WO2010128717A1 - 콜린성 제２형 세타리듬을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법 - Google Patents

콜린성 제２형 세타리듬을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining drug suitability for preventing or treating anxiety disorders using cholinergic type II theta rhythm.
  • Anxiety means both normal emotional and psychiatric disorders. Anxiety disorders cause enough pain and disability to significantly disrupt the lives of the suffering as well as the lives of the family, especially those associated with avoidance behavior and agoraphobia. The pain and disability are more severe (Nutt, DJ, CNS Spectr . 10, 49-56, 2005).
  • drugs that enhance serotonergic efficacy are drugs for the treatment of anxiety disorders in the first place (Nutt, DJ, CNS Spectr . 10, 49-56, 2005).
  • drugs that promote acetylcholine delivery in hippocampus may alleviate anxiety in some patients (Cummings, JL et al., Am. J. Geriatr. Psychiatry . 6, S64- 78, 1998; Levy, ML, et al., Gerontology . 45, S15-22, 1999; Kennedy, DO et al. , Neuropsychopharmacology. 31, 845-852, 2006).
  • the mechanism behind this effect is unknown.
  • type 1 is a noncholinergic, serotonin-related theta rhythm
  • Type 2 is cholinergic theta rhythm
  • Bland, BH Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 102, 18165-18170, 2005
  • attenuation of the theta rhythm was seen in the cerebral cortex of some individuals with high levels of anxiety (Mizuki, Y. et al. , Jpn. J. Psychiatry Neurol . 43, 619-626, 1989; Suetsugi, M. et. al. , Neuropsychobiology . 41, 108-112, 2000).
  • no studies have established the physiological meaning of theta rhythm attenuation and whether the attenuated theta rhythm is type 1 or type 2 in anxiety disorders.
  • Dysplasia of the septal nuclei in the basal forebrain is associated with abnormal information processing in the cortical circuit, Alzheimer's disease (Kesner, RP, et al., Brain Cogn . 9, 289-300, 1989; Colom, LV, J. Neurochem . 96, 609-623, 2006; Moon, WJ, et al. , AJNR Am. J. Neuroradiol . 29, 1308-1313 , 2008), Louis B. disease ( Lewy body disease) (Fujishiro, H. et al. , Acta Neuropathol . 111, 109-114, 2006), frontotemporal dementia (Moon, WJ, et al. , AJNR Am.
  • the medial septum which includes the medial septal nuclei and the vertical limbs of the diagonal band of Broca, forms the hippocampus via the fornix / fimbria pathway. Protruding in the hippocampus to generate theta oscillation of the hippocampus (Bland, BH, Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Manseau F, et al. , J. Neurosci . 28, 4096-4107, 2008).
  • PLC- ⁇ Phospholipase C (PLC) - ⁇ is distinguished from PLC- ⁇ and PLC- ⁇ on the basis of its structure and activity mechanism.
  • PLC- ⁇ acts through a G protein-dependent pathway, which is a transmembrane-spanning group I metabotropic glutamate receptor (mGluR1 and mGluR5), a serotonergic receptor ( serotonergic receptor (5-HT2) (Abe, T. et al., J. Biol. Chem. 267, 13361-13368, 1992) and muscarinic acetylcholine receptors (M1, M3 and M5) (Gutkind, JS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • G protein-dependent pathway which is a transmembrane-spanning group I metabotropic glutamate receptor (mGluR1 and mGluR5), a serotonergic receptor ( serotonergic receptor (5-HT2) (Abe, T. et al.
  • PLC- ⁇ 1 The four PLC- ⁇ subtypes, represented by PLC- ⁇ 1, PLC- ⁇ 2, PLC- ⁇ 3, and PLC- ⁇ 4, each have specific distribution patterns in the brain (Kim, D. et al. , Nature 389, 290-293). , 1997; Watanabe, M. et al., Eur. J. Neurosci. 10, 2016-2025, 1998).
  • PLC- ⁇ 4 expression is expressed in three brain regions (the hippocampus, tonsils and septum) that are known to be associated with anxiety behavior (Treit, D. & Menard, J., Behav. Neurosci .
  • the present inventors studied the relationship between anxiety and theta rhythm using PLC- ⁇ 4 - knockout (PLC- ⁇ 4 -/- ) mice. It was confirmed that the intensity of theta rhythm was significantly decreased and anxiety behavior was increased. The present invention has been completed by revealing that an effective guideline for the treatment of anxiety disorders can be suggested using the measurement of type 2 theta rhythm.
  • the present invention provides a method for determining drug suitability for the prevention or treatment of anxiety disorders using cholinergic type II theta rhythm.
  • the present invention also provides a prognostic monitoring method of anxiety disorder after cholinergic enhancer administration using cholinergic type 2 theta rhythm.
  • the present invention also provides a method for diagnosing anxiety disorder using cholinergic type 2 theta rhythm.
  • the present invention also provides a method for screening or preventing anxiety disorders using cholinergic type 2 theta rhythm.
  • the present invention also provides a kit for determining drug suitability for preventing or treating anxiety disorder, including an electroencephalogram for cholinergic type 2 theta rhythm analysis.
  • the present invention provides a kit for prognostic monitoring of anxiety disorders after cholinergic enhancer administration, including an electroencephalogram for cholinergic type 2 theta rhythm analysis.
  • cholinergic enhancer refers to allosteric sensitization, direct activity of cholinergic receptors, and related intracellular pathways through secondary messenger cascades. It refers to a composition that enhances or regulates cholinergic neurotransmission by the activity or inhibition of cholinesterases. Inhibition of the cholinesterase increases the synaptic concentration of acetylcholine (ACh), thereby inhibiting the activity of acetylcholine at the muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) and nicotinic acetylcholine receptor (nAChR). Promote and extend.
  • ACh acetylcholine
  • mAChR muscarinic acetylcholine receptor
  • nAChR nicotinic acetylcholine receptor
  • anxiety refers to an unpleasant and painful emotional reaction that we experience in a threatening and dangerous situation that may have negative consequences, ie, negative consequences.
  • anxiety disorders refers to a mental disorder in which anxiety is felt for no reason or the degree of anxiety is excessive. In other words, it may be a case of experiencing excessive psychological pain or serious difficulty in realistic adaptation due to pathological anxiety.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the progression of anxiety disorder by administration of a composition of the present invention.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of anxiety disorder improve or benefit altered by administration of a composition of the present invention.
  • the term "administration" means providing a subject with any of the compositions of the present invention in any suitable manner.
  • the term "individual” means any animal, such as a human, monkey, dog, goat, pig, or rat, having a disease in which the symptoms of anxiety disorder may be improved by administering the composition of the present invention.
  • the term “effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit or risk ratio applicable to medical treatment, which means the type of disease, the severity, the activity of the drug, the sensitivity to the drug. , Time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including drug used concurrently, and other factors well known in the medical arts.
  • the present invention provides a method for determining drug suitability for preventing or treating anxiety disorder using cholinergic type II theta rhythm.
  • the method preferably includes but is not limited to the following steps:
  • the anxiety disorder of step 1) includes panic disorder, phobia, obsessive-compulsive disorder, posttraumatic stress disorder, and acute stress disorder.
  • disorders, Generalized anxiety disorders, and Separation anxiety disorders are preferably any one selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the panic disorder refers to an extreme anxiety condition in which sudden fear is extremely extreme for no reason, causing shortness of breath or heart bursting. In other words, it is a disorder that repeatedly experiences a panic attack, which tends to occur after experiencing tiredness, excitement, sexual activity, emotional shock, etc., but in most cases, it is difficult and unpredictable.
  • the phobia refers to an anxiety disorder in which a person feels severe anxiety and fear about a specific situation or a subject and thus avoids the situation or the subject.
  • Specific phobia refers to a disorder that continues to show irrational fear and avoidance of a particular object or situation.
  • Social Phobia is a disability that continues to show avoidance behavior in fear of social situations interacting with others.
  • Agagoraphobia refers to a case of fear of a particular place or situation.
  • the obsessive-compulsive disorder refers to anxiety disorder that causes repeated thoughts, obsessions and actions.
  • the post traumatic stress disorder refers to an anxiety disorder in which an anxiety condition persists after experiencing a traumatic event.
  • the acute stress disorder refers to an anxiety disorder in which dissociative symptoms occur for a short period of time after a traumatic event as a disorder having symptoms very similar to those of post-traumatic stress disorder.
  • the generalized anxiety disorder refers to an anxiety disorder showing chronic anxiety and excessive anxiety in various situations.
  • the separation anxiety disorder refers to a symptom of being severely anxious to fall from a subject having attachment.
  • segregation anxiety exceeds the normal range and interferes with normal social life, it can be regarded as a pathological condition, which means that such separation anxiety is so severe that normal activities are impaired.
  • the cholinergic type 2 theta rhythm of step 1) is preferably measured using an electroencephalogram (EEG), but is not limited thereto.
  • EEG electroencephalogram
  • Cholinergic type 2 theta rhythms generally occur during urethane anesthesia, alert immobility, and passive whole-body rotation (Bland, BH, Prog. Neurobiol. 26, 1). -54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 102, 18165-18170, 2005)
  • Type 1 theta rhythms are mobile, such as walking or running, for example. Occurs during activity (Bland, BH, Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. & Talnov, A., Brain Res. 897, 217-221, 2001).
  • the cholinergic enhancer of step 3) is preferably a composition which acts to increase the amount of acetylcholine neurotransmitters in the hippocampus and the medial septum of the brain.
  • the acetylcholinesterase inhibitor which is a drug that increases acetylcholine nerve signal transduction by inhibiting, is not limited thereto. That is, in addition to acetylcholine degrading enzyme inhibitors, cholinergic enhancer components that activate or modulate allosteric sensitization, direct activity of cholinergic receptors, or related intracellular pathways through secondary messenger cascades are included.
  • the acetylcholine degrading enzyme inhibitor is Rivastigmine, Donepezil, Galantamine, Galacin, Tacrine, Metrifonate, Physostigmine, Neostigmine, Neostigmine, Pyridostigmine, Ambenonium, Demarcarium, Edrophonium, Huperzine A and Onchidal It is preferred to use any one of which is not limited thereto.
  • acetylcholine degrading enzyme inhibitor it is more preferable to use any one selected from the group consisting of rivastigmine, Donepezil, Galantamine and Tacrine, and rivastigmine. Most preferably, but not limited to, Van Dam, D., et al., Psychopharmacology 180, 177-190, 2005; Cerbai, F. et al., Eur. J. Pharmacol . 572, 142-150 , 2007; Kosasa, T., et al., Eur. J. Pharmacol . 380, 101-107, 1999; Scali, C. et al. , J. Neural.Transm .
  • PLC- ⁇ 4 knockout mice in order to determine the relationship between theta rhythm and anxiety behavior, PLC- ⁇ 4 knockout (PLC- ⁇ 4 -/- ) mice (see Korean Patent Application No. 10-2008-0007202) and wild type mice
  • PLC- ⁇ 4 knockout mice The hippocampal electroencephalograms (EEGs) of the hippocampus were examined and the theta rhythm profiles were analyzed and compared.
  • EEGs hippocampal electroencephalograms
  • noncholinergic type 1 theta rhythm was not significantly different between PLC- ⁇ 4 -/- and wild type mice
  • cholinergic type 2 theta rhythm was higher than that of wild type mice in PLC- ⁇ 4 -/- mice.
  • Significantly decreased compared to theta intensity see FIG. 2). Therefore, it can be seen that cholinergic type 2 theta rhythms are associated with anxiety-inducing.
  • a lentiviral vector expressing PLC- ⁇ 4-specific shRNA (shPLC- ⁇ 4) and control shRNA vector) was injected into the medial septum of wild-type mice and examined for anxiety behavior and EEG.
  • shPLC- ⁇ 4 lentiviral vector expressing PLC- ⁇ 4-specific shRNA
  • control shRNA vector a lentiviral vector expressing PLC- ⁇ 4-specific shRNA
  • wild type mice infected with lentiviral expressing shPLC- ⁇ 4 significantly decreased the intensity of cholinergic type 2 theta rhythms compared to wild type mice infected with the control shRNA (see FIG. 3). (See FIG. 4).
  • PLC- ⁇ 4 of the medial septum regulates cholinergic type 2 theta rhythm
  • the decrease in cholinergic type 2 theta rhythm causes anxiety behavior.
  • cholinergic type 2 theta rhythm by measuring the characteristics of cholinergic type 2 theta rhythm through the present invention it can be determined which cholinergic drug should be used for anxiety individuals, it can be usefully used in determining drug suitability for the individual.
  • the present invention also provides a prognostic monitoring method of anxiety disorder after cholinergic enhancer administration using cholinergic type 2 theta rhythm.
  • the method preferably includes but is not limited to the following steps:
  • the cholinergic enhancer of step 1) is preferably a composition which acts to increase the amount of acetylcholine neurotransmitters in the hippocampus and the medial septum of the brain.
  • the acetylcholinesterase inhibitor which is a drug that increases acetylcholine nerve signal transduction by inhibiting, is not limited thereto. That is, in addition to acetylcholine degrading enzyme inhibitors, cholinergic enhancer components that activate or modulate allosteric sensitization, direct activity of cholinergic receptors, or related intracellular pathways through secondary messenger cascades are included.
  • the acetylcholine degrading enzyme inhibitor is Rivastigmine, Donepezil, Galantamine, Galacin, Tacrine, Metrifonate, Physostigmine, Neostigmine, Neostigmine, Pyridostigmine, Ambenonium, Demarcarium, Edrophonium, Huperzine A and Onchidal It is preferred to use any one of which is not limited thereto.
  • the anxiety disorder of step 1) includes panic disorder, phobia, obsessive-compulsive disorder, posttraumatic stress disorder, and acute stress disorder.
  • disorders, Generalized anxiety disorders, and Separation anxiety disorders are preferably any one selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the cholinergic type 2 theta rhythm of step 2) is a hippocampal electroencephalogram of the hippocampus during urethane anesthesia, alert immobility or passive whole-body rotation.
  • EEG is preferably analyzed but not limited thereto.
  • cholinergic type 2 theta rhythm is reduced in anxiety subjects compared to normal individuals, and cholinergic type 2 theta rhythm is normal recovery by cholinergic drug treatment to confirm that anxiety recovers, cholinergic type 2 theta rhythm,
  • cholinergic type 2 theta rhythm is normal recovery by cholinergic drug treatment to confirm that anxiety recovers, cholinergic type 2 theta rhythm
  • the present invention also provides a method for diagnosing anxiety disorder using cholinergic type 2 theta rhythm.
  • the method preferably includes but is not limited to the following steps:
  • the cholinergic type 2 theta rhythm of step 1) is characterized by the hippocampal electroencephalogram of the hippocampus during urethane anesthesia, alert immobility or passive whole-body rotation.
  • EEG is preferably analyzed but not limited thereto.
  • cholinergic type 2 theta rhythm is reduced in anxiety subjects compared to normal individuals, and cholinergic type 2 theta rhythm is normal recovery by cholinergic drug treatment to confirm that anxiety recovers, cholinergic type 2 theta rhythm,
  • anxiety individuals can be diagnosed by measuring the characteristics of cholinergic type 2 theta rhythm and selecting individuals that are lower than normal individuals.
  • the present invention also provides a method for screening or preventing anxiety disorders using cholinergic type 2 theta rhythm.
  • the method preferably includes but is not limited to the following steps:
  • the anxiety disorder of step 1) includes panic disorder, phobia, obsessive-compulsive disorder, posttraumatic stress disorder, and acute stress disorder.
  • disorders, Generalized anxiety disorders, and Separation anxiety disorders are preferably any one selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the cholinergic type 2 theta rhythm of step 2) is a hippocampal electroencephalogram of the hippocampus during urethane anesthesia, alert immobility or passive whole-body rotation.
  • EEG is preferably analyzed but not limited thereto.
  • cholinergic type 2 theta rhythm is reduced in anxiety subjects compared to normal individuals, and cholinergic type 2 theta rhythm is normal recovery by cholinergic drug treatment to confirm that anxiety recovers, cholinergic type 2 theta rhythm,
  • cholinergic type 2 theta rhythm is normal recovery by cholinergic drug treatment to confirm that anxiety recovers, cholinergic type 2 theta rhythm
  • the present invention also provides a kit for determining drug suitability for preventing or treating anxiety disorder, including an electroencephalogram for cholinergic type 2 theta rhythm analysis.
  • the present invention also provides a kit for prognostic monitoring of anxiety disorders after cholinergic enhancer administration, including an electroencephalogram for cholinergic type 2 theta rhythm analysis.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing anxiety disorder, including an electroencephalogram for cholinergic type 2 theta rhythm analysis.
  • the present invention provides a kit for screening an agent for preventing or treating anxiety disorder, including an electroencephalogram for cholinergic type 2 theta rhythm analysis.
  • cholinergic type 2 theta rhythm is reduced in anxiety subjects compared to normal individuals, and cholinergic type 2 theta rhythm is normal recovery by cholinergic drug treatment to confirm that anxiety recovers, cholinergic type 2 theta rhythm, Determining the relationship between cholinergic drugs and anxiety, analyzing cholinergic type 2 theta using an electroencephalogram to determine drug suitability for preventing or treating anxiety disorders, monitoring prognosis of anxiety disorders after cholinergic enhancer administration, diagnosing anxiety disorders, and anxiety It can be seen that it can be usefully used for screening a prophylactic or therapeutic agent.
  • the present invention can be usefully used to study the mechanism of action between cholinergic drugs, type 2 theta and anxiety by revealing that cholinergic type 2 theta rhythm is associated with anxiety.
  • serotonin drugs, GABA drugs, and cholinergic drugs which are effective drugs for anxiety, do not have any biological markers to help with which type of medicine to prescribe due to the diversity of anxiety individuals.
  • the present invention by eating all the different types of drugs to choose the best drug, but the present invention, by using the characteristics of cholinergic type 2 theta rhythm can determine which anxiety subjects to use cholinergic drugs, cholinergic The nature of type 2 theta rhythm can be used to monitor progress after cholinergic drug administration.
  • Figure 2 is a PLC- ⁇ 4 - / - mice in the theta rhythm (theta rhythm) to determine the status, wild type mice (WT) and PLC- ⁇ 4 - / - mouse (KO) to analyze the EEG intended for non-cholinergic first Figure shows the type theta rhythm and cholinergic type 2 theta rhythm:
  • Figure 3 shows the lentiviral expressing shPLC- ⁇ 4 and control shRNA in the medial septum of wild-type mice to see if medial septum selective PLC- ⁇ 4 knockdown is similar to the heterologous theta rhythm phenotype of PLC- ⁇ 4 -/- mice.
  • the EEG analysis shows the results:
  • Figure 4 shows the open field of the lentiviral expressing shPLC- ⁇ 4 and control shRNA in wild-type mice to determine whether medial septum selective PLC- ⁇ 4 knockdown indicates anxiety behavior in PLC- ⁇ 4 -/- mice. ), A graph showing the results of three anxiety behavior tests: elevated plus-maze and light-dark transition:
  • FIG. 7 shows wild type mice (WT) and PLC- ⁇ 4 ⁇ / ⁇ mice (EN) to determine cholinergic type 2 theta rhythm conditions during alert immobility and passive whole-body rotation.
  • Figure 2 shows the cholinergic type 2 theta rhythm by analyzing EEG during borderline floating and passive whole body rotation:
  • PLC- ⁇ 4 -/- mice were prepared as described in Korean Patent Application No. 10-2008-0007202. Specifically, C57BL / 6J (N8) PLC- ⁇ 4 +/- and 129S4 / SvJae (N8) PLC- ⁇ 4 +/- mice were crossed to obtain PLC ⁇ 4 + / + and PLC ⁇ 4-/-mice in the F1 step. Genotypes were determined using PCR analysis as reported in previous literature (Kim, D. et al. , Nature 389, 290-293, 1997). Animal care and handling procedures were performed according to standardized guidance (KIST, Korea). The mice were freely given water and feed under a 12-hour bright, 12-hour dark-illuminated circadian, and were housed in a specific pathogen free (SPF) environment with a temperature of 22 ° C. and a humidity of 55%.
  • SPF pathogen free
  • Open-site heading was performed by placing the mouse in the center of the open-site apparatus (40 x 40 x 40 cm) under dim lighting.
  • the PC-based video behavior analysis system TSE was recorded after recording the movement activity, the number of passes through the center of the open area, and the time spent in the central part of the open area. , Bad Homburg, Germany).
  • the main facilitating parameter was calculated as the ratio of movement activity to the number of passes through the central portion of the test site.
  • the primary palpability was calculated individually for each mouse and then used to calculate the mean and standard deviation for a given experimental group (Treit, D. & Fundytus, M., Pharmacol. Biochem. Behav . 31, 959-962 , 1988; Sienkiewicz-Jarosz, H. et al., J Neural Transm . 107, 1403-1412, 2000).
  • the elevated plus maze used an instrument consisting of two open branches and two closed branches of the same size (45 ⁇ 5 cm) with a 15 cm high wall.
  • the branches are made of black acrylic and extend from the central platform (5 x 5 cm) to form a cross symbol.
  • the entire instrument is raised 30 cm above the bottom layer.
  • Each mouse was placed on a central platform facing one of the open branches.
  • the number of entry into the open and closed branches and the time spent on the open and closed branches were then recorded during the 5 minute test period (Parks, CL et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10734 Ramboz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14476-14481, 1998; Gross, C. et al., Nature 416, 396-400, 2002).
  • the contrast change test used an instrument consisting of cages (25 x 40 x 20 cm) with small passages through which mice could move from one compartment to another and separated by two compartments by black partitions.
  • One compartment containing two thirds of the surface area was made of white plastic and illuminated with illumination; The adjoining side compartment was darkened and darkened. Mice were placed in the dark compartment and allowed to move freely between the two chambers for 5 minutes. Then, the number of shifts between the two compartments, the time spent in each chamber, and the latency for the first change were recorded (Welch, JM et al., Natur e 448, 894-900, 2007).
  • mice were anesthetized with pentobarbital (50 ⁇ ml / kg, i.p.) and then bregma and lambda in the same horizontal plane were opened with a stereotaxic apparatus.
  • Hippocampus EEG records show hippocampal with ground above the cerebellum.
  • Teflon-coated Teflon-coated injection into the fissure tungsten electrode) 150 um (from Brema, 2.0 mm anteroposterior, 1.2 mm mediolateral, and 1.8 mm dorsoventral).
  • the location of the electrodes was verified by optical microscopy with sections stained with Nissl according to the protocol. Amplify the translocation site (x 1,000), After bandpass-filtered (0.1-100 Hz), 1-kHz samples were continuously counted at 12 bit resolution and recorded on a personal computer.
  • the EEG data was collected with 4-s fragments and fast fourier transform (FFT). The data was continuously monitored for movement artifacts, and the recording of each fragment was cross-validated by the experimenter, obscuring the animal's genotype. All fragments were collected during mouse movement and discarded the amplitude of the amplified EEG signal greater than ⁇ 1.25V for that fragment.
  • FFT fast Fourier transform
  • EEG spectral intensities were calculated at 1-Hz bins using fast Fourier transform (FFT) of each 4-s epoch. The analysis was performed from each interval in 100 runs from each group. Intensities in the range of 0- to 30-Hz were averaged in the groups over each behavioral state, with mean values consisting of 1-Hz bins.
  • the process of averaging the intensity spectra applied a standardization process that sums and then divides the standard deviation of the EEG raw data for the two comparison states (eg, PLC- ⁇ 4 ⁇ / ⁇ mice and wild type mice).
  • theta rhythms have clear, sharp peak vibrations that distinguish them from other in vivo EEG rhythms such as delta- and gamma-band activity, and because the peak intensity provides more accurate information than the total intensity within the theta-theta vibration range, for comparison purposes. Peak intensities under different conditions were used.
  • Noncholinergic type 1 and cholinergic type 2 theta rhythms associated with different behaviors were recorded.
  • Noncholinergic, serotonin-related type 1 theta rhythms can be distinguished from cholinergic type 2 theta rhythms using muscarinic antagonists (eg, atropine or scopolamine).
  • muscarinic antagonists eg, atropine or scopolamine.
  • the muscarinic antagonist is injected into an animal, the cholinergic type 2 theta rhythm is destroyed, but the relatively unaffected noncholinergic type 1 theta rhythm is maintained.
  • Another action that induces theta rhythms is to distinguish between noncholinergic, cytotonin-related type 1 theta rhythms and cholinergic type 2 theta rhythms.
  • Cholinergic type 2 theta rhythms generally occur during urethane anesthesia, alert immobility, and passive whole-body rotation (Bland, BH, Prog. Neurobiol. 26, 1). -54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 102, 18165-18170, 2005)
  • Type 1 theta rhythms are mobile, such as walking or running, for example. Occurs during activity (Bland, BH, Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. & Talnov, A., Brain Res. 897, 217-221, 2001).
  • PLC- ⁇ 4-specific shRNA and control shRNA were expressed in pLKO puromycin resistance vector (MISSION TRC shRNA Target Set; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • MISSION TRC shRNA Target Set MISSION TRC shRNA Target Set
  • NIH3T3 cells ATCC (http://www.atcc.org/) CRL-1658]
  • pLKO-control SHC002 served as a non-target shRNA.
  • shRNA expressing lentiviral vector constructs were transfected into NIH3T3 cells, followed by Western blot analysis using rabbit anti-PLC- ⁇ 4 (1: 200; Santa Cruz Biotechnology). PLC- ⁇ 4 expression level was determined by. To increase the level of PLC- ⁇ 4 expression in the screening experiment, NIH3T3 cells were transfected with pFLAG-CMV2-PLC- ⁇ 4, a PLC- ⁇ 4 expression plasmid. Expression levels were normalized to transfection efficiency, which was determined by co-transfection together with luciferase plasmids.
  • shPLC- ⁇ 4-1 [TRCN0000076919: 5'-GCCTCTTCAA AGTAGATGAA T-3 '(SEQ ID NO: 1)] and shPLC- ⁇ 4-3 [TRCN0000076921: 5'-CCGTCTCCTA ATGACCTCAA A-3' ( Two of SEQ ID NO: 2) reduced the level of PLC- ⁇ 4 expression in cells transformed together with a lentiviral expression vector.
  • shPLC- ⁇ 4-1 was used for the following in vivo experiments.
  • HEK293T cells [ATCC (http://www.atcc.org/) CRL-1573] were prepared by transfection together with the following three plasmids: (1) constructs expressing heterologous envelope protein VSN-G; (2) a packaging-defective helper construct that expresses a gag-pol gene; And (3) a transfer vector comprising a PLC- ⁇ 4-specific shRNA sequence. Cells were transfected using Lipofectamine Plus as described by the manufacturer (Invitrogen). 48 hours after the transfection, the culture supernatant containing the lentivirus was collected, purified through a 0.45-mm membrane filter (Nalgene, USA), and immediately stored at -70 ° C.
  • Titration concentrations were determined using p24 Perkin-Elmer Life Science (ELISA) or by Western blot analysis using monoclonal anti-p24 antibodies obtained through the AIDS Research and Reference Reagent Program.
  • the titration concentration was generally 10 6 -10 7 transduction units (TU) / ml prior to concentration.
  • Infectious lentiviral particles were concentrated using ultracentrifugation (50,000 ⁇ 2h) using a 20% sucrose cushion at 4 ° C.
  • a lentiviral vector expressing shPLC- ⁇ 4-1 or control shRNA concentrated to high-titration concentrations was injected into the inner septum of 10-week-old wild-type mice by stereotaxic injection. Mice injected with 13 control shRNAs and mice injected with 16 shPLC- ⁇ 4-1 were used, respectively. Four weeks after injection, three anxiety tests were used and then hippocampal EEG was recorded as described below. After conducting behavioral tests and EEG recordings, mice were sacrificed and immunohistochemical analyzes were performed to assess the reduction of endogenous PLC- ⁇ 4 expression in the medial septum.
  • Immunostaining was performed after tissue treatment as reported in the literature (Kim, DS et al. , J. Comp. Neurol. 511, 581-598, 2008). Specifically, animals were subjected to transcardial perfusion in turn with 4% paraformaldehyde in phosphate-buffered saline (PBS) and 0.1 M phosphate buffer (PB, pH 7.4) under urethane anesthesia. Sacrificed. After the brain was removed, it was fixed with the same fixative for 4 hours. The brain tissue was cryopreserved by infiltration with 30% sucrose overnight.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • PB 0.1 M phosphate buffer
  • the entire inner septum site was then frozen in a cryostat and sectioned into 30-um pieces, and then the sections were placed in a 6 well plate containing PBS. Each sixth section at each entire medial septum site from selected animals was used for immunofluorescence analysis. Morphological changes induced by shPLC- ⁇ 4 in the presence and absence of PLC- ⁇ 4 expression in wild-type and PLC- ⁇ 4 -/- mice, respectively, and in PLC- ⁇ 4-positive neurons in the medial septum region, were observed in the mouse anti-neuronal cell nucleus.
  • shPLC- ⁇ 4 Lentivirus vectors expressing shRNA (shPLC- ⁇ 4) or control shRNAs targeting PLC- ⁇ 4 were delivered to the inner septum of 10-week-old wild type mice.
  • shPLC- ⁇ 4 mice showed no significant difference in the total amount of motor activity in the open site compared to control shRNA mice (FIG. 4A; P > 0.05, Student's t- test).
  • shPLC- ⁇ 4 mice across the center of the open site were lower than control shRNA mice (FIG. 4B; P > 0.05, Student's t- test).
  • FIG. 4D the ratio of movement activity to the number of median passages of mice was higher in shPLC- ⁇ 4 mice than in control shRNA mice.
  • Rivastigmine a cholinergic enhancer (Novartis Pharma, Basel, Switzerland) was dissolved in saline. Animals were intraperitoneally injected (ip) with 0.5 mg / kg rivastigmine 60 minutes prior to beginning anxiety behavior test (total volume, 5 ml / kg). Microdialysis study, which shows that 0.5 mg / kg of rivastigmine increases hippocampal acetylcholine concentration by ⁇ 100% (Kosasa, T., et al., Eur. J. Pharmacol . 380, 101-107, 1999 ; Scali, C. et al, J. Neural Transm 109, 1067-1080, 2002; hence
  • Rivastigmine is a second generation carbamate based reverse noncompetitive AChE and butyrylChE (BuChE) inhibitor.
  • the inhibitor is selected because of its long-lasting inhibitory effect and brain specificity (Enz, A. et al. , Prog. Brain Res . 98, 431-438, 1993) and because it selectively increases choline activity in the hippocampus and cortex. (Weinstock, M., et al., J. Neural Transm. Suppl . 43, 219-225, 1994).
  • EEG was recorded after placing the following three groups of mice in a new environment: (1) PLC- ⁇ 4 -/- mice injected with rivastigmine, (2) PLC- ⁇ 4 -/- mice injected with saline, and (3) wild-type mice injected with saline.
  • a new environmental model was chosen that induces anxiety and creates anxiety that is considered optimal among several conditions known to generate cholinergic theta rhythms (e.g. urethane anesthesia, boundary immobilization and passive rotation). .
  • rivastigmine treatment was found to restore normal cholinergic theta rhythm and normal anxiety behavior in PLC- ⁇ 4 ⁇ / ⁇ mice, and the cholinergic theta rhythm plays an important role in suppressing anxiety.
  • the present invention can be used to screen anxious individuals suitable for cholinergic drug administration using cholinergic type 2 theta rhythms, and can be usefully used to monitor the prognosis after cholinergic drug administration to anxious individuals.

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Abstract

본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm)을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 불안증 동물 모델에서 콜린성 제2형 세타리듬이 정상개체에 비해 감소하고, 콜린성 약물 처리에 의해 콜린성 제2형 세타리듬이 정상적으로 회복되고 불안증이 감소하는 것을 확인함으로써 콜린성 제2형 세타리듬 프로파일을 이용하여 콜린성 시스템에 이상이 생겨서 유발되는 불안장애 개체를 찾을 수 있으므로 콜린성 약물 투여가 적절한 개체를 판단할 수 있으며, 콜리성 약물 처리 후 경과를 모니터링하는데 사용할 수 있다.

Description

콜린성 제２형 세타리듬을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법
본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm)을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법에 관한 것이다.
불안(Anxiety)은 정상적인 감정 및 정신 의학적 장애 둘 모두를 의미한다. 불안장애(Anxiety disorder)는 고통을 받는자의 삶 뿐만 아니라 가족들의 삶을 현저하게 붕괴시킬 수 있는 충분한 고통과 장애를 야기하며, 특히 이런 불안장애가 기피 행동(avoidance behavior) 및 광장공포증(agoraphobia)과 관련될 때 그 고통과 장애는 보다 심각하다(Nutt, D.J., CNS Spectr . 10, 49-56, 2005).
현재, 세로토닌성 효능을 증진시키는 약물이 일선의 불안장애 치료용 약물이다(Nutt, D.J., CNS Spectr . 10, 49-56, 2005). 놀랍게도, 최근 연구는 해마(hippocampus)에서 아세틸콜린 전달을 증진시키는 약물이 일부 환자에서 불안을 완화시킬 수 있음이 보고되었다(Cummings, J.L. et al., Am. J. Geriatr. Psychiatry . 6, S64-78, 1998; Levy, M.L., et al., Gerontology . 45, S15-22, 1999; Kennedy, D.O. et al., Neuropsychopharmacology. 31, 845-852, 2006). 이런 효과의 근거인 기작은 알려져 있지 않다.
동물에서 두 가지 종류의 해마의 세타 리듬(theta rhythm)이 알려져 있다: 제 1형(type 1)은 비콜린성, 세로토닌-관련 세타 리듬이고; 제 2형(type 2)은 콜린성 세타 리듬이다(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 18165-18170, 2005). 흥미롭게도, 세타 리듬의 감쇠는 높은 수준의 불안을 가진 일부 개체의 대뇌피질에서 나타났다(Mizuki, Y. et al., Jpn. J. Psychiatry Neurol . 43, 619-626, 1989; Suetsugi, M. et al., Neuropsychobiology . 41, 108-112, 2000). 그러나, 불안장애에서 상기 세타 리듬 감쇠의 생리학적 의미 및 감쇠된 세타 리듬이 제 1형인 또는 제 2형인지를 확립한 연구는 없다.
기저전뇌(basal forebrain)내 중격핵(septal nuclei)의 이형은 피질회로(cortical circuit)에서 비정상적인 정보처리와 관련되고, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease)(Kesner, R.P., et al., Brain Cogn . 9, 289-300, 1989; Colom, L.V., J. Neurochem . 96, 609-623, 2006; Moon, W.J., et al., AJNR Am. J. Neuroradiol . 29, 1308-1313, 2008), 루이바디병(Lewy body disease)(Fujishiro, H. et al., Acta Neuropathol . 111, 109-114, 2006), 이마관자엽 변성(frontotemporal dementia)(Moon, W.J., et al., AJNR Am. J. Neuroradiol . 29, 1308-1313, 2008) 및 파킨슨병(Parkinson's disease dementia)(Dodel, R. et al., J. Neurol . 255, S39-S47, 2008)에서 보여지는 바와 같이 결과적으로 뇌 기능장애를 야기한다. 내측 중격핵(medial septal nuclei) 및 브로카의 대각선조(diagonal band of Broca)의 세로 날개(vertical limb)를 포함하는 내측 격막(medial septum)은 뇌궁/해마술 경로(fornix/fimbria pathway)를 통해 해마에 돌출되어 해마의 세타 진동을 발생시킨다(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Manseau F, et al., J. Neurosci . 28, 4096-4107, 2008). 인간 뇌전도(electroencephalogram)에서 보여진 세타 리듬은, 해마의 세타 리듬에 의해 조절되는 피질 상호작용(corticolimbic interaction)으로부터 발생하는 것으로 생각되어진다(Miller, R., Springer-Verlag, Berlin, 1991; Basar, E., et al., Int. J. Psychophysiol. 39, 197-212, 2001; Kahana, M.J., et al., Curr. Opin. Neurobiol. 11, 739-744, 2001; Cantero, J.L., J. Neurosci. 23, 10897-10903, 2003; Gordon, J.A., et al., J. Neurosci . 25, 6509-6519, 2005; Tejada, S. et al., Eur. J. Neurosci. 26,199-206, 2007).
포스포리파제 C(Phospholipase C; PLC)-β는 구조 및 활성 기작을 근거로 PLC-γ 및 PLC-δ와 구별된다. PLC-β는 G 단백질(G protein)-의존적 경로를 통해 작용하며, 이는 7개의 막 통과 그룹 제 1형 대사성 글루타메이트 수용체(transmembrane-spanning group Ⅰ metabotropic glutamate receptor)(mGluR1 및 mGluR5), 세로토닌성 수용체(serotonergic receptor)(5-HT2)(Abe, T. et al., J. Biol. Chem. 267, 13361-13368, 1992) 및 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor)(M1, M3 및 M5)(Gutkind, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4703-4707 , 1991)에 속하는 특이적 신경전달물질 수용체 아형의 활성에 의해 작용된다. PLC-β1, PLC-β2, PLC-β3 및 PLC-β4로 표시되는 4개의 PLC-β 아형들은 각각 뇌에서 특이적인 분포 패턴을 가지고 있다(Kim, D. et al., Nature 389, 290-293, 1997; Watanabe, M. et al., Eur. J. Neurosci. 10, 2016-2025, 1998). PLC-β4 발현은 불안 행동과 관련되는 것으로 알려진 3개의 뇌 부위(해마, 편도 및 격막)(Treit, D. & Menard, J., Behav. Neurosci .111, 653-658, 1997; Gray, J.A. & McNaughton, N. The neuropsychology of anxiety, Ed 2. New York: Oxford UP, 2000) 중 하나인, 내측 격막에서 신경세포의 세포체(soma) 및 수지상 돌기(dendrite)에서 발현되어 있다(Watanabe, M. et al., Eur. J. Neurosci. 10, 2016-2025, 1998; Nakamura, M. et al., Eur. J. Neurosci . 20, 2929-2944, 2004). 또한, 상기 내측 격막은 해마의 세터 리듬의 발생과 관련된 결절점(nodal point)이다(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986). 이는 PLC-β4가 불안 행동 및 세타 리듬 다양성과 매우 관련 있음을 제시하는 것이다.
그러나, 지금까지 콜린성 약물, 세타 리듬 및 불안 행동 사이 관계는 알려져 있지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 PLC-β4-녹아웃(PLC-β4-/-) 마우스를 이용하여 불안증과 세타리듬 사이 관계를 연구한 결과, PLC-β4의 전체 결실 또는 내측 격막 특이적 녹다운은 콜린성 제2형 세타리듬의 세기를 현저히 감소시키고 불안행동을 증가시키는 것을 확인하였고, 상기 PLC-β4-녹아웃 마우스에서 콜린성 증진제를 처리하는 경우, 콜린성 제2형 세타리듬 및 불안증 모두를 정상적으로 회복시키는 것을 확인함으로써, 콜린성 제2형 세타리듬의 측정을 이용하여 불안장애의 치료를 위한 효과적인 가이드라인을 제시할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm) 프로파일을 이용하여 불안장애 개체의 효과적인 치료제 스크리닝 방법, 및 콜리성 약물 처리 후 경과를 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm)을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용한 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용한 불안장애의 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용한 불안장애 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 정의한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "콜린성 인핸서(cholinergic enhancer)"는, 알로스테릭 감작(allosteric sensitization), 콜린성 수용체의 직접적 활성, 2차 전달자 케스케이드(second messenger cascades)를 통한 관련된 세포간 경로(intracellular pathway)를 활성, 또는 콜린에스테라아제(cholinesterases)의 억제에 의해 콜린성 신경전달을 증진 또는 조절하는 조성물을 의미한다. 상기 콜린에스테라아제의 억제는 아세틸콜린(acetylcholine; ACh)의 시냅스 농도를 증가시켜, 무스카린 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor; mAChR) 및 니코틴 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor; nAChR)에서 아세틸콜린의 활성을 증진 및 연장시킨다.
본 발명에서 사용되는 용어 "불안(anxiety)"은 특정한 대상을 가지고 있지 않은 두려운 감정 즉, 부정적인 결과가 나타날 수도 있는 위협적이고 위험한 상황에서 우리가 경험하게 되는 불쾌하고 고통스러운 정서적 반응을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "불안장애(anxiety disorders)"는 이유 없이 불안을 느끼거나 불안의 정도가 지나친 정신장애를 의미한다. 즉, 병적인 불안으로 인하여 과도한 심리적 고통을 느끼거나 현실적인 적응에 심각한 어려움을 겪는 경우를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 불안장애의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 불안장애의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 불안장애의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm)을 이용한 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 불안장애에 걸린 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm)을 측정하는 단계;
2) 상기 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭이 정상 개체에 비해 감소하는 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 개체가 불안장애 치료제로서 콜린성 인핸서(cholinergic enhancer)의 처리가 필요한 개체로 판정하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 불안장애는 공황 장애(Panic Disorder), 공포증(Phobia), 강박 행동장애(Obsessive-Compulsive Disorder), 외상 후 스트레스 장애(Posttraumatic stress disorder), 급성 스트레스 장애(Acute stress disorder), 일반화된 불안장애(Generalized anxiety disorder), 및 분리불안장애(Separation anxiety disorder)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 공황 장애는 이유 없이 갑자기 공포심이 극도로 심해져 숨이 막히거나 심장이 터질 것 같은 극단적인 불안 증세를 의미한다. 즉, 공황발작(Panic attack)을 반복적으로 경험하는 장애로서 흔히 피곤, 흥분, 성행위, 정서적 충격 등을 경험한 후에 나타나는 경향이 있으나 대부분의 경우 예측하기가 어렵고 갑작스럽게 나타난다.
상기 공포증은 특수한 상황이나 대상에 대해서 심한 불안과 공포를 느끼게 되어 이러한 상황이나 대상을 회피하게 되는 불안장애를 의미한다. 1) 특수 공포증(Specific Phobia)은 특정한 대상이나 상황에 대한 비합리적 두려움과 회피 행동을 지속적으로 나타내는 장애를 의미한다. 2) 대인 공포증(Social Phobia)은 다른 사람들과 상호작용하는 사회적 상황을 두려워하여 회피 행동을 지속적으로 나타내는 장애를 의미한다. 3) 광장 공포증(agoraphobia)은 특정한 장소나 상황에 대한 공포를 나타내는 경우를 의미한다.
상기 강박 행동장애는 원하지 않는 생각, 즉 강박사고(Obsessions)와 행동을 반복하게 되는 불안장애를 의미한다.
상기 외상 후 스트레스 장애는 충격적인 사건을 경험하고 난 후에 불안상태가 지속되는 불안장애를 의미한다.
상기 급성 스트레스 장애는 외상 후 스트레스 장애와 매우 유사한 증상을 나타내는 장애로서 외상적 사건 경험 후 해리성 증상이 단기간 동안 나타나는 불안장애를 의미한다.
상기 일반화된 불안장애는 다양한 상황에서 만성적 불안과 과도한 걱정을 나타내는 불안장애를 의미한다.
상기 분리불안장애는 애착을 갖고 있는 대상과 떨어지는 것을 심하게 불안해하는 증상을 의미한다. 격리불안이 정상적인 범위를 넘어서 정상적인 사회생활에 지장이 될 정도가 되면 이를 병적인 상태라 할 수 있으며 이러한 분리불안이 극심하여 정상적인 활동이 장애를 받는 경우를 의미한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 콜린성 제2형 세타리듬은 뇌전도(electroencephalogram, EEG)를 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
콜린성 제2형 세타 리듬은 일반적으로 우레탄 마취(rethane anesthesia), 경계성 부동(alert immobility) 및 피동적인 전신 회전(passive whole-body rotation) 동안 발생하는(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 18165-18170, 2005) 반면에, 제 1형 세타 리듬은 예를 들어 걷거나 달리는 것과 같은 이동하는 활동 동안 발생(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. & Talnov, A., Brain Res. 897, 217-221, 2001)하는 것을 이용하는 것이다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 콜린성 인핸서는 뇌의 해마와 내측 격막에서의 아세틸콜린 신경전달물질의 양을 증가시키는 작용을 하는 조성물인 것이 바람직하고, 신경말단에서 분비된 아세틸콜린의 분해효소를 억제시킴으로써 아세틸콜린 신경 신호 전달을 증가시키는 약물인 아세틸콜린 분해효소 억제제(acetylcholinesterase inhibitor)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 아세틸콜린 분해효소 억제제 외에도 알로스테릭 감작, 콜린성 수용체의 직접적 활성, 또는 2차 전달자 케스케이드(second messenger cascades)를 통한 관련된 세포간 경로(intracellular pathway)를 활성 또는 조절하는 콜린성 인핸서 성분도 포함된다.
상기 아세틸콜린 분해효소 억제제는 리바스티그민(Rivastigmine), 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine), 타크린(Tacrine), 메트리포네이트(Metrifonate), 피소스티그민(Physostigmine), 네오스티그민(Neostigmine), 피리도스티그민(Pyridostigmine), 암베노늄(Ambenonium), 디마카리늄(Demarcarium), 에드로포늄(Edrophonium), 후퍼진 A(Huperzine A) 및 온키달(Onchidal)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 아세틸콜린 분해효소 억제제는 리바스티그민(Rivastigmine), 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine) 및 타크린(Tacrine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 더욱 바람직하고, 리바스티그민을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다(Van Dam, D., et al., Psychopharmacology 180, 177-190, 2005; Cerbai, F. et al., Eur. J. Pharmacol . 572, 142-150, 2007; Kosasa, T., et al., Eur. J. Pharmacol . 380, 101-107, 1999; Scali, C. et al., J. Neural. Transm . 109, 1067-1080, 2002; Liang, Y.Q. et al., Acta. Pharmacol. Sin . 27, 1127-1136, 2006; Enz, A. et al., Prog. Brain Res . 98, 431-438, 1993; Weinstock, M. et al., J. Neural Transm. Suppl . 43, 219-225, 1994).
본 발명에서는 세타리듬 및 불안행동 사이 관계를 알아보기 위해, 불안행동 동물 모델인 PLC-β4 녹아웃(PLC-β4 -/-) 마우스(대한민국 특허출원 제10-2008-0007202호 참조) 및 야생형 마우스에서 각각 해마의 뇌전도(Hippocampal electroencephalogram, EEG)를 검사하여 세타리듬 프로파일을 분석하여 비교하였다. 그 결과, 비콜린성 제1형 세타 리듬은 PLC-β4 -/- 마우스 및 야생형 마우스에서 유의적인 차이가 없었으나, 콜린성 제2형 세타리듬은 PLC-β4 -/- 마우스에서 세타 세기가 야생형 마우스의 세타 세기에 비해 유의적으로 감소하였다(도 2 참조). 따라서, 콜린성 제2형 세타리듬이 불안 유발과 관련되어 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 내측 격막에서의 PLC-β4와 상기 콜린성 제2형 세타리듬 사이 관계를 알아보기 위해, PLC-β4-특이적 shRNA(shPLC-β4) 및 대조군 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 야생형 마우스의 내측 격막에 주사한 후, 불안 행동 및 EEG를 조사하였다. 그 결과, shPLC-β4를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 야생형 마우스가 대조군 shRNA로 감염된 야생형 마우스에 비해 콜린성 제2형 세타리듬의 세기가 유의적으로 감소하였으며(도 3 참조), 유의적으로 높은 불안 행동을 나타내었다(도 4 참조). 따라서, 내측 격막의 PLC-β4가 콜린성 제2형 세타리듬을 조절하고, 상기 콜린성 제2형 세타리듬 세기의 감소가 불안 행동을 야기시키는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 콜린성 인핸서를 이용하여 콜린성 제2형 세타리듬의 세기를 증가시킴으로써 불안행동을 정상화시킬 수 있는지를 알아보기 위해, PLC-β4 -/- 마우스 및 야생형 마우스에 각각 리바스티그민(Rivastigmine) 및 식염수를 각각 투여한 후, 불안행동 및 EEG를 조사하였다. 그 결과, 리바스티그민 처리는 PLC-β4 -/- 마우스에서 정상적인 콜린성 제2형 세타리듬과 정상적인 불안행동으로 회복시켰다(도 5 및 도 6 참조). 따라서, 콜린성 인핸서가 콜린성 제2형 세타리듬의 회복 및 불안행동을 정상화시킬 수 있음을 알 수 있다.
현재까지, 불안증에 효과가 있는 약물로서 세로토닌성 약물, GABA성 약물, 콜린성 약물들이 효과가 있다는 것이 알려져 있다. 그러나 불안증 개체의 다양성으로 인하여 어떤 개체에게 어떤 종류의 약을 처방해야하는지에 도움이되는 생물학적 마커(biological marker)가 없는 실정이다. 따라서 시행착오법으로 여러 종류의 약을 다 먹어보고 가장 효과가 좋은 약을 선택할 수 밖에 없는 현실이다.
이에, 본 발명을 통하여 콜린성 제2형 세타리듬의 특성을 측정함으로써 어떤 불안증 개체에게 콜린성 약물을 사용하는 것이 좋을지를 판단할 수 있음으로, 개체에 맞는 약물 적합성 판정에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용한 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 유효한 양의 콜린성 인핸서를 불안장애에 걸린 개체에게 투여하는 단계;
2) 상기 개체의 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하는 단계; 및
3) 상기 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭이 정상 개체와 비교하여 회복되는 정도를 불안장애 회복 정도로 판정하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 콜린성 인핸서는 뇌의 해마와 내측 격막에서의 아세틸콜린 신경전달물질의 양을 증가시키는 작용을 하는 조성물인 것이 바람직하고, 신경말단에서 분비된 아세틸콜린의 분해효소를 억제시킴으로써 아세틸콜린 신경 신호 전달을 증가시키는 약물인 아세틸콜린 분해효소 억제제(acetylcholinesterase inhibitor)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 아세틸콜린 분해효소 억제제 외에도 알로스테릭 감작, 콜린성 수용체의 직접적 활성, 또는 2차 전달자 케스케이드(second messenger cascades)를 통한 관련된 세포간 경로(intracellular pathway)를 활성 또는 조절하는 콜린성 인핸서 성분도 포함된다.
상기 아세틸콜린 분해효소 억제제는 리바스티그민(Rivastigmine), 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine), 타크린(Tacrine), 메트리포네이트(Metrifonate), 피소스티그민(Physostigmine), 네오스티그민(Neostigmine), 피리도스티그민(Pyridostigmine), 암베노늄(Ambenonium), 디마카리늄(Demarcarium), 에드로포늄(Edrophonium), 후퍼진 A(Huperzine A) 및 온키달(Onchidal)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 불안장애는 공황 장애(Panic Disorder), 공포증(Phobia), 강박 행동장애(Obsessive-Compulsive Disorder), 외상 후 스트레스 장애(Posttraumatic stress disorder), 급성 스트레스 장애(Acute stress disorder), 일반화된 불안장애(Generalized anxiety disorder), 및 분리불안장애(Separation anxiety disorder)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 콜린성 제 2형 세타 리듬은 우레탄 마취(rethane anesthesia), 경계성 부동(alert immobility) 또는 피동적인 전신 회전(passive whole-body rotation) 동안 해마의 뇌전도(Hippocampal electroencephalogram, EEG)를 분석하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 불안증 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬이 정상개체에 비해 감소하고, 콜린성 약물 처리에 의해 콜린성 제2형 세타리듬이 정상적으로 회복하면서 불안증이 회복하는 것을 확인하여, 콜린성 제2형 세타리듬, 콜린성 약물 및 불안증의 관계를 확인함으로써, 콜린성 제2형 세타리듬의 특성을 측정하여 불안증 개체에게 콜린성 약물 투여후 경과를 모니터링할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용한 불안장애의 진단 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 피검체의 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하는 단계; 및
2) 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭이 정상 개체와 비교하여 낮은 개체를 불안장애에 걸릴 위험성이 있는 개체로 판정하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 콜린성 제2형 세타리듬은 우레탄 마취(rethane anesthesia), 경계성 부동(alert immobility) 또는 피동적인 전신 회전(passive whole-body rotation) 동안 해마의 뇌전도(Hippocampal electroencephalogram, EEG)를 분석하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 불안증 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬이 정상개체에 비해 감소하고, 콜린성 약물 처리에 의해 콜린성 제2형 세타리듬이 정상적으로 회복하면서 불안증이 회복하는 것을 확인하여, 콜린성 제2형 세타리듬, 콜린성 약물 및 불안증의 관계를 확인함으로써, 콜린성 제2형 세타리듬의 특성을 측정하여 정상개체에 비해 낮은 개체를 선별함으로써 불안증 개체인지를 진단할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용한 불안장애 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 피검물질을 불안장애에 걸린 개체에 투여하는 단계;
2) 상기 개체의 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하는 단계; 및
3) 상기 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭을 정상 개체와 비교하여 회복시키는 피검물질을 선별하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 불안장애는 공황 장애(Panic Disorder), 공포증(Phobia), 강박 행동장애(Obsessive-Compulsive Disorder), 외상 후 스트레스 장애(Posttraumatic stress disorder), 급성 스트레스 장애(Acute stress disorder), 일반화된 불안장애(Generalized anxiety disorder), 및 분리불안장애(Separation anxiety disorder)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 콜린성 제 2형 세타 리듬은 우레탄 마취(rethane anesthesia), 경계성 부동(alert immobility) 또는 피동적인 전신 회전(passive whole-body rotation) 동안 해마의 뇌전도(Hippocampal electroencephalogram, EEG)를 분석하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 불안증 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬이 정상개체에 비해 감소하고, 콜린성 약물 처리에 의해 콜린성 제2형 세타리듬이 정상적으로 회복하면서 불안증이 회복하는 것을 확인하여, 콜린성 제2형 세타리듬, 콜린성 약물 및 불안증의 관계를 확인함으로써, 약물을 투여한 불안장애 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하여 상기 리듬을 정상으로 회복시키는 효과적인 약물을 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 불안장애 진단용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료제 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명에서는 불안증 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬이 정상개체에 비해 감소하고, 콜린성 약물 처리에 의해 콜린성 제2형 세타리듬이 정상적으로 회복하면서 불안증이 회복하는 것을 확인하여, 콜린성 제2형 세타리듬, 콜린성 약물 및 불안증의 관계를 확인함으로써, 뇌전도 측정기를 이용하여 콜린성 제2형 세타리듬 분석함으로써 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정, 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링, 불안장애 진단, 및 불안장애 예방 또는 치료제 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬이 불안증과 관련되어 있음을 밝힘으로써 콜린성 약물, 제2형 세타리듬 및 불안증 간의 작용 기작 연구에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 그동안 불안증에 효과가 있는 약물인 세로토닌성 약물, GABA성 약물, 콜린성 약물이 불안증 개체의 다양성으로 인하여 어떤 개체에게 어떤 종류의 약을 처방해야하는지에 도움이되는 생물학적 마커가 없는 실정이어서 시행착오법으로 여러 종류의 약을 다 먹어보고 가장 좋은 약을 선택할 수 밖에 없었으나, 본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬의 특성을 이용하여 어떤 불안증 개체에게 콜린성 약물를 사용하는 것이 좋을지를 판단할 수 있으며, 콜린성 제2형 세타리듬의 특성을 이용하여 콜린성 약물 투여 후 경과를 모니터링할 수 있다.
도 1은 PLC-β4 -/- 마우스가 불안 행동을 보이는지 확인하기 위해, 야생형 마우스(WT)와 PLC-β4 -/- 마우스(KO)를 대상으로 개방장소(open field), 고가플러스 미로(elevated plus-maze) 및 명암 변화(light-dark transition)인 3가지 불안 행동 테스트를 실시한 결과를 나타내는 그래프이다:
(A) 개방장소에서 운동 활동(Locomotor activity);
(B) 개방장소에서 중앙 통과 수(Number of central cross);
(C) 개방장소의 중앙 부위에서 머무른 시간(Time in the central sector);
(D) 주촉성(Thigmotaxis);
(E) 고가플러스 미로의 개방 분지내로 들어가는 퍼센트(Percent entries into the open arms);
(F) 고가플러스 미로에서 총 들어가는 수(Total number of entries);
(G) 밝은 구획 또는 어두운 구획에 존재하는 수(Light/dark transition number); 및
(H) 밝은 구획에 머무르는 시간(Total time in the light compartment).
도 2는 PLC-β4 -/- 마우스에서 세타 리듬(theta rhythm) 상태를 알아보기 위해, 야생형 마우스(WT)와 PLC-β4 -/- 마우스(KO)를 대상으로 EEG를 분석하여 비콜린성 제 1형 세타 리듬과 콜린성 제 2형 세타 리듬을 나타낸 그림이다:
(A) 야생형 마우스 및 PLC-β4 -/- 마우스가 걷는 동안의 EEG 파형;
(B) 야생형 마우스 및 PLC-β4 -/- 마우스가 걷는 동안의 EEG 파형의 평균 세기 스펙트럼;
(C) 야생형 마우스 및 PLC-β4 -/- 마우스의 우레탄 마취 동안의 EEG 파형; 및
(D) 야생형 마우스 및 PLC-β4 -/- 마우스의 우레탄 마취 동안의 EEG 파형의 평균 세기 스펙트럼.
도 3은 내측 격막 선택적 PLC-β4 녹다운이 PLC-β4 -/- 마우스의 이질적인 세타 리듬 표현형과 유사하게 나타내는지 알아보기 위해, shPLC-β4 및 대조군 shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 야생형 마우스의 내측 격막에 주입한 후, EEG를 분석한 결과를 나타낸 그림이다:
(A) 대조군 shRNA 마우스 및 shPLC-β4 마우스가 걷는 동안의 EEG 파형;
(B) 대조군 shRNA 마우스 및 shPLC-β4 마우스가 걷는 동안 기록된 EEG 파형의 평균 세기 스펙트럼;
(C) 대조군 shRNA 마우스 및 shPLC-β4 마우스의 우레탄 마취 동안의 EEG 파형; 및
(D) 대조군 shRNA 마우스 및 shPLC-β4 마우스의 우레탄 마취 동안의 EEG 파형의 평균 세기 스펙트럼.
도 4는 내측 격막 선택적 PLC-β4 녹다운이 PLC-β4 -/- 마우스의 불안 행동을 나타내는지 알아보기 위해, shPLC-β4 및 대조군 shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 야생형 마우스를 대상으로 개방장소(open field), 고가플러스 미로(elevated plus-maze) 및 명암 변화(light-dark transition)인 3가지 불안 행동 테스트를 실시한 결과를 나타내는 그래프이다:
(A) 개방장소에서 운동 활동(Locomotor activity);
(B) 개방장소에서 중앙 통과 수(Number of central cross);
(C) 개방장소의 중앙 부위에서 머무른 시간(Time in the central sector);
(D) 주촉성(Thigmotaxis);
(E) 고가플러스 미로의 개방 분지내로 들어가는 퍼센트(Percent entries into the open arms);
(F) 고가플러스 미로에서 총 들어가는 수(Total number of entries);
(G) 밝은 구획 또는 어두운 구획에 존재하는 수(Light/dark transition number); 및
(H) 밝은 구획에 머무르는 시간(Total time in the light compartment).
도 5는 리바스티그민(Rivastigmine)이 PLC-β4 -/- 마우스의 이질적인 세타 리듬 표현형을 정상화시키는지 알아보기 위해, 야생형 마우스와 PLC-β4 -/- 마우스에 리바스티그민 또는 식염수를 복강 주사한 후, EEG를 분석한 결과를 나타낸 그림이다(WT-sham: 식염수를 주사한 야생형 마우스; KO-sham: 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스; 및 KO-rivastigmine: 리바스티그민를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스):
(A) WT-sham, KO-sham 및 KO-rivastigmine의 각 마우스가 걷는 동안의 EEG 파형;
(B) WT-sham, KO-sham 및 KO-rivastigmine의 각 마우스가 걷는 동안의 기록된 EEG 파형의 평균 세기 스펙트럼;
(C) WT-sham, KO-sham 및 KO-rivastigmine의 각 마우스가 경계성 부동(alert-immobility)인 동안의 EEG 파형;
(D) WT-sham, KO-sham 및 KO-rivastigmine의 각 마우스가 경계성 부동인 동안의 기록된 EEG 파형의 평균 세기 스펙트럼.
도 6은 리바스티그민이 PLC-β4 -/- 마우스의 증가된 불안 행동을 회복시키는지 알아보기 위해, 야생형 마우스와 PLC-β4 -/- 마우스에 리바스티그민 또는 식염수를 복강 주사한 후, 개방장소, 고가플러스 미로 및 명암 변화인 3가지 불안 행동 테스트를 실시한 결과를 나타내는 그래프이다(WT-sham: 식염수를 주사한 야생형 마우스; KO-sham: 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스; 및 KO-rivastigmine: 리바스티그민를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스):
(A) 고가플러스 미로의 개방 분지내로 들어가는 퍼센트(Percent entries into the open arms);
(B) 고가플러스 미로에서 총 들어가는 수(Total number of entries);
(C) 밝은 구획 또는 어두운 구획에 존재하는 수(Light/dark transition number); 및
(D) 밝은 구획에 머무르는 시간(Total time in the light compartment).
도 7은 경계성 부동(alert immobility) 및 피동적인 전신 회전(passive whole-body rotation) 동안 콜린성 제 2형 세타 리듬 상태를 알아보기 위해, 야생형 마우스(WT)와 PLC-β4 -/- 마우스(KO)를 대상으로 경계성 부동 및 피동적인 전신 회전 동안 EEG를 분석하여 콜린성 제 2형 세타 리듬을 나타낸 그림이다:
(A) 야생형 마우스(WT) 및 PLC-β4 -/- 마우스(KO)가 경계성 부동인 동안의 EEG 파형;
(B) 야생형 마우스(WT) 및 PLC-β4 -/- 마우스(KO)가 경계성 부동인 동안의 EEG 파형의 평균적인 세기 스펙트럼;
(C) 야생형 마우스(WT) 및 PLC-β4 -/- 마우스(KO)가 피동적인 전신 회전 동안의 EEG 파형; 및
(D) 야생형 마우스(WT) 및 PLC-β4 -/- 마우스(KO)가 피동적인 전신 회전 동안의 EEG 파형의 평균적인 세기 스펙트럼.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 이에 한정되지 않는다.
<실시예 1> PLC-β4 -/- 마우스에서 불안 행동 분석
본 발명자들은 PLC-β4 -/- 마우스가 증가된 불안 행동을 보이는지 알아보기 위해, 8 ~ 16주령의 어덜트(adult) 마우스를 이용하여 오전 9시 ~ 오후 5시 사이에 개방장소 주촉성(open field thigmotaxis), 고가플러스 미로(elevated plus-maze) 및 명암 변화(light-dark transition)인 3가지 불안 행동 분석을 수행하였다.
통계적 분석을 위해, 군들 간의 차이는 데이타 세트가 정상적으로 분포되어 있음을 확인한 후, 학생 t-테스트(Student's t-test)를 이용하여 비교하였다. PLC-β4-/- 마우스 및 야생형 마우스에 대한 행동 데이타는 군들 간의 차이를 결정하기 위해 ANOVA에 의해 분석한 후 Tukey's post-hoc test를 수행하였다.
<1-1> PLC-β4-/- 마우스의 제조
대한민국 특허출원 제10-2008-0007202호에 기재된 바와 같이 PLC-β4-/- 마우스를 제조하였다. 구체적으로, C57BL/6J(N8)PLC-β4+/-와 129S4/SvJae(N8)PLC-β4+/- 마우스를 교배하여 F1 단계에서 PLCβ4+/+ 및 PLCβ4-/- 마우스를 획득하였다. 이전 문헌에 보고된 바와 같이 PCR 분석을 이용하여 유전자형을 결정하였다(Kim, D. et al., Nature 389, 290-293, 1997). 동물의 보호 및 취급 절차는 규격화된 안내에 따라 수행하였다(KIST, 한국). 상기 마우스들은 12 시간 밝은 조명, 12 시간 어두운 조명 일주기하에서 물과 사료가 자유롭게 주어졌으며, 온도 22℃, 습도 55%가 유지되는 SPF(specific pathogen free) 환경에서 사육하였다.
<1-2> 불안 행동 테스트
개방장소 주촉성은 흐린 조명하에서 개방장소 기구(40 x 40 x 40 cm)의 중앙에 마우스를 놓아 수행하였다. 10분 관찰 기간 동안, 움직임 활동, 개방 장소의 중앙을 통과한 횟수, 및 개방 장소의 중앙 부분에서 소비한 시간을 기록한 후, PC를 이용한 비디오 행동 분석 시스템(PC-based video behavior analysis system)(TSE, Bad Homburg, Germany)를 이용하여 분석하였다. 상기 주촉성 매개변수는 테스트 장소의 중앙 부분을 통과한 횟수에 대한 움직임 활동의 비율로 산출하였다. 상기 주촉성의 지표는 각각의 마우스에 개별적으로 산출한 후, 주어진 실험군에 대해 평균과 표준 편차를 산출하는데 이용하였다(Treit, D. & Fundytus, M., Pharmacol. Biochem. Behav . 31, 959-962, 1988; Sienkiewicz-Jarosz, H. et al., J Neural Transm .107, 1403-1412, 2000).
상기 개방 장소 분석 결과, PLC-β4 -/- 마우스는 야생형 마우스에 비해 개방 장소에서 감소된 운동력을 나타내었다(도 1a; P　<　0.05, Student's t-test). 상기 PLC-β4 -/- 마우스는 야생형 마우스에 비해 개방 장소의 중앙을 적게 통과하였고(도 1b; P　<　0.05, Student's t-test), 개방 장소의 중앙 부분에 더 적은 시간 머물렀다(도 1c; P　<　0.05, Student's t-test). 따라서, 새로운 환경 주변에서 머무르려는 본능적인 경향인 주촉성(Treit, D. & Fundytus, M., Pharmacol. Biochem. Behav . 31, 959-962, 1988)이 야생형 마우스에 비해 PLC-β4 -/- 마우스가 높은 것을 알 수 있었다(도 1d; P　<　0.001, Student's t-test).
고가플러스 미로는 15 ㎝ 높이의 벽을 가지는 동일한 크기(45 x 5 cm)의 2개의 개방된 분지 및 2개의 폐쇄된 분지로 구성된 기구를 사용하였다. 상기 분지는 검은색 아크릴로 제조되어 있고, 십자형 기호를 형성하는 중앙 플랫폼(5 x 5 cm)으로부터 뻗어 있다. 상기 전체 기구는 바닥층 위 30 ㎝ 높이로 올려져 있다. 각 마우스를 개방된 분지 중 하나에 직면하는 중앙 플랫폼에 놓아 두었다. 그런 다음, 개방 및 폐쇄된 분지로 들어가는 수, 및 개방 및 폐쇄된 분지에 대한 소비 시간 을 5분 테스트 기간 동안 기록하였다(Parks, C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10734-10739; 1998; Ramboz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14476-14481, 1998; Gross, C. et al., Nature 416, 396-400, 2002).
상기 고가플러스 미로 분석 결과, PLC-β4 -/- 마우스는 야생형 마우스에 비해 개방된 분지로 들어가는 수가 적었으며(도 1e; P　<　0.001, Student's t-test), 들어간 총 수는 두 군 사이 차이가 없었다(도 1f; P　<　0.001, Student's t-test).
명암 변화 테스트는 마우스가 한 구획에서 다른 구획으로 이동할 수 있는 작은 통로가 있으며 검은색 칸막이에 의해 두 구획으로 분리되어 있는 우리(cage)(25　x　40　x　20　cm)로 구성된 기구를 사용하였다. 표면 부위의 2/3를 포함하는 한 구획은 흰색 플라스틱으로 제조되었고 조명으로 밝게 하였다; 접해 있는 옆 구획은 검고 어둡게 하였다. 마우스를 어두운 구획에 놓아둔 후 5분 동안 두 챔버 사이 자유롭게 움직이도록 하였다. 그런 다음, 두 구획 사이 이동수, 각 챔버에서의 소비 시간, 및 첫번째 변화에 대한 잠복을 기록하였다(Welch, J.M. et al., Natur e 448, 894-900, 2007).
상기 명암 변화 분석 결과, PLC-β4 -/- 마우스는 야생형 마우스에 비해 어두운 구획에서 밝은 구획으로 이동하는 수가 적었다. 또한, 밝은 챔버에 머무르는 시간이 PLC-β4 -/- 마우스가 야생형 마우스에 비해 유의적으로 짧았다(도 1H; P　<　0.001, Student's t-test).
<실시예 2> PLC-β4 -/- 마우스에서 세타 리듬의 프로파일 분석
본 발명자들은 세타 리듬 프로파일이 PLC-β4 -/- 마우스에서 변하는지, 및 상기 변화가 비콜린성 세로토닌 관련 제 1형 또는 콜린성 제 2형 세타 리듬에 기인하는 것인지를 결정하기 위해, 공지된 프로토콜(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 18165-18170, 2005)을 이용하여 10 내지 14주령 수컷 PLC-β4 -/- 마우스 및 야생형 마우스에서 해마의 뇌전도(Hippocampal electroencephalogram, EEG)를 검사하였다.
통계적 분석을 위해, 군들 간의 차이는 데이타 세트가 정상적으로 분포되어 있음을 확인한 후, 학생 t-테스트(Student's t-test)를 이용하여 비교하였다. PLC-β4-/- 마우스 및 야생형 마우스에 대한 행동 데이타는 군들 간의 차이를 결정하기 위해 ANOVA에 의해 분석한 후 Tukey's post-hoc test를 수행하였다.
<2-1> 생체내 국소 부위 전위 기록
전극 주입을 위해, 마우스들을 펜토바르비탈(pentobarbital)(50　ml/kg, i.p.)로 마취시킨 후 동일한 수평면에 있는 브레그마(bregma)와 람다(lambda)를 입체정위 기구(stereotaxic apparatus)로 열었다. 해마 EEG 기록은 소뇌 위를 접지로 갖는 해마 열(hippocampal fissure)에 주입하는 테플론으로 코팅된 텅스텐 전극(Teflon-coated tungsten electrode)(150 um)을 이용하여 수행하였다[브레그마(Bregma)로부터, 2.0 mm 전후측방향(anteroposterior), 1.2 mm 중측방향(mediolateral), 및 1.8 mm 복배방향(dorsoventral)]. 전극의 위치는 프로토콜에 따라 Nissl로 염색된 절편으로 광학현미경에 의해 검증하였다. 전위 부위를 증폭시키고(x 1,000), 밴드패스로 여과시킨 후(bandpass-filtered)(0.1-100 Hz), 1-kHz 샘플로 연속적으로 12 비트(bit) 해상도로 계수화한 다음, 퍼스널 컴퓨터로 기록하였다.
<2-2> 해마의 전극 활성 데이타의 분석
상기 EEG 데이타를 4-s 단편 및 고속 푸리에 변환(fast fourier transform, FFT)으로 수집하였다. 상기 데이타를 움직임 구조(movement artifact)에 대해 연속적으로 모니터하였고, 동물의 유전자형을 가린채 각 단편의 기록을 실험자에 의해 상호 검증하였다. 모든 단편은 마우스 움직임 동안 수집되었고, 상기 단편에 대해 최대 ± 1.25V를 초과하는 증폭된 EEG 신호의 진폭을 버렸다. 해마 전극 활동의 EEG 스펙트럼 특성을 비교하기 위해, 각 4-s 에폭(epoch)의 고속 푸리에 변환(FFT)(Hamming window)을 이용하여 1-Hz 빈스(bins)에서 EEG 스펙트럼 세기를 산출하였다. 분석은 각 군으로부터 100번의 시행에서 각 간격으로부터 기록을 수행하였다. 0- 내지 30-Hz 범위내 세기는 각 행동 상태에 걸쳐서 군에서 평균을 산출하였고, 평균 값은 1-Hz 빈스로 구성하였다. 세기 스펙트럼에 대한 평균을 내는 과정은 2개의 비교 상태에 대한 EEG 원시 데이타의 표준 편차를 합한 후 나누는 표준화 과정을 적용하였다(예를 들어, PLC-β4-/- 마우스 및 야생형 마우스). 생체내 세타 리듬은 델타- 및 감마-밴드 활동과 같은 다른 생체내 EEG 리듬과 구별되는 명확하고 선명한 피크 진동을 가지고, 상기 피크 세기는 세타 세타 진동 범위내 총 세기 보다 정확한 정보를 제공하기 때문에 비교 목적을 위해 서로 다른 조건하에서의 피크 세기를 이용하였다.
<2-3> 비콜린성 제 1형 세타 및 콜린성 제 2형 세타 리듬의 분류
서로 다른 행동과 관련된 비콜린성 제 1형 및 콜린성 제 2형 세타 리듬을 기록하였다. 비콜린성, 세로토닌 관련 제 1형 세타 리듬은 무스카린성 길항제(muscarinic antagonist)[예를 들어, 아트로핀(atropine) 또는 스코폴아민(scopolamine)]를 이용하여 콜린성 제 2형 세타 리듬으로부터 구별할 수 있으며, 이는 상기 무스카린 길항제를 동물내로 주입하는 경우에 콜린성 제 2형 세타 리듬이 파괴되나 상대적으로 영향을 받지 않는 비콜린성 제 1형 세타 리듬은 유지되기 것을 이용하였다. 또한, 세타 리듬을 유도하는 다른 행동을 통해 비콜린성, 세포토닌 관련 제 1형 세타 리듬과 콜린성 제 2형 세타 리듬 사이 구별하는 것이다. 콜린성 제 2형 세타 리듬은 일반적으로 우레탄 마취(rethane anesthesia), 경계성 부동(alert immobility) 및 피동적인 전신 회전(passive whole-body rotation) 동안 발생하는(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 18165-18170, 2005) 반면에, 제 1형 세타 리듬은 예를 들어 걷거나 달리는 것과 같은 이동하는 활동 동안 발생한다(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986; Shin, J. & Talnov, A., Brain Res. 897, 217-221, 2001). 야생형 및 PLC-β4-/- 마우스, 및 내측 격막에 의해 유도된 shRNA 매개 PLC-β4 녹다운 마우스로부터 콜린성 제 2형 세타 리듬을 기록하기 위해 우레탄 마취, 경계성 부동 및 피동적인 전신 회전을 이용하였다. 오픈 챔버(open chamber) 또는 바퀴에서 달리는 마우스로부터 비콜린성 제 1형 세타 리듬을 기록하였다. 동일한 마우스를 각 세팅에서 분석하였다.
<2-4> PLC-β4 -/- 마우스에서 세타 리듬의 분석
우선, PLC-β4 -/- 마우스의 운동 동안 비콜린성 제 1형 세타 리듬을 조사하기 위해, 마우스가 걷는 동안 해마의 전극 활동을 기록하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 운동 동안에 기록된 리듬은 PLC-β4 -/- 마우스 및 야생형 마우스에서 유사하였다. 또한, 4 ~ 12 Hz의 세타 밴드에서 최대 EEG 세기는 PLC-β4 -/- 마우스와 야생형 마우스 간에 유의적인 차이가 없었다(P　>　0.1, Student's t-test)(도　2b).
또한, PLC-β4 -/- 마우스의 생체내에서 콜린성 제 2형 세타 리듬을 특정하기 위해, 우레탄(1　g/kg, i.p.)으로 마취시킨 마우스의 해마 EEG 기록을 수행하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 PLC-β4 -/- 마우스와 야생형 마우스에서의 우레탄은 무처리 마우스에서 수집된 해마 열창 기록(hippocampal fissure recording)을 명확하게 나타내는 간헐성 세타 리듬을 유도하였다(도 2c). 그러나, 세기 스펙트럼 분석은 PLC-β4 -/- 마우스에서 세타 세기가 야생형 마우스의 세타 세기에 비해 약 ~30% 감소하였다(도　2d; P　<　0.05, Student's t test). 아울러, 경계성 부동 또는 피동적인 전신 회전 동안, PLC-β4 -/- 마우스에서 발생된 콜린성 제 2형 세타 리듬도 역시, 야생형 마우스에서 발생된 콜린성 제 2형 세타 리듬에 비해 감소하였다(도 7).
<실시예 3> 내측 격막 내 PLC-β4 결손과 불안 행동 및 콜린성 세타 리듬의 관계 분석
본 발명자들은 내측 격막이 세타 리듬을 조절하고(Bland, B.H., Prog. Neurobiol. 26, 1-54, 1986), 내측 격막에서 현저한 PLC-β4가 발현(Watanabe, M. et al., Eur. J. Neurosci. 10, 2016-2025, 1998)한다는 문헌을 통해, 내측 격막에서 PLC-β4의 결손이 불안 행동을 증가시키고, PLC-β4 -/- 마우스에서 콜린성 세타 리듬이 감소시키는지 조사하였다.
<3-1> shRNA 발현 및 PLC-β4의 shRNA 녹다운의 검증
PLC-β4-특이적 shRNA 및 대조군(control) shRNA를 pLKO 퓨로마이신 저항성 벡터(MISSION TRC shRNA Target Set; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 발현시켰다. NIH3T3 세포[ATCC(http://www.atcc.org/) CRL-1658]에서 PLC-β4 발현을 녹다운시키기 위해, PLC-β4-특이적 shRNA 발현 카세트를 암호화하는 5개의 다른 pLKO 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 시험하였다. pLKO-대조군(SHC002)은 비-표적 shRNA로서 제공하였다. shRNA의 효능을 조사하기 위해, shRNA 발현 렌티바이러스 벡터 컨스트럭트를 NIH3T3 세포에 형질감염시킨 다음, 래빗 항-PLC-β4(1:200; Santa Cruz Biotechnology)를 이용한 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)에 의해 PLC-β4 발현 수준을 결정하였다. 상기 선별 실험에서 PLC-β4 발현 수준을 증가시키기 위해, PLC-β4 발현 플라스미드인 pFLAG-CMV2-PLC-β4로 NIH3T3 세포를 형질감염시켰다. 발현 수준은 형질감염 효율로 표준화하였으며, 이는 루시퍼라제 플라스미드로 함께 형질감염(co-transfection)시킴으로써 결정하였다. PLC-β4-표적화 shRNA, shPLC-β4-1[TRCN0000076919: 5'-GCCTCTTCAA AGTAGATGAA T-3'(서열번호: 1)] 및 shPLC-β4-3[TRCN0000076921: 5'-CCGTCTCCTA ATGACCTCAA A-3'(서열번호: 2)] 중 두개는 렌티바이러스 발현 벡터로 함께 형질전환시킨 세포에서 PLC-β4 발현 수준을 감소시켰다. shPLC-β4-1을 다음의 생체내(in vivo) 실험에 이용하였다.
<3-2> 렌티바이러스 벡터의 제조
HEK293T 세포[ATCC(http://www.atcc.org/) CRL-1573]를 하기 3개의 플라스미드로 함께 형질감염시킴으로써 제조하였다: (1) 이종의 외피 단백질 VSN-G를 발현하는 컨스트럭트; (2) gag-pol 유전자를 발현하는 패키징-결핍 헬퍼(packaging-defective helper) 컨스트럭트; 및 (3) PLC-β4-특이적인 shRNA 서열을 포함하는 전달 벡터(transfer vector). 제조사(Invitrogen)에 의해 기재된 바와 같이 리포펙타민 플러스(Lipofectamine Plus)를 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 상기 형질감염시킨 후 48시간이 지난 다음, 렌티바이러스(lentivirus)를 포함하는 배양 상청액을 채취한 후, 0.45-mm 막 필터(Nalgene, USA)를 통해 정화시킨 다음, 즉시 -70℃에서 저장하였다. 적정 농도는 p24 ELISA(Perkin-Elmer Life Science)를 이용하거나 AIDS Research and Reference Reagent Program을 통해 획득된 단클론 항-p24 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석에 의해 결정하였다. 상기 적정 농도는 일반적으로 농축 이전에 ~ 106-107 형질도입 유닛(transduction unit; TU)/ml이었다. 4℃에서 20% 슈크로즈 쿠션(sucrose cushion)을 이용한 초원심분리(ultracentrifugation)(50,000 × 2h)를 이용하여 감염성 렌티바이러스 입자를 농축하였다.
<3-3> 생체내 내측 격막에서 PLC-β4의 렌티바이러스-매개 녹다운
고-적정 농도로 농축된 shPLC-β4-1 또는 대조군 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 정위 방법의 주사(stereotaxic injection)에 의해 10주령 야생형 마우스의 내측 격막에 주입시켰다. 13마리의 대조군 shRNA로 주입된 마우스 및 16마리의 shPLC-β4-1로 주입된 마우스를 각각 사용하였다. 주사한지 4주 후에, 3가지의 불안 테스트를 이용하여 테스트한 다음, 하기 기재된 바와 같이 해마 EEG를 기록하였다. 행동 테스트 및 EEG 기록을 수행한 후, 마우스를 희생시켰으며, 내측 격막에서 내생의 PLC-β4 발현의 감소를 평가하기 위해 면역조직화학적 분석을 수행하였다.
그 결과, shPLC-β4-1로 감염된 내측 격막의 신경 세포에서 염색된 PLC-β4가 대체로 감소시킨 반면에, 대조군 shRNA 마우스 유래 신경세포는 정상적인 PLC-β4 발현을 나타내었다. 따라서 내측 격막 신경세포에서 shPLC-β4-1를 발현하는 렌티바이러스가 내생의 PLC-β4 발현을 대체로 감소시킨다는 것을 확인하였다.
<3-4> PLC-β4 녹다운 검출을 위한 조직 처리 및 면역형광 염색
문헌에 보고된 바와 같이 조직을 처리한 후 면역염색을 수행하였다(Kim, D.S. et al., J. Comp. Neurol. 511, 581-598, 2008). 구체적으로, 동물을 우레탄 무감각증(urethane anesthesia) 하에 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS)와 0.1 M 인산완충용액(PB, pH 7.4)에서 4% 파라포름알데하이드를 차례로 심장관류(transcardial perfusion)로 희생시켰다. 뇌를 제거한 후, 4시간 동안 동일한 고정액으로 고정시켰다. 상기 뇌 조직을 밤새 30% 자당으로 침윤시킴으로써 냉동보존시켰다. 그 후, 전체 내측 격막 부위를 냉동 박편기(cryostat)로 냉동시킨 후 30-um 조각으로 절편시킨 다음, 상기 절편을 PBS를 포함하는 6 웰 플레이트에 놓았다. 선별된 동물들 유래 각 전체 내측 격막 부위에서 각각의 6번째 절편을 면역형광 분석용으로 사용하였다. 야생형 및 PLC-β4-/- 마우스에서 PLC-β4 발현의 존재 및 부존재 각각, 및 내측 격막 부위의 PLC-β4-양성 신경세포에서 shPLC-β4에 의해 유도된 형태학상 변화는 마우스 항-신경세포 핵 IgG(mouse anti-Neuronal Nuclei(NeuN) IgG)(1:100; Chemicon, CA, USA) 및 래빗 항-PLC β4 IgG(rabbit anti-PLC β4 IgG)(1:100; Chemicon, CA, USA)를 이중 면역형광 염색함으로써 평가하였다. 뇌조직을 항혈청 혼합물에서 실온으로 밤새 배양하였다. PBS로 세번 세척한 후(각 10분), 각 절편을 Cys2-결합 염소 항-마우스 IgG(Cy2-conjugated goat anti-mouse IgG)(1:200; Amersham, PA, USA) 및 Cys3-결합 염소 항-래빗 IgG(Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG)(1:200; Amersham, PA, USA)를 모두 포함하는 혼합물에서 실온으로 1시간 동안 배양하였다. 상기 각 절편을 DAPI(Vector, USA)가 존재하거나 부존재하는 Vectashield 고정 배지(mounting media)에 고정시켰다. Olympus DP50 디지탈 카메라 및 Viewfinder Life Version 1.0 software, 또는 Olympus FluoViewTM FV1000 Confocal Microscope System를 이용하여 이미지를 포착 및 분석하였다. Adobe Photoshop 7.0(San Jose, CA)를 이용하여 형상을 만들었다. 이미지 미세 조종은 경계에 의해 한정하였고, 명암 조절은 전체 이미지로 적용하였다.
<3-5> PLC-β4 결손과 불안 행동 및 콜린성 세타 리듬 관게 분석
PLC-β4를 표적화하는 shRNA(shPLC-β4) 또는 대조군 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 10주령 야생형 마우스의 내측 격막에 운반시켰다.
그 결과, 뇌의 사후 검시에서, shPLC-β4 렌티바이러스로 감염시킨 마우스의 내측 격막의 신경세포에서 염색된 PLC-β4는 대조군 렌티바이러스로 감염시킨 마우스에 비해 감소하는 것으로 나타났다.
또한, 렌티바이러스-매개 PLC-β4 선택적 녹다운이 콜린성 세타 리듬이 감소하거나 불안 수준이 증가하여, PLC-β4 -/- 마우스의 표현형을 재생하는 것인지 조사하였다.
그 결과, 우레탄 마취 동안 기록된 콜린성 세타 리듬은 shPLC-β4를 암호화하는 렌티바이러스로 감염된 야생형 마우스가 대조군 shRNA로 감염된 야생형 마우스에 비해 감소한 반면에(도 3c 및 도 3d), 움직임 동안 관찰된 비콜린성 세타 리듬은 동일하게 나타났다(도 3a 및 도 3b).
또한, shPLC-β4 마우스 및 대조군 shRNA 마우스로 3가지 불안 행동 분석을 수행하였다. 개방 장소 분석에서, shPLC-β4 마우스는 대조군 shRNA 마우스에 비해 개방 장소에서의 운동 활동의 총량에서 유의적인 차이가 없음을 나타내었다(도 4a; P　>　0.05, Student's t-test). 그러나, 개방 장소의 중앙을 가로지르는 shPLC-β4 마우스가 대조군 shRNA 마우스 보다 더 낮았다(도 4b; P　>　0.05, Student's t-test). 따라서, 마우스의 중앙 통과의 수에 대한 움직임 활동의 비율은 shPLC-β4 마우스가 대조군 shRNA 마우스 보다 높았다(도 4d; P　<　0.001, Student's t-test).
또한, 고플러스 미로 테스트에서, shRNA 마우스는 대조군 shRNA 마우스에 비해 개방 분지내로 들어가는 수가 적었다(도 4e; P　<　0.001, Student's t-test); 개방 및 폐쇄 분지로 들어가는 총 수는 두 군 사이 차이가 없었다(도 4f; P　=　0.128, Student's t-test).
또한, 명암 반응 테스트에서, shPLC-β4 마우스가 대조군 shRNA 마우스에 비해 어두운 구획에서 밝은 구획으로 이동하는 수는 거의 없었다(도 4g; P　=　0.01, Student's t-test). shPLC-β4 마우스가 대조군 shRNA 마우스에 비해 밝은 챔버에서 유의적으로 짧은 시간 동안 머물렀다(도 4h; P　=　0.047, Student's t-test). 이런 결과는 PLC-β4 -/- 마우스의 표현형인 콜린성 세타 리듬의 감소와 불안 행동의 증가가 내측 격막 유래 PLC-β4 단백질의 제거에 의해 야기되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4> 리바스티그민에 의한 PLC-β4 -/- 콜린성 세타 리듬 및 불안의 회복
본 발명자들은 PLC-β4 -/- 마우스가 콜린성 제 2형 세타 리듬을 감소시키는 반면에 비콜린성, 세로토닌 관련 제 1형 세타 리듬을 그대로 유지시키는 결과를 통해, PLC-β4 -/- 마우스의 증가된 불안이 콜린성 제 2형 세타 리듬의 감소로부터 야기되는지 조사하였다. 이를 테스트하는 방법으로, PLC-β4 -/- 마우스에서 아세틸콜린 수준의 증가가 콜린성 세타 리듬의 감소된 진폭을 회복시켜 불안 행동을 정상화시킬 수 있는지를 알아보았다. 이에, 해마에서 아세틸콜린의 수준을 증가시키는 것으로 알려진 콜린성 증진제(cholinergic-enhancing drug)이며 아세틸콜린에스테라제 억제제(acetylcholinesterase inhibitor)인 리바스티그민(Rivastigmine)(Van Dam, D. et al., Psychopharmacology 180, 177-190, 2005; Cerbai, F. et al., Eur. J. Pharmacol . 572, 142-150, 2007)을 각각 PLC-β4 -/- 마우스에 투여하였다.
통계적 분석을 위해, 군들 간의 차이는 데이타 세트가 정상적으로 분포되어 있음을 확인한 후, 학생 t-테스트(Student's t-test)를 이용하여 비교하였다. PLC-β4-/- 마우스, 야생형 마우스, 및 리바스티그민 투여 PLC-β4-/- 마우스에 대한 행동 데이타는 군들 간의 차이를 결정하기 위해 ANOVA에 의해 분석한 후 Tukey's post-hoc test를 수행하였다.
<4-1> 리바스티그민의 투여
콜린성 증진제인 리바스티그민(Novartis Pharma, Basel, Switzerland)을 식염수에 용해하였다. 불안 행동 테스트를 시작하기 60분 전에 0.5 mg/kg 리바스티그민으로 동물에 복강주사(i.p.)하였다(총 부피, 5　ml/kg). 0.5 mg/kg의 리바스티그민이 해마 아세틸콜린 농도를 ~100%까지 증가시킨다는 것을 보여주는 문헌인 미세투석 연구(Kosasa, T., et al., Eur. J. Pharmacol . 380, 101-107, 1999; Scali, C. et al., J. Neural. Transm . 109, 1067-1080, 2002; Liang, Y.Q. & Tang, X.C., Acta. Pharmacol. Sin . 27, 1127-1136, 2006), 및 콜린유사약물에 대한 역 U자형의 투여량에 따른 반응 곡선(U-shaped dose-response curve)(Van Dam, D. et al., Psychopharmacology 180, 177-190, 2005)을 통해 보다 높은 투여량이 유용한 효과를 미치지 않는다는 내용을 근거로 하여, 상기 리바스티그민의 투여량을 선택하였다. PLC-β4 +/+(WT) 및 PLC-β4 -/-(KO) 마우스들을 다음과 같은 세가지 처리군 중 하나에 무작위로 분배하였다: (1) WT-sham(식염수를 복강 주사한 야생형 마우스; n　=　10), (2) KO-sham(식염수를 복강 주사한 PLC-β4 -/- 마우스; n　=　10), 및 (3) KO-rivastigmine(리바스티그민을 복강 주사한 PLC-β4 -/- 마우스; n　=　10). 리바스티그민은 2세대 카르밤산염 기초 역 비경쟁적 AChE 및 부티릴(butyryl)ChE(BuChE) 억제제이다. 상기 억제제는 억제 효과가 장기간 지속되고 뇌 특이적이며(Enz, A. et al., Prog. Brain Res . 98, 431-438, 1993), 해마 및 피질에서 선택적으로 콜린 활성을 증가시키기 때문에 이를 선택하여 사용하였다(Weinstock, M., et al., J. Neural Transm. Suppl . 43, 219-225, 1994).
<4-2> 리바스티그민 투여에 의한 콜린성 세타 리듬 회복 분석
콜린성 세타 리듬과 불안 사이 관계를 실험적으로 조사하기 위해, 하기 세개의 마우스 군을 새로운 환경에 놓은 후 EEG를 기록하였다: (1) 리바스티그민을 주사한 PLC-β4 -/- 마우스, (2) 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스, 및 (3) 식염수를 주사한 야생형 마우스. 콜린성 세타 리듬을 발생하는 것으로 알려진 여러 조건(예를 들어, 우레탄 마취, 경계적 부동 및 피동적인 회전) 중 최적의 조건으로 고려된 경계적 부동 상태를 유도하고 불안을 야기하는 새로운 환경 모델을 선택하였다.
그 결과, 새로운 개방 장소에서 이동(즉, 걸음) 동안 기록된 비콜린성 제 1형 세타 리듬은 상기 세 군 사이 유의적인 차이가 없었다(도 5a 및 도 5b). 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스에서, 콜린성 세타 리듬은 식염수를 주사한 야생형 마우스에 비해 감소하였다(도 5c 및 도 5d). 또한, 리바스티그민으로 주사(0.5　mg/kg, i.p.)한 PLC-β4 -/- 마우스의 콜린성 리듬의 세기는 식염수를 주사한 야생형 마우스와 유사한 수준으로 회복하였다(도 5c 및 도 5d). 따라서 해마에서 아세틸콜린 수준을 증가시키는 것이 PLC-β4 -/- 마우스에서 감소한 콜린성 세타 리듬을 회복시키는 것을 알 수 있었다.
<4-3> 리바스티그민 투여에 의한 불안 행동 회복 분석
PLC-β4 -/- 마우스의 증가된 불안 표현형을 회복시키는 리바스티그민 투여가 감소된 콜린성 세타 리듬의 회복과 관련이 있는지 조사하기 위해, 리바스티그민(0.5 mg/kg, i.p.)을 PLC-β4 -/- 마우스에 주사한 다음, 60분 후에 상기 리바스티그민 처리군을 세가지 불안 행동 분석을 테스트하였다. 세가지 불안 테스트에서, 리바스티그민 처리군은 PLC-β4 -/- 마우스의 증가된 불안 표현형을 회복하였다(도 6).
개방 장소 테스트에서, 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스는 움직임이 전체적으로 감소하였고(도　6a; ANOVA, F 2,45　=　6.96, P　=　0.0023) 식염수를 주사한 야생형 마우스(도　6b; ANOVA, F 2,45　=　4.34, P　=　0.019) 보다 개방 장소의 중앙으로 덜 움직였다. 그러나, 리바스티그민을 주사한 PLC-β4 -/- 마우스는 개방 장소의 중앙으로의 움직임 뿐만 아니라 총 움직임 수준에서 야생형 수준으로 나타났다(도 6a 및 도 6b). 또한, 리바스티그민 투여는 식염수를 주사한 야생형 마우스에 비교하여 개방 장소의 중앙 부분에서의 소비 시간의 양을 회복시켰다(도 6c; ANOVA, F 2,45　=　5.46, P　<　0.01). 또한, 리바스티그민 투여는 식염수를 주사한 야생형 마우스에 비교하여 동일한 수준으로 주촉성을 감소시켰다(도 6d; ANOVA, F 2,45 = 7.46, P < 0.001).
고플러스 미로에서, 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스는 개방 분지로 들어가는 수가 적은 반면에, 리바스티그민 처리군의 행동은 식염수를 주사한 야생형 마우스와 구별되었다(도　6e; ANOVA, F 2,45　=　4.2, P　=　0.021). 폐쇄 및 개방된 분지내로 들어가는 총수는 상기 세가지 군이 다르지 않다(도　6f; ANOVA, F 2,45　=　0.43, P　=　0.44).
명암 반응 테스트에서, 식염수를 주사한 PLC-β4 -/- 마우스는 밝은 구획과 어두운 구획 사이 이동이 거의 없었고(도 6g; ANOVA, F 2,21　=　4.5, P　=　0.024), 밝은 챔버에서 유의성이 없는 시간을 보냈다(도 6h; ANOVA, F 2,21　=　4.8, P　=　0.019). 두 가지 경우에서, 리바스티그민 처리 PLC-β4 -/- 마우스의 행동은 식염수를 주사한 야생형 마우스의 행동과 다르지 않았다.
따라서, 리바스티그민 처리는 PLC-β4 -/- 마우스에서 정상적인 콜린성 세타 리듬과 정상적인 불안 행동을 회복시키며, 상기 콜린성 세타 리듬이 불안을 억제하는 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
본 발명은 콜린성 제2형 세타리듬을 이용하여 콜린성 약물 투여에 적합한 불안증 개체를 스크리닝하는데 이용될 수 있으며, 불안증 개체에게 콜린성 약물 투여 후 예후를 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1) 불안장애에 걸린 개체에서 콜린성 제2형 세타리듬(cholinergic type Ⅱ theta rhythm)을 측정하는 단계;
2) 상기 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭이 정상 개체에 비해 감소하는 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 개체가 불안장애 치료제로서 콜린성 인핸서(cholinergic enhancer)의 처리가 필요한 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 콜린성 제2형 세타리듬은 뇌전도(electroencephalogram, EEG)를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)의 콜린성 인핸서는 알로스테릭 감작제, 콜린성 수용체 활성제, 2차 전달자 케스케이드를 통한 신경세포간 경로 활성제, 및 아세틸콜린 분해 효소 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)의 콜린성 인핸서는 리바스티그민(Rivastigmine), 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine), 타크린(Tacrine), 메트리포네이트(Metrifonate), 피소스티그민(Physostigmine), 네오스티그민(Neostigmine), 피리도스티그민(Pyridostigmine), 암베노늄(Ambenonium), 디마카리늄(Demarcarium), 에드로포늄(Edrophonium), 후퍼진 A(Huperzine A) 및 온키달(Onchidal)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료를 위한 약물 적합성 판정용 키트.
1) 유효한 양의 콜린성 인핸서를 불안장애에 걸린 개체에게 투여하는 단계;
2) 상기 개체의 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하는 단계; 및
3) 상기 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭이 정상 개체와 비교하여 회복되는 정도를 불안장애 회복 정도로 판정하는 단계를 포함하는, 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링 방법.
콜린성 제2형 세타리듬 분석용 뇌전도 측정기를 포함하는, 콜린성 인핸서 투여 후 불안장애의 예후 모니터링용 키트.
1) 피검체의 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하는 단계; 및
2) 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭이 정상 개체와 비교하여 낮은 개체를 불안장애에 걸릴 위험성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 불안장애의 진단 방법:
1) 피검물질을 불안장애에 걸린 개체에 투여하는 단계;
2) 상기 개체의 콜린성 제2형 세타리듬을 측정하는 단계; 및
3) 상기 콜린성 제2형 세타리듬의 진폭을 정상 개체와 비교하여 회복시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료제 후보물질 스크리닝 방법.
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