WO2011032537A1 - Inhibierung des schossens und blühens einer zuckerrübenpflanze - Google Patents

Inhibierung des schossens und blühens einer zuckerrübenpflanze Download PDF

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WO2011032537A1
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seq
sugar beet
flowering
nucleic acid
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Josef Kraus
Andreas Menze
David Wurbs
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KWS SAAT SE and Co KGaA
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Definitions

  • the present invention relates to an isolated nucleic acid for inhibiting the shoot and flowering of a sugar beet plant and its use, a protein, a process for producing a transgenic sugar beet plant in which the shoot and flowering after vulcanization is inhibited, vectors or mobile genetic elements, and a transgenic sugar beet in which the shoot and flowering is inhibited after varnish, and seeds and parts thereof.
  • molecular biological methods it is possible to genetically modify crops, thereby changing their properties and improving them.
  • An important feature for cultivation and exploitation of two-year-old plants such as the sugarbeet (Beta vulgaris) is that their shoots and subsequent flowering induction by a prolonged cold period, as occurs in temperate latitudes regularly in winter, needs. This change from the vegetative to the generative phase, caused by a persistent period of low temperatures, is called vemalization.
  • the object is achieved by means of an isolated nucleic acid, wherein the nucleic acid comprises a nucleotide sequence which
  • a) has a sequence or partial sequence of SEQ ID NO: 1-3, or
  • b) is complementary to a sequence or partial sequence of SEQ ID NO: 1-3, or
  • c) has a sequence or partial sequence of SEQ ID NO: 1-3 or a complementary sequence in the antisense direction, or
  • d) is homologous to a sequence or partial sequence of SEQ ID NO: 1-3, or e) is at least 80% identical to a sequence or partial sequence of SEQ ID NO: 1-3, or
  • f encodes a protein or a part of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or
  • the nucleic acid according to the invention can be used for this purpose, for example by means of the RNAi approach or miRNA approach (Fire, A, Xu, S, Montgomery, M, Kostas, S, Driver, S, Melo, C (1998), Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391 (6669): 806-811) to inhibit the shooting and flowering of sugar beets, primarily to completely prevent the shooting and flowering, if possible, eg by inhibiting genes encoding flower inductors such as FT, FUL, Co or VIN3.
  • the nucleic acid according to the invention is distinguished in particular by the fact that it can be used to produce transgenic plants, in particular sugar beet, having particular properties: it can preferably be used, for example, for the following purposes or with the following advantages:
  • the sugar beet is a biennial plant. After overwintering and subsequent vernalization, the sugar beet usually blossoms in the second year.
  • the nucleic acid according to the invention for example a sequence used in an RNAi or microRNA approach according to SEQ ID No: 5 to SEQ ID No: 7 or another sequence or partial sequence according to the invention, genes can be inhibited and the effects of vernalization inhibited or be completely prevented.
  • RNAi or micro (mi) RNA methods already mentioned and familiar to the person skilled in the art
  • SEQ ID No: 5 to SEQ ID No: 7 can be introduced into a sugar beet cell and expressed there by means of molecular biological techniques known to those skilled in the art in antisense orientation under the control of a suitable promoter.
  • the shooting and flowering of the plant can be completely prevented.
  • the beet seed can thus be exploited earlier, which ultimately leads to an extended vegetation period and thus to a higher biomass or a higher sugar yield.
  • the beets can also be cultivated as so-called winter beets.
  • sugar beet is grown in August, the turnip can already be harvested as lees in the following spring. This allows the farmer an additional crop rotation.
  • prolonged cold spells after sowing on the field no longer lead to increased formation of pores. Even without prolonged cold snaps observed in previous sugar beet Schosser Guess can be prevented or at least significantly reduced.
  • sugar beet cultivation normally takes place from April to October / November. Since not all harvested sugar beets can be processed at the same time, they must be stored or stored temporarily. During storage, eg in rents, large storage substance losses (sucrose losses) occur due to cleavage of the sucrose into glucose and fructose.
  • the sowing and harvest dates can be varied so that the total harvest time (campaign) can be extended without harvest losses. This allows more sugar beets to be processed for a longer period without or with little loss of storage substance.
  • sucgar beet or “sugar beet plant” is meant here a plant of the genus Beta vulgaris, e.g. Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima (sugar beet, S.S.), Beta vulgaris ssp. maritima (Lake Mangold), Beta vurlgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (chard), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (beetroot), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa / alba (fodder beet).
  • Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima sucgar beet, S.S.
  • Beta vulgaris ssp. maritima Lake Mangold
  • Beta vurlgaris ssp. vulgaris var. vulgaris chard
  • Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva beetroot
  • isolated nucleic acid is understood as meaning a nucleic acid dissolved out of its natural or original environment, and the term also encompasses a synthetically produced nucleic acid.
  • inhibiting the shooting and flowering of a sugar beet plant is a reduction of the proportion of cropping and possibly flowering sugar beet plants in comparison to a not according to the invention modified sugar beet plant in a comparable development phase, especially in the second year after passing through a corresponding cold period, ie after
  • the term includes a reduction in the proportion of coke to at most 80%, preferably at most 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% or 10%, more preferably at most 5%, 4%, 3 %, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% or 0.1% of the proportion by weight of control plants not modified according to the invention.
  • Control plants are preferably plants of the same variety However, which are not changed according to the present invention, and for example, have a Schosse- ranteil of a maximum of 0.01%.
  • ligation or "complete ligation” of the shoot and flowering, an inhibition of at least 99%, preferably at least 99.5%, more preferably at least 99.8% or at least 99.9%, ie a reduction of the Schosseranteils to at most 1%, at most 0.5%, at most 0.2% or at most 0.1%, in particular in the second year after vernalization, in comparison to a sugar beet plant not modified according to the invention, which for example has a shell fraction of not more than 0.01%.
  • inhibiting / inhibiting the shoot and blooming includes the inhibition / inhibition of the shoot, whether or not flowering of the plant occurs.
  • transgenic as used herein also encompasses the case where a native nucleic acid is introduced into the cell in a form, arrangement or amount in which the nucleic acid is not naturally present in the cell occurs.
  • homology refers to matches or similarities in the nucleotide sequence of two nucleic acid molecules or amino acid sequence of two proteins or peptides.
  • the presence of homology between two nucleic acids or proteins can be determined by placing one position in each sequence with the corresponding one Position in the other sequence compares and determines whether identical or similar residues are present
  • Two identical sequences are homologous if there is a certain minimum of identical or similar nucleotides.
  • Identity means that when comparing two sequences at equivalent positions, respectively Nucleotide or the same amino acid. If necessary, it may be necessary to take account of sequence gaps in order to produce the best possible alination of the comparison sequences.
  • nucleotides / amino acids are non-identical Nu eotide / amino acids with the same or equivalent physicochemical properties.
  • a nucleotide amino acid
  • another nucleotide another amino acid
  • physicochemical properties of an amino acid include hydrophobicity or charge.
  • nucleic acids In connection with nucleic acids is also spoken of a similar nucleotide or a conservative exchange when a nucleotide in a codon is replaced by another in a coding sequence, but, for example, due to the degeneracy of the genetic code, the same Amino acid or a similar amino acid as in the comparison sequence of the encoded codon coded.
  • nucleotide or amino acid exchange is a conservative exchange.
  • nucleic acids is preferably of a minimum length of 60 nucleotides or base pairs, preferably a minimum length of 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160, 180, 200th , 250, 300, 350 or 400 nucleotides or base pairs, particularly preferably of the full length of the nucleic acids to be compared, for proteins / peptides of a minimum length of 20 amino acids, preferably a minimum length of 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 or 300 amino acids, and most preferably from the full length of the amino acid sequences to be compared.
  • the degree of similarity ("positive") or identity of two sequences can be determined, for example, with the aid of the computer program BLAST (SF Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410 Determination of homology depends on the length of the sequences being compared For the purposes of the present invention, homology between at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of nucleic acid sequences, the shorter of which comprises at least 100 nucleotides nucleotides are identical and / or similar ("identities" or "positive” according to BLAST), preferably identical With a sequence length of 50-99 nucleotides, with an identity or at least similarity of at least 80%, preferably at least 85%, 86 %, 87%, 88% or 89%, with a sequence length of 15-49 nucleotides with an identity or
  • Hybridization or “hybridization” is understood to mean a process in which a single-stranded nucleic acid molecule attaches to a complementary nucleic acid strand, ie forms a base pair with it. Standard methods for hybridization are described, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001).
  • the stringency of the hybridization conditions refers to hybridization conditions: high stringency is found when base pairing is difficult, low stringency when base pairing is facilitated, for example, the stringency of the hybridization conditions depends on the salt concentration and ionic strength, respectively In general, the stringency can be increased by increasing the temperature and / or lowering the salt content.
  • Stringent hybridization conditions are to be understood as meaning those conditions in which hybridization occurs predominantly only between homologous nucleic acid molecules.
  • the term “hybridization conditions” does not only refer to the conditions prevailing during the actual attachment of the nucleic acids but also to the conditions prevailing during the subsequent washing steps.
  • Stringent hybridization conditions are, for example, conditions under which only those nucleic acid molecules predominantly hybridize, which are at least at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% sequence identity. Examples of less stringent hybridization conditions are: hybridization in 4 ⁇ SSC at 37 ° C. and subsequent multiple washing in 1 ⁇ SSC at room temperature. Stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 ⁇ SSC at 65 ° C. and subsequent multiple washing in 0.1 ⁇ SSC at 65 ° C. for a total of about 1 hour.
  • fragments or a "partial sequence" of a nucleic acid is here understood to mean a contiguous subsection of the nucleic acid, ie a sequence section consisting of successive nucleotides of the nucleic acid RNAi or miRNA approach can be used advantageously, wherein the sequence can be used for example in antisense ("antisense”) - direction.
  • Antisense or “Antisinnorient- tion” of a nucleic acid sequence means here, for example, that a transcription of the DNA sequence leads to an mRNA whose nucleotide sequence is complementary to a natural (endogenous) mRNA, so that their translation is hindered or prevented by addition of the complementary RNA.
  • An "antisense RNA” or “antisense RNA” is understood as meaning an RNA complementary to a particular mRNA or to certain other RNAs. Therefore, “antisense direction” or “antisense orientation” of an mRNA sequence means that the mRNA has a sequence which is complementary to an mRNA sequence whose translation can thus be hindered or prevented by attachment.
  • Partial sequences which can be advantageously used in the context of the present invention, for example in antisense orientation are, for example, nucleic acids having a sequence according to SEQ ID NO: 5, 6 or 7. These partial sequences are sections of the nucleic acid according to the invention according to SEQ ID NO : 3. It can but also any other nucleic acids with sequences or partial sequences of SEQ ID 1-3, for example in Antisinnraum be used.
  • a partial sequence of a nucleic acid comprises at least 15, preferably at least 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 or at least 100 consecutive nucleotides, more preferably at least 150, 200, 250, 300, 350, 400 or 450 consecutive nucleotides.
  • a part of a protein preferably comprises at least 5, preferably at least 10, 15, 20, 25, 30, 40 or 50, particularly preferably at least 60, 70, 80, 90 or at least 100 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 4.
  • sequence section of SEQ ID NO: 4 preferably comprises at least 50, 60, 70, 80 or 90, more preferably at least 100, 120, 150, 200 or 250 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 4.
  • the necessary or reasonable length of the partial sequence of the nucleic acid or of the protein or of the sequence section can be determined by one skilled in the art by means of its general skill and if necessary by carrying out routine experiments on the basis of the chosen approach and the intended effect, without any inventive step Activity would require.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably at least 85%, preferably at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, particularly preferably at least 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99, 8% or 99.9% identical to a sequence or partial sequence of SEQ ID NO: 1-3.
  • the present invention relates to the use of one or more of the nucleic acids of the invention for inhibiting the shooting and flowering of a sugar beet plant.
  • a nucleic acid according to the invention can be introduced, for example in antisense orientation, into a sugar beet plant, thereby ensuring an inhibition of the genes responsible for the induction of battling and flowering.
  • Methods which are suitable for introducing a nucleic acid according to the invention into a sugar beet cell are known in principle to the person skilled in the art and include, for example, Agrobacterium-mediated transformation.
  • the introduction of a nucleic acid in antisense orientation into a plant is only one of the methods known to those skilled in the art for the inhibition or suppression of gene activity.
  • novel linoleic acids are advantageously useful in other processes or mechanisms that can inhibit shoot / bloom suppression.
  • nucleic acids according to the invention can also be used as a probe for determining further factors, genes or gene products, with the aid of which the flowering and shooting of sugar beet plants can be inhibited and / or suppressed.
  • the present invention relates to a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a protein having an amino acid sequence which has a sequence section of SEQ ID NO: 4, preferably at least 50, 60, 70, 80 or 90, preferably at least 100, 120, 150, 200 or at least 250 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 4, or a protein from Beta vularis which is homologous to the protein having the amino acid sequence or a sequence segment of SEQ ID NO: 4.
  • the protein or any part thereof, or the corresponding amino acid sequences can be used, for example, as a probe at the amino acid level for determining further factors, genes or gene products, with the aid of which the flowering and shooting of sugar beet plants can be inhibited and / or suppressed ,
  • the present invention also relates to a method of producing a transgenic sugar beet plant, comprising the steps of (a) transforming a sugar beet cell with one or more nucleic acids of the invention and (b) obtaining a sugar beet plant from the transformed sugar beet cell.
  • the transformation of the sugar beet cell can be carried out, for example, by means of known vectors, e.g. a Ti plasmid, and is known in the art in principle.
  • the nucleic acids according to the invention can advantageously be placed under the control of a suitable promoter in such a vector.
  • the invention also relates to a vector or a mobile genetic element which comprises one or more nucleic acids according to the invention.
  • Vectors and mobile genetic elements are known in the art and include, for example, plasmids such as the Ti plasmid.
  • the vector or the mobile genetic element can advantageously contain control elements, for example a promoter.
  • the invention also relates to a sugar beet plant which comprises one or more nucleic acids according to the invention, preferably under the control of a suitable promoter, and in which the shoot and flowering is inhibited, and seeds and / or parts of a sugar beet plant according to the invention, with one or more several nucleic acids according to the invention are transformed.
  • FIG. 1 Schematic comparison (BLAST) of the respective positions of the PHD, FNIII and VID domains in BvVIL, AtVILl and AtVIN3. Also indicated is the proportion of identical or similar nucleotides ("identities" / "positive”, in%).
  • VIN3_Ath AtVIN3
  • VILl_Ath AtVILl
  • VIL_Bv BvVIL
  • Fig. 2 Lap and blight resistant sugar beet. Left: Boss-resistant BvVIL transformant WB4-7 (in the picture on the left) in comparison with the sweeping control (in the image on the right); Right:
  • Fig. 3 Schematic representation of the structure of the RNAi cassette used.
  • FIG. 4-6 Schematic representation of the fragments Sal-SMA-775> 1077 (FIG. 4), Sal-SMA-779> 1197 (FIG. 5) and Sal-SMA-971> used for generating the pRNAi vector 1466 (FIG. 6).
  • FIG. 7-9 Schematic representation of the vectors used for the production of RNAi constructs pRNAi-bwil-775> 1077sas (FIG. 7), pRNAi-bwil-779> 1 197sas (FIG. 8) and pRNA-bwil-971> 1466sas ( Figure 9).
  • Fig. 10-12 Schematic representation of the binary Ti plasmids used for Agrobacterium-mediated transformation pLHRNAi-bwil-775-1077sas (Fig. 10), pLHRNAi-bwil-779-1197sas (Fig. 11) and pLHRNAi-bwil_971-1446sas (Fig. 12).
  • 13 Schematic representation of the intron-exon structure of the genomic DNA of BvVIL, with indication of restriction sites.
  • a comparison (BLAST) of the obtained full-length clone or of the translated protein sequence shows only a slight sequence similarity with Arabidopsis "flowering genes” (eg At-VIL and AtVIN family), including the genes VIN3 (VRN7). , VIL1 (VR5), VIL2
  • Table 1 Sequence comparison of Bv-VIL with Arabidopsis thaliana (At) -VIL candidates at the DNA level. The comparison was carried out at 2343 bp for At-VIN3, 2163 bp for At-VILl, 2555 bp for At-VIL2, and 1700 bp for At-VIL2, and for At -VIL4 over a length of 1251 bp using the program AlignX (Clustal W).
  • a comparison (BLAST) of the individual domains shows that the new sequence is a VIL-like sequence. (Fig. 1).
  • the sequence (SEQ ID NO: 1) is therefore referred to here as BvVIL (Beta vulgaris vemalisation vin3-like).
  • BvVIL Beta vulgaris vemalisation vin3-like
  • a sequence comparison of BvVIL with AtVIL candidates at the overall DNA level only shows a maximum homology of 57.2% with AtVIL1. With other At genes of the VIL family shows an even lower sequence similarity.
  • RNAi constructs For the production of RNAi constructs, three regions within SEQ ID NO: 3 were used:
  • sequence according to SEQ ID NO: 5 was amplified by means of the primer pair F_PLT3 ⁇ 1: 775U27, CTgggATACTTgggTgTTggAAAAgC (SEQ ID NO: 8) and F_PLT3 ⁇ 1: 1050L28, TAgA- AACATTggCgAgCCATTCATTAgC (SEQ ID NO: 9) via PCR.
  • sequence according to SEQ ID NO: 6 was amplified by means of the primer pair F_PLT3 ⁇ 1: 779U24, gAACTACTgggTgTTggAAAAgCA (SEQ ID NO: 10), and F_PLT3 ⁇ 1: 1175L23 AATCAgT-CATTggTgTgggATA (SEQ ID NO: 11) via PCR.
  • sequence according to SEQ ID NO 7 was amplified by means of the primer pair F_PLT3 ⁇ 1: 971U21, CAAgATggCCAgAggTATTgT (SEQ ID NO: 12) and F_PLT3 ⁇ 1: 1426L21, CTTCCTTTTTA-CACCCCCCACTg (SEQ ID NO: 13) via PCR.
  • PCR was performed using 10 ng genomic sugar beet DNA, a primer concentration of 0.2 ⁇ at an annealing temperature of 55 ° C in a multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) PCR products were each added to the vector pRTRNAi (Hirner A, Ladwig F, Stransky H, Okumoto S, Keinath M, Harms A, Frommer WB, Koch W.
  • Arabidopsis LHT1 Is a High-Affinity Transporter for Cellular Amino Acid Uptake in Both Root Epidermis and Leaf Mesophyll Plant Cell .18 (8): 1931-46), integrated in an inverted repeat structure, based on the plasmid pRT100, and designed for the production of intronspliced hairpin structures.
  • the vector contains the 35S promoter for constitutive expression (Odell, JT Nagy, F., and Chua, N.-H. (1985), Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature 313, 810 -812), the Arabidopsis ATAAP6 intron and a polyA terminator.
  • the ATAAP6 intron is flanked by the Xhol / Ecl 136II cleavage sites at the 5 'end and by the Smal / Sall restriction cleavage sites at the 3' end, respectively.
  • This allows the integration of identical fragments "in sense” and "antisense", if these fragments have the compatible restriction sites Xhol or Sali, or at the other end are blunt-end, for which the original PCR products were replaced with new ones reamplified PCR primers extended around these restriction sites: Sal-SMA-775> 1077 gagaggacgtcgacctgggatacttgggtg (SEQ ID NO: 14) and cccccccgggtagaaacattggcgagc (SEQ ID NO: 15), SAL-SMA-779> 1197 gagaggacgtcgacgatacttgggtgttgg (SEQ ID NO: 16 ) and
  • PCR fragments were cloned into the TA cloning vector pCR2.1 (TOPO TA cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)) and transformed into E. coli.
  • the fragments Sal-SMA-775> 1077, SAL-SMA-779> 1197 and XHO-SMA-971> 1446 were each cut out by Sall / Smal or Xhol / Smal from the topovector and Subsequently, they were first ligated into the pRTR Ai vector cut with Sall / Smal or Xhol / Ecl 13611 in "sense.” The same fragments were then religated a second time in "antisense" into the compatible Xhol / Ecl 136II or Sall / Smal.
  • the expression cassettes were isolated after restriction of the pRNAi plasmids with HindIII, cloned into the binary vector pLH9000, and the resultant plasmids were amplified with pLHRNAi-bwil-775-1077sas, pLHRNAi-bwil-779-1197sas, and pLHRNAi-bwil-971 -1446sas called.
  • PCR was performed using 10 ng of genomic DNA, a primer concentration of 0.2 ⁇ at an annealing temperature of 55 ° C in a multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA). Checking the flowering and pelt behavior of the transformants
  • Non-flowering / non-flowering plants could be obtained from transformants of all three constructs used.
  • the location of the sequence used on the gene was not critical to the function.
  • the transformants obtained behaved like undenatured sugar beets. They did not start firing or blooming. 30 plants were tested for each independent transformant. All plants were bullet-proof and pitch-resistant without exception. None of the plants showed deviations from the normal phenotype. The plants were further cultivated, they continued to develop into normal beets with normal beet body. Lap and blister resistance persisted over the entire test period of over 4 months (see Fig. 2). A part of the plants was vernalformat a second time for another 3 months.
  • RNA used for the cDNA synthesis was checked by PCR for a contamination with genomic DNA, at the same time the result of the cDNA synthesis was examined in parallel.
  • the FIREPol DNA polymerase (Solis Biodyne, Tartu, Estonia) was used according to the instructions of the manufacturer. The control was total DNA.
  • the PCR program was calculated for a fragment size of 369 bp.
  • the primers were synthesized by Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany) and are listed in Table 3.
  • Total DNA was obtained from four-week-old greenhouse plants of the sugar beet line 3DC4156 with the DNeasy-Plant mini-kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the protocol isolated from the manufacturer.
  • the RevertAid first strand cDNA Synthes kit from Fermentas (Vilnius, Lithuania) was used to synthesize cDNA following the manufacturer's instructions.
  • the cDNA was used as a 1:10 dilution for qPCR analysis with an ABI-StepOnePlus real-time PCR machine, performing an S YBR-green based qPCR.
  • ABI's POWER-S YBR-green PCR mix (Foster City, USA) was used as a reaction buffer. When preparing the reaction mixtures, the instructions of the manufacturer were followed, in each case three repetitions were carried out.
  • the primers for the qPCR were synthesized by Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany) and are listed in Table 4. The primer pair nlosrealtl and nlosrealt2 served for normalization.
  • the qPCR was performed as shown in Table 5.
  • Steps 2-4 were repeated 40x, measurements were taken after step 4 and each step of melting point determination. From the qPCR analysis, relative expression levels for BvVIL were determined. The expression strength of the non-transgenic control was set as 1. The results are shown in Table 6 for the plants from vernalization.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zum Inhibieren des Schossens und Blühens einer Zuckerrübenpflanze bereit, u.a. eine isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO 1-3, die zur Herstellung einer Zuckerrübe verwendet werden kann, bei der das Schossen und Blühen nach Vernalisation inhibiert ist.

Description

Inhibierung des Schossens und Blühens einer Zuckerrübenpflanze
Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäure zum Inhibieren des Schossens und Blühens einer Zuckerrübenpflanze sowie deren Verwendung, ein Protein, ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zuckerrübenpflanze, bei der das Schossen und Blühen nach Vemalisation inhibiert ist, Vektoren oder mobile genetische Elemente sowie eine transgene Zuckerrübe, bei der das Schossen und Blühen nach Vemalisation inhibiert ist, und Samen und Teile davon. Mittels molekularbiologischer Methoden ist es möglich, Nutzpflanzen genetisch zu verändern, ihre Eigenschaften damit zu ändern und zu verbessern. Eine für den Anbau und die Nutzung wichtige Eigenschaft von zweijährigen Pflanzen wie der Zuckerrübe (Beta vulgaris) besteht darin, dass deren Schossen und anschließendes Blühen einer Induktion durch eine längere Kälteperiode, wie sie in gemäßigten Breiten regelmäßig im Winter auftritt, bedarf. Dieser durch eine andauernde Periode mit niedrigen Temperaturen hervorgerufene Wechsel von der vegetativen in die generative Phase wird als Vemalisation bezeichnet.
Es gibt verschiedene Stoffwechselwege, von denen das Blühen gesteuert wird. Dazu gehören u.a. der Langtagstoffwechselweg, ein autonomer, ein giberillinsäure- und ein vernalisationsab- hängiger Stoffwechselweg. Eine große Anzahl von Genen, die an der Regulation des Blühens beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren identifiziert werden. Besonders die Kontrolle des Blühzeitpunktes wurde extensiv an der Modellpflanze Arabidopsis erforscht (Boss, P.K., Bastow, R.M., Mylne, J.S., und Dean, C. (2004) Multiple pathways in the decision to flower: Enabling, promoting, and resetting, Plant Cell 16 Suppl: 18-31; He, Y. und Amasino, R. M. (2005) Role of chromatin modification in flowering-time control, Trends Plant Sei 10, 30-35; Bäurle, I. und Dean, C. (2006) The timing of developmental transitions in plants, Cell 125(4): 655-664). Vor allem mittels Arabidopsis-Mutantenanalyse konnten viele„Frühblüh"(„Early- flowering")- oder„Spätblüh"(„Late-flowering")-Gene identifiziert werden (Gazzani S., Gendali, A.R., Lister, C, und Dean, C. (2003) Analysis of the molecular basts of flowering time Variation in Arabidopsis accessions, Plant Physiol. 132: 1107-1114; Geraldo, N., Bäurle, I., Kidou, S., Hu, X., und Dean, C. (2009), FRIGIDA Delays Flowering in Arabidopsis via a Cotranscriptional Mechanism Involving Direct Interaction with the Nuclear Cap-Binding
BESTÄTIGUNGSKOPIE Complex, Plant Physiology, Juli 1, 2009; 150(3): 1611-1618; Michaels, SD, Amasino, RM (2001) Loss of FLOWERING LOCUS C activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations but not responsiveness to vernalization, Plant Cell 13: 935-942).
In Zuckerrübe wurde bisher nur BvFLC eingehend charakterisiert. Dabei hat sich gezeigt, dass dieses Gen nicht als Schlüsselkontrollgen für den Blühstoffwechsel bzw. die Vernalisation der Zuckerrübe dient (Reeves, PA, He, Y, Schmitz, RJ, Amasino, RM, Panella, LW, Richards, CM (2007), Evolutionary conservation of the FLOWERING LOCUS C-mediated vernalization response: evidence from the sugar beet (Beta vulgaris), Genetics 176(1): 295-307; Chia, T. Y. P., Müller, A., Jung, C, und Mutasa-Göttgens, E. S. (2008), Sugar beet contains a large CONSTANS-LIKE gene family including a CO homologue that is independent of the early- bolting (B) gene locus, J. Exp. Bot. 59(10): 2735-2748). Das Schossen und Blühen von Zuckerrübenpflanzen ist unerwünscht, da in diesem Fall nicht die Samen bzw. Früchte, sondern der unterirdische Teil der Pflanze, die Rübe, genutzt wird, deren Speicherstoffe jedoch während des Schossens und Blühens von der Pflanze aufgebraucht würden. Darüber hinaus kann bei einzelnen Pflanzen, die als„Schosser" bezeichnet werden, ein unerwünschtes Schossen bereits im Jahr der Aussaat auftreten, was bei Ernte und Verarbei- tung sehr nachteilig ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Mittel bereitzustellen, die es ermöglichen, das Schossen und/oder Blühen der Zuckerrübe zu inhibieren und sogar vollständig zu verhindern.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe mittels einer isolierten Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfasst, die
a) eine Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 aufweist, oder
b) zu einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 komplementär ist, oder
c) eine Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 oder eine dazu komplementäre Sequenz in Antisinn-Richtung aufweist, oder
d) zu einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 homolog ist, oder e) mit einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 zu mindestens 80% identisch ist, oder
f) für ein Protein oder einen Teil des Proteins mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 kodiert, oder
g) für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz aus Beta vulgaris kodiert, die zu der Sequenz der SEQ ID NO: 4 oder einem Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 4 homolog ist, oder h) mit einer Sequenz oder Teilsequenz gemäß SEQ ID NO: 1-3 oder einer dazu komplementären Nukleotidsequenz oder einer dazu in Antisinn-Richtung orientierten Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann dazu verwendet werden, beispielsweise mittels RNAi-Ansatz oder miRNA-Ansatz (Fire, A, Xu, S, Montgomery, M, Kostas, S, Driver, S, Mel- lo, C (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdi- tis elegans, Nature 391 (6669): 806-811) das Schossen und Blühen von Zuckerrüben zu hem- men, vornehmlich, das Schossen und Blühen nach Möglichkeit vollständig zu unterbinden, z.B. durch Inhibieren von Genen, die Blühinduktoren wie FT, FUL, Co oder VIN3 kodieren.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sich mit ihr transgene Pflanzen, insbesondere Zuckerrüben, mit besonderen Eigenschaften herstellen las- sen: In bevorzugter Weise lässt sie sich beispielsweise zu folgenden Zwecken bzw. mit folgenden Vorteilen verwenden:
Herstellung nichtschossender, nichtblühender Zuckerrüben
Herstellung einer Zuckerrübe als Winterrübe
Herstellung einer Zuckerrübe als Lenzrübe
Erhöhung der Biomasse von Zuckerrüben
Erhöhung des Zuckerertrages
Vermeidung der Schosserbildung bei Zuckerrüben
Verlängerung der Zuckerrübenkampagne
Vermeidung von Speichersubstanzverlusten bei Zuckerrüben
Nutzung der höheren Feuchte im Herbst
Bedeckung des Bodens und Nutzung des eingelagerten Stickstoffs Schutz für Nützlinge auf dem Feld
Die Zuckerrübe ist eine zweijährige Pflanze. Nach Überwinterung und damit erfolgter Vernali- sation kommt die Zuckerrübe normalerweise im zweiten Jahr zur Blüte. Mittels der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäure, zum Beispiel einer in einem RNAi- oder MicroRNA- Ansatz eingesetzten Sequenz gemäß SEQ ID No: 5 bis SEQ ID No: 7 oder einer anderen erfindungsgemäßen Sequenz oder Teilsequenz, können Gene inhibiert und die Effekte der Vernalisation inhibiert bzw. gänzlich unterbunden werden. Mechanismen und Methoden zur Inhibierung bzw. Abschaltung von Genen sind dem Fachmann beispielsweise unter dem Begriff„Gene silencing" bekannt und können die bereits erwähnten und dem Fachmann geläufigen RNAi- oder Micro(mi)RNA- Verfahren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt. In einem RNAi- Ansatz können beispielsweise die Sequenzen gemäß SEQ ID No: 5 bis SEQ ID No: 7 mittels dem Fachmann bekannter molekularbiologischer Techniken in Antisinnorientierung unter Kontrolle eines geeigneten Promotors in eine Zuckerrübenzelle eingebracht und dort exprimiert werden.
Durch die vorliegende Erfindung kann das Schossen und Blühen der Pflanze vollständig unterbunden werden. Das Rübensaatgut kann dadurch früher ausgebrächt werden, was letztlich zu einer verlängerten Vegetationsperiode und damit zu einer höheren Biomasse bzw. einem höhe- ren Zuckerertrag führt. In Kombination mit einer Kältetoleranz können die Rüben beispielsweise auch als so genannte Winterrüben angebaut werden. Bei einem Anbau der Zuckerrübe im August kann die Rübe im darauf folgenden Frühjahr bereits als Lenzrübe geerntet werden. Dies ermöglicht dem Landwirt eine zusätzliche Fruchtfolge. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure fuhren längere Kälteeinbrüche nach Aussaat auf dem Feld nicht mehr zu verstärkter Schosserbildung. Auch die ohne längere Kälteeinbrüche bei bisherigen Zuckerrüben beobachtbare Schosserbildung kann verhindert oder zumindest deutlich vermindert werden. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung kann nicht nur bewirkt werden, dass das Schossen und in der Folge davon auch das Blühen von Zuckerrüben nach einer ersten Vernalisation, d.h. im zweiten Jahr, inhibiert bzw. verhindert wird, sondern die Zuckerrübe auch wei- teren Kälteperioden ausgesetzt werden kann, ohne dass Vernalisationswirkungen beobachtbar wären. Der Zuckerrübenanbau erfolgt normalerweise von April bis Oktober/November. Da nicht alle geernteten Zuckerrüben zur gleichen Zeit verarbeitet werden können, müssen diese ein- bzw. zwischengelagert werden. Während der Lagerung z.B. in Mieten entstehen große Speichersubstanzverluste (Saccharoseverluste) durch Spaltung der Saccharose in Glucose und Fruktose. Mittels der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere bei deren Verwendung in einem RNAi Ansatz, können die Aussaat und Erntetermine so variiert werden, dass die Gesamterntezeit (Kampagne) ohne Ernteverluste verlängert werden kann. Es können damit mehr Zuckerrüben während eines längeren Zeitraums ohne oder mit geringem Speichersubstanzverlust verarbeitet werden.
Unter dem Begriff„Zuckerrübe" oder„Zuckerrübenpflanze" wird hier eine Pflanze der Gattung Beta vulgaris verstanden, z.B. Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima (Zuckerrübe i.e.S.), Beta vulgaris ssp. maritima (See-Mangold), Beta vurlgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (Mangold), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (Rote Rübe/Bete), Beta vulgaris ssp. vul- garis var. crassa/alba (Futterrübe).
Unter einer„isolierten Nukleinsäure" wird eine aus ihrer natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöste Nukleinsäure verstanden. Der Begriff umfasst auch eine synthetisch hergestellte Nukleinsäure.
Unter einer„Inhibierung des Schossens und Blühens" einer Zuckerrübenpflanze wird hier eine Minderung des Anteils von schossenden und gegebenenfalls blühenden Zuckerrübenpflanzen im Vergleich zu einer nicht erfindungsgemäß veränderten Zuckerrübenpflanze in einer vergleichbaren Entwicklungsphase, insbesondere im zweiten Jahr nach Durchlaufen einer entspre- chenden Kälteperiode, d.h. nach Vernalisation, verstanden. Insbesondere umfasst der Begriff eine Minderung des Schosseranteils auf höchstens 80%, vorzugsweise höchstens 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% oder 10%, besonders bevorzugt höchstens 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% oder 0,1% des Schosseranteils von nicht gemäß der Erfindung veränderten Kontrollpflanzen.„Kontrollpflanzen" sind vorzugsweise Pflanzen derselben Sorte, die jedoch nicht gemäß der vorliegenden Erfindung verändert sind, und die beispielsweise einen Schosse- ranteil von maximal 0.01% aufweisen. Unter dem Begriff„Unterbindung" oder„vollständige Unterbindung" des Schossens und Blühens wird eine Inhibierung um mindestens 99%, vor- zugsweise mindestens 99,5%, besonders bevorzugt mindestens 99,8% oder mindestens 99,9%, d.h. eine Minderung des Schosseranteils auf höchstens 1%, höchstens 0,5%, höchstens 0,2% oder höchstens 0,1%, insbesondere im zweiten Jahr nach Vernalisation, im Vergleich zu einer nicht erfindungsgemäß veränderten Zuckerrübenpflanze, die beispielsweise einen Schosseran- teil von maximal 0,01 % aufweist, verstanden. Der Begriff der Inhibierung bzw. des Unterbindens des Schossens und Blühens umfasst vor allem die Inhibierung/Unterbindung des Schossens, unabhängig davon, ob es zu einem Blühen der Pflanze kommt, oder nicht.
Der Begriff„transgen" bedeutet hier gentechnisch verändert. Der Begriff umfasst, wenn er hier verwendet wird, auch den Fall, dass eine arteigene Nukleinsäure in einer Form, Anordnung oder Menge in die Zelle eingebracht ist, in der die Nukleinsäure natürlicherweise nicht in der Zelle vorkommt.
Der Begriff„Homologie" bezieht sich auf Übereinstimmungen oder Ähnlichkeiten in der Nukleotidsequenz zweier Nukleinsäuremoleküle oder Aminosäuresequenz zweier Proteine bzw. Peptide. Das Vorhandensein einer Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren bzw. Proteinen kann festgestellt werden, indem man jeweils eine Position in der einen Sequenz mit der entsprechenden Position in der anderen Sequenz vergleicht und ermittelt, ob hier identische oder ähnliche Reste vorhanden sind. Zwei miteinander verglichene Sequenzen sind homolog, wenn ein bestimmter Mindestanteil identischer oder ähnlicher Nukleotide vorliegt.„Identisch" heißt, dass beim Vergleich zweier Sequenzen an äquivalenten Stellen jeweils dasselbe Nukleotid bzw. dieselbe Aminosäure steht. Dabei kann es gegebenenfalls erforderlich sein, Sequenzlücken zu berücksichtigen, um eine möglichst gute Alinierung der Vergleichssequenzen herzustellen. Ahnliche Nukleotide/Aminosäuren sind dabei nichtidentische Nu eotide/Aminosäuren mit gleichen oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften. Beim Austausch eines Nukleotids (einer Aminosäure) durch ein anderes Nukleotid (eine andere Aminosäure) mit gleichen oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften spricht man von einem „konservativen Austausch". Beispiele für physikalisch-chemische Eigenschaften einer Aminosäure sind beispielsweise die Hydrophobie oder die Ladung. In Zusammenhang mit Nuklein- säuren wird auch von einem ähnlichen Nukleotid bzw. einem konservativen Austausch gesprochen, wenn in einer kodierenden Sequenz ein Nukleotid in einem Kodon durch ein anderes ersetzt wird, wobei jedoch, z.B. aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes, dieselbe Aminosäure oder eine ähnliche Aminosäure wie in der Vergleichssequenz von dem vom Austausch betroffenen Kodon kodiert wird. Dem Fachmann ist bekannt, welcher Nukleotid- bzw. Aminosäureaustausch ein konservativer Austausch ist. Zur Feststellung des Grades an Ähnlichkeit bzw. Identität zwischen zwei Nukleinsäuren wird dabei vorzugsweise von einer Min- destlänge von 60 Nukleotiden bzw. Basenpaaren, bevorzugt einer Mindestlänge von 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350 oder 400 Nukleotiden bzw. Basenpaaren, besonders bevorzugt von der vollen Länge der zu vergleichenden Nukleinsäuren ausgegangen, bei Proteinen/Peptiden von einer Mindestlänge von 20 Aminosäuren, bevorzugt einer Mindestlänge von 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 oder 300 Aminosäuren, und beson- des bevorzugt von der vollen Länge der zu vergleichenden Aminosäuresequenzen ausgegangen. Der Grad der Ähnlichkeit („positives") oder Identität zweier Sequenzen kann beispielsweise mit Hilfe des Compute rogramms BLAST (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local A- lignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403-410; s. z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unter Verwendung von Standardparametern ermittelt werden. Die Feststellung einer Homolo- gie hängt von der Länge der verglichenen Sequenzen ab. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird von Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen, deren kürzere mindestens 100 Nukleotide umfasst, ausgegangen, wenn mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% der Nukleotide identisch und/oder ähnlich („identities" oder„positives" gemäß BLAST), vorzugsweise identisch, sind. Bei einer Sequenzlänge von 50-99 Nukleotiden wird bei einer Identität oder zumindest Ähnlichkeit von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, 86%, 87%, 88% oder 89%, bei einer Sequenzlänge von 15-49 Nukleotiden bei einer Identität oder Ähnlichkeit von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% von Homologie zwischen den Sequenzen ausgegangen. Bei Proteinen wird von Homologie ausgegangen, wenn bei Verwendung des Computerprogramms BLAST unter Verwendung von Standardparametern und der BLOSUM62-Substitutionsmatrix (Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid Substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sei. II- SA. 89: 10915-10919, 1992) eine Identität („identities") und/oder Ähnlichkeit ("positives"), vorzugsweise Identität, von mindestens 25%, mindestens 26%, mindestens 27%, mindestens 28%, mindestens 29%, mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 45%, mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindes- tens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% erhalten wird, wobei vorzugsweise die gesamte Länge des Proteins/Peptids, das mit einem anderen Protein verglichen wird, berücksichtigt wird, z.B. die Länge von 653 Aminosäuren im Falle der SEQ ID NO: 4. Dem Fachmann ist anhand seines Fachwissens ohne weiteres ersichtlich, welches der verfügba- ren BLAST-Programme (z.B. BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn oder tBLASTx) für die Ermittlung der Homologie in Frage kommt. Darüber hinaus existieren noch weitere Programme, die der Fachmann kennt, und die er im Bedarfsfall bei der Beurteilung der Homologie zweier oder mehrerer zu vergleichender Sequenzen oder Teilsequenzen heranziehen kann. Solche Programme sind beispielsweise auf den Internetseiten des European Bioinformatics Institu- te (EMBL) verfügbar (s. z.B. http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html).
Unter„Hybridisieren" oder„Hybridisierung" wird ein Vorgang verstanden, bei dem ein ein- zelsträngiges Nukleinsäuremolekül sich an einen komplementären Nukleinsäurestrang anlagert, d.h. mit diesem eine Basenpaarung eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind bei- spielsweise in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl. 2001) beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäurestranges eine Basenpaarung mit dem komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisie- rungsbedingungen ab. Der Begriff„Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungs- bedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungs- bedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Tempe- ratur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter„stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff„Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindes- tens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität aufweisen. Wenig stringente Hybridisierungsbedingun- gen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 37 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 1 x SSC bei Raumtemperatur. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind bei- spielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde.
Der Begriff„komplementär" bezieht sich auf die Fähigkeit von Purin- und Pyrimidinnukleoti- den, über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander Basenpaare zu bilden. Komplementäre Basenpaare sind beispielsweise Guanin und Cytosin, Adenin und Thymin sowie Adenin und Uracil. Ein komplementärer Nukleinsäurestrang ist dementsprechend ein Nukleinsäurestrang, der durch Paarung mit komplementären Basen eines anderen Nukleinsäurestrangs einen Doppelstrang bilden kann. Unter einem„Fragment" oder einer„Teilsequenz" einer Nukleinsäure ist hier ein zusammenhängender Teilabschnitt der Nukleinsäure zu verstehen, d.h. ein Sequenzabschnitt aus aufeinander folgenden Nukleotiden der Nukleinsäure. Fragmente können z.B. in einem RNAi- oder miRNA- Ansatz vorteilhaft eingesetzt werden, wobei die Sequenz dabei beispielsweise in Anti- sinn(„antisense")-Richtung eingesetzt werden kann.„Antisinnrichtung" bzw.„Antisinnorien- tierung" einer Nukleinsäuresequenz, z.B. einer DNA-Sequenz, bedeutet hier beispielsweise, dass eine Transkription der DNA-Sequenz zu einer mRNA führt, deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer natürlichen (endogenen) mRNA, so dass deren Translation durch Anlagerung der komplementären RNA behindert oder verhindert wird. Unter einer„Antisinn- RNA" bzw.„Antisense-RNA" wird eine zu einer bestimmten mRNA oder zu bestimmten an- deren RNAs komplementäre RNA verstanden.„Antisinnrichtung" oder„Antisinnorientierung" einer mRNA-Sequenz bedeutet daher, dass die mRNA eine Sequenz aufweist, die komplementär ist zu einer mRNA-Sequenz, deren Translation somit durch Anlagerung behindert oder verhindert werden kann. Teilsequenzen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft beispielsweise in Antisinnorientierung eingesetzt werden können, sind beispielsweise Nuklein- säuren mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 6 oder 7. Bei diesen Teilsequenzen handelt es sich um Abschnitte der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 3. Es können aber auch beliebige andere Nukleinsäuren mit Sequenzen oder Teilsequenzen der SEQ ID 1-3, zum Beispiel in Antisinnrichtung, eingesetzt werden.
Bevorzugt umfasst eine Teilsequenz einer Nukleinsäure mindestens 15, vorzugsweise mindes- tens 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400 oder 450 aufeinander folgende Nukleotide. Ein Teil eines Proteins (s. z.B. Buchstabe f) oben) umfasst vorzugsweise mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 40 oder 50, besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 4. Der Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 4 (s. z.B. Buchstabe g) oben) umfasst bevorzugt mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90, weiter bevorzugt mindestens 100, 120, 150, 200 oder 250 aufeinander folgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 4. Die erforderliche oder sinnvolle Länge der Teilsequenz der Nukleinsäure oder des Proteins oder des Sequenzabschnitts kann der Fachmann mit Hilfe seines allgemeinen Fachkönnens und gegebenenfalls unter Durchführung von Routineversuchen anhand des gewählten Ansatzes und der beabsichtigten Wirkung feststellen, ohne dass es hierzu einer erfinderischen Tätigkeit bedürfte.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist vorzugsweise zu mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, besonders bevorzugt mindestens 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% zu einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 identisch.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Inhibierung des Schossens und Blühens einer Zuckerrübenpflanze. Wie bereits oben angegeben, kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise in Antisinnorientierung in eine Zuckerrübenpflanze eingebracht werden, um dadurch für eine Inhibierung der für die Induktion des Schossens und Blühens verantwortlichen Gene zu sorgen. Verfahren, die zur Einführung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Zuckerrübenzelle geeignet sind, sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt, und umfassen beispielsweise die Agrobakterien- vermittelte Transformation. Das Einbringen einer Nukleinsäure in Antisinnorientierung in eine Pflanze ist allerdings nur eine der dem Fachmann bekannten Verfahren zur Hemmung oder Unterdrückung einer Genaktivität. Die erfindungsgemäßen Nuk- leinsäuren sind auch im Rahmen anderer Verfahren, oder Mechanismen, die eine Hemmung bzw. Unterdrückung des Schossens/Blühens bewirken können, vorteilhaft einsetzbar.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch als Sonde zur Ermittlung weiterer Faktoren, Gene bzw. Genprodukte verwendet werden, mit deren Hilfe das Blühen und Schossen von Zuckerrübenpflanzen gehemmt und/oder unterdrückt werden kann.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 oder ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die einen Sequenz- abschnitt der SEQ ID NO: 4, vorzugsweise mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90, bevorzugt mindestens 100, 120, 150, 200 oder mindestens 250 aufeinander folgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 4, umfasst, oder ein zu dem Protein mit der Aminosäuresequenz oder einem Sequenz- abschnitt der SEQ ID NO: 4 homologes Protein aus Beta vularis. Das Protein oder ein beliebiger Teil davon, bzw. die entsprechenden Aminosäuresequenzen, kann/können beispielsweise als Sonde auf Aminosäureebene zur Ermittlung weiterer Faktoren, Gene bzw. Genprodukte verwendet werden, mit deren Hilfe das Blühen und Schossen von Zuckerrübenpflanzen gehemmt und/oder unterdrückt werden kann.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Her- Stellung einer transgenen Zuckerrübenpflanze, umfassend die Schritte (a) des Transformierens einer Zuckerrübenzelle mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und (b) des Heranziehens einer Zuckerrübenpflanze aus der transformierten Zuckerrübenzelle. Die Transformation der Zuckerrübenzelle kann beispielsweise mit Hilfe bekannter Vektoren, z.B. eines Ti-Plasmids, erfolgen, und ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einem solchen Vektor vorteilhaft unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt sein.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor oder ein mobiles genetisches Element, das eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren umfasst. Vektoren und mobile genetische Elemente sind dem Fachmann bekannt und umfassen zum Beispiel Plasmide wie das Ti-Plasmid. Der Vektor bzw. das mobile genetische Element kann vorteilhaft Kontrollelemente, z.B. einen Promotor, enthalten. Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch eine Zuckerrübenpflanze, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren, vorzugsweise unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, umfasst, und bei der das Schossen und Blühen inhibiert ist, sowie Samen und/oder Teile einer erfindungsgemäßen Zuckerrübenpflanze, die mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren transformiert sind.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren rein zu Veranschaulichungszwecken näher erläutert.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 Schematischer Vergleich (BLAST) der jeweiligen Lage der PHD-, FNIII- und VID- Domänen in BvVIL, AtVILl und AtVIN3. Angegeben ist auch der Anteil identischer bzw. ähnlicher Nukleotide („identities"/„positives", in %). VIN3_Ath = AtVIN3, VILl_Ath = AtVILl, VIL_Bv = BvVIL
Fig. 2 Schoss- und blühresistente Zuckerrübe. Links: Schossresistente BvVIL-Transformante WB4-7 (im Bild links) im Vergleich mit schossender Kontrolle (im Bild rechts); Rechts:
BvVIL-Transformante WB4-7, mehrere Monate alt
Fig. 3 Schematische Darstellung zum Aufbau der verwendeten RNAi-Kassette.
Fig. 4-6 Schematische Darstellung der zur Erstellung des pRNAi- Vektors verwendeten Frag- mente Sal-SMA-775>1077 (Fig. 4), Sal-SMA-779>1197 (Fig. 5) und Sal-SMA-971>1466 (Fig. 6).
Fig. 7-9 Schematische Darstellung der zur Herstellung von RNAi-Konstrukten verwendeten Vektoren pRNAi-bwil-775>1077sas (Fig. 7), pRNAi-bwil-779>l 197sas (Fig. 8) und pRNAi- bwil-971>1466sas (Fig. 9). Fig. 10-12 Schematische Darstellung der für die Agrobakterien- vermittelte Transformation eingesetzten binären Ti-Plasmide pLHRNAi-bwil-775-1077sas (Fig. 10), pLHRNAi-bwil- 779-1197sas (Fig. 11) und pLHRNAi-bwil_971-1446sas (Fig. 12). Fig. 13 Schematische Darstellung der Intron-Exon-Struktur der genomischen DNA von BvVIL, mit Angabe von Restriktionsschnittstellen.
Fig. 14 Struktur der BvVIL-cDNA-Sequenz Ausführungsbeispiele
Identifizierung/Isolierung einer vollständigen cDNA der Zuckerrübe für das Unterbinden des Schossens und Blühens Durch Analysen einer eigens hierfür erstellten proprietären Zuckerrüben-EST-Datenbank wurde eine 1499bp lange, unvollständige cDNA (SEQ ID NO:3) identifiziert. Ausgehend von diesem unvollständigen cDNA-Bank-Klon wurde diese Sequenz vervollständigt. Die erhaltene Sequenz der c-DNA (SEQ ID NO:2) umfasste 1962bp (2285bp einschließlich 3'UTR). Das daraus resultierende Protein umfasst 653 Aminosäuren (SEQ ID NO:4). Die zugehörige geno- mische DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) umfasst 2366bp.
Ein Alignment der genomischen DNA mit cDNA zeigt den Aufbau der gesamten DNA, die aus 4 Exons und 3 Introns besteht (Fig. 13). Eine schematische Darstellung der cDNA ist in Fig. 14 zu finden. Charakterisierung/Annotierung der Sequenz
Ein Vergleich (BLAST) des erhaltenen Volllängen-Klons bzw. der übersetzten Protein- Sequenz zeigt eine nur geringe Sequenzähnlichkeit mit Arabidopsis-„Blüh-Genen" (z.B. At- VIL- und AtVIN-Familie). Dazu gehören die Gene VIN3 (VRN7), VIL1 (VR 5), VIL2
(VELl), VIL3 (VEL2) und VIL4 (VEL3). Die höchste Ähnlichkeit über die gesamte Sequenzlänge besteht zu AtVILl mit 57,2% (s. Tabelle 1).
Tabelle 1: Sequenzvergleich von Bv-VIL mit Arabidopsis-thaliana(At)-VIL-Kandidaten auf DNA-Ebene. Der Vergleich erfolgte bei At-VIN3 über eine Länge von 2343 bp, bei At-VILl über eine Länge von 2163 bp, bei At-VIL2 über eine Länge von 2555 bp, bei At-VIL3 über eine Länge von 1700 bp, und bei At-VIL4 über eine Länge von 1251 bp mit Hilfe des Programms AlignX (Clustal W).
Figure imgf000016_0001
Auch der Vergleich der Sequenzen auf Proteinebene mit der AtVIL- und -VIN-Genfamilie sowohl über die gesamte Sequenz als auch fokussiert auf die verschiedenen Domänen (charakteristisch für die VIL- und VIN-Genfamilie sind die PHD-, die FNIII- und die VID-Domänen) und die Bereiche zwischen den Domänen zeigt ebenfalls eine geringe Homologie (s. Tabelle. 2).
Tabelle 2: BvVIL-Sequenzvergleich auf Proteinebene mit VIL-Genen aus Arabidopsis (Vergleich mit der Gesamt-Sequenzen und einzelnen Domänen). At = Arabidopsis thaliana, Bv = Beta vulgaris, Anm. = Anmerkung, AS = Aminosäuren, ident. = identisch („identities"), pos. = ähnlich („positives"), Kons.-L. AS = Konsensus-Länge AS, gaps = Lücken
Gesamt Domänenvergleiche
Prä-PHD PHD- Inter-PHD- FN3 Inter-FN3-VID VID
Domäne FN3
ident. pos. Kons.- ident. pos. ident. pos. ident. pos. ident. pos. ident. pos. Anm ident. pos.
% % L. AS % % % % % % % % % % % %
AtVILl 46,1 57,3 641 28,8 48,5 66,7 78,8 58,9 67,9 44,7 62,4 34,9 41,3 49,6 61,7
AtVIL2 30,9 42,8 688 34,7 43,2 50,8 62,3 39,4 53,8 24,7 43,5 13 21,9 41,6 58,4
AtVIL3 23,4 33,6 692 16,4 25,9 55,2 65,7 36,3 46 20,7 42,5 3,6 8,3 gaps 44 55
AtVIN3 28,6 39,2 696 27,6 30,1 50 62,1 46,4 67,9 21,2 40 11,9 18 gaps 40,2 54,9 Ein Vergleich (BLAST) der einzelnen Domänen zeigt, dass es sich bei der neuen Sequenz um eine VIL-ähnliche Sequenz handelt. (Fig. 1). Die Sequenz (SEQ ID NO: 1) wird hier deshalb als BvVIL (Beta vulgaris vemalisation vin3-like) bezeichnet. Ein Sequenzvergleich BvVIL mit AtVIL-Kandidaten auf Gesamt-DNA-Ebene zeigt jedoch nur eine maximale Homologie von 57,2 % mit AtVILl . Mit anderen At-Genen der VIL-Familie zeigt sich eine noch geringere Sequenzähnlichkeit.
Eine Analyse nichttransgener Zuckerrüben auf Transkription von BvVIL vor, während und nach Vemalisation ergab, dass das Gen nicht nur nach Vemalisation transkribiert wird, sondern bereits vor, während und nach der Vemalisation konstitutiv aktiv ist. Im Gegensatz dazu wird beispielsweise VIN3 erst durch eine lang anhaltende Vemalisation aktiviert.
Herstellung von RNAi-Konstrukten
Für die Herstellung von RNAi Konstrukten wurden drei Bereiche innerhalb der SEQ ID NO: 3 verwendet:
Nukleotide 775 bis 1077 (SEQ ID NO: 5)
Nukleotide 779 bis 1197 (SEQ ID NO: 6)
Nukleotide 971 bis 1446 (SEQ ID NO: 7)
Die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 wurde mittels des Primerpaares F_PLT3~1:775U27, CTgggATACTTgggTgTTggAAAAAgC (SEQ ID NO: 8) und F_PLT3~1:1050L28, TAgA- AACATTggCgAgCCATTCATTAgC (SEQ ID NO: 9) über PCR amplifiziert.
Die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 wurde mittels des Primerpaares F_PLT3~1 :779U24, gA- TACTTgggTgTTggAAAAAgCA (SEQ ID NO: 10), und F_PLT3~1:1175L23 AATCAgT- CATTggTgTggggATA (SEQ ID NO: 11) über PCR amplifiziert. Die Sequenz gemäß SEQ ID NO 7 wurde mittels des Primerpaares F_PLT3~1:971U21, CAA- gATggCCAgAggTATTgT (SEQ ID NO: 12) und F_PLT3~1:1426L21, CTTCCTTTTTA- CAgCCCACTg (SEQ ID NO: 13) über PCR amplifiziert. Die PCR wurde unter Verwendung von 10 ng genomischer Zuckerrüben-DNA, einer Primer- konzentration von 0,2 μΜ bei einer„Annealing"-Temperatiur von 55 °C in einem Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden jeweils in den Vektor pRTRNAi (Hirner A, Ladwig F, Stransky H, Okumoto S, Keinath M, Harms A, Frommer WB, Koch W. (2006) Arabidopsis LHT1 Is a High-Affinity Transporter for Cellular Amino Acid Uptake in Both Root Epidermis and Leaf Mesophyll Plant Cell. 18(8): 1931 -46) in einer Inverted-Repeat-Struktur integriert. Der Vektor basiert auf dem Plasmid pRTlOO und ist konstruiert für die Herstellung von„intronspliced" Hairpinstrukturen. Der Vektor enthält den 35S-Promoter für eine konstitutive Expression (Odell, J. T. Nagy, F., und Chua, N.-H. (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature 313, 810-812), das ATAAP6-Intron aus Arabidopsis und einen PolyA- Terminator. Das ATAAP6-Intron ist flankiert von den Schnittstellen Xhol/Ecl 136II am 5 '- Ende bzw. von den Restriktionsschnittstellen Smal/Sall am 3 '-Ende. Dies ermöglicht die Integration von identischen Fragmenten„in sense" und„antisense", wenn diese Fragmente die kompatiblen Restriktionsschnittstellen Xhol oder Sali besitzen, bzw. am anderen Ende stump („blunt end") sind. Hierfür wurden die ursprünglichen PCR-Produkte mit neuen um diese Restriktionsschnittstellen verlängerten PCR-Primern reamplifiziert: Sal-SMA-775>1077 gagag- gacgtcgacctgggatacttgggtg (SEQ ID NO: 14) und ccccccgggtagaaacattggcgagc (SEQ ID NO: 15), SAL-SMA-779>1197 gagaggacgtcgacgatacttgggtgttgg (SEQ ID NO: 16) und
ccccccgggaatcagtcattggtgtggggata (SEQ ID NO: 17), XHO-SMA-971>1446 gagaggacctcgag- caagatggccagaggt (SEQ ID NO: 18) und gtcgacccccccgggcttccttttt (SEQ ID NO: 19). Zur weiteren Verwendung wurden die PCR Fragmente in den TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)) kloniert und in E. coli transformiert. Eine Blau- Weiss Selektion ermöglichte die Identifizierung rekombinanter Plasmide (Sambrook, J., Fritsch, E.. F., und Maniatis, T, 1989, In Molecular Cloning, A Laboratrory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Bei den weißen Kolonien ist durch ein Insert die Expression der ss-Galaktosidase unterdrückt, was zu weißen Kolonien f hrt, weil das dem Medium zugefugte Enzymsubstrat nicht mehr gespalten wird. Eine anschließende Sequenzierung mit M13-fwd rev-Primern wurde bei Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt. Die Analyse und das Alignment der Sequenzdaten erfolgte über das Programm Vektor NTI (Invitrogen, Carlsbad, USA). Die Fragmente Sal-SMA-775>1077, SAL-SMA-779>1197 und XHO-SMA-971>1446 (s. Fig. 4-6) wurden jeweils mittels Sall/Smal bzw. Xhol/Smal aus dem Topovektor herausgeschnitten und anschließend zuerst in den mit Sall/Smal bzw. Xhol/Ecl 13611 aufgeschnittenen pRTR Ai Vektor„in sense" ligiert. Anschließend wurden die gleichen Fragmente ein zweites Mal in„antisense" in die kompatiblen Xhol/Ecl 136II bzw. Sall/Smal religiert. Die Klonie- rangen resultierten in den Vektoren pRNAi-bwil-775- 1077sas, pRNAi-bwil-779- 1197sas und pRNAi-bwil_971-1446sas (Fig. 3, 7-9).
Herstellung von Transform ationskonstrukten Für die Herstellung von Transformationskonstrukten wurde der binäre Transformationsvektor pLH9000 (Hausmann, L. und Töpfer, R. (1999) Entwicklung von Plasmid- Vektoren. Vorträge zur Pflanzenzüchtung: Bioengineering für Rapssorten nach Maß 45: 155-172) (NCBI- Zugriffsnr.: AF458478) verwendet. Die Expressionskassetten wurden nach Restriktion der pRNAi-Plasmide mit Hindlll isoliert, in den binären Vektor pLH9000 kloniert, und die resul- tierenden Plasmide wurden mit pLHRNAi-bwil-775- 1077sas, pLHRNAi-bwil-779- 1197sas, und pLHRNAi-bwil-971-1446sas bezeichnet.
Zuckerrüben-Transformation und Überprüfung der Transgenität Für die Pflanzentransformation fanden die binären Vektoren pLHRNAi-bwil-775-1077sas, pLHRNAi-bwil-779-1197sas und pLHRNAi-bwil-971-1446sas Verwendung. Die binären Vektoren wurden in den Agrobacterium-tumefaciens-Stamm C58C1 mit dem residenten Plasmid pGV3101 durch ein direktes DNA-Transformationsverfahren (An, G. (1987), Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis, Methods Enzymol. 153, 292-305) transformiert. Die Selektion rekombinanter A.-tumefaciens-Klone erfolgte unter Verwendung des Antibiotikums Streptomycin (50 mg/1). Die Transformation der Zuckerrüben erfolgte nach Lindsey et al. (1991) unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin (Lindsey, K., Gallois, P., Eady, C. (1991), Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens, Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13; Kiuwer Academic Publishers). Die Trans- genität der Pflanzen wurde durch PCR überprüft. Die Verwendung der Primer GTGGA- GAGGCTATTCGGTA (SEQ ID NO: 20) und CCACCATGATATTCGGCAAG (SEQ ID NO: 21) führte zu der Amplifikation eines 553 bp großen DNA-Fragments aus dem nptll-Gen. Die PCR wurde unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA, einer Primerkonzentration von 0,2 μΜ bei einer Annealingtemperatur von 55 °C in einem Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) durchgeführt. Überprüfung des Blüh- und Schossverhaltens der Transform anten
Ca. 40 unabhängige Transformanten nebst nichttransgener isogener Kontrollen wurden in vitro vermehrt und ins Gewächshaus überführt. Nach einer Anpassungsphase wurden die Transformanten für 3 Monate bei 8°C in der Kühlkammer einer Vernalisation unterzogen (Simulation Winter). Anschließend wurden die Transformanten zusammen mit identisch behandelten nichttransgenen Kontrollpflanzen wieder zurück ins Gewächshaus (25 °C) überführt. Kurz nach Überführung, nach 10 Tagen bereits, begannen die Kontrollpflanzen zu schössen. Nach ca. 4 Wochen begannen die Kontrollpflanzen zu blühen. Im Gegensatz dazu zeigten 10 der 40 Transformanten (25%) überraschenderweise keine Reaktion auf die vorgenommene Schoss- und Blühinduktion mittels Vernalisation.
Es konnten von Transformanten aller drei verwendeten Konstrukte nichtschossen- de/nichtblühende Pflanzen erhalten werden. Die Lage der verwendeten Sequenz auf dem Gen war nicht entscheidend für die Funktion. Die erhaltenen Transformanten verhielten sich wie nicht vernalisierte Zuckerrüben. Sie begannen weder zu schössen noch zu blühen. Es wurden für jede unabhängige Transformante 30 Pflanzen getestet. Alle Pflanzen waren ohne Ausnahme schoss- und blühresistent. Keine der Pflanzen zeigte Abweichungen vom normalen Phänotyp. Die Pflanzen wurden weiter kultiviert, sie entwickelten sich weiter zu normalen Rüben mit normalem Rübenkörper. Die Schoss- und Blühresistenz hielt über den gesamten Prüfzeitraum von über 4 Monaten an (s. Fig. 2). Ein Teil der Pflanzen wurde ein zweites Mal für nochmals 3 Monate vernalisiert. Auch nach dieser zweiten Vernalisation konnten diese Pflanzen nach RückÜberführung ins Gewächshaus bei 25 °C nicht zum Schossen oder Blühen gebracht werden. Überraschenderweise kann somit mittels des erfindungsgemäßen transgenen Ansatzes bei Zuckerrüben die Vernalisation bzw. deren Wirkung, nämlich das Schossen und Blühen, vollständig blockiert bzw. rückgängig gemacht werden.
Nachweis der Reprimierung von BvVIL in Zuckerrübe durch RNAi-Ansatz mittels Ex- pressionsanalysen von Pflanzen während und nach Vernalisation.
Aus sieben Wochen alten Gewächshauspflanzen der Zuckerrübenlinien 3DC4156-wb5-l, 3DC4156-wb4-l, 3DC4156-wb4-14, 3DC4156-wb4-5, 3DC4156-wb5-18, 3DC4156-wb4-9, 3DC4156-wb4-7, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb7-l, 3DC4156-wbl8-l und einer nicht transgenen 3DC4156, die sich die drei letzten Wochen in der Vernalisation befanden, wurde RNA mit TRI-Reagenz (Sigma, St. Louis, USA) nach dem Protokoll des Herstellers isoliert.
Die für die cDNA-Synthese eingesetzte RNA wurde per PCR auf eine Verunreinigung mit ge- nomischer DNA überprüft, gleichzeitig wurde parallel das Ergebnis der cDNA-Synthese untersucht. Dabei wurde die FIREPol-DNA-Polymerase (Solis Biodyne, Tartu, Estland) nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Als Kontrolle diente Gesamt-DNA. Das PCR-Programm wurde für eine Fragmentgröße von 369 bp berechnet. Die Primer wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Primer zur Analyse der RNA/cDNA vin3fwdl994 tgacctaaatgtagtttcagttcc (SEQ ID NO: 22)
vin3rev2317 tcaaagttaccgtctagagaacc (SEQ ID NO: 23)
Gesamt-DNA wurde aus vier Wochen alten Gewächshauspflanzen der Zuckerrübenlinie 3DC4156 mit dem DNeasy-Plant-Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Das RevertAid-first-strand-cDNA-Synthes-Kit von Fermentas (Vilnius, Litauen) diente zur Synthese von cDNA, wobei die Angaben des Herstellers befolgt wurden.
Die cDNA wurde als 1:10- Verdünnung für qPCR- Analysen mit einer ABI-StepOnePlus-Real- Time-PCR-Maschine verwendet, es wurde eine S YBR-green-basierende qPCR durchgeführt. Der POWER-S YBR-green-PCR-Mix von ABI (Foster City, USA) wurde als Reaktionspuffer eingesetzt. Beim Ansetzen der Reaktionsansätze wurden die Angaben des Herstellers befolgt, es wurden jeweils drei Wiederholungen durchgeführt. Die Primer für die qPCR wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und sind in Tabelle 4 aufge- führt. Das Primerpaar nlosrealtl und nlosrealt2 diente dabei zur Normalisierung.
Tabelle 4: Primer zur qPCR- Analyse nlosrealtl GAGGAACTAGACATGGGGATACAT (SEQ ID NO: 24)
nlosrealt2 GCGATACAAAGTAGACATTAGAACTC (SEQ ID NO: 25)
vin3realtl TAGGAAGCAAAGCAGGAAGGGA (SEQ ID NO: 26)
vin3realt2 CCTCCGACAGAACGCATCATCT (SEQ ID NO: 27)
Die qPCR wurde durchgeführt wie in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5: qPCR/Programm
95°C 10 min
95°C 15 s
58°C 30 s
72°C 30 s
95°C 15 s
60°C 1 min
+0,5°C/s bis 95°C Schmelzpunktbestimmung
Die Schritte 2-4 wurden 40x wiederholt, Messungen fanden nach Schritt 4 und jedem Schritt der Schmelzpunktbestimmung statt. Aus der qPCR-Analyse wurden relative Expressionsstärken für BvVIL ermittelt. Die Expressionsstärke der nicht/transgenen Kontrolle wurde dabei als 1 gesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 für die Pflanzen aus der Vernalisation gezeigt.
Tabelle 6: Relative Expression von BvVIL in vernalisierten wb-Linien
Linie relative Expressionsstärke
wb k 5121 0,154
wb k 411 0,191
wb k 4141 0,21
wb k 451 0,238
wb k 5181 0,269
wb k 491 0,289
wb k 472 0,384
wb k 341 0,423
wb k 716 0,529
wb k l811 0,673
3DC WT 1
RNA wurde ebenfalls aus mehre Monate alten Gewächshauspflanzen der Zuckerrübenlinien 3DC4156-wb5-l, 3DC4156-wb4-l, 3DC4156-wb4-14, 3DC4156-wb4-5, 3DC4156-wb5-18, 3DC4156-wb4-9, 3DC4156-wb4-7, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb3-4, 3DC4156-wb7-l, die nach mehreren Vernalisationen nicht-schossend und -blühend blieben, und einer nicht transge- nen 3DC4156, die für vier Wochen im Gewächshaus angezogen worden war, mit TRI-Reagent (Sigma, St. Louis, USA) nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Bei der cDNA-Synthese wurde so verfahren, wie bereits oben für die vernalisierten Pflanzen angegeben.
Für die bereits mehrmals vernalisierten, nicht schossenden und nicht blühenden Pflanzen aus dem Gewächshaus wurde eine qPCR- Analyse nach dem gleichen Muster durchgeführt. Aus dieser qPCR- Analyse wurden ebenfalls relative Expressionsstärken für BvVIL ermittelt. Die Expressionsstärke der nicht-transgenen Kontrolle wurde dabei als 1 gesetzt. Die Ergebnisse für diese Pflanzen sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7: Relative Expression von BvVIL in nicht blühenden und nicht schossenden wb-Linien
Linie relative Expressionsstärke
wb k 5122 0.11
wb k 4142 0.15
wb k 5183 0.17
wb k 496 0.21
wb k 412 0.24
wb k 451 0.24
wb k 711 0.35
wb k 471 0.36
wb k 342 0.44
3DC WT 1
In beiden Ansätzen korreliert eine deutliche Reduktion des BvVIL-Transkriptes mit der Neigung zum Schossen und Blühen, und zwar derart, dass eine Reduktion des BvVIL Transkriptes auf unter 60% zu einer vollständigen Unterdrückung des Schossens und Blühens auszureichen scheint.
Eine Übersicht über die in der Anmeldung aufgeführten Sequenzen ist in der folgenden Tabelle 8 enthalten:
Tabelle 8: Sequenzübersicht
SEQ ID NO: Anmerkung
1 BvVIL, genomische DNA, 2366 nt
2 BvVIL, cDNA, einschließlich 3'-UTR, 2285 (3'-UTR = nt 1963-2285)
3 BvVIL, unvollständige cDNA, 1499 nt
4 BvVIL, Proteinsequenz, 653 AS 5 nt 775-1077 von SEQ ID NO 3, 303 nt
6 nt 779-1197 von SEQ ID NO 3, 419 nt
7 nt 971-1446 von SEQ ID NO 3, 476 nt
8-27 Primer
Sequenzprotokoll - freier Text
Primer Der Ausdruck„Artificial sequence" im Sequenzprotokoll bedeutet„künstliche Sequenz".

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Nukleinsäure zur Inhibierung des Schossens und Blühens einer Zuckerrüben- pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfasst, die
a) eine Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 aufweist, oder
b) zu einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 komplementär ist, oder c) eine Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 oder eine dazu komplementäre Sequenz in Antisinn-Richtung aufweist, oder
d) zu einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 homolog ist, oder
e) mit einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 zu mindestens 80% identisch ist, oder
f) für ein Protein oder einen Teil des Proteins mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 kodiert, oder
g) für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz aus Beta vulgaris kodiert, die zu der Sequenz der SEQ ID NO: 4 oder einem Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 4 homolog ist, oder
h) mit einer Sequenz oder Teilsequenz gemäß SEQ ID NO: 1-3 oder einer dazu komplementären Nukleotidsequenz oder einer dazu in Antisinn-Richtung orientierten Nukleo- tidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilsequenz mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide, besonders bevorzugt mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400 oder 450 aufeinander folgende Nukleotide der SEQ ID NO: 1-3 umfasst, und/oder der Teil des Proteins mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 40 oder 50, besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 4, und/oder der Sequenzabschnitt mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90, bevorzugt mindestens 100, 120, 150, 200 oder 250 aufeinander folgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 4, umfasst. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zu mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o- der 99%, besonders bevorzugt mindestens 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% zu einer Sequenz oder Teilsequenz der SEQ ID NO: 1-3 identisch ist.
Nukleinsäure nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 5, 6 oder 7, bevorzugt in Anti- sinnorientierung, umfasst.
Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Inhibierung des Schossens und Blühens einer Zuckerrübenpflanze.
Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 oder Protein mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90, bevorzugt mindestens 100, 120, 150, 200 oder 250 aufeinander folgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 4, umfasst, oder ein hierzu homologes Protein aus Beta vulgaris.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zuckerrübenpflanze, bei der das Schossen und Blühen nach Vernalisation inhibiert ist, umfassend die Schritte (a) des Transformierens einer Zuckerrübenzelle mit einer oder mehreren Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und b) des Heranziehens einer Zuckerrübenpflanze aus der transformierten Zuckerrübenzelle.
Vektor oder mobiles genetisches Element, umfassend eine oder mehrere Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Transgene Zuckerrübenpflanze, umfassend eine oder mehrere Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der das Schossen und Blühen inhibiert ist.
Samen oder Teile einer transgenen Zuckerrübenpflanze nach Anspruch 9, die mit einer oder mehreren Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 transformiert sind.
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