WO2010147145A1 - 抗グラム陰性菌剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a drug effective for the prevention / treatment of Gram-negative bacterial infection. More specifically, a drug capable of exerting a bactericidal action, a growth inhibitory action, and / or a drug excretion inhibitory action against Gram-negative bacteria by inhibiting the formation of a YaeT complex present in the outer membrane of Gram-negative bacteria. About.
  • Gram-negative bacteria such as multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are the main causative agents of nosocomial infections, leading to serious pathological conditions in patients with reduced immunity There is. Since these bacteria exhibit multidrug resistance, it is difficult to treat infections, which is a big problem. Gram-negative bacteria have two membranes, an inner membrane and an outer membrane. In order for antibiotics to work effectively, antibiotics must pass through the complex membrane structure of Gram-negative bacteria to reach the inside of the cell. There is. However, it is thought that the effect of antibiotics decreases due to drug-modifying enzymes, decreased permeability of the outer membrane, changes in targets, drug discharge by a drug discharge pump, etc., and multidrug resistance is acquired.
  • the multidrug drainage pump is a major contributor to the acquisition of multidrug resistance by Pseudomonas aeruginosa. This pump positively transports and discharges the drug that has entered the inside of the bacterium using energy.
  • Multidrug evacuation pumps are classified into several families. Among them, the RND (resistance nodition division) family pumps, which are known to evacuate various antibiotics, are composed of three types of subunits. Yes. Pseudomonas aeruginosa has multiple RND type pumps, of which the main pump is the MexAB-OprM pump.
  • the present inventors focused on the MexAB-OprM pump of Pseudomonas aeruginosa and inhibited the drug efflux pump function of Pseudomonas aeruginosa by modifying the amino acid sequence of OprM, a subunit constituting the multidrug efflux pump. Then, a method for enhancing the efficacy of antibiotics was developed, and a drug having the effect and a method for screening the drug were proposed (Patent Document 1). However, if a mutation occurs in the target sequence, the effect of the method may be lost.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and by blocking the formation of YaeT complex in the outer membrane of Gram-negative bacteria, it blocks the transport of outer membrane protein (OMP) necessary for the survival of the bacteria. It is an object of the present invention to provide a method and a drug therefor, thereby fundamentally solving the problem of multidrug resistance of gram-negative bacteria.
  • the present invention provides an anti-gram negative bacterial agent characterized by exhibiting a bactericidal action, a growth inhibitory action and / or a drug excretion inhibitory action against gram negative bacteria by inhibiting the formation of YaeT complex.
  • YaeT complex formation of Gram-negative bacteria is inhibited in the presence and / or absence of conventional antibiotics, thereby bactericidal action, growth-inhibiting action and / or drugs against Gram-negative bacteria. Since the excretion inhibitory action is exerted, the problem of multidrug resistance due to mutation of the outer membrane protein is fundamentally solved.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram explaining the outer membrane and inner membrane of Gram-negative bacteria, and the relationship between a YaeT complex and outer membrane protein (cited from nonpatent literature 1). It is a figure which compares the amino acid sequence of the binding site of various Gram-negative bacteria YfgL with YaeT. It is a figure which compares the amino acid sequence of the conserved region of YfiO of various gram-negative bacteria.
  • 2 is a graph showing the concentration dependency of bactericidal action of LTLR and LTLR-NH 2 on PAO1 strain.
  • FIG. 6 is a graph of the change in sensitivity of nalB strain to OFLX in the presence and absence of LTLR-NH 2 (5 mM).
  • FIG. 6 is a graph of the change in sensitivity of nalB strain to AZT in the presence and absence of LTLR-NH 2 (5 mM).
  • FIG. 6 is a graph of the change in sensitivity of the nalB strain to OFLX in the presence and absence of FIRL-NH 2 (1.5 mM).
  • It is a graph which shows the bacterial number change in a corneal ulcer model (Example 7).
  • It is a photograph which shows the external appearance of the cornea 24 hours after in a corneal ulcer model (Example 7).
  • It is a graph which shows the clinical score change in a corneal ulcer model (Example 7).
  • It is a graph which shows the bacterial number change in a pneumonia model (Example 8).
  • It is a graph which shows the bacterial number change in a pneumonia model (Example 8).
  • the anti-gram-negative bacterial agent of the present invention exhibits a bactericidal action, growth inhibitory action, and / or drug excretion inhibitory action against gram-negative bacteria by inhibiting the formation of the YaeT complex.
  • Gram-negative bacteria is used in a commonly used meaning. That is, it is a general term for bacteria whose staining with crystal violet is decolored in Gram staining.
  • Representative gram-negative bacteria include E. coli (Escherichia coli), Salmonella, Pseudomonas, Helicobacter and other proteobacteria and cyanobacteria.
  • E. coli Esscherichia coli
  • Salmonella Salmonella
  • Pseudomonas Salmonella
  • Pseudomonas aeruginosa
  • Haemophilus influenzae that cause respiratory damage
  • Examples include Helicobacter pylori and Gertonel bacteria.
  • cocci include Neisseria meningitidis, Catalaris bacteria, and Neisseria gonorrhoeae.
  • the YaeT complex in Gram-negative bacteria is composed of four lipoproteins, YfgL, YfiO, NlpB, and SmpA, gathered on YaeT, which is a membrane protein.
  • YaeT which is a membrane protein.
  • the first aspect of the present invention is an anti-gram-negative bacterial agent characterized by inhibiting the binding between YaeT and YfgL.
  • the present inventors compared the amino acid sequences of the binding sites of various gram-negative bacteria YfgL to YaeT (see FIG. 2), and examined highly conserved regions. In FIG. 2, the region surrounded by a square indicates highly conserved amino acid residues. Among these, various peptide molecules were synthesized based on the amino acid sequence of the region indicated by “A”. The effect was confirmed.
  • the anti-gram negative bacterial agent of the present invention is preferably a peptide containing an amino acid sequence consisting of at least LTLR.
  • FIG. 3 compares the amino acid sequences of YfiO of various gram-negative bacteria. It was found that within a highly conserved region, peptide molecules having the amino acid sequence “FIRLHP” compete with the binding of YaeT and YfiO and can effectively inhibit their binding. Even if the peptide molecule does not contain the entire amino acid sequence “FIRLHP”, it was confirmed that the peptide molecule was effective if it contained a partial amino acid sequence “FIRL” or “IRLH”.
  • the anti-gram negative bacterial agent of the present invention is preferably a peptide containing an amino acid sequence consisting of at least FIRL or IRLH, and particularly preferably a peptide containing an amino acid sequence consisting of at least FIRLHP.
  • the above peptide molecule may be chemically modified.
  • those obtained by amidating the C terminus of a peptide molecule have a significantly improved bactericidal action as compared to an unmodified peptide molecule.
  • the present inventors consider that the negative charge at the C-terminal is canceled out by the amide group, resulting in improved membrane permeability.
  • the anti-gram-negative bacterial agent of the present invention is preferably one obtained by amidating the C-terminus of the peptide molecule.
  • the site of interaction between YaeT and YfgL and YfiO targeted in the present invention is present in the periplasm between the outer and inner membranes of the fungus (see FIG. 1). Therefore, in order for the drug (peptide molecule) of the present invention to reach the action site from the outside, it is necessary to pass through the outer membrane. In particular, in the case of non-modification, it is preferable to co-administer with a drug that improves the permeability of the outer membrane in order to exert its effectiveness at a practical concentration.
  • the drug having the action of improving the permeability of the outer membrane is not particularly limited, and examples thereof include antibiotics having a cell membrane alteration action. Specific examples include polymyxin B and colistin.
  • the amidated peptide molecule of the present invention when used, the peptide molecule passes through the outer membrane and reaches the YaeT complex formation site without simultaneous administration of an antibiotic having a membrane altering action. It seems to inhibit the biosynthesis of. Therefore, for example, when an antibiotic that does not have a membrane altering action is administered simultaneously, the membrane becomes weak due to the action of the amidated peptide molecule of the present invention, and as a result, it becomes more sensitive to the antibiotic and exhibits a bactericidal effect. Conceivable.
  • the third aspect of the present invention is characterized by containing the anti-gram negative bacterial agent (modified / unmodified) of the present invention and an antibiotic (not depending on the presence or absence of membrane alteration). It is a treatment for negative bacterial infections.
  • Antibiotics having no membrane alteration action are not particularly limited and those conventionally used in general can be used. Examples include cephalosporin antibiotics cephalexin, cefotaxime, etc., fluoroquinolone antibiotics ofloxacin, ciprofloxacin, etc., aminoglycoside antibiotics such as amikamin, carbopenem antibiotics such as meropenem .
  • the method for measuring the viable count of Gram-negative bacteria is as follows. A part of the bacteria cultured overnight at 37 ° C. is added to fresh MH medium, and the culture is continued at the same temperature. When the turbidity of the bacterium (absorbance at 600 nm) reaches 0.7 to 0.8, the microbial solution is added to the MH medium to prepare a microbial solution diluted 100 to 200 times and used for the experiment.
  • a solution obtained by adding 60-80 ⁇ L of the bacterial solution and a peptide or the like to a final concentration of 100 ⁇ L is cultured for a certain time (3 hours) with stirring at 37 ° C. After the culture, the bacterial solution is diluted with a PBS solution, and the diluted solution is plated on an MH agar plate and cultured at 37 ° C. overnight. The viable cell count is obtained by counting the number of colonies growing on the plate the next day.
  • Example 1 In the above experimental system, polymyxin B (final concentration is 0.4 ⁇ g / mL) (this concentration does not affect the survival of Pseudomonas aeruginosa), and Pseudomonas aeruginosa (PAO1 strain) is cultured. did.
  • the peptide LTLR peptide consisting of 4 amino acid residues having the sequence of leucine-threonine-leucine-arginine
  • the viable cell count of Pseudomonas aeruginosa was measured, and how the viable cell count was changed by the addition of the peptide was measured as compared to the viable cell count when the peptide was not added. The results are shown in the graph of FIG.
  • Example 1 In Example 1, peptide LTLE in which the fourth amino acid (R) of peptide LTLR was substituted with glutamic acid (E) was synthesized, and under the same conditions as in Example 1, 2.5 mM LTLE was added to change the number of viable bacteria. Was measured. As a result, a decrease in the survival rate of Pseudomonas aeruginosa was not observed. Therefore, it was suggested that the antibacterial action observed in Example 1 is specific to the amino acid sequence (LTLR). (Comparative Example 2) In Example 1, peptide LRTL in which the amino acid sequence of peptide LTLR was randomized was synthesized.
  • Example 1 Under the same conditions as in Example 1, 2.5 mM LRTL was added, and the change in the number of viable bacteria was measured. As a result, a decrease in the survival rate of Pseudomonas aeruginosa was not observed. Therefore, it was suggested that the antibacterial action observed in Example 1 is specific to the amino acid sequence (LTLR).
  • Example 2 Instead of Pseudomonas aeruginosa of the PA01 strain (standard strain) used in Example 1, clinical isolates (P. aeruginosa 24, 42, 83, 88 and 92) and nalB strain (MexAB-OprM which is a drug efflux pump) were used. Highly expressed strain that became highly multidrug resistant) and nfxC strain (strain that highly expressed MexEF-OprN, a drug efflux pump that became highly multidrug resistant), and measured the effect of LTLR on them did. In this experiment, the final concentration of polymyxin B was 0.2 ⁇ g / mL, and 3 mM LTLR was added to examine changes in survival rate. The results are shown in Table 1 below.
  • Example 3 The same measurement as in Example 2 was performed using E. coli (ATCC 25922) instead of Pseudomonas aeruginosa. As a result, the survival rate of E. coli was about 1%. Thereby, it was suggested that LTLR acts not only on Pseudomonas aeruginosa but also on all Gram-negative bacteria including E. coli.
  • LTLR having an amino terminal acetylation was synthesized and its action was examined. Under the same conditions as in Example 1, LTLR was changed to acetylated LTLR, and the survival rate of Pseudomonas aeruginosa was examined. As a result, no decrease in survival rate was observed, and it was shown that the activity of anti-gram negative bacteria was significantly reduced by acetylation.
  • Example 4 An LTLR with an amidated carboxy terminus was synthesized and its action was investigated. Under the same conditions as in Example 1, various concentrations of amidated LTLR were added to examine changes in the survival rate of Pseudomonas aeruginosa. The result is shown in FIG. It was shown that the activity of LTLR was increased by amidation, and it was revealed that amidation at the carboxy terminus is involved in the increase of the activity as well as the protective action of the peptide. Similar experimental results were obtained for E. coli.
  • Example 5 An experiment similar to that of Example 4 was conducted in a system using ofloxacin (OFLX) or aztreonam (AZT) instead of polymyxin B having a membrane alteration action as an antibiotic. The results are shown in FIGS.
  • OFLX a system using ofloxacin
  • AZT aztreonam
  • FIGS. In the system using either OFLX or AZT, when amidated peptide molecules (LTLR) are added, the survival rate of Pseudomonas aeruginosa in a multidrug-resistant strain (NalB) at the same antibiotic concentration is compared to when not added. Remarkably reduced. That is, it was suggested that the amidated peptide molecule of the present invention reached the target site through the outer membrane and weakened the bacteria. Therefore, it was confirmed that the amidated peptide molecule of the present invention has an action of improving the effect of an antibiotic such as aztreonam.
  • Example 6 The same experiment as in Example 1 was performed with P. aeruginosa (nalB) using FIRL (Yf2B1) that inhibits the binding between YeaT and YfiO as a peptide molecule. The results are shown in FIG. It was confirmed that a peptide molecule that inhibits the binding of YeaT and YfiO exhibits a further excellent anti-gram-negative bacterial action.
  • Example 7 An experiment using a model of rabbit corneal ulcer caused by Pseudomonas aeruginosa infection An ulcer was formed by injuring multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRP) by damaging the central cornea of a Japanese white rabbit (2 kg, male). . Rabbits were divided into the following 3 groups (5 animals each), and instillation of the next drug was started in each group 6 hours after inoculation. Instillation was performed three times, 6 hours, 12 hours, and 18 hours after MDRP inoculation. Group 1: Saline (control) Group 2: Ofloxatin (OFLX) eye drops (Taribit ophthalmic solution 0.3%, Santen Pharmaceutical) Group 3: A mixture of OFLX eye drops and 50 mM FIRL / saline
  • the number of bacteria was measured for each group 12 hours after ulcer formation (6 hours after instillation) and 24 hours after ulcer formation (18 hours after instillation).
  • the measuring method is as follows. The eye fat and cornea were collected, 5 mL of physiological saline was added, emulsified in a mortar, and seeded on a NAC agar medium, and the number of bacteria was counted after 24 hours. The results are shown in the graph of FIG.
  • the corneal opacity of each group was observed 12 hours after ulcer formation (6 hours after instillation), 18 hours after ulcer formation (12 hours after instillation) and 24 hours after ulcer formation (18 hours after instillation).
  • the clinical score was determined by the following method. The observation area is divided into 12 quadrants with the corneal ulcer as the axis, and the presence or absence of turbidity in each quadrant is quantified by turbidity: 1 and turbidity: 0, and the clinical score (total value of 12 quadrants) for each specimen is calculated. To do.
  • the appearance of the cornea in each group of specimens 12 hours and 24 hours after ulcer formation is shown in FIGS. 9 and 10, and the change in clinical score from 12 hours to 24 hours after ulcer formation is shown in FIG.
  • mice Experiment using mouse pneumonia model by Pseudomonas aeruginosa infection 10 7 CFU / mouse Pseudomonas aeruginosa (PAO1 strain) was allowed to act on the trachea of Balb / C mice (7-8 weeks old, female) did. Mice were divided into the following 4 groups (5 animals each), and the following drug and 30 ⁇ L each were administered to each group via the trachea simultaneously with Pseudomonas aeruginosa infection.
  • Pseudomonas aeruginosa infection 10 7 CFU / mouse Pseudomonas aeruginosa (PAO1 strain) was allowed to act on the trachea of Balb / C mice (7-8 weeks old, female) did. Mice were divided into the following 4 groups (5 animals each), and the following drug and 30 ⁇ L each were administered to each group via the trachea simultaneously with Pseudomonas aeruginosa infection.
  • Group 1 Saline (control)
  • Group 2 amidated FIRL (2.5 mM)
  • Group 3 colistin sulfate (4.7 mg / kg)
  • Group 4 Mixed solution of amidated FIRL (2.5 mM) and colistin sulfate (4.7 mg / kg)
  • amidated FIRL alone did not show immediate effects on the pneumonia model (second group), but a synergistic effect was obtained by coadministration with other antibacterial agents. It can be seen that the number of bacteria was reduced to about 1/10 compared to the third group in which only other antibacterial drugs were administered.

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Abstract

　グラム陰性菌の外膜におけるＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、菌の生存に必要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）の生合成を遮断する方法及びそのための薬剤を提供し、以てグラム陰性菌の多剤耐性化の問題を根本的に解決することを目的とする。本発明は、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする抗グラム陰性菌剤を提供する。当該薬剤は、少なくともＬＴＬＲからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子又は少なくともＦＩＲＬからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子であるのが好ましい。

Description

抗グラム陰性菌剤
　本発明は、グラム陰性菌感染症の予防／治療に有効な薬剤に関する。より詳細には、グラム陰性菌の外膜に存在するＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、グラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することのできる薬剤に関する。
　多剤耐性の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）やアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｕｍａｎｎｉｉ）等のグラム陰性菌は院内感染症の主要起因菌であり、免疫力が低下した患者を重篤な病態に至らしめる場合がある。これらの菌は多剤耐性を示すために感染症の治療が難しく大きな問題となっている。グラム陰性菌は内膜と外膜という二つの膜を備えており、抗生物質が有効に作用するためには、抗生物質はグラム陰性菌の複雑な膜構造を通過して細胞内部に到達する必要がある。ところが、薬剤修飾酵素、外膜の透過性の低下、標的の変化、薬剤排出ポンプによる薬剤の排出などによって抗生物質の効果が低下し、多剤耐性を獲得するものと考えられている。
　緑膿菌の多剤耐性獲得に大きく貢献しているのが多剤排出ポンプである。このポンプは、菌内部に入った薬剤をエネルギーを使って積極的に細胞外に輸送、排出する。多剤排出ポンプは幾つかのファミリーに分類され、それらの中で、様々な抗生剤を排出することが知られているＲＮＤ（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ）ファミリーのポンプは３種類のサブユニットから構成されている。緑膿菌には複数のＲＮＤ型ポンプが存在するが、そのうちで主要なポンプはＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭポンプである。
　本発明者等は、緑膿菌のＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭポンプに着目し、当該多剤排出ポンプを構成するサブユニットであるＯｐｒＭのアミノ酸配列を改変することにより、緑膿菌の薬剤排出ポンプ機能を阻害し、抗生剤の薬効を増強する方法を開発し、当該効果を奏する薬剤並びに当該薬剤をスクリーニングする方法を提案した（特許文献１）。しかしながら、標的配列において変異が生ずると、当該方法の効果が失われる可能性があった。
　一方、緑膿菌や大腸菌などを含むグラム陰性菌の研究が進んでおり、β－バレルプロテイン（外膜の孔を形成するタンパク質）生合成にＹａｅＴ複合体が必須であることが知られるに至り（非特許文献１）、当該ＹａｅＴ複合体の立体構造も解明されてきている（非特許文献２）。ＹａｅＴは、ＹｆｇＬ、ＹｆｉＯ、ＮｌｐＢ及びＳｍｐＡなる４つのリポタンパク質と複合体を形成することにより、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の生合成を司っている。言い換えれば、ＹａｅＴの複合体形成を阻害すれば薬剤排出ポンプを含むＯＭＰの外膜への輸送を阻止することができると考えられる。
国際公開第ＷＯ２００７／０９１３９５号パンフレット
Ｓｅｏｋｈｅｅ　Ｋｉｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．　３１７，　ｐｐ．９６１－９６４　（２００７） Ｒａｊｅｅｖ　Ｍｉｓｒａ，　ＡＣＳ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．　２，　ｐｐ．６４９－６５１　（２００７）
　本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、グラム陰性菌の外膜におけるＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、菌の生存に必要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）の輸送を遮断する方法及びそのための薬剤を提供し、以てグラム陰性菌の多剤耐性化の問題を根本的に解決することを目的とする。
　よって本発明は、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする抗グラム陰性菌剤を提供する。
　本発明によれば、従来の抗生物質の存在下及び／又は非存在下で、グラム陰性菌のＹａｅＴ複合体形成を阻害し、それによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用が発揮されるため、外膜タンパク質の変異による多剤耐性化の問題が根本的に解決される。
グラム陰性菌の外膜及び内膜並びにＹａｅＴ複合体と外膜タンパク質との関係を説明する模式図である（非特許文献１から引用）。 種々のグラム陰性菌のＹｆｇＬの、ＹａｅＴとの結合部位のアミノ酸配列を比較する図である。 種々のグラム陰性菌のＹｆｉＯの保存領域のアミノ酸配列を比較する図である。 ＬＴＬＲおよびＬＴＬＲ－ＮＨ２のＰＡＯ１株に対する殺菌作用の濃度依存性を示したグラフである。 ＬＴＬＲ－ＮＨ２　（５　ｍＭ）　の存在および非存在下でのｎａｌＢ株のＯＦＬＸに対する感受性の変化のグラフである。 ＬＴＬＲ－ＮＨ２　（５　ｍＭ）　の存在および非存在下でのｎａｌＢ株のＡＺＴに対する感受性の変化のグラフである。 ＦＩＲＬ－ＮＨ２　（１．５　ｍＭ）　の存在および非存在下でのｎａｌＢ株のＯＦＬＸに対する感受性の変化のグラフである。 角膜潰瘍モデル（実施例７）における細菌数変化を示すグラフである。 角膜潰瘍モデル（実施例７）における１２時間後の角膜の外観を示す写真である。 角膜潰瘍モデル（実施例７）における２４時間後の角膜の外観を示す写真である。 角膜潰瘍モデル（実施例７）における臨床スコア変化を示すグラフである。 肺炎モデル（実施例８）における細菌数変化を示すグラフである。 肺炎モデル（実施例８）における細菌数変化を示すグラフである。
　上記したように、本発明の抗グラム陰性菌剤は、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、グラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする。
　本発明における「グラム陰性菌」なる用語は、一般に用いられている意味で使用される。即ち、グラム染色においてクリスタルバイオレットによる染色が脱色される細菌の総称である。代表的なグラム陰性菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌、シュードモナス、ヘリコバクター等のプロテオバクテリア及びシアノバクテリアが含まれる。医学に関連して分類すると、桿菌としては、呼吸器系の傷害を惹起する緑膿菌、インフルエンザ菌など、泌尿器系の障害を惹起する大腸菌、ミラビリス変形菌など、消化器系の障害を惹起するヘリコバクター・ピロリ、ゲルトネル菌などが挙げられ、球菌としては、髄膜炎菌、カタラリス菌、淋菌が挙げられる。
　グラム陰性菌におけるＹａｅＴ複合体は、膜タンパク質であるＹａｅＴに、ＹｆｇＬ、ＹｆｉＯ、ＮｌｐＢ及びＳｍｐＡなる４つのリポタンパク質が集合して構成されている。中でも、ＹａｅＴ複合体がＯＭＰの生合成を行うためには、ＹｆｇＬ及びＹｆｉＯが結合することが必須とされており、これらのＹａｅＴへの結合を阻害することによりＯＭＰは生合成されないことになる。
　よって、本発明の第一の態様は、ＹａｅＴとＹｆｇＬとの結合を阻害することを特徴とする抗グラム陰性菌剤である。
　この態様の薬剤を探索するに当たり、本発明者等は、各種グラム陰性菌のＹｆｇＬのＹａｅＴへの結合部位のアミノ酸配列を比較し（図２参照）、高度に保存されている領域を検討した。図２において、四角で囲んだ領域が高度に保存されたアミノ酸残基を示しているが、これらの中で「Ａ」で示した領域のアミノ酸配列を基にして様々なペプチド分子を合成し、その作用を確認した。
　その結果、アミノ酸配列「ＬＴＬＲ」を含むペプチド分子を用いた場合、ＹａｅＴとＹｆｇＬとの結合と競合し、それらの結合を有効に阻害できることを見出した。従って、本発明の抗グラム陰性菌剤は、少なくともＬＴＬＲからなるアミノ酸配列を含むペプチドであるのが好ましい。
　次に、本発明の第二の態様として、ＹａｅＴとＹｆｉＯとの結合を阻害することに着目した。各種グラム陰性菌のＹｆｉＯのアミノ酸配列を比較したのが図３である。高度に保存された領域の中で、アミノ酸配列「ＦＩＲＬＨＰ」を有するペプチド分子が、ＹａｅＴとＹｆｉＯとの結合と競合し、それらの結合を有効に阻害できることを見出した。当該ペプチド分子は、アミノ酸配列「ＦＩＲＬＨＰ」全てを含まなくても、その一部のアミノ酸配列「ＦＩＲＬ」又は「ＩＲＬＨ」を含んでいれば有効であることも確認された。従って、本発明の抗グラム陰性菌剤は、少なくともＦＩＲＬ又はＩＲＬＨからなるアミノ酸配列を含むペプチドが好ましく、特に、少なくともＦＩＲＬＨＰからなるアミノ酸配列を含むペプチドであるのが好ましい。
　また、上記のペプチド分子は、化学修飾されていてもよい。例えば、ペプチド分子のＣ末端をアミド化したものは、未修飾のペプチド分子に比較して殺菌作用が格段に向上する。本発明者等は、Ｃ末端の負電荷がアミド基によって打ち消されるために膜透過性が向上した結果ではないかと考えている。
　しかしながら、逆に上記ペプチド分子のＮ末端をアセチル化したものは、その殺菌作用が低下した。
　従って、本発明の抗グラム陰性菌剤は、前記のペプチド分子のＣ末端をアミド化したものであるのが好ましい。
　本発明において標的としているＹａｅＴとＹｆｇＬ及びＹｆｉＯとの相互作用部位は菌の外膜と内膜の間にあるペリプラズムに存在する（図１参照）。従って、本発明の薬剤（ペプチド分子）が外部から作用部位に到達するためには、外膜を通過する必要がある。
　特に未修飾の場合、実用的な濃度で有効性を発揮させるためには、外膜の透過性を向上させる薬剤と同時投与するのが好ましい。
　外膜の透過性を向上させる作用を有する薬剤としては、特に限定されるものではないが、細胞膜変質作用を有する抗生剤が挙げられる。具体的には、ポリミキシンＢ、コリスチン等である。
　一方、Ｃ末端をアミド化したペプチド分子の場合、上記したようにＣ末端の負電荷が消失しているので、それ自身で外膜を通過できると考えられる。実際に、ポリミキシンＢではなく、膜変質作用を持たない抗生剤であるアズトレオナム（βラクタム剤）を同時投与した場合にも菌の生存率の低下が確認された。
　即ち、本発明のアミド化ペプチド分子を用いる場合、膜変質作用を有する抗生剤を同時投与しなくても、当該ペプチド分子が外膜を通過してＹａｅＴ複合体形成部位に到達し、外膜タンパク質の生合成を阻害すると思われる。従って、例えば、膜変質作用を持たない抗生剤を同時投与した場合には、本発明のアミド化ペプチド分子の作用によって膜が脆弱化し、その結果抗生剤に対しより感受性となり、殺菌効果を奏すると考えられる。
　よって、本発明の第三の態様は、本発明の抗グラム陰性菌剤（修飾／未修飾）と、抗生剤（膜変質作用の有無によらない）とを含有することを特徴とする、グラム陰性菌感染症の治療薬である。
　膜変質作用を持たない抗生剤としては、特に限定されず、従来から一般に使用されているものが使用できる。例えば、セファロスポリン系抗生剤であるセファレキシン、セフォタキシム等、フルオロキノロン系抗生剤であるオフロキサシン、シプロフロキサシン等、アミノグリコシド系抗生剤であるアミカミン等、カルバペネム系抗生剤であるメロペネム等が挙げられる。
　以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　以下に示す実施例等において、グラム陰性菌（緑膿菌又は大腸菌）の生菌数の測定方法は次の通りである。
　３７℃で一晩培養した菌の一部をフレッシュなＭＨ培地に添加して、同じ温度で培養を続ける。菌の濁度（６００ｎｍでの吸光度）が０．７?０．８に達したとき、その菌液をＭＨ培地に加えて１００?２００倍希釈した菌液を調製し、実験に供する。
　菌液６０?８０μＬとペプチド等の溶液を加えて最終的に１００μＬにした溶液を３７℃で攪拌しながら一定時間（３時間）培養する。培養後、菌液をＰＢＳ溶液で希釈し、その希釈液をＭＨ寒天プレートに播き、３７℃で一晩培養する。翌日プレートに生えたコロニーの数をカウントすることで生菌数を求める。
（実施例１）
　上記の実験系で、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ）（最終濃度は０．４μｇ／ｍＬ）（この濃度では緑膿菌の生存に影響がない）を添加して、緑膿菌（ＰＡＯ１株）を培養した。この時、さらにペプチドＬＴＬＲ（ロイシンースレオニンーロイシンーアルギニンの配列をもつ４アミノ酸残基からなるペプチド）を種々の濃度で加えた条件で培養した。それぞれの条件下で、緑膿菌の生菌数を測定し、ペプチドを添加しないときの生菌数に比べて、ペプチド添加によって生菌数がどのように変化するかを測定した。結果を図４（Ａ）のグラフに示した。
　０．４μｇ／ｍＬのポリミキシンＢ存在下で、緑膿菌の生存率は、ペプチドＬＴＬＲの濃度依存的に減少し、２．５ｍＭのＬＴＬＲを加えて培養した場合には、緑膿菌の生存率はほぼ０％になった。
（比較例１）
　実施例１において、ペプチドＬＴＬＲの４番目のアミノ酸（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換したペプチドＬＴＬＥを合成し、実施例１と同条件で、２．５ｍＭのＬＴＬＥを加えて生菌数の変化を測定した。その結果、緑膿菌の生存率の減少は観察されなかった。従って、実施例１で観察された抗菌作用はアミノ酸配列（ＬＴＬＲ）に特異的であることが示唆された。
（比較例２）
　実施例１において、ペプチドＬＴＬＲのアミノ酸配列をランダム化したペプチドＬＲＴＬを合成し、実施例１と同条件で、２．５ｍＭ　のＬＲＴＬを加えて生菌数の変化を測定した。その結果、緑膿菌の生存率の減少は観察されなかった。従って、実施例１で観察された抗菌作用はアミノ酸配列（ＬＴＬＲ）に特異的であることが示唆された。
（実施例２）
　実施例１で使用したＰＡ０１株（標準株）の緑膿菌に代えて、臨床分離株（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　２４，４２，８３，８８および９２）、ｎａｌＢ　株（薬剤排出ポンプであるＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭを高発現し、高度多剤耐性となった株）、及びｎｆｘＣ株（薬剤排出ポンプであるＭｅｘＥＦ－ＯｐｒＮを高発現し、高度多剤耐性となった株）を用い、それらに対するＬＴＬＲの作用を測定した。この実験ではｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂの最終濃度を０．２μｇ／ｍＬし、３ｍＭのＬＴＬＲを添加して生存率の変化を調べた。その結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　生存率が最も高かった臨床分離株（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ４２株）であっても、その生存率は半数以下であり、いわゆる高度剤耐性株であるｎａｌＢ株やｎｆｘＣ株においても菌の生存率はほぼゼロであり、本発明のペプチドが多剤耐性菌に対しても有効であることが確認された。
（実施例３）
　緑膿菌のかわりに大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）を用い、実施例２と同様の測定を行った。その結果、大腸菌の生存率は約１％という結果が得られた。これによりＬＴＬＲは、緑膿菌のみならず大腸菌を含むグラム陰性菌全般にも作用することが示唆された。
（比較例２）
　アミノ末端をアセチル化したＬＴＬＲを合成し、その作用を調べた。実施例１と同じ条件下で、ＬＴＬＲをアセチル化ＬＴＬＲに変えて緑膿菌の生存率を調べた。その結果、生存率の減少は観察されず、アセチル化することで抗グラム陰性菌活性が著しく低下したことが示された。
（実施例４）
　カルボキシ末端をアミド化したＬＴＬＲを合成し、その作用を調べた。実施例１と同じ条件下で、種々濃度のアミド化ＬＴＬＲを加えて、緑膿菌の生存率の変化を検討した。その結果を図４（Ｂ）に示す。アミド化によってＬＴＬＲの活性が増加した事を示しており、カルボキシ末端のアミド化はペプチドの保護作用とともにその活性の増大にも関与することが明らかとなった。
　同様の実験結果は大腸菌に対しても得られた。
（比較例３）
　ＬＴＬＲの長さを変えたときに活性にどのように影響するかを調べるために、カルボキシ末端をアミド化したＴＬＲおよびＬＲをそれぞれ合成し、その活性を測定した。実施例４と同様の条件下で、アミド化したＴＬＲあるいはＬＲを１０ｍＭの濃度加えて、緑膿菌に対する作用を調べた。その結果、菌の生存率の減少は見られなかった。
（実施例５）
　抗生剤として、膜変質作用を有するポリミキシンＢに代えて、オフロキサシン（ＯＦＬＸ）又はアズトレオナム（ＡＺＴ）を使用した系で、実施例４と同様の実験を行った。結果を図５及び図６に示す。ＯＦＬＸ又はＡＺＴのいずれを用いた系でも、アミド化ペプチド分子（ＬＴＬＲ）を添加した場合、同じ抗生剤濃度における多剤耐性株（ＮａｌＢ）の緑膿菌の生存率は添加しない場合に比較して格段に低下した。即ち、本発明のアミド化ペプチド分子は、外膜を通過して標的部位に到達し、菌を脆弱化したことが示唆された。従って、本発明のアミド化ペプチド分子は、アズトレオナム等の抗生剤の効果を向上させる作用を有することが確認された。
（実施例６）
　ペプチド分子として、ＹｅａＴとＹｆｉＯとの結合を阻害するＦＩＲＬ（Ｙｆ２Ｂ１）を用い、緑膿菌（ｎａｌＢ）で実施例１と同様の実験を行った。結果を図７に示す。
　ＹｅａＴとＹｆｉＯとの結合を阻害するペプチド分子は更に優れた抗グラム陰性菌作用を示すことが確認された。
　本発明の抗グラム陰性菌剤の一例であるペプチドＦＩＲＬ及びそのアミド化物を用いて以下の動物実験を実施した。
（実施例７）
緑膿菌感染によるウサギ角膜潰瘍モデルを用いた実験
　日本白色家ウサギ（２ｋｇ、雄）の角膜中央部に傷をつけて多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）を接種することにより潰瘍を形成させた。ウサギを以下の３群（５匹ずつ）に分け、接種の６時間後から各群に次の薬剤の点眼を開始した。点眼はＭＤＲＰ接種後６時間、１２時間、１８時間の３回行った。
　第１群：生理食塩水（コントロール）
　第２群：オフロキサチン(OFLX)点眼薬（タリビット点眼液０．３％、参天製薬）
　第３群：OFLX点眼薬と５０ｍMのＦＩＲＬ／生理食塩水の混合液
　潰瘍形成１２時間後（点眼開始６時間後）及び潰瘍形成２４時間後（点眼開始１８時間後）に、各群について菌数を測定した。測定方法は次の通りである。
　眼脂と角膜を回収し、５ｍＬの生理食塩水を加えてすり鉢で乳化し、ＮＡＣ寒天培地に播種し、２４時間後に菌数をカウントした。結果を図８のグラフに示す。
　潰瘍形成１２時間後（点眼開始６時間後）、潰瘍形成１８時間後（点眼開始１２時間後）及び潰瘍形成２４時間後（点眼開始１８時間後）に、各群の角膜実質の混濁を観察し、次の方法で臨床スコアを決定した。
　角膜潰瘍部を軸に観察領域を１２象限に分割し、各象限における混濁の有無を、混濁有り：１、混濁無し：０により数値化し、各検体に関する臨床スコア（１２象限の合計値）を算出する。
　潰瘍形成１２時間後及び２４時間後の各群の検体における角膜の外観を図９及び図１０に示し、潰瘍形成後１２時間から２４時間の臨床スコアの変化を図１１に示す。
　図８～１１に示した結果から明らかなように、従来の抗菌剤であるＯＦＬＸを投与した第２群では、潰瘍形成後１２時間の時点ではコントロール群（第１群）より菌数が増加しているのに対し、本発明のグラム陰性菌剤（ＦＩＲＬ）を同時投与した第３群では１２時間後には菌数が格段に減少しており、本発明の抗グラム陰性菌は即効性に優れている。また、臨床スコアにおいても、本発明のグラム陰性菌剤を動じ投与した第３群では、ＯＦＬＸのみを投与した第２群に比較して混濁の解消が早く、その効果も大きいことがわかる。
(実施例８)
緑膿菌感染によるマウス肺炎モデルを用いた実験
　Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７－８週齢、雌）の気管に、１０７ＣＦＵ／マウスの緑膿菌（ＰＡＯ１株）を作用させて肺炎モデルマウスとした。マウスを以下の４群（５匹ずつ）に分け、各群に次の薬剤、各３０μＬを緑膿菌感染と同時に経気管投与した。
　第１群：生理食塩水（コントロール）
　第２群：アミド化ＦＩＲＬ（２．５ｍＭ）
　第３群：硫酸コリスチン（４．７ｍｇ／ｋｇ）
　第４群：アミド化ＦＩＲＬ（２．５ｍＭ）と硫酸コリスチン（４．７ｍｇ／ｋｇ）の混合液
　６時間後にマウスを屠殺し、細菌数（ＣＦＵ）を測定した。結果を図１２に示す。
　次に、アミド化ＦＩＲＬの濃度を５．０ｍＭとし、硫酸コリスチン（４．７ｍｇ／ｋｇ）をレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）（５．０ｍｇ／ｋｇ）に置換した以外は前記と同様にして第１群から第４群までの細菌数（ＣＦＵ）を測定した。その結果を図１３に示す。
　図１２及び図１３に示した結果から、アミド化ＦＩＲＬ単独では肺炎モデルに対して即効性は見られなかったが（第２群）、他の抗菌薬と同時投与することにより相乗効果が得られ、他の抗菌薬のみを投与した第３群）に比較して細菌数が１／１０程度に減少したことがわかる。

Claims (8)

  1. ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする抗グラム陰性菌剤。
  2. ＹａｅＴとＴｆｇＬとの結合を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の抗グラム陰性菌剤。
  3. 少なくともＬＴＬＲからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子である、請求項２に記載の抗グラム陰性菌剤。
  4. ＹａｅＴとＹｆｉＯとの結合を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の抗グラム陰性菌剤。
  5. 少なくともＦＩＲＬ又はＩＲＬＨからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子である、請求項４に記載の抗グラム陰性菌剤。
  6. 少なくともＦＩＲＬＨＰからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子である、請求項５に記載の抗グラム陰性菌剤。
  7. 前記ペプチド分子のＣ末端がアミド化されていることを特徴とする、請求項３、５又は６に記載の抗グラム陰性菌剤。
  8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の項グラム陰性菌剤と、抗生剤を含有することを特徴とする、グラム陰性菌感染症の治療薬。
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