WO2010143539A1

WO2010143539A1 - 氷結晶化阻害物質

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Publication number: WO2010143539A1
Application number: PCT/JP2010/059005
Authority: WO
Inventors: 秀昭毛笠; 荒井　直樹; 友野　潤; 真一横田; 秀久河原
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2009-06-09
Filing date: 2010-05-27
Publication date: 2010-12-16
Anticipated expiration: 2011-12-09
Also published as: KR20120027232A; EP2441772A1; US20120136138A1; JP2010285359A; EP2441772A4; CN102459319A

Abstract

　本発明は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有し、食品製造に利用できる安全な工程で、簡単に、効率良く、安価に製造できる氷結晶化阻害物質を提供することを目的とする。また、本発明は、当該氷結晶化阻害物質の製造方法、当該氷結晶化阻害物質の活性部分であるポリペプチド、並びに当該氷結晶化阻害物質またはポリペプチドを含む氷結晶化阻害組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物に由来し、かつ、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した分子量が４００ｋＤａ以上であることを特徴とする。

Description

氷結晶化阻害物質

　本発明は、氷結晶化阻害物質、当該氷結晶化阻害物質の製造方法、当該氷結晶化阻害物質の活性部分であるポリペプチド、並びに当該氷結晶化阻害物質またはポリペプチドを含む氷結晶化阻害組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品に関するものである。

　低温時の生体防御物質の１つとして、氷結晶化阻害タンパク質が知られている。氷結晶化阻害タンパク質は、「不凍タンパク質」や「Ａｎｔｉ－Ｆｒｅｅｚｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ」とも呼ばれている。以下、これらを「ＡＦＰ」と略記する。ＡＦＰは、水が凍ってしまう氷点下の温度域において、細胞内に生成する氷結晶の表面に吸着してその成長を食い止め、細胞の凍結を妨げる働きを持つ。このようなＡＦＰは、例えば、魚類、昆虫、植物、菌類、微生物などから見出されている。

　魚類や昆虫由来のＡＦＰは研究が進んでおり、数種類の異なるタイプのＡＦＰが知られている。Ｉ型ＡＦＰは、例えばカレイ科やカジカ科の魚類などに見出されている。Ｉ型ＡＦＰとしては、連続したＡｌａ残基を含む一本鎖α－らせん構造をとる、分子量が３．３～５．０ｋＤａのものが報告されている（非特許文献１）。

　ＩＩ型ＡＦＰは、例えばキュウリウオやタイセイヨウニシンに見出されている。ＩＩ型ＡＦＰとしては、Ｓ－Ｓ結合を有し、カルシウム依存型レクチンの糖認識領域と高い相同性を有する、分子量が１４ｋＤａ以上のものが報告されている（非特許文献１）。

　ＩＩＩ型ＡＦＰは、三次元構造情報が多く得られている球状タンパク質であり、陰イオン交換樹脂に結合するものと陽イオン交換樹脂に結合するものとに分類される。例えば、マクロゾアルケルスアメリカヌスに見出されている。ＩＩＩ型ＡＦＰとしては、分子量が６～７ｋＤａのものが報告されている（非特許文献１）。

　ＩＶ型ＡＦＰは、ＧｌｕとＧｌｎに富み、アポリポプロテインＥ３と高い相同性を示し、αへリックス構造を多く含む。ＩＶ型ＡＦＰの存在下で形成される氷結晶は、特徴的な六方偏四角面体型である。ＩＶ型ＡＦＰとしては、例えば、１０８残基からなる、分子量が１２ｋＤａのカジカ科のミオクソケファルスオコトデケンスピノスス由来のものが報告されている（非特許文献１）。

　βへリックス型ＡＦＰは、－Ｔｈｒ－Ｘａａ－Ｔｈｒ－（式中、「Ｘａａ」は任意のアミノ酸を示す）とＣｙｓを特定の位置に含む１２残基から１３残基の繰り返しアミノ酸配列から構成され、高い熱ヒステリシスを示すことが報告されている。例えばチャイロコメノゴミムシダマシの幼虫や穀物害虫の幼虫などに見出されている。βへリックス型ＡＦＰとしては、分子量が約９ｋＤａのものが報告されている（非特許文献１）。

　不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ）は、主として－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－の繰り返しから構成され、Ｔｈｒの側鎖が氷結晶結合に関わる二糖で修飾されていることが知られている。例えばノトセニア科の魚類に見出されている。不凍糖タンパク質としては、分子量が２．２～３３ｋＤａのものが報告されている（非特許文献１）。

　植物由来のＡＦＰとしては、冬ライ麦やニンジン由来のものなどが知られている。例えば、冬ライ麦由来のＡＦＰはグルカナーゼ、キチナーゼ、ソーマチン様タンパク質を含んでおり、複合体を形成し、サブユニットの分子量は１６～３５ｋＤａであることが知られている（非特許文献２）。ニンジン由来のＡＦＰは、分子量３６ｋＤａの単量体として存在することが知られている（非特許文献３）。

　菌類由来のＡＦＰとしては、例えばイシカリガマノホタケや南極エノキ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｂｅｌｕｔｉｐｅｓ　ＫＵＡＦ－１）などの担子菌類由来のものが知られている。これらのＡＦＰは細胞外分泌タンパク質である。イシカリガマノホタケ由来のものは、分子量が１５～３０ｋＤａであることが報告されている（特許文献１、２）。

　微生物由来のＡＦＰとしては、例えばフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものが知られている。分子量は１９ｋＤａで、０．５℃以上という高い熱ヒステリシス活性を示すことが報告されている（特許文献３）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＧＲ１２－２から分泌される不凍タンパク質は、分子量１６４ｋＤａの新規なリポ糖タンパク質であることが知られている（非特許文献４）。

　しかしながら、これまでに報告されているＡＦＰを含む魚類、植物、昆虫、菌類、細菌などを利用する場合、その生体内にＡＦＰを微量しか含まないことから抽出効率が悪かったり、或いはＡＦＰがその生体内に多量に含まれていても、これら生物の捕獲や培養が難しいという問題があった。よって、これら従来生物の中で、食品用途のＡＦＰの工業的生産に利用できるものはない。

　魚類または昆虫類のＡＦＰについては、遺伝子組み換え技術を用いて生産性を高めている報告もある（特許文献４、５）。しかしながら、そのような組換え技術を利用しなくとも、より簡便な方法で効率良く、安価にＡＦＰを提供し得る方法が求められているのが現状である。このような事情に鑑みると、従来公知の氷結晶化阻害物質のみで十分ということはなく、新規でより有用な氷結晶化阻害物質の開発が強く求められている。

特開２００４－２４２３７号公報特開２００４－２７５００８号公報特開２００４－１６１７６１号公報国際公開ＷＯ９２／１６６１８号パンフレット国際公開ＷＯ９７／２８２６０号パンフレット

生物物理，2003，Vol.43，No.3，pp.130-135 Plant Physiology，1999，Vol.119，pp.1361-1369 Biochem．J．，1999，Vol.340，pp.385-391 Can．J．Microbiol．，1998，Vol.44，p.64

　本発明は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有し、食品製造に利用できる安全な工程で、簡単に、効率良く、安価に製造できる氷結晶化阻害物質を提供することを目的とする。また、本発明は、当該氷結晶化阻害物質の製造方法、当該氷結晶化阻害物質の活性部分であるポリペプチド、並びに当該氷結晶化阻害物質またはポリペプチドを含む氷結晶化阻害組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった。その結果、植物から容易に得ることができ、工業的に極めて簡便な方法で効率よく製造できる氷結晶化阻害物質を見出し、本願発明を完成させるに至った。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物に由来し、かつ、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した分子量が４００ｋＤａ以上であることを特徴とする。

　本発明に係る上記氷結晶化阻害物質の製造方法は、分画分子量５，０００以上の分離膜を用いて植物から氷結晶化阻害物質を分離する工程を含むことを特徴とする。

　本発明に係るポリペプチドは、上記氷結晶化阻害物質の一部であり、かつ氷結晶化阻害活性を有することを特徴とする。

　本発明に係る氷結晶化阻害組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品は、上記氷結晶化阻害物質および／または上記ポリペプチドを含むことを特徴とする。

　本発明の一実施形態について説明すると、以下の通りである。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質は、氷結晶の成長を阻害する機能を有するタンパク質である。ＡＦＰ（不凍タンパク質）は、一般的に、初期氷結晶の表面に作用してその成長を妨げたり、或いは氷結晶の形状を制御してその成長を抑制する。よって、本発明における氷結晶化阻害活性は、氷結晶構造の観察により確認することができる。勿論、氷結晶の成長の阻害を直接測定してもよい。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物に由来するものであり、植物から抽出することができる。本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物は特に限定されないが、例えば、アブラナ科、セリ科、ユリ科およびキク科に属する植物からなる群から選ばれる１以上の植物、並びにこれらの類縁品種および改良品種を挙げることができる。アブラナ科に属する植物としては、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、シロナ、野沢菜、広島菜、ミズナおよびマスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ）からなる群から選ばれる１以上の植物、並びにこれらの類縁品種および改良品種を挙げることができる。セリ科に属する植物はニンジン等が、ユリ科に属する植物はネギ等が、キク科に属する植物は春菊等が挙げられる。

　アブラナ科植物としては、マスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ）、並びにこれらの類縁品種および改良品種が好適である。上記Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ種の植物としては、特に限定されるものではないが、例えば、マスタードグリーン（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａｍｕｓｔａｒｄ　ｇｒｅｅｎｓ）、タカナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ　ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ザーサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ　ｔｕｍｉｄａ）、和がらし（ブラウンマスタード，Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ）が例示できる。Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ種の植物はいずれも入手が容易であり、また、Ｂｒａｓｓｉｃａｊｕｎｃｅａ種の植物を用いれば、本発明に係る氷結晶化阻害物質を効率よく得ることができる。

　例示した上記Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ種の植物の中でも、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａが好ましい。Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａは、さらに容易に入手できる。また、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａは、植物体の単位重量あたりから得られる抽出物が有する氷結晶化阻害活性が、さらに優れている。

　本発明において、「類縁品種」とは、例えば、科の類縁品種は、同じ属に属する植物でも学術上の分類において近い科の品種をいい、具体的な植物の類縁品種は、同じ科に属する植物でも学術上の分類において近い品種をいう。また、「改良品種」とは、人為的な選択、交雑、突然変異、遺伝子組み換えなどにより改良した植物をいうものとする。

　これらの植物は、低温馴化するなど公知の方法によって植物中の氷結晶化阻害物質を誘導した状態で使用してもよい。低温馴化の温度としては、とくに限定されるものではないが、下限温度は０℃以上が好ましく、上限温度は２０℃以下が好ましい。また低温馴化の期間としては、特に限定されるものではないが、３日間以上行うことが好ましい。

　以下、本発明に係る氷結晶化阻害物質の性状について詳細に説明する。本発明者らが実際に得た植物由来氷結晶化阻害物質は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した分子量が４００ｋＤａ以上であり、３４０００±５００Ｄａまたは７１０００±１０００Ｄａの分子量を有する低分子のサブユニットを少なくとも一つ以上含んでなる複合体である。ここでサブユニットは、上記の分子量４００ｋＤａ以上の氷結晶化阻害物質を、例えばジチオスレイトールなどの還元剤の存在下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した際に低分子のバンドとして認められ、分子量４００ｋＤａ以上の氷結晶化阻害物質から解離して得られうるポリペプチドである。本発明の氷結晶化阻害物質は、これらのサブユニットからなる単量体か、サブユニットを２以上含んでなる複合体であってもよいし、複合体の一部を含んでもよい。複合体の一部としては例えば、３４０００±５００Ｄａおよび７１０００±１０００Ｄａのサブユニットが挙げられるが、氷結晶化阻害活性を有する限り、特に限定されるものではない。

　なお、上記氷結晶化阻害物質の一部であり、かつ氷結晶化阻害活性を有することを特徴とするポリペプチドとしては、上記の３４０００±５００Ｄａおよび７１０００±１０００Ｄａのサブユニットを挙げることができる。即ち、本発明に係る氷結晶化阻害ポリペプチドは、上記氷結晶化阻害物質を解離することにより製造することができる。

　さらに、本発明の氷結晶化阻害物質としては、以下の性質を有するものが好適である：
　・ｐＨ８．０の条件で、各種の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーにより吸着画分として得られる
　・ｐＨ６．０の条件で、各種の陽イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーにより非吸着画分として得られる
　・ｐＨ７．４の条件で、各種糖結合タンパク質と結合、吸着しない。

　ここで陰イオン交換体としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）やＱ（Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ）などが挙げられる。また、陽イオン交換体としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＣＭ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）やＳＰ（Ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ）などが挙げられる。また、糖結合タンパク質（レクチン）とは、糖鎖を特異的に認識して結合し、架橋を形成するタンパク質の総称であり、そのような糖結合タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン）、ＲＣＡ１２０(ヒママメレクチン)、ＷＧＡ（小麦胚芽レクチン）などが挙げられる。

　上記の氷結晶化阻害剤は、氷結晶の結晶面に結合して、氷結晶の成長を抑制する。また、その結合は、氷結晶への自由水の更なる結合を阻止することによって氷結晶の成長を阻害する。

　このような性質を有する氷結晶化阻害物質を、例えば冷凍食品に添加して用いれば、食品に含まれる水の氷結晶化を抑制することで、当該食品の味の劣化などを防ぐことができる。例えば、澱粉老化を防止したり、食品中の水が氷結晶化してタンパク質や油脂成分などを物理的に圧迫し、その構造を変化させることによる味や品質などの劣化を抑制することができる。

　本発明の氷結晶化阻害物質は、抽出等によって植物から得られる氷結晶化阻害物質含有溶液を分離する工程を経て好適に回収することができるし、さらに、分離した溶液から氷結晶化阻害物質を精製する精製工程を経て好適に回収することもできる。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質を含んだ溶液を得る方法としては、特に限定されるものではないが、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ種などの植物から、水または有機溶媒を用いて抽出することが好ましい。抽出に用いる植物の形態は、特に限定されるものではなく、植物体の全体でもよく、或いは、例えば、芽、葉、葉柄など、その一部分でもよい。

　氷結晶化阻害物質を抽出するための溶媒は特に限定されるものではないが、水、親水性有機溶媒、超臨界二酸化炭素、亜臨界水などからなる群より選ばれる１以上の溶媒を好適に組み合わせて使用できる。親水性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等が挙げられるが、食品加工に使用可能なものであることが好ましく、エタノール等が例示される。これらの溶媒の中でも、水およびエタノールが好ましい。また、水と有機溶媒を混合して用いることも可能である。水を用いる場合は、加温した水、特に、熱水を用いることが好ましく、有機溶媒を用いる場合は、加温した有機溶媒を用いることが好ましい。加温した水または有機溶媒の温度は、特に限定されない。下限は、０℃以上が好ましく、２０℃以上がさらに好ましい。上限は、１６０℃以下が好ましく、１２０℃以下がさらに好ましい。その他、水性溶媒としては酢酸ナトリウム緩衝液などの種々の緩衝液や、アルコールと水との混合溶媒などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抽出溶媒の種類や量は、抽出に処する植物体の種類や量により適宜選択することができる。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質は、高分子の複合体であることから、植物から上記の手段によって分離した後、種々の限外濾過膜や透析膜などを用いた膜分離により容易に精製、回収することが可能である。その精製方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、逆浸透、限外濾過、精密濾過などを好適に組み合わせて用いることができる。膜分離の分画分子量は、特に限定されるものではない。目的物を膜非透過物の中に回収する場合の分画分子量の下限は５０００以上が好ましく、１００００以上がさらに好ましく、５００００以上が極めて好ましく、１０００００以上が最も好ましく、上限が４０００００を超えない限り好適に用いることができる。膜分離法では分子量の小さい成分が選択的に膜を透過し、その結果、溶液中の分子量の大きい成分の精製、濃縮が達成されるが、実際には溶液中の溶質の膜表面付近への蓄積（濃度分極）や膜表面や細孔内への吸着などにより経時的にその透過性能は低下する。本発明の氷結晶化阻害物質を高分子側に回収する場合、使用する膜の分画分子量が５０００未満では溶液中の夾雑成分の除去が不充分であり、また膜が目詰まりを起こしやすくなるため好ましくない。また、分画分子量が４０００００を超えると、分子量が４００ｋＤａ以上である当該氷結晶化阻害物質の精製、回収が実質的に困難となるので、４０００００以下が好ましい。

　本発明の氷結晶化阻害物質は、必要に応じてさらに精製してもよい。例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離などを好適に組み合わせて夾雑成分を除去してもよい。また、例えば、塩析や有機溶媒による沈殿や、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過などによる精製、透析や限外濾過などによる濃縮を好適に組み合わせて行ってもよい。

　さらに必要により、粉末状または顆粒状など任意の形態に固形化してもよい。固形化の方法は特に限定されないが、例えば、上記の抽出物を噴霧乾燥や凍結乾燥などの常法に従って粉末化する方法や、抽出物を賦形剤に吸着、担持させて粉末または顆粒状に固形化する方法などを挙げることができる。これらの操作は当業者に公知のものであり、用途に応じて適宜選択して用いることができる。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質は、水が氷結晶化することで障害が生じる様々な分野において、この障害を抑制する目的で利用可能である。例えば、食品分野、機械分野、土木分野、化粧品分野、生体試料を用いる医療分野などで利用可能である。

　食品分野では、食品に含まれる水の氷結晶化を抑制することで、当該食品の味の劣化などを防ぐことができる。例えば、澱粉老化を防止したり、食品中の水が氷結晶化して、タンパク質や油脂成分などを物理的に圧迫して、その構造を変化させることによる味や品質などの劣化を、抑制したりすることができる。

　機械分野や土木分野では、機械の可動部、道路、地盤等の凍結防止剤として利用できる。

　化粧品分野では、化粧品の品質の劣化などを防ぐための添加剤や皮膚の保護剤として利用できる。例えば、油脂成分を含む化粧品を凍結させると、当該化粧品に含まれる水が氷結晶化して、当該油脂成分を物理的に圧迫してその構造を壊すことがあり、品質や使用感が劣化する。本発明に係る氷結晶化阻害物質を用いれば、水の氷結晶化を防ぐことで油脂成分の構造が保持されるため、品質の劣化などを抑制することができる。

　医療分野では、生体試料を凍結保存する際の保護剤として用いることができる。例えば、細胞、血液、血小板、臓器などの組織などの生体試料を従来公知の保存液に入れて凍結保存すると、保存液中の水分が凍結して氷結晶を生じ、当該氷結晶により生体試料が損傷することがある。しかし、本発明に係る氷結晶化阻害物質を添加すれば、氷結晶の発生、成長を抑制することができるので、生体試料を氷結晶による損傷から保護することができる。

　本発明の氷結晶化阻害物質の形態は、その用途に応じて様々であり、そのまま、溶液、濃縮液、懸濁液、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などであってもよい。

　次に、本発明に係る抽出物の活性測定法とタンパク質量の測定法について説明する。

　本発明の氷結晶化阻害物質の氷結晶化阻害活性の測定方法は、植物の種類などに応じて適宜適したものを用いる。例えば、氷結晶構造の観察や氷結晶化阻害の直接の測定などの公知の方法にて行うことができ、何れかの方法で氷結晶化阻害活性の向上が認められる場合は、本発明範囲に含まれるものとする。氷結晶化阻害活性の測定は、例えば、ショ糖を３０ｗ／ｖ％含む植物抽出物溶液を－４０℃に冷却した後に－６℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積を測定することにより行うことができる。氷結晶化阻害活性が強いほどこの氷結晶の平均面積は小さくなることから、この数値を指標として、植物抽出物の氷結晶化阻害活性を定量的に評価することができる。対照に比べて、氷結晶化阻害物質を添加したときに氷結晶の形成が少しでも阻害されれば、氷結晶化抑制活性を有すると判断する。

　本発明の抽出物のタンパク質量の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えばＬｏｗｒｙ法やビシンコニン酸（ＢＣＡ）法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ法）などの公知の方法にて行うことができる。標準タンパク質としては、特に限定されないが、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を好適に用いることができる。

　本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物から容易に得ることが可能である。このため、本発明に係る氷結晶化阻害物質は、生体にとって非常に安全性が高い。また、本発明に係る氷結晶化阻害物質は、精製も容易であり、工業上極めて簡便に製造することができる。さらに、本発明の氷結晶化阻害物質を食品に添加することにより、冷凍食品の品質維持などに役立てることができる。また、本発明の氷結晶化阻害物質は、臓器や細胞、血液、血小板などの生体試料の凍結保存における生体試料保護剤や化粧品（皮膚の保護剤）などにも有効に用いることができる。

　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献及び非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献及び非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、実施例および比較例における部および％は特に規定しない限り重量基準である。

　市販のマスタード芽（湿重量：５００ｇ，村上農園製）を１５℃で１０日間冷却し、氷結晶化阻害タンパク質を馴化誘導した。次に、１０００ｇの脱イオン水を加え、１０５℃で２０分間抽出した。減圧濾過により抽出液を分離した後、これをエバポレーター（ロータリーエバポレーター；ＥＹＥＬＡ社製）にて濃縮し、抽出液（１３５ｍＬ）を得た。

　実施例１で得られた抽出液（５０ｍＬ，タンパク質含量：４００ｍｇ）に活性炭（５００ｍｇ）を加え、１５０ｒｐｍで３０分間振とうした。次に、１０,０００×ｇで３０分間遠心分離することにより活性炭を除去し、溶液（４５ｍＬ）を回収した。

　実施例２で得られた溶液を限外濾過膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて濃縮した。分子量１０ｋＤａ以下のタンパク質を除去し、液量が１０ｍＬになったところで限外濾過処理を終了し、濾液（３５ｍＬ）を得た。さらに、脱イオン水（６ｍＬ）で濾過膜洗浄し、濃縮液（１６ｍＬ）を回収した。

　実施例１～３のそれぞれの溶液について、タンパク質濃度と氷結晶化阻害活性を測定した。タンパク質濃度の測定はＢＣＡ法により行った。

　氷結晶化阻害活性は、以下のとおり測定した。実施例１～３のそれぞれの溶液を、６０ｗ／ｖ％のショ糖溶液と１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した。当該混合物（１μＬ）をカバーガラスで挟み込んだ。加熱冷却載物台（ＬＩＮＫＡＭ社製，ＬＫ‐６００ＰＭ）を備えた光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製，ＢＸ５０）のガラスシャーレを２０℃に保ち、その上に上記カバーガラスを載せて、１００℃／ｍｉｎの速度で－４０℃まで冷却した。次に、１００℃／ｍｉｎの速度で－６℃まで温度を上げた。－６℃になった時を０分として、その後、光学顕微鏡をそのままの状態に保ち、３０分後の画像を取り込んだ。また、対照として、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液につき、同様に測定した。得られた画像中に存在する氷結晶の平均面積を算出し、これを氷結晶化阻害活性の指標とした。この結果を表１に示す。表１中、氷結晶の平均面積が小さいほど、氷結晶化阻害活性が強いことを示している。

　表１から分かるように、マスタード芽抽出液の氷結晶化阻害活性は、活性炭処理の前後で維持されており、当該活性炭処理による精製は極めて有効であった。また、限外濾過による限外濾過濃縮液に氷結晶化阻害活性が認められる一方で、限外濾過後の濾液には活性は認められなかったことから、当該限外濾過による精製は極めて有効であった。

　実施例３で得られた濃縮液の溶媒を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＬ，ｐＨ８．０）に置換した。この溶液（５０ｍＬ）を、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムであるＤＥＡＥカラム（１．６×１０ｃｍ，ＧＥヘルスケア社製）にチャージした後、１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出液の流速は、５．０ｍＬ／ｍｉｎとした。また、溶出液におけるＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍまで徐々に高めた。その結果、ＮａＣｌ濃度が約１００ｍＭおよび約１５０ｍＭにおいてピークが得られた。以下、ＮａＣｌ濃度：約１００ｍＭで得られた画分をＤＥＡＥピーク１、約１５０ｍＭで得られた画分をＤＥＡＥピーク２という。それぞれの画分について、実施例４に記載の方法で氷結晶化阻害活性を測定した。対照として、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液につき、同様に測定した。その結果を表２に示した。

　表２の結果から、本条件下においてマスタード芽由来の氷結晶化阻害物質がＤＥＡＥに吸着することは明らかである。また、強い氷結晶化阻害活性が認められたピーク２のＤＥＡＥカラム吸着画分を、活性画分として回収した。

　実施例５で得られたＤＥＡＥ吸着の活性画分（ＤＥＡＥピーク２，１００μＬ）を、氷温下にてアセトンで１０倍に希釈し、溶液中に現れた析出物を１０,０００×ｇで１５分間遠心分離することにより回収した。上清を除去し、析出物に５０ｖ／ｖ％アセトン水溶液を添加し、撹拌した後、１０,０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収した。液を乾固した後、固形分を蒸留水（１００μＬ）で再溶解し、これをアセトン沈殿活性画分とした。このアセトン沈殿活性画分の氷結晶化阻害活性を、実施例４に記載の方法で測定した。対照として、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液につき、同様に測定した。その結果を表３に示した。

　実施例５で得られたＤＥＡＥ吸着の活性画分（ＤＥＡＥピーク２，１ｍＬ）の溶媒を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，５００μＬ）に置換した。この溶液をゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００, ＧＥヘルスケア社製）にチャージし、流速０．３ｍＬ/ｍｉｎの条件で溶出した。その結果、４４０ｋＤａ以上の画分、１５８ｋＤａ以上４４０ｋＤａ未満の画分、４３ｋＤａ未満の画分にそれぞれピークが得られた。以下、４４０ｋＤａ以上の画分をゲル濾過ピーク１、１５８ｋＤａ以上４４０ｋＤａ未満の画分をゲル濾過ピーク２、４３ｋＤａ未満の画分をゲル濾過ピーク３という。それぞれの画分について、実施例４に記載の方法で氷結晶化阻害活性を測定した。その結果を表４に示した。

　表４の結果から、分子量が４４０ｋＤａ以上のゲル濾過ピーク１に氷結晶化阻害活性が認められた。ゲル濾過ピーク１を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー活性画分とした。マスタード芽由来の氷結晶化阻害物質の分子量が４００ｋＤａ以上であることは明らかである。

　実施例１と同様の方法で調製したマスタード芽抽出液（７００ｍＬ，タンパク質濃度８．０ｍｇ／ｍＬ）を、実施例３の方法に従って活性炭処理した上で濃縮し、溶液（５０ｍＬ）を得た。この溶液の溶媒を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０，８００ｍＬ）に置換した後、平衡化したＤＥＡＥ担体（Ｂｅｄｖｏｌｕｍｅ：１８０ｍＬ）と混合し、２５０ｒｐｍで１時間低速撹拌することで、バッチ操作により氷結晶化阻害物質を吸着させた。減圧濾過により非吸着画分を除去した後、１８０ｍＬ（１Ｂｅｄｖｏｌｕｍｅ分）の緩衝液で担体を洗浄した。さらに１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で吸着画分を溶出し、溶液（２００ｍＬ）を得た。この溶液を、脱イオン水（５Ｌ）で８時間ずつ３回透析し、限外濾過でさらに脱塩した後、脱イオン水を加えてその総量を２００ｍＬとした。

　実施例８で得られた氷結晶化阻害物質の脱イオン水溶液を、以下に示す氷結合物質濃縮操作に供した。すなわち、氷結晶化阻害物質を含んだ実施例８の脱イオン水溶液を循環冷却装置（ネスラブ社製）で低速循環させつつ、２４時間で－０．５℃から－２．０℃まで冷却した。２４時間後、生成した氷結晶化阻害物質が吸着した氷を回収した。回収した氷を溶解させ、これを氷結晶化阻害物質濃縮液とした。

　実施例８および実施例９で得られたそれぞれの溶液について、実施例４と同様の方法でタンパク質濃度と氷結晶化阻害活性を測定した。対照として、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液につき、同様に測定した。その結果を表５に示した。

　表５の結果から、実施例９の氷結合物質の濃縮操作によりタンパク質濃度あたりの氷結晶化阻害活性が顕著に増大していることが確認された。氷結晶化阻害物質が濃縮されたのは明らかである。また、透析工程で活性が安定に維持されていることから、当該氷結晶化阻害物質が透析膜を通過できないのは明らかであり、溶媒の置換や低分子物質の除去が極めて容易である。

　実施例９で得られた氷結晶化阻害物質濃縮液について、実施例５と同様の方法でＤＥＡＥカラム処理した。得られた吸着画分と非吸着画分について、実施例４に記載の方法で氷結晶化阻害活性を測定した。その結果を表６に示した。

　比較例１
　市販のマスタード芽（湿重量で４００ｇ）を馴化誘導せずに、実施例１と同様にして脱イオン水（８００ｇ）で抽出した。得られた抽出液を実施例１～６と同様の操作により、氷結晶化阻害物質が得られる画分に対応する画分を濃縮、精製し、比較例1の精製画分を得た。

　実施例６のアセトン沈殿活性画分、実施例７のゲル濾過カラムクロマトグラフィー活性画分、実施例１１の吸着画分と非吸着画分、および比較例１の精製画分を、それぞれＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（１０－２０％グラジエントゲル，アトー社製）にて、２０ｍＡで８５分電気泳動した。電気泳動後のゲルを銀染色により染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。ゲルの染色結果から、氷結晶化阻害活性物質が濃縮されている実施例６および実施例７の活性画分に、見掛けの分子量が３４ｋＤａのバンドが確認された。この３４ｋＤａのバンドは比較例１の精製画分には認められなかったことから、氷結晶化阻害活性を示す画分に特異的に含まれるタンパク質であることは明らかである。また、実施例１１において、強い活性を示す吸着画分に７１ｋＤａの位置にバンドが確認された。このバンドは同実施例において、活性の殆ど見られない非吸着画分には存在しないことから、氷結晶化阻害活性を示す画分に特異的に含まれるタンパク質であることは明らかである。

　また、実施例７のゲルろ過クロマトグラフィーで得られた活性画分は、分子量が４００ｋＤａ以上の画分であることから、当該氷結晶化阻害物質が３４ｋＤａの分子量を有するサブユニットまたは７１ｋＤａの分子量を有するサブユニットを少なくとも一つ以上含んでなる複合体を形成していることは明らかである。

　実施例５で得られたＤＥＡＥカラム吸着画分（１ｍＬ）の溶媒を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１ｍＬ，ｐＨ８．０）に置換した。この溶液（０．５ｍＬ）を同緩衝液で平衡化した、陰イオン交換カラムであるＱカラム（０．７×２．５ｃｍ，ＧＥヘルスケア社製）にチャージすると、氷結晶化阻害活性を有する画分はＱカラムに吸着した。続いて１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させると、氷結晶化阻害活性を有する画分はＱカラムから溶出した。なお、この際、溶出液の流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。本条件下で活性画分がＱカラムに吸着することは明らかである。

　実施例５で得られたＤＥＡＥカラム吸着画分（１ｍＬ）の溶媒を、５０ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍＬ，ｐＨ６．０）に置換した。この溶液（０．５ｍＬ）を、同緩衝液で平衡化したＳＰカラム（０．７×２．５ｃｍ，ＧＥヘルスケア社製）にチャージすると、氷結晶化阻害活性を有する画分はＳＰカラムに吸着しなかった。本条件下では、活性画分がＳＰカラムに吸着しないことは明らかである。

　実施例８で得られた氷結晶化阻害物質の脱イオン水溶液（５ｍＬ）の溶媒を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＬ，ｐＨ７．４，０．５Ｍ　ＮａＣｌ含む）に置換した後、平衡化したＣｏｎＡセファロース担体（Ｂｅｄｖｏｌ：５ｍＬ）と混合し、スターラーにて２００ｒｐｍで１時間低速撹拌した。減圧濾過により非吸着画分を回収した後、２８０ｎｍの吸光度が０．０５を下回るまで同緩衝液で洗浄を繰り返し、２Ｍグルコースを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．４，０．５Ｍ　ＮａＣｌ含む）で吸着画分を溶出、回収した。得られた画分について実施例４と同様の方法で氷結晶化阻害活性を測定した結果を表７に示した。

　表７の結果から、糖結合タンパク質であるＣｏｎＡの吸着画分に氷結晶化阻害活性が認められず、ＣｏｎＡ非吸着画分に活性が認められたことから、当該氷結晶化阻害物質がＣｏｎＡセファロースに吸着しないことは明らかである。

Claims

　植物に由来し、かつ、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した分子量が４００ｋＤａ以上であることを特徴とする氷結晶化阻害物質。
　複数のサブユニットから構成されるものである請求項１に記載の氷結晶化阻害物質。
　少なくとも１つのサブユニットの分子量が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで３４０００±５００Ｄａまたは７１０００±１０００Ｄａである請求項２に記載の氷結晶化阻害物質。
　植物が、アブラナ科、セリ科、ユリ科およびキク科に属する植物からなる群から選ばれる１以上の植物、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項１～３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質。
　アブラナ科に属する植物が、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、シロナ、野沢菜、広島菜、ミズナ、および、マスタードからなる群から選ばれる１以上の植物、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項４に記載の氷結晶化阻害物質。
　アブラナ科に属する植物が、マスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｊｕｎｃｅａ種）、または、これの類縁品種もしくは改良品種である請求項５に記載の氷結晶化阻害物質。
　ｐＨ８において、陰イオン交換カラムに吸着するものである請求項１～６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質。
　陰イオン交換カラムがＤＥＡＥカラムである請求項７に記載の氷結晶化阻害物質。
　陰イオン交換カラムがＱカラムである請求項７に記載の氷結晶化阻害物質。
　ｐＨ６において、陽イオン交換カラムに吸着しないものである請求項１～９のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質。
　陽イオン交換カラムがＳＰカラムである請求項１０に記載の氷結晶化阻害物質。
　ｐＨ７．４において、糖結合タンパク質に吸着しないものである請求項１～１１のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質。
　糖結合タンパク質がＣｏｎＡである請求項１２に記載の氷結晶化阻害物質。
　分画分子量５，０００以上の分離膜を用いて植物から氷結晶化阻害物質を分離する工程を含むことを特徴とする、請求項1～１３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質の製造方法。
　限外濾過または逆浸透により分離する請求項１４に記載の製造方法。
　請求項１～１３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質の一部であり、かつ氷結晶化阻害活性を有することを特徴とするポリペプチド。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定される分子量が３４０００±５００Ｄａまたは７１０００±１０００Ｄａである請求項１６に記載のポリペプチド。
　請求項１～１３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質、および／または、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする氷結晶化阻害組成物。
　請求項１～１３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質、および／または、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする食品。
　請求項１～１３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質、および／または、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする生体試料保護剤。
　請求項１～１３のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質、および／または、請求項１６～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする化粧品。