WO2011031187A1 - Антимикробные средства на основе производных гемина - Google Patents

Антимикробные средства на основе производных гемина Download PDF

Info

Publication number
WO2011031187A1
WO2011031187A1 PCT/RU2010/000488 RU2010000488W WO2011031187A1 WO 2011031187 A1 WO2011031187 A1 WO 2011031187A1 RU 2010000488 W RU2010000488 W RU 2010000488W WO 2011031187 A1 WO2011031187 A1 WO 2011031187A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
arg
leu
nhch
argome
trp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2010/000488
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Евгеньевич НЕБОЛЬСИН
Галина Александровна ЖЕЛТУХИНА
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmenterprises OOO
Original Assignee
Pharmenterprises OOO
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to UAA201204487A priority Critical patent/UA108480C2/ru
Priority to US13/395,149 priority patent/US8906897B2/en
Priority to PL10815682T priority patent/PL2476701T3/pl
Priority to EP10815682.9A priority patent/EP2476701B8/en
Priority to CN201080048604.3A priority patent/CN102906110B/zh
Priority to EA201270405A priority patent/EA020802B1/ru
Application filed by Pharmenterprises OOO filed Critical Pharmenterprises OOO
Priority to IN2980DEN2012 priority patent/IN2012DN02980A/en
Priority to DK10815682.9T priority patent/DK2476701T3/en
Priority to ES10815682.9T priority patent/ES2527432T3/es
Priority to HK13106895.8A priority patent/HK1179278B/xx
Publication of WO2011031187A1 publication Critical patent/WO2011031187A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/02—Iron compounds
    • C07F15/025—Iron compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to the field of bioorganic chemistry and is directed to the development of new antimicrobial agents and compositions based on hemin derivatives, as well as to obtain new hemin derivatives.
  • Bacteria cause epidemic diseases such as cholera, typhoid, paratyphoid, plague, diphtheria, tularemia, brucellosis, as well as tuberculosis, blood poisoning (sepsis), leprosy, syphilis, etc.
  • bacteria cause glanders, anthrax, tuberculosis and etc.
  • Fungal diseases mainly affect the skin and mucous membranes and are, in particular, keratomycoses, microsporia, trichophytosis, cryptococcosis, etc.
  • antimicrobial agents such as antibacterial agents (including antibiotics) and antifungal agents.
  • antibacterial agents including antibiotics
  • antifungal agents many known agents have a number of disadvantages, such as toxicity, sensitivity to the action of proteolytic enzymes, hemolytic effect, insufficient breadth of antimicrobial action.
  • bacteria quickly develop resistance to existing antimicrobial agents, mainly antibiotics. Therefore, the problem of finding new non-toxic, biocompatible antimicrobial agents, the use of which would not lead to resistance, is very relevant.
  • hemin has antimicrobial activity against Staphylococcus aureus [Y. Nitzan, N. Ladan, S. Gozansky, Z. Malik. Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus // FEMS Microbiol. Lett., 1987, V. 48 (3), p. 401-406].
  • the use of hemin as an antibacterial agent is difficult due to its insolubility in water, hemolytic activity, and short duration antibacterial effect.
  • nuclease (nucleolytic) activity was established, manifested in the ability to destroy plasmid DNA [patent RU ⁇ 2250906, 04/27/2005; Zheltukhina G.A., Lobanova T.N., Nebolsin V.E., M.O. Gallyamov, Dranitsyna SM., Kostanyan I.A. // Bioorgan, chemistry. 2006. T. 32, S. 198-210].
  • linear gramicidin D which is a mixture of peptides of the formula (II):
  • Compound II is effective against gram-positive bacteria [W. E.
  • Compound III is mainly effective against gram-positive bacteria at concentrations of 5-15 ⁇ M [Jingbo Xiao, Bernard Weisblum, and Peter Wipf. Electrostatic versus Steric Effects in Peptidomimicry: Synthesis and Secondary Structure Analysis of Gramicidin S Analogues with (E) - Alkene Peptide Isosteres // J. Am. Chem. Soc, 2005, 127 (16), pp 5742-5743]. Compounds II and III are used in medical practice for external use only.
  • antimicrobial peptides are obtained mainly by the solid-phase method, which makes these substances extremely expensive, and their use is not economically feasible. Therefore, the search for shorter analogues of AMP and their derivatives, including conjugates with compounds of other classes, is very relevant.
  • the present invention relates to the use of hemin derivatives of the general formula (I)
  • Ri and R 2 are the same or different, provided that both R ⁇ and R 2 simultaneously do not represent -OH, while
  • R are both -ArgOMe, -SerOMe, -PAlaHA, -
  • PAlaHis -NHCH 2 CH 2 OH, -GlyOMe, -NHCH (CH 2 OH) CH 2 OH, NHCH 2 CH (OH) CH 2 OH, -Glu (ArgOMe) - ArgOM
  • Me p + represents Fe 2+ or Fe 3+ ;
  • the invention also relates to an antimicrobial, including antibacterial and / or antifungal agent based on the above compounds of formula (I) and the corresponding pharmaceutical, antiseptic and / or disinfectant compositions, as well as a method for the treatment and / or prevention of diseases caused by microorganisms.
  • the invention also relates to new derivatives of hemin of the formula (I)
  • R] and R 2 are the same or different, provided that both R] and R 2 simultaneously do not represent —OH,
  • Ri and R 2 both represent —NHCH 2 CH 2 OH, —GlyOMe, —NCHCH (CH 2 OH) CH 2 OH, —NHCH 2 CH (OH) CH 2 OH, —Glu (ArgOMe) —ArgOMe, —HA or -Arg-ArgOMe,
  • Me p + represents Fe 2+ or Fe 3+ ;
  • Figure 1 shows graphs reflecting the dynamics of the release of carboxyfluorescein from model liposomes under the action of hemin derivatives.
  • Figure 2 shows the dependence of hemolytic activity (estimated by the intensity of the output of hemoglobin from red blood cells) on the concentration of hemin derivatives.
  • the inventors of the present invention unexpectedly found that the compounds of the above formula (I), which are conjugates of hemin with peptides, amino acids or their analogs, are promising antimicrobial agents.
  • hemin derivatives of formula (I) are their biocompatibility and biodegradability, low toxicity to normal human cells and the absence of a hemolytic effect, as well as high antibacterial efficacy, including against resistant strains, in combination with antifungal activity.
  • Ri and R 2 are the same or different, provided that both Ri and R 2 at the same time do not represent -OH, while
  • R or one of R] and R 2 is —OH, and the other is —ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu (OMe) OH,
  • Ri and R 2 are both -ArgOMe, -SerOMe, -PAlaHA, -pAlaHis, -NHCH 2 CH 2 OH, -GlyOMe, -NHCH (CH 2 OH) CH 2 OH, NHCH 2 CH (OH) CH 2 OH , -Glu (ArgOMe) - ArgOM -HA or -Arg- ArgOMe,
  • Me p + represents Fe 2+ or Fe 3+ ;
  • Antimicrobial activity includes both antibacterial and antifungal activity.
  • the above compounds of formula (I) are active against gram-positive bacteria, such as bacteria of the genus Staphylococcus (e.g., Staphylococcus aureus), Bacillus (e.g., Bacillus subtilis), Enterococcus (e.g. Enterococcus faecalis) and Micrococcus (e.g. Micrococcus luteus), including resistant ones, i.e. possessing resistance to the action of known antibacterial agents.
  • these bacteria belong to the strains of Bacillus subtilis VKM B-501, Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis VKM B-871 or Micrococcus luteus VKM Ac-2230.
  • these compounds exhibit antibacterial activity against resistant strains of Staphylococcus aureus 25923 ATCC, Staphylococcus aureus N ° 100 KS, Staphylococcus epidermidis 533, Enterococcus faecalis N ° 559 or Enterococcus faecium N ° 569.
  • the above compounds of formula (I) are active against microscopic fungi of Cryptococcus (in particular, Cryptococcus neoformans, preferably a strain of Cryptococcus neoformans N ° 465), as well as Candida (in particular, Candida albicans, preferably a strain of Candida albicans N ° 927) .
  • Cryptococcus in particular, Cryptococcus neoformans, preferably a strain of Cryptococcus neoformans N ° 465
  • Candida in particular, Candida albicans, preferably a strain of Candida albicans N ° 927) .
  • the compounds of formula (I) can exist as isomers, as well as mixtures of isomers that are fully within the scope of the claimed invention. For example, upon modification of one of the two carboxyl groups of hemin, a mixture of (6), (7) derivatives can form.
  • the compounds of formula (I) can be used both in the form of salts with pharmaceutically acceptable acids, for example, lactic, tartaric, citric, hydrochloric, etc., and in the form of salts of carboxyl groups with alkali and alkaline earth metal ions, such as sodium, potassium , calcium, or, for example, with pharmaceutically acceptable bases, such as ammonia, ethanolamine.
  • pharmaceutically acceptable acids for example, lactic, tartaric, citric, hydrochloric, etc.
  • alkali and alkaline earth metal ions such as sodium, potassium , calcium
  • pharmaceutically acceptable bases such as ammonia, ethanolamine.
  • the above compounds of formula (I) and / or their salts can be used as active ingredients in pharmaceutical compositions (for example, in solid, semi-solid or liquid forms) in admixture with an organic or inorganic carrier or excipient.
  • the active ingredient may be included in the composition along with commonly used non-toxic, pharmaceutically acceptable carriers suitable for the manufacture of solutions, tablets, pills, capsules, suppositories, emulsions, suspensions, sprays, inhalers, drops, ointments and any other dosage forms.
  • carriers water, glucose, lactose, gum arabic, gelatin, starch, magnesium trixylite, talc, corn starch, urea, polyethylene glycol and other carriers suitable for the manufacture of solid, soft or liquid preparations can be used.
  • stabilizers, thickeners, colorants and perfumes can be used as additives.
  • the compound of formula I is introduced into the composition in an amount sufficient to obtain an antimicrobial effect.
  • the amount of active ingredient used in combination with a carrier may vary depending on the recipient being treated, on the particular method of drug administration.
  • the content of the active principle in them is 0.001-1 mass%.
  • a diluent of the substance 0.9% sodium chloride solution, distilled water, novocaine solution for injection, Ringer's solution, glucose solution can be used.
  • the compounds of general formula (I) in the form of tablets and suppositories the amount of the substance is 1.0-100.0 mg per unit dosage form.
  • any pharmaceutically acceptable base is used as a pharmaceutical excipient.
  • the compounds of general formula (I) are both water soluble and lipophilic, they can be used in the form of aqueous solutions, alcohol solutions, ointments, creams, etc.
  • the invention further relates to an antimicrobial drug based on the above compounds of formula (I), as well as to a method for treating diseases caused by the above bacteria and / or microscopic fungi, comprising administering to the patient in need of the above compound of formula (I) or a pharmaceutical compositions based on it.
  • the method is intended for the treatment of mammalian patients, including humans.
  • Recommended doses of the compound of formula (I) are 0.01-10 mg / kg.
  • the compounds of formula (I) have antibacterial and antifungal activity, they can also be used as or as part of antiseptic and / or disinfectants.
  • Such agents can be made, for example, in the form of solutions using various solvents, such as water and lower alcohols (for example, 1-propanol or 2-propanol).
  • Ri and R 2 are the same or different, provided that both R] and R 2 simultaneously do not represent —OH,
  • R] and R 2 are —OH, and the other is —Val-Gly-Ala- (D-Leu) -Ala- (D-Val) -Val- (D-Val) -Trp- (D-Leu) -X-
  • Ri and R 2 are both —NHCH 2 CH 2 OH, —GlyOMe, -
  • HA is a histamine residue
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing the above new compounds of formula (I).
  • the compounds of formula (I) are prepared by reacting a hemin derivative activated at the carboxyl group (s) with an amino component.
  • amino groups of amino components are acylated with hemin bis-K-oxysuccinimide ester; or, upon preparation of hemin mono derivatives, 6 (7) -MOHO-N-OKCH-5-norbornene-2,3-dicarboxyimide hemin ester; or a hemin derivative activated on one carboxyl group, and di-tert-butyl pyrocarbonate in the presence of pyridine is used as an activating agent. Reactions are carried out in DMF for 0.5-2 hours, at a temperature of from -15 ° to + 30 ° C.
  • IR spectra were recorded on a Fourier spectrometer: Magna 750 (Nicolet, USA).
  • Liposomes were prepared using an Avanti mini extruder (Avanti Polar Lipids, USA)
  • the peptidyl polymer was filtered off, washed with dichloroethane (2 min * 3), DMF (2 min x 2), isopropanol (2 min x 2), DMF (2 min x 2), isopropanol (2 min x 2), methanol (2 min x 1), diethyl ether (2 min ⁇ 2), dried on a water jet.
  • the degree of substitution of the resin was determined spectrophotometrically.
  • To 10 mg of the obtained Fmoc-Phe polymer 1 ml of a 20% solution of piperidine in DMF was added and stirred for 20 min at 25 ° C.
  • the resin was filtered off, an aliquot of the filtrate was taken, and the optical absorption of the solution of the resulting M- (9-fluorenylmethyl) piperidine was determined at 289 nm.
  • the degree of substitution of the resin was calculated by the formula:
  • c is the content of active groups in the polymer
  • a 289 is the optical density of the solution relative to the control
  • W (mg) is the mass of the polymer taken
  • 5800 is the molar absorption coefficient of (9-fluorenylmethyl) piperidine.
  • the content of Fmoc-Phe in the polymer was 0.3 mmol / g.
  • the peptidyl polymer was filtered, washed with dichloroethane (2 min 3), DMF (2 min 2), isopropanol (2 min 2), DMF (2 min ⁇ 2), isopropanol (2 min x 2), methanol (2 min ⁇ 1), diethyl ether (2 min ⁇ 2).
  • the volume of one portion of the washing solution is 2 ml.
  • the synthetic cycle includes: 1) 10-minute activation of the attached Fmoc amino acid (3 equivalents) with DIC (3 equivalents) and HOBt (3.6 equivalents) in 1 ml of DMF; 2) the release of ⁇ -amino groups by treatment with a 20% solution of piperidine in DMF (3 ml x 3) for 30 min; 3) washing the peptidylpolymer DMF (1.5 ml x 8, 3 min each); 4) additional washing of the peptidylpolymer with a solution of HOBt (3.6 equiv.) In 1.5 ml of DMF for 3 minutes; 5) condensation of the activated Fmoc amino acid (3 equiv.) With the peptidylpolymer within 24 hours; 6) washing the peptidylpolymer DMF (1.5 ml ⁇ 2, 2 min each); 7) control of the completeness of substitution of amino groups upon addition of another Fmoc- amino acids were carried out using the ninhydrin test; with a positive test result, the condensation stage
  • the heminpeptidyl polymer was washed with DCM (2 ml x 2, 2 min each), dried in a vacuum of a water-jet pump and 4.5 ml of a mixture of TFA-TFE-DCM (1: 1: 8) was added to it, stirred in a nitrogen atmosphere for 3 hours.
  • the polymer was separated , washed with a mixture of TFA-TFE-DCM (1: 1: 8) (1 ml x 4, 1 min).
  • the residue was triturated with chilled anhydrous diethyl ether (10-12-fold excess by volume), the precipitate was filtered off, washed with 2 ether, and dried in vacuo.
  • a 20 ml column was filled with swollen Sephadex, after which 60 ml of buffer containing 10 mM Tris, 10 mM MES, 100 mM KCl were equilibrated (buffer A).
  • the volume of the suspension of liposomes containing CF was 500 ⁇ l (lipid concentration 0.045 mg / ml).
  • the suspension was placed in a cuvette, the volume was adjusted to 2 ml with buffer A.
  • 10 ⁇ l of a 10 "4 M solution of hemin derivative of general formula I in DMSO was added to the obtained liposome suspension.
  • the dynamics of the yield of CF were controlled fluorimetrically.
  • F 0 and F f are the fluorescence levels before and after the addition of the peptide, respectively, and F m is the fluorescence value after complete destruction of the liposomes with Triton X-100 detergent added to a final concentration of 2.4% (by weight).
  • Figure 1 presents the dynamics of the release of carboxyfluorescein from liposomes under the action of hemin derivatives of the general formula I at a lipid / hemin derivative ratio of 10: 1 (mol / mol).
  • the main parameters that characterize antibacterial activity are the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC).
  • MIC is the lowest concentration of the test compound that completely inhibits the growth of bacteria in a liquid medium.
  • MMC is the lowest concentration that causes the death of all cells.
  • MICs were evaluated by inhibiting culture growth in a liquid medium with serial dilutions of substances according to a modified method [Amsterdam, D. 1996. Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media, pp.52-111. In Loman, V., ed. Antibiotics in laboratory medicine, 4th ed. Williams and Wilkins, Baltimore].
  • Bacteria were cultured and tested in liquid MH medium (Mueller-Hinton medium: dry extract of beef broth 4 g / l, starch 1, 5 g / l, casein hydrolyzate 17.5 g / l; Sigma-Fluka catalog number 70192) at 37 ° C, 100% humidity and stirring.
  • liquid MH medium Meeller-Hinton medium: dry extract of beef broth 4 g / l, starch 1, 5 g / l, casein hydrolyzate 17.5 g / l; Sigma-Fluka catalog number 70192
  • gramicidin D absorb light at a wavelength of 595 nm, used to evaluate the growth of a bacterial culture. Therefore, when evaluating the optical density of the bacterial suspension, the correction for the absorption of each compound was taken into account, taking into account its concentration in the well.
  • the growth inhibition (IR) of bacteria was calculated as a percentage after 20 hours of incubation of cells with substances according to the optical density (A) measured in each well at a wavelength of 595 nm, using the formula:
  • HPi [(A Kt - A k0 ) - (Ait - A i0 )] x 100 / (A Kt - A k0 ) (1), where the index i denotes the number of the hole, and k is the control well with bacteria into which the test compound not applied, 0 - measurement is carried out immediately after the test substance is introduced into the well, t - measurement 20 hours after the substance is added.
  • the morphological characteristics of the strain and the absence of contamination with foreign bacteria were checked (a) by plating on agar (15 g / l agar) MN medium according to the shape and color of the colonies formed, (b) under a microscope (Mikmed-2, LOMO, Russia) with a 40x objective characteristic morphological features of cells. Then the bacteria were cultured in 1 ml of liquid MH medium at a temperature of 37 ° C with stirring. Cells were reseeded every day. Starting from the 3rd and ending with the 6th reseeding, the cell culture was used to set up the tests.
  • the suspension was diluted with MH medium to 5x10 4 -1x 10 5 cells / ml and transferred into a sterile 96-well plate at 100 ⁇ l per well. Then, the studied compounds were introduced to the cells and serial double dilutions of these compounds were made in the wells of the plate.
  • the maximum concentration of substances in the series was 10 "4 M, the minimum was 1.6 x 10 " 6 M.
  • the study of antibacterial activity was performed in 2 repetitions for each compound, and the result was averaged.
  • MBC MBC was defined as the lowest concentration of the test compound at which the colonies on the Petri dish did not grow.
  • the compound has a bacteriostatic effect: it inhibits the reproduction of bacteria at a specified concentration, but does not kill them.
  • compounds VII, VIII and XVIII inhibit the growth of gram-positive bacteria S. aureus at concentrations up to 50 ⁇ M (table 2).
  • Enterococci E. faecalis on average, are more resistant to the action of these compounds than micrococci M. luteus and staphylococci S. fureus.
  • the most effective compound against E. faecalis was compound XVIII: MIC of 12.5 ⁇ M.
  • test drugs are hemin derivatives, soluble in water (VII, XVIII) and soluble in DMSO (VIII, XV, XIV). Vancomycin was taken as a comparison drug. Each substance was tested in triplicate.
  • Müller-Hinton broth for work was prepared from dry media (Mueller Hinton broth, Acumedia, Baltimore) and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes.
  • Staphylococcus aureus N ° 25923 ATCC American Type Culture Collection
  • Staphylococcus aureus N ° 100 KC Staphylococcus aureus N ° 100 KC
  • the bacterial inoculum was constant and amounted to 5 ⁇ 10 5 CFU / ml.
  • the results are presented in tables (Mer).
  • DMSO-soluble compounds For DMSO-soluble compounds from 2 to 8 wells, 10 ⁇ l of solvent (DMSO) was added, then 20 ⁇ l of stock solution of the test compound in water with a concentration of 5 ⁇ 10 M was added to 1 well and its concentration was adjusted twice to a concentration of 0.039 ⁇ 10 3 M 2 ⁇ l was taken from each well and 198 ⁇ l of bacterial culture (10 5 CFU) was added. As a control, wells that did not contain the tested drugs were included (culture growth control). In addition, purity of nutrient media and solvents was monitored. The plates were incubated in an incubator at 36 ° C for 24 hours.
  • hemin derivatives of the general formula I are active to varying degrees with respect to Gr + strains of resistant bacteria.
  • Fresh capillary blood of a person was used to study hemolytic activity.
  • the hemolysis efficiency was determined by the release of hemoglobin from red blood cells in RPMI-1640 medium (without phenol red, with the addition of 10% fetal calf serum and 20 mM L-glutamine) at an initial density of red blood cells (1, 0 ⁇ 0.1) x 10 7 cells / ml after 3 hours of incubation with the agent (37 ° C, 5% C0 2 , 100% humidity, mixing on an orbital shaker).
  • hemoglobin As a characteristic of hemolytic activity, the proportion of hemoglobin released from red blood cells into the environment was used. Red blood cells, shadows, and intermediate forms containing not released hemoglobin were separated by centrifugation. Hemoglobin was determined by the absorption of the supernatant at a wavelength of 414 nm (near the maximum of the Sorema heme band).
  • Br [(A ei - A ⁇ , eo ..MAmi - Amo ⁇ x lOO / CAet - Aeo) (2), where the index e denotes the supernatant of the sample with red blood cells, i is the added concentration of the compound, o is the supernatant of the sample without adding the studied compounds, m - solution without red blood cells, t - supernatant of the sample with 100% lysed red blood cells.
  • the proportion of hemoglobin released is equal to the fraction of lysed red blood cells, provided that the lysis occurs completely, that is, during lysis, all the hemoglobin contained in it is released from the red blood cell.
  • Blood 100 ⁇ l was taken from the finger of a healthy donor into a tube containing 0.9 ml of RPMI-1640 medium (without phenol red) and heparin (10 u / ml). Cells were besieged by centrifugation for 5 min at 200xg and transferred to 10 ml of RPMI-1640 medium (without phenol red, with the addition of 10% fetal calf serum and 20 mM L-glutamine, then complete medium). The density of red blood cells in the suspension was determined by counting in a Goryaev chamber using a Mikmed-2 microscope (LOMO, Russia) and diluted with complete medium to (2 ⁇ 0.2) ⁇ 10 cells / ml.
  • LOMO LOMO
  • a series of dilutions was used to prepare a series of solutions of the compounds in complete medium with a step of 2 times (maximum concentration 200 ⁇ M, minimum 1.6 ⁇ M, volume 75 ⁇ l). 75 ⁇ l of a suspension of red blood cells with a density of (2 ⁇ 0.2) 10 7 cells / ml was quickly added to the prepared solutions.
  • erythrocytes with a density of (2 ⁇ 0.2) ⁇ 10 7 cells / ml were added: a) 75 ⁇ l of complete medium (4 samples); b) 60 ⁇ l of complete medium and 15 ⁇ l of water (4 samples); or c) 73.5 ⁇ l of complete medium and 1.5 ⁇ l of DMSO (4 samples).
  • erythrocytes from 75 ⁇ l of the suspension were precipitated by centrifugation (5 min at 200xg), the pellet was resuspended in deionized water (50 ⁇ l), after complete lysis, the sample volume was brought to 150 ⁇ l with complete medium .
  • Compound XII does not exhibit hemolytic activity up to 100 ⁇ M.
  • Substances V, VI, VIII, IX, XVIII have low hemolytic activity (figure 2), and the hemolysis efficiency of all synthesized compounds is significantly lower than that of hemin, and is very low even at a maximum concentration of compounds (100 ⁇ M).
  • the total leukocyte fraction was isolated from human blood by free sedimentation, for which purpose freshly collected venous blood from a healthy donor was used.
  • the concentration of leukocytes and erythrocytes in the suspension was determined by counting in a Goryaev chamber, after which the suspension was adjusted with complete medium to a leukocyte concentration of (1,0,0 ⁇ 0,1) ⁇ 10 6 cells / ml. Moreover, the concentration of red blood cells in the suspension of blood cells used for measurements did not exceed 30% of the concentration of leukocytes.
  • test concentration range 3.2-100 ⁇ M for GrD compounds and gramicidin S 8-500 ⁇ M for compound XIII; 8-1000 ⁇ M for compounds V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XIV, XV, XIX and No
  • test concentration range 3.2-100 ⁇ M for GrD compounds and gramicidin S 8-500 ⁇ M for compound XIII; 8-1000 ⁇ M for compounds V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XIV, XV, XIX and No
  • test substances were prepared: water for compounds VII and X; DMSO aqueous solution for compound V, VI, VIII, IX; DMSO for GrD, Gramicidin S, Hem, XI, XIII, XIV, XV, XIX.
  • An additional control is a suspension of white blood cells without any additives.
  • the proportion of dead cells was determined by fluorescence images of cells in the blue (Hoechst 33342) and red (propidium iodide) spectral regions obtained using an Axio Observer fluorescence microscope (Zeiss, Germany) with a 10x objective (Plan-Neofluar 1 Ox / 0.3 )
  • the following sets of fluorescent filters were used.
  • propidium iodide a band-pass filter for excitation 530-585 nm; 600 nm barrier dichroic mirror, 615 nm long-wavelength barrier analysis filter.
  • Hoechst 33342 band pass filter for excitation 359-372 nm; 395 nm barrier dichroic mirror, 397 nm long-wave barrier analysis filter.
  • the objects of exposure were cells of the museum strain of Cryptococcus neoformans N ° 3465, as well as cells of the museum strain of Candida albicans N ° 927 grown on glucose-peptone-yeast medium at 32 ° C for 1 day.
  • Antimycotics pimafucin, amphotericin, fluconazole were used as a comparison compound.
  • compound XII was effective against one of the causative agents of cryptococcosis Cryptococcus humicolus with a MIC of 12.5 ⁇ M.
  • the compounds of general formula I exhibit fungistatic and / or fungicidal effects, the magnitude of which depends on the structure and manifests itself in the concentration range from 10 to 10 ⁇ 6 M.
  • Examples of dosage forms A Gelatin capsules
  • composition of the powder introduced into the capsule :
  • the above ingredients are mixed, and the mixture is introduced into hard gelatin capsules in an amount of 151-285 mg.
  • a tablet form is prepared using the following ingredients:
  • the components are mixed and pressed to form 200 mg tablets each.
  • composition of the aerosol mixture designed for 10 receptions:
  • the compound is mixed with fillers and placed in a special device for spraying.
  • Cocoa butter the amount required to obtain a suppository. If necessary, it is possible to produce rectal, vaginal and urethral suppositories with appropriate excipients.
  • hydrocarbon ointment bases white and yellow petrolatum (Vaselinum album, Vaselinum flavum), liquid paraffin (Oleum Vaselini), white and liquid ointment (Unguentum album, Unguentum flavum), and paraffin wax and wax as additives to give a denser consistency;
  • absorbent ointment bases hydrophilic petrolatum (Vaselinum hydrophylicum), lanolin (Lanolinum), cold cream (Unguentum leniens);
  • ointment bases washed off with water - hydrophilic ointment (Unguentum hydrophylum); water-soluble ointment bases - polyethylene glycol ointment (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), bentonite bases and others.
  • composition of the ointment is an example of the composition of the ointment:
  • composition of the solution for injection is a composition of the solution for injection:
  • compositions for disinfectants and antiseptics A.
  • Compound corresponding to general formula (I) 0.001-1% 1- propanol 30-40%
  • Quaternary ammonium base (or a mixture thereof) 2-10%
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • PEG polyethylene glycol
  • the hemin derivatives of the general formula (I) possess antibacterial and antifungal activity, including against S. aureus pathogenic for humans and its resistant strains.
  • almost all of the claimed hemin derivatives to varying degrees, have the ability to increase the permeability of model lipid membranes, which, as is known from the literature, is an important part of the mechanism of antimicrobial (antibacterial, antifungal) action of antimicrobial agents.
  • the effectiveness of the compounds corresponding to the general formula I confirms their suitability for industrial use in the composition of disinfectant, antiseptic and therapeutic agents with antifungal and antibacterial effects.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новым антимикробным, в том числе антибактериальным и противогрибковым, средствам и композициям на основе производных гемина общей формулы (I), а также к получению новых производных гемина. Преимуществами антибактериальных средств на основе прозводных гемина является их биосовместимость, биодеградируемость, высокая эффективность против резистентных бактерий и широко распространных и опасных для человека микроскопических грибов, отсутствие токсичности и побочных эффектов.

Description

АНТИМИКРОБНЫЕ СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ
ГЕМИНА
Область техники
Изобретение относится к области биоорганической химии и направлено на разработку новых антимикробных средств и композиций на основе производных гемина, а также на получение новых производных гемина.
Уровень техники
Как известно, многие опасные заболевания человека и животных вызываются микроорганизмами, такими как бактерии и микроскопические грибы. Бактерии вызывают такие заболевания эпидемического характера, как холера, брюшной тиф, паратифы, чума, дифтерия, туляремия, бруцеллёз, а также туберкулёз, заражение крови (сепсис), проказа, сифилис и др. У животных бактерии вызывают сап, сибирскую язву, туберкулёз и др. Грибковые заболевания главным образом поражают кожные покровы и слизистые оболочки и представляют собой, в частности, кератомикозы, микроспорию, трихофитию, криптококкоз и т.п.
Борьба с микроорганизмами основывается на применении антимикробных средств, таких как антибактериальные средства (а том числе антибиотики) и противогрибковые средства. Однако многие известные средства обладают рядом недостатков, такими как токсичность, чувствительность к действию протеолитических ферментов, гемолитический эффект, недостаточная широта антимикробного действия. В частности, у бактерий быстро развивается резистентность по отношению к существующим антимикробным средствам, главным образом к антибиотикам. Поэтому проблема поиска новых нетоксичных, биосовместимых антимикробных средств, применение которых не приводило бы к резистентности, весьма актуальна.
Известно, что гемин обладает антимикробной активностью в отношении золотистого стафилококка [Y. Nitzan, Н. Ladan, S. Gozansky, Z. Malik. Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus// FEMS Microbiol. Lett., 1987, V. 48 (3), p. 401-406]. Однако использование гемина в качестве антибактериального средства затруднено вследствие его нерастворимости в воде, гемолитической активности, а также кратковременности антибактериального эффекта.
Ранее предпринимались попытки модификации гемина путем его конъюгации с аминокислотами и пептидами с целью создания биологически активных производных. В результате модификации карбоксильных групп гемина путем получения соответствующих амидов были получены и исследованы соединения общей формулы (I), где Ri и R2, одинаковые или различные, представляют собой -ОН или остаток аминокислоты или пептида, причем Ri и R2 не могут одновременно обозначать -ОН.
Figure imgf000004_0001
Так, для некоторых пептидных производных гемина общей формулы (I), в частности, где один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH (соединение V) или ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH (соединение VI), установлена нуклеазная (нуклеолитическая) активность, проявляющаяся в способности разрушать плазмидную ДНК [патент RU Ш 2250906, 27.04.2005; Желтухина Г.А., Лобанова Т.Н., Небольсин В.Е., М.О. Галлямов, Драницына СМ., Костанян И.А. // Биоорган, химия. 2006. Т. 32, , С. 198-210].
Отдельные аминокислотные и пептидные производные гемина общей формулы (I), а именно те, у которых один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой
Figure imgf000004_0002
(соединение V), или Ri=R2=-ArgOMe (соединение VII), способны ингибировать протеиназу ВИЧ и оказывать, вследствие этого, противовирусное анти-ВИЧ действие [патент RU JVo 2238950, 27.10.2004]. Также показано, что некоторые производные гемина общей формулы (I), а именно те, у которых
Figure imgf000005_0001
(соединение X), Ri=R2=-ArgOMe (соединение VII), R^R^-PAlaHA (соединение IX, НА - остаток гистамина), или один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH (соединение V), или -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH (соединение VI), обладают противовирусной активностью [заявка RU 2007125604, 20.01.2009].
Однако антимикробная, в том числе антибактериальная и противогрибковая, активность указанных выше производных гемина не известна из уровня техники.
С другой стороны, в последнее время много внимания уделялось дизайну новых антимикробных агентов на основе антимикробных пептидов (АМП) [А. Giuliani, G. Pirri, S. F. Nicoletto. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics//Central European Journal of Biology, 2007, V. 2(1), p. 1-33].
Среди известных антимикробных пептидов можно назвать линейный грамицидин D, представляющий собой смесь пептидов формулы (II):
Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-T -(D-Leu)-X-(D-Leu)-T -(D-Leu)-
TrpNHCH2CH2OH (II)
где X = Тгр, Туг, Phe
[W. Е. Herrelland D.Heilman. Experimental and Clinical Studies on Gramicidin// J. Clin. Invest., 1941 , V.20, 583-591.], и циклический грамицидин S формулы (III):
Figure imgf000005_0002
(III)
[G. Nagamurthi and S. Rambhav. Gramicidin-S: Structure-activity relationship//.!. Biosci., 1985, V.7, 3-4, p.323-329].
Соединение II эффективно против грамположительных бактерий [W. Е.
Herrell and D. Heilman. Experimental and Clinical Studies on Gramicidin/AI. Clin. Invest., 1941 , V. 20, Ν° 583] и некоторых вирусов, в частности герпеса [US Patent 6001808, 1999]. Соединение III эффективно главным образом против грамположительных бактерий в концентрациях 5-15 мкМ [Jingbo Xiao, Bernard Weisblum, and Peter Wipf. Electrostatic versus Steric Effects in Peptidomimicry: Synthesis and Secondary Structure Analysis of Gramicidin S Analogues with (E)- Alkene Peptide Isosteres//J. Am. Chem. Soc, 2005, 127 (16), pp 5742-5743]. Соединения II и III используются в медицинской практике только для наружного применения. Недостатками этих антимикробных соединений являются их относительно большая длина и, соответственно, сравнительно высокая стоимость, недостаточная широта антибактериального, противогрибкового и антивирусного действия, а также побочные эффекты, проявляющиеся при применении, в основном это гемолиз эритроцитов и аллергические реакции.
Известен также пептид Arg-Gly-Asp (IV), который является фрагментом антимикробных пептидов семейства цекропинов, многих микробных белков и фибронектина поверхности клеток млекопитающих [A.J. Kastin. Handbook of biologically active peptides// Elsevier, Academic Press, USA, 2006, р.576]. Однако до настоящего времени возможность его применения в качестве средства для лечения инфекционных заболеваний не была изучена.
Основными препятствиями к применению АМП в клинической практике являются их сравнительно высокая стоимость, чувствительность к действию протеолитических ферментов, а также присущий многим АМП гемолитический эффект.
Кроме того, в настоящее время антимикробные пептиды получают в основном твердофазным методом, что делает эти вещества чрезвычайно дорогостоящими, а их применение экономически нецелесообразным. Поэтому является весьма актуальным поиск более коротких аналогов АМП и их производных, в том числе конъюгатов с соединениями других классов.
В связи с тем, что сохраняется потребность в совершенствовании антимикробных средств в отношении снижения их токсичности, уменьшения других побочных эффектов, а также в повышении активности против резистентных штаммов, было предложено использовать в качестве таких средств производные гемина.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению производных гемина общей формулы (I)
Figure imgf000007_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба R\ и R2 одновременно не представляют собой -ОН, при этом
либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)^-(D-Leu)- Trp-NHCH2CH2OH, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N -цикло-(Огп- Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -А^-А^-Тгр-Т -А^- Phe-OH,
либо R] и R2 оба представляют собой -ArgOMe, -SerOMe, -PAlaHA, -
PAlaHis, -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -NHCH(CH2OH)CH2OH, NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu( ArgOMe)- ArgOM
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000007_0002
Меп+ представляет собой Fe2+ или Fe3+ ;
или их изомеров или смесей изомеров, или их фармацевтически приемлемых солей в качестве антимикробных средств.
Также изобретение относится к антимикробному, в том числе антибактериальному и/или противогрибковому, средству на основе вышеуказанных соединений формулы (I) и соответствующим фармацевтическим, антисептическим и/или дезинфицирующим композициям, а также способу лечения и/или профилактики заболеваний, вызванных микроорганизмами. Также изобретение относится к новым производным гемина формулы (I)
Figure imgf000008_0001
где R] и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба R] и R2 одновременно не представляют собой -ОН,
при этом либо один из R\ и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X- (D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N -uHWio-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly- Asp-OH или -Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, - NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe, -HA или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000008_0002
Меп+ представляет собой Fe2+ или Fe3+;
или их изомерам или смесям изомеров, или их фармацевтически приемлемым солям, а также к способу синтеза этих соединений.
Краткое описание фигур чертежей
На Фиг.1 изображены графики, отражающие динамику выхода карбоксифлуоресцеина из модельных липосом под действием производных гемина. На Фиг.2 показаны зависимости гемолитической активности (оцениваемой по интенсивности выхода гемоглобина из эритроцитов) от концентрации производных гемина.
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения приведенной выше формулы (I), представляющие собой конъюгаты гемина с пептидами, аминокислотами или их аналогами, являются перспективными антимикробными средствами.
Преимуществами производных гемина формулы (I) являются их биосовместимость и биодеградируемость, низкая токсичность по отношению к нормальным клеткам человека и отсутствие гемолитического эффекта, а также высокая антибактериальная эффективность, в том числе против резистентных штаммов, в сочетании с противогрибковой активностью.
Без намерения ограничения какой-либо теорией, авторы предполагают, что антимикробное действие соединений формулы (I) может быть частично объяснено их деструктирующим действием по отношению к липидной мембране, которое, как известно, является одним из основных механизмов антимикробного действия. Данное действие продемонстрировано в примере 12 и на фиг.1.
Таким образом, были получены и исследованы следующие новые соединения формулы (I):
Соединение (XI): один из R и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Arg-Gly-Asp-OH;
Соединение (XII): один из R[ и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X- (0-Ьеи)-Тф-(Э-Ьеи)-Тф- НСН2СН2ОН, где Х=Тф, Phe или Туг, (грамицидин D);
Соединение (XIII): один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Ν -цикло-(Огп-Ьеи-0-РЬе-Рго-Уа1)2 (грамицидин S);
Соединение (XIV): R,=R2=-NHCH2CH2OH;
Соединение (XV): Ri=R2=-GlyOMe;
Соединение (XVI): R,=R2=-NHCH(CH2OH)CH2OH;
Соединение (XVII): Ri=R2=-NHCH2CH(OH)CH2OH; Соединение (XVIII): R] =R2=-Glu( ArgOMe)- ArgOMe;
Соединение (XIX): Ri=R2=-HA;
Соединение (XX): один из Rj и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH;
Соединение (XXI): =R2=-Arg-ArgO
где НА представляет собой
Figure imgf000010_0001
Кроме новых соединений были исследованы также известные производные гемина общей формулы (I), которые продемонстрировали аналогичные свойства, а именно:
Соединение (V): один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH;
Соединение (VI): один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH;
Соединение (VII): Ri=R2=- ArgOMe;
Соединение (VIII): R,=R2=-SerOMe;
Соединение (IX): где НА- остаток гистамина;
Соединение (X):
Figure imgf000010_0002
Соединения (V), (VI) раскрыты в патенте RU JN° 2250906, 27.04.2005 и статье Желтухина Г.А., Лобанова Т.Н., Небольсин В.Е., М.О. Галлямов, Драницына СМ., Костанян И.А. // Биоорган, химия. 2006. Т. 32, 2, С. 198-210, соединение (VII) раскрыто в патенте RU N° 2238950, 27.10.2004, соединения (VIII), (IX), (X) раскрыты в заявке RU 2007125604, 20.01.2009. Однако антимикробная, в том числе антибактериальная и противогрибковая, активность этих соединений ранее не была исследована.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на применение производных гемина общей формулы (I)
Figure imgf000011_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба Ri и R2 одновременно не представляют собой -ОН, при этом
либо один из R] и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH,
Figure imgf000011_0002
-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)- Тф-ИНСН2СН2ОН, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N -цикло-(Огп- Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -Α^-Αι^-Τφ-Τφ-Α^- Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -ArgOMe, -SerOMe, -PAlaHA, - pAlaHis, -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -NHCH(CH2OH)CH2OH, NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu( ArgOMe)- ArgOM -НА или -Arg- ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000011_0003
Меп+ представляет собой Fe2+ или Fe3+;
или их изомеров или смесей изомеров, или их фармацевтически приемлемых солей в качестве антимикробных средств.
Антимикробная активность включает как антибактериальную, так и противогрибковую активность.
Представленные выше соединения формулы (I) проявляют активность против грамположительных бактерий, таких как бактерии рода Staphylococcus (например, Staphylococcus aureus), Bacillus (например, Bacillus subtilis), Enterococcus (например, Enterococcus faecalis) и Micrococcus (например, Micrococcus luteus), в том числе резистентных, т.е. обладающих устойчивостью к действию известных антибактериальных средств. Предпочтительно, указанные бактерии относятся к штаммам Bacillus subtilis ВКМ В-501, Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis ВКМ B-871 или Micrococcus luteus ВКМ Ас-2230. Еще более предпочтительно, указанные соединения проявляют антибактериальную активность против резистентных штаммов Staphylococcus aureus 25923 АТСС, Staphylococcus aureus N° 100 КС, Staphylococcus epidermidis 533, Enterococcus faecalis N° 559 или Enterococcus faecium N° 569.
Кроме того, представленные выше соединения формулы (I) проявляют активность против микроскопических грибов Cryptococcus (в частности, Cryptococcus neoformans, предпочтительно штамма Cryptococcus neoformans N° 465), а также Candida (в частности, Candida albicans, предпочтительно штамма Candida albicans N°927).
Соединения формулы (I) могут существовать в виде изомеров, а также в виде смесей изомеров, которые полностью входят в объем заявленного изобретения. Например, при модификации одной из двух карбоксильных групп гемина может образовываться смесь (6),(7)-производных.
Все аминокислоты, входящие в состав производных гемина, представляют собой L-аминокислоты, если не указано иное.
Соединения формулы (I) могут быть использованы как в виде солей с фармацевтически приемлемыми кислотами, например, молочной, винной, лимонной, хлористоводородной и др., так и в виде солей по карбоксильным группам с ионами щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, кальций, или, например, с фармацевтически приемлемыми основаниями, такими как аммиак, этаноламин.
Указанные выше соединения формулы (I) и/или их соли могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах) в смеси с органическим или неорганическим носителем или наполнителем.
Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными, фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, суппозиториев, эмульсий, суспензий, спреев, ингаляторов, капель, мазей и любых других лекарственных форм. В качестве носителей могут быть использованы вода, глюкоза, лактоза, аравийская камедь, желатин, крахмал, триксилит магния, тальк, кукурузный крахмал, мочевина, полиэтиленгликоль и другие носители, пригодные для изготовления твердых, мягких или жидких препаратов. При этом, в качестве добавок могут быть использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.
Соединение формулы I вводят в композицию в количестве, достаточном для получения антимикробного эффекта.
При изготовлении разовой лекарственной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьировать в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства.
Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций содержание действующего начала в них составляет 0,001-1 массовых %. В качестве разбавителя вещества могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы. При использовании соединения общей формулы (I) в виде таблеток и суппозиториев количество вещества составляет 1,0-100,0 мг на единичную дозированную форму. Для таблеток и суппозиториев в качестве фармацевтического наполнителя используют любую фармацевтически пригодную основу.
Поскольку соединения общей формулы (I) являются как водорастворимыми, так и липофильными, то они могут применяться в виде водных растворов, спиртовых растворов, мазей, кремов и т.д.
Далее, изобретение относится к антимикробному лекарственному средству на основе указанных выше соединений формулы (I), а также к способу лечения заболеваний, вызываемых указанными выше бактериями и/или микроскопическими грибами, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту указанного выше соединения формулы (I) или фармацевтической композиции на его основе. Способ предназначен для лечения пациентов-млекопитающих, в том числе людей. Рекомендуемые дозы соединения формулы (I) составляют 0,01-10 мг/кг.
Поскольку соединения формулы (I) обладают антибактериальной и противогрибковой активностью, они могут также использоваться в качестве или в составе антисептических и/или дезинфицирующих средств. Такие средства могут быть изготовлены, например, в виде растворов с использованием различных растворителей, таких как вода и низшие спирты (например, 1- пропанол или 2-пропанол).
Также объектом изобретения являются новые производные гемина общей формулы (I)
Figure imgf000014_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба R] и R2 одновременно не представляют собой -ОН,
при этом либо один из R] и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-
(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH, где Х=Тгр, или Phe, или Туг
(грамицидин D), -N5-4HWio-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-
Asp-OH или -Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -
NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe, -HA или -Arg-ArgOMe, НА представляет собой остаток гистамина
Ме" представляет собой Fe или Fe ;
или их изомеры или смеси изомеров, или их фармацевтически приемлемые соли.
Еще один аспект изобретения относится к способу получения описанных выше новых соединений формулы (I).
Соединения формулы (I) получают путем взаимодействия активированного по карбоксильной/ым группе/ам производного гемина с аминокомпонентом.
В качестве аминокомпонентов используют пептиды, аминокислоты (в основном, α-аминокислоты) или их аналоги, в частности, Val-Gly-Ala-(D-Leu)- А1а-(В-Уа1)-Уа1-(В-Уа1)-Т -(0-Ьеи)-Х-(0-Ьеи)-Т -(0-Ьеи)-Т - НСН2СН2ОН, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), 4Hiuio-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), Arg-Gly-Asp-OH, NH2CH2CH2OH, GlyOMe, NH2CH(CH2OH)CH2OH, -NH2CH2CH(OH)CH2OH, Glu(ArgOMe)-ArgOMe, гистамин (НА), А^-Аг -Тф-Тф-А^-РЬе-ОН и Arg-ArgOMe.
Предпочтительно, аминогруппы аминокомпонентов (например, α- аминогруппы аминокислот) ацилируют бис-К-оксисукцинимидным эфиром гемина; или, при получении моно-производных гемина, 6(7)-MOHO-N-OKCH-5- норборнен-2,3-дикарбоксиимидным эфиром гемина; или активированным по одной карбоксильной группе производным гемина, причем в качестве активирующего агента используют ди-трет-бутилпирокарбонат в присутствии пиридина. Реакции проводят в DMF в течение 0,5-2 часов, при температуре от -15° до +30°С.
Таким образом, предлагаются новые эффективные антимикробные средства с антибактериальным и противогрибковым действием на основе производных гемина. Их преимуществами являются биосовместимость, биодеградируемость, активность в отношении ресистентных штаммов бактерий, отсутствие токсичности и побочных эффектов. При этом концентрации, в которых заявляемые соединения проявляют токсическое действие в отношении нормальных клеток, выше их МИК (минимальной ингибирующей концентрации) и МБК (минимальной бактерицидной концентрации) на 2-3 порядка. Следовательно, заявляемые соединения с большой вероятностью обладают широким спектром антимикробной активности, что делает их перспективными для применения в качестве лекарственных средств.
Изобретение далее иллюстрируется с помощью примеров, которые не предназначены для ограничения его объема.
Список сокращений
DCC - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид
DMSO - диметилсульфоксид
DOPC - диолеоилфосфатидилхолин
GrD - грамицидин D
НА - гистамин
Нет - остаток гемина
МеОН - метиловый спирт
MES - 2-(М-морфолино)этансульфокислота
МН - среда Mueller-Hilton
ОМе- метиловый эфир
ONb - -окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир
01Ви - трет-бутиловый эфир
Z - карбобензокси-группа
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - Ν,Ν'-диметилформамид
ИК - инфракрасная спектроскопия
ИР - ингибирование роста
КФ - карбоксифлуоресцеин
МБК - минимальная бактерицидная концентрация
МИК - минимальная ингибирующая концентрация
МПК - минимальная подавляющая концентрация
ОФ-ВЭЖХ - обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография
Tris - трис-(гидроксиметил)аминометан
ТСХ- хроматография в тонком слое
ХЛФ - хлороформ ЭА - этилацетат
Все величины, выраженные в процентах, относятся к процентам по массе, если не указано иначе.
Примеры
В работе использовались аминокислоты и их производные L-ряда фирмы
«Bachem» (Германия), «Reanal» (Венгрия), DOPC (Sigma-Aldrich), карбоксифлуоресцеин (Fluka, Германия), MES (Sigma-Aldrich), Tris (Sigma- Aldrich), грамицидин D (Sigma-Aldrich), грамицидин S (Красфарма, Россия) хлорид калия ч.д.а. (Химмед, Россия)
Все растворители безводные, за исключением тех, которые использовались для экстракции из водных растворов. Индивидуальность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) в системах: хлороформ - метанол 9: 1 (1), хлороформ - метанол 8:2 (2), хлороформ - метанол 5:3 (3), хлороформ - метанол - уксусная кислота 5:3: 1 (4), метанол - уксусная кислота - вода 4: 1 : 1 (5), бутанол - уксусная кислота - вода 4: 1 : 1 (6). Хроматограммы проявляли хлор-толидиновым реактивом, нингидрином, по свечению в УФ-свете.
Масс-спектры высокого разрешения получали на время-пролетном масс- спектрометре «Ultraflex» («Вшкег», Германия) методом матриксной лазерно- десорбционной ионизации (TOF MALDI), в качестве матрицы использовалась 2,5-дигидроксибензойная кислота.
ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре: «Magna 750» («Nicolet», США).
Электронные спектры снимали на спектрофотометре «Jasco» модель UV VS 7800 (Япония).
ОФ-ВЭЖХ проводили на приборе Gilson 305 (Gilson, Франция).
Препаративную ОФ-ВЭЖХ проводили на колонке Luna 10μ, обращенная фаза С5, размеры 250x21 ,2 мм, (Phenomenex, США) в следующих условиях:
Изократическая элюция 0,1% раствором TFA в воде, скорость потока 4 мл/мин. Поглощение регистрировали при длине волны 220 нм (7).
Динамику выхода КФ из липосом контролировали на флуориметре Сагу Eclipse (Varian, США). Липосомы получали с помощью мини-экструдера Avanti (Avanti Polar Lipids, США)
Пример 1
6, 7-бис-(метиловый эфир Р-глицил)-протогемин (IX) (Соединение XV, Ri=R2=-GlyOMe)
К суспензии 0,030 г (0,236 ммоль) H-GlyOMe HCl в 1,5 мл DMF прибавляли 0,033 мл (0,236 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 3 мин. К полученному раствору прибавляли раствор 0,100 г (0,118 ммоль) 6,7-бис-Ы-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 5 мл DMF, и перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (1) и (2). Раствор концентрировали в вакууме до 0,5 мл и прибавляли 6 мл диэтилового эфира. Полученный остаток растворяли в ХЛФ, при этом наблюдалось выпадение белых кристаллов Et3N HCl, от которых избавлялись декантацией раствора. Растворитель удаляли в вакууме. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 15 мл смеси ХЛФ-МеОН (8:2), два раза встряхивали с 7,5 мл 0,5 N раствора соляной кислоты и промывали водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляли в вакууме. Вещество очищали на колонке (20> 2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ- МеОН (8:2). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,71 (2), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,063 г (67%), Rf 0,26 (1), 0,71 (2). Электронный спектр, λ^, нм, ХЛФ.МеОН (8:2), (ε· 10"3): 400 (115,9), 508 (9,38), 640 (3,81). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1737 (СО сл.эф.), 1648 (амид I), 1539 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 758,5.
Пример 2
6,7-бис-гистаминил-протогемин (IX) (Соединение XIX, R]=R2=HA)
К раствору 0,026 г (0,236 ммоль) гистамина в 1,5 мл DMF прибавляли раствор 0,100 г (0,118 ммоль) 6,7-бис-Ы-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 4 мл DMF и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (2) и (3). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 4 мл МеОН и прибавляли 0,093 мл (0,354 ммоль) 3,8 N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество очищали на колонке (31 х2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН (5:3). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,64 (3), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,049 г (51%), Rf 0,25 (2), 0,64 (3). Электронный спектр, λ™, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10"3): 388 (49,1), 508 (4,18), 640 (1 ,76). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1644 (амид I), 1543 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 802,3.
Пример 3
6, 7-бис-[бис-(метиловый эфир 1^-Ь-аргинил)-Ь-глутамил]-протогемин
IX (XVIII, Ri=R2=-Glu(ArgOMe)-ArgOMe)
1. Бис- (метиловый эфир Ма-аргинил)-Ь-глутаминовой кислоты дигидрохлорид
К суспензии 0,069 г (0,266 ммоль) H-ArgOMe-2HCl в 2 мл DMF прибавляли 0,074 мл (0,531 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 5 мин. К полученному раствору прибавляли 0,077 г (0,133 ммоль) бис-пентафторфенилового эфира Вос-глутаминовой кислоты, полученного ранее, и перемешивали 4 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (5). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Маслообразный осадок отделяли от растворителя декантированием, остатки растворителя удаляли в вакууме. Вещество очищали на колонке (23>< 1 см) с силикагелем Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью метанол - уксусная кислота - вода 4:0,5:0,5. Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,67 (5), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,073 г (77%), Rf 0,67 (5). [<x]D 25 - 8,53° (С 0,38; МеОН). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1735 (СО сл.эф.), 1653 (амид I), 1542, 1558 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 588,31.
К 0,073 г (0,0946 ммоль) бис-(метилового эфира а-аргинил)-Вос-Ь- глутаминовой кислоты (V) приливали 6 мл ~3 N HCl/МеОН. Полученную суспензию перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Контроль процесса осуществляли ТСХ в условиях (6). После достижения полной конверсии в аминосвободный дипептид растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Маслообразный остаток кристаллизовали под безводным диэтиловым эфиром, растворитель отделяли декантацией.
2. 6, 7-бис-[(бис-метиловый эфир -Ь-аргинш)-Ь-глутамш]-протогемин IX (XVIII)
К суспензии полученного H-Glu(ArgOMe)2-3HCl в 1,5 мл DMF прибавляли 0,047 мл (0,335 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 2 мин. Наблюдали выпадение осадка Et3N-HCl. К полученной суспензии прибавляли раствор 0,047 г (0,0558 ммоль) 6,7-6HC-N- оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 2 мл DMF и перемешивали 22 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли ТСХ в условиях (6). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 4 мл МеОН и прибавляли 3,8 N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество трижды очищали на колонке (13 χ ΐ см) с сефадексом LH-20, элюировали МеОН. Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,07 (6), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,030 г (34%). Rf 0,07 (6), Rf(Ha окиси алюминия) 0,70 (6). Электронный спектр, тах, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε ΐθ'3): 400 (92,2), 508 (6,31), 636 (2,39). ИК- Фурье спектр, ν, см"1, таблетка Вг: 1737 (СО сл. эф.), 1649 (амид I), 1528 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 1554,97.
Пример 4
6,7-6uc-N-(2-zudpoKCU3mwi)aMud протогемина (IX) (XIV, Ri=R2=-NH- СН2-СН2-ОН)
К раствору 0,050 г (0,0591 ммоль) 6,7-бис- -оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 3 мл DMF прибавляли 0,010 мл (0,118 ммоль) аминоэтанола и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (2) и (3). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 3 мл МеОН и прибавляли 3,8 N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество очищали на колонке (24x 1 см) с силикагелем Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН (5:3). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,52 (3), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,036 г (82,5%), Rf 0,35 (2), 0,52 (3). Электронный спектр, Хты, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε· 10"3): 400 (183,0), 508 (5,23), 640 (2,08). ИК-Фурье спектр, V, см"1, таблетка КВг: 1632 (амид I), 1549 (амид И). Масс-спектр, m/z:
[М]+ 702,5.
Пример 5
6, 7-6uc-N-(l,3-du2udpoKcunponaH-2-un)aMud протогемина (IX) (XVI, R,=R2=-HN-CH(CH2OH)-CH2OH)
К раствору 0,050 г (0,0591 ммоль) 6,7-бис-М-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 3 мл DMF прибавляли раствор 0,012 г (0,118 ммоль) 2- амино-1 ,3-пропандиола в 0,5 мл DMF и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (4). Раствор концентрировали в вакууме до 0,5 мл и прибавляли 6 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 9 мл смеси ХЛФ-МеОН (8:2), один раз встряхивали с 4 мл 0,06 N раствора соляной кислоты, насыщенного NaCl, и промывали водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляли в вакууме. Вещество очищали на колонке (21 x2 см) с сефадексом LH-20, элюировали МеОН. Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,56 (4), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,018 г (36%), Rf 0,56 (4). Электронный спектр, λ^, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε· 10"3): 400 (40,5), 508 (2,68), 640 (1 ,02). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1629 (амид I), 1550 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 762,0.
Пример 6
6, 7-6uc-N-(2,3-du2udpoKcunponwi)aMud протогемина (IX) (XVII, R,=R2=-HN-H2C-CH(OH)-CH2OH)
К раствору 0,050 г (0,0591 ммоль) 6,7-бис-Ы-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 3 мл DMF прибавляли 0,009 мл (0,118 ммоль) З-амино-1,2- пропандиола и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (3) и (4). Раствор концентрировали в вакууме до 0,5 мл и прибавляли 6 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 3 мл МеОН и прибавляли 3,8 N НС1/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°C. Вещество очищали на колонке (30x2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН:АсОН (5:3:0,5). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0,69 (4), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,023 г (46%), Rf 0,33 (3), 0,69 (4). Электронный спектр, λη,», нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10'3): 396-400 (24,2), 488 (2,14), 600 (1 ,40). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1634 (амид I), 1565 (амид II). Масс- спектр, m/z: [М]+ 762,0.
Пример 7
6(7)-MOHO-(-Val-Gly-Ala-D-Leu-Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-D-Leu-X-D-Leu- Trp-D-Leu-Trp-NH-CH2CH2OH)aMud протогемина (IX) (XII, один из Rt и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Val-Gly-Ala-D-Leu- Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-D-Leu-X-D-Leu-Trp-D-Leu-Trp-NH-CH2CH2OH, где X = Тгр, Туг, Phe)
К раствору 32 мг (0,017 ммоль) грамицидина D в 0,650 мл сухого ДМФА прибавляли 48 мкл 1 N НС1 в метаноле. Реакционную смесь перемешивали 72 ч в темноте при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Выход 30 мг (98%). Масс-спектр, m/z: [М]+ 1854,0
К раствору 30 мг (0,016 ммоль) деформилированного грамицидина D в 0,2 мл ДМФА прибавляли 13,2 мг (0,016 ммоль) 6(7)-моно-К-окси-5-норборнен-2,3- дикарбоксиимидного эфира гемина и перемешивали 1,5 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Остаток растворяли в хлороформе. Остаток очищали на колонке (30x2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН 9: 1. Выход 23,5 мг (59%). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1634 (амид I), 1565 (амид II). Rf 0,65 (1).
Пример 8
6(7)-MOHO-fauKrio-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2J)aMud протогемина (IX) (XIII, один из Rt и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -rf-lHuwio-fOrn-Leu-D-Phe-Pro- Val) 2J)
К раствору 50 мг (0,077 ммоль) гемина в 0,5 мл сухого ДМФА прибавляли
1 мл пиридина и 25,3 мг (0,116 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната и перемешивали 15 мин при комнатной температуре. Одновременно к суспензии 93,5 мг (0,077 ммоль) дигидрохлорида грамицидина S в 0,5 мл ДМФА прибавляли 22 мкл (0,154 ммоль) триэтиламина и перемешивали 2 мин.
К полученному смешанному ангидриду гемина прибавляли раствор аминосвободного грамицидина S и перемешивали 3 ч. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Остаток растворяли в хлороформе. Остаток очищали на колонке (30><2 см) с силикагелем ieselgel 60 F254 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН 12: 1. Выход 20 мг (15%). Масс-спектр, m/z: [М] 1739,5. Электронный спектр,
Figure imgf000023_0001
нм, хлороформ:метанол (4:1), (ε·10'3): 400 (105), 492 (10,6), 640 (6).
Пример 9
6(7)-MOHO-(Arg-Gly-Asp)-npomozeMUH (IX) (XI, один из Rj и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Arg-Gly-Asp-OH)
К суспензии 20 мг (0,038 ммоль) Arg-Gly-Asp CH3COOH CF3COOH в 0,5 мл ДМФА добавляли 5 мкл (0,038 ммоль) триэтиламина и перемешивали 2 мин. Затем добавляли 62 мкл (0,251 ммоль) бис-(0,1 -триметилсилил)ацетамида и перемешивали при комнатной температуре 30 мин. В полученную суспензию вносили 32 мг (0,038 ммоль) 6,7-бис- -оксисукцинимидного эфира протогемина IX, и реакционную массу перемешивали 6 часов. Затем растворитель удаляли в вакууме, осадок растворяли в метаноле для десилилирования карбоксильных групп трипептида. Целевой продукт перекристаллизовывали из метанола. Выход 20 мг (54%). Масс-спектр, m/z: [М]+ 981 ,3
Пример 10
^-[6(7)-(Лротогемин IX)-unJ-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH (XX, один из Rj и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой - ArgArgTrpTrpArgPhe-OH)
а) Твердофазный синтез ArgArgTrpTrpArgPhe-OH (XXI) на 2-хлортритил- хлоридном полимере
Определение степени присоединения стартовой аминокислоты. К 0, 1 г полимера, содержащего 1,43 ммоль активных групп, предварительно набухшего в 5 мл дихлорэтана, добавляли свежеприготовленный раствор 0,044 г (0,1143 ммоль) Fmoc-Phe-OH и 0,040 мл (0,286 ммоль) триэтиламина в 2 мл дихлорэтана, перемешивали воздухом в течение 25 мин при 25°С. Реакцию останавливали прибавлением 2 мл смеси метанол - триэтиламин (9: 1), перемешивали 1 мин. Пептидилполимер отфильтровывали, промывали дихлорэтаном (2 мин * 3), DMF (2 мин х 2), изопропанолом (2 мин χ 2), DMF (2 мин х 2), изопропанолом (2 мин х- 2), метанолом (2 мин χ 1), диэтиловым эфиром (2 мин χ 2), сушили на водоструе. Степень замещения смолы определяли спектрофотометрически. К 10 мг полученного Fmoc-Phe-полимера добавляли 1 мл 20% раствора пиперидина в DMF и перемешивали 20 мин при 25 °С. Смолу отфильтровывали, отбирали аликвоту фильтрата и определяли оптическое поглощение раствора образовавшегося М-(9-флуоренилметил)пиперидина при 289 нм. Степень замещения смолы вычисляли по формуле:
с= 289 ^ #75800
где с - содержание активных групп в полимере, А289 - оптическая плотность раствора по отношению к контролю, W (мг) - масса взятого полимера, 5800 - молярный коэффициент поглощения -(9-флуоренилметил)пиперидина. Содержание Fmoc-Phe в полимере составило 0,3 ммоль/г.
К 0,331 г полимера, содержащего 0,099 ммоль О, предварительно набухшего в 3,3 мл дихлорэтана, добавляли свежеприготовленный раствор 0,115 г (0,3 ммоль) Fmoc-Phe-OH и 0,034 мл (0,25 ммоль) триэтиламина в 0,6 мл дихлорэтана, перемешивали в течение 25 мин при 25°С. Реакцию останавливали прибавлением 6 мл смеси метанол - триэтиламин (9: 1), перемешивали 1 мин. Пептидилполимер отфильтровывали, промывали дихлорэтаном (2 мин 3), DMF (2 мин 2), изопропанолом (2 мин 2), DMF (2 мин χ 2), изопропанолом (2 мин х 2), метанолом (2 мин χ 1), диэтиловым эфиром (2 мин χ 2). Объем одной порции промывочного раствора 2 мл. Синтетический цикл включает в себя: 1) 10-минутную активацию присоединяемой Fmoc-аминокислоты (3 экв.) с DIC (3 экв.) и HOBt (3,6 экв.) в 1 мл DMF; 2) деблокирование α-аминогрупп обработкой 20% раствором пиперидина в DMF (3 мл х 3) в течение 30 мин; 3) промывку пептидилполимера DMF (1 ,5 мл х 8, по 3 мин); 4) дополнительную промывку пептидилполимера раствором HOBt (3,6 экв.) в 1 ,5 мл DMF в течение 3 мин; 5) конденсацию активированной Fmoc-аминокислоты (3 экв.) с пептидилполимером в течение 24 ч; 6) промывку пептидилполимера DMF (1 ,5 мл χ 2, по 2 мин); 7) контроль полноты замещения аминогрупп при присоединении очередной Fmoc- аминокислоты осуществляли с помощью нингидринового теста, при положительном результате теста проводили повтор стадии конденсации. Двукратно конденсацию осуществляли при присоединении следующих аминокислот: Arg2, Тгр3, Тф4, Arg5, Arg6.
Условия синтеза пептида H-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH
Время
Аминокислота реакции Нингидриновый
Количество реагентов
(АК) конденсации, тест
ч
1 Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г АК (0,3 ммоль) 24 +
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г АК (0,3 ммоль) 2
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
2 Fmoc-Τφ-ΟΗ 0,127 г АК (0,3 ммоль) 24 +
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
Fmoc-Τφ-ΟΗ 0,127 г АК (0,3 ммоль) 3
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
3 Fmoc-Τφ-ΟΗ 0,127 г АК (0,3 ммоль) 24 +
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
Fmoc-Τφ-ΟΗ 0,127 г АК (0,3 ммоль) 3
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
4 Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г АК (0,3 ммоль) 24 +
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г АК (0,3 ммоль) 5 +
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль) Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г AK (0,3 ммоль) 12 —
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
5 Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г AK (0,3 ммоль) 16 +
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
Fmoc-Arg-OH* 0,1 18 г АК (0,3 ммоль) 16
0,048 г HOBt (0,36 ммоль)
0,046 мл DIC (0,3 ммоль)
*Перед реакцией боковую функцию Fmoc-Arg-OH в DMF переводили в
гидрохлорид добавлением одного эквивалента 12 N водного раствора НС1.
Растворители отгоняли в вакууме, сушили над NaOH.
После окончания синтеза и деблокирования -аминогруппы 0,143 г пептидилполимера промывали DMF (1 мл χ 8, по 2 мин), промывали HOBt (3,6 экв.) в 1 мл DMF.
б) ^-[6(7)-(Протогемин IX)-wi]-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH (XX). К 0,29 г пептидилполимера (XX) с отщепленной Fmoc-защитой прибавляли 3 экв. 6(7)- моно-1Ч-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (И) в 4,5 мл DMF, перемешивали 5 ч и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Геминпептидилполимер отделяли, промывали DMF (2 мл χ 7, по 3 мин). Нингидриновый тест отрицательный. Геминпептидилполимер промывали DCM (2 мл х 2, по 2 мин), сушили в вакууме водоструйного насоса и прибавляли к нему 4,5 мл смеси TFA-TFE-DCM (1 : 1 :8), перемешивали в атмосфере азота 3 ч. Полимер отделяли, промывали смесью TFA-TFE-DCM (1 : 1 :8) (1 мл х 4, по 1 мин). Остаток растирали с охлажденным безводным диэтиловым эфиром (10-12- кратным избытком по объему), выпавший осадок отфильтровывали, промывали х 2 эфиром, сушили в вакууме. Продукт очищали на колонке (150x20 мм) с сефадексом LH-20, элюируя целевое вещество смесью метанол - вода (20: 1 ). Выход 0,027 г (25%). R/ 0,5 (6). Электронный спектр (метанол), λπ,ϋχ, нм (ε х 10" , М-1 см-1): 393,4. (65,8), 474,8 (8,7), 578,0 (3,61), 607,2 (3, 19). Масс-спектр , т/ . 1605 [М]+ (вычислено 1603,5).
Пример 11 6, 7-бис-[(Метиловый эфир Р-Ь-аргинил)-Ь-аргинил]-протогемин IX (XXI, Ri=R2=-Arg-ArgOMe)
а) Ν-оксисукцинимидный эфир N0 ',14е ',Λ^ ' -трибензилоксикарбониларгинина К раствору 0,410 г (0,709 ммоль) Z3ArgOH в 5 мл ХЛФ (безв.) добавляли 0,0816 г (0,709 ммоль) Ν-оксисукцинимида в 1 мл DMF. Реакционную смесь охлаждали до -10°С и прибавляли по каплям в течение 10 мин. 0,146 г (0,709 ммоль) DCC в 5 мл ХЛФ. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при 0°С, затем 5 часов при комнатной температуре и оставляли на 17 часов при 4-5°С. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (11). Выпавший осадок DCU отделяли двукратным фильтрованием, растворитель удаляли в вакууме. Остаток кристаллизовали из этилацетата петролейным эфиром. Твердый осадок сушили в вакууме над безводным СаС12. Выход 0,380 г (81%), Rf 0,68 (11). ИК-спектр Фурье, v, см"1, таблетка КВг: 1742 (СО сл.эф.), 1610 (OCONH), 1541 (OCONH), 1262 (ароматика). Масс-спектр, m/z: [М]+ 673,7. Лит. [106]: Т.пл. 85-86. [a]D 25 - 9,7° (С 2; диоксан).
б) Метиловый эфир N" '.N0 ',Λ^ '-трибензилоксикарбониларгиниларгинина
К суспензии 0,023 г (0,0890 ммоль) H-ArgOMe-2HCl в 2 мл DMF прибавляли 0,024 мл (0,178 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 5 мин. К полученному раствору прибавляли 0,060 г (0,890 ммоль) N- оксисукцинимидного эфира а,М<3, (3-трибензилоксикарбониларгинина, полученного ранее, в смеси 1,5 мл DMF, и перемешивали 22 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (2). Растворитель концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Маслообразный осадок отделяли от растворителя декантированием, остатки растворителя удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 15 мл смеси ХЛФ:МеОН (8:2) и промывали водой. Органический слой удаляли в вакууме. Вещество очищали колоночной хроматографией на силикагеле Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) (8x3 см), элюировали смесью ХЛФ-МеОН (9: 1). Фракции, содержащие вещество с Rf 0,48 (2), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0,056 г (78%), Rf 0,48 (2). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1727 (СО сл.эф.), 1642 (амид I), 1548 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 748. в) 6, 7 -бис- [(Метиловый эфир -Ь-аргинил)-Ь-аргинил]-протогемин IX К 0,054 г (0,0511 ммоль) метилового эфира Ма-аргинил-г3-аргинина приливали 8 мл смеси метанол - уксусная кислота - вода (6: 1 : 1). К раствору прибавляли палладиевый катализатор и гидрировали при комнатной температуре 1 ч, контролируя ход реакции ТСХ в системе (2). После окончания реакции катализатор отфильтровывали, промывали водой, растворитель удаляли в вакууме при 40°С. К суспензии полученного H-ArgArgOMe-3CH3COOH в 2 мл DMF прибавляли 0,0216 мл (0,1542 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 2 мин. Наблюдали выпадение осадка Et3N-HCl. К полученной суспензии прибавляли раствор 0,022 г (0,0257 ммоль) 6,7-6HC-N- оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 1 мл DMF и перемешивали 3,5 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли ТСХ в условиях (5). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 7 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 15 мл смеси ХЛФ-МеОН (8:2), два раза встряхивали с 7,5 мл 0,1 N раствора соляной кислоты и промывали водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляли в вакууме. Вещество очищали препаративной ТСХ на силикагеле Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) (11 x 14 см), элюировали смесью МеОН:АсОН:Н20 (4: 1 : 1). Выход 0,015 г (40%). Rf 0,1 (5). Электронный спектр, λπ^, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε· 10 3): 400 (79,2), 478 (5,72), 596 (3,41). ИК-Фурье спектр, V, см"1, таблетка КВг: 1739 (СО сл. эф.), 1642 (амид I), 1531 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 1270,4.
Пример 12
Исследование деструктирующего действия производных гемина общей формулы I в отношении липидных мембран
Для изучения влияния производных гемина на проницаемость липидной мембраны была использована методика измерения индуцированного этими веществами выхода карбоксифлуоресцеина (КФ) из нагруженных им липосом по методике, описанной в [Y.N. Antonenko, Т.В. Stoilova, S.I. Kovalchuk, et al. Large unselective pore in lipid bilayer membrane formed by positively charged peptides containing a sequence of gramicidin A//FEBS Letters, 2005, V.579, p.5247-5252]. Для приготовления липосом использовали стоковый раствор DOPC в хлороформе с концентрацией 20 мг/мл. Стоковый раствор объемом 200 мкл упаривали в токе азота, добавляли 0,4 мл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис, 10 мМ MES, 100 мМ КС1 100 мМ КФ, встряхивали 2 мин и подвергали трем циклам замораживания-оттаивания, встряхивая смесь после каждого цикла. Полученную смесь мультиламеллярных липосом продавливали через поликарбонатный фильтр с порами диаметром 0,1 мкм, используя мини-экструдер Avanti (Avanti Polar Lipids, США). Невключившийся в липосомы КФ отделяли гель- хроматографией на сефадексе G-50. Сефадекс оставляли на ночь в воде для набухания. Колонку объемом 20 мл заполняли набухшим сефадексом, после чего уравновешивали 60 мл буфера, содержащего 10 мМ Tris, 10 мМ MES, 100 мМ КС1 (буфер А). Объем суспензии липосом, содержащих КФ, составлял 500 мкл (концентрация липида 0,045 мг/мл). Суспензию помещали в кювету, объем доводили до 2 мл буфером А. К полученной суспензии липосом добавляли 10 мкл 10"4 М раствора производного гемина общей формулы I в ДМСО. Динамику выхода КФ контролировали флуориметрически. Флуоресценцию карбоксифлуоресцеина возбуждали при длине волны 490 нм, регистрировали при 520 нм (ширина обеих щелей 5 нм). Относительное количество вышедшего из липосом красителя в конкретный момент времени рассчитывали по формуле:
a = (Ff - F0)/(Fm - F0),
где F0 и Ff являются уровнем флуоресценции до и после добавления пептида, соответственно, a Fm - значение флуоресценции после полного разрушения липосом детергентом Triton Х- 100, добавленным до конечной концентрации 2,4% (по массе).
На фиг.1 представлена динамика выхода карбоксифлуоресцеина из липосом под действием производных гемина общей формулы I при соотношении липид/производное гемина 10: 1 (моль/моль).
Пример 13
Исследование антибактериальной активности соединений общей формулы I
Для определения антибактериальной активности веществ были использованы штаммы Bacillus subtilis ВКМ В-501, Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis ВКМ B-871, Micrococcus luteus ВКМ Ac-2230 (получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН). Основные параметры, которые характеризуют антибактериальную активность, - это минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и минимальная бактерицидная концентрация (МБК). МИК - это наименьшая концентрация исследуемого соединения, полностью ингибирующая размножение бактерий в жидкой среде. МБК - это наименьшая концентрация, вызывающая гибель всех клеток.
МИК оценивали методом ингибирования роста культуры в жидкой среде с серийными разведениями веществ по модифицированной методике [Amsterdam, D. 1996. Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media, pp.52-111. In Loman, V., ed. Antibiotics in laboratory medicine, 4th ed. Williams and Wilkins, Baltimore].
Бактерии культивировали, и тестирование проводили в жидкой среде МН (среда Mueller-Hinton: сухой экстракт говяжьего бульона 4 г/л, крахмал 1 ,5 г/л, гидролизат казеина 17,5 г/л; Sigma-Fluka каталожный номер 70192) при 37°С, 100% влажности и перемешивании. Для тестирования использовали культуру (с 4 по 7 пересев от разморозки) в экспоненциальной фазе роста.
Все исследуемые соединения кроме грамицидина D поглощают свет на длине волны 595 нм, используемой для оценки роста бактериальной культуры. Поэтому при оценке оптической плотности суспензии бактерий учитывали поправку на поглощение каждого соединения с учетом его концентрации в лунке. Ингибирование роста (ИР) бактерий рассчитывали в процентах через 20 часов инкубации клеток с веществами по оптической плотности (А) измеряемой в каждой лунке на длине волны 595 нм, используя формулу:
HPi = [(AKt - Ак0) - (Ait - Ai0)]x 100/(AKt - Ак0) (1), где индекс i обозначает номер лунки, к - контрольная лунка с бактериями, в которую исследуемое соединение не вносится, 0 - измерение проводится сразу же после внесения исследуемого вещества в лунку, t - измерение через 20 часов после внесения вещества.
Для определения антибактериальной активности исследуемых соединений использовали следующий экспериментальный протокол. Криопробирку с культурой тестируемого штамма (Bacillus subtilis BKM В-501, Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230) в среде с 7% ДМСО, хранившуюся в жидком азоте, быстро размораживали, 100 мкл суспензии клеток добавляли к 1 ,5 мл свежей среды МН. Клетки растили в течение суток при температуре 37°С и перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин. Морфологические признаки штамма и отсутствие контаминации посторонними бактериями проверяли (а) путем посева на агаризованную (15 г/л агара) среду МН по форме и цвету образующихся колоний, (б) под микроскопом (Микмед-2, ЛОМО, Россия) с 40х объективом по характерным морфологическим признакам клеток. Далее бактерии культивировали в 1 мл жидкой среды МН при температуре 37°С и перемешивании. Клетки пересевали каждые сутки. Начиная с 3-его и заканчивая 6-м пересевом, культуру клеток использовали для постановки тестов.
Для постановки теста 5 мкл бактериальной суспензии в стационарной фазе роста переносили в 1 мл стерильной среды МН и инкубировали до достижения экспоненциальной фазы роста (3-5 ч, 37°С при перемешивании со скоростью 150 об/мин). Чтобы оценить концентрацию микроорганизмов, измеряли оптическую плотность (А) полученной бактериальной культуры на длине волны 595 нм. Считали, что А=0,2, измеренная от 200 мкл суспензии клеток в 96-луночном планшете с учетом поглощения среды, соответствует 4x 10 клеток/мл для обоих используемых штаммов. С учетом измерения концентрации клеток суспензию разбавляли средой МН до 5х104-1х 105 клеток/мл и переносили в стерильный 96-луночный планшет по 100 мкл на лунку. Затем к клеткам вносили исследуемые соединения и делали серийные двукратные разведения этих соединений в лунках планшета. Максимальная концентрация веществ в серии составляла 10"4 М, минимальная - 1,6x 10"6 М. Исследование антибактериальной активности выполняли в 2 повторах для каждого соединения, а результат усредняли.
В качестве контролей использовали: 100 мкл бактериальной культуры без добавления каких-либо веществ (4 лунки); бактериальную культуру, в которую добавлен 1% ДМСО или вода в объеме, как в лунках с максимальной концентрацией тестируемых соединений (4 лунки); 100 мкл стерильной среды МН без бактерий и без исследуемых веществ для контроля случайной контаминации в планшете (4 лунки).
Сразу после внесения соединений с помощью планшетного фотометра "Униплан" (Пикон, Россия) в каждой лунке измеряли Аю, а в контрольных лунках - Ак0 необходимые для расчета по формуле (1). Планшет инкубировали в течение 20 ч при температуре 37°С и перемешивании со скоростью 150 об/мин. Затем в каждой лунке измеряли Ajtj а в контрольных лунках - AKt и рассчитывали ингибирование роста бактерий по формуле (1). МИК определяли, как минимальную концентрацию исследуемого соединения, при которой ингибирование роста составляет 100%.
Для определения МБК среду из лунок, где концентрация исследуемого соединения равнялась МИК, МИКх2 и МИКх4, переносили на чашки Петри с агаризованной средой МН (15 г/л агара) и равномерно растирали по площади чашек стерильными шпателями. Чашки инкубировали 2 суток. МБК определяли как наименьшую концентрацию исследуемого соединения, при которой колонии на чашке Петри не вырастают.
Все тесты на антибактериальную активность повторили с перерывом в 2 дня, чтобы оценить изменчивость устойчивости бактериальных клеток к действию исследуемых соединений.
Таблица 1
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении грамположительных бактерий Bacillus subtilis
ВКМВ-501
Вещество МИК, мкМ МБК, мкМ
V 19±7 38±13
VI 38±13 75±25
VII 3,1±0,8 3,1±0,8
VIII 6,3±1,6 9±4
IX 50±13 100±25
XI 12,5±4 25±7
XII 38±13 38±13
XIV 1,6±0,4 6,3± 1 ,6
XV 12,5±4 25±7
XVI >200 >200
XVII >200 >200 XVIII 1,6±0,4' He достигнута
XIX 100± 25 He достигнута
Hem 13±4 50 ± 13
Грамицидин S 2,5 5
Таблица 2
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus 209Р
Figure imgf000033_0001
Таблица 3
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении грамположительных бактерий Enterococcus faecalis ВК В-871
Вещество МИК, мкМ МБК, мкМ
V 100 400
Figure imgf000034_0001
Грамицидин S 3,1 6,3
Таблица 4
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении грамположительных бактерий Micrococcus luteus
ВКМАс-2230
Figure imgf000034_0002
XIX 25 25
Hem 12,5 25
Грамицидин S 0,4 0,8
Пояснение к таблицам 1 -4
'Соединение обладает бактериостатическим эффектом: оно ингибирует размножение бактерий в указанной концентрации, но не убивает их.
2 3 МБК не достигнута. Приведена максимальная использованная концентрация вещества.
Таким образом, соединения VII, VIII и XVIII, подавляют рост грамположительных бактерий S. aureus в концентрациях до 50 мкМ (таблица 2).
Бактерии М. luteus высокочувствительны к действию данных соединений. Соединения V, VI, VII, VIII, IX , гемин, GrD и грамицидин S ингибируют рост М luteus в концентрациях до 30 мкМ. При этом для соединений V, VII, VIII, GrD и грамицидина S (таблица 4) МИК достаточно низка - меньше 10 мкМ. Соединения Н и VI несколько менее активны (МИК = 12,5 и 25 мкМ, соответственно). Все исследованные соединения проявили бактерицидную активность в отношении М. luteus, причем МБК не превышает 30 мкМ.
Энтерококки Е. faecalis в среднем более устойчивы к действию данных соединений, чем микрококки М. luteus и стафилококки S. fureus. Наиболее эффективным соединением в отношении Е. faecalis оказалось соединение XVIII: МИК 12,5 мкМ.
Все исследованные соединения проявляют активность в отношении грамположительных бактерий В. subtilis. Наиболее активными оказались вещества VII и XVIII (МИК меньше 10 мкМ).
Пример 14
Определение специфической активности производных ге ина в отношении штаммов резистентных бактерий
Материалы и методы
Испытуемые препараты - производные гемина, растворимые в воде (VII, XVIII) и растворимые в ДМСО (VIII, XV, XIV). В качестве препарата сравнения был взят ванкомицин. Каждое вещество испытывалось в трех повторах.
В работе использовались одноразовые стерильные 96-луночные плоскодонные планшеты, чашки Петри, пипетки, наконечники и пробирки (Пан- Эко, Москва).
Питательные среды: бульон Мюллера-Хинтон для работы готовили из сухих сред (Mueller Hinton broth, Acumedia, Baltimore) и стеризовали автоклавированием при 121 °С в течение 15 минут.
Для культивирования Staphylococcus aureus использовали готовую сухую среду - Триптиказо-соевый агар (Tripticase Soy Agar, BBL). Для культивирования Enterococcus faecalis использовали готовую сухую среду - Колумбийский агар (Columbia Agar Base, BBL). Среды стерилизовали автоклавированием при 121 °С в течение 15 минут.
Исследуемые резистентные бактериальные штаммы
Грамположител ьные :
Staphylococcus aureus N° 25923 АТСС (American Type Culture Collection); Staphylococcus aureus N° 100 КС;
Staphylococcus epidermidis 34° 533;
Enterococcus faecalis N° 559;
Enterococcus faecium N° 569.
Бактериальный инокулюм был постоянный и составлял 5х 105 КОЕ/мл. Полученные результаты представлены в таблицах (Мер).
Постановка эксперимента
Для водорастворимых соединений с 2 по 8 лунки вносили растворитель (вода) по 15 мкл, затем в 1 лунку вносили 30 мкл стокового раствора исследуемого соединения в воде с концентрацией 1 x 10 М, и последовательным двукратным разведением доводили его концентрацию до 0,007х 103 М. Из каждой лунки отбирали по 10 мкл и добавляли по 190 мкл бактериальной культуры (105 КОЕ).
Для растворимых в ДМСО соединений с 2 по 8 лунки вносили растворитель (ДМСО) по 10 мкл, затем в 1 лунку вносили 20 мкл стокового раствора исследуемого соединения в воде с концентрацией 5x 10 М и последовательным двукратным разведением доводили его концентрацию до 0,039x 103 М. Из каждой лунки отбирали по 2 мкл и добавляли по 198 мкл бактериальной культуры (105 КОЕ). В качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов (контроль роста культуры). Кроме того ставился контроль чистоты питательных сред и растворителей. Планшеты инкубировали в термостате при 36°С в течение 24 часов.
Оценку роста культур проводили визуально, сравнивая рост микроорганизмов в присутствии изучаемых тест-соединений с ростом культуры без них. За МПК - минимальную подавляющую концентрацию принимали последнее разведение испытуемых препаратов с подавлением роста бактериальной культуры.
Полученные результаты представлены в таблицах.
Таблица 5
Определение МИК производных гемина
в отношении Гр+ штаммов (х10"5М)
Figure imgf000037_0001
Таблица 6
Определение МИК ванкомицина
в отношении Гр+ и Гр- штаммов (мкг/мл)
Бактериальные штаммы Ванкомицин
Staphylococcus aureus N° 25923 АТСС 1 ,0
Staphylococcus aureus N° 100 КС 1,0
Staphylococcus epidermidis N° 533 1,0
Enterococcus faecalis Ne 559 1 ,0 Enterococcus faecium >32,0
Таким образом, производные гемина общей формулы I активны в разной степени в отношении Гр+ штаммов резистентных бактерий.
Пример 15
Методика определения гемолитической активности соединений общей формулы I
Для исследования гемолитической активности использовали свежую капиллярную кровь человека. Эффективность гемолиза определяли по выходу гемоглобина из эритроцитов в среде RPMI-1640 (без фенолового красного, с добавлением 10% фетальной телячьей сывотки и 20 мМ L-глутамина) при начальной плотности эритроцитов (1 ,0±0,1)х 107 клеток/мл через 3 часа инкубации с агентом (37°С, 5% С02, 100% влажность, перемешивание на орбитальном шейкере).
В качестве характеристики гемолитической активности использовали долю гемоглобина, вышедшего из эритроцитов во внешнюю среду. Эритроциты, тени и промежуточные формы, содержащие не вышедший гемоглобин, отделяли центрифугированием. Гемоглобин определяли по поглощению супернатанта на длине волны 414 нм (вблизи максимума полосы Соре гема).
Поскольку все исследуемые соединения кроме GrD поглощают свет на данной длине волны, при расчете доли вышедшего гемоглобина учитывали поправку на поглощение каждого соединения с учетом его концентрации. Выход гемоглобина (ВГ) рассчитывали в процентах по оптической плотности (А) на длине волны 414 нм, используя формулу:
Br = [(Aei - A ■,ео ..MAmi - Amo^x lOO/CAet - Aeo) (2), где индекс е обозначает супернатант образца с эритроцитами, i - добавленную концентрацию соединения, о - супернатант образца без добавления исследуемых соединений , m - раствор без эритроцитов, t - супернатант образца со 100% лизированными эритроцитами. Доля вышедшего гемоглобина равна доле лизированных эритроцитов при условии, что лизис происходит полностью, то есть при лизисе из эритроцита выходит весь содержащийся в нем гемоглобин.
Исследование гемолитической активности выполняли в 2 повторах для каждого соединения, а результат усредняли.
Для определения гемолитической активности соединений использовали следующий экспериментальный протокол. Кровь (100 мкл) отбирали из пальца здорового донора в пробирку, содержащую 0,9 мл среды RPMI-1640 (без фенолового красного) и гепарин (10 ед/мл). Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 200xg и переносили в 10 мл среды RPMI-1640 (без фенолового красного, с добавлением 10% фетальной телячьей сывотки и 20 мМ L-глутамина, далее - полная среда). Плотность эритроцитов в суспензии определяли подсчетом в камере Горяева с помощью микроскопа "Микмед-2" (ЛОМО, Россия) и разбавляли полной средой до (2±0,2)χ 10 клеток/мл.
Методом последовательных разведений с шагом в 2 раза готовили серии растворов соединений в полной среде (максимальная концентрация 200 мкМ, минимальная - 1 ,6 мкМ, объем 75 мкл). К приготовленным растворам быстро добавляли 75 мкл суспензии эритроцитов с плотностью (2±0,2) 107 клеток/мл.
Для отрицательных контролей к 75 мкл суспензии эритроцитов с плотностью (2±0,2)χ 107 клеток/мл добавляли: а) 75 мкл полной среды (4 образца); б) 60 мкл полной среды и 15 мкл воды (4 образца); или в) 73,5 мкл полной среды и 1 ,5 мкл ДМСО (4 образца). Для определения 100%-ного выхода гемоглобина (положительный контроль, 4 образца) эритроциты из 75 мкл суспензии осаждали центрифугированием (5 мин при 200xg), осадок ресуспендировли в деионизированной воде (50 мкл), после полного лизиса объем пробы доводили полной средой до 150 мкл.
Все образцы (кроме положительного контроля) инкубировали в течение 3 ч при температуре 37°С, 5% С02, 100% влажности и перемешивании со скоростью 150 об/мин. Затем все образцы центрифугировали в течение 5 мин при 2700xg. В лунки 96-луночного планшета переносили по 130 мкл супернатанта из каждого образца. После чего с помощью фотометрического анализатора "Униплан" (Пикон, Россия) измеряли оптическую плотность в лунках планшета на длине волны 414 нм. Выход гемоглобина рассчитывали по формуле (2). На фиг.2 представлена гемолитическая активность производных гемина и соединений сравнения - грамицидина S, грамицидина D и гемина. Данные представлены в виде среднего по 2-м повторам ± стандартное отклонение.
Фиг.2.
Соединение XII, не проявляет гемолитическую активность вплоть до 100 мкМ. Вещества V, VI, VIII, IX, XVIII имеют низкую гемолитическую активность (фиг.2), причем эффективность гемолиза всех синтезированных соединений значительно ниже, чем у гемина, и весьма низка даже при максимальной концентрации соединений (100 мкМ).
Пример 16
Исследование цитотоксической активности соединений общей формулы (I) в отношении лейкоцитов человека
Суммарную фракцию лейкоцитов выделяли из крови человека методом свободной седиментации, для чего использовали свежеотобранную венозную кровь здорового донора.
Кровь (10 мл) с добавкой 10 ед./мл гепарина выдерживали в течение 2,5 ч при температуре 15-18°С в темноте. Отбирали светлый верхний слой жидкости (4 мл) над столбом оседающих эритроцитов, трижды отмывали сбалансированным солевым раствором Хенкса и ресуспендировали в среде RPMI-1640 (с добавлением 8% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L- глутамина и 10 мМ HEPES, далее - полная среда).
Концентрацию лейкоцитов и эритроцитов в суспензии определяли подсчетом в камере Горяева, после чего суспензию доводили полной средой до концентрации лейкоцитов (1 ,0±0,1)χ 106 клеток/мл. При этом концентрация эритроцитов в используемой для измерений суспензии клеток крови не превышала 30% от концентрации лейкоцитов.
Для определения цитотоксичности исследуемых соединений для лейкоцитов человека суспензию клеток переносили в лунки стерильных 96- луночных планшетов, методом последовательных разведений с шагом в 2 раза вносили исследуемые вещества (диапазон тестируемых концентраций: 3,2-100 мкМ для соединений GrD и грамицидина S 8-500 мкМ для соединения XIII; 8- 1000 мкМ для соединений V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XIV, XV, XIX и Нет) и аккуратно перемешивали. Эксперимент выполняли в двух параллельных повторах. В качестве контролей использовали клетки, к которым добавляли эквивалентное количество растворителя, в котором были приготовлены исследуемые вещества: воду для соединений VII и X; водный раствор ДМСО для соединения V, VI, VIII, IX; ДМСО для GrD, грамицидин S, Hem, XI, XIII, XIV, XV, XIX. Дополнительный контроль - суспензия лейкоцитов без всяких добавок.
Клетки инкубировали с исследуемыми соединениями 3 ч (37°С, 5% С02, 100% влажность). Гибель лейкоцитов оценивали при помощи флуоресцентной микроскопии. Для выявления мертвых и живых клеток использовали окрашивание йодистым пропидием (проникает только в ядра мертвых клеток) и Hoechst 33342 (окрашивает все ядра). Клетки инкубировали в планшетах 15 мин одновременно с йодистым пропидием и Hoechst 33342 (37°С, 5% С02), а затем планшеты помещали под микроскоп для анализа.
Долю погибших клеток определяли по флуоресцентным изображениям клеток в синей (Hoechst 33342) и красной (йодистый пропидий) областях спектра, полученным при помощи флуоресцентного микроскопа Axio Observer (Zeiss, Германия) с 10х объективом ("Plan-Neofluar" 1 Ох/0,3). Использовали следующие наборы флуоресцентных фильтров. Для йодистого пропидия: полосовой фильтр на возбуждение 530-585 нм; барьерное дихроичное зеркало 600 нм, длинноволновый барьерный анализирующий фильтр 615 нм. Для Hoechst 33342: полосовой фильтр на возбуждение 359-372 нм; барьерное дихроичное зеркало 395 нм, длинноволновый барьерный анализирующий фильтр 397 нм.
С помощью цифровой фотокамеры регистрировали три типа изображений клеток: а) в проходящем белом свете; б) флуоресцентное изображение в синей области спектра с ультрафиолетовым возбуждением; в) флуоресцентное изображение в красной области спектра с возбуждением зеленым светом. Фотографировали не менее 4 полей зрения на лунку в разных ее областях. Результат анализа усредняли по 1000-1500 клеток для каждой концентрации исследуемых соединений. Таблица 7
Цитотоксическая активность соединений общей формулы (I)
в отношении лейкоцитов человека
Figure imgf000042_0001
Соединения V, VII, VIII, IX и X в концентрации до 1 мМ не вызывают гибель лейкоцитов из крови человека. При этом небольшой токсический эффект растворов грамицидина S, XI, в ДМСО полностью обусловлен токсическим действием растворителя (ДМСО). Для соединений VI, XIII, XIV, XV и XIX обнаружен слабый токсический эффект, который проявляется при концентрациях, близких к 1 мМ, для соединений XIV, XV и XIX, при концентрациях больше 125 мкМ для соединений VI и XIII. Соединение сравнения - гемин обладает существенно более высокой токсичностью в отношении лейкоцитов по сравнению с заявляемыми соединениями (40% против 3-17%, таблица 7).
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности заявляемых веществ для создания на их основе нетоксичных, биосовместимых антимикробных агентов, в том числе для профилактики и лечения заболеваний, вызванных различными грамположительными бактериями, в том числе резистентными.
Пример 17
Исследование противогрибковой активности соединений общей формулы (I)
Объектом воздействия являлись клетки музейного штамма Cryptococcus neoformans N° 3465, а также клетки музейного штамма Candida albicans N°927, выращенных на глюкозо-пептон-дрожжевой среде при 32°С в течение 1 суток. В качестве соединения сравнения использовались антимикотики пимафуцин, амфотерицин, флуконазол.
Эксперимент проводили в круглодонных 96-луночных планшетах фирмы
"Ленмедполимер» в двух повторностях. В первый столбец (0) вносили 10 мкл стокового раствора водорастворимых препаратов с концентрацией 10"2-10"3 моль/л, во второй также 10 мкл плюс 10 мкл растворителя, соответствующего данному соединению, суспендировали и переносили 10 мкл в следующую ячейку, и т.д. до 8 ячейки ряда. Стоковые растворы водонерастворимых соединений общей формулы I (V, VIII, XII, XIII, XIV, гемин) готовили в ДМСО, разбавляли ДМСО и средой. Концентрация ДМСО в реакционной ячейке составляла < 5%.
Затем в каждую ячейку вносили 190 мкл суспензии клеток культуры Сг. neoformans в синтетической питательной среде (конечная концентрация клеток примерно 103 КОЕ/мл), содержащей рН-индикатор бромкрезоловый синий (рН среды 5,5, цвет индикатора - голубой). При понижении рН до 4,5 цвет индикатора в среде изменяется на желтый, что является признаком роста клеток гриба. Синтетическая среда состояла из следующих компонентов: соли, аминокислоты, микроэлементы, витамины, антибиотик и глюкоза (всего 30 компонентов) [Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts// In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- 1998.- Elsevier.- Ed. by Kurtsman CP, Fell J.W.- P.77- 100]. После внесения суспензии клеток Cr. neoformans планшет в течение 1 часа инкубировали при 32°С с перемешиванием, затем переносили в стационарный термостат и инкубировали 2 и 5 суток при 27°С. После внесения суспензии клеток С. albicans планшеты инкубировали в течение 1 часа при 32°С с перемешиванием, затем переносили в стационарный термостат и инкубировали 1 и 4 суток при 27°С.
Результаты приведены в таблице 8 и 9.
Таблица 8
Рост культуры Cryptococcus neoformans в присутствии
соединений общей формулы I
Figure imgf000044_0001
(-) - отсутствие роста, индикатор голубой;
(±) - слабый рост, индикатор желтый, но осадок выросших клеток в виде размытого пятна;
(+) - сильный рост, индикатор желтый, осадок клеток в виде плотного
компактного пятна;
* на 2 сутки голубой цвет до 6 ячейки, но с небольшим осадком на дне; на 5 сутки желтый; концентрация препаратов в 0 ячейке составляет 5,00* 10
Таблица 9
Рост культуры Candida albicans в присутствии
соединений общей формулы I
Figure imgf000045_0001
Контрольные посевы из ячеек, проведенные через 1-4 сутки воздействия соединениями общей формулы I, показали практически фунгицидный эффект соединения XVIII в концентрации около 5* 10"5 М.
Кроме того, соединение XII оказалось эффективным против одного из возбудителей крипотоккоза Cryptococcus humicolus с МПК 12,5 мкМ.
Таким образом, соединения общей формулы I проявляют фунгистатический и/или фунгицидный эффекты, величина которых зависит от строения и проявляется в интервале концентраций от 10 до 10~6 М.
Пример 18
Примеры лекарственных форм А. Желатиновые капсулы
Состав вводимого в капсулу порошка:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг
Оксид магния 50 мг
Крахмал 100-200 мг
Указанные выше ингредиенты смешивают, и смесь вводят в твердые желатиновые капсулы в количестве 151-285 мг.
Б. Таблетированная форма
Таблетированную форму получают, используя приведенные ниже ингредиенты:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг
Крахмал картофельный 100 мг
Поливинилпирролидон 10 мг
Магния стеарат 2 мг
Лактоза 48-82 мг
Аэросил 5 мг
Компоненты смешивают и прессуют для образования таблеток весом 200 мг каждая.
В. Аэрозольная форма
Состав аэрозольной смеси, рассчитанной на 10 приемов:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 10-100 мг
Магния сульфата 150 мг
Лактоза 110-140 мг
Соединение смешивают с наполнителями и помещают в специальное устройство для распыления.
Г. Суппозитории
В качестве суппозиторной основы могут быть использованы:
основы, не растворимые в воде - масло какао;
основы, растворимые в воде или смешиваемые с водой - желатино- глицериновые или полиэтиленоксидные;
комбинированные основы - мыльно-глицериновые. Пример состава суппозитория:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) - 1-50 мг,
Масло какао - количество, необходимое для получения суппозитория При необходимости возможно изготовление ректальных, вагинальных и уретральных суппозиториев с соответствующими наполнителями.
Д. Мази
В качестве мазевой основы могут быть использованы:
углеводородные мазевые основы - вазелин белый и желтый (Vaselinum album, Vaselinum flavum), вазелиновое масло (Oleum Vaselini), мазь белая и жидкая (Unguentum album, Unguentum flavum), а в качестве добавок для придания более плотной консистенции - твердый парафин и воск;
абсорбтивные мазевые основы - гидрофильный вазелин (Vaselinum hydrophylicum), ланолин (Lanolinum), кольдкрем (Unguentum leniens);
мазевые основы, смываемые водой - гидрофильная мазь (Unguentum hydrophylum); водорастворимые мазевые основы - полиэтиленгликолевая мазь (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), бентонитовые основы и другие.
Пример состава мази:
Соединение соответствующее общей формуле (I) 0,01 г - 0,1 г
Вазелин 10 г
Мази изготавливают по соответствующей технологии.
Е. Раствор для инъекций
В качестве растворителя при приготовлении раствора для инъекций могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина. Форма выпуска - ампулы, флаконы, шприц-тюбики.
Состав раствора для инъекций:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг
Вода дистиллированная 1 -2 мл
Возможно изготовление различных лекарственных форм для инъекций - стерильных растворов, стерильных порошков и таблеток.
Примеры композиций для дезинфицирующих и антисептических средств А. Соединение, соответствующее общей формуле (I) 0,001-1% 1- пропанол 30-40%
2- пропанол 10-70% вода дистиллированная 10-60%
Б. Соединение, соответствующее общей формуле I 0,001 -1%
Четвертичное аммониевое основание (или их смесь) 2-10%
Вода дистиллированная до 100%
В. Соединение, соответствующее общей формуле I 0,001-1%
Диметилсульфоксид (DMSO) 1-20% или полиэтиленгликоль (PEG) М.М. 200- 12000 1 -20% вода дистиллированная до 100%
Г. Соединение, соответствующее общей формуле I 0,001 - 1 %
Смесь спиртов, DMSO, PEG, ПАВ в различных сочетаниях
1-80% и соотношениях
вода дистиллированная до 100%
Д. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001 - 1 % вода дистиллированная до 100%
Таким образом, производные гемина общей формулы (I) обладают антибактериальной и противогрибковой активностью, в том числе в отношении патогенного для человека S. aureus и его резистентных штаммов. Кроме того, практически все заявленные производные гемина в различной степени обладают способностью увеличивать проницаемость модельных липидных мембран, что, как известно из литературных данных, представляет собой важную часть механизма антимикробного (антибактериального, противогрибкового,) действия антимикробных агентов. Эффективность соединений, соответствующих общей формуле I, подтверждает их пригодность для промышленного применения в составе дезинфицирующих, антисептических и терапевтических средств с противогрибковым и антибактериальным действием.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение сое инения общей формулы (I)
Figure imgf000049_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба R] и R2 одновременно не представляют собой -ОН, при этом
либо один из R] и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)- Trp-NHCH2CH2OH, где X=Trp, или Phe, или Туг (грамицидин D), - 5-цикло-(Огп- Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -Arg-Arg-Trp-Trp-Arg- Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -ArgOMe, -SerOMe, -PAlaHA, - PAlaHis, -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -NHCH(CH2OH)CH2OH, NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOM -НА или -Arg- ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000049_0002
Me" представляет собой Fe или Fe ;
или его изомеров или смесей изомеров, или их фармацевтически приемлемых солей, в качестве антимикробного средства.
2. Применение по п.1 , где антимикробное средство представляет собой антибактериальное средство.
3. Применение по п.2, где указанное антибактериальное средство проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus и/или Micrococcus.
4. Применение по п.З, где бактерии выбирают из видов Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Micrococcus luteus.
5. Применение по п.З, где бактерии относятся к штамму Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus N° 25923 ATCC, Staphylococcus aureus Ns 100 КС, Staphylococcus epidermidis N° 533, Enterococcus faecalis N° 559 или Enterococcus faecium N° 569.
6. Применение по n. l, где антимикробное средство представляет собой противогрибковое средство.
7. Применение по п.6, где указанное противогрибковое средство проявляет активность в отношении микроскопических грибов рода Candida и/или Criptococcus .
8. Применение по п.7, где микроскопические грибы представляют собой
Cryptococcus neoformans или Candida albicans.
9. Применение по п.6, где микроскопические грибы относятся к штамму Candida albicans N°927 или Cryptococcus neoformans Ns 3465.
10. Применение по любому из п.п.1-9, где в соединениях общей формулы (I)
либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp- (D-Leu)-Trp-NHCH2CH20H, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N - 4H Jio-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -Arg-Arg- Trp-Trp-Arg-Phe-OH,
либо R\ и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, - NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe, -HA или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000050_0001
1 1. Антимикробное средство, представляющее собой производное гемина общей формулы (I)
Figure imgf000051_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба Ri и R2 одновременно не представляют собой -ОН, при этом
либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTipHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)^-(D-Leu)- Τ -ΝΗΟΗ2ΟΗ2ΟΗ, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N -цикло-(Огп- Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -А^-А^-Т -Т -А^- Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -ArgOMe, -SerOMe, -pAlaHA, - pAlaHis, -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -NHCH(CH2OH)CH2OH, NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)- ArgOMe, -НА или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000051_0002
Меп+ представляет собой Fe2+ или Fe3+;
или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемую соль.
12. Антимикробное средство по п.П , которое представляет собой антибактериальное средство.
13. Антимикробное средство по п.12, которое проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus и/или Micrococcus.
14. Антимикробное средство по п.13, где бактерии выбирают из видов Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Micrococcus luteus.
15. Антимикробное средство по п.13, где бактерии относятся к штамму Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus N° 25923 ATCC, Staphylococcus aureus jNe 100 КС, Staphylococcus epidermidis N° 533, Enterococcus faecalis Ν° 559 или Enterococcus faecium N° 569.
16. Антимикробное средство по п.П, которое представляет собой противогрибковое средство.
17. Антимикробное средство по п.16, которое проявляет активность в отношении микроскопических грибов рода Candida и/или Criptococcus.
18. Антимикробное средство по п.17 микроскопические грибы представляют собой Cryptococcus neoformans или Candida albicans.
19. Антимикробное средство по п.17, где микроскопические грибы относятся к штамму Candida albicans N° 927 или Cryptococcus neoformans Ν° 3465.
20. Антимикробное средство по любому из п. п.11-19, где в соединениях общей формулы (I)
либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Уа1-01у-А1а-(0-Ьеи)-А1а-(0-Уа1)-Уа1-(0-Уа1)-Т -(0-Ьеи)-Х-(0-Ьеи)-Т - ' (D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH, где Х=Тф, или Phe, или Туг (грамицидин D), -Νδ- цикло-(Огп-Ьеи-0-РЬе-Рго-Уа1)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -Arg-Arg- Τφ-Τφ-Arg-Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, - NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe, -HA или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000052_0001
21. Фармацевтическая композиция, обладающая антимикробной активностью, включающая в качестве активного ингредиента соединение формулы (I)
Figure imgf000053_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба R] и R2 одновременно не представляют собой -ОН, при этом
либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)- Тф- НСН2СН2ОН, где Х=Тф, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N -цикло-(Огп- Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -А^-А^-Тф-Тф-А^- Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -ArgOMe, -SerOMe, -PAlaHA, - pAlaHis, -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -NHCH(CH2OH)CH2OH, NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)- ArgOMe, -НА или -Arg- ArgOMe,
Figure imgf000053_0002
где НА представляет собой остаток гистамина
Меп+ представляет собой Fe2+ или Fe3+ ;
или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.
22. Фармацевтическая композиция по п.21 , которая представляет собой антибактериальное средство.
23. Фармацевтическая композиция по п.22, которая проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus и/или Micrococcus.
24. Фармацевтическая композиция по п.23, где бактерии выбирают из видов Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Micrococcus luteus.
25. Фармацевтическая композиция по п.23, где бактерии относятся к штамму Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis BKM B-871 , Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus -Ni. 25923 ATCC, Staphylococcus aureus N° 100 КС, Staphylococcus epidermidis N° 533, Enterococcus faecalis N° 559 или Enterococcus faecium N° 569.
26. Фармацевтическая композиция по п.21 , которая представляет собой противогрибковое средство.
27. Фармацевтическая композиция по п.26, которая проявляет активность в отношении микроскопических грибов рода Candida и/или Criptococcus.
28. Фармацевтическая композиция по п.27, где микроскопические грибы представляют собой Cryptococcus neoformans или Candida albicans.
29. Фармацевтическая композиция по п.27, где микроскопические грибы относятся к штамму Candida albicans N°927 или Cryptococcus neoformans N° 3465.
30. Фармацевтическая композиция по любому из п.п.21-29, где в соединениях общей формулы (I)
либо один из R] и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Уа1-01у-А1а-(0-Ьеи)-А1а-(0-Уа1)-Уа1-(0-Уа1)-Тгр-(0-Ьеи)-Х-(0-Ьеи)-Тф- (D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -Νδ- цикло-(Огп-Ьеи-0-Рпе-Рго-Уа1)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -Arg-Arg- Trp-Trp-Arg-Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe (XV), - NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe (XVIII), -НА или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000054_0001
31. Способ лечения и/или профилактики заболеваний, вызванных бактериями или микроскопическими грибами, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту средства по любому из п.п.11-20 или фармацевтической композиции по любому из п.п.21-30.
32. Способ по п.31 , в котором заболевание вызвано бактериями.
33. Способ по п.32, в котором бактерии являются грамполо ительными бактериями рода Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus или Micrococcus.
34. Способ по п.33, где бактерии выбирают из видов Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Micrococcus luteus.
35. Способ по п.33, где бактерии относятся к штамму Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis BKM B-871 , Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus N° 25923 ATCC, Staphylococcus aureus Ν° 100 КС, Staphylococcus epidermidis N° 533, Enterococcus faecalis N° 559 или Enterococcus faecium N° 569.
36. Способ no n.31 , в котором заболевание вызвано микроскопическими грибами.
37. Способ по п.36, где микроскопические грибы относятся к роду Candida или Criptococcus.
38. Способ по п.37, где микроскопические грибы представляют собой Cryptococcus neoformans или Candida albicans.
39. Способ по п.37, где микроскопические грибы относятся к штамму Candida albicans N° 927 или Cryptococcus neoformans N° 3465.
40. Способ по любому из п. п.31-39, где в соединениях общей формулы (I) либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Уа1-С1у-А1а-(0-Ьеи)-А1а-(0-Уа1)-Уа1-(0-Уа1)-Тгр-(0-Ьеи)-Х-(0-Ьеи)-Т - (D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -Νδ- цикло-(Огп-Ьеи-В-РЬе-Рго-Уа1)2 (грамицидин S), -Arg-Gly-Asp-OH или -Arg-Arg- Trp-Trp-Arg-Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, - NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe, -HA или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000055_0001
41. Антисептическая и/или дезинфицирующая композиция, содержащая соединение общей формулы (I), охарактеризованное в п.1.
42. Антисептическая и/или дезинфицирующая композиция по п.41 , содержащая соединение общей формулы (I), охарактеризованное в п.10.
43. Производн гемина общей формулы (I)
Figure imgf000056_0001
где Ri и R2 одинаковые или различные, при условии, что оба R] и R2 одновременно не представляют собой -ОН,
при этом либо один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Уа1-С1у-А1а-(0-Ьеи)-А1а-(Б-Уа1)-Уа1-(0-Уа1)-Т -(0-Ьеи)-Х- (0-Ьеи)-Тгр-(0-Ьеи)-Тф- НСН2СН2ОН, где Х=Тгр, или Phe, или Туг (грамицидин D), -N -цикло-(Огп-Ьеи-0-РЬе-Рго-Уа1)2 (грамицидин S), -Arg-Gly- Asp-OH или -Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH,
либо Ri и R2 оба представляют собой -NHCH2CH2OH, -GlyOMe, -
NHCH(CH2OH)CH2OH, -NHCH2CH(OH)CH2OH, -Glu(ArgOMe)-ArgOMe (XVIII), -НА или -Arg-ArgOMe,
где НА представляет собой остаток гистамина
Figure imgf000056_0002
Меп+ представляет собой Fe2+ или Fe3+,
или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемая соль.
44. Соединение по п.43, где один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Arg-Gly-Asp-OH, или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемая соль.
45. Соединение по п.43, где один из R и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Уа1-01у-А1а-(0-Ьеи)-А1а-(0-Уа1)-Уа1-(0-Уа1)-Тф-(0-
Leu)-X-(D-Leu)^-(D-Leu)^-NHCH2CH2OH, где Х=Тф, Phe или Туг, (грамицидин D), или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемая соль.
46. Соединение по п.43, где один из К\ и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Ns-4Hioio-(OiTi-Leu-D-Phe-Pro-Val)2 (грамицидин S), или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемая соль.
47. Соединение по п.43, где Ri=R2=-NHCH2CH2OH, или его фармацевтически приемлемая соль.
48. Соединение по п.43, где Ri=R2=-GlyOMe, или его фармацевтически приемлемая соль.
49. Соединение по п.43, где Ri=R2=-NHCH(CH2OH)CH2OH, или его фармацевтически приемлемая соль.
50. Соединение по п.43, где R!=R2=-NHCH2CH(OH)CH2OH, или его фармацевтически приемлемая соль.
51. Соединение по п.43, где, Ri=R2=-Glu(ArgOMe)-ArgOMe, или его фармацевтически приемлемая соль.
52. Соединение по п.43, где Ri=R2=-HA, или его фармацевтически приемлемая соль.
53. Соединение по п.43, где один из Ri и R2 представляет собой -ОН, а другой представляет собой -Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH, или его изомер или смесь изомеров, или их фармацевтически приемлемая соль.
54. Соединение по п.43, где R!=R2=-Arg-ArgOMe, или его фармацевтически приемлемая соль.
55. Способ получения соединения общей формулы (I) по любому из п.п.43-54, включающий взаимодействие активированного по карбоксильной/ым группе/ам производного гемина с амино компонентом.
56. Способ по п.55, где в качестве активированного производного гемина используют 6,7-бис-М-оксисукцинимидный эфир гемина или 6(7)-MOHO-N-OKCH-5- норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир гемина, а в качестве растворителя используют Ν,Ν-диметилформамид.
57. Способ по п.55, где для активирования по одной из карбоксильных групп гемина используют ди-трет-бутилпирокарбонат, причем процесс проводят в Ν,Ν-диметилформамиде в присутствии пиридина.
PCT/RU2010/000488 2009-09-10 2010-09-08 Антимикробные средства на основе производных гемина Ceased WO2011031187A1 (ru)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA201204487A UA108480C2 (en) 2009-09-10 2010-08-09 Antimicrobials based on hemin derivatives
PL10815682T PL2476701T3 (pl) 2009-09-10 2010-09-08 Środki przeciwdrobnoustrojowe na bazie pochodnych heminy
EP10815682.9A EP2476701B8 (en) 2009-09-10 2010-09-08 Antimicrobial agents based on hemin derivatives
CN201080048604.3A CN102906110B (zh) 2009-09-10 2010-09-08 基于氯高铁血红素衍生物的抗微生物剂
EA201270405A EA020802B1 (ru) 2009-09-10 2010-09-08 Антимикробные средства на основе производных гемина
US13/395,149 US8906897B2 (en) 2009-09-10 2010-09-08 Antimicrobial agents based on hemin derivatives
IN2980DEN2012 IN2012DN02980A (ru) 2009-09-10 2010-09-08
DK10815682.9T DK2476701T3 (en) 2009-09-10 2010-09-08 Antimicrobial agents on the basis of heminderivater
ES10815682.9T ES2527432T3 (es) 2009-09-10 2010-09-08 Agentes antimicrobianos a base de derivados de hemina
HK13106895.8A HK1179278B (en) 2009-09-10 2010-09-08 Antimicrobial agents based on hemin derivatives

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009133914/04A RU2415868C1 (ru) 2009-09-10 2009-09-10 Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение
RU2009133914 2009-09-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011031187A1 true WO2011031187A1 (ru) 2011-03-17

Family

ID=43732659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000488 Ceased WO2011031187A1 (ru) 2009-09-10 2010-09-08 Антимикробные средства на основе производных гемина

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8906897B2 (ru)
EP (1) EP2476701B8 (ru)
CN (1) CN102906110B (ru)
DK (1) DK2476701T3 (ru)
EA (1) EA020802B1 (ru)
ES (1) ES2527432T3 (ru)
IN (1) IN2012DN02980A (ru)
PL (1) PL2476701T3 (ru)
RU (1) RU2415868C1 (ru)
UA (1) UA108480C2 (ru)
WO (1) WO2011031187A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2475498C1 (ru) * 2011-11-17 2013-02-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
CN102967649A (zh) * 2012-05-24 2013-03-13 新疆科丽生物技术有限公司 电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用
RU2656595C1 (ru) * 2018-03-16 2018-06-06 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Циклическое производное гемина с антимикробными свойствами и способ его синтеза

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3295962B1 (en) * 2016-09-15 2021-01-27 Nano4Imaging GmbH Tetrapyrrole conjugates as mri contrast agents
RU2678985C2 (ru) 2017-02-06 2019-02-05 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" Биоцидный пептид и препарат на его основе
WO2019023706A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 The Penn State Research Foundation ULTRASOUND-SENSITIVE PEPTIDE PARTICLES FOR ADMINISTRATION OF SPACE-RESOLVED MOLECULES

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001808A (en) 1996-08-19 1999-12-14 Metatron, Inc. Method of treating herpes virus infections with spermostatic gramicidin
RU2193038C2 (ru) * 1995-11-24 2002-11-20 Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко., Лтд. Способ получения металлсодержащих производных бактериохлорофилла, новые металлированные производные бактериохлорофилла, фармацевтическая композиция
RU2238950C2 (ru) 2002-04-25 2004-10-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Производные гемина и их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, применение и фармацевтическая композиция
RU2250906C2 (ru) 2003-07-10 2005-04-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
RU2280649C1 (ru) * 2004-11-26 2006-07-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептиды, их фармацевтически приемлемые соли, фармкомпозиция и применение в качестве противоопухолевых агентов
RU2296131C2 (ru) * 2004-11-26 2007-03-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептид, его фармацевтически приемлемые соли и применение в качестве противовирусного и вирулецидного агента
RU2007125604A (ru) 2007-07-09 2009-01-20 ООО "Фарминтерпрайсез" (RU) Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, композиция и применение

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629198A (en) * 1991-08-02 1997-05-13 Meiji Milk Products Co., Ltd. Anti-HIV agent

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2193038C2 (ru) * 1995-11-24 2002-11-20 Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко., Лтд. Способ получения металлсодержащих производных бактериохлорофилла, новые металлированные производные бактериохлорофилла, фармацевтическая композиция
US6001808A (en) 1996-08-19 1999-12-14 Metatron, Inc. Method of treating herpes virus infections with spermostatic gramicidin
RU2238950C2 (ru) 2002-04-25 2004-10-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Производные гемина и их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, применение и фармацевтическая композиция
RU2250906C2 (ru) 2003-07-10 2005-04-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
RU2280649C1 (ru) * 2004-11-26 2006-07-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептиды, их фармацевтически приемлемые соли, фармкомпозиция и применение в качестве противоопухолевых агентов
RU2296131C2 (ru) * 2004-11-26 2007-03-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептид, его фармацевтически приемлемые соли и применение в качестве противовирусного и вирулецидного агента
RU2007125604A (ru) 2007-07-09 2009-01-20 ООО "Фарминтерпрайсез" (RU) Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, композиция и применение

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. GIULIANI; G. PIRRI; S. F. NICOLETTO: "Antimicrobial Peptides: An Overview of a Promising Class of Therapeutics", CENTRAL EUROPEAN JOURNAL OF BIOLOGY, vol. 2, no. 1, 2007, pages 1 - 33
A. J. KASTIN: "Handbook of Biologically Active Peptides", 2006, ELSEVIER/ACADEMIC PRESS, pages: 576
AMSTERDAM, D.: "Antibiotics in Laboratory Medicine", 1996, WILLIAMS AND WILKINS, article "Susceptibility Testing of Antimicrobials in Liquid Media", pages: 52 - 111
G. NAGAMURTHI; S. RAMBHAV: "Gramicidin-S: Structure - Activity Relationship", J. BIOSCI., vol. 7, no. 3-4, 1985, pages 323 - 329
JINGBO XIAO; BERNARD WEISBLUM; PETER WIPF: "Electrostatic versus Steric Effects in Peptidomimicry: Synthesis and Secondary Structure Analysis of Gramicidin S Analogues with (E)-Alkene Peptide Isosteres", J. AM. CHEM. SOC., vol. 127, no. 16, 2005, pages 5742 - 5743
See also references of EP2476701A4 *
W. E. HERRELL; D. HEILMAN: "Experimental and Clinical Studies on Gramicidin", J. CLIN. INVEST., vol. 20, no. 583, 1941
W. E. HERRELLAND; D. HEILMAN: "Experimental and Clinical Studies on Gramicidin", J. CLIN. INVEST., vol. 20, 1941, pages 583 - 591
Y. N. ANTONENKO; T. B. STOILOVA; S. I. KOVALCHUK ET AL.: "Large Unselective Pore in Lipid Bilayer Membrane Formed by Positively Charged Peptides Containing a Sequence of Gramicidin A", FEES LETTERS, vol. 579, 2005, pages 5247 - 5252
Y. NITZAN; H. LADAN; S. GOZANSKY; Z. MALIK: "Characterization of Hemin Antibacterial Action on Staphylococcus aureus", FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 48, no. 3, 1987, pages 401 - 406
YARROW, D.: "The Yeasts. A Taxonomic Study", 1998, ELSEVIER, article "Methods for the Isolation, Maintenance and Identification of Yeasts", pages: 77 - 100
ZHELTUKHINA, G.A.; LOBANOVA, T.N.; NEBOLSIN, V.E.; GALLYAMOV, M.O.; DRANITSYNA, S.M; KOSTANYAN, LA., BIOORG. KHIM., vol. 32, no. 2, 2006, pages 198 - 210
ZHELTUKHINA, G.A.; LOBANOVA, T.N.; NEBOLSIN, VE.; GALLYAMOV, M.O.; DRANITSYNA, S.M; KOSTANYAN, LA., BIOORG. KHIM., vol. 32, no. 2, 2006, pages 198 - 210

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2475498C1 (ru) * 2011-11-17 2013-02-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
WO2013073998A3 (ru) * 2011-11-17 2013-08-08 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
CN104039824A (zh) * 2011-11-17 2014-09-10 制药有限责任公司 具有抗菌和抗病毒活性的氯高铁血红素之新衍生物
EP2781525A4 (en) * 2011-11-17 2015-05-27 Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstennostiyu Pharmentpr NEW DERIVATIVES OF HEMIN WITH ANTIBACTERIAL AND ANTIVIRAL EFFECT
EA023667B1 (ru) * 2011-11-17 2016-06-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
US9605013B2 (en) 2011-11-17 2017-03-28 Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostiyu “Pharmenterprises” Derivatives of hemin with antibacterial and antiviral activity
CN104039824B (zh) * 2011-11-17 2017-06-06 制药有限责任公司 具有抗菌和抗病毒活性的氯高铁血红素之新衍生物
CN102967649A (zh) * 2012-05-24 2013-03-13 新疆科丽生物技术有限公司 电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用
RU2656595C1 (ru) * 2018-03-16 2018-06-06 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Циклическое производное гемина с антимикробными свойствами и способ его синтеза

Also Published As

Publication number Publication date
EP2476701A1 (en) 2012-07-18
RU2415868C1 (ru) 2011-04-10
UA108480C2 (en) 2015-05-12
PL2476701T3 (pl) 2015-03-31
EP2476701B1 (en) 2014-08-13
HK1179278A1 (zh) 2013-09-27
CN102906110B (zh) 2016-04-13
EP2476701A4 (en) 2013-01-16
CN102906110A (zh) 2013-01-30
US20120264724A1 (en) 2012-10-18
IN2012DN02980A (ru) 2015-07-31
EA020802B1 (ru) 2015-01-30
EP2476701B8 (en) 2014-09-24
EA201270405A1 (ru) 2012-08-30
DK2476701T3 (en) 2014-11-17
ES2527432T3 (es) 2015-01-23
US8906897B2 (en) 2014-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhong et al. Design and synthesis of new N-terminal fatty acid modified-antimicrobial peptide analogues with potent in vitro biological activity
KR101345333B1 (ko) 라이신 및 트립토판 잔기가 ４번 반복된 신규한 항균 및 항진균 펩타이드 및 이의 용도
DE102009007381A1 (de) Antibiotische Peptide
KR101038542B1 (ko) 라이신과 프롤린 잔기 치환으로 박테리아 선택성을 높인새로운 수딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도
RU2415868C1 (ru) Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение
RU2475498C1 (ru) Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
KR20090002556A (ko) 개불 유래의 새로운 항균 펩타이드 및 그의 용도
WO2010104147A1 (ja) 抗酸化剤
CN115028685B (zh) 一种阳离子双环抗菌肽及其应用
Zhang et al. Rational design and synthesis of Oreoch-2 analogues as efficient broad-spectrum antimicrobial peptides
TWI403330B (zh) 低血球溶解性之抗微生物胜肽、醫藥組成物及其用途
CN121086025A (zh) 具有广谱抗菌活性的抗菌肽及其制备方法
US6358921B1 (en) Antimicrobial peptide compositions and method
US6800727B2 (en) Peptides with increased + charge and hydrophobicity by substituting one or more amino acids of CA-MA peptide and pharmaceutical compositions containing thereof
JP2013523661A (ja) 低赤血球溶解性の抗微生物ペプチド、医薬組成物およびその使用
US7745390B2 (en) Antimicrobial peptides
CN112457375B (zh) 多肽化合物及其制备方法与应用
HK1179278B (en) Antimicrobial agents based on hemin derivatives
CN116003453B (zh) 一种基于双1,4-消除反应的可逆环化肽及其应用
KR100980300B1 (ko) 라이신 펩토이드 잔기를 포함하는 새로운 박테리아선택성을 갖는 피시딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도
CN121086024A (zh) 抑制耐药性革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的新型抗菌肽及其制备方法
CN119504930A (zh) 一种广谱性大环多肽化合物及其制备方法、应用
WO2020065595A1 (es) Lipopeptidos cortos con actividad antimicrobiana contra bacterias gram negativas y gram positivas
Middleton Synthesis and Characterization of Antifungal Peptoids against Cryptococcus by Means of Structure Activity Relationship

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080048604.3

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10815682

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010815682

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201204487

Country of ref document: UA

Ref document number: 2980/DELNP/2012

Country of ref document: IN

Ref document number: 201270405

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13395149

Country of ref document: US