WO2011000959A1 - Point of care testsystem und verfahren zum aufbringen einer probe - Google Patents

Point of care testsystem und verfahren zum aufbringen einer probe Download PDF

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test
sample channel
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Lars Von Olleschik-Elbheim
Mark HÜNKEN
Marc Dangers
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DST Diagnostische Systeme und Technologien GmbH
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    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces

Definitions

  • the present invention relates to a test system or
  • Assay system detection system
  • test method preferably in use for the point-of-care (PoC) area.
  • Protein analysis Another example is the multitude of analytical methods and methods used to detect the antibody reactions, so-called immune reactions, which are used for the determination of (bio) markers and many more
  • Substances / analytes are used. Rapid test methods are known, such as the lateral flow
  • LFT flow-through test
  • FTT flow-through test
  • AT agglutination test
  • SPT solid-phase test
  • nitrocellulose detection of IgE binding to soluble and insoluble allergens ", & J. IMMUNOL, METHODS 1984, 73 (1), 139-45.
  • Binding assays for allergy detection from whole blood can be used.
  • a particular problem is the simultaneous or simultaneous sample wetting of the individual detection sites. This is required for reproducibility and achievement of a high quality result.
  • WO2002072264 for immunoassays known to allow a controlled and targeted sample delivery on a membrane.
  • a test method is provided, wherein a. at least one test reagent is fixed on a first surface, and a second on the back
  • Sample channel is guided, wherein the sample channel opens into an orifice surface which is opposite to the second surface, wherein the second
  • the Surface is wettable at least in a region opposite the mouth, c. and the sample liquid exits its mouth by pressurizing the sample channel and forms a drop adhering to the mouth surface, d. wherein contact between droplets and a wetting point on the second surface is created by passing the droplet through the
  • Pressurizing the sample channel is increased so that the drop touches the wetting point, e. the sample liquid is directly or through said contact of the wetting point
  • test reagent can be substances such as peptides, proteins, enzymes or their substrates, ligands or Receptors, antibodies or antigens, DNA, RNA, PNA, but also molecules of non-biochemical origin, such as
  • test reagents may contain combinations of these types of molecules or fragments thereof,
  • Lipids and sugars are also included in the invention. Furthermore, natural substances and
  • test reagents as is often the case in allergy tests or food intolerance tests.
  • the mouth surface and / or the first and / or second surface of a Nachweistos may for example consist of glass, plastic, in particular transparent plastic.
  • Preferred are polycarbonates such as macrolone, polycyclic olefins such as topaz, polypropylene, PMMA or polyimides.
  • the surface can furthermore be coated, for example with proteins, in particular antibodies, sugars, for example dextranes, or else with metals, glass, or plastics, or carbon derivatives, such as
  • test reagents are fixed on the first surface.
  • the test reagents can be fixed in a layer below the first surface.
  • the test reagents can be on the surface
  • Stabilizing matrix or be applied as lyophilizate and dissolve when wetted from the surface.
  • the fixation can continue to take place by utilizing non-covalent interactions, such as exist between antibody and protein A, between biotin and
  • Streptavidin between hexa-histidine and nickel-NTA or in the base pairing of DNA. Furthermore, an element of
  • Test reagents are covalently bound to the first surface.
  • the test reagent remains when wetted substantially at the first surface
  • a sample liquid can be any substance or
  • Substance mixture if appropriate, including solvents, of any origin, in particular derived from a plant or an animal, in particular from a mammal, in particular from a
  • the sample liquid may not be complete, whole blood, half blood, serum, saliva,
  • processed forms of such fluids such as EDTA-stabilized blood.
  • the sample channel may have a means for pressurizing.
  • this can be a filling opening or a filling nozzle into which, for example, a syringe is plugged, with which a user can exert manual pressure.
  • Further embodiments provide blisters or pumping chambers, or connections for external pumps.
  • a heating device can be provided, with which the liquid is expanded or brought to evaporation, whereby pressure is built up.
  • the mouth area may be in the area of the mouth of the
  • Macrolone and polyolefins such as Topaz in untreated form, or post-treated, provided the post-treatment such as
  • Plasma treatment does not or only slightly reduces the wettability.
  • This wettable area may be surrounded by a hydrophobic area with which the droplet size can be restricted.
  • the second surface is in an area of
  • this area can consist of nitrocellulose.
  • Surface at the mouth of the sample channel has a distance to the mouth surface of 0.001 mm to 15 mm, in particular from 0.01 mm to 2 mm, in particular from 0.04 to 0.4 mm.
  • the wetting point lies on the second surface and is the first point of this surface which the drop contacts as it grows on the second surface.
  • Sample channel can be generated.
  • the sample channel is therefore designed such that it expands terminally toward the second surface, so that the droplet at least partially or completely wets the surface of the expansion.
  • the expansion extends according to the invention from the mouth of the sample channel to the mouth edge of the expansion.
  • the expansion advantageously has the effect that the contact angle and drop surface are energetically optimal when the drop forms in the expansion. However, when expanding beyond the limits of expansion, more energy must be applied. Thus, the expansion causes the drop to assume an advantageous stable and reproducible position and shape.
  • the wetting point on the second surface and the passage point of the sample liquid on the first surface are advantageously precise in this way
  • the method when the mouth surface at the position at the mouth edge of the expansion at a distance from the second surface of 0.001 mm to 15 mm, in particular from 0.01 mm to 2 mm, in particular from 0.04 to 0.4 mm
  • the second surface may terminate or at least partially rest on at least one mouth edge of an expansion, or a gap may be formed from the second surface to the mouth edge of the expansion.
  • the space formed represents a cavity which is spatially delimitable (e.g.
  • the individual mouth edges of the widening are preferably designed in a single muzzle surface, which lies opposite the first and second surface and / or lies completely or partially against the second surface.
  • a gap may therefore assume different volume columns from the second surface or first surface to each mouth edge of an expansion.
  • the second surface may have an inclined plane to the mouth surface of the entirety of sample channels / extensions.
  • Muzzle edges of the expansions partially rest, be it at the mouth edges of the expansions or next to the
  • Mouth-side expansion of at least one of the sample channels is conical or concave, in particular hemispherical, in the form of a plate or a spherical cap is formed.
  • the expansion can also be arbitrary, approximately oval or substantially assume concave forms.
  • the expansion can also be a
  • the cylindrical shape or have generally edges and kinks. It may be preferable to shape the expansion trumpet-shaped.
  • the widening at the mouth edge has a diameter between 0.015 and 15 mm, in particular between 0.1 and 6 mm, in particular between 1 and 4 mm.
  • the expansion has a depth, i. a distance from the mouth of the sample channel to the mouth edge of the expansion of 0.001 mm to 2 mm, in particular between 0.01 and 1 mm.
  • sample channel may additionally have a
  • the expansion may be of a radially symmetric shape
  • first and / or second surface parallel and / or planar to the planes of
  • this distance between the muzzle surface and the second surface can not be met exactly or is not stable, for example, when a membrane is used as a first surface and second surface.
  • the inventive method has the particular advantage that even under this condition, the wetting of the wetting points almost uniform and
  • test is supplied by at least one further channel at least one (test, detection) reagent, in particular a washing solution and / or a stop solution.
  • test, detection reagent
  • One or more channels may lead from different directions to the location where a test reagent is fixed and / or to the wetting point. It is preferred to arrange the further channel perpendicular to the line sample channel - wetting point (second surface) - if necessary.
  • the further channel can have several
  • the reagent may be, for example, a stop reagent which stops an enzymatic reaction, for example in an ELISA.
  • the reagent may be, for example, a substrate
  • Embodiment in which a labeled secondary antibody is supplied Furthermore, it is preferable to supply a washing solution, for example, to wash away non-binding antibodies from the measuring station. It may be preferred to sequentially supply multiple (test) reagents through the same channel.
  • mouth surface and the second surface are rigidly connected to each other, in particular the volume between the mouth of the sample channel, including expansion and second
  • the surface is complete with the intermediate space closed relative to the external environment and forms a first cavity, and in which the air in this volume can escape through another channel or through at least one further opening.
  • the first cavity can be different
  • the cavity at at least one mouth of a sample channel a distance from the mouth to the second surface of 0.001 mm to 15 mm, in particular from 0.01 mm to 2 mm, in particular from 0.04 to 0.4 mm.
  • This cavity can continue to run above
  • the first and / or second surface consists of a gel-like, porous, sieve-like, permeable or semipermeable membrane, or dialysis membrane, in particular a coated or uncoated nitrocellulose membrane.
  • the first and / or second surface may be wholly or partly connected to the substrate material of the cavity. It may also be applied as a coating and prepared in situ by known micromechanical methods, for example by printing, steaming or sol-gel techniques, and may be released from its substrate by dissolving a previously deposited sacrificial layer.
  • the first and / or second surface may be patterned by known methods, for example by applying a protective mask to areas to be preserved and subsequent etching or plasma treatment.
  • the first and / or second surface may be composed of multiple layers and processed in situ, for example, holes may have been formed in the first and / or second surfaces with a laser, or at least one of its layers may be functionalized by plasma or biomolecule treatment ,
  • the distance between the first and second surfaces may be preferable to make the distance between the first and second surfaces in the range of 0.001 to 1 mm. In a preferred embodiment, it is monomolecular.
  • a membrane is at least partially manufactured outside and applied to a surface or positioned therebetween only after these manufacturing steps.
  • the membrane can, for example, on be adhered to at least a portion of its surface, fixed by static charge, or mechanically clamped, in particular between the first and second surface, or be attached by combinations of different methods.
  • the membrane is provided before positioning and outside with at least one test reagent.
  • Test reagents may be applied to the membrane by a dispensing unit, by stripping one
  • test reagents is applied in situ. It can be any suitable test reagents. It can be any suitable test reagents.
  • the membrane is absorbing water, so that the sample liquid after
  • the membrane may consist of a non-woven material, and in particular of nitrocellulose.
  • Material such as cotton to connect, which increases the capacity for capillarity, ie the suction power. It is particularly preferred to position the membrane in the form of at least one strip in the cavity, in particular in a mutually parallel positioning. In a particularly preferred embodiment, the membranes or strips are spotted with test reagents,
  • test reagents in the form of strips, squares or
  • Test reagent applied as a strip on the membrane, which extends from one edge of the membrane to the other. More preferably, the membrane is strip-shaped, and the strips
  • Test reagents range from one longitudinal edge of the membrane strip to the opposite longitudinal edge.
  • a second cavity is located on the first surface which is independent of the cavity formed on the second surface into which at least one microfluidic channel can connect, which connects this second cavity to a reservoir or to the outside space.
  • the second cavity can be designed differently without affecting the method according to the invention.
  • no test reagent is located at the point of penetration on the first
  • such a passage point on the first surface is opposite to the first wetting point on the second surface.
  • the sample liquid spreads by capillary force and / or pressure on the membrane, and reaches at least one detection space with test reagent, which may lie on a said, covered portion of the membrane.
  • the membrane on the first surface not only carries the test reagent, but also prevents larger particulate components of the sample fluid from contacting the test reagent. This embodiment advantageously allows larger ones
  • a sample fluid such as Erythrocytes of a whole blood sample
  • Ingredients in a sample fluid can not interact with the test fields.
  • the invention also relates to such
  • Embodiments in which the penetration point of test reagents is free on the first surface Embodiments in which the penetration point of test reagents is free on the first surface.
  • At least two, in particular at least ten, detection sites are placed at separate locations on the first surface. Part of the seats may also be provided for control purposes. Preference is given to various detections, in particular different allergens or
  • At least two sample channels, each with an expansion into the mouth area, open, and at least two of these sample channels are connected via at least one branch to at least one common reservoir or a common filling opening.
  • At least one sample channel ends before dilation, a constriction or throttle, which increases the flow resistance, the Hagen-Poiseuille by reducing and / or Change in the shape of the cross-sectional area of the sample channel can be achieved.
  • a reduction in the cross-sectional area is preferably more than 1%, in particular more than 10%, in particular more than 30%. Particularly preferred is a change of an angular cross section of 0.5 * 1 mm to a round diameter of 0.5 mm.
  • the cross section of the throttle may differ from that of the sample channel and have square, round, or irregular cross sections. It may be preferable to vary the cross section over the length of the throttle in shape or size.
  • the throttle is not straight, but is kinked or meandering in its course.
  • constriction of the respective sample channel to a length of 1 cm to 0.5 mm.
  • the constriction is in the form of a step.
  • sample channel deviates perpendicularly from the first sample channel, or at an angle of 40 to 120 degrees with respect to the longitudinal axis of the first sample channel.
  • one or more sample channels originate from a first sample channel, the transition from the first sample channel to the at least one subsequent sample channel having a reduction of the cross section, which also has the function of a throttle.
  • one or more, in particular four sample channels originate in a crossed shape from a first sample channel.
  • At least two, in particular all, mouths of the sample channels originate from a common filling nozzle.
  • the cross sections of the sample channels are different and designed such that different running resistances of the sample channels are compensated. This ensures that the different samples flow into the expansion at the same time and in equal amounts, even if the lengths of the channels or the number of kinks or bends per sample channel are different. Consequently, the size of droplets that arise in different widenings is approximately equal in this embodiment.
  • constriction according to the invention can be created in the form of a sieve-like structure, which is positioned substantially transversely to the longitudinal axis of the sample channel.
  • the diameters of the individual sieve openings can be different, their arrangement irregular.
  • the screen openings become larger toward the edge in order to flatten the laminar flow profile in the sample channel. It may also be preferred for two or more
  • sample liquid first fill the sample channels simultaneously. Upon reaching a constriction, the sample liquid stops first and the other sample channels continue to fill, until at all the Narrowing is achieved. Only then does the sample liquid penetrate through the bottlenecks into the widenings, where it forms one drop at a time.
  • the wetting is particularly suitable by means of an upwardly radially open plate, since such a plate supports the formation of a drop.
  • the drop is used to overcome the distance between the sample channel and the membrane and depends on the diameter of the
  • Membrane an absorbent role, in which after contact with the sample, the membrane to saturation passively sample
  • each sample channel may be throttled independently of each other.
  • a throttling can be done, for example, by a valve, or simply by means of a storage space, wherein a first sample channel has a 40-120 degree angle.
  • test reagents are arranged in such a way that they are arranged in a star shape with equal or different distances or angles around a wetting point on the first surface or the membrane, so that in a straight line between a fixed test reagent and the wetting point no further fixed test reagent is located.
  • Detection sites influence, such as by cross-reactive antibodies from the samples.
  • a plurality of membranes, in particular strip-shaped membranes are arranged in parallel, and the second cavity consists of one or more parallel partial cavities.
  • a second membranes in particular strip-shaped membranes are arranged in parallel, and the second cavity consists of one or more parallel partial cavities.
  • the second cavity extends. It is further preferred that the second cavity extends similarly far over a membrane strip. It is further preferred that the membrane strips completely separate the first and second cavities and that no sample liquid can pass from the first into the second cavity without passing through the membrane.
  • the second cavity is connected to a filling nozzle, through which
  • Pressure generation can be filled in the second cavity.
  • this cavity is connected to an outlet opening or to a waste container, so that air and excess liquid can escape from the second cavity.
  • further cavities or partial cavities with common filling nozzles or waste containers are connected to one another for the second cavity.
  • At least one lens is arranged above at least one fixed test reagent, so that the human eye can also recognize smaller detection sites well.
  • the test reagent is lyophilized and / or covalently or non-covalently coupled to the first surface or membrane.
  • the pore size of the first surface or membrane is sized so that proteins can pass through the pores, but not red blood cells or white blood cells.
  • a pore size of less than 0.8 .mu.m is preferred, especially less than 0.2 .mu.m.
  • the assay procedure involves a binding assay. For example, binding between peptides and / or proteins or DNA, RNA or PNA hybridization, antibody-antigen binding, aptamer-target binding, primary-secondary antibody interaction, ligand-receptor interaction or combination thereof
  • a binding assay in which an antigen is fixed on the first surface, the sample fluid contains antigen-specific IgE, and an anti-IgE antibody is added carrying an enzymatic, fluorescent, luminescent or colored label.
  • the invention further relates to a test system consisting of a first surface and a second surface, wherein a. at least one test reagent is fixed on a first surface, and on the backside a second surface is formed, b. wherein the sample channel opens into an orifice surface opposite the second surface, the second surface being wettable at least in a region opposite the orifice, c. wherein the sample channel is widened terminally toward the second surface, wherein the mouth edge of the expansion at a distance from the second surface of 0.001 mm to 15 mm, in particular from 0.01 mm to 2 mm, in particular 0.04 to 0.4 mm and the first and second surface, each independently
  • test system can be designed according to the above features, even if these features are related to the method according to the invention. Further embodiments are set forth in the claims and figures. Examples and figures:
  • FIG. 1 (a) shows a possible arrangement consisting of a second cavity (1), membrane (2), expansion (3), surface of the expansion (4), constriction or throttle (5), substrate (6), detection space with test reagent (7) and sample channel (8) and mouth area (9)
  • FIG. 1 (b) shows that the arrangement ensures virtually uniform wetting in the case of the membrane not lying against the muzzle surface (9) (oblique position of the membrane in the drawing is exaggerated for clarity).
  • FIG. 2 shows the wetting process according to the invention.
  • Block arrows at the bottom of the screen indicate the direction of propagation of the pressure in the liquid.
  • Figure 3 shows in longitudinal section different forms of constriction or throttle.
  • the expansions are represented as trapezoids.
  • On the right a trumpet-shaped
  • Figure 4 (a) shows the distribution of the sample liquid in the sample channels, which is passed from a common filling nozzle (2) in a cross shape to the throttle (1) and the subsequent widenings.
  • FIG. 4 (b) shows schematically the plane of the supply of the
  • Waste container (5)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem oder Assaysystem (Nachweissystem) und Testverfahren vorzugsweise im Gebrauch für den Point-of-Care (PoC) Bereich.

Description

POINT OF CARE TESTSYSTEM UND VERFAHREN ZUM AUFBRINGEN EINER PROBE
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem oder
Assaysystem (Nachweissystem) und Testverfahren vorzugsweise im Gebrauch für den Point-of-Care (PoC) Bereich.
In der Forschung, Diagnostik, oder einer Vielzahl weiterer Anwendungsfelder stellen analytische Labortests, die zur qualitativen oder/und quantitativen Bestimmung von Molekülen, Analyten bzw. deren Aktivität oder Zusammensetzung dienen, die Basis für weitreichende Aussagen bis hin zur Entwicklung neuer Verfahren oder Vorrichtungen dar. Die Basis sind die allgemein bekannten Methoden der DNA/RNA Analytik bzw. der
Proteinanalytik. Ein weiteres Beispiel sind die Vielzahl von analytischen Verfahren und Methoden, die eingesetzt werden, um die Antikörperreaktionen, sogenannte Immunreaktionen, welche für die Bestimmung von (Bio) Markern und vielen weiteren
Substanzen/Analyten eingesetzt werden. Es sind Schnelltestverfahren bekannt, wie der Lateral-Flow-
Test (LFT) , Flow-Through-Test (FTT) , Agglutinations-Test (AT) oder Solid-Phase-Test (SPT) . Alle diese Verfahren dienen zum schnellen Nachweis von Analyten ohne die Verwendung von
Geräten und sind zur visuellen Auswertung geeignet. Ein robustes Assayprinzip ist bekannt, wie im Stand der
Technik zur in-vitro Diagnostik als Immunoassay (IA),
insbesondere als EIA, oder „binding assay" („Sandwich") beschrieben (Siehe z.B. EP0171150B1, EP 0063810B1). Ferner ist z.B. der fluorometrische Nachweis von IgE im Rahmen eines Bindungsassays aus EP0119613 Bl bekannt. Darüber hinaus, sei auf das Schrifttum von Roger P. Ekins (z.B. WO 8401031 u.v.a.) verwiesen .
Ferner ist ein membrangestützer Bindungsassay, insbesondere von IgE aus Blut an Allergenen seit Ende der 1980-iger Jahre bekannt. Z.B. CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 101, no . 25, 17th December 1984, page 578, abstract no . 228190b, Columbus, Ohio, US; B. J. WALSH et al . : "Allergen discs prepared from
nitrocellulose : detection of IgE binding to soluble and insoluble allergens", & J. IMMUNOL. METHODS 1984, 73(1), 139- 45.
Für den PoC Bereich ist beispielsweise der käuflich
erhältliche Fast-Check-PoC der Anmelderin beschrieben (siehe EP1718970), der auf Basis eines membrangestützen
Bindungsassays zum Allergienachweis aus Vollblut eingesetzt werden kann.
Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis ein Nachweissystem eines PoC Testsystems zu verbessern.
Ein besonderes Problem ist die gleichzeitige bzw. simultane Probenbenetzung der einzelnen Nachweisplätze. Dies ist zur Reproduzierbarkeit und Erzielung eines qualitativ hochwertigen Ergebnisses erforderlich.
Ein ähnlich bedeutendes Problem ist die Benetzung der
Nachweisplätze mit einer jeweils gleichen Menge
Probenflüssigkeit . Im Stand der Technik sind Röhrensysteme, wie z.B. aus der
WO2002072264 für Immunoassays bekannt, die eine kontrollierte und gezielte Probenzuführung auf einer Membran erlauben sollen .
Allerdings ist nachteilig, dass die bekannten Kanal- oder Röhrensysteme kein gleichförmiges Zubringen oder Homogenität der Einzelproben aus einer Gesamtprobe gewährleisten.
Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung für ein PoC- Testsystem eine verbesserte Probenzuführung bereitzustellen, die ein verbessertes Ergebnis erzielt. Überaschender Weise wird diese Aufgabe durch den Anspruch 1 gelöst. Erfindungsgemäß ist ein Testverfahren vorgesehen, wobei a. mindestens ein Testreagenz auf einer ersten Oberfläche fixiert ist, und rückseitig eine zweite
Oberfläche ausgebildet ist, b. mindestens eine Probenflüssigkeit in einem
Probenkanal geführt wird, wobei der Probenkanal in eine Mündungsfläche mündet, die der zweiten Oberfläche gegenüberliegt, wobei die zweite
Oberfläche mindestens in einem Bereich benetzbar ist, der der Mündung gegenüberliegt, c. und die Probenflüssigkeit durch Druckbeaufschlagung des Probenkanals aus seiner Mündungsöffnung austritt und einen an der Mündungsfläche haftenden Tropfen bildet, d. wobei ein Kontakt zwischen Tropfen und einem Benetzungspunkt auf der zweiten Oberfläche erzeugt wird, indem der Tropfen durch die
Druckbeaufschlagung des Probenkanals so vergrößert wird, dass der Tropfen den Benetzungspunkt berührt, e. die Probenflüssigkeit durch die genannte Berührung des Benetzungspunkts direkt oder durch
Kapillarwirkung der ersten Oberfläche und/oder Druckbeaufschlagung des Probenkanals von der zweiten
Oberfläche in Richtung der ersten Oberfläche
eindringt oder bis zur ersten Oberfläche durchtritt und mit dem Testreagenz reagiert.
Weitere vorteilhafte Durchführungsarten und Ausführungsformen gehen aus den Unteransprüchen hervor.
Ein Testreagenz kann beispielsweise Substanzen, wie Peptide, Proteine, Enzyme oder deren Substrate, Liganden oder Rezeptoren, Antikörper oder Antigene, DNA, RNA, PNA enthalten, aber auch Moleküle nicht biochemischen Ursprungs, wie
beispielsweise Jod. Die Testreagenzien können Kombinationen dieser Molekülsorten enthalten oder deren Fragmente,
Konjugate, modifizierte, etwa glykolisierte oder
phosphorylierte Formen. Lipide und Zucker sind ebenfalls erfindunggemäß umfasst. Ferner können Naturstoffe und
natürliche Extrakte in Testreagenzien vorkommen, wie dies bei Allergietests oder Nahrungsmittelunverträglichkeittests häufig der Fall ist.
Die Mündungsfläche und / oder die erste und / oder zweite Oberfläche eines Nachweisträgers kann beispielsweise aus Glas, Kunststoff, insbesondere transparentem Kunststoff bestehen. Bevorzugt sind Polycarbonate wie beispielsweise Macrolon, polyzyklische Olefine wie beispielsweise Topaz, Polypropylen, PMMA oder Polyimide. Die Fläche kann weiterhin beschichtet sein, beispielsweise mit Proteinen, insbesondere Antikörpern, Zuckern wie zum Beispiel Dextranen, oder aber mit Metallen, Glas, oder Kunststoffen, oder Carbonderivaten wie
beispielsweise Carbon Nanotubes.
Ein oder mehrere Testreagenzien sind auf der ersten Oberfläche fixiert. Erfindungsgemäß können die Testreagenzien in einer Schicht unterhalb der ersten Oberfläche fixiert sein. Die Testreagenzien können zum Beispiel an der Oberfläche
eingetrocknet sein, entweder allein oder in einer
stabilisierenden Matrix, oder als Lyophylisat aufgetragen werden und lösen sich bei Benetzung von der Oberfläche. Die Fixierung kann weiterhin durch Ausnutzung nicht kovalenter Wechselwirkungen erfolgen, wie sie beispielsweise zwischen Antikörper und Protein A bestehen, zwischen Biotin und
Streptavidin, zwischen Hexa-Histidin und Nickel-NTA oder bei der Basenpaarung von DNA. Ferner kann ein Element der
Testreagenzien kovalent an die erste Oberfläche gebunden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform bleibt das Testreagenz bei Benetzung im Wesentlichen an der ersten Oberfläche
fixiert, insbesondere zu mehr als 50%.
Eine Probenflüssigkeit kann eine beliebige Substanz oder
Substanzgemisch, ggfs. samt Lösungsmittel, beliebiger Herkunft sein, insbesondere von einer Pflanze oder einem Tier stammen, insbesondere von einem Säugetier, insbesondere von einem
Menschen. Die Probenflüssigkeit kann beispielsweise nicht abschließend Vollblut, Halbblut, Serum, Speichel,
Tränenflüssigkeit, Urin, Sekret, Hirnflüssigkeit oder
prozessierte Formen solcher Flüssigkeiten, wie etwa EDTA - stabilisiertes Blut enthalten.
Der Probenkanal kann ein Mittel zur Druckbeaufschlagung aufweisen. Das kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine Befüllöffnung oder ein Befüllstutzen sein, in den zum Beispiel eine Spritze gesteckt wird, mit der ein Benutzer manuell Druck ausüben kann. Weitere Ausführungsformen sehen Blister oder Pumpkammern vor, oder Anschlüsse für externe Pumpen. Ferner kann auch eine Heizvorrichtung vorgesehen sein, mit der die Flüssigkeit ausgedehnt oder zur Verdampfung gebracht wird, wodurch Druck aufgebaut wird.
Die Mündungsfläche kann im Bereich der Mündung des
Probenkanals benetzbar beschaffen sein, so dass der bei
Druckbeaufschlagung entstehende Tropfen haftet und sich nicht unkontrolliert löst. Diese erfindungsgemäße Eigenschaft erfüllen nicht abschließend Polycarbonate wie beispielsweise
Macrolon und Polyolefine wie Topaz in unbehandelter Form, oder nachbehandelt, sofern die Nachbehandlung wie etwa
Plasmabehandlung die Benetzbarkeit nicht oder nur gering mindert. Dieser benetzbare Bereich kann von einem hydrophoben Bereich umgeben sein, mit dem die Tropfengröße beschränkt werden kann.
Die zweite Oberfläche ist in einem Bereich des
Benetzungspunkts, der der Mündung gegenüberliegt, benetzbar beschaffen, so dass der Tropfen die zweite Oberfläche berührt. Insbesondere kann dieser Bereich aus Nitrozellulose bestehen.
Besonders bevorzugt ist das Verfahren, wenn die zweite
Oberfläche an der Mündung des Probenkanals einen Abstand zur Mündungsfläche von 0,001 mm bis 15 mm, insbesondere von 0,01 mm bis 2 mm, insbesondere von 0,04 bis 0,4 mm aufweist.
Der Benetzungspunkt liegt auf der zweiten Oberfläche und ist der erste Punkt dieser Oberfläche, den der Tropfen bei seinem Wachstum auf der zweiten Oberfläche berührt. Besonders
bevorzugt sind Ausführungsformen, bei denen der
Benetzungspunkt vollständig reproduzierbar ist, wie sie durch die benannte Hydrophobisierung auf der Mündungsfläche,
und/oder durch Hydrophobisierung um den Benetzungspunkt herum auf der zweiten Oberfläche, und / oder besonders bevorzugt durch eine Aufweitung um die endständige Öffnung des
Probenkanals erzeugt werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der Probenkanal daher derart gestaltet, dass er sich endständig zur zweiten Oberfläche hin aufweitet, so dass der Tropfen die Oberfläche der Aufweitung zumindest teilweise oder ganz benetzt. Die Aufweitung reicht erfindungsgemäß von der Mündung des Probenkanals bis zum Mündungsrand der Aufweitung.
Erfindungsgemäß ist die Aufweitung im Bereich des
Mündungsrandes benetzbar. Es kann bevorzugt sein, dass der Bereich des Mündungsrandes der Aufweitung hydrophob beschaffen ist .
Die Aufweitung bewirkt vorteilhaft, dass Kontaktwinkel und Tropfenoberfläche energetisch optimal sind, wenn der Tropfen sich in der Aufweitung bildet. Bei der Ausdehnung über die Grenzen der Aufweitung hinweg muss dagegen mehr Energie aufgebracht werden. Damit bewirkt die Aufweitung, dass der Tropfen eine vorteilhafte stabile und reproduzierbare Lage und Form einnimmt. Der Benetzungspunkt auf der zweiten Oberfläche und der Durchtrittspunkt der Probenflüssigkeit auf der ersten Oberfläche sind auf diese Weise vorteilhaft präzise
festgelegt .
Besonders bevorzugt ist das Verfahren, wenn die Mündungsfläche an der Position am Mündungsrand der Aufweitung einen Abstand zur zweiten Oberfläche von 0,001 mm bis 15 mm, insbesondere von 0,01 mm bis 2 mm, insbesondere von 0,04 bis 0,4 mm
aufweist .
In einer weiteren Ausführungsform kann die zweite Oberfläche an mindestens einem Mündungsrand einer Aufweitung abschließen oder zumindest teilweise aufliegen oder ein Zwischenraum ist von der zweiten Oberfläche zum Mündungsrand der Aufweitung ausgebildet. Der gebildete Raum stellt eine Kavität dar, der räumlich abgrenzbar ist (z.B. mittels einem Gehäuse,
Seitenwände etc.).
Weiterhin sind die einzelnen Mündungsränder der Aufweitung vorzugsweise in einer einzigen Mündungsfläche ausgestaltet, die der ersten und zweiten Oberfläche gegenüber liegt und / oder der zweiten Oberfläche ganz oder teilweise anliegt. Ein Zwischenraum kann daher unterschiedliche Volumensäulen von der zweiten Oberfläche oder ersten Oberfläche zu einem jeden Mündungsrand einer Ausweitung annehmen. Beispielsweise kann die zweite Oberfläche eine schiefe Ebene zu der Mündungsfläche aus der Gesamtheit von Probenkanälen/Ausweitungen aufweisen. Insbesondere kann die zweite Oberfläche auf der Ebenen der
Mündungsränder der Aufweitungen partiell aufliegen, sei es an den Mündungsrändern der Aufweitungen oder neben den
Aufweitungen .
Besonders bevorzugt ist das Verfahren, wenn die
mündungsseitige Aufweitung mindestens eines der Probenkanäle konisch oder konkav, insbesondere halbkugelig, in Form eines Tellers oder einer Kugelkappe ausgebildet ist. Die Aufweitung kann auch beliebige, annähernd ovale oder im Wesentlichen konkave Formen annehmen. Die Aufweitung kann auch eine
zylindrische Gestalt aufweisen, oder allgemein Kanten und Knicke aufweisen. Es kann bevorzugt sein, die Aufweitung trompetenförmig zu formen. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aufweitung an dem Mündungsrand einen Durchmesser zwischen 0,015 und 15 mm, insbesondere zwischen 0,1 und 6 mm, insbesondere zwischen 1 und 4 mm.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aufweitung eine Tiefe, d.h. einen Abstand von der Mündung des Probenkanals bis zum Mündungsrand der Aufweitung von 0,001 mm bis 2 mm, insbesondere zwischen 0,01 und 1 mm.
Des Weiteren kann der Probenkanal zusätzlich einen
Mündungsstutzen aufweisen, sofern dieser die Benetzung der Aufweitung nicht einschränkt.
Die Aufweitung kann von einer radialsymmetrischen Form
abweichen, beispielsweise elliptisch oder oval, oder
unregelmäßigen Querschnitt aufweisen.
Bevorzugt ist zudem ein nahezu gleicher Abstand der zweiten Oberfläche zu den Mündungsrändern über einen großen Teil der ersten Oberfläche und über mehrere Benetzungspunkte hinweg. Weiterhin ist bevorzugt, dass die erste und / oder zweite Oberfläche parallel und / oder planar zur Ebenen der
Mündungsränder bzw. Mündungsfläche aus der Gesamtheit von Probenkanälen/Ausweitungen verläuft.
Es kann fertigungstechnisch bedingt sein, dass dieser Abstand zwischen Mündungsfläche und zweiter Oberfläche nicht genau eingehalten werden kann oder nicht stabil ist, beispielweise wenn eine Membran als erste Oberfläche und zweite Oberfläche verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren weist den besonderen Vorteil auf, dass auch unter dieser Bedingung die Benetzung der Benetzungspunkte nahezu gleichförmig und
gleichzeitig erfolgt. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der dem Test durch mindestens einen weiteren Kanal mindestens ein (Test-, Nachweis) Reagenz , insbesondere eine Waschlösung und / oder eine Stopplösung zugeführt wird. Ein oder mehrere Kanäle können aus verschiedenen Richtungen zum Ort führen, an dem ein Testreagenz fixiert ist, und / oder zum Benetzungspunkt . Bevorzugt ist, den weiteren Kanal senkrecht zur Linie Probenkanal - Benetzungspunkt (zweite Oberfläche) - ggfs. Durchtrittspunkt (erste Oberfläche) anzuordnen. Insbesondere kann der weitere Kanal mehrere
Messplätze seriell oder parallel mit einem Reagenz versorgen. Das Reagenz kann beispielsweise ein Stoppreagenz sein, das eine enzymatische Reaktion, beispielsweise bei einem ELISA, stoppt. Das Reagenz kann beispielsweise ein Substrat
enthalten, das bei einem Lumineszenzverfahren (Firefly) die Lichtemission einleitet. Besonders bevorzugt ist eine
Ausführungsform, bei der ein markierter Sekundärantikörper zugeführt wird. Des Weiteren ist bevorzugt, eine Waschlösung zuzuführen, beispielsweise um nicht bindende Antikörper vom Messplatz wegzuspülen. Es kann bevorzugt sein, mehrere (Test- ) Reagenzien durch den gleichen Kanal nacheinander zuzuführen.
Weiterhin bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der die Mündungsfläche und die zweite Oberfläche starr miteinander verbunden sind, bei der insbesondere das Volumen zwischen Mündung des Probenkanals samt Aufweitung und zweiter
Oberfläche ggfs. samt Zwischenraum abgeschlossen gegenüber der äußeren Umgebung ist und eine erste Kavität bildet, und bei der die in diesem Volumen befindliche Luft durch einen weiteren Kanal oder durch mindestens eine weitere Öffnung entweichen kann. Die erste Kavität kann unterschiedliche
Formen annehmen, sofern sie gewährleistet, dass der Tropfen den Benetzungspunkt der ersten Oberfläche berühren kann.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der die Kavität an mindestens einer Mündung eines Probenkanals einen Abstand von der Mündung zur zweiten Oberfläche von 0,001 mm bis 15 mm, insbesondere von 0,01 mm bis 2 mm, insbesondere von 0,04 bis 0,4 mm aufweist.
Diese Kavität kann weiterhin einen oben ausgeführten
Zwischenraum umfassen. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der die erste und / oder zweite Oberfläche aus einer gelartigen, porösen, siebartigen, permeablen oder semipermeablen Membran, oder Dialysemembran, insbesondere einer beschichteten oder unbeschichteten Nitrozellulose-Membran besteht. Erfindungsgemäß kann die erste und / oder zweite Oberfläche ganz oder teilweise mit dem Substratmaterial der Kavität verbunden sein. Sie kann auch als Beschichtung aufgebracht sein und durch bekannte mikrotechnische Verfahren in situ hergestellt sein, beispielweise durch drucken, bedampfen oder Sol-Gel Verfahren, und kann von Ihrem Substrat gelöst werden durch das Auflösen einer vorher aufgebrachten Opferschicht. Die erste und / oder zweite Oberfläche kann durch bekannte Verfahren strukturiert werden, beispielsweise durch Aufbringen einer schützenden Maske auf beizubehaltende Bereiche und nachfolgendes Ätzen oder Plasmabehandlung. Die erste und / oder zweite Oberfläche kann aus mehreren Schichten aufgebaut sein und in situ bearbeitet werden, beispielsweise können mit einem Laser Löcher in die erste und / oder zweite Oberfläche erzeugt worden sein, oder mindestens eine ihrer Schichten kann durch Plasmabehandlung oder mit Biomolekülen funktionalisiert sein .
Es kann bevorzugt sein, den Abstand zwischen erster und zweiter Oberfläche im Bereich von 0,001 bis 1 mm auszuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist sie monomolekular. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Membran, zumindest teilweise außerhalb gefertigt und erst nach diesen Fertigungsschritten auf eine Oberfläche aufgebracht oder dazwischen positioniert. Die Membran kann beispielsweise auf zumindest einem Teil ihrer Fläche geklebt werden, durch statische Aufladung fixiert, oder mechanisch geklemmt sein, insbesondere zwischen erster und zweiter Oberfläche, oder durch Kombinationen verschiedener Verfahren befestigt sein. Erfindungsgemäß wird die Membran vor der Positionierung und außerhalb mit mindestens einem Testreagenz versehen. Die
Testreagenzien können durch eine Dispensiereinheit auf die Membran aufgebracht sein, durch Abstreifen von einem
Gegenstand, insbesondere einer Röhre mit oder ohne
Nachfülleinrichtung, durch Druckverfahren, beispielsweise
Siebdruck, durch photochemische Fixierung oder mittels eines Sprays. Es können auch Linkermoleküle an der Membran verankert werden, an die die Moleküle des Testreagenz binden, ohne die Bindung der Analyten aus der Probenflüssigkeit wesentlich zu beeinflussen.
In einer anderen Ausführungsform wird zumindest ein Teil der Testreagenzien in situ aufgebracht. Dabei können
beispielsweise die benannten Verfahren eingesetzt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Membran Wasser aufsaugend, so dass sich die Probenflüssigkeit nach
Benetzung des Benetzungspunkts mit dem Tropfen sich weiter auf oder in der Membran ausbreitet. Die Ausbreitung kann durch Kapillarkraft und / oder kontinuierlicher Druckbeaufschlagung der Probenflüssigkeit erfolgen. Insbesondere kann die Membran aus einem vliesartigen Material bestehen, und insbesondere aus Nitrozellulose.
Es kann bevorzugt sein, die Membran mit einem weiteren
Material, beispielsweise Watte zu verbinden, das die Kapazität für die Kapillarität, d.h. die Saugleistung erhöht. Es ist besonders bevorzugt, die Membran in Form von mindestens einem Streifen in der Kavität zu positionieren, insbesondere in einer zueinander parallelen Positionierung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Membranen oder Streifen mit Testreagenzien gespottet,
bedruckt, oder die Testreagenzien werden berührend
aufgetragen . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Testreagenzien in Form von Streifen, Quadraten oder
Rechtecken, Kreisen, Zahlen oder Buchstaben, oder Symbolen aufgebracht. Besonders bevorzugt ist weiterhin, andere
schwarz-weisse, graue oder farbige Symbole vorab ohne
Testreagenz aufzubringen, so dass beispielsweise aus einem vorab aufgebrachten „-" Zeichen ein „+"-Zeichen wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das
Testreagenz als Streifen auf der Membran aufgebracht, der von einer Kante der Membran bis zur anderen reicht. Besonders bevorzugt ist die Membran streifenförmig, und die Streifen
Testreagenz reichen von einer Längskante des Membranstreifens bis zur gegenüberliegenden Längskante.
In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich auf der ersten Oberfläche eine zweite Kavität die unabhängig von der gebildeten Kavität an der zweiten Oberfläche ist, in die mindestens ein mikrofluidischer Kanal münden kann, der diese zweite Kavität mit einem Reservoir oder mit dem Außenraum verbindet .
Die zweite Kavität kann unterschiedlich ausgestaltet sein, ohne dass das erfindungsgemäße Verfahren beeinträchtigt wird. Insbesondere kann es bevorzugt sein, mikrofluidische Kanäle in der zweiten Kavität münden zu lassen, die mit einem Reservoir oder der äußeren Umgebung verbunden sind.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform befindet sich kein Testreagenz am Durchtrittspunkt auf der ersten
Oberfläche. Erfindungsgemäß liegt ein solcher Durchtrittspunkt auf der ersten Oberfläche dem ersten Benetzungspunkt auf der zweiten Oberfläche gegenüber. Sobald der Tropfen den Benetzungspunkt der zweiten Oberfläche berührt, breitet sich die Probenflüssigkeit durch Kapillarkraft und/oder Druck weiter auf der Membran aus, und erreicht mindestens einen Nachweisplatz mit Testreagenz, der auf einem genannten, abgedeckten Teilbereich der Membran liegen kann. Bei dieser Ausführungsform trägt die Membran auf der ersten Oberfläche nicht nur das Testreagenz, sondern hindert auch größere partikuläre Bestandteile der Probenflüssigkeit daran, das Testreagenz zu berühren. Diese Ausführungsform erlaubt vorteilhaft, dass größere
Bestandteile in einer Probenflüssigkeit, wie z.B. Erythrozyten einer Vollblutprobe, nicht mit den Testfeldern wechselwirken können .
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls solche
Ausführungsformen, in denen auf der ersten Oberfläche der Durchtrittspunkt von Testreagenzien frei ist.
In einer weiteren Ausführungsform sind mindestens zwei, insbesondere mindestens zehn Nachweisplätze an voneinander getrennten Stellen auf der ersten Oberfläche platziert. Ein Teil der Plätze kann auch für Kontrollbestimmungen vorgesehen sein. Bevorzugt ist, verschiedene Nachweise, insbesondere verschiedene Allergene oder
Nahrungsmittelunverträglichkeitssubstanzen, auf verschiedenen Nachweisplätzen durchzuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform münden mindestens zwei Probenkanäle mit je einer Aufweitung in die Mündungsfläche, und mindestens zwei dieser Probenkanäle sind über mindestens eine Verzweigung mit mindestens einem gemeinsamen Reservoir oder einer gemeinsamen Befüllöffnung verbunden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist
mindestens ein Probenkanal endständig vor der Aufweitung eine Verengung oder Drossel auf, die den Fließwiderstand erhöht, der nach Hagen-Poiseuille durch Verringerung und/oder Veränderung der Form der Querschnittsfläche des Probenkanals erreicht werden kann. Bevorzugt ist eine Verringerung der Querschnittsfläche um mehr als 1%, insbesondere mehr als 10%, insbesondere von mehr als 30%. Besonders bevorzugt ist eine Änderung eines eckigen Querschnitts von 0,5 * 1 mm zu rundem Durchmesser von 0,5 mm. Der Querschnitt der Drossel kann von dem des Probenkanals abweichen und quadratische, runde, oder unregelmäßige Querschnitte aufweisen. Es kann bevorzugt sein, den Querschnitt über die Länge der Drossel in Form oder Größe zu variieren. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Drossel nicht gerade, sondern ist in ihrem Verlauf geknickt oder mäandrierend.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die Verengung des jeweiligen Probenkanals auf einer Länge von 1 cm bis 0,5 mm.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verengung in Form einer Stufe.
Es kann bevorzugt sein, das der Probenkanal senkrecht vom ersten Probenkanal abweicht, oder in einem Winkel von 40 bis 120 Grad bezüglich der Längsachse des ersten Probenkanals.
In einer bevorzugten Ausführungsform entstammen ein oder mehrere Probenkanäle aus einem ersten Probenkanal, wobei der Übergang vom ersten Probenkanal zu dem mindestens einen nachfolgenden Probenkanal eine Reduktion des Querschnitts aufweist, die auch die Funktion einer Drossel aufweist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform entstammen ein oder mehrere, insbesondere vier Probenkanäle in gekreuzter Form aus einem ersten Probenkanal.
In einer bevorzugten Ausführungsform entstammen mindestens zwei, insbesondere alle Mündungen der Probenkanäle einem gemeinsamen Befüllstutzen . In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Querschnitte der Probenkanäle unterschiedlich und derart ausgelegt, dass unterschiedliche Laufwiderstände der Probenkanäle ausgeglichen werden. Damit wird erreicht, dass die unterschiedlichen Proben zu gleicher Zeit und in gleichen Mengen in die Aufweitung fließen, auch wenn die Längen der Kanäle oder die Anzahl der Knicke oder Biegungen pro Probenkanal unterschiedlich sind. Folglich ist die Größe von Tropfen, die in unterschiedlichen Aufweitungen entstehen, bei dieser Ausführungsform annähernd gleich.
In einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Verengung in Form einer siebartigen Struktur erstellt werden, die im Wesentlichen quer zur Längsachse des Probenkanals positioniert ist. Die Durchmesser der einzelnen Sieböffnungen können unterschiedlich sein, ihre Anordnung unregelmäßig.
Besonders bevorzugt ist eine quadratische oder hexagonale Anordnung der Sieböffnungen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Sieböffnungen zum Rand hin größer, um das laminare Strömungsprofil im Probenkanal abzuflachen. Es kann ferner bevorzugt sein, bei zwei oder mehr
Probenkanälen die Durchmesser der Verengungen so zu variieren, dass verschiedene Probenkanäle ungeachtet ihrer
unterschiedlichen Länge gleiche Strömungswiderstände
aufweisen . Diese Verengung oder Reduzierung des Durchmessers entlang des jeweiligen Probenkanals erlaubt eine optimale homogene
Verteilung der Einzelproben aus einer Gesamtprobe, da eine Drosselung entlang des Strömungsgradienten erreicht wird und auf diese Weise eine gleichzeitige Tropfenbildung am Auslass des Probenkanals an der Membran zu einer optimalem Benetzung führt. Werden die Probenkanäle von einer gemeinsamen
Befüllöffnung her mit Probenflüssigkeit gefüllt, füllen sich zunächst die Probenkanäle gleichzeitig. Bei Erreichen einer Verengung stoppt die Probenflüssigkeit zunächst und die anderen Probenkanäle befüllen sich weiter, bis bei allen die Verengung erreicht ist. Erst dann dringt die Probenflüssigkeit durch die Engstellen in die Aufweitungen vor und bildet dort jeweils einen Tropfen.
Hierbei ist die Benetzung mittels eines nach oben radial geöffneten Tellers besonders geeignet, da ein solcher Teller die Bildung eines Tropfens unterstützt. Der Tropfen dient der Überwindung des Abstandes zwischen dem Probenkanal und der Membran und ist abhängig von dem Durchmesser der
Auslassmündung aus dem Kanal. D.h. die Tellerform führt zu einer starken Vergrößerung der Tropfenform und führt dazu, dass die Probe an der Benetzungsstelle in Kontakt mit dem Membranmaterial gebracht wird. Nachfolgend übernimmt die
Membran eine saugende Rolle, bei der nach Kontaktaufnahme mit der Probe die Membran bis zur Absättigung passiv Probe
aufnimmt .
In einer weiteren Ausführungsform kann ein jeder Probenkanal unabhängig voneinander gedrosselt sein. Eine solche Drosselung kann beispielsweise durch ein Ventil erfolgen, oder einfach mittels eines Stauraumes, wobei ein erster Probenkanal einen 40 - 120 Grad Winkel aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens zwei Testreagenzien derart angeordnet, dass sie sternförmig mit gleichen oder unterschiedlichen Abständen oder Winkeln um einen Benetzungspunkt auf der ersten Oberfläche oder der Membran angelegt sind, so dass in gerader Verbindungslinie zwischen einem fixierten Testreagenz und dem Benetzungspunkt sich keine weitere fixierte Testreagenz befindet. Diese
Anordnung vermeidet, dass die Probenflüssigkeit über
verschiedene Nachweisplätze läuft und die Daten dieser
Nachweisplätze sich beeinflussen, etwa durch kreuzreaktive Antikörper aus den Proben.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind mehrere Membranen, insbesondere streifenförmige Membranen parallel angeordnet, und die zweite Kavität besteht aus einer oder mehreren parallelen Teilkavitäten . Insbesondere kann eine zweite
Kavität so bemessen sein, dass sie sich über mehrere,
bevorzugt alle Nachweisplätze eines Membranstreifens
erstreckt. Bevorzugt ist ferner, dass die zweite Kavität sich ähnlich weit über einen Membranstreifen erstreckt. Ferner ist bevorzugt, dass der Membranstreifen erste und zweite Kavität vollständig voneinander trennt und keine Probenflüssigkeit von der ersten in die zweite Kavität gelangen kann, ohne durch die Membran hindurchzutreten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die zweite Kavität mit einem Befüllstutzen verbunden, durch den
Testreagenzien oder Waschlösungen mit einer Spritze,
Wassersäule, Pumpe oder anderen Vorrichtungen zur
Druckerzeugung in die zweite Kavität gefüllt werden können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist diese Kavität mit einer Ausgangsöffnung oder mit einem Abfallbehälter verbunden, so dass Luft und überschüssige Flüssigkeit aus der zweiten Kavität entweichen kann. Bevorzugt sind zur zweiten Kavität weitere Kavitäten oder Teilkavitäten mit gemeinsamen Befüllstutzen oder Abfallbehältern miteinander verbunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist über mindestens einem fixierten Testreagenz mindestens eine Linse angeordnet, so dass das menschliche Auge auch kleinere Nachweisplätze gut erkennen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Testreagenz lyophilisiert und / oder kovalent oder nicht kovalent an die erste Oberfläche oder Membran gekoppelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Porengröße der ersten Oberfläche oder Membran so bemessen, dass Proteine die Poren passieren können, Erythrozyten oder weiße Blutkörperchen jedoch nicht. Insbesondere ist eine Porengröße von kleiner 0,8 um bevorzugt, ganz besonders kleiner 0,2 um. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Testverfahren einen Bindungsassay . Dabei können beispielsweise Bindung zwischen Peptiden und/oder Proteinen oder DNA-, RNA- oder PNA-Hybridisierung, Antiköper-Antigen-Bindung, Aptamer- Target Bindung, Primär- Sekundärantikörper Wechselwirkung, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung oder Kombination davon
verwendet werden. Besonders bevorzugt ist ein Bindungsassay, bei dem ein Antigen auf der ersten Oberfläche fixiert ist, die Probenflüssigkeit antigenspezifische IgE enthält, und ein Anti-IgE Antikörper hinzugegeben wird, der eine enzymatische, fluoreszente, lumineszente oder farbige Markierung trägt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Testsystem bestehen aus einer ersten Oberfläche und zweiten Oberfläche, wobei a. mindestens ein Testreagenz auf einer ersten Oberfläche fixiert ist, und rückseitig eine zweite Oberfläche ausgebildet ist, b. wobei der Probenkanal in eine Mündungsfläche mündet, die der zweiten Oberfläche gegenüberliegt, wobei die zweite Oberfläche mindestens in einem Bereich benetzbar ist, der der Mündung gegenüberliegt, c. wobei der Probenkanal endständig zur zweiten Oberfläche hin aufgeweitet ist, wobei der Mündungsrand der Aufweitung einen Abstand zur zweiten Oberfläche von 0,001 mm bis 15 mm, insbesondere von 0,01 mm bis 2 mm, insbesondere 0,04 bis 0,4 mm aufweist und die erste und zweite Oberfläche, jeweils unabhängig
voneinander eine Kavität ausbildet.
Das Testsystem kann durch vorstehende Merkmale entsprechend ausgebildet sein, auch wenn diese Merkmale im Bezug zum erfindungsgemäßen Verfahren stehen. Weitere Ausführungen sind in den Ansprüchen und Figuren dargelegt. Beispiele und Figuren:
Diese Beispiele dienen ausschließlich zur Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu
beschränken . Beispiel 1:
A) Blutabnahme lOOμl periphäres Blut, oder Serum oder
heparinisiertes Vollblut
B) Mischen der Probe mit der Nachweislösung
C) Eingeben der Lösung in das Testgehäuse, die
Nachweisfelder werden von ersten Oberfläche her homogen durchfeuchtet
D) 5 Minuten Inkubation
E) Über die Rückseite der nachweistragenden ersten
Oberfläche wird 3x mit je 1 ml Waschflüssigkeit
gewaschen, zwischen den Waschschritten sind je 1 ml Inkubationszeit .
F) Eingabe des Substrats über die Rückseite der Membran, 5 Minuten Inkubation
G) Abstoppen der Reaktion durch Eingabe von Stopplösung über die Rückseite der Membran
H) Visuelles Auslesen der Nachweisfelder Beschreibung der Figuren:
Figur 1 (a) zeigt eine mögliche Anordnung bestehend aus einer zweiten Kavität (1), Membran (2), Aufweitung (3), Oberfläche der Aufweitung (4) , Verengung oder Drossel (5), Substrat (6), Nachweisplatz mit Testreagenz (7) und Probenkanal (8) und Mündungsfläche (9) Figur 1 (b) zeigt, dass bei nicht an der Mündungsfläche (9) anliegender oder schräg liegender Membran die Anordnung eine nahezu gleichförmige Benetzung gewährleistet (Schräglage der Membran in der Zeichnung ist zur Verdeutlichung übertrieben) . Figur 2 zeigt den erfindungsgemäßen Benetzungsvorgang. Die
Blockpfeile am unteren Bildrand geben die Ausbreitungsrichtung des Drucks in der Flüssigkeit an. (Links) Die
Probenflüssigkeit tritt aus der Drossel aus und bildet einen Tropfen in der Aufweitung (Mitte) Der Tropfen wächst und berührt die Membran im Benetzungspunkt (1) (Rechts) Die
Probenflüssigkeit breitet sich in der Membran aus, in Richtung (2) der Nachweisplätze.
Figur 3 zeigt im Längsschnitt unterschiedliche Formen der Verengung oder Drossel. Die Aufweitungen sind jeweils als Trapeze dargestellt. Ganz rechts eine trompetenförmige
Aufweitung .
Figur 4 (a) zeigt die Verteilung der Probenflüssigkeit in den Probenkanälen, die aus einem gemeinsamen Befüllstutzen (2) kreuzförmig zu der Drossel (1) und den sich anschließenden Aufweitungen geleitet wird.
Figur 4 (b) zeigt schematisch die Ebene der Zufuhr der
Waschlösung über den gemeinsamen Befüllstutzen (1); mit den zweiten Kavitäten (2), in denen die Membranen liegen; den angedeuteten Aufweitungen (3) an der Unterseite der Membran (zweite Oberfläche) samt den Nachweisplätzen (4) eines
Abfallbehälters (5) .

Claims

Patentansprüche
1. Testverfahren, wobei: a. mindestens ein Testreagenz auf einer ersten Oberfläche fixiert ist, und rückseitig eine zweite
Oberfläche ausgebildet ist, b. mindestens eine Probenflüssigkeit in einem Probenkanal geführt wird, wobei der Probenkanal in eine Mündungsfläche mündet, die der zweiten
Oberfläche gegenüberliegt, wobei die zweite
Oberfläche mindestens in einem Bereich benetzbar ist, der der Mündung gegenüberliegt, c. und die Probenflüssigkeit durch
Druckbeaufschlagung des Probenkanals aus seiner Mündungsöffnung austritt und einen an der
Mündungsfläche haftenden Tropfen bildet, d. wobei ein Kontakt zwischen Tropfen und einem Benetzungspunkt auf der zweiten Oberfläche erzeugt wird, indem der Tropfen durch die
Druckbeaufschlagung des Probenkanals so vergrößert wird, dass der Tropfen den Benetzungspunkt
berührt, e. die Probenflüssigkeit durch die genannte Berührung des Benetzungspunkts direkt oder durch
Kapillarwirkung der ersten Oberfläche und/oder
Druckbeaufschlagung des Probenkanals von der zweiten Oberfläche in Richtung der ersten Oberfläche eindringt oder bis zur ersten Oberfläche durchtritt und mit dem Testreagenz reagiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenkanal derart gestaltet ist, dass er sich endständig zur Mündungsfläche hin aufweitet, und dass der Tropfen die Aufweitung zumindest teilweise benetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mündungsfläche zumindest an der Position am Mündungsrand der Aufweitung einen Abstand zur zweiten Oberfläche von 0,001 mm bis 15 mm, insbesondere von 0,01 mm bis 2 mm, insbesondere 0,04 bis 0,4 mm aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Oberfläche an mindestens einem Mündungsrand der Aufweitung abschließt oder zumindest teilweise auf der Aufweitung oder neben der Aufweitung aufliegt und / oder ein Zwischenraum von der zweiten Oberfläche zum Mündungsrand der Aufweitung ausgebildet ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kavität ausgebildet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die mündungsseitige
Aufweitung mindestens eines der Probenkanäle konisch oder konkav, insbesondere halbkugelig, in Form eines Tellers oder einer Kugelkappe ausgebildet ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiterer
Kanal, ggfs. mindestens ein weiteres Reagenz,
insbesondere eine Waschlösung oder eine Stopplösung zugeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste und / oder zweite Oberfläche aus einer gelartigen, porösen, siebartigen, permeablen oder semipermeablen Membran, Dialysemembran, insbesondere einer beschichteten oder unbeschichteten Nitrozellulose-Membran besteht.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass der Durchtrittspunkt auf der ersten Oberfläche frei von Testreagenz ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste und zweite
Oberfläche jeweils eine voneinander unabhängige Kavität ausbilden .
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Probenkanal endständig vor der Aufweitung eine Verengung oder Drossel aufweist .
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei mindestens eine
Verengung eine Verringerung der Querschnittsfläche um mehr als 1%, insbesondere mehr als 10%, insbesondere von mehr als 30% aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Probenkanäle aus einem ersten Probenkanal entstammen, wobei der erste Probenkanal eine Drosselung aufweist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, dass zwei oder mehr Probenkanälen die Durchmesser der Verengungen variieren, so dass
verschiedene Probenkanäle ungeachtet ihrer
unterschiedlichen Länge gleiche Strömungswiderstände aufweisen .
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere
Probenkanäle in gekreuzter Form aus einem ersten
Probenkanal entstammen.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dass mindestens zwei Testreagenzien derart angeordnet sind, dass sie sternförmig mit gleichen oder unterschiedlichen Abständen oder Winkeln um eine Mündung mindestens eines Probenkanals auf der ersten Oberfläche oder der Membran angelegt sind, so dass in gerader Verbindungslinie zwischen einem fixierten Testreagenz und der Mündung sich keine weitere fixierte Testreagenz befindet.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das Testverfahren einen
Bindungsassay beinhaltet.
18. Testsystem bestehend aus einer ersten Oberfläche und
zweiten Oberfläche, dadurch gekennzeichnet,
dass a. mindestens ein Testreagenz auf einer ersten
Oberfläche fixiert ist, und rückseitig eine zweite Oberfläche ausgebildet ist, b. wobei der Probenkanal in eine Mündungsfläche
mündet, die der zweiten Oberfläche gegenüberliegt, wobei die zweite Oberfläche mindestens in einem
Bereich benetzbar ist, der der Mündung gegenüberliegt, c. wobei der Probenkanal endständig zur zweiten
Oberfläche hin aufgeweitet ist, wobei der Mündungsrand der Aufweitung einen Abstand zur zweiten Oberfläche von 0,001 mm bis 15 mm, insbesondere von 0,01 mm bis 2 mm, insbesondere 0,04 bis 0,4 mm aufweist und die erste und zweite Oberfläche, jeweils unabhängig voneinander eine Kavität ausbildet.
19. Testsystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Probenkanal endständig vor der Aufweitung eine Verengung oder Drossel aufweist.
20. Testsystem nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, dass die mündungsseitige Aufweitung mindestens eines der Probenkanäle konisch oder konkav, insbesondere halbkugelig, in Form eines Tellers oder einer Kugelkappe ausgebildet ist.
21. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Aufweitung am
Mündungsrand einen Durchmesser zwischen 0,015 und 15 mm, insbesondere zwischen 0,1 und 6 mm, insbesondere zwischen 1 und 4 mm aufweist.
22. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Aufweitung eine Tiefe, von 0,001 mm bis 2 mm, insbesondere zwischen 0,01 und 1 mm aufweist.
23. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass der Durchtrittspunkt auf der ersten Oberfläche frei von Testreagenz ist.
24. Testsystem nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem ein
Bindungsassay ist, insbesondere geeignet für Blutproben.
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