到活性成分加上存在于前述无菌过滤溶液中的任意额外的所希 望成分的粉末。
对于局部给药， 可以以纯净形式即当其是液体时施用本发明的化合 物。 然而， 通常希望将本发明的化合物与皮肤病学可接受的载体组合作为 可以是固体或液体的组合物或制剂施用于皮肤。
可用的固体载体包括细碎的固体， 例如滑石、 粘土、 微晶纤维素、 二 氧化硅、 氧化铝等。 可用的液体载体包括水、 二曱基亚砜 (DMSO)、 醇或 二醇或者水-醇 /二醇共混物， 本发明的化合物可以溶于其中或者任选地借 助于无毒表面活性剂以有效水平分散于其中。 可以加入佐剂例如芳香剂以 及另外的抗微生物剂， 以便使性能对于给定的用途而言最优化。 可以由吸 收垫施加所得的液体组合物、 用来浸渍绷带和其它敷料或者使用泵式喷雾 器或气雾剂喷雾器将其喷到受影响的区域。 优选以鼻喷雾剂的形式使用。
还可以随同液体载体一起使用增稠剂例如合成聚合物、 脂肪酸、 脂肪 酸的盐和酯、 脂肪醇、 改性纤维素或改性矿物质， 以形成用于直接涂敷到 使用者皮肤上的可铺展的糊、 凝胶、 软膏、 皂等。
本发明的药物组合物和制剂优选含有基于所述药物组合物和制剂的 总重量为至少 0.1wt%、 优选 0.5wt% ~ 99.5wt%、 更优选 1.0 wt% - 90.0wt%的活性化合物。 所述药物组合物和制剂的百分比可以改变并且可 以有利地为给定单位剂型重量的约 2%到约 60%。
本发明的药物组合物可按照各种制剂类型的常规方法使用， 使用剂量可 根据用药途径、 患者年龄、 体重、 所治疗疾病的类型和严重程度等变化， 如 口 J!艮途径每次 J!艮用剂量在 10mg— lOOmg 活性化合物， 每天剂量在 20mg-300m 活性化合物；注射途经每次 5mg-80mg活性化合物，每天 1-2次。 按照患者个体情况用药， 通常每天治疗剂量口服 50mg-200mg活性化合物、 注射剂量： 20mg-100mg活性化合物、 预防口服用药为： 15mg-60mg活性化 合物。
在本发明的再一实施方案中，提供本发明所述的式（ II )灯盏花乙素衍生 物或其药学上可接受的盐在制备预防、 改善或治疗心脑血管疾病、 炎症和 /或 肿瘤的药物中的用途。
所述心脑血管疾病例如脑血栓、 脑梗塞以及类型未定的中风后瘫痪、 高 血压、 脑栓塞、 慢性蛛网膜等脑血管意外所致瘫痪以及冠心病、 心绞痛等。
所述炎症例如多发性神经炎、 治疗痛风性关节炎等。
所述肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤， 例如腺瘤、 脂肪瘤、 骨瘤、 皮肤癌、 胃癌、 肠癌和肺癌等。
发明人采用两种与人类疾病相近的动物模型， 测定多种药效学指标， 综 合评价 A2对急性心脑缺血的影响。 动物实验结果表明， A2在实验条件下， 对心肌缺血有明显保护作用， A2高剂量组 40mg/kg显示出了比 40mg/kg灯盏 花素片和 50mg/kg的尼莫地平片还要好的作用。大剂量使用本发明化合物时， 也没有发现该化合物的毒副作用， 证明其用药安全。
下面具体描述 A2的制备方法， A2的药理学作用以及本发明药物组合物 的常规制剂的制备方法。 通过下面的描述， 本领域技术人员将更加全面地理 解本发明， 但是本发明绝不仅限于此。
制备实施例 1 4，, 5,6-三曱 灯盏花乙素（A1 ) 的制备
将 5克（ 10.8mmol )灯盏花素（昆明制药集团股份有限公司生产）溶解 于 100毫升体积比为 10:3的 DMF和二氯曱烷混合溶剂中， 加入 4.6克碘曱 烷和 7.5克（54mmol )碳酸钟， 于室温下搅拌 2天， TLC (薄层层析法）显 示反应已完全， 加入 50毫升 1N盐酸， 并用 50毫升乙酸乙酯萃取 3次，合并 有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干有机溶剂， 以乙酸乙酯 /曱醇为 10: 1 ( V/V ) 用硅胶柱分离提取， 得到 3.1 克淡黄色固体 Al， 产率为 60 %。 I^ MR ( 400MHz, CDC13 ) 67.78 (d, 2H), 6.92 (d, 2H), 6.60 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 4.94 (d， 1H), 4.01 (d， 1H), 3.83 (s， 3H), 3.81 (s， 3H), 3.71 (s， 3H), 3.47-3.67 (m， 5H); C13NMR ( 100MHz, CDC13 ) 6181.76, 181.68, 168.14, 163.59, 163.54, 161.79, 155.15, 152.38, 152.10, 151.62, 132.25, 127.28, 122,17, 113.62, 105.97, 102.82, 100.13, 93.63, 75.02, 74.77, 71.90, 70.31, 60.00, 54.63, 51.54; MS(ESI) M+ 504。
制备实施例 2 4，,5,6-三曱氧基-8-(3,4,5-三乙酰基-葡萄醛酸)-黄芩素） ( A2 ) 的制备
从制备实施例 1得到的 A1中取 504毫克，并溶解于 10毫升体积比为 10:3 的乙酸乙酯和二氯曱烷混合溶剂中，加入 0.5毫升乙酸酐和 1滴吡啶于室温下 搅拌 6小时， TLC检测原料反应完毕， 加入 20毫升饱和食盐水和 10毫升乙 酸乙酯， 萃取留下有机相， 用无水疏酸钠干燥， 蒸干溶剂， 以乙酸乙酯 /石油 醚按体积比为 1: 10用硅胶柱分离提取得到 421毫克淡黄色产物 A2， 产率为 66.8%。 I^ MRi 400MHz, CDC13 )67.86 (d, 2H), 7.03 (d, 2H), 6.75 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.40 (m, 3H), 5.26 (d, 1H), 4.25 (d, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.76 (s， 3H), 2.11 (s, 3H), 2.08 (s， 3H), 2.07 (s， 3H), C13NMR ( 100MHz, CDC13 ) 6182.78, 169.98, 169.36, 169.23, 166.82, 164.54, 162.71, 155.26, 153.94, 152.27, 134.45, 128.13, 123.19, 114.49, 107.96, 103.98, 99.63, 96.26, 72.78, 71.21, 70.51, 68.95, 61.09, 55.51, 53.09, 20.59, 20.48.
实验例一 A2对心脑血管缺血保护作用的药理学研究
大量的药理研究证明， 灯盏花素具有扩张脑血管， 降低脑血管阻力， 增 加脑血流量， 改善微循环， 提高血脑屏障通透性， 增强机体巨噬细胞吞噬免 疫作用， 对抗垂体后叶素所至脑缺血缺氧， 并能对抗由二磷酸腺苷（ADP ) 引起的血小板凝聚作用。 灯盏花素在临床上广泛用于治疗脑血栓、 脑梗塞以 及类型未定的中风后瘫痪、 高血压、 脑栓塞、 多发性神经炎、 慢性蛛网膜等 脑血管意外所致瘫痪以及冠心病、 心绞痛、 治疗痛风性关节炎等症。
下面通过动物药理学实验来说明本发明化合物 A2的活性，并且通过与灯 盏花素及尼莫地平的对比研究来说明其显著的治疗效果。
选择与人类疾病相近且重复性好的动物模型， 是评价药物治疗效果的基 础。 下面的生物实验中采用两种与人类疾病相近的动物模型， 测定多种药效 学指标， 综合评价 A2对心脑缺血的作用。
1材料
1.1药品与试剂
上述实施例合成的 A2纯品。市售灯盏花素片， 20mg/片，批号 20070418， 由云南省药物研究所制药厂生产。 尼莫地平 （尼达尔片）， 20mg/片， 天津市 中央药业有限公司生产， 批号 070301。 以上样品均用 0.5%羧曱基纤维素钠 ( CMC-Na ) 配制成所需浓度的混悬液供大鼠灌胃用。
红四氮峻（TTC )， 进口， AMRESCO分装， 批号 0765， 上海生工出品。 腺苷二磷酸钠 ( ADP ), 批号 A2754， Sigma公司生产， 进口分装， 北京鼎国 生物技术发展中心出品。
AST (血清天冬氨酸转氨酶） (紫外动力学法， 批号 0704151 )、 LDH ( (血 清）乳酸脱氢酶）（紫外动力学法， 批号 0704102、 CK-MB (心肌型肌酸激酶 同功酶）（选择性抑制动力学法， 批号 100412 )、 TT (凝血酶时间）（批号 0504052 )、 PT (凝血酶原时间）（批号 0604161 )、 APTT (活化部分凝血活酶 时间）（批号 0604131 )及 FIB (纤维蛋白原）（批号 060405 )测定试剂盒， 均 为四川迈克科技有限公司出品。
1.2动物
清洁级 SD大鼠， 雄性， 体重 240 ~ 385g， 合格证号： SCXK (沪) 2003-0002， 来 源于上海西普尔一必凯实验动物有限公司， 由昆明医学院实验动物中心代购。
1.3仪器
TM1024全自动生化分析仪， 日本东京株式会社； Centrifuge 5810R型冷 冻离心机， 德国 eppendoff 公司； BS110型电子分析天平， 赛多利斯公司； Millipore超纯水处理系统， 美国 Millipore公司； 6951D型心电机， 上海光电 公司； C2000-4血凝仪及 LBY-NS血小板聚集仪， 北京普利生集团。
1.4统计
结果以 ±SD表示， 正态分布数据用 t检验， 偏态分布数据用秩和检验。
2方法
2.1 大鼠冠状动脉结扎心肌缺血实验
2.1.1实验分组及造型：
雄性 SD大鼠， 330 ~ 385g， 按体重随机分为： 空白组、 模型组、 灯盏花 素片 40mg/k 组、 A2 20mg/k 组及 A2 40mg/k 组。 各组动物按剂量每日灌 胃给药一次， 连续 5天， 空白组和模型组给予等容量 0.5%CMC-Na 10ml/kg 体重。 末次给药后 30min， 用 12%水合氯醛腹腔注射 350mg/k 麻醉动物， 行开胸手术暴露心脏， 于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支， 距 根部 2 ~ 3mm处结扎，快速心脏复位关闭胸腔。假手术组仅置线头而不结扎。
2.1.2检测指标：
分别记录结扎前及结扎后 5分、 30分、 lh、 2h、 4h和 24h肢体 II导联心 电图， 测量 S-T段（J点）变化值。 待记录 24h心电图后， 颈动脉插管取血二 份： 一份分离血清按试剂盒方法测定 AST、 LDH及 CK-MB的活性； 一份用 3.8%枸橼酸钠以 1:9抗凝， lOOOrpm离心 5min制备富血小板血浆（PRP )， 3500rpm离心 lOmin制备贫血小板血浆 （ PPP )。 按比浊法测定 ADP-2Na诱 导的血小板聚集率， ADP的终浓度为 6mol L; 按试剂盒方法分别测定 TT、 ΡΤ、 ΑΡΤΤ及 FIB。 后迅速摘出心脏，置于水生理盐水中泵出心腔内积血， 去掉心房及脂肪组织，吸干水分称取心室重，随后沿冠状切成 5片，在 1%TTC 溶液中避光于 37°C 孵育染色 10min。 经染色后， 正常心肌组织呈红色， 而梗 死组织呈白色， 将梗塞部位剪下称重， 计算坏死部分占心室重的百分比为心肌 梗塞范围。
2.2 大鼠 MCAO (中脑动脉闭塞）局灶性脑缺血实验
2.2.1 实验分组及造型：
雄性 SD大鼠， 体重 240-290g， 分组及剂量同前， 另设一阳性对照药尼莫 地平 50mg/kg组。 各组动物每日按剂量灌胃给药一次， 连续 5天。 末次灌胃 后 30min， 用 12%水合氯醒腹腔注射 350mg/kg麻醉动物， 左侧卧位， 沿右 耳眼线中点切开皮肤， 分离颞肌， 绞断颧骨， 在颧骨根前方用牙科钻钻孔， 暴露 MCA， 在大脑下静脉和嗅束间用针挑起， 断之， 棉球压迫止血后， 分层 缝合肌肉和皮肤。 假手术组除了不挑断 MCA外， 其余步骤相同。
2.2.2观察指标：
动物于造模后 6h及 24h根据运动等行为表现进行神经功能评分，以此作 为脑功能障碍指标。 评分采用盲法， 即评分者不知道给药的情况， 评分标准 如下：
症 状 行为障碍评分 提鼠尾离开地面约一尺， 手术对侧前肢出现腕屈曲， 肘屈 1 - 4 曲， 肩内旋或有腕， 肘屈曲又有内旋。
将动物置于平地面上， 分别推双肩向内侧， 检查阻力。 1 - 3 将动物置于金属网面上， 观察两前肢的张力。 1 - 3 将动物置于平地面上， 观察有无转圈。 1 - 2 满分 12 以上标准满分为 12分， 分数越高， 表明动物行为障碍越严重。
造模 24h， 经神经功能评分后， 颈动脉插管取血， 一份分离血清按试剂 盒方法测定 AST及 LDH的活性；一份用 3.8%枸橼酸钠以 1: 9抗凝， lOOOrpm 离心 5min制备富血小板血浆（ PRP )， 3500rpm离心 lOmin制备贫血小板血 浆（PPP )。 按比浊法测定 ADP-2Na诱导的血小板聚集率， ADP的终浓度为 6mol/L; 按试剂盒方法分别测定 TT、 ΡΤ、 ΑΡΤΤ及 FIB。取血后快速断头取 脑， 放入水生理盐水中去除嗅球、 小脑和低位脑干， 吸干水分称取脑重， 沿 冠状切成 5片， 置入 5ml含有 4%TTC及 lmol LK2HPO40.1ml的溶液中，避 光于 37°C温孵 30min， 其间每隔 7-8min翻动一次， 经染色后， 正常脑组织呈 玫瑰红色， 而梗死组织呈白色， 将梗塞部位剪下称重， 以重量求面积法计算 梗死组织重量占双侧大脑半球重的百分比作为脑梗塞范围。
3 结果
3.1 对大鼠冠状动脉结扎心肌缺血的影响
3.1.1 对心肌缺血心电图 S-T段的影响：
模型组大鼠结扎冠状动脉后， 心电图上 S-T段（J点） 明显升高或下降， 而假手术组则变化不大， 表明实验造模成功。 A2高剂量组能明显减少各时间 点 S-T段的变化， 表明对心肌缺血时的心电图有明显改善作用； A2低剂量组 仅对缺血 5 min 30min和 24h的心电图有改善作用。 结果见表 1
表 1 A2对心肌缺血大鼠心电图 S-T段的影响 剂量 动物数 扎 后 ST 段 变 化 （X±SD mv ) 组 另 U
(/kg) (只） 5min 30min lh 2h 4h 24h 假手术 10ml 10 0.06±0.06 0.05±0.05 0.04±0.05 0.06±0.04 0.06±0.05 0.01±0.02 模 型 10ml 11 0.37±0.12^ 0.24±0.09^ 0.14±0.08^ 0.16±0.08^ 0.16±0.10^ 0.18±0.14^ 灯盖花
40mg 12 0.15±0.14** 0.09±0.08** 0.07±0.06* 0.07±0.07** 0.08±0.06* 0.02±0.03** 素片
A2 40mg 12 0.14±0.11** 0.06±0.05** 0.05±0.04** 0.05±0.04** 0.06±0.05* 0.02±0.02**
A2 20mg 12 0.17±0.14** 0.12±0.08** 0.11±0.09 0.11±0.07 0.11±0.09 0.07±0.08* 与假手术组相比： MP < 0.01; 与模型组相比： *P < 0.05 **P < 0.01 o
3.1.2对心肌缺血大鼠心肌酶学的影响：
模型组大鼠血清 AST LDH及 CK-MB活性有不同程度的增高， 尤以 CK-MB及 LDH活性增高更明显， 表明心肌损伤造模成功。 A2两种剂量均 能明显降低 CK-MB和 LDH的释放， 并具有降低 AST的趋势， 表明减轻心 肌细胞损伤作用显著； 两个给药组大鼠的心肌梗塞范围均显著小于模型对照 组， 与模型组相比分别缩小 60.87%和 45.65%。 结果见表 2
表 2 A2对大鼠心肌梗塞范围和酶学的影响 剂 量 动物数 心 肌 酶 学 （X±SD ku/L ) 心朋 塞范围 组 别
(/kg) (只） AST LDH CK-MB ( X±SD, % ) 缩小率 假手术 10ml 10 0.52±0.21 0.82±0.21 0.65±0.26 0.19±0.27 一 模 型 10ml 11 0.72±0.35 1.08±0.27Δ 2.06±1.30^ 6.44±3.62^ 一 灯盖花
40mg 12 0.68±0.33 0.94±0.42 0.92±0.64* 3.09±1.58* 52.02 素片
A2 40mg 12 0.61±0.19 0.61±0.25** 0.80±0.67* 2.52±2.14* 60.87
A2 20mg 12 0.61±0.25 066±0.31** 0.71±0.46** 3.50±2.68* 45.65 与假手术组相比 ： ΔΡ < 0.05, ΔΔΡ < 0.01 ;与模型组相比： * P < 0.05, ** P < 0.01 o
3.1.3对冠状动脉结扎心肌缺血大鼠血小板聚集及凝血的影响 大鼠冠状动脉结扎致心肌缺血造模后， 血小板聚集率明显升高， ATPP 时间有缩短趋势， 纤维蛋白原的含量明显增加。各给药组能明显抑制 ADP诱 导的血小板聚集， 并有延长 TT、 ΑΡΤΤ时间的趋势， Α2还具有降低纤维蛋 白原含量的趋势。 结果见表 3。
表 3 Α2对冠状动脉结扎致心肌缺血大鼠血凝及血小板聚集的影响 组 别 剂 量 动物数 血凝指标 血小板
(/kg) (只） ττ PT APTT FIB 聚集率
( s ) (s) is) is/L) ( % ) 假手术 10ml 10 77.14±25.12 23.74±6.65 85.95±30.16 3.57±0.49 49.00±6.34 模 型 10ml 11 72.37±40.79 24.56±4.96 56.58±41.58 4.75±1.19^ 57.50±4.00^ 灯盖花 40mg 12 92.49±34.44 26.58±3.81 69.74±33.82 3.90±0.96 48.93±7.22** 素片
Α2 40mg 12 93.04±35.67 25.75±5.25 75.96±35.86 3.95±0.84 48.22±5.55**
Α2 、、、、 2、、、、0、、、m、、、、g、、、 12 92.41±42.38 25.90±3.52 78.17±28.13 4.77±1.11 51.20±7.41* 与假手术组相比： ΔΡ < 0.05，ΔΔΡ < 0.01; 与模型组相比： *Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01。
3.2对 MCAO致局灶性脑缺血大鼠的影响
3.2.1 对 MCAO大鼠神经功能障碍及脑梗塞范围的影响
大鼠 MCAO造模后， 活动减少， 出现不同程度的运动障碍， 模型组与假 手术组相比差异显著。 各给药组均能明显改善 MCAO大鼠的神经功能障碍， 缩小脑梗塞的范围， A2分别缩小 64.65% 、 59.11%。 结果见表 4。
表 4 A2对 MCAO大鼠神经功能障碍及脑梗塞范围的影响 组 另 U 剂 量 动物数 脑梗塞 范 围 行 为 学 评 分（X±SD， 分
(/kg) (只） ( X±SD, % ) 缩小率 6h 24h 假手术 10ml 10 0.04±0.09 - 0.6±0.97 0.60±1.08 模 型 10ml 11 5.77±2.59ΔΔ - 8.73±1.01ΔΔ 7.54±1.29ΔΔ 尼莫地平 50mg 12 2.27±2.56** 60.66 6.50±1.68** 4.83±1.40** 灯盖花素片 40mg 11 2.70±1.42** 53.21 6.27±1.01** 5.18±1.33**
A2 40mg 12 2.04±1.42** 64.65 5.75±1.40** 4.25±1.59**
、、、、、、、、、、、、、、、、 A、、、、2、、、、、、、、、、、、、、、、、、 、、、、、 2、、、、0、、、m、、、 g、 、、、、、、、、、、、、、、、 1、、、2、、、、、、、、、、、 、、、、、、、、、、 2、、、、.、3、、、6、、、±、、、、1、、、.、8、、、0、、、、*、、*、、、、、、、、、 、、、、、、、 5、、、9、、、.、、1、、、1、、、、、、、、、、、、、、、 、、 6、、、、.、4、、、2、、、±、、、、1、、、.、6、、、2、、、、*、、*、、、、、 >、、、、、、、、、 4、、、.、、9、、、2、、、±、、、1、、、.、、3、、、0、、、*、、*、、、 与假手术组相比： ΔΡ < 0.05. ，ΔΔΡ < 0.01;与模型组相比: *Ρ < 0.05, **Ρ < 0·01。 3.2.2 对 ADP诱导的 MCAO大鼠血小板聚集及凝血的影响
大鼠 MCAO造模后，血小板聚集率明显增加，凝血时间有所缩短而纤维 蛋白原的含量有增加的趋势。两种样品均能明显抑制由 ADP诱导的血小板聚 集， 并具有降低纤维蛋白原含量的趋势， A2有延长 APTT时间、 有延长 TT 时间的趋势。 结果见表 5。
表 5 A2对 MCAO大鼠血凝及血小板聚集的影响 （ X±SD ) 组 别 剂 量动物数 血凝指标 血小板
(/kg) (只） TT (s) PT (s) APTT (s) FIB (^L) 聚集率
( % ) 假手术 10ml 10 87.96±29.56 28.02±5.49 81.63±39.80 3.70±0.58 46.30±10.97 模 型 10ml 11 71.58±35.64 25.82±7.79 57.86±32.72 4.50±1.40 60.38±9.28^ 尼莫地平 50mg 12 88.55±32.24 23.38±8.23 61.02±44.79 3.52±1.14 54.15±7.76 灯盖花素片 40mg 11 98.07±36.83 26.78±3.51 74.79±26.26 3.24±0.90* 49.5±6.80**
A2 40mg 12 62.04±40.78 23.43±8.67 75.15±27.40 3.59±0.75 52.38±5.23*
A2 20mg 12 95.55±24.81 25.56±5.31 62.48±29.07 3.38±1.08 50.52±4.06** 与假手术组相比： ΔΡ < 0.05, ΔΔΡ < 0.01; 与模型组相比： *P < 0.05, **P < 0.01o
3.2.3对 MCAO大鼠血清 AST、 LDH及体重的影响：
模型组大鼠血清 AST及 LDH活性明显增高而手术后 24h体重显著下降， 两给药组均能明显降低 LDH的释放， A2还能明显降低 AST活性， 能明显对 抗造模大鼠的体重减轻， 表明两样品减轻脑组织损伤作用显著。 结果见表 6。
表 6 A2对 MCAO大鼠血清 AST、 LDH及体重的影响 剂量 动物数 体重（X±SD， g ) 血清酶（X±SD， u/L ) ) 组 别
(/kg) (只） 给药前 手术前 术后 6h 术后 24h AST LDH 假手术 10ml 258.0±15.5 269.5±16.6 258.0±15.8 255.5±16.6 156.0±51.0 566.1±191.2 模 型 10ml 257.3±10.1 267.7±9.6 252.3±7.5 240.0±8.7Δ 246.6±121.5Δ 907.1±256.7Α 尼莫地
50mg 12 259.6±14.5 265.8±12.9 257.1±11.4 249.6±10.5 198.6±118.2 536.7±262.8 平
灯盖花
+ , 40mg 259.1±13.0 267.7±19.4 256.8±15.7 247.3±15.4 244.3±183.6 719.5±133.4 素片 S
A2 40mg 256.3±13.4 265.8±12.3 253.8±12.0 244.2±12.1 152.9±33.1* 472.0±231.8*
257.9±11.5 268.8±12.3 258.3±11.8 250.0±15.2* 171.2±71.5 571.1±287.3* 与假手术组相比： ΔΡ < 0.05， ΔΔΡ < 0.01; 与模型组相比： *Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01。 4.结论
选择与人类疾病相近且重复性好的动物模型， 是评价药物治疗效果的基 础。 本研究采用两种与人类疾病相近的动物模型， 测定多种药效学指标， 综 合评价两种样品对急性心脑缺血的影响。 结果表明， Α2能明显改善冠状动脉 结扎致心肌缺血大鼠的心电图变化， 降低血清 CK-MB及 LDH的活性， 缩小 心肌梗死范围， 抑制血小板聚集， 并具有延长凝血时间和降低纤维蛋白原的 趋势， 提示其对心肌缺血有明显保护作用。 Α2不仅可以减少 MCAO大鼠脑 梗塞范围， 使行为障碍程度得到明显改善， 血清中 LDH及 AST的活性明显 降低； 同时还能明显抑制 ADP诱导的血小板聚集， 并有一定的抗凝趋势， 从 而抑制血栓形成。 研究结果表明， A2对心脑缺血具有显著保护作用。
在所采用的两种缺血性心脑血管疾病模型上， A2在实验条件下， 对心肌 缺血有明显保护作用， A2 高剂量组显示出了比 40mg/kg 灯盏花素片和 50mg/kg的尼莫地平片还好的作用。
实验例二 本发明化合物 A2和灯盏花乙素的溶解性比较研究
表 7 本发明化合物 A2和灯盏花乙素的溶解性比较 化合物 H20 MeOH 95%EtOH n-BuOH 0.01N NaOH 灯盏花乙素 极微溶解 略溶 略溶 略溶 溶解
A2 极微溶解 溶解 溶解 易溶 溶解 注： 极易溶解、 易溶、 溶解、 略溶、 微溶、 极微溶解、 几乎不溶和不溶的定 义按照 2005CP规定。
从表 7可以看出， A2较之灯盏花乙素， 生物理化性质明显改善， 即脂 溶性明显的改善， 进而可以明显提高其生物利用度， 提高疗效。
通过下面的实验说明本发明化合物 A2在制备药物制剂上的应用。
制剂制备实施例 1: A2冻干粉针剂的制备
原料配方： （制备 1000支， 产品规格： 60mg/支）
A2 60g
甘露醇 100g
NaCl 5g
制备方法：
按配方称取根据前述制备实施例制备的 A2， 加注射用水 1000ml, 搅拌、 并用 O.OlNNaOH调节使溶解， 溶解后加入甘露醇 100g、 NaCl 5g, 搅拌使溶 解完全， 加注射用水至总配液量 2000ml ， 加入总配液量 1%的针用活性炭， 吸附 30分钟， 先用滤纸加砂棒过滤除去活性炭， 滤液经过 0.45μιη的滤膜过 滤等处理后， 在 100级条件下， 用 0.2μιη以下的滤膜精滤。 精滤液送入灌装 机， 灌装 2.0ml/支， 半压塞， 送入冷冻真空干燥机， 快速冷却至零下 40°C， 保持 2小时， 抽真空至约 lPa以下， 逐步緩慢升温至 31°C， 保持 2小时。 压 塞， 取出制品， 扎盖、 包装、 检验合格得成品 1000支。
制剂制备实施例 2: A2滴丸的制备
原料配方： （制备 1000丸， 产品规格： 50mg/丸）
A2 50克
聚乙二醇 -6000 200克
制备方法具体如下：
称取 200克聚乙二醇 -6000于 100 °C左右水浴中熔化， 熔化后 65-75°C恒 温。 称取粉碎过的 A2 50克， 并将其在搅拌下逐渐加入到聚乙二醇 -6000的恒 温液中， 充分搅拌使混合均匀， 送至滴丸机的贮药罐内。 于 65-80°C恒温、 搅 拌混合均勾后即可滴制。 二曱硅油或液体石蜡为冷凝液， 冷却液温度为 3.5-11 °C , 滴速控制在 60 - 80滴 /分钟。 滴制完毕， 取出， 吸去表面硅油或石 蜡油， 在室温条件下自然干燥定型后， 在 50±2°C干燥制得（A2 ) 口服滴丸。
制剂制备实施例 3: A2片剂的制备
原料配方： （制备 1000片， 产品规 ： 10mg/片）
A2 40克
乳 糖 30克
低取代羟丙基纤维素 (L-HPC) 50克
羧曱基淀粉钠 (CMS-Na) 5克
乙 醇 30毫升
水 54毫升
微粉硅胶 5克
制备方法：
按比例称取粉碎过的 A2、 乳糖、低取代羟丙基纤维素、羧曱基淀粉钠等， 按常规工艺处理后， 混合均匀， 加入适宜乙醇作润湿剂制备软材， 制粒， 干 燥， 整粒， 取颗粒检查合格后， 加入助流剂微粉硅胶， 混合均匀后压片。 质 量检查合格后分装， 贴签， 包装即得 A2口腔崩解片。
以上实施例只是用于进一步说明本发明， 而不是用来限制本发明的保护 范围。凡是在本发明保护范围内所做出的具体实施方式及应用上的各种变动， 都属于本发明的保护范围。

Claims

权 利 要 求
1、 一种式（ II )的灯盏花乙素衍生物或其药学上可 的盐:
Figure imgf000020_0001
2、 权利要求 1所述的式（II )灯盏花乙素衍生物的制备方法， 其特征在 于包括如下步骤：
a)、 将灯盏花素溶于有机溶剂中， 加入曱醚化反应试剂和碱， 于 0 ~ 40 C、 优选室温下搅拌；
b)、 步骤 a反应得到的产物经分离提取得到式（I ) 的 4，，5，6-三曱氧基灯 盖花乙素；
Figure imgf000020_0002
c)、 将步骤 b)得到的式（I ) 的 4，，5，6-三曱氧基灯盏花乙素溶解于有机溶 剂中， 加入乙酰化试剂和碱， 于 0 ~ 40 、 优选室温下搅拌；
d)、将步骤 c)反应得到的产物经分离提取得到式（II )的灯盏花乙素衍生 物。
3、根据权利要求 2所述的制备方法， 其特征在于所述步骤 a)中的有机溶 剂选自 N，N-二曱基曱酰胺、二曱基亚砜、二氯曱烷、二氯乙烷及其任意组合。
4、 根据权利要求 3所述的制备方法， 其特征在于所述有机溶剂是 N，N- 二曱基曱酰胺和二氯曱烷按体积比 10:1 - 10:5、优选 10:2 - 10:4、更优选 10:3 得到的混合溶剂。
5、根据权利要求 3所述的制备方法， 其特征在于所述有机溶剂是二曱基 亚砜和二氯乙烷按体积比 10:1 - 10:5、 优选 10:2 - 10:4、 更优选 10:3得到的 混合溶剂。
6、 根据权利要求 2~5中任一项所述的制备方法， 其特征在于所述步骤 a)中有机溶剂的用量为 10- 100毫升每克灯盏花素、 优选 20- 80毫升每克灯 盏花素、 更优选 30- 50毫升每克灯盏花素。
7、 根据权利要求 2~ 6中任一项所述的制备方法， 其特征在于步骤 a)中 所述曱醚化反应试剂选自卤代曱烷、 硫酸二曱酯和碳酸二曱酯， 优选卤代曱 烷， 例如碘曱烷、 溴曱烷等， 最优选碘曱烷， 其用量按摩尔比相对于反应底 物为 1-10:1、 优选 3- 5:1、 更优选 4:1。
8、 根据权利要求 2~ 7中任一项所述的制备方法， 其特征在于步骤 a)中 所述碱为 M2C03或 MHC03， 其中 M为 Na、 K或 Li， 所述碱的用量按摩尔 比相对于反应底物为 1-15:1、 优选 3- 10:1、 更优选 5-8:1。
9、根据权利要求 2~8中任一项所述的制备方法，其特征在于步骤 b)为： 以体积比为 1-15:1、优选 3- 10:1、更优选 6- 8:1的乙酸乙酯 /曱醇用硅胶柱 分离得到式（I) 的 4，，5，6-三曱氧基灯盏花乙素。
10、根据权利要求 2~9中任一项所述的制备方法， 其特征在于所述步骤 c)中的有机溶剂是乙酸乙酯和二氯曱烷按体积比 10:1-10:5、 优选 10:2- 10:4、 更优选 10:3得到的混合溶剂。
11、 根据权利要求 2~10 中任一项所述的制备方法， 其特征在于所述步 骤 c)中的有机溶剂的用量为 10 - 100毫升每克式（ I )化合物， 更优选 20 - 80 毫升每克式（I)化合物， 最优选 30- 50毫升每克式（I)化合物。
12、 根据权利要求 2 ~ 11中任一项所述的制备方法， 其特征在于步骤 c) 所述乙酰化试剂为醋酸酐或乙酰氯， 用量按摩尔比相对于反应底物为 1- 10:1， 优选 3- 5:1， 更优选 4:1。
13、 根据权利要求 2 ~ 12中任一项所述的制备方法， 其特征在于步骤 c) 所述碱为吡啶或三乙胺或二异丙基乙基胺，用量按摩尔比相对于反应底物为 1 -15:1， 优选 3- 10:1， 更优选 5- 8:1。
14、 根据权利要求 2 ~ 13中任一项所述的制备方法， 其特征在于步骤 d) 为： 将步骤 c)反应得到的产物以乙酸乙酯 /石油醚按体积比为 1:1-15、 优选 1:3 - 10、更优选 1:6 - 8用硅胶柱分离提取得到式（ II )的灯盏花乙素衍生物。
15、 一种用于预防、 改善或治疗心脑血管疾病、 炎症和 /或肿瘤的药物组 合物，其特征在于所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求 1所述的式( II ) 灯盏花乙素衍生物或其药学上可接受的盐作为活性组分， 还包含药学上可接 受的载体。
16、根据权利要求 15所述的药物组合物， 其特征在于按照制剂的常规制 备方法制成包括口服剂、 注射制剂或鼻喷雾剂的常规制剂。
17、权利要求 1所述的式（II )的灯盏花乙素衍生物或其药学上可接受的 盐在制备预防、 改善或治疗心脑血管疾病、 炎症和 /或肿瘤的药物中的用途。
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