WO2009157702A2 - 폴리락테이트와 그 공중합체 생성능이 개선된 변이 미생물을 이용한 폴리락테이트와 그 공중합체의 제조방법 - Google Patents

폴리락테이트와 그 공중합체 생성능이 개선된 변이 미생물을 이용한 폴리락테이트와 그 공중합체의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • Polylatate is a representative biodegradable polymer derived from lactate and is a polymer having high applicability as a general purpose polymer or a medical polymer.
  • PLA is produced by polymerizing lactate produced by microbial fermentation, but only low molecular weight (1000-5000 Daltons) PLA is produced by the direct polymerization of lactate.
  • polyhydroxyalkanoate is a polyester (microorganisms) that accumulate inside as energy or carbon source storage material when there is an excessive carbon source and lack of other nutrients such as phosphorus, nitrogen, magnesium and oxygen. polyester). PHA is regarded as a material to replace conventional synthetic plastics because it has properties similar to synthetic polymers derived from petroleum and shows complete biodegradability.
  • the present invention provides for the production of mutant microorganisms in which one or more genes involved in the production pathways of coenzyme donors and lactates have been genetically engineered for increased production of coenzyme donors and lactates; Culturing the mutant microorganism in a medium comprising glucose or glucose and hydroxyalkanoate; It is intended to provide a method for preparing a polylactate or hydroxyalkanoate-lactate copolymer comprising recovering a polylactate or hydroxyalkanoate-lactate copolymer from the mutant microorganism.
  • the coenzyme A donor may be acetylcoenzyme A.
  • acetylcoenzyme A is likely to be a coenzyme donor among the metabolic pathways of microorganisms that synthesize lactate using glucose.
  • the enzyme involved in the production pathway of acetate may be, for example, acetate kinase, and the gene encoding the enzyme may be ackA .
  • the enzyme involved in the main production pathway of ethanol may be, for example, acetaldehyde dehydrogenase, the gene encoding the enzyme may be adhE .
  • the enzyme involved in the consuming reaction of phosphoenolpyruvate may be, for example, phosphoenolpyruvate carboxylase, encoding the enzyme
  • the gene may be ppc .
  • the enzyme involved in the conversion of pyruvate to lactate may be, for example, lactate dehydrogenase, and the gene encoding the enzyme may be ldhA . .
  • the mutant microorganism is inactivated gene encoding the enzyme involved in the production path of acetate (acetate) and at the same time involved in the consumption reaction of phosphoenolpyruvate (phosphoenolpyruvate)
  • the gene encoding the enzyme is inactivated and the gene encoding the enzyme involved in the conversion from pyruvate to lactate may be amplified.
  • the mutant microorganism is an enzyme that inactivates a gene encoding an enzyme involved in the production pathway of acetate and converts acetate to acetyl CoA.
  • Gene encoding the gene is amplified and at the same time the gene encoding the enzyme involved in the depletion reaction of phosphoenolpyruvate is inactivated and the conversion from pyruvate to lactate The gene encoding the enzyme involved in the may be amplified.
  • the amplification of the gene may be by substitution of a native promoter with a strong promoter.
  • potent promoters include trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter and the like.
  • the mutant microorganism may be further manipulated to increase pyruvate.
  • Pyruvate is a common precursor of acetyl coenzyme A and lactate, one of the coenzyme A donors. As pyruvate increases, the amount of acetyl coenzyme A and lactate increases.
  • the mutant microorganism may be one in which one or more of the following genes are further weakened or inactivated so that pyruvate is increased: aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, tpiA, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, fumA, fumB, fumC, eptB, gpmA, gpmB, ptsG, mdh, ppc, pgi, glgC, sucA, sucB, ribA, folE, pflB etc.
  • a gene encoding pyruvate dehydrogenase which converts pyruvate to acetyl coenzyme A, aceE, aceF, lpdA, or a gene encoding pyruvate formate lyase, which converts pyruvate to formate.
  • Attenuating or inactivating phosphorus pflB increases pyruvate and increases the amount of acetylcoenzyme A and lactate.
  • the metabolic flow from malate to pyruvate can also be enhanced by attenuating or inactivating the mdh , a gene encoding malate dehydrogenase that converts malate to oxaloacetate.
  • ptsG a gene encoding one of the groups of phosphotransferase enzymes that consume glucose while consuming phosphoenolpyruvate, a precursor of pyruvate, is converted from pyruvate to glucose.
  • Metabolic flow to pyruvate can be increased by attenuating or inactivating tpiA , a gene encoding trios phosphate isomerase, which converts glyceraldehyde 3-phosphate to dihydroxy acetone phosphate during glycolysis .
  • polylactate When the mutant microorganism is cultured in a medium containing glucose, polylactate may be obtained from the microorganism, and when the mutant microorganism is cultured in a medium containing glucose and hydroxyalkanoate, hydroxyalkanoate-lock may be obtained from the microorganism.
  • Tate copolymers can be obtained.
  • the kind of hydroxyalkanoate-lactate copolymer obtained may vary depending on the kind of hydroxyalkanoate to be included in the medium.
  • the hydroxyalkanoate is 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxybutyrate, 4-hydroxybutyrate, carbon number (D) -3-hydroxycarboxylic acid, 2-hydroxypropionic acid, 3-hydroxypropionic acid (3) -hydroxypropionic acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyheptanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxynonanoic acid (3-hydroxynonanoic acid), 3-hydroxydecanoic acid, 3-hydroxyundecanoic acid, 3-hydroxydodecanoic acid, 3-hydroxy 3-hydroxytetradecanoic acid, 3-hydroxyhexadecanoic acid, 4-hydroxy valeric acid (4-hydroxyvaleric acid), 4-hydroxyhexanoic acid, 4-hydroxyheptanoic acid, 4-hydroxyoctanoic acid, 4-hydroxy 4-hydroxydecanoic acid, 5-hydroxyvaleric acid, 5-hydroxyhexanoic acid, 6-hydroxydodecanoic acid, 3 3-hydroxy-4
  • E. coli XL1-Blue is a gene encoding an enzyme involved in the production of acetate ackA Or a gene encoding an enzyme involved in the production pathway of ethanol.
  • adhE Is a gene encoding an enzyme that inactivates or reconverts acetate to acetyl coenzyme A.
  • ac A gene that encodes an enzyme that is involved in the consuming reaction of phosphoenolpyruvate.
  • ppc Gene that encodes an enzyme that inactivates or is involved in the conversion of pyruvate to lactate.
  • ldhA Mutant Escherichia coli which efficiently produces polylactate or its copolymer by transforming E.
  • pMlocX vectors [lee, KH, Park, JH, Kim, TY, Kim, HU & Lee, SY Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production for deletion of the ackA gene. Molecular systems biology 3 , 149 (2007)] as a template was carried out by the first PCR with the primers of SEQ ID NO: 1 and 3. Using the obtained DNA fragment as a template, secondary primer extension PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 2 and 4. DNA fragments obtained by secondary PCR were obtained and electroporated into competent cells of XL1-Blue and XL1-Blue mutant strains expressing lambda red recombinase. The ackA gene deletion mutant strain was prepared by electroporation. Colony PCR was performed with primers of SEQ ID NOs: 5 and 6 to confirm ackA gene deletion.
  • primers of SEQ ID NOS: 7 and 9, 8, and 10 were sequentially used in the same manner for the deletion of the ppc gene, and the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 were used to confirm the deletion.
  • primers of SEQ ID NOs: 13 and 15, 14, and 16 were used sequentially in the same manner for deletion of the adhE gene, and primers of SEQ ID NOs: 17 and 18 were used to confirm the deletion.
  • primers of SEQ ID NOs: 27 and 30, 28, 31, 29, and 32 were sequentially used in the same manner for the ldhA gene to be replaced with the trc promoter of the native gene. Primers were used.
  • Table 1 shows the chromosomal DNA characteristics of mutant strains derived from E. coli XL1-Blue prepared by the above method.
  • Pseudomonas sp To isolate PHA synthase (phaC1 Ps6-19 ) gene from 6-19 (KCTC 11027BP), Pseudomonas sp. Extracting the entire DNA of 6-19, constructing primers with base sequences of SEQ ID NOs: 35 and 36 based on the phaC1 Ps6-19 gene sequence (Song Ae-jin, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004) PCR was performed to obtain the phaC1 Ps6-19 gene. PCR reaction was performed on agarose gel electrophoresis to identify a 1.7 kbp gene segment corresponding to the phaC1 Ps6-19 gene.
  • phaC1 Ps6-19 synthase For the expression of phaC1 Ps6-19 synthase, an operon-type constitutive expression system in which a monomer feed enzyme and a synthetase are expressed is introduced.
  • DNA fragments containing PHB-producing operons from Ralstonia eutropha H16 from pSYL105 vector were digested with BamHI / EcoRI and BamHI from pBluescript II (Stratagene) PReCAB recombinant vector was prepared by inserting in / EcoRI recognition site.
  • the pReCAB vector is known to express PHA synthase (phaC RE ) and monomer feeder enzymes (phaA RE & phaB RE ) at all times by the PHB operon promoter and to work well in Escherichia coli (Lee et al ., Biotech. Bioeng . , 1994, 44: 1337-1347.
  • the pReCAB vector was digested with BstBI / SbfI to remove R.eutropha H16 PHA synthase (phaC RE ), and then the pPs619C1-ReAB recombinant vector was prepared by inserting the phaC1 Ps6-19 gene obtained above into the BstBI / SbfI recognition site. .
  • the BstBI position which is inherent in the BstBI / SbfI recognition region, was first removed without using amino acid conversion by the SDM (site directed mutagenesis) method.
  • the overlapping PCR was performed using primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 37 and 38, SEQ ID NOs: 39 and 40, SEQ ID NO: 41, and SEQ ID NO: 42 to add a site.
  • PPs619C1-ReAB recombinant vector was transformed into E. coli XL-1Blue (Stratagene) to confirm PHB synthesis of the phaC1 Ps6-19 synthase , and this was detected by PHB detection medium (LB agar, glucose 20g / L, Nile red). At 0.5 ⁇ g / ml), no PHB production was observed.
  • 3HB-CoA is generated from glucose by the monomer supply enzymes phaA RE and phaB RE , and phaC1 Ps6-19 synthase SCL variants (phaC1 Ps6-19 200 & phaC1 Ps6-19 300) are used as the substrates. Is synthesized.
  • propionyl-CoA transferase for providing lactyl-CoA which is a monomer necessary for synthesizing PLA and PLA copolymers, is derived from Clostridium propionicum
  • Propionyl-CoA transferase CP-PCT
  • cp-pct used a fragment obtained by PCR chromosomal DNA of Clostridium propionicum using primers SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50.
  • the Nde I site originally present in the wild type CP-PCT was removed using the SDM method for ease of cloning.
  • overlapping PCR was performed using primers having nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 51 and 52 to add Sbf I / Nde I recognition sites.
  • phaC1 Ps6-19 synthase remove the SCL mutant of phaC1 Ps6-19 300 a pPs619C1300-ReAB by cutting the vector with Sbf I / Nde I Ralstonia eutrophus H16 monomer feed enzymes (phaA RE & phaB RE) of origin containing the following, the The pPs619C1300-CPPCT recombinant vector was prepared by inserting the PCR cloned CP-PCT gene into the Sbf I / Nde I recognition site.
  • CP-PCT is known to be highly toxic due to severe metabolic disorders when expressed in E. coli.
  • the expression of CP-PCT by IPTG using the tac promoter or T7 promoter, which is widely used for expression of recombinant proteins, is recombined simultaneously with the addition of inducers. E. coli all died.
  • Clostridium propionicum propionate CoA transferase variants that can efficiently provide lactyl-CoA.
  • pPs619C1300-CPPCT prepared in 1-2-1 above was used as a template, Mn 2+ was added using primers SEQ ID NOs: 53 and 54, and dNTPs Error-prone PCR was performed in the presence of a difference in concentration.
  • PCR was performed under normal conditions using the primers of SEQ ID NOs: 53 and 54 to amplify the PCR fragment containing the random mutation.
  • phaC1 Ps6-19 synthase SCL mutant of phaC1 by cutting a pPs619C1300-CPPCT vector containing Ps6-19 300 with Sbf I / Nde I to remove the wild-type cp-pct, the amplified mutant PCR fragment Sbf I / Nde I
  • a ligation mixture was inserted into the recognition site and introduced into E. coli JM109 to produce a CP-PCT library of ⁇ 10 ⁇ 5 scale.
  • the prepared CP-PCT library was grown for 3 days in a polymer detection medium (LB agar, glucose 20g / L, 3HB 1g / L, Nile red 0.5 ⁇ g / ml) and then screened to determine whether the polymer was produced.
  • a polymer detection medium LB agar, glucose 20g / L, 3HB 1g / L, Nile red 0.5 ⁇ g / ml
  • Female candidates were selected first. These candidates were subjected to liquid culture (LB agar, glucose 20g / L, 3HB 1g / L, ampicillin 100mg / L, 37 ° C) for 4 days under conditions in which the polymers were produced, and FACS (Florescence Activated Cell Sorting) analysis to analyze the final two individuals. Selected.
  • CP-PCT Variant 512 Based on the final selected mutants (CP-PCT Variant 512, CP-PCT Variant 522) random mutations were performed again by the method of Error-prone PCR and CP-PCT as shown in Table 4 below. Variant 531-536 was obtained.
  • PCR was performed under normal conditions using the primers of SEQ ID NOs: 53 and 54 to amplify the PCR fragment containing the CpPct532 mutation.
  • the pPs619C1300-CPPCT vector Sbf I / Nde I was cut to remove the portion CPPCT, the amplified PCR fragments CpPct532 Sbf I / Nde I made the ligation mixture was inserted into the recognition site to prepare a pPs619C1300-CPPCT532 vector.
  • the phaC1 Ps6-19 synthase variant (phaC1 Ps6-19 300) of the basis and using the SDM method using primers of SEQ ID NOS: 55 and 56 are E130D, S325T, S477R, and Q481M mutation made in the 1-2-1 PHA synthase variant (phaC1 Ps6-19 400) derived from Pseudomonas sp. 6-19 having the amino acid sequence was prepared.
  • the recombinant vector (pPs619C1400-CPPCT532) thus obtained was transformed into E. coli JM109, which was then transformed into 3HB-containing polymer detection medium (LB agar, glucose 20g / L, 3HB 2g / L, Nile red 0.5 ⁇ g / ml). As a result of the growth, the formation of the polymer was confirmed.
  • 3HB-containing polymer detection medium LB agar, glucose 20g / L, 3HB 2g / L, Nile red 0.5 ⁇ g / ml
  • PHA synthase is very important.
  • phaC1 Ps6-19 synthase variant (phaC1 Ps6-19 300) prepared in 1-2-1, E130D and S477F using the SDM method using the primers SEQ ID NO: 57 and 58, 59, 60
  • a PHA synthase variant (phaC1 Ps6-19 310) derived from Pseudomonas genus 6-19 having an amino acid sequence with Q481K mutation.
  • the recombinant vector (pPs619C1310-CPPCT532) thus obtained was transformed into E. coli JM109, and then transformed into a polymer detection medium containing 3HB (LB agar, glucose 20g / L, 3HB 2g / L, Nile red 0.5 ⁇ g / ml). As a result of the growth, the formation of the polymer was confirmed.
  • 3HB LB agar, glucose 20g / L, 3HB 2g / L, Nile red 0.5 ⁇ g / ml
  • the mutant microorganisms were selected in LB plate medium to which 10 g / ml tetracycline, 100 g / ml ampicillin and 20 g / l glucose were added. This transformed strain was inoculated in 10 ml LB medium and pre-cultured at 30 ° C. for 12 hours.
  • the XB / p400-532 strain is a strain into which the pPs619C1400-CPPCT532 vector is introduced without manipulating the metabolic flow of Escherichia coli XL1-Blue.
  • Table 5 shows the results of the polymer production according to the culture volume conditions of the XB / p400-532 strain.
  • flask culture was performed with a culture volume of 50 ml and 100 ml.
  • Table 6 shows the results of the polymer production according to the culture volume conditions of the XB / p400-532 strain and the mutant microorganism JLX7 / p400-532 of the present invention.
  • the increase and control of the LA fraction is a major factor in the improvement of the strain.
  • the LA fraction increased approximately 3.46 times from 14.32 mol% to 49.55 mol% when incubated at 50 ml of culture volume, whereas it increased by 1.58 times from 40.45 mol% to 63.95 mol% when incubated with 100 ml of culture volume. Although the increase was low, the absolute value of the LA fraction was the highest (63.95 mol%). In other words, for 50 ml of culture, the increase was relatively high but did not exceed the value (63.95 mol%) in the 100 ml culture at the level of 50 mol%. This means that, together with metabolic engineering at the genetic level, culture conditions are also regulatory factors that need to be optimized for the production of PLA and its copolymers.
  • the combination of genetic mutations applied to the mutant microorganisms of the present invention was confirmed to have an effect on the increase in polymer production capacity.
  • the basal medium was supplied with 20 g / l of glucose as a carbon source, 10 ⁇ g / ml of tetracycline as a carbon source, 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 10 ⁇ g / ml of thiamin as a carbon source.
  • 2 g / l of DL-3-hydroxybutyrate sodium salt (ACROS) was supplied once (M20 for p310-532) to twice (M18 for p400-532) at the beginning of the culture, and 72 rpm at 30 ° C. at 200 rpm. Time incubation.
  • Table 7 shows the polymer production capacity of the mutant microorganisms introduced with p400-532 vector, respectively, using the XB wild type and JLX1, JLX2, JLX3, JLX4, JLX5, JLX6, JLX7 strains as the host strains.
  • Table 8 shows the polymer production capacity of the mutant microorganisms introduced p310-532 vector using the XB wild type and JLX1, JLX2, JLX3, JLX4, JLX5, JLX6, JLX7, JLX8 strains of Table 1 as host strains, respectively.
  • the production of the polymer is affected by both the metabolic flow of the host strain and the activity of the enzymes that directly affect the polymer production. Therefore, as can be seen in Tables 7 and 8, even in the same host cell, it can be seen that the LA fraction, polymer content, etc. in the produced polymer vary depending on the applied enzyme activity, and nevertheless, overall, JLX5, JLX7 or JLX8 In the case of the strain it was found that the polymer generating ability is always excellent.
  • 3-hydroxybutyrate (3HB) feed amount was adjusted to examine its production capacity.
  • Table 9 shows the polymer production capacity according to the 3HB feed (0, 0.5, 1, 2, 4, 8g / l) when using the XB wild-type and JLX7 strain as a host strain and introducing the p400-532 vector.
  • Table 10 shows the polymer production capacity according to the 3HB feed (0, 0.5, 1, 2, 4g / l) when using the XB wild-type and JLX7, JLX8, JLX9 strain as a host strain and introducing the p310-532 vector.
  • JLX 7 in which the host cell is XB wild-type, fails to produce P (3HB-co-LA) copolymer with PLA homopolymer and at least 50 mol% LA.
  • P (3HB-co-LA) copolymer in which the host cell is XB wild-type, fails to produce P (3HB-co-LA) copolymer with PLA homopolymer and at least 50 mol% LA.
  • JLX8 or JLX9 3-10 wt% of PLA homopolymer was produced, and 13-65 wt% of P (3HB-co-LA) copolymer having LA of 50-86 mol%.

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Abstract

본 발명은 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성의 증가를 위해 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성 경로에 관여하는 유전자가 유전공학적으로 조작되어 있는 변이 미생물을 이용하여 폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 미생물의 대사 경로 중에 코엔자임 에이 공여체와 락테이트의 양을 동시에 증가시킴으로써 폴리락테이트와 락테이트 함량이 높은 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 효율적으로 생합성할 수 있어 산업적으로 유용하다.

Description

폴리락테이트와 그 공중합체 생성능이 개선된 변이 미생물을 이용한 폴리락테이트와 그 공중합체의 제조방법
본 발명은 폴리락테이트와 그 공중합체 생성능이 개선된 변이 미생물을 이용한 폴리락테이트와 그 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
폴리락테이트(polylatate, PLA)는 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 사슬연결제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 사슬연결제를 이용하기 때문에 고분자량의 PLA를 제조하는 방법은 유기용제(solvent)나 사슬연결제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어 있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
한편, 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(PHA synthase)가 필수적이다.
PHA 합성효소는 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 기질로 사용하여 PHA를 합성한다. 그러나 2번-탄소위치에 수산화(hydroxylation)된 락테이트와 같은 하이드록시알카노에이트는 PHA 합성효소의 기질특이성에 적합하지 않아, 자연적으로 혹은 재조합 세포나 식물을 이용하여 PLA 및 그 공중합체를 제조한 예는 없었다. 이에, 본 발명자들은 락틸-CoA를 제공하기 위하여 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제와 이를 기질로 이용하는 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체를 사용하여 성공적으로 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 수 있었다(대한민국 특허출원 제10-2005-0043798호).
하지만 기존에 개발된 미생물의 PLA 및 PLA공중합체의 생성 효율은 아직까지 낮은 편이어서 PLA 및 PLA공중합체 생성능이 보다 좋은 미생물의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 효율적으로 생산해 내는 변이 미생물을 이용하여 폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성의 증가를 위해 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 유전공학적으로 조작되어 있는 변이 미생물을 이용하여 폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따르면 미생물의 대사 경로 중에 락테이트와 코엔자임 에이 공여체의 양을 동시에 증가시킴으로써 폴리락테이트와 락테이트 함량이 높은 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 효율적으로 생합성할 수 있어 산업적으로 유용하다.
도 1은 ackA, adhE, acs, ppc 또는 ldhA 유전자를 불활성화 또는 증폭시켜 폴리락테이트와 그 공중합체 생성능을 높인 변이 미생물의 내부 대사 경로를 나타낸 것이다.
폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 효율적으로 합성하기 위해서는 폴리락테이트의 단량체인 락틸 CoA의 생성을 증가시켜야 한다. 이를 위해서는 락틸 CoA의 생합성에 필요한 코엔자임 에이 공여체의 양이 증가되고 이와 동시에 주요 전구 기질인 락테이트의 양이 증가되도록 미생물의 대사 흐름이 변경될 필요가 있다. 코엔자임 에이 공여체나 락테이트 중 어느 하나의 양이 증가한다고 해서 락틸 CoA의 생합성 효율이 크게 증진되지는 않는다. 따라서 본 발명에서는 미생물의 대사 과정 중 코엔자임 에이 공여체와 락테이트의 양을 동시에 증가시켜 폴리락테이트 또는 그의 공중합체의 생합성 효율을 높이고, 고분자 내의 락테이트 함량을 높이고자 한다.
락테이트(lactate)의 공급에는 외부에서 락테이트를 공급해주어 락테이트 트랜스포터(lactate transporter)를 통해 세포 내로 들어가게 하는 방법과 혐기 조건에서 포도당(glucose)으로부터 생성되는 세포 내 락테이트를 이용하게 하는 방법이 있다. 외부에서 공급해주는 경우는 락테이트의 받아들임(uptake)이 제한이 될 수 있다. 또한, 세포 밖에서 공급된 락테이트는 대장균의 세포막에 존재하는 D-락테이트 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase)와 L-락테이트 탈수소화 효소(L-lactate dehydrogenase)에 의해 파이루베이트로 전환되면서 세포 안으로 전달되는데, 이는 락틸 CoA의 생성을 증가시키고자 하는 본 발명의 목적에 적합하지 않다. 따라서 본 발명에서는 글루코스를 이용하여 락테이트를 생성하고 이로부터 락틸-CoA를 합성하는 경로를 선택하여, 락틸-CoA의 생성이 증가되도록 미생물의 대사 경로를 유전공학적으로 조작하고자 한다.
이를 위해, 본 발명은 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성의 증가를 위해 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 유전공학적으로 조작되어 있는 변이 미생물을 제조하고; 상기 변이 미생물을 글루코스 또는 글루코스와 하이드록시알카노에이트를 포함하는 배지 중에서 배양하고; 상기 변이 미생물로부터 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 회수하는 것을 포함하는 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 코엔자임에이 공여체는 아세틸코엔자임 에이일 수 있다. 코엔자임에이 공여체 중에서도 아세틸코엔자임 에이는 글루코스를 이용하여 락테이트를 합성하는 미생물의 대사 경로 중에서 코엔자임 공여체가 될 수 있는 가능성이 높다.
코엔자임 에이 공여체 중 하나인 아세틸 코엔자임 에이의 양을 증가시키기 위해, 미생물의 아세테이트(acetate)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 에탄올(ethanol)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 불활성화시키거나 아세테이트(acetate)를 아세틸 코엔자임 에이(Acetyl CoA)로 재전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 상기 유전자 중 둘 이상의 유전자를 불활성화 또는 증폭시킴으로써 아세틸 코엔자임 에이의 양을 보다 증가시킬 수도 있다.
락틸 CoA의 생성을 위해 코엔자임 에이를 제공해 줄 수 있는 코엔자임에이 공여체는 아세틸 코엔자임 에이 외에도 β-케토아디필-CoA(β-ketoadipyl-CoA), γ-부티로베타닐-CoA(γ-butyrobetainyl-CoA), (R)-메틸말로닐-CoA((R)-methylmalonyl-CoA), (S)-메틸-말로닐-CoA ((S)-methyl-malonyl-CoA), 2'-(5''-포스포리포실)-3'-디포스포-CoA (2'-(5''-phosphoribosyl)-3'-dephospho-CoA), 2'-(5''-트리포스포리포실)-3'-디포스포-CoA (2'-(5''-triphosphoribosyl)-3'-dephospho-CoA), 3,4-디하이드록시페닐아세틸-CoA(3,4-dihydroxyphenylacetyl-CoA), 3-하이드록시아디필-CoA(3-hydroxyadipyl-CoA), 3-하이드록시부티릴-CoA(3-hydroxybutyryl-CoA), 3-하이드록시페닐아세틸-CoA(3-hydroxyphenylacetyl-CoA), 3-메틸크로토닐-CoA(3-methylcrotonyl-CoA), 4-하이드록시페닐아세틸-CoA (4-hydroxyphenylacetyl-CoA), 페닐아세틸-CoA의 cis-디하이드로디오일 유도체 (cis-dihydrodiol derivative of phenylacetyl-CoA), Δ2-에노일-CoA (Δ2-enoyl-CoA), 2-trans-4-cis-디에노일-CoA (2-trans-4-cis-dienoyl-CoA), 3-하이드록시아실-CoA (3-hydroxyacyl-CoA), 3-케토아실-CoA (3-ketoacyl-CoA), cis-2-에노일-CoA (cis-2-enoyl-CoA), cis-3-에노일-CoA (cis-3-enoyl-CoA), trans-2-에노일-CoA (trans-2-enoyl-CoA), trans-3-에노일-CoA (trans-3-enoyl-CoA), cis-2,3-디하이드로아실-CoA(cis-2,3-dehydroacyl-CoA), D-3-디하이드록시아실-CoA(D-3-hydroxyacyl-CoA), 지방 아실 CoA(fatty acyl CoA), 장쇄 아실-CoA(long-chain acyl-CoA), trans,trans-Δ2-Δ4-디에노일-CoA(trans,trans-Δ2-Δ4-dienoyl-CoA), 고장쇄 지방 아실-CoA(very long chain fatty acyl-CoA), CoA 유도체(CoA derivative), 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA), 아세틸-CoA(acetyl-CoA), ω-카복시아실-CoA(ω-carboxyacyl-CoA), 아실-CoA(acyl-CoA), L-3-하이드록시아실-CoA(L-3-hydroxyacyl-CoA), 부티릴-CoA(butyryl-CoA), 코엔자임 A (CoA), 코엔자임-A-그룹 (CoA), 코마로일-CoA(coumaroyl-CoA), 크로토노베타닐-CoA(crotonobetainyl-CoA), 크로토닐-CoA(crotonyl-CoA), D-카니티닐-CoA(D-carnitinyl-CoA), 디포스포-CoA(dephospho-CoA), 포르밀-CoA(formyl-CoA), 이소발레릴-CoA(isovaleryl-CoA), L-카니티닐-CoA(L-carnitinyl-CoA), 말로닐-CoA(malonyl-CoA), O-숙시닐벤조일-CoA(O-succinylbenzoyl-CoA), 옥살릴-CoA(oxalyl-CoA), 팔미토일 CoA(palmitoyl CoA), 페닐아세틸-CoA(phenylacetyl-CoA), 피메로일-CoA(pimeloyl-CoA), 프로피오닐-CoA(propionyl-CoA), 숙시닐-CoA(succinyl-CoA), trans-Δ2, cis-Δ4-데카디에노일-CoA(trans-Δ2, cis-Δ4-decadienoyl-CoA), trans-Δ2-디세노일-CoA(trans-Δ2-decenoyl-CoA), 락틸 CoA(lactyl CoA) 등이 이용될 수 있다. 코엔자임 에이 공여체로서 아세틸 코엔자임 에이 이외의 것을 이용할 경우 이들 코엔자임 에이 공여체의 양의 증가를 위해 상기 불활성화 또는 증폭되는 유전자의 종류는 변화될 수 있을 것이다.
이와 동시에, 미생물의 대사 흐름 중 락테이트의 양을 증가시키기 위해, 미생물의 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 불활성화시키거나 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 상기 유전자 중 둘 이상의 유전자를 불활성화 또는 증폭시킴으로써 락테이트의 양을 보다 증가시킬 수도 있다. 일반적으로 혐기 조건에서 포도당으로부터 생성되는 세포 내 락테이트를 이용하기 위해서는 먼저 세포성장을 위해 호기 조건에서 충분히 키운 후, 락테이트 생성을 위해 혐기 조건이나 마이크로혐기 조건으로 변경시켜야 하나, 위와 같이 락테이트의 양이 증가되도록 유전자를 조작할 경우에는 1단계 배양만으로도 세포 성장과 함께 세포 내 락테이트를 이용한 고분자 생산이 동시에 이루어질 수 있는 효율적인 생산 시스템을 구축할 수 있게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 합성할 수 있는 미생물이면 어떠한 것이든 가능하다. 이러한 미생물로는 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 포함될 수 있다. 상기 박테리아로는 예를 들어 알칼리제네스(Alcaligenes)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리치아(Escherichia)속, 랄스토니아속(Ralstonia)속, 바실러스(Bacillus)속, 코리네박테리움 (Corynebacterium)속 등이 포함될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대장균 XL1-Blue를 유전공학적으로 조작한 변이 대장균을 개시하나, 본 발명의 미생물은 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 아세테이트의 생성 경로에 관여하는 효소는 예컨대, 아세테이트 키나아제(acetate kinase)일 수 있으며, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 ackA일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 에탄올의 주요 생성 경로에 관여하는 효소는 예컨대, 아세트알데히드 디하이드로게나아제(acetaldehyde dehydrogenase)일 수 있으며, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 adhE일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 아세테이트를 아세틸 코엔자임 에이로 재전환하는 효소는 예컨대, 아세틸 코엔자임 에이 합성효소(acetyl CoA synthetase)일 수 있으며, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 acs일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 포스포에놀파이루베이트의 소모 반응에 관여하는 효소는 예컨대, 포스포에놀파이루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase)일 수 있으며, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 ppc일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 파이루베이트에서 락테이트로의 전환에 관여하는 효소는 예컨대, 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)일 수 있으며, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 ldhA일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 변이 미생물은 아세테이트(acetate)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있고, 동시에 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있으며 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 변이 미생물은 아세테이트(acetate)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있고 아세테이트(acetate)를 아세틸 코엔자임 에이(Acetyl CoA)로 재전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있으며, 동시에 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있고 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있을 수 있다.
본 발명에 있어서, "불활성화"라 함은 유전자가 변이로 인해 전사되지 못하거나 전사된 mRNA가 본래의 단백질로 제대로 번역되지 못하는 것을 말한다. 유전자를 "불활성화"시키기 위해서는 유전자를 결실시키거나, 유전자의 핵산 서열에 변화를 일으켜 변이시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, "증폭"이라 함은 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 증가된 것을 말한다. 변이시키기 전의 미생물에 증폭시키고자 하는 유전자가 존재하지 않는 경우에는 하나 이상의 상기 유전자를 상기 미생물에 도입하여 증폭시킬 수 있고, 변이시키기 전의 미생물에 증폭시키고자 하는 유전자가 존재하는 경우에는 같은 방법으로 하나 이상의 유전자를 상기 미생물에 추가로 도입하거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 증가하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 예를 들어, 발현을 증폭시키는 유전자가 변이시키고자 하는 미생물 내에 존재하는 경우 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터를 강력 프로모터로 치환함으로써 상기 유전자의 발현을 증폭시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 유전자의 증폭은 고유 프로모터(native promoter)의 강력 프로모터(strong promoter)로의 치환에 의한 것일 수 있다. 이러한 강력 프로모터의 예로는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터 등이 포함된다.
상기 변이 미생물은 파이루베이트가 증가되도록 추가로 조작될 수 있다. 파이루베이트는 코엔자임 에이 공여체 중의 하나인 아세틸 코엔자임 에이와 락테이트의 공통적인 전구체로서, 파이루베이트가 증가하면 아세틸 코엔자임 에이와 락테이트의 양이 증가하게 된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 변이 미생물은 파이루베이트가 증가되도록 추가로 하나 이상의 하기 유전자들이 추가로 약화 또는 불활성화되어 있는 것일 수 있다: aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, tpiA, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, fumA, fumB, fumC, eptB, gpmA, gpmB, ptsG, mdh, ppc, pgi, glgC, sucA, sucB, ribA, folE, pflB 등. 예를 들어, 파이루베이트를 아세틸 코엔자임 에이로 전환시키는 파이루베이트 탈수소화효소를 코딩하는 유전자인 aceE, aceF, lpdA 또는 파이루베이트를 포르메이트로 전환시키는 파이루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 유전자인 pflB를 약화 또는 불활성화시키게 되면 파이루베이트가 증가하면서 아세틸코엔자임 에이와 락테이트의 양이 증가하게 된다. 또한, 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 말레이트 탈수소화효소를 코딩하는 유전자인 mdh를 약화 또는 불활성화시킴으로써 말레이트에서 파이루베이트로의 대사흐름을 강화시킬 수 있다. 다르게는 파이루베이트의 전구체인 포스포에놀파이루베이트를 소모하면서 포도당을 받아들이는 역할을 하는 포스포트랜스퍼라아제 효소군 중의 하나를 코딩하는 유전자인 ptsG나, 포도당으로부터 파이루베이트로 전환되는 해당과정 중 글라이세르알데하이드 3-포스페이트를 디하이드록시 아세톤 포스페이트로 전환시키는 트리오스 포스페이트 이성화효소를 코딩하는 유전자인 tpiA를 약화 또는 불활성시킴으로써 파이루베이트로의 대사흐름을 증가시킬수도 있다.
상기 변이 미생물을 글루코스를 포함하는 배지에서 배양하면 미생물로부터 폴리락테이트를 수득할 수 있으며, 상기 변이 미생물을 글루코스 및 하이드록시알카노에이트를 포함하는 배지 중에서 배양하면 미생물로부터 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 수득할 수 있게 된다. 배지에 포함시키는 하이드록시알카노에이트의 종류에 따라 수득되는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 종류는 달라질 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acid), 2-하이드록시프로피온산(2-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-4-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hexenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헵탄산(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methyl ester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propyl ester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzil ester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3, 12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시노난산(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-heptenoic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 대장균 XL1-Blue을 유전공학적으로 조작하여 폴리(D-락테이트)와 락테이트 함량이 높은 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-D-락테이트)를 효율적으로 생산하는 방법에 대하여 개시하고 있다. 본 발명의 방법에 따르면 이 외의 다양한 폴리(하이드록시알카노에이트-락테이트)를 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1: 폴리락테이트와 3-하이드록시부티레이트-락테이트 공중합체를 효율적으로 생성하는 변이 미생물의 제작
하기 실시예 1에서는 대장균 XL1-Blue에서 아세테이트의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 ackA 또는 에탄올의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 adhE를 불활성화시키거나 아세테이트를 아세틸 코엔자임 에이로 재전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 acs를 증폭시키고, 동시에 포스포에놀파이루베이트의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 ppc를 불활성화시키거나 파이루베이트에서 락테이트로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 ldhA를 증폭시키고, 위와 같이 변이시킨 대장균을 PHA 합성효소의 유전자와 프로피오닐-CoA-트랜스퍼라아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환함으로써 폴리락테이트 또는 그의 공중합체를 효율적으로 생산해 내는 변이 대장균을 제조하였다. 도 1은 ackA, adhE, acs, ppc 또는 ldhA 유전자를 불활성화 또는 증폭시켜 폴리락테이트와 그 공중합체 생성능을 높인 변이 미생물의 내부 대사 경로를 나타낸 것이다.
실시예 1-1: 아세틸-CoA 및 락테이트의 양이 증가된 변이 미생물의 제작
1-1-1: ackA, adhE 또는 ppc 유전자의 결실
대장균 XL1-Blue(Stratagene)에서 아래 프라이머들로 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000)을 이용하여, ackA, adhE 또는 ppc를 결실시켰다.
ackA 유전자의 결실을 위해pMlocX 벡터[lee, K.H., Park, J.H., Kim, T.Y., Kim, H.U. & Lee, S.Y. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production. Molecular systems biology 3, 149(2007)]를 주형으로 하여 서열번호 1 및 3의 프라이머로 1차 PCR을 수행하였다. 이때 얻어진 DNA 절편을 주형으로 하여 서열번호 2 및 4의 프라이머를 사용하여 2차 프라이머 연장 PCR을 수행하였다. 2차 PCR을 통해 얻어진 DNA 절편을 획득하여 람다 레드 리콤비네이즈(λ-red recombinase)가 발현된 XL1-Blue 및 XL1-Blue 유래의 돌연변이 균주들의 컴피턴트 세포(electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션(electroporation)하여 ackA 유전자 결실 돌연변이 균주를 제작하였다. ackA 유전자 결실의 확인을 위해 서열번호 5 및 6의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다.
또한, ppc 유전자의 결실을 위해 같은 방법으로 서열번호 7 및 9, 8 및 10의 프라이머가 순차적으로 사용되었고, 결실의 확인을 위해 서열번호 11 및 12의 프라이머가 사용되었다.
또한, adhE 유전자의 결실을 위해 같은 방법으로 서열번호 13 및 15, 14 및 16의 프라이머가 순차적으로 사용되었고, 결실의 확인을 위해 서열번호 17 및 18의 프라이머가 사용되었다.
1-1-2: acs 또는 ldhA 유전자의 증폭
상기 1-1-1에 기술한 바와 같이, one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000)을 이용하여, acs와 ldhA의 대장균 염색체 DNA 상의 각각의 고유 프로모터를 강력 프로모터의 하나인 trc 프로모터로 치환시켜 증폭하였다.
acs 유전자의 고유 프로모토의 trc 프로모터로의 치환을 위해, pMloxC 벡터를 주형으로 하여 서열번호 19 및 22의 프라이머로 1차 PCR을 수행하고, 이 때 얻어진 DNA 절편을 주형으로 서열번호 20 및 23의 프라이머로 2차 PCR을 수행하였다. 2차 PCR을 통해 얻어진 DNA 절편을 주형으로 서열번호 21 및 24의 프라이머로 3차 PCR을 수행하여 최후의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 람다 레드 리콤비네이즈(λ-red recombinase)가 발현된 XL1-Blue 및 XL1-Blue 유래의 돌연변이 균주들의 컴피턴트 세포(electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션(electroporation)하여 acs 유전자의 고유 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 돌연변이 균주를 제작하였다. acs 유전자의 프로모터 치환을 확인하기 위해 서열번호 25 및 26의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다.
또한, ldhA 유전자의 고유 유전자의 trc 프로모터로의 치환을 위해 같은 방법으로 서열번호 27 및 30, 28 및 31, 29 및 32의 프라이머가 순차적으로 사용되었고, 치환의 확인을 위해 서열번호 33 및 34의 프라이머가 사용되었다.
1-1-3: ackA , adhE , acs , ppc 또는 ldhA 가 불활성화 또는 증폭된 변이 미생물의 제조
상기 1-1-1 또는 1-1-2 의 과정을 통해, ackA, adhE, acs, ppc 또는 ldhA가 여러 조합으로 불활성화 또는 증폭된 변이 미생물 JLX1-9를 제작하였다.
표 1는 상기 방법으로 제작된 대장균 XL1-Blue 유래의 돌연변이 균주들의 염색체 DNA 특징을 나타낸 것이다.
표 1
Figure PCTKR2009003389-appb-T000001
실시예 1-2: PHA 합성효소의 유전자와 프로피오닐-CoA-트랜스퍼라아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
1-2-1. pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터의 제작
Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP) 유래의 PHA 합성효소(phaC1Ps6-19) 유전자를 분리하기 위해 Pseudomonas sp. 6-19의 전체 DNA를 추출하고, phaC1Ps6-19 유전자 서열(송애진, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)에 기반한 서열번호 35 및 36의 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하고, PCR을 수행하여 phaC1Ps6-19 유전자를 수득하였다.PCR 반응물을 아가로오스 젤 전기영동하여, phaC1Ps6-19 유전자에 해당하는 1.7kbp 크기의 유전자 절편을 확인하였다.
phaC1Ps6-19 합성효소의 발현을 위해서 단량체(monomer) 공급 효소와 합성효소가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템을 도입하였다.
pSYL105 벡터(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다.
pReCAB 벡터는 PHA 합성효소 (phaCRE)와 단량체 공급효소 (phaARE & phaBRE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현되며, 대장균에서도 잘 작동된다고 알려져 있다(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347). pReCAB 벡터를 BstBI/SbfI으로 절단하여 R.eutropha H16 PHA 합성효소 (phaCRE)를 제거한 다음, 상기에서 수득한 phaC1Ps6-19 유전자를 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 제조하였다.
BstBI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1Ps6-19 합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환 없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 37 및 38, 서열번호 39 및 40, 서열번호 41 및 서열번호 42의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
상기 phaC1Ps6-19 합성효소의 PHB 합성 여부를 확인하기 위해 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 E.coli XL-1Blue(Stratagene)에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육 시킨 결과 PHB 생성이 관찰되지 않았다.
SCL(short chain length) 활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳을 아미노산 서열 배열 분석을 통해 찾았고, 서열번호 43 내지 48의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 하기 표 2과 같은 phaC1Ps6-19 합성효소 변이체들을 만들었다.
표 2
Figure PCTKR2009003389-appb-T000002
이들 재조합 벡터를 E.coli XL-1Blue에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지 (LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시켰다. 그 결과, pPs619C1200-ReAB로 형질전환된 E.coli XL-1Blue와 pPs619C1300-ReAB로 형질전환된 E.coli XL-1Blue에서 모두 PHB 생성을 확인할 수 있었다.
즉, 단량체 공급효소인 phaARE와 phaBRE 에 의해 글루코스로부터 3HB-CoA가 생성되고, 이를 기질로 하여 phaC1Ps6-19 합성효소 SCL 변이체들(phaC1Ps6-19200 & phaC1Ps6-19300)이 PHB를 합성한 것이다.
여기에 PLA 및 PLA 공중합체 합성시 필요한 단량체인 락틸-CoA를 제공하기 위한 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 구축하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(CP-PCT)를 사용하였다.
cp-pct는 Clostridium propionicum의 염색체 DNA를 서열번호 49 및 서열번호 50의 프라이머를 이용하여 PCR하여 얻어진 단편을 사용하였다. 이 때, 원래 야생형 CP-PCT에 존재하는 NdeI site를 cloning의 용이성을 위해 SDM방법을 이용하여 제거하였다. 또한, SbfI/NdeI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 51과 52의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.
phaC1Ps6-19 합성효소 SCL 변이체인 phaC1Ps6-19300를 함유한 pPs619C1300-ReAB 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 Ralstonia eutrophus H16 유래의 단량체 공급효소 (phaARE & phaBRE)를 제거한 다음, 상기 PCR 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제조하였다.
1-2-2. pPs619C1300-CPPCT532 재조합 벡터의 제작
CP-PCT의 경우 대장균에서 고발현될 경우 심각한 대사 장애를 일으켜 독성을 나타낸다고 알려져 있는데, 일반적으로 재조합 단백질 발현에 널리 사용되는 tac 프로모터나 T7 프로모터를 사용한 IPTG에 의한 발현유도 시스템에서는 유도제 첨가와 동시에 재조합 대장균이 모두 사멸하였다.
따라서 lactyl-CoA를 효율적으로 제공할 수 있는 Clostridium propionicum propionate CoA transferase 변이체의 개발이 필요하다.
이를 위해 약하게 발현되지만 미생물 성장에 따라 지속적으로 발현되는 항시적 발현 시스템을 사용하여 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성에 성공하였다.
cp-pct에 무작위적 돌연변이(random mutagenesis)를 도입하기 위해 상기 1-2-1에서 제작된 pPs619C1300-CPPCT을 주형으로 하고, 서열번호 53 및 54의 프라이머를 이용하여 Mn2+이 첨가되고 dNTPs의 농도 차이가 존재하는 조건에서 Error-prone PCR을 실시하였다.
그 후, 무작위적 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 서열번호 53 및 54의 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다.
phaC1Ps6-19 합성효소 SCL 변이체인 phaC1Ps6-19300를 함유한 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 야생형 cp-pct를 제거한 후, 상기 증폭된 돌연변이 PCR 단편을 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 E. coli JM109에 도입하여 ~10^5 정도 규모의 CP-PCT 라이브러리를 제작하였다.
상기 제작된 CP-PCT 라이브러리는 고분자 검출 배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일간 생육 시킨 후 고분자 생성 여부를 확인하는 스크리닝 작업을 수행하여 80여 개체의 후보를 1차 선정하였다. 이들 후보를 고분자가 생성되는 조건에서 4일간 액체 배양(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, ampicillin 100mg/L, 37℃)하였고, FACS(Florescence Activated Cell Sorting) 분석하여 최종 2개체를 선정하였다.
상기 제작된 CP-PCT 변이체의 돌연변이 위치를 찾기 위해 유전자 염기 서열을 분석하였고 그 결과는 다음 표 3과 같다.
표 3
Figure PCTKR2009003389-appb-T000003
상기 최종 선별된 돌연변이체들(CP-PCT Variant 512, CP-PCT Variant 522)을 기본으로 다시 상기 Error-prone PCR의 방법으로 무작위적 돌연변이를 수행하였고 하기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같은 CP-PCT 변이체 531-536을 얻었다.
표 4
Figure PCTKR2009003389-appb-T000004
그 후, CpPct532 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 서열번호 53 및 54의 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. 상기 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 CPPCT 부분을 제거한 후, 상기 증폭된 CpPct532 PCR 단편을 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 pPs619C1300-CPPCT532 벡터를 제조하였다.
1-2-3. pPs619C1400-CPPCT532 (p400-532) 재조합 벡터의 제작
락틸-CoA를 효율적으로 이용하지 못하는 PHA 합성효소를 이용하여 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 때에는 합성효율이 매우 낮을 수 밖에 없기 때문에 PLA 및 PLA 공중합체를 합성하기 위해서는 락틸-CoA를 효율적으로 이용할 수 있는 PHA 합성효소가 매우 중요하다 할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 슈도모나스 속 6-19 (Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체를 사용하여, 락틸-CoA를 기질로 사용하여 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체를 고효율로 제조할 수 있는 시스템을 발명하였다.
상기 1-2-1에서 제작된 phaC1Ps6-19 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19300)를 기초로 하여 서열번호 55 및 56의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 E130D, S325T, S477R 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열을 가진 Pseudomonas 속 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19400)를 제작하였다.
이로부터 얻은 재조합 벡터(pPs619C1400-CPPCT532)를 E.coli JM109에 형질전환 시키고, 이를 3HB가 포함된 중합체 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 2g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육 시킨 결과, 중합체 생성을 확인할 수 있었다.
1-2-4. pPs619C1310-CPPCT532 (p310-532) 재조합 벡터의 제작
락틸-CoA를 효율적으로 이용하지 못하는 PHA 합성효소를 이용하여 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 때에는 합성효율이 매우 낮을 수 밖에 없기 때문에 PLA 및 PLA 공중합체를 합성하기 위해서는 락틸-CoA를 효율적으로 이용할 수 있는 PHA 합성효소가 매우 중요하다 할 수 있다. 이에, 상기 1-2-1에서 제작된 phaC1Ps6-19 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19300)를 기초로 하여 서열번호 57 및 58, 59, 60의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 E130D, S477F 및 Q481K이 변이된 아미노산 서열을 가진 Pseudomonas 속 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19310)를 제작하였다.
이로부터 얻은 재조합 벡터(pPs619C1310-CPPCT532)를 E.coli JM109에 형질전환 시키고, 이를 3HB가 포함된 중합체 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 2g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육 시킨 결과, 중합체 생성을 확인할 수 있었다.
1-3. 폴리락테이트와 3-하이드록시부티레이트-락테이트 공중합체를 효율적으로 생성하는 변이 미생물의 제작
실시예 1-1에서 제작된 아세틸-CoA 및 락테이트의 양이 증가된 변이 미생물에 상기 실시예 1-2-3 및 1-2-4에서 제작된 pPs619C1400-CPPCT532또는 pPs619C1310-CPPCT532벡터를 도입함으로써 폴리락테이트와 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-락테이트)를 효율적으로 생성하는 변이 미생물을 제작하였다.
상기 변이 미생물을 테트라사이클린(tetracycline) 10㎍/ml, 엠피실린(ampicillin) 100㎍/ml 및 glucose 20g/l가 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이 형질전환 균주를 10ml LB 배지에 접종하여 30℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 6.67g KH2PO4, 4g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10 ㎖ 포함)의 성분이 있고 10N NaOH로 pH를 7.0으로 맞춘 100ml의 배지를 함유한 250㎖ 플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 테트라사이클린(tetracycline) 10㎍/ml, 엠피실린(ampicillin) 100㎍/ml 및 thiamine 10㎍/ml와 함께 접종하여, 30℃에서 200rpm으로 72시간 내지 96시간 배양하였다. 이 때, 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 공중합체의 생성을 위해, 배양 초기에 DL-3-하이드록시부티레이트 소듐 염(ACROS) 2g/l를 한 번 내지 두 번 공급해주었다. 돌연변이 균주 중 ppc 유전자의 결실로 인해 세포 성장이 어려운 균주 배양을 위해서 숙시네이트(succinate) 4g/l 가 첨가되었다. 또한, trc 프로모터로 치환된 ldhA 및 acs 유전자의 발현을 위해 OD600 0.5 정도에 1mM IPTG가 첨가되었다.
배양 종료 후, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 증류수로 3번 세척한 후 100℃의 건조기에서 24시간 건조하였고, 건조된 균체 중 일부를 채취하여 가스크로마토그래피(GC)분석을 수행함으로써 세포 내 합성된 P(3HB-co-LA) 함량을 측정하였다. 분석에 사용된 표준물질은 P(3HB-co-3HV) 공중합체(이중 3HV의 함량은 무게비로 약 12%) 및 폴리락테이트 호모폴리머이었다. 상기 대사조작들에 의해 PLA 호모폴리머의 3~10wt% 정도의 생성이 가능하게 되었고, P(3HB-co-LA) 공중합체의 생성은 고분자 내 LA 분율이 1.7~4.3배 증가하고, 고분자 함량이 1.4~27.3배 증가하는 우수한 개선 효과를 보였다.
실시예 2: 폴리락테이트와 3-하이드록시부티레이트-락테이트 공중합체를 효율적으로 생성하는 변이 미생물의 배양부피조건에 따른 고분자 생성능 비교
플라스크 배양에 있어, 배양 조건과 이에 따른 락테이트 생성 정도가 미생물의 세포성장(바이오매스)과 P(3HB-co-LA) 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 배양 부피를 달리하여 배양해 보고자 하였다. 이를 위해 250ml 플라스크에 50ml, 100ml, 150ml의 배지를 넣고 XB/p400-532 균주를 배양하였다. 상기 XB/p400-532 균주는 대장균 XL1-Blue의 대사 흐름을 조작하지 않은 채 pPs619C1400-CPPCT532 벡터를 도입한 균주이다.
하기 표 5는 XB/p400-532 균주의 배양 부피 조건에 따른 고분자 생성 결과를 나타낸 것이다.
표 5
Figure PCTKR2009003389-appb-T000005
예상대로 배지 부피가 증가함에 따라 상대적으로 (마이크로)혐기 조건이 형성되면서 세포성장은 약화되었고, 이에 따라 고분자 함량(content)는 약 1.5배 증가하였다. 그리고 (마이크로)혐기 조건에 따른 락테이트의 생성이 증가하면서 고분자 내의 락테이트 분율은 2.2배 정도 증가하였다.
이를 기반으로 대사적으로 조작된 본 발명의 변이 미생물 JLX7/p400-532의 효과를 확인하기 위해, 배양 부피를 50ml, 100ml 로 하여 플라스크 배양을 시행해보았다.
하기 표 6은 XB/p400-532 균주와 본 발명의 변이 미생물 JLX7/p400-532의 배양 부피 조건에 따른 고분자 생성 결과를 나타낸 것이다.
표 6
Figure PCTKR2009003389-appb-T000006
50ml의 배양 부피로 배양하였을 때, 숙주 균주로 XB/p400-532를 사용한 경우와 비교하여, P(3HB-co-LA) 함량은 1.24 배 증가하였고, 고분자 농도도 1.98배 증가하였다. 뿐 아니라, 고분자 내 락테이트(LA) 분율이 14.32 mol%에서 49.55 mol%로 약 3.46 배 증가하였다. 100ml의 배양 부피로 배양하였을 때, 숙주 균주로 XB/p400-532를 사용한 경우와 비교하여, P(3HB-co-LA) 함량은 1.62배 증가하였고, 고분자 농도도 2.98배 증가하였다. 고분자 내 LA 분율 또한 40.45 mol%에서 63.95 mol%로 1.58 배 증가하였다.
PLA 공중합체 내 LA 분율이 고분자 물성에 있어 중요한 영향을 끼치는 만큼 LA 분율의 증대 및 조절은 균주 개량에 있어 주요관건이 되는 부분이다.
50ml의 배양 부피로 배양하였을 때, LA 분율이 14.32 mol%에서 49.55 mol%로 약 3.46 배 증가한 데 비해, 100ml의 배양 부피로 배양하였을 때는 40.45 mol%에서 63.95 mol%로 1.58 배 증가하는, 상대적으로 증가 폭이 낮은 결과를 보였지만, LA 분율의 절대치는 가장 높은 값 (63.95 mol%)을 보였다. 다시 말해, 50ml의 배양 경우, 그 증가 폭은 상대적으로 높지만 50 mol% 수준으로, 100ml 배양에서의 값(63.95 mol%)을 능가하지 못했다. 이는 유전자 수준에서의 대사 공학과 함께 배양 조건도 PLA와 그 공중합체 생산에 있어 최적화해야 할 조절 인자임을 의미한다.
실시예 3: 변이 유전자의 조합에 따른 변이 미생물의 고분자 생성능 비교
본 발명의 변이 미생물에 적용된 유전적 돌연변이의 조합이 고분자 생성능 증가에 미치는 효과를 확인하였다.
상기 경우와 같이, 기본 배지는 MR 배지에 탄소원으로 글루코스 20g/l, 마커로 테트라사이클린(tetracycline) 10㎍/ml, 엠피실린(ampicillin) 100㎍/ml 및 티아민 10㎍/ml을 공급하였다. 또한, 배양 초기에 DL-3-하이드록시부티레이트 소듐 염(ACROS) 2g/l를 한 번(p310-532 경우 M20) 내지 두 번(p400-532 경우-M18) 공급하였고, 30℃에서 200rpm으로 72시간 배양하였다.
숙주 균주로 XB, JLX1 균주를 사용한 경우는 추가 사항없이 위 배양 조건 대로 배양하였고, JLX3, JLX5, JLX6, JLX7, JLX8 균주를 사용한 경우에는 ppc 유전자의 결실로 인한 세포 성장 저해를 보완하기 위해 숙시네이트(succinate) 4g/l를 배양 초기에 추가로 공급하였다. JLX2, JLX4, JLX5, JLX7, JLX8 균주를 사용한 경우는 ptrc-ldhA 또는 ptrc-ldhA와 ptrc-acs 의 발현을 유도하기 위해 OD600 0.5 정도에 1mM IPTG를 공급하였다.
하기 표 7은 XB 야생형 및 표 1의 JLX1, JLX2, JLX3, JLX4, JLX5, JLX6, JLX7 균주를 숙주 균주로 하여 p400-532 벡터를 각각 도입한 변이 미생물들의 고분자 생성능을 나타낸 것이다.
표 7
Figure PCTKR2009003389-appb-T000007
또한, 하기 표 8은 XB 야생형 및 표 1의 JLX1, JLX2, JLX3, JLX4, JLX5, JLX6, JLX7, JLX8 균주를 숙주 균주로 하여 p310-532 벡터를 각각 도입한 변이 미생물들의 고분자 생성능을 나타낸 것이다.
표 8
Figure PCTKR2009003389-appb-T000008
폴리머의 생성은 숙주 균주의 대사 흐름과 폴리머 생성에 직접적으로 영향을 미치는 효소들의 활성 모두에 의해 영향을 받는다. 따라서, 표 7 및 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 같은 숙주세포라 하더라도 적용된 효소 활성에 따라 생성되는 폴리머내 LA 분율, 폴리머 함량 등이 달라짐을 알 수 있었으며, 그럼에도 불구하고 전반적으로, JLX5, JLX7 또는 JLX8균주의 경우 고분자 생성능이 항상 우수함을 알 수 있었다.
실시예 4: 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate)의 공급량에 따른 고분자 생성능 비교
PLA 단일 중합체와 락테이트(LA) 함량이 높은 P(3HB-co-LA) 공중합체의 생합성을 위해, 3-하이드록시부티레이트(3HB) 공급량을 조절하여 그 생성능을 살펴보았다.
표 9은 숙주 균주로 XB 야생형 및 JLX7 균주를 사용하고 p400-532 벡터를 도입하였을 때, 3HB 공급량(0, 0.5, 1, 2, 4, 8g/l)에 따른 고분자 생성능을 나타낸 것이다.
표 9
Figure PCTKR2009003389-appb-T000009
표 10은 숙주 균주로 XB 야생형 및 JLX7, JLX8, JLX9 균주를 사용하고 p310-532 벡터를 도입하였을 때, 3HB 공급량(0, 0.5, 1, 2, 4g/l)에 따른 고분자 생성능을 나타낸 것이다.
표 10
Figure PCTKR2009003389-appb-T000010
p400-532와 p310-532의 경우 모두, 숙주세포가 XB 야생형인 경우는 PLA 호모폴리머와 50mol% 이상의 LA를 가지는 P(3HB-co-LA) 공중합체를 생성하지 못하는 데에 반해, JLX 7, JLX8, 또는 JLX9의 경우 PLA 호모폴리머를 3~10wt% 생성할 수 있었고, 50~86 mol% 수준의 LA를 가지는 P(3HB-co-LA) 공중합체를 13~65wt% 생성할 수 있었다.

Claims (18)

  1. 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성의 증가를 위해 코엔자임에이 공여체 및 락테이트의 생성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 유전공학적으로 조작되어 있는 변이 미생물을 제조하고;
    상기 변이 미생물을 글루코스 또는 글루코스와 하이드록시알카노에이트를 포함하는 배지 중에서 배양하고;
    상기 변이 미생물로부터 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 회수하는 것을 포함하는
    폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코엔자임에이 공여체가 아세틸코엔자임 에이(acetyl-CoA), β-케토아디필-CoA(β-ketoadipyl-CoA), γ-부티로베타닐-CoA(γ-butyrobetainyl-CoA), (R)-메틸말로닐-CoA((R)-methylmalonyl-CoA), (S)-메틸-말로닐-CoA ((S)-methyl-malonyl-CoA), 2'-(5''-포스포리포실)-3'-디포스포-CoA (2'-(5''-phosphoribosyl)-3'-dephospho-CoA), 2'-(5''-트리포스포리포실)-3'-디포스포-CoA (2'-(5''-triphosphoribosyl)-3'-dephospho-CoA), 3,4-디하이드록시페닐아세틸-CoA(3,4-dihydroxyphenylacetyl-CoA), 3-하이드록시아디필-CoA(3-hydroxyadipyl-CoA), 3-하이드록시부티릴-CoA(3-hydroxybutyryl-CoA), 3-하이드록시페닐아세틸-CoA(3-hydroxyphenylacetyl-CoA), 3-메틸크로토닐-CoA(3-methylcrotonyl-CoA), 4-하이드록시페닐아세틸-CoA (4-hydroxyphenylacetyl-CoA), 페닐아세틸-CoA의 cis-디하이드로디오일 유도체 (cis-dihydrodiol derivative of phenylacetyl-CoA), Δ2-에노일-CoA (Δ2-enoyl-CoA), 2-trans-4-cis-디에노일-CoA (2-trans-4-cis-dienoyl-CoA), 3-하이드록시아실-CoA (3-hydroxyacyl-CoA), 3-케토아실-CoA (3-ketoacyl-CoA), cis-2-에노일-CoA (cis-2-enoyl-CoA), cis-3-에노일-CoA (cis-3-enoyl-CoA), trans-2-에노일-CoA (trans-2-enoyl-CoA), trans-3-에노일-CoA (trans-3-enoyl-CoA), cis-2,3-디하이드로아실-CoA(cis-2,3-dehydroacyl-CoA), D-3-디하이드록시아실-CoA(D-3-hydroxyacyl-CoA), 지방 아실 CoA(fatty acyl CoA), 장쇄 아실-CoA(long-chain acyl-CoA), trans,trans-Δ2-Δ4-디에노일-CoA(trans,trans-Δ2-Δ4-dienoyl-CoA), 고장쇄 지방 아실-CoA(very long chain fatty acyl-CoA), CoA 유도체(CoA derivative), 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA), 아세틸-CoA(acetyl-CoA), ω-카복시아실-CoA(ω-carboxyacyl-CoA), 아실-CoA(acyl-CoA), L-3-하이드록시아실-CoA(L-3-hydroxyacyl-CoA), 부티릴-CoA(butyryl-CoA), 코엔자임 A (CoA), 코엔자임-A-그룹 (CoA), 코마로일-CoA(coumaroyl-CoA), 크로토노베타닐-CoA(crotonobetainyl-CoA), 크로토닐-CoA(crotonyl-CoA), D-카니티닐-CoA(D-carnitinyl-CoA), 디포스포-CoA(dephospho-CoA), 포르밀-CoA(formyl-CoA), 이소발레릴-CoA(isovaleryl-CoA), L-카니티닐-CoA(L-carnitinyl-CoA), 말로닐-CoA(malonyl-CoA), O-숙시닐벤조일-CoA(O-succinylbenzoyl-CoA), 옥살릴-CoA(oxalyl-CoA), 팔미토일 CoA(palmitoyl CoA), 페닐아세틸-CoA(phenylacetyl-CoA), 피메로일-CoA(pimeloyl-CoA), 프로피오닐-CoA(propionyl-CoA), 숙시닐-CoA(succinyl-CoA), trans-Δ2, cis-Δ4-데카디에노일-CoA(trans-Δ2, cis-Δ4-decadienoyl-CoA), trans-Δ2-디세노일-CoA(trans-Δ2-decenoyl-CoA) 및 락틸 CoA(lactyl CoA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이 미생물이 코엔자임에이 공여체의 생성의 증가를 위해 아세테이트(acetate)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 에탄올(ethanol)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있거나 아세테이트(acetate)를 아세틸 코엔자임 에이(Acetyl CoA)로 재전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 것인 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이 미생물이 락테이트의 생성의 증가를 위해 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있거나 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 것인 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이 미생물이 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 알칼리제네스(Alcaligenes)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리치아(Escherichia)속, 랄스토니아속(Ralstonia)속, 바실러스(Bacillus)속, 코리네박테리움 (Corynebacterium)속으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인 제조 방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 아세테이트의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 ackA인 제조 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 에탄올의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 adhE인 제조 방법.
  10. 제3항에 있어서, 아세테이트(acetate)를 아세틸 코엔자임 에이(Acetyl CoA)로 재전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 acs인 제조 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 포스포에놀파이루베이트의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 ppc인 제조 방법.
  12. 제4항에 있어서, 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 ldhA인 제조 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 변이 미생물이 코엔자임에이 공여체의 생성의 증가를 위해 아세테이트(acetate)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있고, 락테이트의 생성의 증가를 위해 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있으며 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 것인 제조 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 변이 미생물이 코엔자임에이 공여체의 생성의 증가를 위해 아세테이트(acetate)의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있고 아세테이트(acetate)를 아세틸 코엔자임 에이(Acetyl CoA)로 재전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있으며, 락테이트의 생성의 증가를 위해 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)의 소모 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있고 파이루베이트(pyruvate)에서 락테이트(lactate)로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 것인 제조 방법.
  15. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자의 발현의 증폭은 고유 프로모터(native promoter)의 강력 프로모터(strong promoter)로의 치환에 의한 것인 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 강력 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 및 lac 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택된 것인 제조 방법.
  17. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이 미생물은 aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, tpiA, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, fumA, fumB, fumC, eptB, gpmA, gpmB, ptsG, mdh, pgi, glgC, sucA, sucB, ribA, folE 및 pflB 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 추가로 약화 또는 불활성화되어 있는 것인 제조 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acid), 2-하이드록시프로피온산(2-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hexenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헵탄산(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methyl ester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propyl ester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzil ester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3, 12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시노난산(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-heptenoic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 제조 방법.
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