WO2010077168A1 - Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, способ получения этого препарата и его применение - Google Patents

Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, способ получения этого препарата и его применение Download PDF

Info

Publication number
WO2010077168A1
WO2010077168A1 PCT/RU2009/000424 RU2009000424W WO2010077168A1 WO 2010077168 A1 WO2010077168 A1 WO 2010077168A1 RU 2009000424 W RU2009000424 W RU 2009000424W WO 2010077168 A1 WO2010077168 A1 WO 2010077168A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
preparation
nanocontainers
cells
stem cells
signaling
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2009/000424
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ
Виктор Иванович СЕВАСТЬЯНОВ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to US13/143,049 priority Critical patent/US20110268774A1/en
Priority to EP09836446.6A priority patent/EP2380973A4/en
Publication of WO2010077168A1 publication Critical patent/WO2010077168A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/126—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells

Definitions

  • the invention relates to medicine, in particular to neurology, neurosurgery and oncology, and is intended for the treatment of tumors of the brain and spinal cord, degenerative, hypoxic, ischemic diseases and traumatic injuries of the central nervous system (CNS) and other diseases of humans and animals.
  • CNS central nervous system
  • RNA or DNA molecules acts as a pharmaceutical in such gene therapy.
  • gene transduction in cells is carried out by a retrovirus (lentivirus) associated with a particular gene.
  • the closest analogue (prototype) of the present invention can be considered the technical solution, which consists in the use of astrocytes to induce apoptosis of malignant gliomas (Uzzamap M, Keller G., Germano Isabelle M. In vivo G Canal Delivera b Canal br admir g réelle f réelle f f f f st Departmental of Neurosurgeru (MU, IMG) and Gene and CeIl Medicipe (GK), Mt. Sipai S Vintage Hool metre, New York, USA. .
  • astrocytes obtained from embryonic ESCs under certain conditions secrete genes that can be used to induce apoptosis of malignant glioma cells in vitro. It has been proven that the TRIAL gene (TNF-dependent ligand inducing apoptosis) induces apoptosis in various tumor cells, including glioma cells.
  • TRIAL gene TNF-dependent ligand inducing apoptosis
  • the authors of this work evaluated the apoptotic effect of the use of transgenic TRIAL delivered using astrocytes derived from embryonic CK in malignant gliomas ip vivo. Nude mice were transplanted with Al 72 human malignant glioma cells, which formed a heterotopic xenograft.
  • Embryonic CK astrocytes secreting TRIAL were then introduced into these xenografts. TRIAL expression in malignant glioma xenografts was confirmed by PCR diagnostics with reverse transcription and immunohistochemistry after external gene induction. 48 hours after the injection of astrocytes in the experimental group, a significant decrease in tumor volume was noted - 14% after a single dose of astrocytes and 31% after a double dose. TUNEL staining revealed a large number of apoptotic tumor cells. 7 days after the injection, the tumor underwent severe necrosis. Death receptor expression (DR4) in experimental groups was significantly higher than in the control. The authors of this work suggest that astrocytes derived from ESCs and secreting TRAIL can be used as vectors for gene delivery to malignant gliomas.
  • the main problem is the interpretation of the results of these ultramodern studies and the lack of a real opportunity for the correction of identified genetic defects.
  • the use of gene therapy to correct a specific molecular breakdown is methodologically justified, but involves a number of technical and technological difficulties of the current stage of scientific research.
  • the solution to the problem may not be proposed in correcting a specific genetic “Breaking” the mutant genes (genetic defect) and replacing the damaged gene, and in setting a new vector (direction) for the development of the entire cell cycle of the pathological cell and the cells of the entire pathological zone.
  • a decrease in the expression of this gene below normal values triggers the work of a whole cascade of genes in the cell nucleus, resulting in an antiapoptotic effect, neoangiogenesis, proliferation and cell reproduction (pathogenetic and pathophysiological conditions of tumor formation), and an increase in p53 expression triggers apoptosis, impaired angiogenesis, and impaired cell migration and stopping the formation of new cells (pathogenetic links of atrophic and degenerative processes in the brain). Therefore, the management of key genes can become the basis for the management of basic cellular processes in a given (reprogrammed) direction by the researcher of the development of certain physiological and algorithmized processes in the cell.
  • CK As a controlled "biota” for the transfer of signals to a pathological cell, the authors of the present invention considered healthy human and animal CK, which by its nature is a universal control system genetically programmed to repair damage and regenerate in damaged organs and tissues. It has the unique ability to migrate to the pathology zones according to the concentration gradient of chemokines and local proinflammatory factors and can fully perform the transfer functions for the necessary signaling molecules.
  • An analysis of a number of scientific facts on the functioning of CK in the pathological zone shows that, under certain cellular events of pathological cells (for example, apoptosis), healthy CK receives certain signals from these cells, processes them and sends back signals (for “survival”) to damaged cells.
  • CK carry out intercellular and intracellular biocontrol of local sanogenesis and reparative functions of cells in the tissue.
  • pathological cells respond to these signals (a cascade of cytokines and neurophic and other information factors secreted by CK), and in them signal systems are triggered inductively, contributing to the formation of the necessary regenerative processes.
  • the main objective of the present invention is the creation of such a stem cell preparation with reprogrammed cellular signaling that would ensure targeted delivery of signaling substances (i.e., signaling proteins and pharmaceuticals capable of regulating signaling pathways) strictly into the affected area of the mammalian body, and also the launch at a given time and long-term support of an active signaling intercellular effect of a given therapeutic nature by a healthy and well-managed emoy CK for administering defective (mutant neural or cancer) cell system.
  • signaling substances i.e., signaling proteins and pharmaceuticals capable of regulating signaling pathways
  • a stem cell preparation with reprogrammed cell signaling containing a basic stem cell preparation in the membrane and / or core and / or the cytoplasm of which is implanted capable of regulating the signaling pathways of stem cells and cells of a pathological focus in a mammalian organism, a protein or pharmaceutical preparation previously encapsulated in nanocontainers obtained from biodegradable material intact for organelles and stem cell compartments of the base preparation and having predetermined biodegradation periods the body of a mammal to provide a programmed release of a protein or pharmaceutical preparation in the intra- or the intercellular space of stem cells and thereby reprogramming the signal transduction of key stem cell genes in the required therapeutic direction of the development of physiological events of the cell cycle directly in the pathological zone of an organ or tissue of the body.
  • the stem cells of the base preparation are predominantly autologous stem cells.
  • nanocontainers does not exceed 100 nm.
  • nanocontainers nanocontainers based on biopolymer material can be used.
  • biopolymer material copolymers of polylactide glycolide and / or polyoxybutyrate valerate can be used.
  • Nanocontainers based on liposomes or nanoemulsions can also be used as nanocontainers. Another objective of the present invention is to develop a method for producing the specified preparation of stem cells with reprogrammed cell signaling.
  • a method for producing a stem cell preparation with reprogrammed cell signaling includes selecting a basic stem cell preparation, selecting a protein or pharmaceutical preparation capable of regulating the signaling pathways of stem cells and cells of the pathological focus in the body.
  • a drug with autologous stem cells As the base drug, a drug with autologous stem cells.
  • Encapsulation can be carried out by ultradispersing a mixture of biopolymer material with a protein or pharmaceutical preparation.
  • nanocontainers can be carried out by direct intracellular injection of a suspension or emulsion of nanocontainers into the membrane, cytoplasm or stem cell nucleus of the base drug, as well as by endocytosis of nanocontainers into the cytoplasm of stem cells upon exposure of the suspension or emulsion of nanocontainers in the base drug.
  • the claimed method for producing the claimed preparation is carried out under sterile conditions or directly in the operating room (ex temro) or in a culture laboratory.
  • the present invention provides the use of the claimed CK preparation as an agent for intracellular and extracellular regulation of signaling pathways of pathological cells in the treatment of diseases, injuries and tumors of the brain and spinal cord, as well as tumors and metastatic lesions of other organs and systems of the mammal.
  • the mechanism of action of the claimed CK preparation with reprogrammed cellular signaling is due to directed migration to the pathological zone of the brain or other organ of a mammal contained in the CK preparation with signaling molecules of a protein or pharmaceutical preparation encapsulated in biodegradable nanocontainers implanted in them.
  • a programmed release of signaling molecules from nanocontainers to the CK or intercellular space of the pathological zone occurs and a predetermined effect of signaling molecules on extracellular and intracellular signaling pathways and gene transduction is performed in order to form therapeutic inductive cellular processes (instrumental apoptosis, controlled differentiation of , inductive proliferation, etc.) in the pathological zone.
  • the drug was developed on an experimental model of a brain tumor (C6 glioma), but in the process of creating and experimentally using this drug, universal possibilities of its use have opened up not only in the pathology of the central nervous system, but also in diseases of other organs and systems of humans and animals. It should be noted that the use according to the present invention of the use of healthy CK as a means of delivering signaling substances to the affected areas in the body is possible only under certain conditions, namely:
  • the acute phase of inflammation should be completed and the effect of dominant local inflammatory and destructive pathogenetic factors of damage should be minimized to a minimum.
  • the abnormal cell becomes insensitive to the control signals of healthy CK.
  • cases of the formation of tumors in tissues after transplantation of CK into them due to the transformation of healthy CK into mutant (cancerous) CK under the influence of aggression of factors of inflammation and necrosis are described. Therefore, the use of primary and even cultured CK without altering cellular signaling in them is hardly justified in the presence of acute inflammation, autoimmune process, atrophic process, tumors, and in most cases is contraindicated in a number of nervous diseases. In these cases, it is necessary to strengthen the natural ability to bioregulate and regenerate their own CK, which is possible when reprogramming the functionality of primary CK at the genetic level.
  • a pathologically altered mutant cell becomes an object of control (OS), and self-control should take a healthy managed CK.
  • OS object of control
  • Extrapolating the mathematical approach to the system of cellular interactions it can be argued that the slowest phase in the development of the cell cycle is the functioning of CK itself.
  • Nervous CK has the slowest activity of biological processes in neurogenesis (the full cycle of dividing adult CK is 21 days, and its predecessors is 12 hours).
  • Mutant (for example, cancerous) CK in glioma has an even slower division cycle (28 days), and accordingly healthy CK in relation to it is controllable and subordinate. Therefore, healthy CK signals are not controlling for mutant (cancerous) CK. It is the inhibition of biological processes in a cancer cell that makes it insensitive to radiation and chemotherapy, while actively dividing cells fully respond to radiation exposure and chemotherapeutic effects. Most likely, the mutant CK functions according to the principle of open control. The essence of this principle is that the control program is rigidly defined by a master device (master signal). The control does not take into account the influence of disturbances on the process parameters. Healthy CK works on the principle of compensation and the principle of feedback.
  • the essence of the compensation principle is the possibility of correcting the control action when deviating from a given value at the input of the op-amp by summing the signal of the control device with a corrective action proportional to the disturbance and compensating for its effect.
  • the feedback principle is based on the fact that the control action is adjusted depending on the output value of the signal. If the value of the output value deviates from the required value, the signal is corrected in order to reduce this deviation.
  • the corresponding dominant signals can accelerate or enhance the activity of the controlling mutant CK and make it controlled in the general continuum of the studied cell systems, subordinate healthy CK to signaling and, as a result, lead the functioning of the cell cycle in a given therapeutic direction.
  • the biological functional activity of cancerous CK by changing the biological functional activity of cancerous CK, one can make it susceptible to standard radiation and chemotherapy regimens.
  • the problem of developing new methods of treating nervous and oncological diseases using the present invention goes into the plane of controlling the interaction of two biological systems - on the one hand, mutant (cancerous) CK, on the other - healthy CK.
  • a new technical solution for reprogramming the transduction of key somatic CK genes is proposed - to encapsulate protein and pharmaceutical preparations of cell signaling (i.e., drugs capable of regulating the signaling pathways of stem cells and cells of a pathological focus in a mammalian organism) into nanocontainers made of biodegradable material intact for stem cell organelles and implant nanocontainers with cell signaling preparations in them membrane, nucleus or cytoplasm CK.
  • cell signaling i.e., drugs capable of regulating the signaling pathways of stem cells and cells of a pathological focus in a mammalian organism
  • the specified temporal parameters of the biodegradation of the nanocontainer material allow informational molecules of cytokines and neurotrophic factors to leave the nanocontainer’s bio-neutral shell (nanocapsules) in the CK cytoplasm after a strictly defined time after administration of the proposed CK preparation to the patient and to carry out the programmed action of signaling molecules on the necessary components of signaling pathways and (or) genes cell nuclei, causing their expression (induction) and directing the development of the cell cycle in a predetermined erapevticheskom direction via intracellular or extracellular signals.
  • the methodology for isolating key (control) genes is based on the fundamental principles of systems management theory and on the results of a transcriptional proteomic analysis of a biopsy of a pathological section of the nervous tissue of a given patient, the culture of his mutant (cancerous) CK, isolated from the biopsy, and native, mobilized healthy patient CK.
  • Key genes should be considered only those genes whose protein expression is significantly lower than normal.
  • the norm parameters in each case are determined on the basis of studying the expression of healthy CK proteins of the patient during their transcriptional proteomic analysis.
  • Quantitative indicators of protein expression of the isolated key genes of the mutant (cancerous) CK are basic for the analysis and selection of signaling molecules in order to select the desired protein or pharmaceutical preparation and calculate their safe concentration when implanted in the patient’s native healthy CK. Methodology for the selection of signaling molecules for reprogramming expression
  • the signal molecule should regulate the expression (induction) of those signal systems or key genes of healthy CK, the functioning of which will ensure the formation of a new intracellular signaling pathway, which will result in the formation of an extracellular or intracellular signal, necessary for the development of events of a certain programmed cell cycle.
  • the signaling molecule In the structure of the signaling pathway of a specific cellular event, the signaling molecule must ensure the strict development of cellular events according to a given scenario at different stages of the signaling pathway from its release to the implementation of the extracellular CK response.
  • the signal of the extracellular response CK should change the biological activity of the cell and the direction of its physiological functioning.
  • the present invention does not set the task of repairing damaged genes, creating mutant genes that constantly produce a particular protein, lysing genes or blocking the ability to translate this gene.
  • the present invention provides a "block" control of the expression (induction) of key genes in a particular physiological direction of the development of a specific complex of cellular events.
  • the target cell is not only tumor and cancer CK, but also healthy autologous CK transplanted to the patient.
  • AT the present invention shows the possibility of CK biocontrol due to the interventional programmed effect of intracellular and extracellular regulation factors (signaling protein molecules) on cancer and healthy CK genes using physiological mechanisms of cell signaling.
  • a transcriptional-proteomic comparative analysis of cancerous CK and tumor cells with healthy patient CK identifies key genes and intact links of the pathological cell genome, as well as disturbances in the signaling pathways of the tumor cell genome [7].
  • a control for comparison is the expression of healthy (hematopoietic, neural or mesenchymal) CK genes.
  • the key genes of cancerous CK are defined as genes with the lowest expression, and the highest gene expression indices allow us to verify the structure of signaling pathway disorders.
  • the effect on the transduction of genes and signaling pathways of target cells is carried out by short induction signals of cell-cell-cell interaction coming from signaling molecules (cytokines, monoclonal antibodies, recombinant ligands, growth factors, heat shock proteins, etc.) released from biodegradable nanocontainers, as a result, the action of promoters or inhibitors of CK core genes is triggered.
  • the signals begin to enter the cell and into the extracellular space after a predetermined time after the introduction of the proposed drug CK into the patient.
  • This time is determined by the start time of biodegradation of nanocontainers and it is necessary for the CK of the proposed preparation to deliver nanocontainers with signaling molecules to this zone as a result of their ability to migrate to the pathological zone of the body. It is necessary provide multi-vector and multi-level effects on different receptors of the same target cells in the therapeutic direction.
  • FIG. Figure 1 shows a diagram of the signaling pathways for the formation of apoptosis (arrows indicate the possible points of application of the regulatory signaling effect for the formation of the algorithmically regulated apoptosis in autologous CK); in FIG. 2 - an electron microscope image of nanocontainers with a protein preparation; nanocontainers obtained on the basis of biopolymers); in FIG. 3 - MPT of the rat brain with experimental C6 glioma on the eighteenth day (Fig. 3A) and twenty-sixth day (Fig.
  • the choice of the basic preparation CK The preparation of the basic cellular preparation was carried out on the basis of the standard preparation of hematopoietic CK, the preparation of which is described in patent RU 2283119 (IPC A61K 35/14, 09.09.2006) for the “Preparation of autologous hematopoietic stem cells, method for its preparation, cryopreservation and use for traumatic disease of the central nervous system. " Autologous neural stem cells (HCK) obtained from the olfactory lining of the patient’s nose can also be used for the base preparation. The methodology and protocol for producing HCK are published [11-14].
  • the tissue of the olfactory lining including the olfactory epithelium and the layer of connective tissue (lamipa rorria), is obtained from patients and processed according to the standard cultural protocol described in the scientific literature [15, 16]. Under local anesthesia, the patient takes fragments of the mucous membrane x 5 mm in size, which are excised from the upper part of the superior nasal concha. The resulting tissue is delivered to the laboratory in chilled balanced saline. Hanks (HBSS) without Ca 2+ and Mg 2+ containing antibiotics and antimycotics (1: 100; Gibso, Sigma). Delivery time should not exceed 2 hours.
  • HBSS Hanks
  • HBSS Hanks solution
  • Composition of the medium minimal medium Eagle (MEM, Sigma) 90%, fetal calf serum (FBS, Gibco, Ivitrogep), glucose 0.8%, glutamine 2 mM (Gibso), additives B27 (Sigma), HEPES 20 mM, and growth factors (only for primary cultures) - fibroblast growth factor (FGF2, lng / ml, Sigma) and neuro growth factor (NGF 2 ng / ml, Sigma).
  • MEM minimal medium Eagle
  • the resulting cell suspension is centrifuged (3 min at 1200 rpm), and the pellet is resuspended in a nutrient medium of the same composition. The number and viability of dissociated cells is determined in the chamber
  • Dissociated cells (5-10 5 cells / ml) were cultured in 12-well plates on a polylysine-laminin substrate for 14 days (36.5 ° C, 5% CO 2 ). A partial change of 1/3 of the nutrient medium is carried out twice a week. The primary culture after the formation of the confluent monolayer is removed using a trypsin / EDTA solution. After washing in HBSS and centrifugation, the cells are resuspended in culture medium. The cell suspension (10000-12000 cells / cm 2 ) is transferred to 12-well tablets or vials (area 25 cm 2 ). In this way, cultures are passaged 4 times until a drainage monolayer is formed.
  • the free-floating neurospheres formed in the cell monolayer attached to the substrate are selected using the Pasteur pipettes and dissociated by the enzymatic treatment described above. Isolation of the neurospheres makes it possible to separate them from the lining of intramural glial cells, fibroblasts, and stromal (supporting) cells attached to the substrate.
  • the cell suspension of neurosphere cells after washing and centrifugation, is resuspended in a nutrient medium and cultured in 12-well plates (10000-12000 cells / cm 2 ) and on coverslips (18x18 mm) in Petri dishes until a drainage monolayer is formed. The resulting cultures use For cytological and immunocytochemical studies. A part of the cells of the last Passages are frozen in cryopreservation medium (90% serum,% Dimethyl sulfoxide) and stored in liquid nitrogen.
  • the cell monolayer is fixed in a 4% paraformaldehyde solution prepared in 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4) for 30 minutes. After washing in PBS (3 x min.), The cells are incubated for 24 hours at 4 ° C with primary antibodies to ⁇ -tubulin (1: 300, Chemisop), nestin (1: 100, Chemisop) and neuronal specific enolase (1: 100, antibodies obtained in the laboratory of the applicant of this application).
  • the cells After washing in PBS, the cells are sequentially treated with biotin-boosted antibodies with an avidin-biotin complex (ABC, Vestor Laboratories, Ips) and a diaminobenzidine solution prepared on phosphate buffer (DBA 0.5 mg / ml, hydrogen peroxide 0.03%,).
  • DBA 0.5 mg / ml, hydrogen peroxide 0.03%,
  • the preparations are dehydrated and placed under coverslips in a synthetic resin (Epellap, Merk).
  • Signal proteins or a pharmaceutical preparation capable of regulating the signaling pathways of CK and cells of the pathological focus are selected in each case individually depending on the tasks of induction cell therapy.
  • the table below presents examples of therapy using known signaling agents (agents that affect cancer CK or its niche) that can be used in the present invention.
  • apoptosis is currently the most studied cellular process, it was decided to work out a new cell preparation with reprogrammable properties precisely on the model of this physiological cell event.
  • the general signaling pathway for apoptosis formation is shown in FIG. 1. It can be seen from the scheme that the processes of apoptosis trigger extracellular molecules of the signaling proteins of tumor necrosis factor (TNFa), proteins of death receptors (FAS-L), insulin growth factor (IGF). The process can also be activated at the intracellular level by acting on caspases and the p53 gene.
  • TNFa tumor necrosis factor
  • FAS-L proteins of death receptors
  • IGF insulin growth factor
  • the process can also be activated at the intracellular level by acting on caspases and the p53 gene.
  • substances participating in the signal chains of apoptosis should be selected as signal proteins. Examples of such substances are ricin and viscumin.
  • the authors of the present invention organized experiments to check the cytotoxic effect of ricin and viscumin on cells of Sat neurogliomas. It was shown that these proteins have high functional activity in relation to the cells of this line.
  • the LD50 value was 5x10 " moles for ricin and 5x10 " '' moles for viscumin.
  • both protein toxins induce apoptosis of Sat neuroglioma cells.
  • microscopic methods it was possible to identify nuclear fragmentation and exposure of phosphatidylserine to the cell membrane.
  • the use of a flow cytofluorimeter made it possible to identify the percentage of cells in which DNA fragmentation is observed after treatment with these toxins.
  • rapamycin can be mentioned which inhibits the growth of cancerous CK and stimulates the growth of normal CK (see table).
  • nanocontainers Encapsulation of the selected protein or pharmaceutical preparation in nanocontainers from biodegradable material.
  • the authors of the present invention have developed certain technical conditions for the production of nanocontainers (nanocapsules):
  • the size of the nanocapsule should not exceed 100 nm.
  • the nanocapsule must inside contain hermetically signal molecules substances and be coated externally with a biodegradable biopolymer or liposomal membrane, biologically neutral for the body and having a predetermined period of its biodegradation within the body.
  • Nanocapsules should be neutral for internal cell compartments and not very difficult to manufacture.
  • the biodegradation process of the nanocapsule should begin at a strictly specified period of time after the introduction of CK into the patient. Depending on the specific conditions and objectives of treatment, this period can be set in a very wide range - from 1-2 hours to several days or even months. 5. If possible, the nanocapsule should have the ability to be controlled.
  • the nanocapsule should biodegrade to cell-safe components.
  • the nanocapsule should be contrasted for methods of radiation diagnostics and easily diagnosed by computer and magnetic resonance imaging.
  • the molecules of the signal substance inside the nanocapsule should retain their potential activity to the maximum extent in order to fully realize it after exiting the nanocapsule as a result of the biodegradation of the latter.
  • a nanocapsule should be easily implanted through the plasma membrane of a cell into its cytoplasm by endocytosis, by direct intracellular injection, or using physiological approaches and physicochemical methods of influencing CK.
  • the biodegradable material of the nanocapsule shell must be capable of conjugation with lipids in order to enable the attachment (“locking”) of nanocapsules to the CK plasma membrane.
  • the proposed cell preparation with nanocapsules must meet safety criteria and be non-toxic.
  • biodegradable material For the production of nanocapsules, it is necessary to choose a biodegradable material.
  • three types of nanocapsules were used to deliver signal protein molecules to target cells: 1) biodegradable nanocapsules based on biopolymer materials (polylactide glycolide copolymers and polyoxybutyrate valerate copolymers);
  • nanoemulsions In all three of these cases of biologically active substances nanocapsulation, the obtained nanoparticle size was in the range from 100 nm, which made them capable of passive diffusion in CK or active capture by cells by pinocytosis, while nanocapsules were larger. 100 nm are able to propagate only in the intercellular space.
  • the resulting nanocapsules with signal protein molecules inside them were placed in 1.5 ml plastic tubes and stored at minus 12 ° C until further analysis and use.
  • Biodegradable nanocapsules based on biopolymer materials (polylactide glycolide copolymers and polyoxybutyrate valerate copolymers)
  • the signal protein was encapsulated in a biopolymer (polylactide glycolide or polyoxybutyrate valerate) carrier in an experimental setup as follows.
  • a portion of the lyophilized preparation of the signal protein, pre-mixed with finely divided polylactide powder (average particle size of -20 ⁇ m) was loaded into a high pressure chamber, followed by filling with CO 2 .
  • the temperature of the chamber was maintained at 50 ° C, and the temperature of the nozzle was about 30 ° C.
  • the pressure of supercritical CO 2 was MPa.
  • the contents of the autoclave were thoroughly mixed with a magnetic mixer (150 rpm) for 60 minutes, followed by discharge of the resulting mixture and carbon dioxide through a nozzle into the receiving chamber. After holding the obtained product under atmospheric conditions for 3 hours (this is necessary for the complete removal of CO 2 from the polymer particles and their final solidification), the collected particles were ultradispersed to a nanocapsule size of not more than nm. Ultradispersion was carried out in a Tl 8 Basis ULTRA-TURRAX submersible dispersant.
  • the dispersing element is S18N-19G (PSA-WERKE GMBH & CO. KG, Germany).
  • Preferred methods for preparing mixed liposomes from non-phospholipid amphiphilic membrane mimetics and phospholipids are based on the phase behavior of amphiphilic lipids and phospholipids.
  • Volumetric ratio of water the solution of the amphiphilic membrane mimetic and the aqueous phospholipid solution ranged from 5: 1 to 20: 1.
  • the mixing temperature is from 20 ° C.
  • a protein or pharmaceutical preparation of a signaling substance was added to the ingredients during mixing.
  • a phospholipid solution was injected at high speed through at least one nozzle into the aqueous phase of an amphiphilic membrane mimetic; or (b) an amphiphilic membrane mimetic was injected through at least one nozzle into a phospholipid aqueous phase or (c) a phospholipid solution was injected at high speed, through at least one nozzle simultaneously with the injection of a solution of an amphiphilic membrane mimetic, also through at least one nozzle into a common reservoir.
  • Nanoemulsions The preparation of ultramicroemulsions (with a particle size of not more than nm) was carried out on the basis of spontaneously dispersing concentrates of pharmacologically active esters (ASE). As ASE, undecenoates, laurates, palmitates, stearates can be used. A spontaneously dispersible concentrate was diluted with a phosphate buffer containing a signal protein preparation, and a thermodynamically stable ultramicroemulsion with micelles with a radius of 1.5-3 nm was obtained. To increase the lifetime of the water-in-oil emulsion, emulsifiers, stabilizers, etc. were added to the aqueous phase. The signal protein molecules were in the aqueous phase.
  • ASE spontaneously dispersing concentrates of pharmacologically active esters
  • nanocontainers nanocapsules
  • the implantation of nanocontainers (nanocapsules) in the CK of the base preparation was carried out by exposing the suspension or emulsion of nanocapsules with the signal protein molecules contained in them in the base CK preparation for 60 minutes or by culturing autologous CK under standard conditions for 24 hours with the addition of a solution of nanocapsules with signaling protein molecules.
  • the nanocapsules for the implantation of the nanocapsules according to the present invention, it is possible in principle to apply standard methods of gene therapy, for example, direct intracellular injections of a suspension or emulsion of nanocapsules into the membrane, cytoplasm or core of the CK base preparation, as well as the use of conjugates of nanocapsules with cholera toxin, cholesterol, polyethylene glycolotene and , the use of cationic lipids with nanocapsules, covalent lipophilic compounds with nanocapsules, immunoliposomes with nanocapsules, n ytralnyh liposomes nanocapsules, hydrocarbon enhaser cell membrane permeability and fusion-gene elements.
  • standard methods of gene therapy for example, direct intracellular injections of a suspension or emulsion of nanocapsules into the membrane, cytoplasm or core of the CK base preparation, as well as the use of conjugates of nanocapsules with cholera toxin, cholesterol, polyethylene glycolotene and
  • composite nanocapsules were made whose shell consisted of a biodegradable biopolymer and herpes virus shell proteins.
  • the use of neurotropic herpes virus proteins for the nanocapsule shell mimics a pseudovirus capsid.
  • the outer shell of the nanocapsule can merge with the plasma membrane of autologous CK, and nanocapsules with signal protein molecules easily penetrate into CK by its active endocytosis.
  • the described methods of encapsulating protein-soluble water preparations in nanocontainers can also be used for the superselective transfer of traditional chemotherapeutic drugs used for cytotoxic and cytoreduction therapy.
  • the formulation autologous CK with nanocontainers allow to carry out target delivery nanocontainers with a pharmaceutical preparation (chemotherapy) in zone 'tumor using CK homing migration mechanisms in pathological zone.
  • the preparation CK with reprogrammed cellular signaling can be introduced into the patient’s body by known methods, for example, by intracerebral, intramedullary, intraventricular, intrathecal or intravascular transplantation, depending on the purpose of the treatment, as well as by implantation into tissue-engineering structures used to close defects in the brain and spinal cord.
  • the present invention can be considered as a new direction in the treatment of tumors, ischemic, degenerative and traumatic injuries of the central nervous system and qualify as a high-tech method of cell cytocorrection or cytoregulation therapy of central nervous system tumors, as well as the treatment of other solid tumors and somatic diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение используется в медицине для лечения опухолей головного и спинного мозга, дегенеративных, гипоксических, ишемических заболеваний и травматических повреждений центральной нервной системы (ЦНС) и других заболеваний человека и животных. Цель изобретения — обеспечение целевой доставки сигнальных веществ строго в пораженную зону организма и запуск в заданное время и длительную поддержку активного сигнального межклеточного воздействия заданного терапевтического характера со стороны здоровой и хорошо управляемой стволовой клетки (CK) на управляющую систему дефектных клеток. Препарат CK с репрограммированным клеточным сигналингом содержит базовый препарат CK, в мембрану и/или ядро и/или цитоплазму которых имплантирован способный к регулированию сигнальных путей CK и клеток патологического очага в организме млекопитающего белковый или фармацевтический препарат, предварительно инкапсулированный в наноконтейнеры размером до 100 нм, полученные из биодеградируемого материала, интактного для органелл и компартаментов CK базового препарата. Этот материал имеет заданные сроки биодеградации в организме млекопитающего для обеспечения программируемого выхода белкового или фармацевтического препарата во внутри- или межклеточное пространство и осуществления тем самым перепрограммирования сигнальной трансдукции ключевых генов CK в требуемом терапевтическом направлении развития физиологических событий клеточного цикла непосредственно в патологической зоне органа или ткани организма.

Description

ПРЕПАРАТ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С РЕПРОГРАММИРОВАННЫМ КЛЕТОЧНЫМ СИГНАЛИНГОМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТОГО ПРЕПАРАТА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
Область техники
Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, нейрохирургии и онкологии, и предназначено для лечения опухолей головного и спинного мозга, дегенеративных, гипоксических, ишемических заболеваний и травматических повреждений центральной нервной системы (ЦНС) и других заболеваний человека и животных.
Предшествующий уровень техники
Проблема лечения опухолей, дегенеративных заболеваний и повреждений головного и спинного мозга до настоящего времени остается крайне трудной и практически нерешаемой задачей. Несмотря на значительные достижения современной медицины, выживаемость больных с глиальными опухолями мозга остается на уровне не более 12-15 месяцев. Не получено существенных результатов и в лечении дегенеративных, гипоксических и ишемических заболеваний нервной системы. По- видимому, это связано, с одной стороны, с ограниченными возможностями нервной ткани к регенерации и саногенезу и особенностями нейрогенеза во взрослом мозге, а с другой стороны, со спецификой патогенеза ряда нервных болезней.
Однако за последние два десятилетия представления о возможностях лечения указанных нарушений существенно изменились. Это связано с накоплением научных фактов о регенераторном потенциале ЦНС, открытием механизмов накопления генетических мутаций в нервных клетках головного и спинного мозга при патологии
ЦНС и получением неопровержимых доказательств о возможности управления процессами регенерации, ангиогенеза и синаптогенеза в нервной ткани ([1], с. 167, 194).
Концепция раковой (мутантной) стволовой клетки, сформулированная в современной научной литературе, открыла новые горизонты в лечении онкологических болезней и позволяет по-новому рассмотреть патогенетические основы возникновения нейроонкологических заболеваний и ряда нервных болезней [2]. Целая серия открытий конца XX и начала XXI века в области клеточной и молекулярной биологии, посвященных регуляции клеточных событий в нервной клетке (дифференцировка, апоптоз, пролиферация и т.д.), позволила с новых теоретических позиций взглянуть на проблему патогенеза целого ряда нервных болезней. Раскрыты ключевые механизмы, управляющие супрессией опухолевых генов и сигнальными процессами в нервной клетке, выявлены закономерности нарушения сигнальной системы клеточной регуляции при патологических состояниях мозга [3]. Появление новых производственных технологий для получения широкого спектра химиопрепаратов из сигнальных белков клеточной и межклеточной регуляции и понимание фундаментальных механизмов их действия привело к возможности получения уникальных экспериментальных результатов их применения на животных и человеке. Это открывает огромные перспективы в решении проблемы лечения онкологических и нервных болезней. Разработка и применение новых лекарственных средств, разработанных на базе вне- и внутриклеточных сигнальных белков, дали возможность добиться существенного прогресса в лечении ряда неизлечимых ранее онкологических заболеваний. Доказана возможность прямого воздействия сигнальных белков на раковые и здоровые стволовые клетки. Однако восторженное отношение к клиническому применению сигнальных клеточных энзимов, протеинов и антител к ним для лечения нейроонкологических и ряда неврологических болезней сегодня завершилось разочарованием и неудовлетворенностью полученными результатами. Как показали многочисленные исследования применения препаратов, разработанных на базе сигнальных белков, в терапевтических концентрациях они оказались губительны для здоровой нервной ткани человека, что резко сократило возможности их использования в клинической практике [4].
Надежды на прорыв в лечении заболеваний нервной системы, в том числе и нейроонкологической патологии, в последние -15 лет возлагались на клиническое применение CK [5]. Открытие наличия нейральных стволовых клеток во взрослом мозге дало принципиально новое понимание сущности нейрогенеза [6] . Однако успехи эмпирического и экспериментального применения клеточных технологий для лечения нервных болезней, также остаются достаточно скромными, и клиническое использование CK пока ограничено и имеет целый ряд существенных недостатков ([1], с. 360).
В конце 90-х годов XX века, с накоплением новых данных о характере и структуре генетических дефектов при целом ряде опухолей мозга и нервных болезней, сформировалось новая научная дисциплина - генотерапия, которая в перспективе также выглядела многообещающим научным направлением в лечении нервных болезней [4]. К сожалению, успехи и генной инженерии, и генной терапии пока остаются скромными и также не увенчались большими достижениями и окончательной победой над нервными болезнями. В настоящее время генная терапия пока технологически не может дать ощутимых результатов, несмотря на широкие возможности и перспективы ее применения в неврологии, нейрохирургии и нейроонкологии .
Возникает резонный вопрос: почему прорыв в фундаментальных областях знаний, клеточной и молекулярной биологии нервной клетки не принес аналогичного биотехнологического прорыва в клинических нейроисследованиях? Ответ на этот вопрос прост, но не однозначен. С позиций информационного подхода ([1], с. 37-58) эти противоречия могут быть объяснены нестыковкой достижений и существующих подходов, полученных на разных информационных уровнях научных исследований. Технологический прорыв в биологии произошел на субклеточном, молекулярном, атомарном уровнях и экстраполировать его результаты на организменный и тканевой уровень довольно трудно и малоперспективно. Именно этим объясняются неудачи клинического применения большого спектра современных рекомбинантных белков клеточного сигналинга семейства цитокинов и нейротрофинов, а также информационных молекул сигнальных белков межклеточного и внутриклеточного взаимодействия. Следует подчеркнуть, что молекулы сигнальных белков и антител к ним крайне нестабильны и работают в микро- и нано диапазоне. Эффективность их применения при системном (пероральном, парентральном, интратекальном и др.) применении крайне ограничена из-за резкого снижения их концентрации в биологических жидкостях организма при разбавлении в крови, ликворе, лимфатической жидкости. Кроме того, молекулы сигнальных белков имеют очень короткий период длительности своих информационных эффектов и большие возможности воздействия на различные клетки соматических органов при циркуляции их в биологических жидкостях человека и животных [7]. Крайне низкие концентрации сигнальных белков в патологических зонах мозга при системном введении вынуждают исследователей наращивать терапевтическую концентрацию препарата в крови, которая становится токсической для здоровых нейронов, сосудов мозга и соматических органов. Это приводит к тотальному и бесконтрольному воздействию этих сигнальных белков на различных уровнях организма (паренхиматозные органы, железы внутренней секреции и т д.), что вызывает регуляторный дисбаланс функционирования клеток этих органов. сопровождаемый тяжелыми осложнениями такой терапии [4].
Известны работы и исследования, описывающие базовые подходы комплементационной генной терапии опухолей и инфекционных заболеваний, когда в организм больного вводится полноценно работающий ген. Так, создание аутологичных модифицированных Т-лимфоцитов с использованием ретровирусов со встроенными генами позволяет успешно применять генетические конструкции для коррекции иммунодефицита [4]. В роли фармацевтического препарата при подобной генной терапии выступает клонированный ген или искусственно синтезированные молекулы РНК или ДНК. Как правило, в этих исследованиях трансдукция генов в клетках осуществляется ретровирусом (лентивирусом), связанным с определенным геном.
Наиболее близким аналогом (прототипом) настоящего изобретения можно считать техническое решение, заключающееся в использовании астроцитов с целью вызывания апоптоза злокачественной глиомы (Uzzаmап M, Кеllеr G., Germano Isabelle M. In vivо Gепе Dеlivеrу bу еmbrуопiс stеm сеll-dеrivеd аstrосуtеs fоr mаligпапt gliоmаs. Dераrtmепts оf Nеurоsurgеrу (MU, IMG) and Gene and CeIl Mediciпe(GK), Mt. Siпаi Sсhооl оf Меdiсiпе, Nеw Yоrk, USA. Nеurо Опсоl Аdvапсе Рubliсаtiоп DOI: Л 215/15228517-2008- 056, публ. 1 августа 2008). В данной работе было показано, что астроциты, полученные из эмбриональных ЭСК в определенных условиях выделяют гены, которые могут быть использованы с целью вызывания апоптоза клеток злокачественной глиомы iп vitrо. Было доказано, что ген TRIAL (ТNF-зависимый лиганд, индуцирующий апоптоз) вызывает апоптоз в различных опухолевых клетках, в том числе глиомных. Авторы этой работы оценили апоптический эффект от применения трансгенного TRIAL, доставляемого с помощью астроцитов, полученных из эмбриональных CK, в злокачественных глиомах iп vivо. Голым мышам были пересажены клетки злокачественной глиомы человека Al 72, сформировавшие гетеротопный ксенотрансплантат. В эти ксенотрансплантаты были затем введены полученные из эмбриональных CK астроциты, выделяющие TRIAL. Экспрессия TRIAL в ксенотрансплантатах злокачественной глиомы была подтверждена ПЦР-диагностикой с обратной транскрипцией и иммуногистохимией после внешней индукции гена. Через 48 часов после инъекции астроцитов в экспериментальной группе было отмечено значительное снижение объема опухоли - 14% после одинарной дозы астроцитов и 31% после двойной дозы. Окрашивание TUNEL выявило большое количество апоптических клеток опухоли. Через 7 дней после инъекции опухоль подверглась тяжелому некрозу. Экспрессия рецептора смерти (DR4) в экспериментальных группах была значительно выше, чем в контрольных. Авторы этой работы выдвигают предположение о том, что астроциты, полученные из ЭСК и выделяющие TRAIL, могут Использоваться как векторы для доставки генов в злокачественные глиомы.
Однако необходимо отметить, что указанное известное техническое решение, как и многие другие подобные способы генотерапии, имеет серьезные ограничения и до настоящего времени не было внедрено в клиническую практику. Применение рекомбинантного вирусного вектора в генной терапии крайне опасно и по данным, представленным Киселевым В. И. [4], уже однажды привело к смерти 18-летнего пациента при проведении первой фазы клинических испытаний. Было доказано, что смерть, вызванная развитием дыхательной недостаточности, отказом почек и отмиранием коры мозга, наступила в ответ на введение генно-инженерной конструкции. Поэтому авторы настоящего изобретения категорически отказались от применения трансгенных конструкций из вирусных плазмид, ретровирусов и лентивирусов, связанных с генами для их трансдукции в патологических клетках. Раскрытие изобретения
В настоящее время показано, что при большинстве нервных болезней фактор воспаления и стресса только запускает патологические механизмы в нервных клетках, но доминирующими процессами в патологической нервной ткани являются нарушенные механизмы клеточной регуляции, имеющие точный адрес своего происхождения - генетическую поломку в ядрах нервных клеток. В большинстве неврологических руководств описаны типичные генетические мутации, выявленные в нервных клетках при опухолях мозга, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, синильных деменциях, боковом амиотрофическом склерозе, энцефалопатиях сосудистого и токсического генеза и целом ряде дегенеративно-атрофических заболеваний ЦНС. Выявление этих генетических поломок в настоящее время не вызывает серьезных технических проблем, если использовать современные методы геномного и протеомного анализа клеток патологического очага. Главной проблемой является интерпретация полученных результатов этих суперсовременных исследований и отсутствие реальной возможности для коррекции выявленных генетических дефектов. Применение генной терапии для коррекции конкретной молекулярной поломки методологически оправдано, но сопряжено с рядом технических и технологических трудностей современного этапа научных исследований. Решение проблемы может быть предложено не в исправлении конкретного генетического «paзлoмa» мутантных генов (генетического дефекта) и замены поврежденного гена, а в задании нового вектора (направления) развития всего клеточного цикла патологической клетки и клеток всей патологической зоны. В этом случае, учитывая блочный характер вовлечения генов клетки в биоуправление и регуляцию, мутации генов (даже в нескольких различных локусах хромосом), приводящие к определенному клеточному циклу, не будут определяющими для жизни и развития всей клетки. Например, если исходом патогенетических процессов в нервной ткани является запуск механизма внутриклеточного апоптоза мутантной нервной CK, то очевидно, что необходимо поменять вектор всех клеточных процессов на индукцию направленной дифференцировки или направленной пролиферации и наоборот. Это возможно сделать, если использовать новый подход - перепрограммирование трансдукции (экспрессии или ингибирования) ключевых генов клетки сигнальными белками. Иллюстрацией этого положения служит работа ключевого гена опухолевой супрессии p53. Снижение экспрессии этого гена ниже нормальных величин запускает работу целого каскада генов в ядре клетки, результатом чего становится антиапоптозный эффект, неоангиогенез, пролиферация и клеточное размножение (патогенетические и патофизиологические условия формирования опухоли), а повышение экспрессии p53 приводит к запуску апоптоза, нарушения ангиогенеза, нарушению клеточной миграции и остановке процессов образования новых клеток (патогенетические звенья атрофических и дегенеративных процессов в мозге). Следовательно, управление ключевыми генами может стать основой управления основными клеточными процессами в заданном (репрограммированном) исследователем направлении развития определенных физиологических и алгоритмированных процессов в клетке.
Таким образом, учитывая недостаточность существующей биотехнологической базы генной терапии и отсутствие адекватного носителя генов, в настоящее время целесообразно отказаться от разрушения или приостановки функционирования патологических нервных клеток путем исправления дефектов конкретных мутантных генов и попытаться осуществить биокоррекцию развития клеточных процессов в патологической ткани, задавая программируемый вектор направления развития определенного клеточного цикла. Сегодня созданы все теоретические предпосылки и технологические возможности для осуществления такой биокоррекции (биорегуляции). Достаточно хорошо изучены механизмы клеточного и межклеточного сигналинга, возникновения и динамики развития апоптоза, клеточной дифференцировки, пролиферации и других клеточных процессов. Расшифровано большое количество участвующих в этих процессах сигнальных белков и созданы их рекомбинантные копии и антитела, которые свободно продаются ведущими мировыми биотехнологическими компаниями, например Sigmа-Аldriсh Соrр. (США) и МШiроrе Соrроrаtiоп (США), а также широко используются различными фармацевтическими компаниями для проведения клинических испытаний в онкологии, неврологии и нейрохирургии.
Однако до настоящего времени не известен универсальный «минибoт» для транспортировки сигнальных белков к месту их действия. Современная научная литература в области молекулярных исследований предлагает рассмотреть в качестве кандидатов на эту роль различные модифицированные бактерии, генно-инженерные конструкции и самосборные атомарные нанокострукции (наноботы). Разработаны различные иммунные моноклональные самонаводящиеся антительные бинарные системы со стрептаведином и биотином и иммунолипосомальные наноконструкции, позволяющие осуществить векторный суперселективный транспорт сигнальных молекул к различным клеткам опухоли или патологической зоны [4]. Однако эффекты, достигаемые этими препаратами, очень грубые и разрушающие, поэтому эти препараты не могут претендовать на использование их для целей коррекции клеточного сигналинга и биоуправления процессами в клетке.
Таким образом, возникла необходимость в разработке нового трансферного механизма доставки сигнальной информации, который бы смог обеспечить передачу информационного сигнального воздействия на уровень генома патологической клетки, минуя клетки соматических органов и здоровые клетки мозга, интегрировать взаимодействия на различных информационных уровнях и осуществить систему биоуправления и регуляции патологическим процессом на клеточном и межклеточном уровнях. Нужна новая методология и логистика целевого трансфера сигналов к конкретным генам клеток-мишеней патологической зоны в ЦНС.
Опираясь на фундаментальные принципы теории управления систем [8], можно предположить базовые принципы и механизмы регуляции вне- и внутриклеточного биосигналинга [9]. Для этого необходимо разработать определенные алгоритмы кратковременного управляющего сигнального воздействия (экспрессия, стабилизация, ингибирование) на определенные (ключевые) гены клетки и на основании этих алгоритмов запрограммировать сигнальное управляющее воздействие на объект управления (OY). ОУ должен адекватно и постоянно реагировать на клеточный сигналинг. Ответ на воздействие на ОУ необходимо мониторировать и регистрировать, что позволит постоянно осуществлять его коррекцию и управление. А мощность, периодичность и продолжительность сигналов не должны разрушать управляемую систему, которой и является клетка. Для этих целей существующие технологии иммунолипосомальных конструкций и бинарных систем не подходят, так как обладают очень «жecткими» параметрами воздействия на клетку.
В качестве управляемого «биoбoтa» для трансфера сигналов к патологической клетке авторы настоящего изобретения рассмотрели здоровую CK человека и Животных, которая по своей природе является универсальной управляющей системой, генетически запрограммированной на восстановление повреждений и регенерацию в поврежденных органах и тканях. Она обладает уникальной способностью мигрировать в зоны патологии по градиенту концентрации хемокинов и локальных провоспалительных факторов и может в полном объеме выполнить функции трансфера для необходимых сигнальных молекул. Анализ целого ряда научных фактов по функционированию CK в патологической зоне показывает, что при определенных клеточных событиях патологических клеток (например, при апоптозе) здоровая CK получает определенные сигналы от этих клеток, обрабатывает их и посылает обратные сигналы (на «выживaниe») поврежденным клеткам. Таким образом, CK осуществляют межклеточное и внутриклеточное биоуправление локальным саногенезом и репативными функциями клеток в ткани. В зависимости от степени повреждения, патологические клетки реагируют на данные сигналы (каскад цитокинов и нейрофических и других информационных факторов, выделяемых CK), и в них индуктивно запускаются сигнальные системы, способствующие формированию необходимых регенераторных процессов.
Таким образом, основной задачей настоящего изобретения является создание такого препарата стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, который обеспечил бы целевую доставку сигнальных веществ (т.е. сигнальных белков и фармацевтических препаратов, способных к регулированию сигнальных путей) строго в пораженную зону организма млекопитающего, а также запуск в заданное время и длительную поддержку активного сигнального межклеточного воздействия заданного терапевтического характера со стороны здоровой и хорошо управляемой CK на управляющую систему дефектной (мутантной нервной или раковой) клетки.
Решение указанной задачи достигается тем, что согласно настоящему изобретению предложен препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, содержащий базовый препарат стволовых клеток, в мембрану и/или ядро и/или цитоплазму которых имплантирован способный к регулированию сигнальных путей стволовых клеток и клеток патологического очага в организме млекопитающего белковый или фармацевтический препарат, предварительно инкапсулированный в наноконтейнеры, полученные из биодеградируемого материала, интактного для органелл и компартаментов стволовых клеток базового препарата и имеющего заданные сроки биодеградации в организме млекопитающего для обеспечения программируемого выхода белкового или фармацевтического препарата во внутри- или межклеточное пространство стволовых клеток и осуществления тем самым перепрограммирования сигнальной трансдукции ключевых генов стволовых клеток в требуемом терапевтическом направлении развития физиологических событий клеточного цикла непосредственно в патологической зоне органа или ткани организма, В качестве стволовых клеток базового препарата использованы преимущественно ауто логичные стволовые клетки.
Размер наноконтейнеров не превышает 100 нм. В качестве наноконтейнеров могут быть использованы наноконтейнеры на основе биополимерного материала. В качестве биополимерного материала могут быть использованы сополимеры полилактидгликолида и/или полиоксибутиратвалерата.
В качестве наноконтейнеров могут быть использованы также наноконтейнеры на основе липосом или наноэмульсии. Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа получения указанного препарата стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом.
Решение указанной второй задачи достигается тем, что согласно настоящему изобретению предложен способ получения препарата стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, включающий в себя выбор базового препарата стволовых клеток, выбор белкового или фармацевтического препарата, способного к регулированию сигнальных путей стволовых клеток и клеток патологического очага в организме млекопитающего, инкапсулирование выбранного белкового или фармацевтического препарата в наноконтейнеры из биодеградируемого материала, интактного для органелл и компартаментов стволовых клеток базового препарата и имеющего заданные сроки биодеградации в организме млекопитающего, и последующую имплантацию наноконтейнеров в мембрану и/или ядро и/или цитоплазму стволовых клеток базового препарата.
В качестве базового препарата выбирают преимущественно препарат с аутологичными стволовыми клетками.
Инкапсулирование можно проводить проводят путем ультрадиспергирования смеси биополимерного материала с белковым или фармацевтическим препаратом.
Имплантацию наноконтейнеров можно проводить путем прямых внутриклеточных инъекций суспензии или эмульсии наноконтейнеров в мембрану, цитоплазму или ядро стволовых клеток базового препарата, а также путем эндоцитоза наноконтейнеров в цитоплазму стволовых клеток при экспозиции суспензии или эмульсии наноконтейнеров в базовом препарате.
Преимущественно, заявленный способ получения заявленного препарата проводят в стерильных условиях или непосредственно в операционной (ех tеmроrо) или в культуральной лаборатории.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено применение заявленного препарата CK в качестве средства для внутри- и внеклеточной регуляции сигнальных путей патологических клеток при лечении заболеваний, повреждений и опухолей головного и спинного мозга, а также опухолей и метастатических поражений других органов и систем млекопитающего.
Механизм действия заявленного препарата CK с репрограммированным клеточным сигналингом обусловлен направленной миграцией в патологическую зону мозга или другого органа млекопитающего содержащихся в препарате CK с имплантированными в них сигнальными молекулами белкового или фармацевтического препарата, инкапсулированными в биодеградируемые наноконтейнеры. В результате строго заданной по времени биодеградации наноконтейнеров происходит запрограммированное высвобождение сигнальных молекул из наноконтейнеров в CK или межклеточное пространство патологической зоны и осуществляется заданное воздействие сигнальных молекул на внеклеточные и внутриклеточные сигнальные пути и трансдукцию генов с целью формирования терапевтических индуктивных клеточных процессов (инструктивного апоптоза, управляемой дифференцировки, индуктивной пролиферация и т.д.) в патологической зоне.
Теоретическим и экспериментальным обоснованием создания заявленного клеточного препарата с репрограммированным клеточным сигналингом явились собственные исследования авторов настоящего изобретения, а также убедительные экспериментальные доказательства, опубликованные в литературе [6], где показано, что CK способны мигрировать в опухоль и (или) зоны повреждения мозга по градиенту концентрации воспалительных хемокинов. Отработанные в эксперименте доказательства миграционных способностей HCK и гемопоэтических CK показали универсальность данного феномена для всех типов CK. Способности целевой миграции CK в патологические зоны мозга позволяют использовать CK в качестве универсального транспортного средства для доставки необходимых информационных и сигнальных воздействий в патологические зоны.
Препарат разрабатывался на экспериментальной модели опухоли мозга (глиоме C6), но в процессе создании и экспериментальном применении этого препарата открылись универсальные возможности его использования не только при патологии ЦНС, но и при заболеваниях других органов и систем человека и животных. Необходимо отметить, что предлагаемое согласно настоящему изобретению использование здоровых CK в качестве средства доставки сигнальных веществ к пораженным зонам в организме возможно только при выполнении определенных условий, а именно:
1. В зоне патологического процесса должна быть завершена острая фаза воспаления и практически снивелировано до минимума действие доминантных локальных воспалительных и деструктивных патогенетических факторов повреждения.
2. Повреждение или патогенное воздействие не должно приводить к необратимой мутации генов в ядре пострадавших клеток.
3. Должны сохраниться возможности обеспечения функционирования микроокружения патологической клетки.
В остальных случаях патологическая клетка становится нечувствительна к управляющим сигналам здоровой CK. Более того, в научной литературе описаны случаи формирования опухолей в тканях после трансплантации в них CK из-за трансформации здоровой CK в мутантную (раковую) CK под воздействием агрессии факторов воспаления и некроза. Поэтому применение первичных и даже культивированных CK без изменения клеточного сигналинга в них вряд ли оправдано при наличии острого воспаления, аутоиммунного процесса, атрофическом процессе, опухолях и в большинстве случаев противопоказано при целом ряде нервных болезней. В этих случаях необходимо усилить природные возможности к биорегуляции и регенерации собственных CK, что возможно при перепрограммировании функциональных возможностей первичных CK на генетическом уровне.
Если руководствоваться фундаментальными принципами теории управления систем, то в соответствии с настоящим изобретением, объектом управления (ОУ) становится патологически измененная мутантная клетка, а управление на себя должна взять здоровая управляемая CK. Чтобы лучше понять и прогнозировать поведение ОУ, можно воспользоваться кибернетическим принципом математической теории колебаний, согласно которому управляющей в системе является более медленная фаза [8]. Экстраполируя математический подход к системе клеточных взаимодействий, можно утверждать, что наиболее медленной фазой в развитии цикла клетки является функционирование самой CK. Нервная CK имеет самую медленную активность биологических процессов в нейрогенезе (полный цикл деления взрослой CK составляет 21 день, а ее предшественников - 12 часов). Мутантная (например, раковая) CK при глиоме имеет еще более медленный цикл деления (28 дней), и соответственно здоровая CK по отношении к ней является управляемой и соподчиненной. Поэтому сигналы здоровой CK не являются управляющими для мутантной (раковой) CK. Именно заторможенность биологических процессов в раковой клетке делает ее малочувствительной к лучевой и химиотерапии, тогда как активно делящиеся клетки полностью отвечают на лучевую нагрузку и химиотерапевтическое воздействие. Наиболее вероятно, что мутантная CK функционирует по принципу разомкнутого управления. Сущность этого принципа состоит в том, что программа управления жестко определена задающим устройством (задающим сигналом). Управление не учитывает влияние возмущений на параметры процесса. Здоровая CK работает по принципу компенсации и принципу обратной связи. Сущность принципа компенсации заключается в возможности коррекции управляющего воздействия при отклонении от заданной величины на входе ОУ путем суммирования сигнала управляющего устройства с корректирующим воздействием, пропорциональным возмущению и компенсирующим его влияние. Принцип обратной связи базируется на том, что управляющее воздействие корректируется в зависимости от выходной величины сигнала. Если значение выходной величины отклоняется от требуемого, то происходит корректировка сигнала с целью уменьшения данного отклонения.
Таким образом, с кибернетических позиций теории управления систем становится понятна глубинная сущность неэффективности лечения нейроонкологической и нейро дегенеративной патологии существующими терапевтическими подходами. К решению этих проблем можно подойти с новых методологических позиций. Классической иллюстрацией математического принципа разомкнутого управления в технике является магнитофон, который функционирует в строго заданном режиме воспроизведения звука и не реагирует ни на какие внешние воздействия. Но с помощью сигнального воздействия (реостата сопротивления, вставленного в электрическую цепь) можно замедлить или убыстрить воспроизведение звука. Трансформируя вышеизложенное на биологический язык, соответствующими доминантными сигналами можно ускорить или усилить активность управляющей мутантной CK и сделать ее управляемой в общем континууме изучаемых клеточных систем, подчинить сигналингу здоровой CK и, как следствие, повести в заданном терапевтическом направлении функционирование клеточного цикла. Более того, изменив биологическую функциональную активность раковой CK, можно сделать ее восприимчивой к стандартным режимам лучевой и химиотерапии.
В соответствии с вышеизложенным, проблема разработки новых методов лечения нервных и онкологических болезней с использованием настоящего изобретения переходит в плоскость управления взаимодействием двух биологических систем - с одной стороны мутантная (раковая) CK, с другой - здоровая CK.
При решении вышеуказанной задачи, касающейся запуска и длительной поддержки активного сигнального межклеточного воздействия со стороны здоровой CK на управляющую систему дефектной клетки, необходимо обеспечить возможность постоянной генерации сигнала определенной силы внутри здоровой стволовой клетки, учитывая то, что здоровая CK, являясь генетически детерминированным биологическим объектом, способна мигрировать в зону опухоли или патологический очаг пациента. В этой связи запустить работу ключевых генов воздействием на известные сигнальные механизмы не представляет большого труда. Старт репрограммирования CK возможно осуществить при химическом, физическом или интервенционном воздействии на CK молекулами сигнальных рекомбинантных белков или антител к ним iп vitrо перед трансплантацией CK пациенту. Эффект данного воздействия в ряде случаев будет достаточно сильным, но кратковременным и нестойким. Это может привести к разбалансировке функционирования компартаментов CK и нарушить ее миграционные и навигационные способности. Поэтому согласно настоящему изобретению предложено новое техническое решение по репрограммированию трансдукции ключевых генов соматических CK - инкапсулировать белковые и фармацевтические препараты клеточного сигналинга (т.е. препараты, способные к регулированию сигнальных путей стволовых клеток и клеток патологического очага в организме млекопитающего) в наноконтейнеры из биодеградируемого материала, интактного для органелл стволовой клетки, и имплантировать наноконтейнеры с находящимися в них препаратами клеточного сигналинга в мембрану, ядро или цитоплазму CK. Это обеспечивает целевую доставку здоровых CK в пораженную зону организма и активизацию (запуск) терапевтических Индуктивных клеточных процессов, таких как апоптоз, пролиферация, дифференцировка, биоактивация клеточных процессов и т.д.) именно в этой пораженной зоне в результате разрушения биодеградируемой оболочки наноконтейнеров в заданный период времени и предотвращение за счет этого нежелательного, а во многих случаях, и опасного действиям указанных препаратов клеточного сигналинга на здоровые клетки других участков организма пациента.
Заданные временные параметры биодеградации материала наноконтейнеров позволяют информационным молекулам цитокинов и нейротрофических факторов выходить из бионейтральной оболочки наноконтейнера (нанокапсулы) в цитоплазму CK через строго определенное время после введения предложенного препарата CK пациенту и осуществлять запрограммированное воздействие сигнальных молекул на необходимые компоненты сигнальных путей и (или) гены ядра клетки, вызывая их экспрессию (индукцию) и направляя развитие клеточного цикла в заранее определенном терапевтическом направлении посредством внутриклеточных или внеклеточных сигналов.
Методология выделения ключевых (управляющих) генов основана на фундаментальных принципах теории управления систем и на результатах транскрипционно-протеомного анализа биоптата патологического участка нервной ткани данного пациента, культуры его мутантных (раковых) CK, выделенных из биоптата, и нативных мобилизованных здоровых CK пациента. Ключевыми генами должны считаться только те гены, экспрессия белков которых значительно ниже показателей нормы. Параметры нормы в каждом конкретном случае определяются на основании изучения экспрессии протеинов здоровых CK пациента при проведении их транскрипционно-протеомного анализа. Количественные показатели экспрессии белков выделенных ключевых генов мутантной (раковой) CK являются базовыми для анализа и подбора сигнальных молекул с целью выбора требуемого белкового или фармацевтического препарата и расчета их безопасной концентрации при имплантации в нативные здоровые CK пациента. Методология выбора сигнальных молекул для репрограммирования экспрессии
(индукции) ключевых генов аутологичных CK должна базироваться на следующих положениях:
1. Сигнальная молекула должна регулировать экспрессию (индукцию) тех сигнальных систем или ключевых генов здоровой CK, функционирование которых обеспечит формирование нового внутриклеточного сигнального пути, результатом чего станет образование внеклеточного или внутриклеточного сигнала, необходимого для развития событий определенного запрограммированного клеточного цикла.
2. В структуре сигнального пути определенного клеточного события сигнальная молекула должна обеспечить строгое развитие клеточных событий по заданному сценарию на разных этапах сигнального пути от ее освобождения до реализации внеклеточного ответа CK.
3. Сигнал внеклеточного ответа CK, запущенный внутриклеточной управляющей сигнальной молекулой, должен изменить биологическую активность клетки и направление ее физиологического функционирования.
При выборе сигнального препарата сигнального вещества (белкового или фармацевтического) целесообразно руководствоваться нижеперечисленными базовыми принципами репрограммирования трансдукции (экспрессии или индукции) ключевых генов здоровых CK. Принцип разноуровневости сигнального воздействия. Сущность принципа заключается в воздействии внеклеточного сигнала здоровой CK не менее чем на три различных рецептора или сигнальных пути мутантной (раковой) CK, что позволит дублировать управляющий сигнал на внеклеточном и внутриклеточном уровнях.
Принцип одновекторности применения различных сигналов заключается в воздействии различных внеклеточных сигнальных молекул нативной CK на сигнальные пути мутантной (раковой) CK в рамках строго заданного сценария развития событий клеточного цикла (например, развития инструктивного апоптоза).
Принцип доминантности управляющего сигнала здоровой CK предполагает, что запрограммированное сигнальное воздействия здоровой CK на мутантную (раковую) CK должна обеспечить повышение активности экспрессии ее ингибированных ключевых генов (преимущественно не менее чем в 2 раза).
В отличие от известных методов генотерапии, настоящее изобретение не ставит задачу восстановления поврежденных генов, создания мутантных генов, постоянно продуцирующих определенный белок, лизирования генов или блокирования способности к трансляции данного гена. В настоящем изобретении предлагается «блoчнoe» управление экспрессией (индукцией) ключевых генов в конкретном физиологическом направлении развития определенного комплекса клеточных событий. Согласно настоящему изобретению клеткой-мишенью становится не только опухолевая и раковая CK, но и здоровая аутологичная CK, трансплантированная пациенту. В настоящем изобретении показана возможность биоуправления CK за счет интервенционного программируемого воздействия факторов внутриклеточной и внеклеточной регуляции (молекулы сигнальных белков) на гены раковой и здоровой CK с использованием физиологических механизмов клеточного сигналинга. Транскршщионно-протеомным сравнительным анализом раковой CK и клеток опухоли со здоровыми CK пациента определяются ключевые гены и сохранные звенья генома патологической клетки, а также выявляются нарушения сигнальных путей генома опухолевой клетки [7]. Контролем для сравнения являются показатели экспрессии генов здоровых (гемопоэтических, нейральных или мезенхимальных) CK. Ключевые гены раковой CK определяются как гены с самой низкой экспрессией, а самые высокие показатели экспрессии генов позволяют верифицировать структуру нарушений сигнальных путей. Анализ экспрессии выделяемых ключевых генов раковой CK и опухолевых клеток позволяет выявить патологию основных сигнальных путей клеток патологической зоны в мозге, мониторировать молекулярные процессы, проходящие в патологической клетке при проводимой терапии как iп vitrо так и iп vivо, а также оценивать эффективность и качество проводимой терапии. Последующее лечение с помощью предложенного препарата CK обеспечивает запуск инструктивных индукционных управляемых клеточных процессов в патологических клетках (индукционный инструктивный апоптоз, индукционная направленная дифференцировка и коммитирование клеток в опухоли, индукционная программируемая пролиферация, репрограммируемая активация экспрессии ключевых генов для повышения активности раковых CK с целью усиления эффективности лучевой и химиотерапии и т.д.). Воздействие на трансдукцию генов и сигнальные пути клеток-мишеней осуществляется короткими индукционными сигналами клеточно- межклеточного взаимодействия, поступающими от сигнальных молекул (цитокинов, моноклональных антител, рекомбинантных лиrанд, факторов роста, белков теплового шока и т.д.), высвобождающихся из биодеградируемых наноконтейнеров, в результате чего запускается действие промоторов или ингибиторов генов ядра CK. Сигналы начинают поступать внутрь клетки и во внеклеточное пространство по истечении заданного времени после введения предложенного препарата CK в организм пациента. Это время определяется временем начала биодеградации наноконтейнеров и необходимо для того, чтобы CK предложенного препарата в результате своей способности к миграции в патологическую зону организма успели доставить наноконтейнеры с молекулами сигнального вещества в эту зону. При этом необходимо обеспечить многовекторность и многоуровневость воздействия на различные рецепторы одних и тех же клеток-мишеней в терапевтическом направлении.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение поясняется чертежами. На фиг. 1 представлена схема сигнальных путей формирования апоптоза (стрелками показаны возможные точки приложения регуляторного сигнального воздействия для формирования алгоритмированной регуляции апоптоза в аутологичной CK); на фиг. 2 - полученное с помощью электронного микроскопа изображение наноконтейнеров с белковым препаратом; наноконтейнеры получены на основе биополимеров); на фиг. 3 — MPT головного мозга крысы с экспериментальной глиомой C6 на восемнадцатые сутки (фиг. ЗА) и двадцать шестые сутки (фиг. 3B) после имплантации предложенного препарата CK с наноконтейнерами, содержащими промоторы апоптоза (аксиальная проекция; Tl -взвешенное изображение, контрастированное Магневистом). Ниже описаны преимущественные примеры осуществления способа получения заявленного препарата CK с репрограммированным клеточным сигналингом согласно настоящему изобретению.
Варианты осуществления изобретения
Выбор базового препарата CK Изготовление базового клеточного препарата осуществлялось на основе стандартного препарата гемопоэтических CK, способ приготовления которого описан в патенте RU 2283119 (МПК A61K 35/14, .09.2006) на «Пpeпapaт аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, способ его получения, криоконсервации и использования для травматической болезни центральной нервной cиcтeмы». Для базового препарата могут использоваться также аутологичные нейральные стволовые клетки (HCK), полученные из обонятельной выстилки слизистой носа пациента. Методика и протокол получения HCK опубликованы [11-14].
Ткань обонятельной выстилки, включающую обонятельный эпителий и слой соединительной ткани (lаmiпа рrорriа), получают от пациентов и обрабатывают по стандартному культуральному протоколу, описанному в научной литературе [15, 16]. Под местной анестезией у пациента берут фрагменты слизистой оболочки размером х 5 мм, которые иссекают из верхнего отдела верхней носовой раковины. Полученную ткань доставляют в лабораторию в охлаждённом сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) без Ca2+ и Mg2+, содержащем антибиотики и антимикотики (1 :100; Gibсо, Sigmа). Время доставки не должно превышать 2 часов. После повторной промывки в том же растворе из слизистой оболочки удаляют кровеносные сосуды, после чего ткань измельчают и инкубируют в течение 40 минут при 36,50C в растворе трипеина/ЭДТА 0,25%, приготовленном на 0,01 M фосфатном буфере (PBS, рН 7,4). Действие ферментов блокируют средой DMEM (Gibсо), содержащей 3% сыворотки. Ткань промывают в трёх сменах раствора Хенкса (HBSS) и диссоциируют повторным пипетированием в питательной среде. Состав среды: минимальная среда Игла (MEM, Sigmа) 90%, эмбриональная сыворотка телят (FBS, Gibсо, Ivitrоgеп), глюкоза 0,8%, глутамин 2 мМ (Gibсо), добавок B27 (Sigmа), HEPES 20 мМ, а также ростовые факторы (только для первичных культур) - фактор роста фибробластов (FGF2, lнг/мл, Sigmа) и нейроростовой фактор (NGF 2 нг/мл, Sigmа).
Полученную суспензию клеток центрифугируют (3 мин при 1200 об/мин), а осадок ресуспендируют в питательной среде того же состава. Количество и жизнеспособность диссоциированных клеток определяют в камере
Горяева после окраски 0,1% раствором трипанового синего. Для последующего культивирования используют клеточные суспензии только с 85-95% жизнеспособных клеток.
Диссоциированные клетки (5-105 кл/мл) культивируют в 12-лyнoчныx планшетах на полилизин-ламининовом субстрате в течение 14 суток (36,50C, 5% CO2). Частичную смену 1/3 части питательной среды производят два раза в неделю. Первичную культуру после формирования сливного монослоя снимают с помощью раствора трипсина/ЭДТА. После промывки в HBSS и центрифугирования клетки ресуспендируют в питательной среде. Клеточную суспензию (10000-12000 кл/см2) переносят в 12-лyнoчныe планшеты или флаконы (площадь 25 см2). Таким способом культуры пассируют 4 раза до формирования сливного монослоя. Формирующиеся в клеточном монослое прикреплённые к субстрату и свободноплавающие нейросферы отбирают с помощью Пастеровских пипеток и диссоциируют описанным выше методом ферментной обработки. Выделение нейросфер позволяет отделить их от прикреплённых к субстрату обклад очных глиальных клеток, фибробластов и стромальных (опорных) клеток. Клеточную суспензию клеток нейросфер после промывки и центрифугирования ресуспендируют в питательной среде и культивируют в 12-лyнoчныx планшетах (10000-12000 кл/см2) и на покровных стеклах (18x18 мм) в чашках Петри до формирования сливного монослоя. Полученные культуры используют Для цитологических и иммуноцитохимических исследований. Часть клеток последних Пассажей замораживют в среде для криоконсервирования (90% сыворотки, % Диметилсульфоксида) и хранят в жидком азоте.
Клеточный монослой фиксируют в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,01 M фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 30 мин. После промывки в PBS (3 х мин.) клетки инкубируют 24 часа при 40C с первичными антителами к β-тубулину (1 :300, Сhеmiсоп), нестину (1 :100, Сhеmiсоп) и нейрональной специфической енолазе (1 :100, антитела получены в лаборатории заявителя настоящей заявки). После промывки в PBS клетки последовательно обрабатывают биотиншжрованными антителами с авидин-биотиновым комплексом (ABC, Vесtоr Lаbоrаtоriеs, Iпс) и раствором диаминобензидина, приготовленным на фосфатном буфере (DBA 0,5 мг/мл., перекись водорода 0,03%,). Препараты обезвоживают и заключают под покровные стекла в синтетическую смолу (Епtеllап, Меrk).
Чтобы исключить возникновение реакций «тpaнcплaнтaт против xoзяинa», для получения базового препарата необходимо применять только аутологичный биоматериал, например, HCK, выделенные из обонятельной выстилки носа пациента или препарат культуры гемопоэтических стволовых клеток (CD34+), выделенных из высокоочищенной смеси мононуклеаров, полученных из лейкоконцентрата мобилизованных CK периферической крови пациента. Могут быть также использованы культуры мезенхимальных CK, полученных из биоптата костного мозга пациента. Однако нельзя полностью исключать возможность использования базового препарата и из алогенных CK.
Выбор белкового или фармацевтического препарата
Сигнальные белки или фармацевтический препарат, способный к регулированию сигнальных путей CK и клеток патологического очага, выбираются в каждом конкретном случае индивидуально в зависимости от задач индукционной клеточной терапии.
В нижеприведенной таблице представлены примеры терапии с использованием известных сигнальных веществ (агентов, влияющих на раковую CK или ее нишу), которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Индукционная (сигнальная) терапия, направленная на опухолевые клетки и раковые CK
Таблица
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Учитывая, что апоптоз в настоящее время является самым изученным клеточным процессом, было решено отрабатывать новый клеточный препарат с репрограммируемыми свойствами именно на модели этого физиологического клеточного события. Общая схема сигнальных путей формирования апоптоза представлена на фиг. 1. Из схемы видно, что процессы апоптоза запускают внеклеточные молекулы сигнальных белков фактора некроза опухоли (TNFa), белки рецепторов смерти (FAS-L), инсулиновый фактор роста (IGF). Активировать процесс можно также и на внутриклеточном уровне, воздействуя на каспазы и ген p53. Таким образом, для целей программирования индукционного инструктивного апоптоза в опухоли мозга, в качестве сигнальных белков должны быть выбраны вещества, участвующие в сигнальных цепях апоптоза. Примерами таких веществ могут служить рицин и вискумин.
Авторами настоящего изобретения было организовано проведение экспериментов по проверке цитотоксического действия рицина и вискумина на клетки нейроглиомы Сб. Было показано, что эти белки обладают высокой функциональной активностью по отношению к клеткам данной линии. Величина ЛД50 составила 5x10" моль для рицина и 5x10"' ' моль для вискумина. С использованием четырех специфических методов было показано, что оба белковых токсина вызывают апоптоз клеток нейроглиомы Сб. С помощью микроскопических методов удалось выявить фрагментацию ядер и экспозицию фосфатидилсерина на клеточной мембране. Использование проточного цитофлуориметра позволило выявить процент клеток, в которых наблюдается фрагментация ДНК после обработки данными токсинами. Электрофорез выявил специфическую фрагментацию ДНК, характерную для действия кacпaзa-3 -зависимой апоптотической эндонуклеазы CAD. В качестве примера фармацевтического препарата, используемого в заявленном изобретении, можно указать рапамицин, подавляющий рост раковых CK и стимулирующий рост нормальных CK (см. таблицу).
Инкапсулирование выбранного белкового или фармацевтического препарата в наноконтейнеры из биодеградируемого материала Авторами настоящего изобретения были разработаны определенные технические условия для производства наноконтейнеров (нанокапсул):
1. Размер нанокапсула не должен превышать 100 нм.
2. Нанокапсула должна внутри себя герметично содержать молекулы сигнального вещества и быть покрытой снаружи биодеrрадируемой биополимерной или липосомальной оболочкой, биологически нейтральной для организма и имеющей заданные сроки ее биодеградации внутри организма.
3. Нанокапсулы должны быть нейтральными для внутренних компартаментов клетки и не очень сложными в производстве.
4. Процесс биодеградации нанокапсулы должен начинаться в строго заданный период времени после введения препарата CK в организм пациента. В зависимости от конкретных условий и задач лечения этот период может задаваться в очень широком диапазоне - от 1-2 часов до нескольких суток или даже месяцев. 5. По возможности, нанокапсула должна иметь способность к управляемой
(программируемой) биодеградации под воздействием методов ионизирующей радиации, лазерного излучения и (или) химических агентов, чтобы иметь при необходимости возможность управлять процессом клеточного сигналинга по заранее определенному алгоритму (программе) в зависимости от конкретных условий и задач лечения.
6. Нанокапсула должна биодеградировать на безопасные для клетки компоненты.
7. Нанокапсула должна быть контрастна для методов лучевой диагностики и легко диагностироваться методами компьютерной и магнитно-резонансной томографии.
8. Находящиеся внутри нанокапсулы молекулы сигнального вещества должны в максимальной степени сохранять свою потенциальную активность, чтобы полностью реализовать ее после выхода из нанокапсулы в результате биодеградации последней.
9. Нанокапсула должна легко имплантироваться через плазматическую мембрану клетки внутрь ее цитоплазмы путем эндоцитоза, путем прямой внутриклеточной инъекции или с использованием физиологических подходов и физико-химических методов воздействия на CK.
. Биодеградируемый материал оболочки нанокапсул в ряде случаев должен обладать способностью к конъюгированию с липидами для обеспечения возможности прикрепления («зaякopивaния») нанокапсул на плазматическую мембрану CK.
11. Предлагаемый клеточный препарат с нанокапсулами должен соответствовать критериям безопасности и быть нетоксичным.
Для производства нанокапсул необходимо выбрать биодеградируемый материал. В соответствии с поставленными задачами настоящего изобретения, для доставки молекул сигнального белка в клетки-мишени были использованы нанокапсулы трех видов: 1) биодеградируемые нанокапсулы на основе биополимерных материалов (сополимеры полилактидгликолида и сополимеры полиоксибутиратвалерата);
2) биодеградируемые нанокапсулы на основе липосом;
3) наноэмульсии. Во всех трех указанных случаях нанокапсулирования БАВ получаемый размер наночастиц был в диапазоне от до 100 нм, что делало их способными к пассивной диффузии в CK или к активному захвату клетками путем пиноцитоза, в то время как нанокапсулы с размером более. 100 нм способны распространяться только в межклеточном пространстве. Полученные нанокапсулы с молекулами сигнального белка внутри них помещали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и хранили при температуре минус 12°C до их дальнейшего анализа и использования.
Биодеградируемые нанокапсγлы на основе биополимерных материалов (сополимеры полилактидгликолида и сополимеры полиоксибутиратвалерата) Инкапсуляцию сигнального белка в биополимерный (полилактидгликолидный или полиоксибутиратвалератный) носитель проводили на экспериментальной установке следующим образом. Навеску лиофилизированного препарата сигнального белка, предварительно перемешанного с мелкодисперсным порошком полилактида (средний размер частиц -20 мкм) загружали в камеру высокого давления с последующим наполнением CO2. Температуру камеры поддерживали на уровне 50°C, а температура сопла составляла около 30°C. Давление сверхкритического CO2 составляло МПа. Содержимое автоклава тщательно перемешивали с помощью магнитного смесителя (150 об/мин) в течение 60 мин с последующим сбросом полученной смеси и диоксида углерода через сопло в приемную камеру. После выдержки полученного продукта в атмосферных условиях в течение 3 часов (это необходимо для полного удаления CO2 из частиц полимера и их окончательного затвердевания) собранные частицы подвергали ультрадиспергированию до размера нанокапсул не более нм. Ультрадиспергирование проводили в погружном диспергаторе Tl 8 bаsiс ULТRА-ТURRАХ. Диспергирующий элемент - S18N-19G (ПСА- WERKE GMBH & СО. KG, Германия). Биодеградируемые нанокапсулы на основе липосом
Предпочтительные методы получения смешанных липосом из нефосфолипидных амфифильных мембранных миметиков и фосфолипидов основаны на фазовом поведении амфифильных липидов и фосфолипидов. Объемное соотношение водного раствора амфифильного мембранного миметика и водного раствора фосфолипида составляло от 5:1 до 20:1. Температура смешивания от до 200C. Иногда требовалось нагреть амфифильный мембранный миметик и другие ингредиенты, чтобы получить гомогенный водный раствор перед добавлением фосфолипидов. Белковый или фармацевтический препарат сигнального вещества добавляли к ингредиентам в процессе их смешивания.
Получение липосом заданного размера (не более нм) осуществляли двумя способами:
1. Интенсивно перемешивали ингредиенты, добавляемые в определенном порядке, до получения мультиламеллярных везикул. Далее проводили измельчение частиц до получения одноламеллярных или малых мультиламеллярных липосом.
2. С помощью форсунок: (а) впрыскивали раствор фосфолипида на высокой скорости минимум через одно сопло в водную фазу мембранного миметика амфифильной природы или (б) впрыскивали мембранный миметик амфифильной природы минимум через одно сопло в водную фазу фосфолипида или (в) впрыскивали раствор фосфолипида на высокой скорости минимум через одно сопло одновременно с впрыском раствора мембранного миметика амфифильной природы также минимум через одно сопло в общий резервуар.
Наноэмульсии Получение ультрамикроэмульсий (с размером частиц не более нм) осуществляли на основе спонтанно диспергирующихся концентратов фармакологически активных сложных эфиров (АСЭ). В качестве АСЭ можно применять ундеценоаты, лаураты, пальмитаты, стеараты. Спонтанно диспергирующийся концентрат разбавляли фосфатным буфером, содержащим препарат сигнального белка, и получали термодинамически стабильную ультрамикроэмульсию с мицеллами радиусом 1,5-3 нм. Для увеличения времени жизни эмульсии «вoдa в мacлe» в водную фазу добавляли эмульгаторы, стабилизаторы и др. Молекулы сигнального белка находились в водной фазе.
При определении задаваемого времени биодеградации нанокапсул внутри клетки следует принимать во внимание, какое конкретное сигнальное вещество будет инкапсулироваться, а также учитывать метод изготовления нанокапсул, что позволит «зaпpoгpaммиpoвaть» время выхода сигнального вещества в аутологичную CK из нанокапсулы в строго заданный период. Экспериментально доказаны и клинически подтверждены высокие биосовместимые свойства предложенных нанокапсул.
Имплантация наноконтейнеров в CK базового препарата
Имплантация наноконтейнеров (нанокапсул) в CK базового препарата осуществлялась при экспозиции суспензии или эмульсии нанокапсул с находящимися в них молекулами сигнального белка в базовом препарате CK в течение 60 минут или при культивировании аутологичных CK в стандартных условиях в течение 24 часов с добавлением к ним раствора нанокапсул с молекулами сигнального белка.
Кроме того, для имплантации нанокапсул согласно настоящему изобретению имеется принципиальная возможность применять стандартные методы генотерапии, например, прямые внутриклеточные инъекции суспензии или эмульсии нанокапсул в мембрану, цитоплазму или ядро CK базового препарата, а также использование коньюгатов нанокапсул с холерным токсином, холестерином, полиэтиленгликолем и асиалгликопротеинами, использование катионных липидов с нанокапсулами, ковалентных липофильных соединений с нанокапсулами, иммунолипосом с нанокапсулами, нейтральных липосом с нанокапсулами, углеводородных энхасер клеточной проницаемости и мембранных фьюжен-генных составляющих.
В ряде случаев изготавливали композитные нанокапсулы, оболочка которых состояла из биодеградируемого биополимера и белков оболочки вируса герпеса. Использование нейротропных белков вируса герпеса для оболочки нанокапсулы имитирует псевдовирусный капсид. В этом случае, наружняя оболочка нанокапсулы может сливаться с плазматической мембраной аутологичной CK, и нанокапсулы с молекулами сигнального белка легко проникают в CK путем ее активного эндоцитоза.
Описанные методы инкапсулирования белковых водорастворимых препаратов в наноконтейнеры можно также применить для суперселективного трансфера традиционных химиотерапевтических препаратов, используемых для цитотоксической и циторедукционной терапии. Предложенный препарат аутологичных CK с наноконтейнерами позволит осуществить целевую доставку наноконтейнеров с фармацевтическим препаратом (химиопрепаратом) в зону ' опухоли, используя миграционные механизмы хоуминга CK в патологическую зону.
Полученный в соответствии с настоящим изобретением препарат CK с репрограммированным клеточным сигналингом может быть введен в организм пациента известными методами, например путем интрацеребральной, интрамедулярной, внутрижелудочковой, интратекальной или ' внутрисосудистой трансплантации в зависимости от целей лечения, а также путем имплантации в тканево-инженерные конструкции, используемые для закрытия дефектов головного и спинного мозга. Исходя из вышеизложенного, настоящее изобретение может быть рассмотрено как новое направление в лечении опухолей, ишемических, дегенеративных и травматических повреждений ЦНС и квалифицироваться как высокотехнологичный метод клеточной цитокоррекционной или циторегуляционной терапии опухолей ЦНС, а также терапии других солидных опухолей и соматических заболеваний. Конкретные примеры осуществления настоящего изобретения и используемые при этом приемы приведены в данном описании только в пояснительных целях и не ограничивают объем и сущность изобретения, которые определяются исключительно нижеизложенной формулой изобретения. Специалистам в данной области техники будут понятны возможные различные варианты и модификации настоящего изобретения, не выходящие за пределы формулы изобретения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брюховецкий А.С. Трансплантация нервных клеток и тканевая инженерия мозга при нервных болезнях. - M.: ЗАО Клиника «Heйpoвитa», 2003.
2. Коbауаshi N., Nаvаrrо-Аlvаrеs N., Sоtо-Guеtiеrrеz А., Каvаmоtо Нirопоbu. еt аl. Cancer Stem CeIIs Rеsеаrсh: Сштепtlу Situаtiоп апd Problems//Cell Тrапsрlапtаtiоп, 2008,
Vol.l7, p.l9-25.
3. Брюховецкий А.С, Чехонин В. П., Менткевич Г.Л. Стволовые клетки в нейроонкологии: здоровые и раковые стволовые клетки, их возможная роль и место в канцерогенезе и современных высокотехнологичных сценариях лечения опухолей мозга. Материалы научно-практической-конференции «Bыcoкиe технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы)). - M., 2008, с. 43-44.
4. Введение в молекулярную медицину. Под ред. А.А.Пальцева. - M.: Медицина, 2006.
5. Цымбалюк В. И., Медведев В. В. Нейрогенные стволовые клетки. Монография. - Киев: Издательство «Koвaль»5 2005.
6. ZigоvаТ., Snyder E., Sanberg P. Nеurаl Stem CeIIs fоr Вrаiп апd Sрiпаl Соrd Rераir, 2003.
7. Пальцев M.A., Иванов A.A., Северин CE. Межклеточные взаимодействия. - M.: Медицина, 2003.
8. Неймарк Ю.И., Коган P.Я., Савельев В.П. Динамические модели теории управления. - M.: Наука , 1985.
9. Гродинз Ф. Теория регулирования и биологические системы. - M.: Мир, 1966. . Фокин СВ., Беркинблит М.Б. Математические проблемы в биологии. - M., 1973.
11. Zhang X., Кluеbеr К. M., Guо Z. // Ехреrimепtаl Nеurоlоgу, - 2004, VoI. 186, р. 112-123.
12. Zhang X., Саi J., Кluеbеr К.М. еt аl. // Stеm Сеlls, 2005, VoI. 23,-p. 442-453.
13. Zhang X., Саi J., Кluеbеr К. M. аt аl. // Stеm Сеlls, 2006а, VoI. 24, р. 434-442. 14. Zhang X., Кluеbеr K.M., Guо Z. еt аl. // Вrаiп Rеs., 2006b, Vol.1073-1074, р. 109-
119.
15. Маrshаll СТ., Guо Z., Lu С еt аl. // Вrаiп Rеs., 2005, VoI. 1045, р. 45-56.
16. Маrshаll СТ., Lu С, Wiпstеаd W. еt аl. // Нistоl. НistораtоL, 2006, VoI. 21, р. 633- 643.

Claims

Формула изобретения
1. Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сиrналингом, содержащий базовый препарат стволовых клеток, в мембрану и/или ядро и/или цитоплазму которых имплантирован способный к регулированию сигнальных путей стволовых клеток и клеток патологического очага в организме млекопитающего белковый или фармацевтический препарат, предварительно инкапсулированный в наноконтейнеры, полученные из биодеградируемого материала, интактного для органелл и компартаментов стволовых клеток базового препарата и имеющего заданные сроки биодеградации в организме млекопитающего для обеспечения программируемого выхода белкового или фармацевтического препарата во внутри- или межклеточное пространство стволовых клеток и осуществления тем самым перепрограммирования сигнальной трансдукции ключевых генов стволовых клеток в требуемом терапевтическом направлении развития физиологических событий клеточного цикла непосредственно в патологической зоне органа или ткани организма.
2. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стволовых клеток базового препарата использованы аутологичные стволовые клетки.
3. Препарат стволовых клеток по п. 1, отличающийся тем, что размер наноконтейнеров не превышает 100 нм.
4. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве наноконтейнеров использованы наноконтейнеры на основе биополимерного материала.
5. Препарат по п. 4, отличающийся тем, что в качестве биополимерного материала использованы сополимеры полилактидгликолида и/или полиоксибутиратвалерата.
6. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве наноконтейнеров использованы наноконтейнеры на основе липосом.
7. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве наноконтейнеров использованы наноэмульсии.
8. Способ получения препарата стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, включающий в себя выбор базового препарата стволовых клеток, выбор белкового или фармацевтического препарата, способного к регулированию сигнальных путей стволовых клеток и клеток патологического очага в организме млекопитающего, инкапсулирование выбранного белкового или фармацевтического препарата в наноконтейнеры из биодеградируемого материала, интактного для органелл и компартаментов стволовых клеток базового препарата и имеющего заданные сроки биодеградации в организме млекопитающего, и последующую имплантацию наноконтейнеров в мембрану и/или ядро и/или цитоплазму стволовых клеток базового препарата.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что выбирают базовый препарат с ауто логичными стволовыми клетками.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что инкапсулирование проводят путем ультрадиспергирования смеси биополимерного материала с белковым или фармацевтическим препаратом.
11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что имплантацию наноконтейнеров проводят путем прямых внутриклеточных инъекций суспензии или эмульсии наноконтейнеров в мембрану, цитоплазму или ядро стволовых клеток базового препарата.
12. Способ по п. 8, отличающийся тем, что имплантацию наноконтейнеров проводят путем их эндоцитоза в цитоплазму стволовых клеток при экспозиции суспензии или эмульсии наноконтейнеров в базовом препарате.
13. Способ по п. 8, отличающийся тем, что его проводят в стерильных условиях или непосредственно в операционной (ех tеmроrо) или в культуральной лаборатории.
14. Применение препарата стволовых клеток по любому из п. п. 1-7 в качестве средства для внутри- и внеклеточной регуляции сигнальных путей патологических клеток при лечении заболеваний, повреждений и опухолей головного и спинного мозга, а также опухолей и метастатических поражений других органов и систем млекопитающего .
PCT/RU2009/000424 2008-12-30 2009-08-20 Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, способ получения этого препарата и его применение Ceased WO2010077168A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/143,049 US20110268774A1 (en) 2008-12-30 2009-08-20 preparation of stem cells with reprogrammed cell signalling, a method of producing the preparation and a method of use thereof
EP09836446.6A EP2380973A4 (en) 2008-12-30 2009-08-20 PREPARATION BASED ON REPROGRAMMABLE CELL SIGNALING STEM CELLS, METHOD OF MAKING THE PREPARATION AND USE THEREOF

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008152343 2008-12-30
RU2008152343/15A RU2428475C2 (ru) 2008-12-30 2008-12-30 Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, способ получения этого препарата и его применение

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010077168A1 true WO2010077168A1 (ru) 2010-07-08

Family

ID=42309989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2009/000424 Ceased WO2010077168A1 (ru) 2008-12-30 2009-08-20 Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, способ получения этого препарата и его применение

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110268774A1 (ru)
EP (1) EP2380973A4 (ru)
RU (1) RU2428475C2 (ru)
WO (1) WO2010077168A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2628092C1 (ru) * 2016-02-10 2017-08-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) Способ получения МСК-ассоциированных недифференцированных гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипов CD34+/CD133+

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2535972C2 (ru) * 2012-12-24 2014-12-20 Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ Противоопухолевый индивидуальный протеом-основанный таргетный клеточный препарат, способ его получения и применение этого препарата для терапии рака и других злокачественных новообразований
RU2634032C1 (ru) * 2016-09-29 2017-10-23 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ определения кинетики биодеградации полимерных скаффолдов in vivo
CA3080691C (en) * 2017-11-10 2022-11-15 Regenesis Science Co., Ltd. Method for producing cultured cell, and method for producing therapeutic agent for spinal cord injury disease

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005059118A2 (en) * 2003-12-18 2005-06-30 Keele University Stem cell targeting using magnetic particles
RU2283119C1 (ru) 2005-03-29 2006-09-10 Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ Препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, способ его получения, криоконсервации и использования для лечения травматической болезни центральной нервной системы
WO2006127953A2 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 University Of Utah Research Foundation Echogenic microbubbles and microemulsions for ultrasound-enhanced nanoparticle-mediated delivery of agents
WO2008124639A2 (en) * 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Poly (amino acid) targeting moieties

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040096515A1 (en) * 2001-12-07 2004-05-20 Bausch Andreas R. Methods and compositions for encapsulating active agents
WO2006089236A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 The Cleveland Clinic Foundation Apparatus and methods for replacing a cardiac valve
US20070116680A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Rensselaer Polytechnic Institute Stem cells within gel microenvironments
EP2054079A4 (en) * 2006-07-19 2009-12-23 Univ Florida COMPOSITIONS FOR CELL REPROGRAMMING AND USES THEREOF

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005059118A2 (en) * 2003-12-18 2005-06-30 Keele University Stem cell targeting using magnetic particles
RU2283119C1 (ru) 2005-03-29 2006-09-10 Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ Препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, способ его получения, криоконсервации и использования для лечения травматической болезни центральной нервной системы
WO2006127953A2 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 University Of Utah Research Foundation Echogenic microbubbles and microemulsions for ultrasound-enhanced nanoparticle-mediated delivery of agents
WO2008124639A2 (en) * 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Poly (amino acid) targeting moieties

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Introduction into molecular medicine.", 2006, MEDICINA
BRYUKHOVETSKIY A.S., CHEKHONIN V.P., MENTKEVICH G.L.: "High technologies in the therapy and rehabilitation of nervous system disorders", MATERIALS OF RESEARCH AND PRACTICE CONFERENCE, 2008, pages 43 - 44
BRYUKHOVETSKIY A.S., TRANSPLANTATION OF NEURAL CELLS AND TISSUE ENGINEERING OF BRAIN IN NERVOUS DISEASES, 2003
FOKIN S. V., BERKINBLIT M.B., MATHEMATIC PROBLEMS IN BIOLOGY, 1973
GRODINS F.: "Regulation theory and biological systems", 1966, MIR
KOBAYASHI N., NAVARRO-ALVARES N., SOTO-GUETIERREZ A., KAVAMOTO HIRONOBU. ET AL., CANCER STEM CELLS RESEARCH: CURRENTLY SITUATION AND PROBLEMS//CELL TRANSPLANTATION, vol. 17, 2008, pages 19 - 25
MARSHALL C.T., GUO Z., LU C. ET AL., BRAIN RES., vol. 1045, 2005, pages 45 - 56
MARSHALL C.T., LU C., WINSTEAD W. ET AL., HISTOL. HISTOPATOL., vol. 21, 2006, pages 633 - 643
NEIMARK Y.I., COGAN R.Y., SAVELYEV V. P.: "Dynamic models of control theory", 1985, NAUKA
PALTSEV M.A., IVANOV A.A., SEVERIN S.E.: "Intercellular interactions", 2003, MEDICINA
See also references of EP2380973A4 *
TSYMBALYUK V.I., MEDVEDEV V.V., NEUROGENIC STEM CELLS, 2005
WILFRIED REICHARDT ET AL.: "Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation.", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 181, 2008, pages 4770 - 4779, XP008140664, Retrieved from the Internet <URL:http://www.jimmunol.Org/cgi/content/full/181/7/4770> [retrieved on 20091123] *
ZHANG X., CAI J., KLUEBER K. M., STEM CELLS, vol. 24, 2006, pages 434 - 442
ZHANG X., CAI J., KLUEBER K.M. ET AL., STEM CELLS, vol. 23, 2005, pages 442 - 453
ZHANG X., KLUEBER K. M., GUO Z., EXPERIMENTAL NEUROLOGY, vol. 186, 2004, pages 112 - 123
ZHANG X., KLUEBER K.M., GUO Z. ET AL., BRAIN RES., vol. 1073-107, 2006, pages 109 - 119
ZIGOVAT., SNYDER E., SANBERG P., NEURAL STEM CELLS FOR BRAIN AND SPINAL CORD REPAIR, 2003

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2628092C1 (ru) * 2016-02-10 2017-08-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) Способ получения МСК-ассоциированных недифференцированных гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипов CD34+/CD133+

Also Published As

Publication number Publication date
US20110268774A1 (en) 2011-11-03
EP2380973A4 (en) 2013-08-21
RU2428475C2 (ru) 2011-09-10
EP2380973A1 (en) 2011-10-26
RU2008152343A (ru) 2010-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bondarenko et al. Neurotrophic factors in Parkinson’s disease: clinical trials, open challenges and nanoparticle-mediated delivery to the brain
Spuch et al. Liposomes for Targeted Delivery of Active Agents against Neurodegenerative Diseases (Alzheimer′ s Disease and Parkinson′ s Disease)
Ramamoorth et al. Non viral vectors in gene therapy-an overview
Zyuzin et al. Multilayer capsules inside biological systems: state-of-the-art and open challenges
Orive et al. Biomaterials for promoting brain protection, repair and regeneration
Bergen et al. Nonviral approaches for neuronal delivery of nucleic acids
Binda et al. Innovative therapies and nanomedicine applications for the treatment of Alzheimer’s disease: a state-of-the-art (2017–2020)
TWI292324B (en) Encapsulation of plasmid dna (lipogenestm) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjucates into targeted liposome complexes
Cui et al. Effect of PEGylated magnetic PLGA-PEI nanoparticles on primary hippocampal neurons: reduced nanoneurotoxicity and enhanced transfection efficiency with magnetofection
Huang et al. Magnetic nanocomplexes for gene delivery applications
Mitra et al. A review of techniques for biodelivery of nerve growth factor (NGF) to the brain in relation to Alzheimer’s disease
Ansari et al. Multifunctional nanocarriers for Alzheimer’s disease: befriending the barriers
Hu et al. Engineering strategies for apoptotic bodies
WO2010077168A1 (ru) Препарат стволовых клеток с репрограммированным клеточным сигналингом, способ получения этого препарата и его применение
Agirre et al. New insights into gene delivery to human neuronal precursor NT2 cells: a comparative study between lipoplexes, nioplexes, and polyplexes
Wu et al. The Blood–Brain Barrier Cell-Targeted Gene Delivery System to Enhance Nerve Growth Factor Protein Secretion in the Brain
Wang et al. Reiterated targeting peptides on the nanoparticle surface significantly promote targeted vascular endothelial growth factor gene delivery to stem cells
Guo et al. Cell type-targeting nanoparticles in treating central nervous system diseases: Challenges and hopes
Kumar et al. Bioinspired approaches for central nervous system targeted gene delivery
Yao et al. Non-viral gene therapy for spinal cord regeneration
Guo et al. Electrosprayed Microparticles with Loaded pDNA-Calcium Phosphate Nanoparticles to Promote the Regeneration of Mature Blood Vessels: Guo et al.
Dubey et al. Advancements in nanoparticle-based gene delivery systems for therapeutic applications: A comprehensive review
Kumar et al. Nanoparticles: a new frontier in neurodegenerative disease therapy
CN113968968B (zh) 氨基脂质化合物、其制备方法和应用
Haladjova et al. Enhanced gene expression promoted by hybrid magnetic/cationic block copolymer micelles

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09836446

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13143049

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009836446

Country of ref document: EP