WO2009157543A1 - 医療用組成物および医療用キット - Google Patents

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hydroxyapatite
cells
carrier
medical composition
polylactic acid
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真也 福本
小山　英則
西沢　良記
古薗　勉
正弘 岡田
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Japan Health Sciences Foundation
Osaka Metropolitan University
University of Osaka NUC
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Osaka University NUC
Japan Health Sciences Foundation
Osaka City University PUC
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    • A61L2300/426—Immunomodulating agents, i.e. cytokines, interleukins, interferons

Definitions

  • the present invention relates to a medical composition and a medical kit capable of inducing angiogenesis.
  • peripheral arterial disease for example, obstructive arteriosclerosis
  • peripheral arterial disease for example, stenosis and occlusion of the peripheral arteries of the extremities occur, resulting in intractable ulcers and gangrene.
  • intractable ulcers and gangrene progress, it may be necessary to cut the extremities, and the number of such severe patients has increased in recent years.
  • pluripotent stem cells isolated from bone marrow or peripheral blood are directly transplanted into the ischemic leg or ischemic myocardium to induce angiogenesis, thereby trying to regenerate normal blood flow. (Angiogenic therapy by cell transplantation).
  • autologous bone marrow mononuclear cell transplantation for human lower limb ischemia has been performed in Japan for the first time since the end of 2000, and is currently performed in dozens of facilities throughout Japan (for example, non-patented) Reference 3).
  • Osaka City University has performed 11 cases of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation (including 3 dialysis patients) for patients with chronic severe limb ischemia from 2002 to the present, and peripheral blood.
  • Mononuclear cell transplantation has been conducted in 11 cases (including 2 dialysis patients).
  • the effective rate of the autologous bone marrow mononuclear cell transplantation was 62.5% as a whole, and 33.3% in dialysis patients (for example, see Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 In recent years, among bone marrow cells, younger CD34-positive cells are concentrated and transplanted (see, for example, Non-Patent Document 5), or granulocyte growth factor (G-CSF) is used during peripheral blood mononuclear cell transplantation. A method of using them together (for example, see Non-Patent Document 6) has also been tried. However, in this method, results that still exceed the effectiveness of the original method have not been obtained.
  • G-CSF granulocyte growth factor
  • vascular proliferative cytokines for example, bFGF
  • a vascular proliferative cytokine is supported on a carrier such as gelatin hydrogel (for example, see Non-Patent Document 7) or gelatin microsphere (for example, see Non-Patent Document 8), and the carrier is administered to a living body. ing.
  • Patent Document 1 In recent years, there has been an attempt to induce angiogenesis by immobilizing cells on an artificial carrier and embedding the carrier in a living body (see, for example, Patent Document 1).
  • the above-mentioned conventional angiogenesis therapy has a problem that not only can blood vessels be sufficiently born, but also the invasiveness to the patient's body is high.
  • the conventional angiogenesis therapy by cell transplantation it is known that 70% to 80% of the transplanted cells begin to circulate within the body within 48 hours after transplantation, and few transplanted cells remain locally. . That is, the above-mentioned angiogenesis therapy has a problem that the transplanted cells cannot be effectively kept locally, and as a result, the blood vessels cannot be regenerated sufficiently.
  • Non-Patent Document 4 it is known that the above-described conventional angiogenesis therapy by cell transplantation can enhance the therapeutic effect to some extent by increasing the number of cells to be transplanted.
  • Non-Patent Document 4 it is necessary to use cells derived from the patient's own body as transplanted cells, but patients suffering from peripheral arterial disease and the like often have deteriorated general health. Therefore, there is a problem that if a large amount of cells are collected from a patient, the burden on the patient's body increases, in other words, the invasiveness to the patient's body increases.
  • angiogenesis therapy using an angiogenic cytokine
  • biological materials such as gelatin have excellent biological activity, but on the other hand, the influence of chemical cross-linking agents, antigenicity of biological materials, and viruses And have many problems such as prion infection. That is, the angiogenesis therapy has a problem that it is highly invasive to the patient's body after the carrier is transplanted to the patient's body.
  • Patent Document 1 has a problem in that the carrier after being embedded in the living body is not decomposed in the living body, and thus the carrier causes side effects.
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and its purpose is a medical application that has a high effect of angiogenesis, has low invasiveness to a patient's body, and is easy to administer to a living body. It is to provide a composition and a medical kit.
  • the present inventors have been able to keep cells alive for a long time locally in a patient's body by adhering the cells on a carrier coated with hydroxyapatite. As a result, it was found that angiogenesis can be effectively induced even with a small number of transplanted cells, and the present invention has been completed.
  • the medical composition of the present invention includes a support made of a bioabsorbable polymer, and a particulate carrier having a surface layer made of hydroxyapatite provided on the support. And cells provided on the surface of the carrier.
  • the particle diameter of the carrier is preferably 10 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the carrier is preferably porous.
  • the bioabsorbable polymer includes polylactic acid, polyglycolic acid, polyethylene glycol, propylene glycol, polyhydroxybutyrate, polycarbonate, polyamide, cellulose, chitin, chitosan, starch, polyglutamic acid, It is preferably at least one selected from the group consisting of polydioxanone, cyanoacrylate polymer, polycaprolactone, synthetic polypeptide, hyaluronic acid, polymalic acid, polybutylene succinate, and combinations thereof.
  • a synthetic polymer can be used as the bioabsorbable polymer.
  • the cells include bone marrow mononuclear cells, peripheral blood mononuclear cells, pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, vascular endothelial progenitor cells, iPS cells, ES cells, platelets, and mesenchymal stem cells. It is preferably at least one cell selected from the group consisting of
  • an angiogenic cytokine is provided on the surface of the carrier.
  • the angiogenic cytokine is aFGF, bFGF, VEGF, HGF, PDGF, PIGF, TNF, EGF, angiopoietin, IL, HAPO, Shh, TGF- ⁇ , G-CSF, M-CSF.
  • the cytokine is at least one cytokine selected from the group consisting of SCF, EPO, TPO, and Flt.
  • the medical kit of the present invention is characterized by including the medical composition and a syringe for administering the medical composition to a living body.
  • the method for producing a medical composition of the present invention is a particulate carrier having a support made of a bioabsorbable polymer and a surface layer made of hydroxyapatite provided on the support. And a step of mixing cells with cells.
  • the step it is preferable to mix 1 ⁇ 10 10 or less of the cells per carrier particle.
  • the medical composition of the present invention includes a support made of a bioabsorbable polymer, a particulate carrier having a surface layer made of hydroxyapatite provided on the support, and a surface of the carrier. And the cells provided in the above. Moreover, the medical composition of this invention can also contain cytokine as needed.
  • the medical kit of the present invention comprises the medical composition and a syringe for administering the medical composition to a living body.
  • the medical composition of the present invention comprises a support made of a bioabsorbable polymer, and a particulate carrier and a cell having a surface layer made of hydroxyapatite provided on the support. It is a method including the process of mixing.
  • the medical composition can remain locally in the living body, a blood vessel can be effectively born at a target location.
  • the cells are provided on the surface of the carrier, there is an effect that blood vessels can be effectively regenerated with a small number of cells.
  • the carrier is mainly formed of a bioabsorbable polymer and hydroxyapatite
  • the medical composition after inducing angiogenesis can be decomposed and absorbed.
  • the burden on the living body can be reduced.
  • the decomposition and absorption rate of the medical composition can be adjusted by changing the composition and form of the support.
  • constituents of the medical composition of the present invention have low toxicity to the living body, there is an effect that side effects (for example, inflammation) can be prevented from occurring when administered to the living body.
  • animal-derived proteins such as collagen and gelatin are not used, there is an effect that high biological safety can be ensured.
  • a particulate carrier since a particulate carrier is used, it can be administered into a living body by a syringe. As a result, the medical composition can be administered by a method with less burden on the patient's body, and the medical composition can be easily administered locally.
  • the medical composition can be easily administered by the patient himself / herself, even if the aging of society progresses, for example, it is possible to easily relieve a patient suffering from floor rubbing or the like. Play. This also has the effect of preventing the patient's QOL (Quality Of Life) from being lowered and reducing medical costs.
  • QOL Quality Of Life
  • (A) is a photomicrograph of bone marrow cells provided on polylactic acid particles
  • (b) is a photomicrograph of bone marrow cells provided on hydroxyapatite / polylactic acid particles
  • (c) It is a microscope picture of the bone marrow cell equipped on the polylactic acid film
  • (d) is a microscope picture of the bone marrow cell equipped on the hydroxyapatite / polylactic acid film
  • (A) is a photomicrograph of the polylactic acid membrane / L929 cell complex before trypsin treatment
  • (b) is a photomicrograph of the polylactic acid membrane / L929 cell complex after trypsin treatment.
  • (C) is a photomicrograph of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / L929 cell complex before trypsin treatment, and (d) is the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / L929 cell complex after trypsin treatment. It is a micrograph.
  • (A) is a schematic view showing a state of transplanting a membrane-like hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex
  • (b) is a diagram of a particulate hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex. It is a schematic diagram which shows a mode that intramuscular injection is carried out.
  • (A) to (c) are photomicrographs of the administration site of hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex. It is a microscope picture of the administration location of a hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex.
  • (C) and (d) are photomicrographs of the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex, and (a) and (b) are the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex. It is a micrograph.
  • (A) is a photograph showing the state of the lower limb of the mouse after administration of various complexes based on the particulate scaffold, and
  • (b) is a graph analyzing the survival rate of the mouse according to the Kaplan-Meier method. It is a schematic diagram which shows an example of peripheral arterial disease treatment using the medical composition of this invention.
  • the medical composition of the present embodiment includes a support and a carrier having a surface layer provided on the support, and cells provided on the surface of the carrier.
  • a support and a carrier having a surface layer provided on the support, and cells provided on the surface of the carrier.
  • each configuration will be described in detail.
  • the medical composition of the present embodiment can be used particularly as a composition for angiogenesis.
  • the support is made of a bioabsorbable polymer.
  • Bioabsorbable polymer has low toxicity in vivo and gradually decomposes and absorbs in vivo. Therefore, if the support is formed of a bioabsorbable polymer, the medical composition of the present embodiment can be maintained at a desired position in the body until the angiogenesis is sufficiently induced, and the angiogenesis can be sufficiently performed. After the induction, it is possible to quickly decompose and absorb the medical biomedical composition of the present embodiment. Moreover, since the toxicity with respect to a biological body is low if it is the said structure, generation
  • the bioabsorbable polymer constituting the support is not particularly limited, but polylactic acid, polyglycolic acid, polyethylene glycol, propylene glycol, polyhydroxybutyrate, polycarbonate, polyamide, cellulose, chitin, chitosan, starch, polyglutamic acid , Polydioxanone, cyanoacrylate polymer, polycaprolactone, synthetic polypeptide, hyaluronic acid, polymalic acid, butylene polysuccinate, and at least one selected from the group consisting of combinations thereof.
  • polylactic acid it is preferable to use polylactic acid.
  • bioabsorbable polymer used together with polylactic acid Although it does not specifically limit as a bioabsorbable polymer used together with polylactic acid, for example, one bioabsorbable polymer other than the polylactic acid mentioned above may be used together, and multiple may be used together. When a bioabsorbable polymer other than polylactic acid is used in combination with polylactic acid, a support excellent in biodegradability can be formed, and the degradation rate of polylactic acid can also be adjusted.
  • bioabsorbable polymer used in combination with polylactic acid for example, polyglycolic acid, polycaprolactone or polyethylene glycol, and a copolymer comprising these combinations are most preferable. If it is the said structure, the decomposition
  • the content of the substance other than polylactic acid in the raw material constituting the support is not particularly limited.
  • polyglycolic acid it is preferably 0% by weight to 100% by weight in the raw material. More preferably, it is 80% by weight.
  • the content is preferably 0% by weight to 100% by weight, more preferably 20% by weight to 80% by weight in the above raw material. If it is the said structure, the lifetime in the body of the medical composition of this Embodiment can be adjusted to desired time.
  • the shape of the bioabsorbable polymer forming the support in other words, the shape of the bioabsorbable polymer in the support is not particularly limited, and a desired shape can be appropriately taken.
  • the bioabsorbable polymer is preferably in the form of particles, fibers, films, or nonwoven fabrics.
  • nonwoven fabric refers to cloth-like fibers formed without going through a weaving process. Among these shapes, a nonwoven fabric is most preferable. According to the said structure, since the surface area of a support body can be increased, many cells can be adhere
  • the contact area between the support and the living body (for example, various enzymes in body fluids) can be increased.
  • the medical composition after exhibiting the angiogenic action can be rapidly decomposed and absorbed.
  • the shape of the support is not particularly limited, and can take a desired shape as appropriate.
  • As the shape of the support for example, a spherical shape, a film shape, or a flat shape is preferable, and a spherical shape is most preferable.
  • the support may be a non-porous one, but is preferably porous (sponge-like).
  • the carrier described later can also be formed to be porous. If the support is formed to be porous, the surface area of the support can be increased, so that many cells can be adhered on the support. As a result, angiogenesis can be induced more effectively.
  • the medical composition of the present embodiment when the medical composition of the present embodiment is administered into the body, the contact area between the carrier and the living body (for example, various enzymes in body fluids) can be increased, so that after angiogenesis is exerted The medical composition can be quickly decomposed and absorbed.
  • the size (diameter of the cross section) of the support is not particularly limited, but when a carrier is formed by forming a surface layer to be described later, the particle diameter of the carrier is preferably 0.01 ⁇ m to 5 cm, more preferably 1 ⁇ m. It may be formed to be ⁇ 1 mm, most preferably 10 ⁇ m to 200 ⁇ m. That is, the size of the support is determined in relation to the thickness of the surface layer described later. In addition, if the said particle diameter is 1 mm or less, it can administer to a biological body easily with a syringe. In addition, a substance having a particle diameter larger than 1 mm can be administered to a living body by incision transplantation.
  • a surface layer made of hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) is provided on the above-described support.
  • carrier which is the object which equips the cell mentioned later mainly with the said surface layer and the said support body is formed.
  • the location where the surface layer is provided on the support is not particularly limited, and may be provided so as to cover a part of the support surface, or may be provided so as to cover the entire support surface.
  • the thickness of the surface layer is not particularly limited. As described above, the thickness of the surface layer may be adjusted so that the particle diameter of the carrier is preferably 0.01 ⁇ m to 5 cm, more preferably 1 ⁇ m to 1 mm, and most preferably 10 ⁇ m to 200 ⁇ m. That is, the thickness of the surface layer is determined in relation to the size of the support described above.
  • the method for forming the surface layer is not particularly limited. For example, first, nano-sized hydroxyapatite particles, in other words, hydroxyapatite nanocrystals are formed, and then the support is coated with the hydroxyapatite nanoparticles. It is preferable to do.
  • the crystals (particles) may be an unfired body (amorphous) or a fired body.
  • the size of the hydroxyapatite particles that coat the support is not particularly limited.
  • hydroxyapatite particles having a particle diameter in the range of 10 nm to 700 nm, more preferably 20 nm to 600 nm, and most preferably 25 nm to 500 nm are used. It is preferable.
  • the method for forming the surface layer is not particularly limited, but preferably includes at least a “primary particle generation step”, a “sintering step”, and a “surface layer formation step”.
  • a “removal step” and a “mixing step” may be included.
  • a manufacturing method including all of the above five steps will be described as an example of a method for forming a surface layer, but is not limited thereto.
  • primary particles mean particles formed of hydroxyapatite (HAp) before the sintering step. That is, it means a particle formed for the first time in the production process of hydroxyapatite particles. In a narrow sense, it means single crystal particles. In the present specification, the “primary particles” include those in an amorphous state and those in a sintered body after sintering.
  • a “secondary particle” is a state in which a plurality of “primary particles” are bonded together by physical bonds (for example, fusion) or chemical bonds (for example, ionic bonds or covalent bonds). Means particles. At this time, the number of primary particles that are bonded together, the shape after bonding, and the like are not particularly limited.
  • the “single crystal primary particles” mean primary particles made of hydroxyapatite single crystals, or particle clusters in which the primary particles made of the single crystals are aggregated by ionic interaction.
  • the “particle aggregate aggregated by ionic interaction” is a particle aggregate that self-assembles by ionic interaction when dispersed in a medium containing water or an organic solvent. It does not contain secondary particles that are melted and polycrystallized.
  • the primary particle generation step is not particularly limited as long as it is a step capable of generating the primary particles.
  • alkaline pH e.g., pH 12.0
  • Ca (NO 3) 2 solution prepared to alkaline pH (e.g., 12.0) were prepared in the (NH 4) 2 HPO 4 aqueous solution, a high temperature What is necessary is just to add gradually (for example, 80 degreeC).
  • the state of the primary particles generated by the primary particle generation step (for example, particle size and particle size distribution) is directly reflected in the state of the hydroxyapatite particles (particle size and particle size distribution). Therefore, if an attempt is made to produce hydroxyapatite particles having a fine particle size (nanosize) and a uniform particle size (narrow particle size distribution), the particle size is fine (nanosize) in the primary particle production step. It is preferable to generate primary particles having a uniform diameter (narrow particle size distribution).
  • the particle diameter of the primary particles is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 500 nm, more preferably 20 nm to 450 nm, and most preferably 25 nm to 400 nm.
  • the coefficient of variation of the particle diameter of the primary particle group composed of primary particles is preferably 20% or less, more preferably 18% or less, and most preferably 15% or less.
  • the particle diameter and coefficient of variation of the primary particles may be calculated based on the measurement results obtained by measuring the particle diameter of at least 100 primary particles using a dynamic light scattering method or an electron microscope. By generating the primary particle group as described above, it is possible to form a surface layer with good cell adhesion efficiency described later.
  • the “variation coefficient” is a value indicating the variation in particle diameter between particles that can be calculated by standard deviation ⁇ average particle diameter ⁇ 100 (%).
  • a method for producing primary particles having the above-mentioned fine (nano-size) and uniform particle size (narrow particle size distribution) is not particularly limited, but for example, in JP-A-2002-137910
  • the described method can be used. That is, primary particles can be synthesized by solubilizing and mixing a calcium solution and a phosphoric acid solution in a surfactant / water / oil emulsion phase and reacting them at or above the cloud point of the surfactant. At this time, the size of the primary particles can be controlled by changing the functional group of the surfactant and the ratio of the hydrophilic / hydrophobic ratio.
  • thermodynamic stability of the micelle can be controlled by setting the reaction temperature to be higher than the cloud point of the surfactant. That is, by raising the reaction temperature above the cloud point of the surfactant, the ability of the surfactant to form micelles can be lowered.
  • the driving force for crystal growth of hydroxyapatite which has been restricted within the frame of micelles, becomes greater than the driving force for maintaining the frame of micelles.
  • crystallization can be controlled using the mechanism.
  • the functional group (hydrophilic site) of the surfactant and the hydrophilic / hydrophobic ratio of the surfactant are important. If they are different, the stability of the micelles, and Cloud point is also different.
  • the cloud point of the surfactant varies depending on the type of the surfactant. Therefore, it is possible to change the stability of the micelle and the cloud point by appropriately changing the type of the surfactant, and thereby the size of the hydroxyapatite fine particles can be controlled.
  • the type of surfactant used in the above method is not particularly limited.
  • the known anionic surfactant, cationic surfactant, and zwitterionic surfactant disclosed in JP-A-5-17111 An agent or a nonionic surfactant can be used.
  • nonionic surfactant polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene allyl ether, polyoxyethylene alkyl allyl ether, polyoxyethylene derivative, oxyethylene / oxypropylene block copolymer, sorbitan fatty acid ester Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene alkylamine and the like are preferably used.
  • quaternary ammonium salts such as stearylamine hydrochloride, lariultrimethylammonium chloride, and alkylbenzenedimethylammonium chloride.
  • anionic surfactants include higher alcohol sulfates such as sodium lauryl alcohol sulfate and sodium oleyl alcohol sulfate, alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate and ammonium lauryl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, and dodecylnaphthalene. It is preferable to use alkylaryl sulfonates such as sodium sulfonate.
  • amphoteric surfactant it is preferable to use an alkylbetaine type, alkylamide betaine type, or amine oxide type amphoteric surfactant.
  • the above surfactants can be used alone or in combination of two or more. Among these, it is most preferable to use pentaethylene glycol dodecyl ether from the viewpoint of cloud point and solubility.
  • oil phase examples include hydrocarbons such as toluene, xylene, hexane, dodecane, and cyclohexane, halogenated hydrocarbons such as chlorobenzene and chloroform, ethers such as diethyl ether, and butanol.
  • hydrocarbons such as toluene, xylene, hexane, dodecane, and cyclohexane
  • halogenated hydrocarbons such as chlorobenzene and chloroform
  • ethers such as diethyl ether
  • butanol examples include alcohols, ketones such as methyl isobutyl ketone and cyclohexanone.
  • These oil phases may be selected from one or two types so as to reduce the solubility of water and dissolve any of the above surfactants according to the surfactant to be used. From the viewpoint of water solubility and surfactant solubility, it is most preferable to use dodecane as the oil phase.
  • the reaction temperature, reaction time, addition amount of the raw material, and the like may be adopted after selecting optimal conditions according to the composition of the primary particles.
  • the upper limit of the reaction temperature is a reaction of an aqueous solution, it is preferably a temperature at which the solution does not boil, specifically 90 ° C. or less.
  • this step may include a step of washing the generated primary particles with water or the like, and a step of collecting the primary particles by centrifugation, filtration, or the like.
  • the mixing step is a step of mixing the primary particles and the anti-fusing agent. That is, a step for preventing fusion of primary particles in the subsequent sintering step by interposing an anti-fusing agent in advance between the particles of the primary particle group obtained by the primary particle generation step. It is.
  • the mixture of primary particles and anti-fusing agent obtained by the mixing step will be referred to as “mixed particles”.
  • the anti-fusing agent is not particularly limited as long as it can prevent fusion between primary particles, but it is preferable that it does not volatilize even at the sintering temperature in the subsequent sintering step. . If it is non-volatile under the sintering temperature condition, it will not disappear from the primary particles during the sintering process, and the fusion of the primary particles can be reliably prevented. However, it is not necessary to have 100% non-volatility at the sintering temperature, as long as it has non-volatility to the extent that 10% or more remains between the primary particles after the sintering process.
  • the anti-fusing agent may be chemically decomposed by heat after the sintering process is completed. That is, it is sufficient if it remains after the end of the sintering process, and it is not necessary to be the same substance (compound) before and after the start of the sintering process.
  • the anti-fusing agent is a substance that is soluble in a solvent, particularly an aqueous solvent. If an anti-fusing agent that dissolves in a solvent is used, the anti-fusing agent (for example, calcium carbonate) can be removed simply by suspending the mixed particles containing the anti-fusing agent in an aqueous solvent such as pure water. Can do. In particular, if the anti-fusing agent is soluble in an aqueous solvent, it is not necessary to use an organic solvent to remove the anti-fusing agent. It becomes. Therefore, the anti-fusing agent can be removed from the mixed particles more easily. In addition, although it does not specifically limit as said solvent, For example, water, ethanol, methanol etc. are mentioned as an aqueous solvent, Acetone, toluene etc. are mentioned as an organic solvent.
  • the aqueous solvent preferably contains a chelate compound such as oxalate, ethylenediamine, bipyridine, and ethylenediaminetetraacetate in order to increase the solubility of the anti-fusing agent in water. Further, the aqueous solvent preferably contains electrolyte ions such as sodium chloride, ammonium nitrate and potassium carbonate in order to increase the solubility of the anti-fusing agent in water.
  • the solubility of the anti-fusing agent is preferably 0.01 g or more, more preferably 1 g or more, and most preferably 10 g or more. .
  • the anti-fusing agent are not particularly limited.
  • calcium salts such as calcium chloride, calcium oxide, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium carbonate, calcium hydroxide, calcium acetate, and calcium citrate.
  • the method of mixing the primary particles and the anti-fusing agent in the mixing step is not particularly limited.
  • the primary particles may be dispersed in the anti-fusing agent solution.
  • the latter is the preferred method for interposing the anti-fusing agent between the primary particles uniformly and reliably.
  • the sintering step is a step in which the mixed particles obtained in the mixing step are exposed to a sintering temperature to convert the mixed particles contained in the mixed particles into ceramic particles (sintered particles). At this time, since the anti-fusing agent is interposed between the mixed particles, it is possible to prevent the hydroxyapatite primary particles from fusing even when exposed to high temperature conditions in the sintering process.
  • the sintering temperature in the sintering step is not particularly limited as long as it is appropriately set so that the hardness of the ceramic particles becomes a desired hardness.
  • the sintering temperature is preferably 100 ° C. to 1800 ° C., more preferably 150 ° C. to 1500 ° C., and most preferably 200 ° C. to 1200 ° C.
  • the sintering time may be appropriately set based on the desired ceramic particle hardness and the like.
  • the apparatus etc. which are used for the said sintering process are not specifically limited, A commercial baking furnace can be used suitably.
  • a removal process is a process of removing the anti-fusing agent mixed between particles of the sintered body particles obtained by the sintering process.
  • the specific removal means and method may be appropriately selected according to the anti-fusing agent employed in the mixing step, and is not particularly limited.
  • a solvent that does not dissolve hydroxyapatite particles (non-soluble) and that dissolves the anti-fusing agent (soluble) is used.
  • soluble hydroxyapatite particles
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it satisfies the above requirements, and may be an aqueous solvent or an organic solvent.
  • the removal process eliminates the need for facilities necessary for using organic solvents, eliminates the need for facilities for treating organic solvent waste, high safety in manufacturing operations, and low risk to the environment.
  • the solvent used is preferably an aqueous solvent.
  • aqueous solvent it is preferable to use water, ethanol, methanol or the like as the aqueous solvent.
  • an organic solvent it is preferable to use acetone or toluene.
  • the aqueous solvent preferably contains a chelate compound such as oxalate, ethylenediamine, bipyridine, and ethylenediaminetetraacetate in order to increase the solubility of the anti-fusing agent. Further, the aqueous solvent preferably contains electrolyte ions such as sodium chloride, ammonium nitrate and potassium carbonate in order to increase the solubility of the anti-fusing agent.
  • a chelate compound such as oxalate, ethylenediamine, bipyridine, and ethylenediaminetetraacetate in order to increase the solubility of the anti-fusing agent.
  • electrolyte ions such as sodium chloride, ammonium nitrate and potassium carbonate in order to increase the solubility of the anti-fusing agent.
  • the removal step is preferably performed under the condition of pH 4.0 to pH 12.0.
  • the hydroxyapatite particles are filtered or centrifuged. Only need to be recovered.
  • the removal step is not limited to once, and may be performed twice or more. By performing the removal step a plurality of times, the removal rate of the anti-fusing agent between the hydroxyapatite particles is further improved.
  • the anti-fusing agent can be removed using a magnet by using a magnetic material as the anti-fusing agent. More specifically, after suspending and dispersing the sintered body particle group containing the anti-fusing agent obtained by the sintering step in an appropriate solvent (water or the like), a magnetic force is applied to the suspension, Only the anti-fusing agent may be adsorbed to the magnet, and only the hydroxyapatite particles that have not been adsorbed may be recovered. Alternatively, the sintered particles can be ground to powder without being suspended in a solvent, and then the anti-fusing agent can be separated by a magnet.
  • the removing step further includes a classification step for making the hydroxyapatite particle size uniform.
  • the classification step is not particularly limited as long as the particle size of the hydroxyapatite particles can be made uniform.
  • classification can be performed by filter filtration, centrifugation, or the like, but is not limited to these methods.
  • hydroxyapatite particles for coating the support surface can be produced.
  • the surface layer forming step is a step of forming a surface layer on the support by coating the support with the hydroxyapatite particles obtained by the series of steps described above.
  • the surface layer forming step is a step of forming a carrier having a support and a surface layer.
  • the surface layer forming step is not particularly limited as long as the surface layer is formed on the support and a support composed of the support and the surface layer can be formed.
  • the support may be dispersed in the solution.
  • the solvent is not particularly limited, and for example, an aqueous solvent or an organic solvent can be used. More specifically, water, ethanol, methanol, or the like is preferably used as the aqueous solvent, and acetone, toluene, or the like is preferably used as the organic solvent.
  • the solvent containing the hydroxyapatite particles and the support is preferably subjected to ultrasonic treatment.
  • ultrasonic treatment By performing ultrasonic treatment, it is possible to form a surface layer having a more uniform thickness over the entire surface of the support.
  • the specific conditions for the ultrasonic treatment are not particularly limited.
  • a commercially available apparatus can be used as appropriate as an apparatus for applying ultrasonic waves.
  • the surface layer forming step preferably includes a step of separating and washing the support (carrier) coated with the hydroxyapatite particles after the ultrasonic treatment and then drying the carrier.
  • the step of separating the carrier is not particularly limited, but it is preferable to separate the carrier by, for example, centrifugation or filter filtration.
  • the carrier can be washed with a solvent.
  • a solvent it does not specifically limit as said solvent,
  • the carrier after being washed is preferably dried. It does not specifically limit as a drying method, For example, it is also possible to dry at room temperature, and it is also possible to dry by applying desired temperature.
  • the carrier formed as described above is formed into particles.
  • “particulate” is intended to mean fine particles having a size and shape that can be administered by a syringe.
  • the shape of the particles is not particularly limited, but is preferably spherical, rod-shaped, needle-shaped, scale-shaped, cloth-shaped, sheet-shaped, or a combination of these shapes.
  • the particle diameter of the carrier is preferably 0.01 ⁇ m to 5 cm, more preferably 1 ⁇ m to 1 mm.
  • the medical composition of the present embodiment tends to easily enter into the capillary blood vessels, and when the size of the carrier is larger than 200 ⁇ m, the medical composition is It tends to aggregate, in other words, it tends to clog the injection needle when administered to a living body by a syringe. Therefore, the particle diameter of the carrier is most preferably 10 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the said particle diameter is 1 mm or less, it can administer to a biological body easily with a syringe.
  • a substance having a particle diameter larger than 1 mm can be administered to a living body by incision transplantation.
  • the particle size of the carrier can be measured by a known method.
  • the measurement can be performed in the same manner as in the case of the primary particles described above using a dynamic light scattering method or an electron microscope.
  • cells are provided on the carrier formed as described above.
  • the cell is not particularly limited as long as it can induce angiogenesis.
  • the cells are selected from the group consisting of bone marrow mononuclear cells, peripheral blood mononuclear cells, pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, vascular endothelial progenitor cells, iPS cells, ES cells, platelets, and mesenchymal stem cells. It is preferred to use at least one cell.
  • bone marrow mononuclear cells, peripheral blood mononuclear cells, pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, and vascular endothelial progenitor cells are cells that have already been shown to be effective in angiogenesis therapy in humans or animals. preferable.
  • iPS cells and ES cells are more preferable because they do not place a burden on the patient from the viewpoint of the cell source.
  • the method for providing the cells on the surface of the carrier is not particularly limited.
  • the interaction is not particularly limited.
  • the cell may be immobilized on a carrier with a cross-linking agent, or the cell may be adhered on the carrier due to the adhesion ability of the cell, or depending on the adsorption ability of hydroxyapatite.
  • Cells may be adsorbed on a carrier.
  • the cells may be immobilized on a carrier by a plurality of the above interactions.
  • it does not specifically limit as said crosslinking agent It is possible to use a well-known crosslinking agent suitably.
  • the cells provided on the surface of the carrier may be provided directly on the surface of the carrier, or may be provided indirectly on the surface of the carrier via another cell. That is, it is possible to provide the entire cell mass on the surface of the carrier by immobilizing some cells in the cell mass composed of a plurality of cells on the carrier. When a porous carrier is used, it is possible to provide cells in the pores.
  • the specific method for immobilizing the cells on the carrier is not particularly limited.
  • the carrier and the cells are preferably mixed, and the cells are more preferably cultured on the carrier for a predetermined time.
  • the culture time for culturing is not particularly limited, but for example, it is preferable to culture for 0.1 to 24 hours. If it is the said culture
  • the ratio between the carrier and the cells provided on the carrier is not particularly limited.
  • the weight ratio between the carrier and the cells is preferably 1/10 to 10/1. If the weight ratio is 1/10 or more, a sufficient amount of cells are provided on the carrier, so that blood vessels can be regenerated effectively. Further, if the weight ratio is 10/1 or less, not only can blood vessels be effectively born, but also reliably prevent side effects (for example, inflammation) that can be caused to the living body by hydroxyapatite and the like. Can do.
  • various physiologically active substances are provided on the surface of the carrier in addition to the cells.
  • the physiologically active substance is not particularly limited, but is preferably at least one physiologically active substance selected from the group consisting of anti-inflammatory agents, angiogenic cytokines, antibiotics and cell growth factors.
  • an angiogenic cytokine is provided on a carrier, angiogenesis can be induced more effectively.
  • an anti-inflammatory agent is provided on a carrier, it is possible to prevent inflammation from occurring even when a large amount of the medical composition is administered in vivo.
  • an antibiotic is provided on the carrier, various secondary infections can be prevented.
  • a cell growth factor is provided on a carrier, not only angiogenesis but also various cells (various tissues) can be regenerated as needed.
  • the angiogenic cytokine is not particularly limited.
  • aFGF acidic? Brobroblast? Growth? Factor
  • bFGF basic? Fibroblast? Growth? Factor
  • VEGF vascular? Endothelial? Growth? Factor
  • HGF hepatocyte? Growth?
  • PDGF platelet- derived growth factor
  • PIGF platelet-induced growth factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • EGF epidermal growth factor
  • angiopoietin IL (interleukin)
  • HAPO hemangiopoietin
  • Shh sonic hedgehog
  • TGF- ⁇ transforming growth factor-beta
  • G-CSF granulocyte-colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage-colony stimulating factor
  • SCF stem cell factor
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • Flt Flt (FMS) -like tyrosine kinase ligand) less selected from the group consisting of Both are preferably one cytokine.
  • carrier it becomes possible to induce angiogenesis more effectively.
  • the method for providing the physiologically active substance on the carrier surface is not particularly limited.
  • the interaction is not particularly limited.
  • the physiologically active substance may be immobilized on the carrier with a cross-linking agent, or the physiologically active substance may be adsorbed on the carrier by the adsorption ability of hydroxyapatite.
  • the physiologically active substance may be immobilized on the carrier by a plurality of the above interactions.
  • it does not specifically limit as said crosslinking agent It is possible to use a well-known crosslinking agent suitably.
  • the medical kit of the present embodiment includes the above-described medical composition of the present invention and a syringe for administering the medical composition to a living body (for example, a patient). Note that the medical kit of the present embodiment can be used particularly as an angiogenesis kit.
  • the syringe is not particularly limited as long as it can administer the medical composition in vivo via a needle.
  • the syringe includes not only a general syringe but also a catheter, an infusion, and the like.
  • the medical kit of the present embodiment can be added to the medical kit of the present embodiment as necessary.
  • it does not specifically limit as the said structure,
  • it is preferable that it is at least 1 structure selected from the group which consists of an injection needle, a disinfectant, an oil and a knife. If it is a medical kit which also contains these structures, the medical composition of this invention can be administered to a biological body more simply and safely.
  • a medical composition can be administered in a body with a syringe. That is, the medical composition can be easily administered locally by the patient himself.
  • the medical kit of the present embodiment preferably includes various liquids that can be used as an injection solution.
  • the liquid may be any liquid that can dissolve the medical composition of the present invention and has low toxicity to the living body.
  • the liquid include physiological saline, but are not limited thereto.
  • a support made of a bioabsorbable polymer, and a particulate carrier having a surface layer made of hydroxyapatite provided on the support are mixed with cells. It is a method including a process.
  • the carrier and the cell are mixed, whereby the cell is provided on the surface of the carrier.
  • the cells provided on the surface of the carrier may be provided directly on the surface of the carrier, or may be provided indirectly on the surface of the carrier via another cell.
  • the carrier and the cells may be mixed in a liquid (for example, a buffer such as a liquid medium, physiological saline, or phosphate buffer).
  • a liquid for example, a buffer such as a liquid medium, physiological saline, or phosphate buffer.
  • angiogenesis can be suitably induced, and side effects such as inflammation can be suppressed.
  • the medical composition produced by the production method of the present embodiment in other words, the medical composition of the present invention also includes a liquid in a state where the carrier and the cells are mixed in the above step. That is, the medical composition of the present invention may contain cells that are not directly attached to the carrier.
  • a configuration using a polylactic acid film and a configuration using polylactic acid particles were examined.
  • the structure using a polylactic acid film and the structure using polylactic acid particles showed the same effect on angiogenesis, but ease of administration, presence or absence of scars at the time of administration, necessity of treatment of the scars, etc. From this point of view, it can be said that the configuration using polylactic acid particles is superior. This point can be easily understood from the following specific description.
  • the resulting precipitate was collected and dried at 80 ° C. under reduced pressure (about 0.1 Pa) to obtain mixed particles.
  • the mixed particles were put in a crucible and fired at a sintering temperature of 800 ° C. for 1 hour. At this time, calcium polyacrylate is thermally decomposed into calcium oxide (CaO).
  • the residual rate of calcium oxide (CaO) after the sintering process was 25% or more.
  • the sintered body particles obtained in the sintering step were suspended in 500 mL of a 50 mmol / L ammonium nitrate (NH 4 NO 3 ) aqueous solution, and then the sintered body particles were separated and washed by centrifugation. Furthermore, after suspending the sintered body particles in distilled water, separation and washing were performed in the same manner to remove the anti-fusing agent and ammonium nitrate, and hydroxyapatite particles (hydroxyapatite nanocrystals) were recovered.
  • a 50 mmol / L ammonium nitrate NH 4 NO 3
  • the particle size of the hydroxyapatite particles was measured by a dynamic light scattering method.
  • the dynamic light scattering was measured using a dynamic light scattering photometer DLS-6000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. under the conditions of room temperature, 10 ppm particle concentration, and scattering angle of 90 °.
  • the particle diameter of the hydroxyapatite particles was distributed between 60 nm and 100 nm, and the coefficient of variation of the particle diameter at this time was as narrow as 11%. This indicates that the nanocrystal is a group of particles having a uniform particle size (narrow particle size distribution).
  • the hydroxyapatite particles produced in Example 1 were dispersed in ethanol at a concentration of 2% by weight.
  • the washed polylactic acid nonwoven fabric film is immersed in ethanol in which the hydroxyapatite particles are dispersed, and subjected to ultrasonic irradiation for 5 minutes at room temperature (ultrasonic irradiator: US-2 manufactured by ND Corporation, output: 120 W, frequency : 38 kHz). After leaving at room temperature for 30 minutes, the polylactic acid nonwoven fabric film was washed with ethanol and dried at room temperature.
  • hydroxyapatite / polylactic acid particle composite Polylactic acid particles (particle diameter 100 ⁇ m) were washed with ethanol at room temperature. Next, the hydroxyapatite particles produced in Example 1 were dispersed in ethanol at a concentration of 2% by weight.
  • the washed polylactic acid particles are immersed in ethanol in which the hydroxyapatite particles are dispersed, and subjected to ultrasonic irradiation for 5 minutes at room temperature (ultrasonic irradiator: US-2 manufactured by NN Corporation, output: 120 W, frequency: 38 kHz). After leaving at room temperature for 30 minutes, the polylactic acid particles were washed with ethanol and dried at room temperature.
  • hydroxyapatite / polylactic acid particle composite As a result of observing the produced hydroxyapatite / polylactic acid particle composite with a scanning electron microscope, it was confirmed that the surface of the polylactic acid particles was uniformly coated with hydroxyapatite nanocrystals. The coverage of the polylactic acid particle surface with hydroxyapatite particles was almost 100%.
  • the scanning electron microscope used was JSM-6301F manufactured by JEOL Ltd., and the hydroxyapatite / polylactic acid particle composite was observed at a magnification of 90,000 times.
  • Bone marrow cells were cultured for 2.5 hours on the hydroxyapatite / polylactic acid membrane composite and the hydroxyapatite / polylactic acid particle composite prepared in Examples 2 and 3.
  • a polylactic acid film or polylactic acid particles without hydroxyapatite particles were used.
  • bone marrow cells adhered on the hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex and on the hydroxyapatite / polylactic acid particle complex were fixed with phosphate buffer / glutaraldehyde, and then the hydroxyapatite / polylactic acid membrane.
  • Dehydration treatment was performed by sequentially immersing the bone marrow cell complex from a 50% aqueous ethanol solution into a 100% aqueous ethanol solution.
  • FIG. 1 (a) shows the results for polylactic acid particles
  • FIG. 1 (b) shows the results for hydroxyapatite / polylactic acid particles
  • FIG. 1C shows the result of the polylactic acid film
  • FIG. 1D shows the result of the hydroxyapatite / polylactic acid film.
  • FIG. 1 (a) and FIG. 1 (c) bone marrow cells are not observed on polylactic acid particles and polylactic acid film not having hydroxyapatite particles
  • FIG. ) and FIG. 1 (d) many granular bone marrow cells were observed on the hydroxyapatite / polylactic acid particle composite and the hydroxyapatite polylactic acid film.
  • JSM-6301F manufactured by JEOL Ltd. was used, and the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex was observed at a magnification of 300 times.
  • L929 cells were cultured for 6 days on the hydroxyapatite / polylactic acid membrane composite prepared in Example 2.
  • a polylactic acid film not coated with hydroxyapatite particles was used as a negative control.
  • each of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / L929 cell complex and the polylactic acid membrane / L929 cell complex was treated with trypsin, and then the adhesion state of the L929 cells was observed with an optical microscope. .
  • FIG. 2A shows the polylactic acid membrane / L929 cell complex before trypsin treatment
  • FIG. 2B shows the polylactic acid membrane / L929 cell complex after trypsin treatment.
  • 2 (c) shows the hydroxyapatite / polylactic acid film / L929 cell complex before trypsin treatment
  • FIG. 2 (d) shows the hydroxyapatite / polylactic acid film / L929 after trypsin treatment. The cell complex is shown.
  • L929 cells are easily detached from the polylactic acid film not covered with hydroxyapatite particles, but are covered with hydroxyapatite particles. It was revealed that L929 cells do not detach easily from the polylactic acid film. In other words, it was revealed that the cells on the nanoscaffold coated with hydroxyapatite particles show strong adhesion that does not easily peel off even after trypsin treatment.
  • Bone marrow cells were cultured for 2.5 hours on the hydroxyapatite / polylactic acid particle composite prepared in Example 3.
  • bone marrow cells adhered on the hydroxyapatite / polylactic acid particle complex are fixed with phosphate buffer / glutaraldehyde, and then the hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex is 50% ethanol aqueous solution. To 100% ethanol aqueous solution for dehydration.
  • the hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex was treated with butanol and freeze-dried, and then the hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex was observed with a scanning electron microscope.
  • a scanning electron microscope JSM-6301F manufactured by JEOL Ltd. was used, and the hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex was observed at a magnification of 300 times.
  • FIGS. 4 (a) to 4 (c) a hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex or a hydroxyapatite / polylactic acid film / bone marrow cell.
  • a number of neovascularizations were observed near the surface of the complex.
  • the region surrounded by the dotted line in FIGS. 4A and 4B is a hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex or a hydroxyapatite / polylactic acid film / bone marrow cell complex.
  • the site where the body was administered was shown, and a number of neovascularizations were observed at the site.
  • FIG. 4C is an enlarged photograph of a portion where angiogenesis occurs.
  • FIG. 5 is a photomicrograph of the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid particle composite or the hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex, and angiogenesis is observed at the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane composite. I could't.
  • FIG. 6C is a photomicrograph of the administration site of hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex, and angiogenesis was confirmed at the administration site.
  • FIG. 6 (d) is a photomicrograph focusing on the administered hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex, and white arrows indicate bone marrow cells.
  • FIG. 6A when a hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex was administered, no angiogenesis was observed in the vicinity of the complex. Further, as shown in FIG. 6 (b), when a hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex was administered, bone marrow cells could not be confirmed in the vicinity of the complex.
  • the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex and the hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex exhibit a high angiogenic action, and adhere to cells (for example, bone marrow) over a long period of time. It has become clear that cells can be kept alive.
  • the total length of blood vessels observed at the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex and the hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex was measured under a microscope.
  • the total length of blood vessels present at the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex is the length of blood vessels present at the administration site of the hydroxyapatite / polylactic acid membrane complex. It was revealed that it was about three times the total of. This also revealed that the hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex induced angiogenesis.
  • Hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex and hydroxyapatite / polylactic acid membrane / bone marrow cell complex showed almost the same effect on angiogenic effect, but ease of administration, presence or absence of scars at the time of administration, From the viewpoint of the necessity of treatment of the scar, the hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex was superior. Therefore, it was decided to examine the effects of hydroxyapatite / polylactic acid particles / bone marrow cell complex in more detail.
  • Angiogenesis enhancing action of hydroxyapatite / polylactic acid particles / bone marrow cell complex An ischemic limb was produced by a known method using a BALB / C mouse, and a hydroxyapatite / polylactic acid particle / bone marrow cell complex, a hydroxyapatite / polylactic acid particle complex, Each of the bone marrow cells alone was administered intramuscularly with a syringe. Thereafter, the prognosis of the ischemic leg was observed. Bone marrow cells were collected from BALB / C mice different from the transplanted mice.
  • mice administered with hydroxyapatite / polylactic acid particle complex or bone marrow cells alone mice with lower extremities falling and necrotic were observed.
  • recovery of lower limbs was observed in mice administered with hydroxyapatite / polylactic acid particles / bone marrow cell complex.
  • mouth according to the Kaplan-Meier method in detail is shown in (b) of FIG. FIG. 8 (b) also revealed that the lower limbs recovered in mice administered with the hydroxyapatite / polylactic acid particles / bone marrow cell complex.
  • the medical composition of the present invention can not only regenerate a blood vessel in a tissue in which the blood vessel is destroyed, but also regenerate a blood vessel in a desired tissue. Therefore, the medical composition of the present invention has peripheral arterial disease (eg, obstructive arteriosclerosis, Buerger's disease (Burger's disease), collagen disease and Raynaud's disease), or refractory ulcer (eg, floor rub, Diabetic foot , Collagen disease and ischemic ulcer, etc.) (see, for example, FIG. 9).
  • peripheral arterial disease eg, obstructive arteriosclerosis, Buerger's disease (Burger's disease), collagen disease and Raynaud's disease
  • refractory ulcer eg, floor rub, Diabetic foot , Collagen disease and ischemic ulcer, etc.
  • the medical composition and medical kit of the present invention can be used particularly as an an

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Abstract

　血管新生の効果が高いとともに、患者の体への侵襲性が低く、更に生体への投与が容易な医療用組成物および医療用キットを提供するために、生体吸収性高分子からなる支持体、および支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と、担体の表面に備えられた細胞と、を含む医療用組成物を用いる。

Description

医療用組成物および医療用キット
　本発明は、血管新生を誘導することができる医療用組成物および医療用キットに関するものである。
　近年、糖尿病患者や慢性腎不全患者の増加に伴い、その合併症である末梢動脈疾患（例えば、閉塞性動脈硬化症など）を煩う患者数も増加している。末梢動脈疾患では、例えば四肢末梢動脈の狭窄や閉塞が起こり、その結果、難治性潰瘍や壊疽が生じる。難治性潰瘍や壊疽が進行した場合、四肢を切断する必要が生じる場合もあり、このような重篤な患者数も近年増加している。
　１９９７年に浅原らにより成人ヒト末梢血中から血管内皮前駆細胞が分離同定された（例えば、非特許文献１参照）。その後、骨髄中に存在する多能性幹細胞または血管内皮前駆細胞が、各組織における正常な血管新生および病的な血管新生（血管発生）に関与することが明らかになった（例えば、非特許文献２参照）。
　当該知見に基づき、骨髄または末梢血より分離した多能性幹細胞などを虚血下肢または虚血心筋に直接移植して血管新生を誘導し、これによって、正常な血流を再生しようとする試みがなされている（細胞移植による血管新生療法）。
　例えば、ヒトの下肢虚血に対する自家骨髄単核細胞移植は、２０００年末から世界に先駆けて我が国で行われており、現在では日本全国の十数箇所の施設において行われている（例えば、非特許文献３参照）。具体的には、大阪市立大学においては２００２年から現在に至るまでに慢性重症下肢虚血患者に対して、自家骨髄単核細胞移植を１１例（うち、透析患者３例）行うとともに、末梢血単核細胞移植を１１例（うち、透析患者２例）行っている。なお、上記自家骨髄単核細胞移植の有効率は、全体では６２．５％であり、透析患者では３３．３％であった（例えば、非特許文献４参照）。
　近年では、骨髄細胞の中でも、より幼若なＣＤ３４陽性細胞を濃縮して移植する方法（例えば、非特許文献５参照）や、末梢血単核細胞移植時に顆粒球増殖因子（Ｇ－ＣＳＦ）を併用する方法（例えば、非特許文献６参照）なども試みられている。しかしながら、当該方法においては、未だに元の方法の有効性を超えるような結果は得られていない。
　また、血管増殖性サイトカイン（例えば、ｂＦＧＦなど）を、潰瘍治療や血管新生療法に用いる試みもなされている。具体的には、血管増殖性サイトカインをゼラチンハイドロゲル（例えば、非特許文献７参照）またはゼラチンマイクロスフェア（例えば、非特許文献８参照）などの担体に担持させて、当該担体を生体に投与している。
　また、近年においては、人工的な担体に細胞を固定化させて、当該担体を生体内に埋設することによって血管新生を誘導しようとする試みもある（例えば、特許文献１参照）。
日本国公開特許公報「特開２００４－５１９５２号（２００４年２月１９日公開）」
Science, 275：964-967, 1997 Curr. Opin. Mol. Ther., 4:395-402, 2002 Lancet, 360:427-435, 2002 日本透析医学会雑誌, 37:1493-1501, 2004 Hypertension, 46:7-18, 2005 J. Cardiovasc Pharmacol Ther., 12:89-97, 2007 J. Biomater. Sci., Polym. Eds., 2005, 16, 893-902 J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2002, 124:50-56 Circulation, 109:1543-1549, 2004
　しかしながら、上記従来の血管新生療法では、十分に血管を新生させることができないばかりか、患者の体への侵襲性が高いという問題点を有している。
　近年の細胞移植による血管新生療法では、移植された細胞のうち、新生された血管の構造内に取り込まれるものは１０％弱と僅かであることが明らかになっている。そして、その他の大部分の移植細胞が複数のサイトカインを局所的に分泌することこそが、血管新生にとって重要であると考えられるようになっている（例えば、非特許文献９参照）。
　しかしながら、上記従来の細胞移植による血管新生療法では、移植された細胞のうち７０％～８０％が移植後４８時間以内に体内を循環し始め、局所に留まる移植細胞が少ないことが知られている。つまり、上記血管新生療法では、効果的に移植細胞を局所に留まらせることができないので、その結果、十分に血管を新生させることができないという問題点を有している。
　また、上記従来の細胞移植による血管新生療法では、移植する細胞数を増加させれば、ある程度は治療効果を増強することができることが知られている（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、移植細胞は患者自身の体に由来する細胞を用いる必要があるが、末梢動脈疾患などを患っている患者は全身の健康状態が悪化している場合が多い。したがって、患者から大量の細胞を採取しようとすれば、患者の体への負担が大きくなる、換言すれば、患者の体への侵襲性が高くなるという問題点を有している。
　また、上記従来の血管増殖性サイトカインを用いた血管新生療法では、ゼラチンなどの生物由来材料は優れた生物活性を有するものの、その反面で化学架橋剤の影響、生物由来材料の抗原性、およびウイルスやプリオンの感染などの多くの問題を有している。つまり、当該血管新生療法は、担体を患者の体に移植した後に、患者の体への侵襲性が高いという問題点を有している。
　また、上述した特許文献１に記載の方法では、生体内に埋設された後の担体が、生体内にて分解されないので、当該担体によって副作用が生じるという問題点を有している。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、血管新生の効果が高いとともに、患者の体への侵襲性が低く、更に生体への投与が容易な医療用組成物および医療用キットを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ハイドロキシアパタイトによってコーティングされた担体上に細胞を接着させることによって、患者の体内の局所に細胞を長時間生きたままで保持することが可能となり、その結果、少ない移植細胞数でも効果的に血管新生を誘導することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の医療用組成物は、上記課題を解決するために、生体吸収性高分子からなる支持体、および前記支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と、前記担体の表面に備えられた細胞と、を含むことを特徴としている。
　本発明の医療用組成物では、前記担体の粒子径は、１０μｍ～２００μｍであることが好ましい。
　本発明の医療用組成物では、前記担体は、多孔質であることが好ましい。
　本発明の医療用組成物では、前記生体吸収性高分子は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリヒドロキシブチレート、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロース、キチン、キトサン、デンプン、ポリグルタミン酸、ポリジオキサノン、シアノアクリレート重合体、ポリカプロラクトン、合成ポリペプチド、ヒアルロン酸、ポリリンゴ酸、ポリコハク酸ブチレン、およびこれらの組み合わせからなる共重合体からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。なお、生体吸収性高分子として合成高分子を用いることも可能である。
　本発明の医療用組成物では、前記細胞は、骨髄単核細胞、末梢血単核細胞、多能幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、血小板、および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞であることが好ましい。
　本発明の医療用組成物では、前記担体の表面に、血管新生サイトカインが備えられていることが好ましい。
　本発明の医療用組成物では、前記血管新生サイトカインは、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＩＧＦ、ＴＮＦ、ＥＧＦ、angiopoietin、ＩＬ、ＨＡＰＯ、Ｓｈｈ、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、およびＦｌｔからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインであることが好ましい。
　本発明の医療用キットは、上記課題を解決するために、前記医療用組成物と、前記医療用組成物を生体に投与するための注射器と、を備えることを特徴としている。
　本発明の医療用組成物の製造方法は、上記課題を解決するために、生体吸収性高分子からなる支持体、および前記支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と細胞とを混合する工程を含むことを特徴としている。
　本発明の医療用組成物の製造方法では、前記工程では、前記担体１粒子あたり１×１０１０個以下の前記細胞を混合することが好ましい。
　本発明の医療用組成物は、上述したように、生体吸収性高分子からなる支持体、および前記支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と、前記担体の表面に備えられた細胞と、を含むものである。また、本発明の医療用組成物は、必要に応じてサイトカインを含むことも可能である。
　また、本発明の医療用キットは、上述したように、前記医療用組成物と、前記医療用組成物を生体に投与するための注射器と、を備えるものである。
　また、本発明の医療用組成物は、上述したように、生体吸収性高分子からなる支持体、および前記支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と細胞とを混合する工程を含む方法である。
　本発明では、医療用組成物が生体内の局所に留まることができるので、目的の箇所に効果的に血管を新生することができる。
　また、本発明では、担体の表面に細胞が備えられているので、少ない数の細胞にて効果的に血管を新生することができるとういう効果を奏する。
　また、本発明では、担体が主として生体吸収性高分子およびハイドロキシアパタイトによって形成されているので、血管新生を誘導した後の医療用組成物を、分解・吸収することができる。つまり、血管新生を誘導した後の医療用組成物を自動的に除去することによって、生体への負担を軽減することができるという効果を奏する。更に、支持体の組成や形態を変えることによって、医療用組成物の分解・吸収速度を調節することができるという効果を奏する。
　また、本発明の医療用組成物の構成成分は生体に対して毒性が低いので、生体に投与したときに副作用（例えば、炎症など）が発生することを防止することができるという効果を奏する。
　また、本発明では、コラーゲンやゼラチンなどの動物由来タンパク質を用いないので、高い生物学的安全性を確保することができるという効果を奏する。
　また、本発明では、粒子状の担体を用いるので、注射器によって生体内に投与することができる。その結果、患者の体に対して負担が少ない方法にて医療用組成物を投与することができるとともに、当該医療用組成物を容易に局所に投与することができるという効果を奏する。
　また、本発明では、患者自身によって容易に医療用組成物を投与することができるので、社会の高齢化が進行しても、例えば床擦れ等に悩まされる患者を容易に救済することができるという効果を奏する。また、これによって、患者のＱＯＬ（Quality Of Life）の低下を防ぐことができるとともに、医療費を低減させることができるという効果を奏する。
（ａ）は、ポリ乳酸粒子上に備えられた骨髄細胞の顕微鏡写真であり、（ｂ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子上に備えられた骨髄細胞の顕微鏡写真であり、（ｃ）は、ポリ乳酸膜上に備えられた骨髄細胞の顕微鏡写真であり、（ｄ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜上に備えられた骨髄細胞の顕微鏡写真である。 （ａ）は、トリプシン処理を行う前のポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体の顕微鏡写真であり、（ｂ）は、トリプシン処理を行った後のポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体の顕微鏡写真であり、（ｃ）は、トリプシン処理を行う前のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体の顕微鏡写真であり、（ｄ）は、トリプシン処理後のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体の顕微鏡写真である。 （ａ）は、膜状のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体を移植する様子を示す模式図であり、（ｂ）は、粒子状のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体を筋肉注射する様子を示す模式図である。 （ａ）～（ｃ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体の投与箇所の顕微鏡写真である。 ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所の顕微鏡写真である。 （ｃ）および（ｄ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体の投与箇所の顕微鏡写真であり、（ａ）および（ｂ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所の顕微鏡写真である。 ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体、および、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所に観察される血管の長さの合計を示すグラフである。 （ａ）は、粒子状スキャホールドに基づく各種複合体を投与した後のマウスの下肢の様子を示す写真であり、（ｂ）は、カプランマイヤー法に従ってマウスの生存率を解析したグラフである。 本発明の医療用組成物を用いた末梢動脈疾患治療の一例を示す模式図である。
　本発明の実施の形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
　〔１．医療用組成物〕
　本実施の形態の医療用組成物は、支持体および当該支持体上に設けられた表層を有する担体と、上記担体の表面に備えられた細胞とを含むものである。以下に、各構成について詳細に説明する。なお、本実施の形態の医療用組成物は、特に、血管新生用組成物として用いることが可能である。
　　〔１－１．支持体〕
　上記支持体は、生体吸収性高分子によって形成されている。
　生体吸収性高分子は、生体内において毒性が低いとともに、生体内において徐々に分解・吸収さる。したがって、生体吸収性高分子によって支持体を形成すれば、十分に血管新生を誘導するまで本実施の形態の医療用組成物を体内の所望の位置に維持することができるとともに、十分に血管新生を誘導した後には、本実施の形態の医療生用組成物を速やかに分解・吸収させることが可能になる。また、上記構成であれば、生体に対する毒性が低いので、炎症などの副作用の発生を抑制することができる。
　上記支持体を構成する生体吸収性高分子としては特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリヒドロキシブチレート、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロース、キチン、キトサン、デンプン、ポリグルタミン酸、ポリジオキサノン、シアノアクリレート重合体、ポリカプロラクトン、合成ポリペプチド、ヒアルロン酸、ポリリンゴ酸、ポリコハク酸ブチレン、およびこれらの組み合わせからなる共重合体からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。これらの中では、ポリ乳酸を用いることが好ましい。また、ポリ乳酸とその他の生体吸収性高分子とを併用して、支持体を形成することが、更に好ましい。つまり、上記支持体は、ポリ乳酸のみによって形成されることが好ましく、ポリ乳酸とその他の生体吸収性高分子との混合物によって形成されることが更に好ましい。
　ポリ乳酸と併用する生体吸収性高分子としては特に限定されないが、例えば、上述したポリ乳酸以外の生体吸収性高分子を１つ併用してもよいし、複数併用してもよい。ポリ乳酸以外の生体吸収性高分子をポリ乳酸と併用すれば、生分解性に優れた支持体を形成することができるとともに、ポリ乳酸の分解速度をも調節することができる。
　ポリ乳酸と併用する生体吸収性高分子としては、例えば、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンまたはポリエチレングリコール、およびこれらの組み合わせからなる共重合体が最も好ましい。上記構成であれば、本実施の形態の医療用組成物の分解・吸収速度を高めることができる。そして、その結果、医療用組成物の安全性を高めることが可能になる。
　上記支持体を構成する原料中におけるポリ乳酸以外の物質の含有率は特に限定されないが、例えば、ポリグリコール酸の場合には、上記原料における０重量％～１００重量％であることが好ましく、２０重量％～８０重量％であることが更に好ましい。また、ポリエチレングリコールの場合にも、上記原料における０重量％～１００重量％であることが好ましく、２０重量％～８０重量％であることが更に好ましい。上記構成であれば、本実施の形態の医療用組成物の体内での存続時間を、所望の時間に調節することができる。
　支持体を形成する生体吸収性高分子の形状、換言すれば、支持体中の生体吸収性高分子の形状は特に限定されず、適宜所望の形状をとることが可能である。例えば、上記生体吸収性高分子の形状としては、粒子状、繊維状、膜状、または不織布であることが好ましい。なお、本明細書中において「不織布」とは、織る工程を経ずに形成された布状の繊維を意図する。これらの形状の中では、不織布であることが最も好ましい。上記構成によれば、支持体の表面積を増加させることができるので、支持体上に多くの細胞を接着させることができる。そして、その結果、より効果的に血管新生を誘導することができる。また、上記構成によれば、本実施の形態の医療用組成物を体内に投与した場合に、支持体と生体（例えば、体液中の各種酵素）との接触面積を増加させることができるので、血管新生作用を発揮した後の医療用組成物を、速やかに分解・吸収することができる。
　上記支持体の形状も特に限定されず、適宜所望の形状をとることが可能である。上記支持体の形状としては、例えば、球状、膜状、または偏平状であることが好ましく、球状であることが最も好ましい。
　また、上記支持体は、非多孔質のものを用いることも可能であるが、多孔質（スポンジ状）であることが好ましい。なお、支持体を多孔質に形成すれば、後述する担体をも多孔質に形成することができる。そして、担体を多孔質に形成すれば、担体の表面積を増加させることができるので、担体上に多くの細胞を接着させることができる。そして、その結果、より効果的に血管新生を誘導することができる。また、本実施の形態の医療用組成物を体内に投与した場合に、担体と生体（例えば、体液中の各種酵素）との接触面積を増加させることができるので、血管新生作用を発揮した後の医療用組成物を、速やかに分解・吸収することができる。
　上記支持体の大きさ（断面の直径）は特に限定されないが、後述する表層を形成して担体を形成した場合に、当該担体の粒子径が、好ましくは０．０１μｍ～５ｃｍ、より好ましくは１μｍ～１ｍｍ、最も好ましくは１０μｍ～２００μｍとなるように形成すればよい。つまり、支持体の大きさは、後述する表層の厚さとの関係において決定されることになる。なお、上記粒子径が１ｍｍ以下であれば容易に注射器にて生体に投与することができる。また上記粒子径が１ｍｍよりも大きい物に関しては、切開移植によって生体に投与することも可能である。
　　〔１－２．表層〕
　本実施の形態の医療用組成物では、上述した支持体上に、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）からなる表層が設けられている。そして、主として当該表層と上記支持体とによって、後述する細胞を備えさせる対象である担体が形成されている。
　上記支持体上の上記表層が設けられる箇所は特に限定されず、支持体表面の一部を覆うように設けられていてもよく、支持体表面の全体を覆うように設けられていてもよい。
　また、上記表層の厚さとしても特に限定されない。先に説明したように、担体の粒子径が、好ましくは０．０１μｍ～５ｃｍ、より好ましくは１μｍ～１ｍｍ、最も好ましくは１０μｍ～２００μｍとなるように、表層の厚さを調節すればよい。つまり、表層の厚さは、先に説明した支持体の大きさとの関係において決定されることになる。
　上記表層を形成する方法としては特に限定しないが、例えば、まず、ナノサイズのハイドロキシアパタイト粒子、換言すれば、ハイドロキシアパタイトナノ結晶、を形成した後、当該ハイドロキシアパタイトナノ粒子によって、上記支持体をコーティングすることが好ましい。当該結晶（粒子）は、未焼成体（アモルファス）であっても、焼成体であってもよい。
　上記支持体をコーティングするハイドロキシアパタイト粒子のサイズとしては特に限定されないが、例えば、１０ｎｍ～７００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～６００ｎｍ、最も好ましくは２５ｎｍ～５００ｎｍの範囲内の粒子径を有するハイドロキシアパタイト粒子を用いることが好ましい。
　以下に、上記ハイドロキシアパタイト粒子、表層（換言すれば、担体）の形成方法の一例について、更に具体的に説明する。
　上記表層の形成方法としては特に限定されないが、少なくとも「一次粒子生成工程」、「焼結工程」、「表層形成工程」を含んでいることが好ましい。また、上記工程以外に、「除去工程」、「混合工程」」を含んでいてもよい。なお、以下の説明においては、表層の形成方法の一例として、上記５つの工程を全て含んだ製造方法について説明するが、これに限定されない。
　上記５つの工程は、「１．一次粒子生成工程」→「２．混合工程」→「３．焼結工程」→「４．除去工程」→「５．表層形成工程」の順で行われる。なお、「１．一次粒子生成工程」～「４．除去工程」までは、表層の原料となるハイドロキシアパタイト粒子を作製する工程であって、表層形成工程は、当該ハイドロキシアパタイト粒子を用いて支持体上に表層を形成し、支持体と表層とからなる担体を形成する工程である。以下に、各工程について説明する。
　　　＜１．一次粒子生成工程＞
　ここで「一次粒子」とは、焼結工程の前に、ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）によって形成された粒子のことを意味する。すなわち、ハイドロキシアパタイト粒子の製造工程において、初めて形成された粒子のことを意味する。また狭義には単結晶粒子のことを意味する。なお本明細書において「一次粒子」とは、非晶質（アモルファス）の状態のもの、及びその後に焼結を行なった焼結体の状態のものをも含む。
　これに対して「二次粒子」とは、複数の「一次粒子」同士が、物理的結合（例えば、融着など）または化学的結合（例えば、イオン結合または共有結合など）によって結合した状態の粒子を意味する。このとき、結合し合う一次粒子の個数、結合後の形状などは特に限定されない。
　また特に「単結晶一次粒子」とは、ハイドロキシアパタイトの単結晶からなる一次粒子、または、当該単結晶からなる一次粒子がイオン的相互作用によって集合化した粒子塊のことを意味する。なお前記「イオン的相互作用にて集合化した粒子塊」とは、水もしくは有機溶媒を含む媒体にて分散させた場合にイオン的相互作用で自己集合する粒子塊であって、焼結によって粒子間が溶融して多結晶化した二次粒子を含まない。
　一次粒子生成工程は、上記一次粒子を生成することができる工程であればよく、特に限定されない。例えば、ｐＨをアルカリ性（例えば、ｐＨ１２．０）に調製したＣａ（ＮＯ３）２水溶液に対して、ｐＨをアルカリ性（例えば、１２．０）に調製した（ＮＨ４）２ＨＰＯ４水溶液を、高温（例えば、８０℃）にて徐々に添加すればよい。
　一次粒子生成工程によって生成された一次粒子の状態（例えば、粒子径、粒度分布）が、ハイドロキシアパタイト粒子の状態（粒子径、粒度分布）にそのまま反映される。したがって、粒子径が微細（ナノサイズ）でかつ粒子径が均一な（粒度分布が狭い）ハイドロキシアパタイト粒子を製造しようとすれば、当該一次粒子生成工程において粒子径が微細（ナノサイズ）でかつ粒子径が均一な（粒度分布が狭い）一次粒子を生成しておくことが好ましい。
　一次粒子の粒子径としては特に限定されないが、１０ｎｍ～５００ｎｍが好ましく、２０ｎｍ～４５０ｎｍがさらに好ましく、２５ｎｍ～４００ｎｍが最も好ましい。また一次粒子からなる一次粒子群の粒子径の変動係数は、２０％以下であることが好ましく、１８％以下であることがさらに好ましく、１５％以下であることが最も好ましい。なお一次粒子の粒子径および変動係数は、動的光散乱法または電子顕微鏡を用いて、少なくとも１００個以上の一次粒子について粒子径を測定し、当該測定結果に基づいて計算すればよい。上記のような一次粒子群を生成しておくことによって、後述する細胞の接着効率のよい表層を形成することができる。なお「変動係数」は、標準偏差÷平均粒子径×１００（％）で計算することができる粒子間の粒子径のバラツキを示す値である。
　上記のような微細（ナノサイズ）でかつ粒子径が均一な（粒度分布が狭い）一次粒子を生成する方法については、特に限定されるものではないが、例えば、特開２００２－１３７９１０号公報に記載された方法を利用することができる。つまり、界面活性剤／水／オイル系エマルジョン相にカルシウム溶液およびリン酸溶液を可溶化して混合させ、界面活性剤の曇点以上で反応させることによって、一次粒子を合成することができる。また、このとき上記界面活性剤の官能基および親水性／疎水性比の割合を変えることによって、一次粒子の大きさを制御することができる。
　上記一次粒子を製造する原理を簡単に説明すれば、以下の通りである。界面活性剤／水／オイル系エマルジョン相にカルシウム溶液およびリン酸溶液を混合し、反応させてハイドロキシアパタイ卜微粒子を合成する方法においては、界面活性剤のミセルの中でハイドロキシアパタイトの核が成長し、結晶成長する。このとき反応温度を界面活性剤の曇点以上に設定することにより、ミセルの熱力学的安定性を制御することができる。すなわち界面活性剤の曇点以上に反応温度を上げることによって、界面活性剤のミセルを形成する能力を下げることができる。その結果、ミセルという枠の中で制限を受けていたハイドロキシアパタイトの結晶成長の駆動力が、ミセルの枠を維持しようとする駆動力よりも大きくなる。そして、そのメカニズムを利用して結晶の形態（例えば、形や大きさなど）を制御することができる。
　界面活性剤によってミセルを作る場合には、界面活性剤の官能基（親水性部位）および当該界面活性剤の親水性／疎水性比が重要であり、これらが異なれば、ミセルの安定性、および曇点も異なる。また界面活性剤の曇点は、界面活性剤の種類によって異なる。したがって、界面活性剤の種類を適宜変更することにより、ミセルの安定性および雲点を変更することが可能となり、これによって、ハイドロキシアパタイト微粒子の大きさを制御することができる。
　なお上記方法において用いる界面活性剤の種類は特に限定されず、例えば、特開平５－１７１１１号公報に開示された公知の陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を用いることができる。より具体的には、非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミンなどを用いることが好ましい。また、陽イオン界面活性剤としては、ステアリルアミン塩酸塩、ラリウルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルベンゼンジメチルアンモニウムクロライドなどの第４級アンモニウム塩などを用いることが好ましい。また、陰イオン界面活性剤としては、ラリウルアルコール硫酸エステルナトリウム、オレイルアルコール硫酸エステルナトリウムなどの高級アルコール硫酸エステル塩類、ラリウル硫酸ナトリウム、ラリウル硫酸アンモニウムなどのアルキル硫酸塩類、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルアリールスルホン酸塩類などを用いることが好ましい。また、両性界面活性剤としては、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、アミンオキサイド型の両性界面活性剤を用いることが好ましい。上記界面活性剤は、１種類、または２種類以上の組み合わせにて使用することが可能である。このなかで、曇点および溶解性の点から、ペンタエチレングリコールドデシルエーテルを使用することが最も好ましい。
　また上記方法において利用可能なオイル相としては、例えば、トルエン、キシレン、ヘキサン、ドデカン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、クロロベンゼン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ブタノールなどのアルコール類、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類などを挙げることができる。
　これらのオイル相は、使用する界面活性剤に応じて、水の溶解度を小さくするとともに、上記界面活性剤のいずれかを溶解するように、１種もしくは２種を選択すればよい。水の溶解度および界面活性剤の溶解性の点から、上記オイル相としては、ドデカンを使用することが最も好ましい。この他反応温度、反応時間、原料の添加量等は、一次粒子の組成に応じて適宜最適な条件を選択の上、採用すればよい。ただし反応温度の上限は、水溶液の反応であるから溶液が沸騰しない温度であれることが好ましく、具体的には９０℃以下が好ましい。
　また、本工程には生成した一次粒子を水等で洗浄する工程、遠心分離、ろ過等で一次粒子を回収する工程が含まれていてもよい。
　　　＜２．混合工程＞
　混合工程は、一次粒子と融着防止剤とを混合する工程である。つまり、上記一次粒子生成工程によって得られた一次粒子群の粒子間に、あらかじめ融着防止剤を介在させておくことによって、その後の焼結工程における一次粒子同士の融着を防止するための工程である。なお本当該混合工程によって得られた一次粒子と融着防止剤との混合物を「混合粒子」と呼ぶこととする。
　上記融着防止剤としては、一次粒子間の融着を防止できるものであれば特に限定されるものではないが、後段の焼結工程の焼結温度においても、揮発しないものであることが好ましい。焼結温度条件下で不揮発性であれば、焼結工程中に一次粒子間から消失することが無く、一次粒子同士の融着を確実に防止することができる。ただし焼結温度において１００％の不揮発性を有する必要は無く、焼結工程終了後に一次粒子間に１０％以上残存する程度の不揮発性を有するものであればよい。
　また、上記融着防止剤は、焼結工程終了後に、熱によって化学的に分解するものであってもよい。すなわち、焼結工程終了後に残存するものであればよく、焼結工程の開始前後で、同一の物質（化合物）である必要は無い。
　また融着防止剤が、溶媒、特に水系溶媒に溶解する物質であることが好ましい。溶媒に溶解する融着防止剤を用いれば、融着防止剤が混在する混合粒子を純水等の水系溶媒に懸濁するだけで、融着防止剤（例えば、炭酸カルシウムなど）を除去することができる。特に水系溶媒に溶解する融着防止剤であれば、融着防止剤を除去する際に有機溶媒を用いる必要が無いため、除去工程に有機溶媒の使用に対応する設備、有機溶媒廃液処理が不要となる。それゆえ、より簡便に混合粒子から融着防止剤を除去することができる。なお、上記溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水系溶媒としては、水、エタノール、メタノール等が挙げられ、有機溶媒としては、アセトン、トルエン等が挙げられる。
　また、上記水系溶媒は、融着防止剤の水への溶解性を上げるために、シュウ酸塩、エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸塩などのキレート化合物を含んでいることが好ましい。さらに、上記水系溶媒は、融着防止剤の水への溶解性を上げるために、塩化ナトリウム、硝酸アンモニウム、炭酸カリウムなどの電解質イオンを含んでいることが好ましい。
　ここで、融着防止剤の溶媒に対する溶解度は、高ければ高いほど除去効率が高くなるために好ましいといえる。溶媒１００ｇに対する溶質の量（ｇ）を溶解度とすると、上記融着防止剤の溶解度は、０．０１ｇ以上であることが好ましく、１ｇ以上であることがさらに好ましく、１０ｇ以上であることが最も好ましい。
　上記融着防止剤の具体例としては特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウムなどのカルシウム塩（または錯体）、ポリアクリル酸カルシウム、塩化カリウム、酸化カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、リン酸カリウムなどのカリウム塩、塩化ナトリウム、酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどのナトリウム塩などを用いることが好ましい。
　なお、当該混合工程において一次粒子と融着防止剤とを混合させる方法は特に限定されず、例えば、固体状のハイドロキシアパタイト一次粒子に固体状の融着防止剤を混合後、ブレンダーを用いて混合する方法であってもよいし、融着防止剤の溶液中に一次粒子を分散させる方法であってもよい。ただし、固体と固体とを均一に混合することは困難であるため、一次粒子間に均一かつ確実に融着防止剤を介在させるためには、後者の方が好ましい方法であるといえる。後者の方法を採用した場合には、ハイドロキシアパタイト一次粒子を分散させた後の融着防止剤溶液を乾燥させることが好ましい。これによれば、ハイドロキシアパタイト一次粒子と融着防止剤とが均一に混合された状態を、長期にわたって維持することができる。
　　　＜３．焼結工程＞
　焼結工程は、上記混合工程によって得られた混合粒子を焼結温度に曝して、当該混合粒子に含まれる混合粒子をセラミック粒子（焼結体粒子）にする工程である。このとき、混合粒子の粒子間には融着防止剤が介在しているので、焼結工程における高温条件に曝されても、ハイドロキシアパタイト一次粒子同士の融着を防止することができる。
　上記焼結工程における焼結温度は、セラミック粒子の硬度が所望の硬度となるように適宜設定すればよく特に限定されない。例えば、焼結温度は、１００℃～１８００℃であることが好ましく、１５０℃～１５００℃であることがさらに好ましく、２００℃～１２００℃であることが最も好ましい。なお焼結時間については所望するセラミック粒子の硬度等を基準に適宜設定すればよい。
　なお、当該焼結工程に用いる装置等は特に限定されるものではなく、適宜、市販の焼成炉を用いることができる。
　　　＜４．除去工程＞
　除去工程は、焼結工程によって得られた焼結体粒子の粒子間に混在する融着防止剤を取り除く工程である。
　具体的な除去の手段・手法については、上記混合工程において採用した融着防止剤に応じて適宜採用すればよく、特に限定されない。例えば、溶媒への溶解性を有する融着防止剤を用いる場合には、ハイドロキシアパタイト粒子を溶解しない溶媒（非溶解性）であって、かつ融着防止剤を溶解する（溶解性）溶媒を用いることによって、融着防止剤のみを溶解して除去することができる。
　用いる溶媒としては、上記要件を満たす溶媒であれば特に限定されるものではなく、水系溶媒であっても、有機溶媒であってもよい。当該除去工程においては、有機溶媒の使用時に必要な設備が不要となること、有機溶媒の廃液の処理に必要な設備が不要となること、製造作業の安全性が高いこと、環境に対するリスクが低いこと等の理由から、使用する溶媒としては、水系溶媒が好ましい。
　例えば、水系溶媒としては、水、エタノール、またはメタノールなどを用いることが好ましい。また、有機溶媒としては、アセトン、またはトルエンなどを用いることが好ましい。
　また、上記水系溶媒は、融着防止剤の溶解性を上げるために、シュウ酸塩、エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸塩などのキレート化合物を含んでいることが好ましい。さらに、上記水系溶媒は、融着防止剤の溶解性を上げるために、塩化ナトリウム、硝酸アンモニウム、炭酸カリウムなどの電解質イオンを含んでいることが好ましい。
　なお、ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）の焼結体粒子は、ｐＨ４．０以下の条件において溶解するので、ｐＨ４．０～ｐＨ１２．０の条件下で除去工程を行うことが好ましい。
　溶媒を用いて融着防止剤を除去する場合には、焼結工程によって得られた融着防止剤を含む焼結体粒子群を溶媒に懸濁させた後、ろ過または遠心分離によってハイドロキシアパタイト粒子のみを回収すればよい。上記ハイドロキシアパタイト粒子の製造方法においては、上記除去工程は、１回に限られるものではなく２回以上行ってもよい。上記除去工程を複数回行うことによって、ハイドロキシアパタイト粒子間の融着防止剤の除去率がさらに向上する。
　上記溶媒を用いて融着防止剤を除去する方法の他、融着防止剤として磁性体を用いることによって、マグネットを用いて融着防止剤を除去することができる。より具体的には、焼結工程によって得られた融着防止剤を含む焼結体粒子群を適当な溶媒（水等）に懸濁して分散させた後、当該懸濁液に磁力をかけ、融着防止剤のみをマグネットに吸着させ、吸着しなかったハイドロキシアパタイト粒子のみを回収すればよい。また溶媒に懸濁することなく、焼結体粒子をすりつぶして粉体にした後、マグネットによって融着防止剤を分離することも可能である。
　除去工程には、さらにハイドロキシアパタイト粒子の粒子径を均一にするための分級工程が含まれていることが好ましい。上記分級工程はハイドロキシアパタイト粒子の粒子径を均一にし得る工程であればよく、特に限定されない。例えば、フィルター濾過、遠心分離などによって分級を行うことが可能であるが、これらの方法に限定されない。
　以上のようにして、支持体表面をコーティングするためのハイドロキシアパタイト粒子を作製することができる。
　　　＜５．表層形成工程＞
　表層形成工程は、上述した一連の工程によって得られたハイドロキシアパタイト粒子によって支持体をコーティングし、これによって、支持体上に表層を形成する工程である。換言すれば、表層形成工程は、支持体と表層とを有する担体を形成する工程である。
　表層形成工程は支持体上に表層を形成して、支持体と表層とからなる担体を形成することができる工程であればよく、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、上記ハイドロキシアパタイト粒子を適当な溶媒に溶解させた後、当該溶液に支持体を分散させればよい。
　上記溶媒としては特に限定されず、例えば、水系溶媒または有機溶媒を用いることが可能である。更に具体的に、水系溶媒としては、水、エタノール、またはメタノールなどを用いることが好ましく、有機溶媒としては、アセトン、またはトルエンなどを用いることが好ましい。
　ハイドロキシアパタイト粒子および支持体を含む溶媒は、超音波処理にかけられることが好ましい。超音波処理を行うことによって、上記支持体の表面全体にわたって、より厚さが均一な表層を形成することが可能となる。なお、上記超音波処理の具体的な条件は特に限定されない。また、超音波をかける装置も、適宜市販の装置を用いることが可能である。
　表層形成工程では、上記超音波処理のあと、ハイドロキシアパタイト粒子によってコーティングされた支持体（担体）を分離・洗浄した後、当該担体を乾燥させる工程を含むことが好ましい。
　上記担体を分離する工程は特に限定されないが、例えば、遠心分離、またはフィルター濾過によって上記担体を分離することが好ましい。また、上記担体は、溶媒を用いて洗浄することができる。上記溶媒としては特に限定されないが、例えば、水系溶媒または有機溶媒を用いることが好ましい。更に具体的には、水系溶媒としては、水、エタノール、またはメタノールなどを用いることが好ましく、有機溶媒としては、アセトン、またはトルエンなどを用いることが好ましい。
　洗浄された後の担体は、乾燥させることが好ましい。乾燥方法としては特に限定されず、例えば、室温にて乾燥させることも可能であり、所望の温度をかけることによって乾燥させることも可能である。
　以上のようにして、後述する細胞を備える対象である担体を作製することができる。
　なお、以上のようにして形成された担体は粒子状に形成されている。なお、本明細書において「粒子状」とは、注射器によって投与することが可能な程度の大きさおよび形状を有する微細な粒子が意図される。当該粒子の形状は特に限定しないが、球状、ロッド状、針状、鱗片状、布状、シート状、または、それら形状の組み合わせであることが好ましい。
　具体的には、上記担体の粒子径、好ましくは０．０１μｍ～５ｃｍであり、より好ましくは１μｍ～１ｍｍである。担体の大きさが１０μｍよりも小さくなれば、本実施の形態の医療用組成物が毛細血管中に入り込み易くなる傾向を示し、担体の大きさが２００μｍよりも大きくなれば、医療用組成物が凝集し易くなる、換言すれば、注射器によって生体に投与する場合に注射針に目詰まりを生じる傾向を示す。したがって、上記担体の粒子径は、１０μｍ～２００μｍであることが最も好ましい。なお、上記粒子径が１ｍｍ以下であれば容易に注射器にて生体に投与することができる。また上記粒子径が１ｍｍよりも大きい物に関しては、切開移植によって生体に投与することも可能である。
　なお、上記担体の粒子径は、公知の方法によって測定することができる。例えば、動的光散乱法または電子顕微鏡を用いて、上述した一次粒子の場合と同様に測定することができる。
　　〔１－３．細胞〕
　本実施の形態の医療用組成物では、上述したようにして形成された担体上に、細胞が備えられている。
　上記細胞は血管新生を誘導させ得る細胞であればよく、特に限定されない。例えば、上記細胞としては、骨髄単核細胞、末梢血単核細胞、多能幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、血小板、および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を用いることが好ましい。特に、骨髄単核細胞、末梢血単核細胞、多能幹細胞、造血幹細胞、および血管内皮前駆細胞は、既に血管新生療法での有効性がヒトあるいは動物で示されている細胞であるため、より好ましい。また、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞は、細胞の供給源の観点から患者に負担をかけないので、より好ましい。
　上記細胞を担体表面に設ける方法としては特に限定されないが、例えば、上記細胞と上記表層との間の相互作用を介して設けることが好ましい。上記相互作用としては特に限定しないが、例えば、架橋剤によって細胞を担体上に固定化してもよいし、細胞の接着能によって細胞を担体上に接着させてもよいし、ハイドロキシアパタイトの吸着能によって細胞を担体上に吸着させてもよい。また、上記相互作用の複数によって、細胞を担体上に固定化してもよい。なお、上記架橋剤としては特に限定されず、適宜公知の架橋剤を用いることが可能である。また、担体の表面に設けられる細胞は、直接担体表面上に備えられていてもよく、別の細胞を介して間接的に担体表面上に設けられてもよい。つまり、複数の細胞からなる細胞塊中の一部の細胞を担体上に固定化することによって、当該細胞塊全体を担体表面に設けることも可能である。また、多孔質の担体を用いる場合には、孔内にも細胞を設けることが可能である。
　上記細胞を担体上に固定化する具体的な方法としては特に限定されないが、例えば、上記担体と細胞とを混合することが好ましく、上記担体上で細胞を所定の時間培養することが更に好ましい。培養を行う場合の培養時間としては特に限定されないが、例えば０．１時間～２４時間培養することが好ましい。当該培養時間であれば、担体上に更に強固に細胞を接着させることができる。また、当該培養時間であれば、接着させた細胞を増殖させることによって、本実施の形態の医療用組成物の血管新生作用を増強させることができる。
　担体と当該担体上に備えられた細胞との比率は特に限定されないが、例えば、担体と細胞との重量比は、１／１０～１０／１であることが好ましい。当該重量比が１／１０以上であれば、十分な量の細胞が担体上に備えられているので、効果的に血管を新生させることができる。また、当該重量比が１０／１以下であれば、効果的に血管を新生させることができるのみならず、ハイドロキシアパタイトなどによって生体に引き起こされ得る副作用（例えば、炎症など）を確実に防止することができる。
　なお、本実施の形態の医療用組成物では、上記細胞以外に、上記担体の表面に各種生理活性物質が備えられていることが好ましい。
　上記生理活性物質としては特に限定されないが、例えば、抗炎症剤、血管新生サイトカイン、抗生物質および細胞増殖因子からなる群より選択される少なくとも１種類の生理活性物質であることが好ましい。例えば、血管新生サイトカインを担体上に備えさせれば、より効果的に血管新生を誘導することができる。また、抗炎症剤を担体上に備えさせれば、多量の医療用組成物を生体内に投与したとしても、炎症が発生することを防止することができる。また、抗生物質を担体上に備えさせれば、各種２次感染などを防止することができる。また、細胞増殖因子を担体上に備えさせれば、血管新生のみならず、必要に応じて各種細胞（各種組織）をも再生させることができる。
　例えば、上記血管新生サイトカインとしては特に限定されないが、例えば、ａＦＧＦ（acidic fibroblast growth factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）、ＰＩＧＦ（platelet-induced growth factor）、ＴＮＦ（tumor necrosis factor）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）、angiopoietin、ＩＬ（interleukin）、ＨＡＰＯ（hemangiopoietin）、Ｓｈｈ（sonic hedgehog）、ＴＧＦ－β（transforming growth factor-beta）、Ｇ－ＣＳＦ（granulocyte-colony stimulating factor）、Ｍ－ＣＳＦ（macrophage-colony stimulating factor）、ＳＣＦ（stem cell factor）、ＥＰＯ（erythropoietin）、ＴＰＯ（thrombopoietin）、およびＦｌｔ（FMS-like tyrosine kinase ligand）からなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインであることが好ましい。上記構成によれば、担体上に細胞のみを備えさせた場合と比較して、より効果的に血管新生を誘導することが可能になる。
　なお、上記生理活性物質を担体表面に設ける方法としては特に限定されないが、例えば、上記細胞と上記表層との間の相互作用を介して設けることが好ましい。上記相互作用としては特に限定しないが、例えば、架橋剤によって生理活性物質を担体上に固定化してもよいし、ハイドロキシアパタイトの吸着能によって上記生理活性物質を担体上に吸着させてもよい。また、上記相互作用の複数によって、生理活性物質を担体上に固定化してもよい。なお、上記架橋剤としては特に限定されず、適宜公知の架橋剤を用いることが可能である。
　〔２．医療用キット〕
　本実施の形態の医療用キットは、上述した本発明の医療用組成物と、当該医療用組成物を生体（例えば、患者）に投与するための注射器とを備えるものである。なお、本実施の形態の医療用キットは、特に、血管新生用キットとして用いることが可能である。
　医療用組成物に関しては、既に説明したので、ここではその説明を省略する。
　上記注射器としては特に限定されず、針を介して上記医療用組成物を生体内に投与できるものであればよい。例えば、上記注射器には、一般的な注射器のみならず、カテーテル、および点滴などが含まれる。
　また、本実施の形態の医療用キットには、必要に応じて、注射器以外に様々な構成を追加することが可能である。当該構成としては特に限定されないが、例えば、注射針、消毒薬、オイフおよびメスからなる群より選択される少なくとも１つの構成であることが好ましい。これらの構成をも含む医療用キットであれば、より簡便かつ安全に本発明の医療用組成物を生体に投与することができる。
　本実施の形態の医療用キットであれば、注射器にて医療用組成物を体内に投与することができる。つまり、患者自身によって容易に医療用組成物を局所に投与することができる。
　また、本実施の形態の医療用キットは、注射液として用いることが可能な、各種液体を備えていることが好ましい。上記液体は、本願発明の医療用組成物を溶解することが可能であるとともに、生体に対して毒性が低いものであればよい。例えば。上記液体としては、生理食塩水などを挙げることができるが、これに限定されない。
　〔３．医療用組成物の製造方法〕
　本実施の形態の医療用組成物の製造方法は、生体吸収性高分子からなる支持体、および当該支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と細胞とを混合する工程を含む方法である。
　上記生体吸収性高分子、支持体、表層、担体および細胞の具体的な構成については、既に説明したので、ここではその説明を省略する。
　上記工程では担体と細胞とが混合され、これによって、担体の表面に細胞が備えられる。なお、担体の表面に備えられる細胞は、直接担体表面上に備えられていてもよく、別の細胞を介して間接的に担体表面上に備えられていてもよい。
　上記工程を行う具体的な方法は特に限定されない。例えば、液体（例えば、液体培地、生理食塩水、リン酸バッファーなどのバッファー）中にて、上記担体と上記細胞とを混合すればよい。
　上記工程では、担体１粒子あたり、好ましくは１×１０１０個以下の細胞、更に好ましくは１×１０８個以下の細胞、更に好ましくは１×１０６個以下の細胞、最も好ましくは１×１０４個以下の細胞を混合する。上記構成によれば、好適に血管新生を誘導することができるとともに、炎症などの副作用を抑えることができる。
　なお、本実施の形態の製造方法によって製造される医療用組成物、換言すれば本願発明の医療用組成物は、上記工程において担体と細胞とを混合した状態の液体をも包含する。つまり、本願発明の医療用組成物中には、担体に対して直接接着していない細胞が含まれ得る。
〔実施例〕
　以下の実施例では、本願発明の医療用組成物の血管新生効果を簡便に検討するために、ポリ乳酸膜を用いた構成と、ポリ乳酸粒子を用いた構成との両方について検討した。ポリ乳酸膜を用いた構成とポリ乳酸粒子を用いた構成とは、血管新生に関しては同等の効果を示したが、投与の容易性、投与時にできる傷跡の有無、当該傷跡の治療の必要性などの観点からは、ポリ乳酸粒子を用いた構成の方が優れているといえる。この点については、以下の具体的な記載から容易に理解できるであろう。
　〔１．ハイドロキシアパタイト粒子の作製〕
　アンモニア水にてｐＨを１２．０に調製したＣａ（ＮＯ３）２水溶液（４２ｍＮ、８００ｍＬ）を、コンデンサーおよび半月状攪拌翼が設置された１Ｌフラスコに注ぎ込み、８０℃に保持した。
　アンモニア水にてｐＨを１２．０に調製した（ＮＨ４）２ＨＰＯ４水溶液（１００ｍＮ、２００ｍＬ）を、上記フラスコに８０℃、１０ｍＬ／ｈの速度にて添加し、２４時間反応させた。これによって、ハイドロキシアパタイトの一次粒子を作製した。
　１．０ｇのポリアクリル酸（ＡＬＤＲＩＣＨ社製、重量平均分子量１５，０００ｇ／ｍｏｌ）を含むｐＨ１２．０の水溶液１００ｍＬに、１．０ｇのハイドロキシアパタイトの一次粒子を分散させることによって、当該一次粒子の表面にポリアクリル酸を吸着させた。なお、当該工程について、以下に更に詳細に説明する。
　まず、１．０ｇのポリアクリル酸（ＡＬＤＲＩＣＨ社製、重量平均分子量１５，０００ｇ／ｍｏｌ）を純水１００ｍＬに溶解させた。次いで、アンモニア水溶液（２５％水溶液）を室温にて攪拌しながら添加することによって、ポリアクリル酸水溶液のｐＨを１２．０に調整した。なお、当該水溶液のｐＨは、株式会社　堀場製作所製のｐＨメータ　Ｄ－２４ＳＥを用いて測定した。次いで、当該水溶液１００ｍＬに、１．０ｇのハイドロキシアパタイトの一次粒子を分散させた後、当該分散液に、０．１２ｍｏｌ／Ｌの硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）水溶液１００ｍＬを添加することによって、一次粒子の表面上にポリアクリル酸カルシウムを析出させた。なお、当該ポリアクリル酸カルシウムは、融着防止剤として機能する。
　生じた沈殿物を回収し、減圧下（約０．１Ｐａ）８０℃にて乾燥させることによって、混合粒子を取得した。
　当該混合粒子をルツボに入れ、８００℃の焼結温度にて１時間の焼成を行った。この時、ポリアクリル酸カルシウムは熱分解し、酸化カルシウム（ＣａＯ）となる。
　なお、焼結工程終了後の酸化カルシウム（ＣａＯ）の残存率は、２５％以上であった。
　次いで、５０ｍｍｏｌ／Ｌ硝酸アンモニウム（ＮＨ４ＮＯ３）水溶液５００ｍＬに、上記焼結工程にて得られた焼結体粒子を懸濁し、その後、遠心分離によって当該焼結体粒子を分離・洗浄した。更に、上記焼結体粒子を蒸留水に懸濁した後、同様に分離・洗浄を行うことによって、融着防止剤および硝酸アンモニウムを除去し、ハイドロキシアパタイト粒子（ハイドロキシアパタイトナノ結晶）を回収した。
　上記ハイドロキシアパタイト粒子の粒子径を、動的光散乱法によって測定した。なお、動的光散乱の測定には、大塚電子株式会社製のダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ－６０００を用い、室温、１０ｐｐｍの粒子濃度、散乱角９０°の条件下にて測定を行った。その結果、上記ハイドロキシアパタイト粒子の粒子径は、６０ｎｍ～１００ｎｍの間に分布し、さらにこのときの粒子径の変動係数は１１％と狭かった。このことは、上記ナノ結晶が、均一な粒子径を有する（粒子径分布が狭い）粒子群であることを示している。
　〔２．ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の作製〕
　ポリ乳酸不織布膜（厚さ１４０μｍ、目付２０ｇ／ｍ２、引裂強力３Ｎ）をアンモニア水溶液（ｐＨ１２．０）に３０分間浸漬することによって、ポリ乳酸不織布の膜表面にカルボキシル基を導入した。上記処理後のポリ乳酸粒子を、水およびエタノールにて洗浄した。
　実施例１において作製したハイドロキシアパタイト粒子を、２重量％の濃度にてエタノール中に分散させた。
　洗浄したポリ乳酸不織布膜を上記ハイドロキシアパタイト粒子を分散させたエタノール中に浸漬し、室温にて５分間の超音波照射（超音波照射器：株式会社エヌエヌディ製のＵＳ－２、出力：１２０Ｗ、周波数：３８ｋＨｚ）を行った。室温にて３０分間放置した後、ポリ乳酸不織布膜をエタノールにて洗浄し、室温にて乾燥させた。
　作製したハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体を走査型電子顕微鏡にて観察した結果、ポリ乳酸膜の表面が、ハイドロキシアパタイト粒子にて均一にコーティングされていることが確認された。また、ハイドロキシアパタイト粒子によるポリ乳酸膜表面の被覆率は、約４０％であった。なお、走査型電子顕微鏡としては日本電子株式会社製のＪＳＭ－６３０１Ｆを用い、９万倍の倍率にて、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体を観察した。
　〔３．ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体の作製〕
　ポリ乳酸粒子（粒子径１００μｍ）を室温にてエタノールで洗浄した。次いで、実施例１において作製したハイドロキシアパタイト粒子を、２重量％の濃度にてエタノール中に分散させた。
　洗浄したポリ乳酸粒子を上記ハイドロキシアパタイト粒子を分散させたエタノール中に浸漬し、室温にて５分間の超音波照射（超音波照射器：株式会社エヌエヌディ製のＵＳ－２、出力：１２０Ｗ、周波数：３８ｋＨｚ）を行った。室温にて３０分間放置した後、ポリ乳酸粒子をエタノールにて洗浄し、室温にて乾燥させた。
　作製したハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体を走査型電子顕微鏡にて観察した結果、ポリ乳酸粒子の表面が、ハイドロキシアパタイトナノ結晶にて均一にコーティングされていることが確認された。また、ハイドロキシアパタイト粒子によるポリ乳酸粒子表面の被覆率は、ほぼ１００％であった。なお、走査型電子顕微鏡としては日本電子株式会社製のＪＳＭ－６３０１Ｆを用い、９万倍の倍率にて、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体を観察した。
　〔４．ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体への骨髄細胞の接着性〕
　実施例２および３において作製したハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体上およびハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体上にて、骨髄細胞を２．５時間培養した。なお、コントロールとしては、ハイドロキシアパタイト粒子を備えないポリ乳酸膜またはポリ乳酸粒子を用いた。
　培養後、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体上およびハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体上に接着した骨髄細胞を、リン酸緩衝液／グルタールアルデヒドにて固定し、その後、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体を５０％エタノール水溶液から１００％エタノール水溶液に順次浸漬して脱水処理を行った。
　次いで、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体およびハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体をブタノール処理および凍結乾燥した後、走査型電子顕微鏡によって観察した。図１の（ａ）は、ポリ乳酸粒子の結果を示し、図１の（ｂ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子の結果を示している。一方、図１の（ｃ）は、ポリ乳酸膜の結果を示し、図１の（ｄ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜の結果を示している。
　図１の（ａ）および図１の（ｃ）に示すように、ハイドロキシアパタイト粒子を備えていないポリ乳酸粒子およびポリ乳酸膜上には骨髄細胞が認められないのに対し、図１の（ｂ）および図１の（ｄ）に示すように、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体上およびハイドロキシアパタイトポリ乳酸膜上には、粒状の骨髄細胞が多数観察された。なお、走査型電子顕微鏡としては日本電子株式会社製のＪＳＭ－６３０１Ｆを用い、３００倍の倍率にて、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体を観察した。
　また、実施例２において作製したハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体上にて、Ｌ９２９細胞を６日間培養した。なお、ネガティブコントロールとしては、ハイドロキシアパタイト粒子にて被覆されていないポリ乳酸膜を用いた。
　６日間の培養後、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体、および、ポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体のそれぞれをトリプシンにて処理し、その後、Ｌ９２９細胞の接着状態を光学顕微鏡によって観察した。
　図２の（ａ）は、トリプシン処理を行う前のポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体を示し、図２の（ｂ）は、トリプシン処理を行った後のポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体を示している。また、図２の（ｃ）は、トリプシン処理を行う前のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体を示し、図２の（ｄ）は、トリプシン処理後のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／Ｌ９２９細胞複合体を示している。
　図２の（ａ）～図２の（ｄ）に示すように、ハイドロキシアパタイト粒子にて被覆されていないポリ乳酸膜からはＬ９２９細胞が容易に剥離するが、ハイドロキシアパタイト粒子にて被覆されているポリ乳酸膜からはＬ９２９細胞は容易に剥離しないことが明らかになった。つまり、ハイドロキシアパタイト粒子にて被覆されたナノスキャホールド上の細胞は、トリプシン処理をしても容易に剥離しないような、強固な接着性を示すことが明らかになった。
　〔５．ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体への骨髄細胞の接着性〕
　実施例３において作製したハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体上にて、骨髄細胞を２．５時間培養した。
　培養後、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体上に接着した骨髄細胞を、リン酸緩衝液／グルタールアルデヒドにて固定し、その後、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体を５０％エタノール水溶液から１００％エタノール水溶液に順次浸漬して脱水処理を行った。
　次いで、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体をブタノール処理および凍結乾燥した後、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体を、走査型電子顕微鏡によって観察した。その結果、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の場合と同様に、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体上にも、粒状の骨髄細胞が多数観察された。なお、走査型電子顕微鏡としては日本電子株式会社製のＪＳＭ－６３０１Ｆを用い、３００倍の倍率にて、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体を観察した。
　〔６．ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体の血管新生増強作用〕
　下肢虚血モデルマウスを公知の大腿動脈切除法によって作製し、膜状のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体、および、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の各々を大腿動脈を切除した下肢の筋肉表面に付着させた後に、皮膚を縫合した（図３の（ａ）参照）。また、粒子状のハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体、および、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体の各々を、注射器を用いて筋肉内に投与した（図３の（ｂ）参照）。投与の２週間後に、走査型顕微鏡にて血管新生の有無を確認した。
　投与２週間後に投与箇所を開いて観察することによって、組織下に、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体、および、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の各々が投与されていることが確認できた。
　次いで、血管新生の有無を確認したところ、図４の（ａ）～図４の（ｃ）に示すように、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体またはハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体を投与した場合には、当該複合体の表面近傍に多数の血管新生が認められた。具体的には、図４の（ａ）および図４の（ｂ）の点線にて囲まれた領域は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体またはハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体が投与された箇所を示し、当該箇所には多数の血管新生が認められた。なお、図４の（ｃ）は、血管新生が生じている箇所の拡大写真である。
　一方、図５は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体またはハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所の顕微鏡写真であって、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所には血管新生が認められなかった。
　実体顕微鏡を用いた観察においても、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体またはハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体を投与した場合には、当該複合体の内外に多数の血管新生が認められた。例えば、図６の（ｃ）は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体の投与箇所の顕微鏡写真であって、当該投与箇所には血管新生が確認された。また、図６の（ｄ）は、投与されたハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体に焦点を合わせた顕微鏡写真であって、白色矢印は骨髄細胞を示している。つまり、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体を投与した場合には、移植後２週間経過した後にも、複合体に接着している骨髄細胞がハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の表面に留まっていることが確認できた。
　一方、図６の（ａ）に示すように、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体を投与した場合には、当該複合体の近傍には血管新生は認められなかった。また、図６の（ｂ）に示すように、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体を投与した場合には、当該複合体の近傍には骨髄細胞は確認できなかった。
　以上のことから、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体およびハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体は、高い血管新生作用を示すとともに、長期にわたって、接着している細胞（例えば、骨髄細胞）を生きたままで保持することが可能であることが明らかになった。
　また、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体、および、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所に観察される血管の長さの合計を、顕微鏡観察下にて測定した。図７に示すように、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体の投与箇所に存在する血管の長さの合計は、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜複合体の投与箇所に存在する血管の長さの合計の、約３倍であることが明らかになった。このことからも、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体が、血管新生を誘導していることが明らかになった。
　ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体およびハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸膜／骨髄細胞複合体は、血管新生効果に関してはほぼ同じ効果を示したが、投与の容易性、投与時にできる傷跡の有無、当該傷跡の治療の必要性などの観点からは、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体の方が優れていた。そこで、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体の効果について、更に詳細に検討することにした。
　〔７．ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体の血管新生増強作用〕
　ＢＡＬＢ／Ｃマウスを用いて公知の方法によって虚血肢を作製し、大腿動脈を切除した下肢の筋肉中に、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体、骨髄細胞のみ、の各々を注射器にて筋肉内に投与した。その後、虚血下肢の予後を観察した。なお、骨髄細胞は、移植するマウスとは別のＢＡＬＢ／Ｃマウスから採取した。
　図８の（ａ）に示すように、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子複合体、または、骨髄細胞のみを投与したマウスでは、下肢が脱落・壊死するマウスが観察された。一方、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体を投与したマウスでは、下肢の回復が観察された。なお、カプランマイヤー法に従ってマウスの生存率を詳細に解析した結果を、図８の（ｂ）に示す。図８の（ｂ）からも、ハイドロキシアパタイト／ポリ乳酸粒子／骨髄細胞複合体を投与したマウスでは、下肢が回復することが明らかになった。
　なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明の医療用組成物は、血管が破壊された組織内に血管を再生させることができるのみならず、所望の組織内に血管を新生させることが可能となる。それ故、本発明の医療用組成物は、末梢動脈疾患（例えば、閉塞性動脈硬化症、バージャー病（ビュルガー病）、膠原病およびレイノー病など）、または難治性潰瘍（例えば、床擦れ、Diabetic foot、膠原病および虚血性潰瘍など）の治療に用いることができる（例えば、図９参照）。また、本発明によれば、特に、注射器にて投与することを意図した医療用組成物を提供することができる。また、本発明の医療用組成物および医療用キットは、特に、血管新生用組成物（血管再生用組成物）および血管新生用キット（血管再生用キット）として利用することが可能である。

Claims (10)

  1. 　生体吸収性高分子からなる支持体、および前記支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と、
    　前記担体の表面に備えられた細胞と、を含むことを特徴とする医療用組成物。
  2. 　前記担体の粒子径は、１０μｍ～２００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の医療用組成物。
  3. 　前記担体は、多孔質であることを特徴とする請求項１または２に記載の医療用組成物。
  4. 　前記生体吸収性高分子は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリヒドロキシブチレート、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロース、キチン、キトサン、デンプン、ポリグルタミン酸、ポリジオキサノン、シアノアクリレート重合体、ポリカプロラクトン、合成ポリペプチド、ヒアルロン酸、ポリリンゴ酸、ポリコハク酸ブチレン、およびこれらの組み合わせからなる共重合体からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載の医療用組成物。
  5. 　前記細胞は、骨髄単核細胞、末梢血単核細胞、多能幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、血小板、および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞であることを特徴とする請求項１～４の何れか１項に記載の医療用組成物。
  6. 　前記担体の表面に、血管新生サイトカインが備えられていることを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の医療用組成物。
  7. 　前記血管新生サイトカインは、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＩＧＦ、ＴＮＦ、ＥＧＦ、angiopoietin、ＩＬ、ＨＡＰＯ、Ｓｈｈ、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、およびＦｌｔからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインであることを特徴とする請求項６に記載の医療用組成物。
  8. 　請求項１～７の何れか１項に記載の医療用組成物と、
    　前記医療用組成物を生体に投与するための注射器と、を備えることを特徴とする医療用キット。
  9. 　生体吸収性高分子からなる支持体、および前記支持体上に設けられたハイドロキシアパタイトからなる表層を有する粒子状の担体と細胞とを混合する工程を含むことを特徴とする医療用組成物の製造方法。
  10. 　前記工程では、前記担体１粒子あたり１×１０１０個以下の前記細胞を混合することを特徴とする請求項９に記載の医療用組成物の製造方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017127798A (ja) * 2016-01-18 2017-07-27 日東紡績株式会社 ハイドロキシアパタイト粒子が付着した基材及びその製造方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014049821A1 (ja) * 2012-09-28 2014-04-03 テルモ株式会社 医療システム
CN105073980A (zh) * 2012-09-28 2015-11-18 公益财团法人先端医疗振兴财团 含有适合用于缺血性疾病治疗的细胞的细胞群体的体外增殖方法
WO2014049817A1 (ja) * 2012-09-28 2014-04-03 テルモ株式会社 医療部材
WO2014103667A1 (ja) * 2012-12-28 2014-07-03 日本バイリーン株式会社 機能性不織布及びその製造方法
BR112017012289B1 (pt) * 2014-12-12 2022-11-16 Motejo. Ltd Agente para injeção hipodérmica
PL226891B1 (pl) 2015-05-05 2017-09-29 Inst Wysokich Ciśnień Polskiej Akademii Nauk Sposób wytwarzania implantu kostnego iimplant kostny
US20170056304A1 (en) * 2015-08-26 2017-03-02 Honeywell International Inc. Particulate hydroxyapatite compositions and methods for preparing the same
JPWO2018097198A1 (ja) * 2016-11-28 2019-10-17 株式会社バイオ未来工房 間葉系幹細胞の分離方法及びリン酸カルシウム類を含有する不織布の使用
CN108030960B (zh) * 2017-12-22 2021-04-13 重庆医科大学附属永川医院 一种促进骨创伤愈合的植入材料及其制备方法
JPWO2020196581A1 (ja) * 2019-03-26 2020-10-01
CN118354851A (zh) * 2022-03-17 2024-07-16 武礼伟仁株式会社 一种将羟基磷灰石涂敷到无纺布上的装置及其方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0517111A (ja) 1991-02-21 1993-01-26 Ricoh Co Ltd 水酸アパタイト超微粒子
JPH115751A (ja) * 1997-04-24 1999-01-12 Takeda Chem Ind Ltd アパタイト被覆固形組成物およびその製造法
JP2000005298A (ja) * 1998-06-17 2000-01-11 Natl Inst For Res In Inorg Mater アパタイトコーティング有機材料の製造方法
JP2002137910A (ja) 2000-10-31 2002-05-14 Japan Science & Technology Corp ハイドロキシアパタイトナノ粒子およびその製造方法
JP2003310256A (ja) * 2002-02-25 2003-11-05 Pentax Corp 細胞培養担体および細胞培養方法
JP2004051952A (ja) 2002-05-30 2004-02-19 Japan Science & Technology Corp ハイドロキシアパタイト複合体およびその製造方法、ならびに、それを用いた医療用材料
JP2004167202A (ja) * 2002-11-21 2004-06-17 Hajime Ogushi 血管新生を目的とする移植材料及びその製造方法
JP2004210848A (ja) * 2002-12-27 2004-07-29 Trial Corp 被覆粒子の製造方法
WO2004075939A1 (ja) * 2003-02-26 2004-09-10 Trial Corporation 生分解性樹脂及びリン酸カルシウムを含む再生医療用材料及びその製造方法
JP2005279138A (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 内部に多孔構造を有する球状生体内分解性高分子／セラミックス複合体及びその製造方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69821510T2 (de) * 1997-04-24 2004-06-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Mit apatit beschichtete feste zusammensetzung
AU2001266338B8 (en) 2000-06-27 2006-12-14 Anges Mg, Inc. Pharmaceutical compositions for angiogenic therapy
KR20030034177A (ko) * 2000-09-13 2003-05-01 쥬가이 세이야쿠 가부시키가이샤 허혈성 질환 치료제
DE10307925A1 (de) * 2002-02-25 2003-09-04 Pentax Corp Träger für eine Zellkultur und Verfahren zur Kultivierung von Zellen
US20090291087A1 (en) * 2002-03-21 2009-11-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modulating angiogenesis
WO2003088925A2 (en) 2002-04-18 2003-10-30 Carnegie Mellon University Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefor in delivery of nucleic acids
US7435592B2 (en) * 2003-05-13 2008-10-14 Immunovative Therapies, Ltd. Compositions for allogeneic cell therapy
JP4717336B2 (ja) * 2003-08-06 2011-07-06 グンゼ株式会社 骨再生用基材およびその製造法
FI120333B (fi) * 2003-08-20 2009-09-30 Bioretec Oy Huokoinen lääketieteellinen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi
JP2006006125A (ja) * 2004-06-22 2006-01-12 Nipro Corp 骨髄単核細胞の調製方法及び細胞調製装置
JP5043436B2 (ja) * 2004-09-14 2012-10-10 独立行政法人科学技術振興機構 セラミック粒子群およびその製造方法並びにその利用
JP4570445B2 (ja) * 2004-11-04 2010-10-27 独立行政法人科学技術振興機構 ハイブリット複合体を表面に備える体内留置型医療用デバイスの製造方法
JP2010502372A (ja) * 2006-09-08 2010-01-28 シンフォニー メディカル， インコーポレイテッド 心臓の局所的な異常の治療のための心筋内パターン形成
JP2008126005A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 Osaka Industrial Promotion Organization 細胞組織体−ハイドロキシアパタイト複合体の安全な調製法
WO2008142862A1 (ja) * 2007-05-18 2008-11-27 National University Corporation Asahikawa Medical College 血管内皮前駆細胞の移植による抗がん療法
KR101297037B1 (ko) 2010-03-26 2013-08-14 숙명여자대학교산학협력단 혈관신생촉진용 펩타이드 및 이의 용도
KR101234807B1 (ko) 2010-08-18 2013-02-19 한국원자력의학원 혈관신생 촉진용 약학 조성물 및 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0517111A (ja) 1991-02-21 1993-01-26 Ricoh Co Ltd 水酸アパタイト超微粒子
JPH115751A (ja) * 1997-04-24 1999-01-12 Takeda Chem Ind Ltd アパタイト被覆固形組成物およびその製造法
JP2000005298A (ja) * 1998-06-17 2000-01-11 Natl Inst For Res In Inorg Mater アパタイトコーティング有機材料の製造方法
JP2002137910A (ja) 2000-10-31 2002-05-14 Japan Science & Technology Corp ハイドロキシアパタイトナノ粒子およびその製造方法
JP2003310256A (ja) * 2002-02-25 2003-11-05 Pentax Corp 細胞培養担体および細胞培養方法
JP2004051952A (ja) 2002-05-30 2004-02-19 Japan Science & Technology Corp ハイドロキシアパタイト複合体およびその製造方法、ならびに、それを用いた医療用材料
JP2004167202A (ja) * 2002-11-21 2004-06-17 Hajime Ogushi 血管新生を目的とする移植材料及びその製造方法
JP2004210848A (ja) * 2002-12-27 2004-07-29 Trial Corp 被覆粒子の製造方法
WO2004075939A1 (ja) * 2003-02-26 2004-09-10 Trial Corporation 生分解性樹脂及びリン酸カルシウムを含む再生医療用材料及びその製造方法
JP2005279138A (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 内部に多孔構造を有する球状生体内分解性高分子／セラミックス複合体及びその製造方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CIRCULATION, vol. 109, 2004, pages 1543 - 1549
CURR. OPIN. MOL. THER., vol. 4, 2002, pages 395 - 402
HYPERTENSION, vol. 46, 2005, pages 7 - 18
J. BIOMATER. SCI., POLYM. EDS., vol. 16, 2005, pages 893 - 902
J. CARDIOVASC PHARMACOL THER., vol. 12, 2007, pages 89 - 97
J. THORAC. CARDIOVASC. SURG., vol. 124, 2002, pages 50 - 56
JOURNAL OF JAPANESE SOCIETY FOR DIALYSIS THERAPY, vol. 37, 2004, pages 1493 - 1501
LANCET, vol. 360, 2002, pages 427 - 435
SCIENCE, vol. 275, 1997, pages 964 - 967
See also references of EP2298365A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017127798A (ja) * 2016-01-18 2017-07-27 日東紡績株式会社 ハイドロキシアパタイト粒子が付着した基材及びその製造方法

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Publication number Publication date
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