WO2011070214A2 - Conjugados y composiciones para inmunoterapia y tratamiento anti-tumoral - Google Patents

Conjugados y composiciones para inmunoterapia y tratamiento anti-tumoral Download PDF

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Pedro BERRAONDO LÓPEZ
Jessica Fioravanti
José MEDINA ECHEVERZ
Ignacio Javier Melero Bermejo
Maria Del Carmen Ochoa Nieto
Francisco De Asis Palaz0N Garcia
Silvia Bulfone-Paus
Erwin Hans Duitman
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Definitions

  • the present invention is within the scope of immunology and, more specifically, in the field of compositions that have the ability to promote both the innate immune response and the adaptive immune response in a subject. These compositions are useful for the treatment of all those diseases that require greater activity of the immune system, such as tumors and infectious diseases.
  • Interleukin 15 is an essential cytokine for the activity of NK, NKT cells and CD8 memory T lymphocytes. It exerts its function by means of a receiver that consists of 3 subunits called ⁇ , ⁇ and ⁇ . The ⁇ and ⁇ subunits are common to the IL-2 receptor. The ⁇ chain of the IL15 receptor is unique to the IL15 and is necessary for the exit to the extracellular medium of the cytokine [Duitman, EH, et al, Mol Cell Biol, 2008. 28: 4851-61] and "presents" the IL15 to the IL15RP and IL15Ry subunits.
  • this interleukin Due to the stimulating properties of the immune system, this interleukin has anti-tumor properties dependent on the presence of NK cells (Suzuki, 2001, J.Leuokoc.BioL, 69: 531-537) and T cells (Hazama, 1999, Br .J.Cancer., 80: 1420-1426, Meazza, 2000, Int.J.Cancer, 87: 574-581 and Klebanoff, 2004, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2004, 101: 1969-1974) .
  • IL 15 is also involved in the protection against viral infections and in the expansion and maintenance of a T-cell response in the immunization and development of dendritic cells.
  • IL15 may be a useful therapeutic agent in the treatment of diseases in which the immune system is involved.
  • studies in alive to characterize the function of IL15 have been impeded due in part to the lack of availability of recombinant IL15 and the low level of secretion observed when IL15 is expressed from the native gene.
  • most cytokines have very small plasma half-lives since they occur in vivo locally and transiently. Therefore, the use of IL15 in vivo requires the use of relatively high doses and frequent administrations, resulting in different side effects that can result in patients suffering from cancer cannot tolerate the treatment.
  • IL15 has been used in antitumor therapy in combination with other treatments such as anti-CD40, IL-7 or IL-6 antibodies [Chou, PC, et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol, 130: 25-34; Lin, CY, et al., Cancer Lett, 2008. 272 (2): p. 285-95; Zhang, M., et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2009, 106: 7513-8 and Cha, E., et al., Breast Cancer Res Treat, 2009]. These combinations show a synergistic effect which allows to achieve similar effects with lower doses of IL15.
  • IL15 Another possibility of increasing the activity of IL15 consists in its co-administration with a fusion protein comprising the constant region of an immunoglobulin and the soluble region of the ⁇ chain of the IL15 receptor, resulting in a 50-fold increase in the activity of IL15 (Rubinstein MP et al, 2006, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103: 9166-71 and Stoklasek TA et al, 2006, J. Immunol; 177: 6072-80).
  • “sushi domain” is an agonist of IL15 [Mortier, E., et al., J Biol Chem, 2006.
  • a fusion protein containing said domain and IL15 shows an antitumor effect superior to that of IL15 and which results in a 65% decrease in the number of lung metastases of the B16F10 tumor and in the decrease in the number of metastases of human HCT-116 tumor implanted in the blind intestine of nude mice [Bessard, A., et al, Mol Cancer Ther, 2009. 8 (9): p.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising, together or separately,
  • IL15 or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70%> identity with IL15 and a polynucleotide encoding IL15 or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70%) identity with IL1 and
  • a polymucleotide that encodes the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70% identity with the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor.
  • the invention relates to a fusion protein comprising
  • the invention relates to a polymucleotide encoding a fusion protein of the invention, with a vector or a gene construct comprising a polynucleotide of the invention, with a host cell comprising a fusion protein of the invention, with a polynucleotide of the invention, with a vector of the invention or a gene construct of the invention.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a composition of the invention, a fusion protein of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector or a gene construct of the invention, a host cell of the invention.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle comprising contacting a population of lymphocytes previously exposed in vivo to said antigen with a composition of the invention, a protein. of fusion of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector or a gene construct of the invention, a host cell of the invention.
  • the invention relates to a composition of the invention, a fusion protein of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector or a gene construct of the invention, a host cell of the invention for use in medicine or for the treatment of diseases that require the stimulation of the immune response of a subject.
  • FIG. 1 Functional proliferation assay of pApo-hIL15 co-administered with pSushi by hydrodynamic injection.
  • CTLL2 cells were cultured with serial dilutions of sera obtained 24 hours after treating mice with pApo-hIL15 and pApo-hIL15 + pSushi.
  • the incorporation of tritiated thymidine into CTLL2 cells was studied as a proliferation index (cpm) and it was observed that the sera of the mice treated simultaneously with pApo-hIL15 and pSushi induced a greater proliferation than the sera of mice treated only with pApo-hIL15 (p ⁇ 0.001).
  • the mean and standard error of the mean of a representative experiment with 4-5 animals per group is shown. The results were statistically compared using ANO VA of repeated measures.
  • Figure 3 Increase in the total number and percentage of CD8 + T cells with respect to total splenocytes over time (t (d), in days).
  • Groups of C57B16 mice received the different plasmid constructs by hydrodynamic injection and at 3, 4, 5, 6 and 7 days they were sacrificed and the spleens were removed.
  • the number of CD8 + T cells A
  • the percentage of CD8 + T cells with respect to total splenocytes B
  • the number of CD8 CD44 + T memory cells were analyzed + with respect to total splenocytes (D).
  • mice that were given plasmids pApo-hIL 15 and pSushi ( ⁇ ) have a greater number of CD8 + T cells than the rest of the groups: pApo-hIL15 ( ⁇ ), phIL15 + pSushi (A), phIL15 ( ⁇ ), pApo (o) and saline vehicle (*).
  • the mean and standard error of the mean of a representative experiment with 2 animals per group are shown.
  • FIG. 4 Increase in the percentage of CD8 + T cells with respect to total liver lymphocytes over time (t (d), in days).
  • C57B16 mice received the different constructions hydrodynamically. At 3, 4, 5, 6 and 7 days, the livers were sacrificed and the livers were isolated. The percentage of CD8 + T cells was analyzed for total lymphocytes.
  • the group of mice given the plasmids pApo-hIL15 and pSushi ( ⁇ ) had a higher percentage of CD8 + T cells than the rest of the groups: pApo-hIL15 ( ⁇ ), phIL15 + pSushi (A), phIL15 ( ⁇ ), pApo ( ⁇ ) and saline vehicles (*).
  • FIG. 6 Antitumor effect in time (t (d), in days) of the constructs in the CT26 subcutaneous tumor model.
  • Balb / c mice received 5xl0 5 CT26 cells subcutaneously and after 3 days they were treated hydrodynamically with pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo or with saline solution (S). Tumors were measured in mm 2 with a digital caliber every 2 days (A), and the survival time (% SV) of the animals (B) was observed.
  • mice that were given the plasmids pApo-hIL15 and pSushi had a delayed growth of the tumors and a greater survival than the mice of the rest of the groups.
  • the mean and standard error of the mean of a representative experiment with 8 animals per group are shown.
  • FIG. 7 Antitumor effect over time (t (d): in days) of plasmids in the MC38 subcutaneous tumor model.
  • C57B 16 mice received 5xl 0 5 MC38 cells subcutaneously and at 6 days were hydrodynamically treated with pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo or with saline solution (S). Tumors were measured in mm 2 with a digital caliber every 2 days (A), and the survival time (% SV) of the animals (B) was observed.
  • mice were sacrificed and the mice were divided into 3 groups: I, mice killed due to liver metastases or with generalized metastases; II, mice that present metastases in part of the liver tissue; III, mice free of liver metastases. Data from a representative experiment are shown.
  • Figure 9 Effect of the different plasmids in knock out mice for the IL15 ⁇ receptor.
  • Four mice lacking the IL15 ⁇ receptor were treated by hydrodynamics with plasmids pApo-hIL15 and pSushi, phIL15 and pSushi, pApo and pApo-hIL15. They were sacrificed at 5 days, the spleen was removed and splenic populations of NK cells and CD8 + T lymphocytes were studied by flow cytometry using the CD3 marker for differentiation.
  • the figure also includes the populations of NK and T CD8 + memory of a non-mutated C57B 16 mouse.
  • NK cells A
  • B CD8 + T lymphocytes
  • C subpopulation CD8 + CD44 +
  • Figure 10 Increase in the total number of splenocytes and CD8 + and NK1.1 T cells.
  • mice Groups of C57B16 mice were treated by hydrodynamic injection with the plasmids: 1) pmSushi-mIL15-mApo; 2) pApo-hIL 15 in combination with pSushi (pApo-hIL15 + pSushi); 3) pApo-hIL15; 4) phIL15 in combination with pSushi (phIL15 + pSushi); 5) phIL15 and 6) pApo.
  • the spleens were sacrificed and the spleens were removed.
  • the population of total splenocytes was studied by flow cytometry; B) CD8 + memory T lymphocytes (CD8 + CD3 + ); and C) of NK cells (NK1.1 + CD3 + ).
  • the group of mice that were administered pmSushi-mIL15-mApo had higher number of CD8 T cells with respect to total splenocytes than the rest of the groups.
  • the mean and standard error of the mean of a representative experiment with 2-3 animals per group is shown.
  • the data were analyzed by one-way ANOVA followed by a Bonferroni test comparing the pmSushi-mIL15-mApo group with the rest of the injected groups with plasmids encoding the indicated proteins * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.001; *** p ⁇ 0.0001.
  • FIG. 11 Comparative effect of the human or murine iso15 form of IL15 on increasing the total number of splenocytes and on the percentage of CD8 + T cells and NK cells with respect to total splenocytes.
  • Groups of C57BL / 6 mice were treated by hydrodynamic injection with the plasmids: 1) pmIL15; 2) phIL15; 3) pmIL 15 in combination withpSushi; and 4) phIL15 in combination with pSushi.
  • the spleens were sacrificed and isolated and the total splenocytes (A), the CD8 T cells were counted with respect to the number of total splenocytes (B), and the NK cells with respect to the number of total splenocytes (C).
  • the mean and standard error of the mean (if any) of a representative experiment with 1-2 animals per group is shown.
  • the data were analyzed by Kruskall-Wallis test followed by a Dunn ' s multiple comparison test.
  • the figures show that mIL15 and hIL15 stimulate the number of splenocytes and CD8 and NK T cells in spleen in a similar way.
  • Figure 12 Effect of the fusion of mSushi with mIL 15 and ApoAI on the percentage of NK cells in spleen (A) and in liver (B).
  • Groups of C57BL / 6 mice were treated by hydrodynamic injection with the plasmids: 1) pmSushi-mIL15-mApo, administered at different doses of 1 ⁇ g / mouse, 2.5 ⁇ g / mouse, and 5 ⁇ g / mouse respectively; and 2) pm Sushi-mIL15 in combination with pApo, both administered at the same 3 doses.
  • spleens (A) and livers (B) were sacrificed and NK cells were labeled (NK1.1 + CD3 + ).
  • mice received 5x1 or 5 MC38 cells subcutaneously and at 8 and 19 days were treated hydrodynamically with the plasmids: 1) pApo; 2) pmSushi-mIL15-mApo and 3) pApo-hIL15 in combination with pSushi (pApo-hIL15 + pSushi). Tumors were measured in mm2 with a digital caliber every 2-3 days. It was found that the mice that were administered pmSushi-mIL15-mApo had delayed tumor growth. The mean and standard error of a representative experiment with 5-9 animals per group is shown. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • IL15 R-sushi a nucleic acid encoding a fusion protein comprising IL15 fused to the ApoA protein together with the sushi domain of the IL15 receptor ⁇ chain
  • Such superior activity is a result not only of the higher and more lasting circulating levels of IL15 obtained as observed in example 3 of the present invention, but in the ability to induce proliferation of CTLL2 cells (example 4 of the present invention ), the ability to promote the proliferation of intrasplenic CD8 and CD8 memory T lymphocytes, intrahepatic CD8 T lymphocytes and CD8 T lymphocytes in blood (example 5 of the present invention) and a greater antitumor effect in two experimental tumor models ( example 7 of the present invention) and in an anti-metastatic effect (example 8 of the present invention).
  • nucleic acid that encodes and allows the expression of a triple fusion protein comprising ApoAl protein fused to IL 15 and IL15aR-sushi produces a proliferation of CD8 lymphocytes and much higher NK cells which is obtained with the administration of a nucleic acid encoding IL15, either alone or in combination with another encoding IL15aR-sushi, or with a nucleic acid encoding ApoAl fusion protein with IL15, either alone or in combination with another that encodes IL15 R-sushi.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising, together or separately,
  • IL15 or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70%> identity with IL15 and a polynucleotide encoding IL15 or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70%) identity with IL1 and
  • the Sushi domain of the IL15 receptor alpha chain or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70%> identity with the Sushi domain of the IL15 receptor alpha chain and (a) a polynucleotide encoding the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor or a functionally equivalent variant thereof that has at least 70% identity with the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor.
  • composition refers to a composition of matter comprising the indicated components, that is, the Apo A, IL15 polypeptide and the Sushi domain of the IL15 receptor alpha chain as well as any product resulting, directly or indirectly, from the combination of the different components in any quantity thereof.
  • the composition may be formulated as a single formulation or may be presented as formulations of each of the components separately that may be combined for joint use as a combined preparation.
  • the composition can be a kit of parts where each of the components is formulated and packaged separately.
  • protein used interchangeably herein with polypeptide, refers to a chain of amino acids of any length where the different amino acids are linked together by peptide bonds or by disulfide bonds.
  • polynucleotide refers to a polymer formed by a variable number of monomers wherein the monomers are nucleotides, including both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • the polynucleotides include monomers modified by methylation or as well as unmodified forms.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably in the present invention and include mRNA, cDNA and recombinant polynucleotides.
  • polynucleotides are not limited to polynucleotides as they appear in nature, but include polynucleotides in which nucleotide analogs and unnatural internucleotide bonds appear.
  • Non-limiting examples of this type of unnatural structures include polynucleotides in which sugar is different from ribose, polynucleotides in which 3 '-5' and 2 '-5' phosphodiester bonds appear, polynucleotides in which inverted links (3 '-3' and 5 '-5') appear and branched structures.
  • the polynucleotides of the invention include unnatural internucleotide bonds such as nucleic acid peptides (PNA or peptide nucleic acids), closed nucleic acids (LNA or locked nucleic acids), C1-C4 alkyl phosphonate bonds of the methylphosphonate type, phosphoramidate, C1- C6 alkyl phosphotrioester, phosphorothioate and phosphorodithioate.
  • PNA nucleic acid peptides
  • LNA or locked nucleic acids closed nucleic acids
  • C1-C4 alkyl phosphonate bonds of the methylphosphonate type phosphoramidate
  • C1- C6 alkyl phosphotrioester phosphorothioate
  • phosphorodithioate phosphorodithioate
  • the first component of the invention is selected from the group of an Apo A polypeptide or a functionally equivalent variant thereof and a nucleic acid encoding an Apo A polypeptide or a functionally equivalent variant thereof.
  • ApoA polypeptide refers to any member of the Apo A family that is part of the high density lipoproteins (HDL) and that is capable of interacting specifically with surface receptors. of the liver cells thus guaranteeing their ability to vehicularize to this organ the molecules of interest coupled to said Apo A protein.
  • the Apo A molecules that can be used in the present invention are selected from the ApoA-I group, ApoA-II, ApoA-III, ApoA-IV and ApoA-V or functionally equivalent variants thereof.
  • the Apo A protein used in the present invention is the ApoA-I protein.
  • ApoA-I means, in the context of the present invention, the mature form of the pre-proApoA-I protein that is part of the high density lipoproteins (HDL).
  • ApoA-I is synthesized as a precursor (preproApoA-I) that contains a secretion signal sequence that is removed to give rise to the precursor.
  • the signal sequence consists of 18 amino acids, the propeptide of 6 and the mature form of the 243 amino acid protein.
  • the form is used mature protein lacking signal and processed peptide.
  • the ApoA-I protein is of human origin and its amino acid sequence is that shown in SEQ ID NO: 1 (accession number in UniProt P02647).
  • the ApoA-I protein is of murine origin, in particular mouse, and its amino acid sequence is that shown in SEQ ID NO: 2 (accession number in UniProt Q00623).
  • the ApoA-1 protein is of murine origin, in particular of rat, and its amino acid sequence is that shown in SEQ ID NO: 3 (accession number in UniProt P04639).
  • SR-BI class B type I scavenger receptor
  • the ability to interact with the HDL receptor is essentially determined as described by Monaco et al (EMBO J., 1987, 6: 3253-3260) either by studies of ApoA-I binding to hepatocyte membranes or either by determining the ability of ApoA-I or its variant to inhibit HDL binding to hepatocyte membrane receptors.
  • the dissociation constant of the binding of the ApoA-I variant to hepatocyte membranes is at least 10 "8 M, 10 " 7 M, 10 "6 M, 10 " 5 M or 10 "4 M.
  • ApoA-I variants contemplated in the context of the present invention include polypeptides that show at least 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, or 95% similarity or identity with the ApoA-I polypeptides.
  • the degree of identity between two polypeptides is determined using computer-implemented algorithms and methods that are widely known to those skilled in the art.
  • the identity between two amino acid sequences is preferably determined using the BLASTP algorithm (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol 215: 403-410).
  • the ApoA-I variants used in the context of the invention have a high serum half-life with respect to the ApoA-I mentioned above, which makes it possible to reach serum ApoA-I levels higher than those observed with ApoA-I.
  • Methods for determining the half-life of a whey protein and, in particular ApoA-I are known in the art and include, among others, using the methods based on metabolic tides with labeled proteins described by Eisenberg, S. et al ( J.Lipid Res., 1973, 14: 446-458), by Blum et al. (J. Clin.
  • the first component of the invention may be a nucleic acid encoding at least one of the ApoA and Apo A variants mentioned above.
  • the nucleic acid encodes ApoA it may be of human origin corresponding to the sequence with access number X02162 in NCBI (SEQ ID NO: 4), of murine origin corresponding to the sequence with access number X64262 in NCBI (SEQ ID NO: 5), of rat corresponding to the sequence with access number MOOOOlen NCBI (SEQ ID NO: 6).
  • nucleic acid that forms the first component of the invention must be expressed inside a cell and eventually secreted to the medium, for which the sequence encoding ApoA or a functionally equivalent variant of the it can present at a 5 'end a sequence that encodes a secretory signal.
  • secretory signal sequence refers to an amino acid sequence that is capable of promoting access to the cellular secretory pathway of all those proteins that have said sequence at their N-terminal end. .
  • Signal sequences suitable for use in the present invention include, among others, the signal sequence of tissue plasminogen activator (tPA), growth hormone, GM-CSF and immunoglobulin and, in particular, IgK or IgVx .
  • tPA tissue plasminogen activator
  • growth hormone growth hormone
  • GM-CSF growth hormone
  • immunoglobulin immunoglobulin
  • IgK or IgVx immunoglobulin
  • the signal sequence that is part of component A of the invention is the Apo A signal sequence itself as defined above.
  • the first component of the invention may be a nucleic acid that shows a sequence identity of at least 70%, at least 75%, at least 80%), at least 85%, at least 90%>, at least 91 %>, at least 92%, at least 93%>, at least 94%>, at least 95%, at least 96%>, at least 97%, at least 98% or at least 99% or identity with any of the sequences mentioned above where the percentage of identity is determined by using an algorithm of the GAP, BESTFIT or FASTA type whose computer implementation appears in the Wisconsin Genetics Software Package Relay 7 (Wisconsin Genetics Software Package Relay 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) And in which the local algorithms of Smith and Waterman (Adv.
  • the first component of the composition of the invention is a polynucleotide encoding ApoA or a variant thereof and which is capable of hybridizing specifically with any of the ApoA sequences native to different mammals defined above.
  • polynucleotides capable of specifically hybridizing with a target polynucleotide is understood, in the context of the present invention, those polynucleotides that are capable of hybridizing under strict conditions, with strict conditions being understood, the conditions that allow the specific hybridization of two nucleic acids at temperatures of around 65 ° C for example, in a solution of 6 X SSC, 0.5% SDS, 5% Denhardt solution and non-specific denatured DNA at a concentration of 100 ⁇ ⁇ ⁇ any other solution with an equivalent ionic strength and after a washing step at 65 ° C in the presence of a solution of, for example, 0.2% SSC and 0.1% SDS and any other solution with an equivalent ionic strength.
  • the second component of the invention is selected from the group of IL15 or a functionally equivalent variant thereof and from a nucleic acid encoding IL15 or a functionally equivalent variant thereof.
  • IL15 or "IL-15”, as used in the present invention, refers to a cytokine whose isolation, cloning and sequence is described in Grabstein et al. (US5747024 and Grabstein et al, 1994, Science 246: 965-968).
  • the term IL15 includes any polypeptide form with an amino acid sequence of a natural IL15.
  • IL15 examples include rodent IL15 (mouse, rat, hamster), human, primate, canine, feline, swine, equine, bovine, sheep, and Similar.
  • IL15 mammalian polypeptides that may be part of the compositions and fusion proteins of the invention include, without limitation, IL15 of human origin and whose amino acid sequence is that shown in P40933 (SEQ ID NO: 7); Mouse IL15 and whose amino acid sequence is that shown in P48346 (SEQ ID NO: 8), rat IL15 and whose amino acid sequence is that shown in P97604 (SEQ ID NO: 9), cat IL15 and whose amino acid sequence it is the one shown in 097687 (SEQ ID NO: 10) and bovine IL15 whose amino acid sequence is that shown in Q28028 (SEQ ID NO: ll).
  • IL15 functionally equivalent variant of IL15
  • polypeptides that result from the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids from the sequence of any of the aforementioned IL15 sequences and that keep at least one of the substantially intact IL15 functions, wherein said function is selected from:
  • CD8 + T cells determined, for example, by the method described by Montes, et al, (Clin. Exp. Immunol, 2005, 142: 292-302) based on the incubation of a population of peripheral blood mononuclear cells with an antigenic peptide in the presence of the IL15 variant followed by the determination of the percentage of cells that can be labeled with specific antibodies against CD8 ),
  • NK CD56 + cells the ability to promote the activation of NK cells after being presented in trans by dendritic cells. This ability can be determined by measuring the incorporation of tritiated thymidine by the NK CD56 + cells in the presence of IL15 or by measuring the secretion by the NK cells of the GM-CSF cytokine. Methods to determine both functionalities of IL15 have been described by Carson, W. et al. (J.Exp.med.,
  • IL15 The ability of IL15 to inhibit Fas-mediated apoptosis in B cell precursor cells, as described by Demirci et al. (Cell Mol Immunol. 2004, 1: 123-8.), which can be determined using standard techniques of apoptosis determination such as TUNEL or the determination of DNA fragmentation by gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • Variants of IL15 contemplated in the context of the present invention include polypeptides that show at least 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, or 95% similarity or identity with the polypeptides of IL15 of mammals mentioned above.
  • the degree of identity between two polypeptides is determined using computer-implemented algorithms and methods that are widely known to those skilled in the art.
  • the identity between two amino acid sequences is preferably determined using the BLASTP algorithm (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol 215: 403-410).
  • the second component of the invention may be a nucleic acid encoding at least one of the native IL15 and IL15 variants mentioned above.
  • Nucleic acids encoding mammalian IL15 can be recovered from nucleic acid repositories and include, without limitation, polynucleotides whose sequences are defined by access numbers U14407 (human, SEQ ID NO: 12), U14332 (mouse, SEQ ID NO: 13), U69272 (rat, SEQ ID NO.14), AF108148 (cat, SEQ ID NO; 15 ) and U42433 (bovine, SEQ ID NO: 16).
  • Such polymucleotides include those that show a sequence identity of at least 70%, at least 75%>, at least 80%>, at least 85%>, at least 90%>, at least 91% or, at least 92% >, at least 93%>, at least 94%>, at least 95%>, at least 96%>, at least 97%>, at least 98%> or at least 99%> of identity with any of the sequences mentioned above where the percentage of identity is determined by the use of an algorithm among those mentioned above.
  • the polynucleotides that form the second component of the invention are polynucleotides capable of specifically hybridizing with the polymucleotides defined above. Methods for determining the ability of a polynucleotide to hybridize specifically with a target sequence have been described in detail in the context of the first component of the invention.
  • nucleic acid that forms the second component of the invention can be operatively coupled to a signal sequence which allows secretion into the medium of IL15 or the functionally equivalent variant.
  • Signal sequences suitable for use in the present invention include those mentioned above in the context of the first component of the composition of the invention.
  • the signal sequence that is part of the second component of the composition of the invention is the IL15 signal sequence itself as defined above or the signal sequence of an immunoglobulin, in particular, IgK or IgVx.
  • the third component of the invention is selected from the group of the sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor or a functionally equivalent variant thereof.
  • the term "sushi domain of the IL15 receptor alpha chain” (hereinafter IL15Ra-sushi), as used in the present invention, refers to an amino acid sequence that appears in the extracellular region of the receptor alpha chain of IL15 and corresponding to the sequence that begins with the first cistern that appears in the first exon of the gene of the alpha chain of the IL15 receptor and that concludes with the cysteine encoded by exon 4 of the gene of the alpha chain of the receptor of IL15.
  • the sushi domain is defined as the sequence that begins at the first cysteine residue of the alpha chain of the IL15 receptor after the signal sequence and concludes with the fourth cysteine residue after the signal sequence in said sequence.
  • Sushi domains suitable for use in the present invention include the sushi domain that comes from the alpha chain of the human-derived IL15 receptor, corresponding to the sequence with access number NP 002180 in UniProt and whose Sushi domain corresponds to the sequence
  • “Functionally equivalent variant of the sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor” means all those polypeptides that result from the insertion, substitution or deletion of one or more amino acids of the sequence of any of the sequences of the sushi domains of human or murine origin mentioned above and that substantially keep intact the ability to bind to IL15 and to increase the proliferative effect of IL15 in cells expressing the receptor of Low affinity IL15 (for example, Mo-7e or 32 ⁇ line cells) as described by Mortier et al. (J.Biol.Chem., 2006, 281: 1612-1619).
  • Low affinity IL15 for example, Mo-7e or 32 ⁇ line cells
  • Variants of IL15Ra-sushi contemplated in the context of the present invention include polypeptides showing at least 70%, 72%>, 74%>, 76%>, 78%>, 80%>, 90% or, or 95% or similarity or identity with the polypeptides mentioned above.
  • the degree of identity between two polypeptides is determined using computer-implemented algorithms and methods that are widely known to those skilled in the art.
  • the identity between two amino acid sequences is preferably determined using the BLASTP algorithm (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol 215: 403-410).
  • the third component of the invention may be a nucleic acid encoding at least one sushi domain of the native IL15 receptor alpha chain and variants thereof mentioned above.
  • Nucleic acids encoding mammalian IL15Ra-sushi can be recovered from the corresponding alpha chain sequences found in the nucleic acid repositories and include, without limitation, the sequences encoding IL15Ra-sushi alpha chain Human IL15 receiver (access numbers in NCBI correspond to U31628, SEQ ID NO: 19) and mouse (access number in NCBI: U22339, SEQ ID NO: 20).
  • polynucleotides include those that show a sequence identity of at least 70%>, at least 75%>, at least 80%, at least 85%>, at least 90%>, at least 91%>, at least 92%>, at least 93%>, at least 94%>, at least 95%>, at least 96% or, at least 97%>, at least 98%> or at least 99%> of identity with any of the sequences mentioned above where the percentage of identity is determined by the use of an algorithm among those mentioned above.
  • the polynucleotides that form the third component of the invention are polynucleotides capable of specifically hybridizing with the polynucleotides defined above. Methods for determining the capacity of a polynucleotide of specifically hybridizing with a target sequence have been described in detail in the context of the first component of the invention.
  • nucleic acid that forms the second component of the invention can be operatively coupled to a signal sequence allowing secretion to the medium of the sushi domain or its functionally equivalent variant.
  • Signal sequences suitable for use in the present invention include those mentioned above in the context of the first component of the composition of the invention.
  • the signal sequence that is part of the second component of the composition of the invention is the signal sequence of the alpha chain of the IL15 receptor as defined above or the signal sequence of an immunoglobulin, in particular IgK. or of IgV%.
  • the third component of the compositions of the invention is a polynucleotide comprising or consisting of the sequence identified as SEQ ID NO: 21 and encoding a polypeptide comprising the Sushi domain of the human IL 15RA receptor, preceded by its own signal peptide (SEQ ID NO: 22).
  • compositions of the invention may be formed by polypeptides or polynucleotides from different species. However, in a preferred embodiment all three components originate from the same animal species. In a preferred embodiment, the three components are of human origin. In another preferred embodiment, the three components are of murine origin.
  • compositions in which the first and second components form a single molecule are binary compositions formed by a first component which in turn comprises the first and second components defined above, and a second component, which corresponds to the third component defined above.
  • first and second components of the composition are polypeptides
  • said single molecule is a fusion protein comprising (i) an Apo A polypeptide or a functionally equivalent variant thereof and (ii) IL15 or a functionally equivalent variant thereof.
  • fusion protein refers to polypeptides comprising two or more regions that come from different or heterologous proteins.
  • both the first and second components of the composition are polynucleotides
  • said single molecule is a polynucleotide encoding a fusion protein comprising (i) a polypeptide comprising an Apo A polypeptide or a functionally equivalent variant thereof and (ii) IL15 or a functionally equivalent variant thereof.
  • the invention contemplates compositions in which the first component is in the N-terminal position with respect to the second component and compositions in which the first component is in the C-terminal position. with respect to the second component.
  • the invention contemplates compositions in which the first component is in 5 'position with respect to the second component and compositions in which the first component is in 3' position with respect to the second component.
  • first and second components are directly associated, that is, that the C-terminal end of the first component is found associated to the N-terminal end of the second component or that the C-terminal end of the second component is associated to the N-terminal end of the first component or that the 3 'end of the first component is associated to the 5' end of the second component and compositions in which the 3 'end of the second component is associated with the 5' end of the first component.
  • the invention contemplates compositions in which the fusion of the first and second components is carried out through a peptide linker (in the case where the first and second components are of a polypeptide nature) or of a sequence encoding a peptide linker (in the case that the first and second components are polynucleotide in nature).
  • linker refers to a molecule that connects two molecules and often allows connected molecules to acquire a functional configuration
  • the linker peptide preferably comprises at least two amino acids at least three amino acids, at least five amino acids, at least ten amino acids, at least 15 amino acids, at least 20 amino acids, at least 30 amino acids, at least 40 amino acids, at least 50 amino acids, at at least 60 amino acids, at least 70 amino acids, at least 80 amino acids, at least 90 amino acids or about 100 amino acids.
  • Linkers suitable for use in the present invention include:
  • Linkers comprising 2 amino acids or more selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine such as, without limitation, the sequence linkers SGGTSGSTSGTGST (SEQ ID NO: 23), AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO: 24), GGSGGAP (SEQ ID NO: 25) and GGGVEGGG (SEQ ID NO: 26) described by Muller, KM et al. ((Methods. Enzimology, 2000, 328: 261-281).
  • PKPSTPPGSS SEQ ID NO: 30 which has been used for the production of dimerized antibodies by means of a rolled helix (Pack P. and Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31: 1579-1584),
  • the two components of the conjugates of the invention may be connected by a peptide whose sequence contains a cut-off target for a protease, thereby allowing separation of ApoA-I from component (ii).
  • Suitable protease cutting sites. for incorporation into the polypeptides of the invention include enterokinase (DDDDK cutting site SEQ ID NO: 33), factor Xa (IEDGR cutting site, SEQ ID NO: 34), thrombin (LVPRGS cutting site, SEQ ID NO: 35 ), TEV protease (ENLYFQG cutting site, SEQ ID NO: 36), PreScission protease (LEVLFQGP cutting site, SEQ ID NO: 37), internal and the like.
  • the cutting site is that of a protease that is expressed in tumor tissues, in inflamed tissues or in liver so that the separation of Apo A and component (ii) takes place once the Conjugate has reached the liver.
  • the linker contains a matrix 9 metalloprotease recognition site (LFPTS cutoff site, SEQ ID NO: 38).
  • compositions in which both the component resulting from the first and second component fusion (the Apo A fusion protein with IL15) and the third component (the Sushi domain of the IL15 receptor ⁇ chain ) are used in the form of a nucleic acid the invention is not limited to compositions in which both components are nucleic acids but alternatively contemplates compositions in which the first and / or the second component are polypeptides.
  • the invention contemplates compositions formed by:
  • polypeptide comprising a fusion protein formed by Apo A and IL 15 and a polypeptide comprising the sushi domain of the ⁇ chain of the IL15 receptor.
  • polypeptide comprising a fusion protein formed by Apo A and IL15 and a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the sushi domain of the ⁇ chain of the IL15 receptor.
  • polynucleotide encoding a polypeptide comprising a fusion protein formed by Apo A and IL15 and a polypeptide comprising the sushi domain of the ⁇ chain of the IL15 receptor.
  • compositions of the invention contemplates compositions in which the ratio between the quantities of the two components may range between 50: 1 and 1: 50, in particular between 20: 1 and 1: 20, between 1: 10 and 10: 1, or between 5: 1 and 1: 5.
  • each of the components may come from a different species, although it is preferred that the components that form a single molecule come from the same species.
  • Apo A or the variant functionally equivalent thereof is of human origin and IL15 or the functionally equivalent variant thereof is of human origin.
  • Apo A or the functionally equivalent variant thereof is of murine origin and IL15 or the functionally equivalent variant thereof is of murine origin.
  • the single molecule that forms the first component of the composition is formed by the ApoAI polypeptide of human origin and IL15 of human origin, separated by a linker that has the GAP sequence.
  • the polynucleotide encoding said fusion has a sequence identified in the present invention as SEQ.ID.NO: 39.
  • the single molecule that forms the first component of the composition is formed by the ApoAI polypeptide of murine origin and IL15 of human origin, separated by a linker that has the GAP sequence.
  • the polynucleotide encoding said fusion has a sequence identified in the present invention as SEQ.ID.NO: 40.
  • the single molecule that forms the first component of the composition is formed by the ApoAI polypeptide of murine origin and IL15 of murine origin, separated by a linker having the GAP sequence.
  • the polynucleotide encoding said fusion has a sequence identified in the present invention as SEQ.ID.NO: 41.
  • the polypeptide comprising the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor or the functionally equivalent variant thereof can be of human origin. or of murine origin. However, if the components that form the single molecule are both of human origin, it is preferred that the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor or the functionally equivalent variant thereof is also of human origin. Alternatively, if the components that make up the single molecule are both of murine origin, it is preferred that the Sushi domain of the receptor alpha chain of IL15 or the functionally equivalent variant thereof is also of murine origin.
  • the invention contemplates a fusion protein comprising ApoA or a functionally equivalent variant thereof and IL15 or a functionally equivalent variant thereof.
  • ApoA ApoA
  • IL15 functionally equivalent variant of ApoA
  • IL15 functionally equivalent variant of IL15
  • Fusion proteins can have the ApoA polypeptide in N-terminal position with respect to IL-15 or IL-15 polypeptide in N-terminal position with respect to Apo A.
  • both components can be linked directly or through a linker , which may be any of the linkers mentioned in the present invention.
  • the components may be of human or murine origin, so that the invention contemplates fusions of ApoA and IL15 of human origin, fusions of ApoA the IL15 of murine origin and fusions of ApoA and IL15 where ApoA is of human origin and IL15 It is of murine origin and fusions of ApoA and IL15 where ApoA is of murine origin and IL15 of human origin.
  • the Apo A and IL 15 fusion proteins correspond to the polypeptides with sequence SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41.
  • the invention relates to a fusion protein comprising
  • the B region of the fusion protein essentially coincides with the second component of the compositions of the invention and has therefore been described in detail above.
  • the C region of the fusion protein essentially coincides with the third component of the compositions of the invention and has therefore been described in detail above.
  • fusion protein of the invention can have different arrangements of regions A, B and C.
  • the invention contemplates:
  • region A is in the N-terminal position
  • region B is in the central position
  • region C is in the C-terminal position
  • region A is in the N-terminal position, region C in the central position and region B in the C-terminal position,
  • a fusion protein in which the C region is in the N-terminal position, the A region is in the central position and the B region is in the C-terminal position and
  • fusion protein in which the C region is in the N-terminal position, the B region is in the central position and the A region is in the C-terminal position.
  • regions A, B and / or C may be directly associated, that is, where the C-terminal amino acid of one region is linked through a peptide bond with the N-terminal amino acid of another region.
  • the different regions are linked together through a peptide linker.
  • Suitable linkers for the fusion protein of the invention are essentially the same as those used in the composition of the invention and have been described in detail above. The person skilled in the art will appreciate that the fusion protein may contain one or two peptide linkers depending on whether only two of the three regions are associated with each other through a linker or if the three regions are associated through linkers.
  • the fusion protein has a CBA type arrangement, that is, it comprises, in the N-to C-terminal sense, the Sushi domain of IL15Ra (region C), IL15 (region B) and ApoAI (region TO).
  • regions C and B are separated by a linker of the type GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO: 32).
  • regions B and A are separated by a linker of the GAP type.
  • regions C and B are separated by a linker of type GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO: 32) and regions B and A are separated by a linker of type GAP.
  • fusion proteins of the invention are exemplified with fusion proteins in which regions A, B and C are of murine origin, the person skilled in the art will appreciate that the invention contemplates fusion proteins wherein each of the regions A , B and C may be of a different origin from among the different variants of the regions mentioned above.
  • the fusion protein comprises a region A of human origin or of murine origin, a region B of human origin or of murine origin a region C of human origin or of murine origin.
  • regions A, B and C are of murine origin.
  • regions A, B and C are of human origin.
  • the fusion protein has an arrangement of the C-B-A type where the three components are of human origin and where both the C and B regions and the B and A regions are connected by peptide linkers.
  • the fusion protein comprises, in the N- to C-terminal sense, the sushi domain of human IL15Ra (region C), human IL15 (region B) and human ApoAI (region A).
  • regions C and B are found by a linker of the type GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ.
  • regions B and A are separated by a linker of the GAP type.
  • regions C and B are separated by a linker of type GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ and regions B and A are separated by a linker of type GAP.
  • the fusion protein comprises the sequence defined by SEQ ID NO: 42.
  • the fusion protein comprises, in the N- to C-terminal sense, the sushi domain of murine IL15Ra (region C), murine IL15 (region B) and murine ApoAI (region A).
  • regions C and B are separated by a linker of the type GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ.
  • regions B and A are They are separated by a GAP type linker.
  • regions C and B are separated by a linker of type GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ and regions B and A are separated by a linker of type GAP.
  • the fusion protein comprises the sequence defined by SEQ ID NO: 43.
  • the invention contemplates a polynucleotide encoding the fusion protein of the invention. Since the fusion protein of the invention exerts its function from the extracellular medium, it is convenient that the polynucleotide encodes a fusion of the fusion protein of the invention with a signal sequence that allows access of the fusion protein to the secretory pathway. and secretion to the fusion protein medium.
  • Signal sequences suitable for use in conjunction with the fusion protein include both the signal sequence of any of the components of the fusion protein (the signal sequence of Apo A, the signal sequence of IL15 or the signal sequence of the ⁇ chain of the receptor of IL15) or any of the signal sequences mentioned above in the context of the first component of the composition of the invention, that is, suitable signal sequences of tissue plasminogen activator (tPA), growth hormone, GM-CSF and of immunoglobulins and, in particular, the IgK or IgVx signal sequences.
  • tissue plasminogen activator tPA
  • the polynucleotide of the invention comprises the sequence identified as SEQ.ID.NO. 44 encoding a fusion or conjugate protein comprising the Sushi domain of human origin, IL15 of human origin and ApoAl of human origin, wherein the Sushi domain and IL15 are separated by a GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ sequence linker, where IL15 and ApoAl they are separated by a GAP sequence linker and where the fusion is preceded by the signal sequence of the alpha chain of the IL-15 receptor of human origin.
  • the polynucleotide of the invention comprises the sequence identified as SEQ.ID.NO.
  • the invention which encodes a fusion or conjugate protein comprising the Sushi domain of murine origin, IL15 of murine origin and ApoAl of murine origin, wherein the Sushi domain and IL15 are separated by a GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ sequence linker, where IL 15 and ApoAl are separated by a GAP sequence linker and where the fusion is preceded by the signal sequence of the alpha chain of the murine-derived IL-15 receptor.
  • the polynucleotide encoding the fusion protein of the invention can be operatively associated with a regulatory region of expression thus resulting in a gene construct. Therefore, in another aspect, the invention relates to a gene construct comprising a polynucleotide of the invention.
  • the construction comprises the polynucleotide of the invention placed under the operational control of sequences that regulate the expression of the polynucleotide of the invention.
  • sequences that regulate the expression of the polynucleotide of the invention The person skilled in the art will appreciate that the polynucleotides of the invention must access the nucleus of a target tissue and there be transcribed and translated to give rise to the biologically active fusion protein.
  • any promoter can be used for the gene constructs of the present invention as long as said promoter is compatible with the cells in which it is desired to express the polynucleotide.
  • suitable promoters for the realization of the present invention include, without necessarily being limited, constitutive promoters such as those derived from eukaryotic virus genomes such as polyomavirus, adenovirus, SV40, CMV, avian sarcoma virus, virus hepatitis B, the promoter of the metallothionein gene, the promoter of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus, LTR regions of retroviruses, the promoter of the immuno globuin gene, the promoter of the actin gene, the promoter of the EF-1 alpha gene as well as inducible promoters in which protein expression depends on the addition of a molecule or an exogenous signal, such as the tetracycline system, the NFKB / IUZ UV system, the Cre / Lox system and the shock gene promoter thermally, the adjustable RNA polymerase II promoters described in WO / 2006/135436 as well as tissue specific promoters.
  • the polynucleotides of the invention or the gene constructs that constitute them may be part of a vector.
  • the invention relates to a vector comprising a polynucleotide or a gene construct of the invention.
  • the person skilled in the art will appreciate that there is no limitation as to the type of vector that can be used since said vector can be a cloning vector suitable for propagation and to obtain suitable polynucleotides or gene constructs or expression vectors in different heterologous organisms suitable for the purification of the conjugates.
  • suitable vectors include prokaryotic expression vectors such as pUC18, pUC19, Bluescript and their derivatives, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, phage and shuttle vectors such as pSA3 and pAT28, yeast expression vectors such as 2 micron plasmid type vectors, integration plasmids, YEP vectors, centromeric plasmids and the like, insect cell expression vectors such as pAC series and series vectors pVL, plant expression vectors such as pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE and the like series and expression vectors in upper eukaryotic cells well based on viral vectors (adenovirus, associated viruses to adenoviruses as well as retroviruses and lentiviruses)
  • the vector of the invention can be used to transform, transfect or infect cells capable of being transformed, transfected or infected by said vector.
  • Said cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cell and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (or in which) has been integrated.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al, 2001, cited supra).
  • the invention relates to a cell comprising a polynucleotide, a gene construct or a vector of the invention, for which said cell has been able to be transformed, transfected or infected with a construct or vector provided by it.
  • Transformed, transfected or infected cells can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001, cited supra).
  • said host cell is an animal cell transfected or infected with an appropriate vector.
  • Suitable host cells for the expression of the conjugates of the invention include, but are not limited to, mammalian, plant, insect, fungal and bacterial cells.
  • Bacterial cells include, but are not limited to, Gram positive bacteria cells such as species of the genus Bacillus, Streptomyces and Staphylococcus and Gram negative bacteria cells such as cells of the genus Escherichia and Pseudomonas.
  • Fungal cells preferably include yeast cells such as Saccharomyces, Pichia pastoris and Hansenula polymorpha.
  • Insect cells include, without limitation, Drosophila cells and Sf9 cells.
  • Plant cells include, among others, crop plant cells such as cereals, medicinal, ornamental or bulb plants.
  • Mammalian cells suitable for the present invention include epithelial cell lines (pigs, etc.), osteosarcoma cell lines (human, etc.), neuroblastoma cell lines (human, etc.), epithelial carcinomas (human, etc.), glial cells (murine, etc.), liver cell lines (mono, etc.).
  • CHO cells (Ch ⁇ nese Hamster Ovary), COS cells, BHK cells, HeLa cells, 91 1, AT I 080, A549, 293 or PER.C6, human ECCs NTERA-2 cells, D3 cells of the mESCs line, embryonic stem cells human such as HS293 and BGVOl, SHEFl, SHEF2 and HS181, NIH3T3, 293T, REH and MCF-7 cells and hMSCs cells.
  • HS293 and BGVOl embryonic stem cells human such as HS293 and BGVOl, SHEFl, SHEF2 and HS181, NIH3T3, 293T, REH and MCF-7 cells and hMSCs cells.
  • IL15 The ability of IL15 to promote proliferation of T lymphocytes sensitized by an antigen has been described. Thus, it has been shown that contacting a population of isolated lymphocytes previously exposed to a particular antigen with IL15 results in an increase in lymphocyte proliferation. This expanded population of lymphocytes can be used in an adoptive immunotherapy for which it is subsequently re-administered to the patient from whom said initial population has been obtained.
  • the invention relates to an in vitro method for promoting the expansion of specific T lymphocytes of an antigen comprising contacting a population of lymphocytes previously exposed to said antigen with a composition of the invention, a protein of fusion of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a gene construct of the invention or a host cell of the invention.
  • expansion is used in the present invention interchangeably with proliferation and should be understood as cell division or cell growth.
  • the expansion can be determined using widely known methods such as, for example, the methods described in Transplantation (1999) 67: 605-613.
  • lymphocytes refers to a population of lymphocytes that is capable of recognizing a particular antigen. Typically, lymphocytes are isolated from a patient who has been exposed to said antigen. Alternatively, the antigen can be contacted with the lymphocyte population in an artificial antigen presentation system as described in US Pat. Nos. US2828150 or US6787154.
  • antigen refers to any substance that is capable of triggering an immune response in a subject that is not tolerant to said antigen.
  • the antigen can come from the subject itself, in which case it is an autoantigen, or it can be an alloantigen, that is, a derived antigen of an individual of the same species.
  • the antigen can be a xenoantigen, that is, an antigen derived from an individual of a different species.
  • Lymphocytes that can be used in the method of the present invention include, without limitation cytotoxic T lymphocytes (CTL), helper T cells, lymphokine-activated cells, tumor infiltrating lymphocytes (TILS), NK cells, cells naive, memory cells, gammadeltaT cells, NKT cells as well as cell populations comprising varying amounts of one or more of the aforementioned cells.
  • the lymphocytes are CTL.
  • Suitable methods for obtaining CTLs for subsequent in vitro expansion using the method of the invention are widely known to a person skilled in the art and include, without limitation, isolation from peripheral blood, from umbilical cord blood. , from tissues containing lymphocytes.
  • the lymphocytes are isolated by lymph node drainage in patients suffering from a certain disease.
  • lymphocytes Once lymphocytes have been isolated, they are contacted with a composition of the invention, a fusion protein of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, a gene construct of the invention or a cell. host of the invention under conditions suitable for lymphocyte expansion to occur.
  • the general conditions for the expansion of antigen-specific CTLs can be established according to known methods [eg, Carter J. et al. , Immunology, 57 (1), 123-129, (1996)] and can be routinely optimized by the person skilled in the art.
  • the contact of lymphocytes with the composition, fusion protein, polynucleotide, vector, gene construct or host cell of the invention is carried out by culturing the lymphocytes in a medium suitable for said cells.
  • Cells can be cultured under conventional conditions in any suitable medium to grow lymphocytes that include a Minimum Essential Medium or RPMI 1640 Medium.
  • factors necessary for proliferation and viability of these including serum, for example, fetal calf serum or human serum and antibiotics, for example, penicillin, streptomycin.
  • the lymphocytes are maintained under conditions necessary to support growth, for example, an appropriate temperature of about 37 ° C and an atmosphere, for example, air plus 5% C0 2 .
  • lymphocytes can be treated prior to stimulation with the compounds of the invention to promote their activation in vitro, for which lymphocytes are contacted with the antigen against which they are specific. This is particularly necessary in the case of patients with tumors that produce immunosuppressive substances. For this, it is necessary to stimulate lymphocyte culture with the appropriate antigen.
  • the antigen is presented to the T cell such that the signal is triggered in the T cell through the TCR / CD3 complex.
  • the antigen can be presented to the T cell by a cell presenting antigen.
  • Antigen presenting cells include dendritic cells, mononuclear phagocytes, B lymphocytes or Langerhans cells. Antigen presenting cells can be isolated, for example, from the bone marrow, blood, thymus, epidermis, liver or fetal liver.
  • the antigen is a tumor antigen
  • an autologous tumor extract and / or a recombinant tumor antigen it is possible to use an autologous tumor extract and / or a recombinant tumor antigen.
  • lymphocyte activation prior to its expansion can be carried out using a cell infected with a pathogen, for example a virus that presents pathogen antigens.
  • the treatment of the cells with the compositions, fusion proteins of the invention be carried out in the presence of an anti-CD3 antibody and, preferably, with a human monoclonal anti-CD3 antibody, and more preferably with OKT3.
  • concentration of anti-CD3 antibodies during the expansion process is not particularly limited, and is, for example, 0.001 to 100 mg / mL, and more preferably 0.01 to 100 mg / mL.
  • the cells may be more co-cultured with an anti-CD28 antibody, and more preferably with a human monoclonal anti-CD28 antibody.
  • the cells can be co-cultured with a lymphocyte stimulating factor, such as a lectin. In addition, one or more of these components can be immobilized to a solid phase.
  • cells can be co-cultured with feeder cells according to the circumstances.
  • suitable feeder cells include, without limitation, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous or non-autologous EBV-B cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • EBV-B cells autologous or non-autologous EBV-B cells.
  • the cytotoxic activity of the lymphocyte population obtained by the method of the invention can be determined using known methods. For example, it is possible to determine the ability of lymphocytes to cause lysis of a labeled target cell and determine the release of the labeled material. Alternatively, the cytotoxic activity can be determined by determining the level of cytokines (for example, GM-CSF and IFN- ⁇ ) produced by lymphocytes or by the target cell.
  • cytokines for example, GM-CSF and IFN- ⁇
  • the cytotoxic activity can be determined by contacting the lymphocytes with a specific antibody of cytotoxic lymphocytes labeled with a first fluorescent molecule and with a complex formed by the antigenic peptide and the major histocompatibility complex labeled with a second fluorescent molecule followed by the detection of cells labeled with both molecules by flow cytometry.
  • the expanded lymphocyte populations according to the methods of the present invention are particularly useful for use in adoptive immunotherapy, that is, for re-administration to subjects that require a greater immune response against a particular antigen.
  • T lymphocytes are used autologously, that is, they are re-administered to the subject from which they were originally removed.
  • compositions, polynucleotides and fusion proteins of the invention are useful for the treatment of diseases that require a prolonged dose of IL15. Therefore, in another aspect, the invention relates to a pharmaceutical preparation comprising a therapeutically effective amount of a composition, a fusion protein, a polynucleotide, a gene construct, a vector or a host cell according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • Preferred excipients for use in the present invention include sugars, starches, celluloses, gums and proteins.
  • the pharmaceutical composition of the invention will be formulated in a solid dosage pharmaceutical form (for example tablets, capsules, dragees, granules, suppositories, sterile crystalline or amorphous solids that can be reconstituted to provide liquid forms etc.), liquid (for example solutions, suspensions, emulsions, elixirs, lotions, ointments etc.) or semi-solid (gels, ointments, creams and the like).
  • a solid dosage pharmaceutical form for example tablets, capsules, dragees, granules, suppositories, sterile crystalline or amorphous solids that can be reconstituted to provide liquid forms etc.
  • liquid for example solutions, suspensions, emulsions, elixirs, lotions, ointments etc.
  • semi-solid gels, ointments
  • compositions of the invention can be administered by any route, including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intrarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteric, topical, sublingual or rectal.
  • oral, intravenous, intramuscular, intrarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteric, topical, sublingual or rectal A review of the different forms of administration of active ingredients, of the excipients to be used and their manufacturing procedures can be found in the Treaty of Farmacia Galenica, C.
  • compositions comprising said vehicles can be formulated by conventional procedures known in the state of the art.
  • compositions and compounds of the invention can be formulated as nanolipopaticles in those cases where the composition comprises an ApoA protein or a ApoA fusion and a second component (IL15 or Sushi domain of the IL15 receptor alpha chain) or in those cases wherein the invention contemplates a fusion protein comprising Apo A, IL15 and the sushi domain of IL15RA).
  • IL15 or Sushi domain of the IL15 receptor alpha chain
  • the invention contemplates a fusion protein comprising Apo A, IL15 and the sushi domain of IL15RA.
  • the formation of nanolipoparticula is based on the fact that ApoA is the major component of high density lipoprotein (HDL).
  • HDL high density lipoprotein
  • nanopolarparticle any water-soluble particle, formed by a core of apolar lipids (such as esterified cholesterol and triglycerides) covered with a polar outer layer formed by apoproteins, phospholipids and free cholesterol.
  • apolar lipids such as esterified cholesterol and triglycerides
  • Nanolipoparticles or lipoproteins are classified according to their density in chylomicrons, very low density lipoproteins (VLDs), intermediate density lipoproteins (IDLs), low density lipoproteins (LDLs) and high density lipoproteins (HDLs). The different characteristics of lipoproteins are shown in Table 1.
  • the nanolipoparticle is a lipoprotein of the HDL type characterized by presenting a composition as indicated in the table above and because, the apolipopro proteins that form the protein fraction are Apo A, Apo C, Apo D and Apo E .
  • Nanolipoparticles can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.
  • nanolipoparticles can be obtained in vitro by adding cholesterol and phosphatidylcholine to the fusion protein as described in Lerch et al. (Vox Sang, 1996, 71: 155-164) or in vivo through the use of a non-human animal that expresses in the liver the conjugate of the invention resulting in the formation of nanolipoparticles that are secreted to the serum, where they can be isolated
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises nucleic acids (polynucleotides of the invention, vectors or gene constructs)
  • the invention contemplates pharmaceutical compositions specially prepared for the administration of said nucleic acids.
  • the pharmaceutical compositions can comprise said nucleic acids in a naked form, that is, in the absence of compounds that protect nucleic acids from their degradation by the body's nucleases, which entails the advantage that the toxicity associated with the reagents used is eliminated for transfection.
  • Suitable routes of administration for naked compounds include intravascular, intratumoral, intracranial, intraperitoneal, intrasplenic, intramuscular, subretinal, subcutaneous, mucosa, topical and oral (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21: 857-867).
  • nucleic acids can be administered as part of liposomes, cholesterol-conjugated or conjugates to compounds capable of promoting translocation through cell membranes such as the Tat peptide derived from the HIV-1 TAT protein, the third helix of the Antennapedia protein of D.melanogaster, the VP22 protein of herpes simplex virus, arginine oligomers and peptides such as those described in WO07069090 (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21: 99-103, Schwarze, SR et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21: 45-48, Lundberg, M et al, 2003, Mol.
  • the polynucleotide can be administered as part of a plasmid vector or a viral vector, preferably adenovirus-based vectors, adeno-associated viruses or retroviruses, such as murine leukemia virus (MLV) or lentivirus (HIV) based viruses. , IVF, EIAV).
  • adenovirus-based vectors preferably adenovirus-based vectors, adeno-associated viruses or retroviruses, such as murine leukemia virus (MLV) or lentivirus (HIV) based viruses. , IVF, EIAV).
  • compositions, fusion proteins and polynucleotides of the invention are administered by the so-called "hydrodynamic administration" as described by Liu, F., et al., (Gene Ther, 1999, 6: 1258- 66).
  • the compounds are introduced into the body intravascularly at high speed and volume, resulting in high levels of transfection with a more diffuse distribution. It has been shown that the effectiveness of intracellular access depends directly on the volume of fluid administered and the speed of injection (Liu et al, 1999, Science, 305: 1437-1441).
  • mice In mice, administration has been optimized in lml / 10 g body weight values over a period of 3-5 seconds (Hodges et al, 2003, Exp.Opin.Biol.Ther, 3: 91-918).
  • the exact mechanism that allows cell transfection in vivo with polynucleotides after hydrodynamic administration is not fully known.
  • administration by the tail vein takes place at a rate that exceeds the heart rate, which causes the administered fluid to accumulate in the superior vena cava. This fluid subsequently accesses the vessels in the organs and, subsequently, through fenestrations in said vessels, accesses the extravascular space.
  • compositions of the invention can be administered in doses of less than 10 mg per kilogram of body weight, preferably less than 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 or 0.00001 mg per kg of body weight and less than 200 nmol of agent, that is, around 4.4 x 10 16 copies per kg of body weight or less than 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75 , 0.15 or 0.075 nmol per kg of body weight.
  • the unit dose can be administered by injection, by inhalation or by topical administration.
  • the bifunctional polynucleotides and compositions of the invention can be administered directly to the organ in which the target AR is expressed in which case doses of between 0.00001 mg to 3 mg per organ are administered, or preferably between 0.0001 and 0.001 mg per organ, around 0.03 and 3.0 mg per organ, around 0, 1 and 3.0 mg per organ or between 0.3 and 3.0 mg per organ.
  • the dose depends on the severity and response of the condition to be treated and may vary between several days and several months or until it is observed that the condition remits.
  • the optimal dosage can be determined by periodic measurements of the agent concentrations in the patient's organism.
  • the optimal dose can be determined from the EC50 values obtained by previous tests in vitro or in vivo in animal models.
  • the unit dose can be administered once a day or less than once a day, preferably, less than once every 2, 4, 8 or 30 days. Alternatively, it is possible to administer an initial dose followed by one or several maintenance doses, generally of less quantity than the initial dose.
  • the maintenance regimen may involve treating the patient with doses ranging from 0.01 ⁇ g to 1.4 mg / kg body weight per day, for example, 1, 0.1, 0.01, 0.001, or 0.00001 mg per kg body weight per day.
  • the maintenance doses are preferably administered at most once every 5, 10 or 30 days.
  • the treatment should be continued for a time that will vary according to the type of alteration suffered by the patient, its severity and the patient's condition. After treatment, the evolution of the patient should be monitored to determine if the dose should be increased in case the disease does not respond to treatment or if the dose should be decreased if an improvement in the disease or unwanted side effects is observed.
  • the daily dose can be administered in a single dose or in two or more doses depending on the particular circumstances. If repeated administration or frequent administrations is desired, it is advisable to implement an administration device such as a pump, a semipermanent catheter (intravenous, intraperitoneal, intracisternal or intracapsular) or a reservoir.
  • the invention also relates to the compositions, fusion proteins and polynucleotides of the invention for use in medicine.
  • the compositions of the invention are capable of promoting the proliferation of in vivo splenic, hepatic and peripheral blood CD8 lymphocytes in vivo (see example 5 of the invention), have antitumor effect in different models of colorectal adenocarcinoma (see examples 6 and 7) and show antimetastatic effect (see example 8).
  • These effects together with evidence of the ability of IL15 to promote the activity of NK cells, allow the use of the compounds and compositions of the invention in the treatment of patients who may benefit from stimulation of the innate immune response (mediated by NK cells ) or adaptive (mediated by CD8 lymphocytes).
  • the invention relates to a composition of the invention, a fusion protein of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector or a gene construct of the invention, or a host cell of the invention for its use in stimulating the immune response of a subject.
  • composition of the invention, the fusion protein of the invention, the polynucleotide of the invention, the vector or gene construct of the invention, or the host cell of the invention are used for the treatment of disease that requires activation. of the immune system in response to an antigen.
  • the invention relates to the use of a composition of the invention, a fusion protein of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector or a gene construct of the invention, or a host cell of the invention for the preparation. of a medication for stimulating the immune response of a subject to an antigen or for the treatment of disease that requires an activation of the immune system.
  • the invention relates to a method for promoting stimulation of the immune response of a subject to an antigen or for the treatment of a disease that requires activation of the immune system comprising administering to said subject a composition of the invention. , a fusion protein of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector or a gene construct of the invention, or a host cell of the invention.
  • stimulation of the immune response of a subject refers to the initiation of an immune response against a particular antigen in an individual where said response takes place for the first time as the reactivation of the immune response in subjects where said immune response has already taken place. It is understood that the immune response may involve both an innate and adaptive immune response, and may involve a humoral and cellular response.
  • the ability of the compounds and compositions of the invention to increase the immune response of a subject to a particular antigen may be useful for the treatment of diseases associated with the presence of said antigen in the organism, which includes diseases caused for viral infections if it is a viral antigen, diseases caused by bacterial infections if it is a bacterial antigen, diseases caused by fungal infections if it is a fungal antigen, allergies if it is an allergen, diseases caused by an infestation parasitic if it is a parasitic antigen and / or a tumor if it is a specific tumor cell antigen. Therefore, in preferred embodiments, the disease that requires an activation of the immune system is selected from the group of an infectious disease and a neoplastic disease.
  • Diseases caused by viral infections include, without limitation, diseases caused by HIV-1 (AIDS) infections, by human herpesviruses such as herpes simplex virus (herpes simplex, genital herpes), cytomegalovirus (mononucleosis, retinitis, hepatitis), Epstein Barr virus (infectious mononucleosis , Burkitt lymphoma and nasopharyngeal carcinoma) and varicella zoster virus (chickenpox, shingles); for hepatitis viruses such as hepatitis B virus or hepatitis C virus, for paramyxovirus such as respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, rubella virus, measles virus, mumps virus, human papillomavirus; flaviviruses such as yellow fever virus, dengue virus, tick-borne encephalitis virus or Japanese encephalitis virus) and rotavirus.
  • herpesviruses such as herpe
  • Diseases caused by bacterial infections include, without limitation, diseases caused by microorganisms of the genus Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, hysteria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Heamophilus or Bordetella.
  • Diseases caused by fungal infections that can be treated with the compounds and combinations of the invention include, without limitation, candidiasis, aspergillosis, histoplasmosis, cryptococcal meningitis and the like.
  • Parasitic infestations that can be treated with the compounds and combinations of the invention include, without limitation, malaria, Pneumocystis jiroveci infection, pneumonia, sleep sickness, leishmaniosis, cryptosporidiosis, toxoplasmosis and trypanosome.
  • Allergic type disorders that can be treated with the compounds and compositions of the invention include, without limitation, allergies caused by pollen exposure (tree, grass, weed and grass pollen allergens), allergies caused by exposure to insect allergens ( inhalable, saliva and venom allergens), allergens from animal dander and hair and food allergens.
  • conjugates and compositions of the invention are also suitable for the treatment of hyperproliferative diseases.
  • proliferative disease refers to diseases that are caused or result from inappropriately high levels of cell division, inappropriately low levels of apoptosis or both and include both primary tumors and metastases.
  • primary tumor refers to a tumor that is located in the primary site where the tumor originated.
  • metastasis refers to the process by which a tumor extends to tissues of the organism other than the primary site of origin of the tumor.
  • treatment of a hyperproliferative disease or “treatment of a tumor” means the administration of the compounds and compositions of the invention to prevent or delay the onset of symptoms, complications or biochemical indications of cancer or tumor, to relieve its symptoms or to stop or inhibit its development and progression such as, for example, the appearance of metastases.
  • the treatment may be a prophylactic treatment to delay the onset of the disease or to prevent the manifestation of its clinical or subclinical symptoms or a therapeutic treatment to eliminate or alleviate the symptoms after the manifestation of the disease or in relation to its surgical treatment or with radiotherapy
  • the cancer to be treated in the context of the present invention can be any type of cancer or tumor.
  • These tumors or cancer include, and are not limited to, neoplasms located in the colon, abdomen, bone, breast, digestive system, liver, pancreas, peritoneum, endocrine glands (adrenal, parathyroid, pituitary, testicles, ovaries, thymus, thyroid), eye, head and neck, nervous system (central and peripheral), lymphatic system, pelvis, skin, soft tissue, spleen, thorax and genitourinary apparatus and, more particularly, childhood acute lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, corticosuprarenal carcinoma, hepatocellular cancer in adults (primary), cancer adult liver disease (primary), acute lymphocytic leukemia in adults, acute myeloid leukemia in adults, Hodgkin disease in adults, Hodgkin lympho
  • the invention relates to a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising an antigen and a composition, a fusion protein, a polynucleotide, a gene construct, a vector or a host cell according to the invention.
  • vaccine refers to a composition that comprises at least one antigen of interest and that enables the immune response of a subject to said antigen to be activated.
  • the goal of vaccines is to activate both cell-mediated and antibody-mediated immunity.
  • cell-mediated immunity includes stimulation of a T-cell response, primarily, a CD4 + mediated response, and / or a CD8 + T-cell response.
  • adjuvant refers to an immune agent that is capable of activating the immune system allowing to obtain a more intense and more efficient immune response to a vaccine than would be obtained as a result of administer the vaccine without adjuvant.
  • Typical adjuvant responses include, without limitation, the activation, proliferation and / or differentiation of immune system cells (B cells, T cells, dendritic cells, antigen presenting cells, macrophages, NK cells), increase or decrease in marker expression and cytokines, stimulation of IgA, IgM and / or IgG titres, splenomegayla (increased splenic cellularity), hyperplasia, formation of infiltrates in different organs and other types of responses that can be quantified by the person skilled in the art using technology standard.
  • Viral antigens suitable for use in vaccines that can be used with the compounds and combinations of the invention include HIV-1 antigens, (such as tat, nef, gp l 20 or gp l 60, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), human herpes virus, (such as gH, gL gM gB gC gK gE or gD or derivatives thereof) or immediate early protein such as ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 of VHS1 or VHS2 , cytomegalus virus, especially human, (such as gB or derivatives thereof), Epstein Barr virus (such as
  • Bacterial antigens or derivatives suitable for use in vaccines that can be used with the compounds and combinations of the invention include antigens of
  • Neisseria spp including N. gonorrhea and N. meningitidis (transferrin binding proteins, lactoferrin binding proteins, PilC and adhesins); S. pyogenes antigens (such as M proteins or fragments thereof and C5A protease); S. agalactiae, S. mutans antigens; H. ducreyi; Moraxella spp, including M catarrhalis, also known as Branhamella catarrhalis (such as adhesins and invasins of high and low molecular weight); Bordetella spp antigens, including B. pertussis (for example Parapertussis and B.
  • bronchiseptica such as pertactin, toxin from whooping cough or derivatives thereof, filamentous hemagglutinin, adenylate cyclase, fimbriae
  • Mycobacterium spp. antigens including M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuber culo sis, M. smegmatis; Legionella spp, including L.
  • ESAT6 85 A antigen, -B or -C ESAT6, 85 A antigen, -B or -C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSPIO, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, 19kDa PPD [Rv3763], 38kDa PPD [Rv0934]
  • Escherichia spp antigens including enterotoxic E. coli (for example colonization factors, thermolabile toxin or derivatives thereof, thermostable toxin or derivatives thereof), enterohemorrhagic E. coli and enteropathogenic E. coli antigens (eg similar toxin to Shiga toxin or derivatives thereof); Vibrio spp antigens, including V.
  • cholera for example cholera toxin or derivatives thereof
  • Shigella spp antigens including S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii
  • Yersinia spp including Y. enterocolitica (for example a Yop protein)
  • antigens of Y. pestis, Y. pseudotuberculosis Campylobacter spp, including C. jejuni (for example toxins, adhesins and invasins)
  • Salmonella spp antigens including S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; hysteria spp., including L.
  • H. pylori for example urease, catalase, vacuolizing toxin
  • Pseudomonas spp antigens including P. aeruginosa
  • Staphylococcus spp. Including S. aureus, S. epidermidis
  • Enterococcus spp. Including E.faecalis, E. faecium
  • Clostridium spp. Including C. tetani (for example tetanus toxin and derivative thereof);
  • C. botulinum antigens for example botulinum toxin and derivative thereof), C.
  • Bacillus spp. antigens including B. anthracis (for example anthrax toxin and derivatives thereof); Corynebacterium spp., Including C. diphtheriae (for example diphtheria toxin and derivatives thereof); Borrelia spp. antigens, including B. burgdorferi (eg OspA, OspC, DbpA, DbpB); B. garinii antigens (for example OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.
  • B. burgdorferi eg OspA, OspC, DbpA, DbpB
  • B. garinii antigens for example OspA, OspC, DbpA, DbpB
  • afzelii for example OspA, OspC, DbpA, DbpB
  • B. andersonfi antigens for example OspA, OspC, DbpA, DbpB
  • antigens from B. hermsii for example OspA, OspC, DbpA, DbpB
  • Ehrlichia spp. Including E. equi and the agent of human granulocytic ehrlichiosis
  • Rickettsia spp including R. rickettsii
  • Chlamydia spp. Including C. trachomatis (for example MOMP, heparin binding proteins); Chlamydia pneumoniae antigens (eg MOMP, heparin binding proteins), C.
  • psittaci antigens Leptospira spp., including L. interrogans
  • Treponema spp. Including T. pallidum (for example, rare outer membrane proteins), antigens of T. denticola, T. hyodysenteriae
  • Plasmodium spp. antigens including P. falciparum
  • Toxoplasma spp. and T. gondii for example SAG2, SAGS, Tg34
  • Entamoeba spp. antigens including E. histolytica
  • Babesia spp. Including B. microti
  • Trypanosoma spp. Including T.
  • Giardia spp. Including G. lamblia; leishmania spp., including L. major; Pneumocystis spp., Including P. carinii; Trichomonas spp., Including T. vaginalis; Schisostoma spp., Including S. mansoni, Antigens of or derivatives of yeasts such as Candida spp., Including C. albicans; Cryptococcus spp., Including C. neoformans; M.
  • tuberculosis antigens such as Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rvl884c, Rv2389c, Rv2450, Rvl009, aceA (Rv0467), PstSl, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c, 16 kDal, Ral 2, D2 , Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 and hTCC l); Chlamydia antigens (such as high molecular weight protein (HWMP), ORF3 (EP 366 412) and possible membrane proteins (Pmp); Streptococcus spp antigens, including S.
  • HWMP high molecular weight protein
  • ORF3 ORF3
  • Pmp membrane proteins
  • pneumoniae (PsaA, PspA, streptolysin, proteins) binding to choline, the pneumolysin protein antigen, and mutant detoxified derivatives thereof); Haemophilus spp. derived antigens, including H. influenzae type B (for example PRP and conjugates thereof); unclassifiable H.
  • influenzae antigens such as OMP26, high molecular weight adhesins, P5, P6, protein D and lipoprotein D, and fimbrine and fimbrine derived peptides, or multi-copy variants or fusion proteins thereof
  • Plasmodium falciparum derived antigens such as RTS.S, TRAP, MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, sequestrin, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PffiXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27 / 25, Pfsl6, Pfs48 / 45, Pfs230 and its analogues in Plasmodium spp.)
  • Fungal antigens suitable for use in vaccines include, but are not limited to, for example, Candida fungal antigen components; Histoplasma fungal antigens such as heat shock protein 60 (HSP60) and other Histoplasma fungal antigen components; Fungal cryptococcal antigens such as capsular polysaccharides and other fungal antigen components of cryptococci; fungal coccidia antigens such as spherical antigens and other components of fungal coccidia antigen; and Tinea fungal antigens such as trichophytin and other components of coccidia fungal antigen.
  • Candida fungal antigen components such as heat shock protein 60 (HSP60) and other Histoplasma fungal antigen components
  • HSP60 heat shock protein 60
  • Fungal cryptococcal antigens such as capsular polysaccharides and other fungal antigen components of cryptococci
  • fungal coccidia antigens such as spherical antigens and other components of fungal coccidia anti
  • Protozoal antigens suitable for use in vaccines include, but are not limited to, Plasmodium falciparum antigens such as merozoite surface antigens, sporozoite surface antigens, circumsporozoite antigens, gametocyte / gamete surface antigens, pf blood stage antigen, 55 / RESA and other components of plasmoid antigens; Toxoplasma antigens such as SAG-I, p30 and other components of Toxoplasma antigen; schistosome antigens such as glutathione-S-transferase, paramyosin and other schistosome antigen components; Leishmannia antigen and other Leishmania antigens such as gp63, lipophosphoglycan and its associated protein and other components of Leishmania antigen; and Trypanosoma cruzi antigens such as the 75-77 kDa antigen, the 56 kDa
  • Environmental allergens or antigens suitable for use in vaccines include, but are not limited to an antigen derived from naturally occurring allergens such as pollen allergens (pollen allergens trees, grass, weeds and grass), insect allergens (inhalable, saliva and poison allergens), animal dander and hair allergens, and food allergens.
  • an antigen derived from naturally occurring allergens such as pollen allergens (pollen allergens trees, grass, weeds and grass), insect allergens (inhalable, saliva and poison allergens), animal dander and hair allergens, and food allergens.
  • Important pollen allergens from trees, grass and herbs originate from taxonomic orders of Fagales, Oléales, Pi ⁇ ales and Platanaceae including among others birch (Betula), alder (Alnus), hazelnut (Corylus), carpe (Carpinus) and olive tree ( Olea), cedar (Cryptomeria and Juniperus), banana (Platanus), the order of Poales including among other lawns of the genera Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale and Sorghum, the orders of Asterales and Urticales including among other herbs of the genus Ambrosia, Artemisia and Parietaria.
  • allergenic antigens that may be used include house dust mite allergens of the Dermatophagoides and Euroglyphus, storage mites for example Lepidoglyphys, Glycyphagus and Tyrophagus, those of cockroaches, mosquitoes and fleas for example Blatella, Periplaneta, Chironomus and Ctenocepphalides, those of mammals such as cat, dog and horse, birds, poison allergens including those originate from insect bites or bites such as those of the taxonomic order of Hymenoptera including bees (Apidae superfamily), wasps and ants (Formicoidaé superfamily).
  • allergenic antigens include allergens by inhalation of fungi such as the genera Alternaria and Cladosporium.
  • Tumor antigens suitable for use in vaccines that can be used with the compounds and combinations of the invention include, but are not limited to MAGE, MART-l / Melan-A, gp l OO, dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), protein binding to adenosine deaminase (ADAbp), cyclophilin b, associated colorectal antigen (CRC) - 0017-1A / GA733, carcinoembryonic antigen (CEA) and its antigenic epitopes CAP-1 and CAP-2, etv6, amll, prostate specific antigen (PSA) and its antigenic epitopes PSA-1, PSA-2, and PSA-3, prostate-specific membrane antigen (PSMA), T-cell receptor / CD3 chain, MAGE family of tumor antigens (eg, MAGE -
  • compositions of the invention in particular, the fusion of Apo A and IL15 or the polynucleotide encoding said fusion and the Sushi domain of the alpha chain of the IL15 receptor or the nucleic acid encoding said domain can be presented as a single formulation (for example, as a tablet or capsule comprising a fixed amount of each of the components) or, conversely, may be presented as separate formulations and then combined for joint, sequential or separate administration.
  • the compositions of the invention also contemplate the formulation as a kit-of-parts wherein the components are formulated separately but packaged in the same container.
  • the formulation of the first and second components of the compositions of the invention can be similar, that is, formulated in a similar manner (for example, in tablets or tablets), which allows their administration by the same via.
  • the two components can be presented in blister Each blister contains the medications that have to be consumed over a day. If the medications have to be administered several times a day, the medications corresponding to each administration can be arranged in different sections of the blister, preferably recording in each section of the blister the moment of the day in which they should be administered.
  • the components of the composition of the invention can be formulated differently so that the different components are administered differently.
  • the first component is formulated as a tablet or capsule for oral administration and that the second component is formulated for intravenous administration.
  • compositions of the invention are administered by methods known to one skilled in the art, including, without limitation, intravenous, oral, nasal, parenteral, topical, transdermal, rectal and the like.
  • Total mouse liver RNA was isolated from individual samples using TRI reagent (Sigma, Madrid, Spain). The concentration and purity of the samples was determined by absorbance at 260 and 280 nm with background correction at 320 nm in photometer spectrum (Biophotometer, Eppendorf).
  • RNA 3 ⁇ g was treated with DNase I and retrotranscribed to cDNA with M-MLV RT in the presence of RNase OUT (all reagents from Invitrogen, Carfsbed, CA). 25 ⁇ of total liver cDNA were obtained. The reaction was incubated 1 h at 37 ° C, denatured 1 min at 95 ° C and brought to 4 ° C. Samples were used immediately for PCR or stored at -20 ° C.
  • Cloning of murine Apolipoprotein A-I cDNA (mApoAl) and obtaining plasmid pCMV-mApoAl pCMV-mApoAl (pApo), comprises a sequence SEQ.ID.NO. 1 encoding a polypeptide comprising murine apolipoprotein A-I (Apoal) preceded by its own signal peptide, and which is operably linked to the cytomegalovirus promoter;
  • the FwATGmApoAl sense primer was designed: 5 '- ATGAAAGCTGTGGTGCTGGC-3' (SEQ.ID.NO. 46),
  • the mApoAl cDNA (795 total nucleotides, 72 nucleotides encoding the signal peptide and 723 nucleotides encoding the native protein) was amplified by PCR on the total liver cDNA, using BioTaq DNA polymerase (Bioline, London, United Kingdom): 5 min 94 ° C, 30 cycles of 40 sec at 94 ° C, 40 sec at 55 ° C and 40 sec at 72 ° C, followed by 7 min at 72 ° C in 2720 Thermal cycler thermal cycler (Applied Biosystems , Foster City, USA).
  • the PCR product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment by QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the purified mApoAl cDNA was cloned, following the instructions provided by the manufacturer, into the pcDA3 ⁇ 4 TM 3.1 / V5-His TOPO® TA expression vector (Invitrogen, Carfsbed, CA), which we will call pCMV-mApoAl or also pApo. Finally, the sequence obtained by sequencing was confirmed.
  • pCMV-hIL15 Cloning of human Interleukin 15 (hIL15) and obtaining plasmid pCMV-hIL15 pCMV-hIL15 (phIL15), comprises a sequence SEQ.ID.NO. 2 encoding a polypeptide comprising human IL15 preceded by the signal peptide of the IgVx chain, and which is operably linked to the cytomegalovirus promoter;
  • GGCGCGCCC 9 nucleotide sequence
  • HIL15 cDNA (345 total nucleotides) was amplified by PCR on the expression plasmid pVkL / IL-15IResneo (Meazza et al. Eur. J. Immunol. 1997; 27: 1049-1054).
  • This plasmid contains the human mature IL15 coding sequence preceded by the IgVx chain, under the control of the cytomegalovirus promoter.
  • the term pCMV-hIL5 or phIL15 will be used to refer to it.
  • PCR was performed using EasyA high fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA).
  • the amplification conditions were: 2 min 95 ° C, 30 cycles of 40 sec at 95 ° C, 30 sec at 57 ° C and 45 sec at 72 ° C, followed by 7 min at 72 ° C in 2720 Thermal cycler thermal cycler ( Applied Biosystems Foster City, USA).
  • the PCR product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment by QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the purified hIL15 cDNA was cloned, following the instructions provided, in the expression vector pTrcHis2 TOPO® TA (Invitrogen, Carfsbed, CA), which we will call pTrcHis2-hIL 15. Finally, the sequence obtained by sequencing was confirmed.
  • pCMV-Apo-hIL15 that encodes the gene fusion of mApoAl and hIL15
  • pCMV-Apo-hIL15 comprises a sequence SEQ.ID.NO. 40, which encodes a fusion protein comprising murine apolipoprotein A-I, bound to human IL15 by a GAP linker (linker), and which is operably linked to the cytomegal virus promoter; and the RvAscImApoAl antisense primer was designed:
  • GGCGCGCCC 9 nucleotide sequence
  • the PCR product (804 nucleotides) was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the purified mApoAl-AscI DNA was cloned, following the instructions provided, in the pcDNA TM 3.1 / V5-His TOPO® TA expression vector (Invitrogen, Carfsbed, CA), which we will call pCMV-mApoAl-AscI. Finally, the sequence obtained by sequencing was confirmed.
  • the digestion product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment by QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA), obtaining the purified DNA AscI-hIL15 -NotI (345 nucleotides).
  • the plasmid pCMV-mApoAl-AscI was digested 50 min at 37 ° C with the enzyme AscI and Buffer 4 (New England Biolabs). The digestion product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment by QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the purified DNA pCMV-mApoAl was then digested 50 min at 37 ° C with the enzyme Notl, lxBSA and Buffer 3 (New England Biolabs) taking advantage of the restriction site present in the skeleton of pcDNA 3.1 V5-His TOPO® TA.
  • the digestion product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment by QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the vector opened by AscI and Notl pCMV-mApoAl was ligated with the AscI-hIL15-NotI insert in a 1: 3 ratio (vector: insert) using the T4 DNA ligase High Concentration ligase and as a buffer solution the 2X Rapid Ligation Buffer (Promega Madison, Wl, USA), incubating the mixture 10 min at room temperature.
  • ToplO bacteria Invitrogen, Carfsbed, CA
  • the transformed bacteria were selected for their growth in Petri dishes with LB medium with ampicillin, since the vector contains a gene for resistance to this antibiotic.
  • Plasmid DNA was extracted from the positive bacteria using the MiniPrep technique (Qiagen, Germany) to subsequently digest 2 ⁇ g of said plasmid with the Ascl / Pmel enzymes (New England Biolabs) and electrode the result of said digestion in a 1% agarose gel to check the presence of the insert.
  • the resulting plasmid of 6669 nts will be referred to hereafter as pCMV-Apo-hIL15 or also pApo-hIL15.
  • pCMV-Sushi corresponds to the plasmid IL-15RAMD previously described by Duitmann et al. (Duitman, E.H., et al., Mol Cell Biol, 2008; 28: 4851-4861), which was kindly provided by the authors of this work.
  • pCMV-Sushi which contains a sequence SEQ ID NO: 20 encoding a polypeptide comprising the Sushi domain of the murine IL15 receptor ⁇ chain (IL15ra), preceded by an IgK signal peptide, and which is operably linked to the cytomegalovirus promoter.
  • pCMV-mSushi-mIL15 comprises a sequence encoding a polypeptide comprising the Sushi domain of the murine IL15 receptor ⁇ chain (IL15ra), linked to murine IL 15 by a flexible linker of the GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ type (SEQ ID NO: 32).
  • pmSushi-mIL15-mApo which encodes the gene fusion of mSushi, mIL15 and mApoAl
  • pCMV-mSushi-mIL15-mApoAl comprises a sequence SEQ ID NO: 45 that encodes a fusion protein comprising the Sushi domain of the ⁇ chain of the murine IL15 receptor (IL15ra), murine IL15, and murine apolipoprotein AI.
  • Primers were designed to amplify the Sushi sequence fused to murine IL15 and bind to it at the same time the 9 nucleotide sequence (GGCGCGCCC) that constitutes a restriction site for the 3 'AscI enzyme in the gene and eliminates the termination codon. This added restriction sequence will allow cloning with an Apo sequence containing the 5 'AscI sequence and will result in a GAP short-binding peptide, which will give the constituent proteins some mobility.
  • the primers were:
  • the sequence was amplified by PCR, using as a template the pmSushi-mIL15 described in the previous example, and the primers Fw Sushi and Rv IL15 AscI, with the enzyme BioTaq DNA polymerase (Bioline, London, United Kingdom), 1 min 94 ° C , 30 cycles of 30 sec at 94 ° C, 30 sec at 58 ° C and 45 sec at 72 ° C, followed by 2 min at 72 ° C in 2720 Thermal cycler thermal cycler (Applied Biosystems Foster City, USA).
  • the PCR product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and purified the gel fragment by QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the purified DNA was cloned, following the instructions provided, into the pcDNA TM 3.1 / V5-His TOPO® TA expression vector (Invitrogen, Carfsbed, CA), which we will call pCMV-mSushi-mIL15-AscI. Finally, the sequence obtained by sequencing was confirmed.
  • the plasmid pCMV-mIFN-AscI-mApo (described in patent application WO2009150284 and comprising a polynucleotide encoding a fusion protein between mlFN and mApo), 50 min at 37 ° C with the enzymes was digested AscI and Ncol in Buffer 4 (New England Biolabs). The digestion product was migrated in 1% agarose gel Agarose Dl low EEO (Pronadisa, Madrid, Spain), and the upper band containing the open vector without the IFN sequence was purified from the gel by QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia , CA).
  • Plasmid pCMV-mSushi-mIL15-AscI was digested using the same enzymes and conditions. In this case, the lower band containing the mSushi-mIL15 fragment was purified. Both purified fragments were ligated in a 1: 3 ratio (vector: insert) using the T4 DNA ligase High Concentration ligase and as a buffer solution the 2X Rapid Ligation Buffer (Promega Madison, Wl, USA), incubating the mixture 10 min at room temperature . ToplO bacteria (Invitrogen, Carfsbed, CA) were subsequently transformed. The transformed bacteria were selected for their growth in Petri dishes with LB medium with ampicillin, since the vector contains a gene for resistance to this antibiotic.
  • Plasmid DNA was extracted from the positive bacteria using the MiniPrep technique (Qiagen, Germany) to subsequently digest 2 ⁇ g of said plasmid with the Ascl / Pmel enzymes (New England Biolabs) and electrophoresis to separate the result of said digestion in 1% agarose gel to check the presence of the insert.
  • the resulting plasmid will hereinafter be referred to as pCMV-mSushi-mIL 15-mApoAl or also pmSushi-mIL 15 -mApo.
  • Each DNA plasmid (10 ⁇ g) was resuspended in 1.8 ml of 0.9% saline (Braun) introduced by the tail vein by hydrodynamic injection, using 27.5G needles and 2.5ml syringes (Becton-Dickinson, Spain ). Blood samples were obtained retroorbitally, after inhalation anesthesia with isofluorane (Forane, Abbott). The serum was recovered by two consecutive centrifugations at 9, lxg for 5 minutes and stored at -20 ° C. Parenteral anesthesia was performed by intraperitoneal injection of 200 ⁇ / mouse with a 9: 1 mixture of ketamine (Imalgene) and xylazine (Rompun).
  • the CT26 cell line is derived from a BALB / c mouse colorectal carcinoma adeno and was induced by the N-nitroso-N-methyl urethane carcinogen.
  • the MC38 line comes from a murine adenocarcinoma.
  • Serum levels of hIL15 were measured by ELISA in 96-well flat plates NUNC maxisorp. With an ELISA kit (Set Human IL15, BD Biosiences, San Diego, CA, USA), according to the instructions provided by the manufacturer.
  • the study of cell populations was carried out by means of flow cytometry.
  • blood was obtained from the retroorbital route of the spleen and liver of the animals.
  • the solid organs were incubated for 15 min with a solution of collagenase and DNAse to facilitate cell disintegration, which was carried out with the help of a Cell Strainer ⁇ (BC Falcon, Bedford, MA, USA).
  • Liver lymphocytes were isolated by centrifugation of the cell suspension in a 35% solution of Percoll® (GE Heathcare, Uppsala, Sweden).
  • the cells were resuspended in 50 PBS and incubated for 10 min at 4 ° C in the dark with the corresponding antibody mixture. Two washes were subsequently performed and analyzed on a FACScalibur ⁇ cytometer (BD Bioscience, San Diego, CA, USA). The subsequent analysis of the data was performed with the Flow Jo Version 5.7.2 program.
  • NK1.1-PE CD3-FITC
  • CD8-PE CD44-APC
  • CD62L-PE CD8-PECy7
  • NK1.1-APC BD-Pharmamingen, BD Bioscience, San Diego, CA, USA
  • Plasmids injected into the different groups were: pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo or saline vehicle (S).
  • Serum samples were obtained at 8, 24, 96, 168 and 240 hours and the concentration of hIL15 in them was determined by a sandwich ELISA.
  • Sera from mice that received the control plasmid expressing ApoAl did not contain detectable levels of hIL15 ( Figure 1).
  • Mice that had been injected with the plasmid expressing hIL 15 had maximum concentrations of hIL 15 at 8h that decreased rapidly ( Figure 1).
  • mice that received the plasmids encoding ApoAl-hIL15 (with or without coinfection of the plasmid pSushi) had higher concentrations of serum hIL15 at 8h, which continued to increase until 24h.
  • Plasmids were administered by hydrodynamic injection and serum samples were obtained at 24h.
  • the serum was decomplemented by thermal denaturation (45 minutes 56 ° C) and added to CTLL2 cell cultures.
  • cell proliferation was measured with tritiated thymidite.
  • concentration of hIL15 in the serum was measured by a commercial sandwich ELISA.
  • the mouse serum treated with pApo-hIL15 + pSushi induced a more intense proliferation of CTLL2 cells ( Figure 2).
  • the percentage of CD8 T lymphocytes was also analyzed with respect to the lymphocytes present in the liver of mice treated with the different plasmids.
  • the plasmids were injected by hydrodynamic injection and on day 3, 4, 5, 6 and 7 the livers were disintegrated, the lymphocytes were isolated by centrifugation in a solution of Percoll ⁇ and, after labeling the CD8 T lymphocytes with anti-antibody CD3 and anti-CD8 were analyzed by flow cytometry.
  • the mice given the plasmids pApo-hIL15 and pSushi together had a percentage of CD8 T lymphocytes in the liver superior to the mice in the rest of the groups ( Figure 4).
  • the percentage of CD8 T lymphocytes was analyzed with respect to lymphocytes present in peripheral blood of mice treated with the different plasmids.
  • the plasmids were injected by hydrodynamic injection and on day 3, 4, 5 and 6 blood samples were obtained and the CD8 T lymphocytes were labeled with anti-CD3, anti-CD8, anti-CD44 and anti-CD62L antibodies. They were analyzed by flow cytometry.
  • the mice that were given the plasmids pApo-hIL 15 and pSushi together had a percentage of CD8 T lymphocytes in peripheral blood higher than the mice in the rest of the groups on days 5 and 6 after treatment (Figure 5A).
  • CD8 T lymphocytes CD8 + CD44 +
  • Figure 5B A higher percentage of memory CD8 T lymphocytes (CD8 + CD44 +) was also observed in this group ( Figure 5B) and within T cell subpopulations CD8 memory effectors (CD8 + CD44 + CD62L-) and CD8 central memory (CD8 + CD44 + CD62L +) ( Figures 5C and 5d).
  • CD8 T lymphocytes Studies of the number and percentage of CD8 T lymphocytes show that the administration of pApo-hIL15 and pSushi induces more abundant populations of CD8 T lymphocytes in spleen, liver and peripheral blood than the administration of the other plasmids. Specifically, the administration of pApo-hIL15 and pSushi results in a significantly larger population of CD8 T lymphocytes in spleen, liver and blood than the administration of the phIL15 and pSushi constructs.
  • Example 6 Antitumor effect of ApoAl and hIL15 based constructs in the subcutaneous CT26 model.
  • a subcutaneous tumor model in Balb / c mice induced by the CT26 cell line derived from a colorectal adenocarcinoma was chosen. 5x10 5 cells were injected per mouse subcutaneously and treated at 3 days with the different constructs based on ApoAl, hIL15 and Sushi. The size of the tumors was measured by calculating the product of 2 diameters twice a week with a digital caliber. Mice were sacrificed when their size was greater than 246 mm 2 .
  • mice 5x10 5 cells of the MC38 line were injected subcutaneously and treated with the different constructions based on ApoAl, hIL15 and Sushi at 6 days to the mice bearing tumor nodules.
  • the size of the tumors was measured by calculating the product of 2 diameters twice a week with a digital caliber and the mice were sacrificed when their size was greater than 246mm 2 .
  • Example 8 Antimetastatic effect of constructs based on ApoAl and hIL15 in the intrasplenic MC38 model
  • mice 5xl0 5 cells of the MC38 line were injected per mouse intra-spleen and were treated the next day with the different constructions based on ApoAl, hIL15 and pSushi. At 19 days the mice were sacrificed and the number of metastases present in the liver was observed.
  • mice were grouped into 3 groups: I mice died due to massive liver metastases or with generalized metastases (it is not possible to see healthy tissue in the liver with the naked eye); II mice that present metastases in part of the liver tissue; III mice free of liver metastases.
  • mice treated with pApo-hIL15 and pSushi 71% had a liver free of metastasis, compared with 30% of mice treated with pApo-hIL 15, 25% in those treated with phIL15 + pSushi, 20% of those They received saline (S) and 0% of the phIL 15 and Apo groups (Figure 8).
  • Example 9 Effect of administration of ApoAl and hIL15-based constructs on "knock out” mice for the IL15 ⁇ receptor
  • mice lacking the IL15 ⁇ receptor had a characteristic phenotype, since they lack NK cells and have a small amount of memory CD8 T cells (Lodolce et al. Immunity 1998; 9: 669-676).
  • mice Four mice were injected, one with the plasmids pApo-hIL15 and pSushi, another with phIL15 and pSushi, another with pApo and finally another with pApo-hIL15. Five days after the mice were sacrificed, the spleen was removed and the splenic populations of NK cells and memory CD8 T lymphocytes by flow cytometry (Figure 9).
  • mice treated with plasmids pApo-hIL15 and pSushi had a percentage of 1.02% NK cells, much higher than the mouse treated with pApo (0.39%>).
  • memory CD8 T lymphocytes of those mice treated with pApo-hIL15 and pSushi had 1.47% of CD8 + CD44 + cells with respect to the total splenocytes. This percentage is similar to that achieved with the pApo-hIL15 construction alone.
  • Example 10 Effect of the administration of a triple construction, based on the fusion of Sushi, IL15 and ApoAl.
  • mice groups of C57BL / 6 mice (2-3 animals per treatment group) were established, to which the plasmid to be tested was injected by hydrodynamic injection (2.5 ⁇ g / mouse).
  • hydrodynamic injection 2.5 ⁇ g / mouse.
  • the spleens were disintegrated to obtain a unicellular suspension, the total cells were counted and, after labeling the CD8 T lymphocytes with anti-CD3, anti-CD8 and anti-CD44 antibodies and NK cells with anti-CD3 antibodies , anti-NKl. l, were analyzed by multi-color flow cytometry.
  • the plasmids to be tested in the different treatment groups were:
  • Example 11 Effect on the stimulation of proliferation of CD8 and NK T cells in the mouse spleen of the constructs encoding murine IL15 and human IL15.
  • the stimulatory activity on the number of splenocytes of the constructs encoding the mIL15 and hIL15 molecules was comparatively studied by administering the corresponding plasmids by hydrodynamic injection (10 ⁇ g / mouse) co-administered or not with the plasmid pSushi.
  • the spleens were disintegrated to obtain a unicellular suspension, the total cells were counted and, after labeling the CD8 T lymphocytes with anti-CD3 and anti-CD8 antibodies and the NK cells with anti-NKl antibodies.
  • l and anti-CD-3 were analyzed by multi-color flow cytometry.
  • the pmSushi-mIL15-mApo plasmid which encodes the triple fusion protein, increases the number of NK cells in the spleen and in the liver to a greater extent than the pmSushi-mIL15 plasmid co-administered with the plasmid pApo.
  • mice Groups of C57BL / 6 mice were established, to which the plasmid to be tested was injected by hydrodynamic injection:
  • Example 13 Antitumor effect of a triple construct, based on the fusion of Sushi, IL15 and ApoAl in the subcutaneous MC38 model.
  • mice 5xl0 5 cells of the MC38 line were injected subcutaneously and treated at 8 and 19 days with the different constructs.
  • the plasmids to be tested in the different treatment groups were:
  • mice bearing tumor nodules were established: 5 mice were treated with pApo; 8 mice were treated with pmSushi-mIL15-mApo and 9 mice were treated with pApo-hIL15 + pSushi which were injected, by hydrodynamic injection, the plasmid to be tested pApo (1 ⁇ g / mouse), pmSushi-mIL15-mApo (1 ⁇ g / mouse) and pApo-hIL15 + pSushi (10 ⁇ g / mouse each).
  • the size of the tumors was measured by calculating the product of 2 diameters twice a week with a digital caliber and the mice were sacrificed when their size was greater than 246mm.
  • mice treated with the plasmid pApo had a visible tumor on the day of sacrifice (29 days) and 80% of the mice had a tumor> 40mm2, while no mouse treated with pApo-hIL15 + pShushi was tumor free at the end of the study (day 29) and 80%) of the mice had a tumor> 40mm2 although they received a dose 10 times higher of the plasmids separately than of the triple fusion.

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Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones que presentan capacidad de promover tanto la respuesta inmune innata como de la respuesta inmune adaptativa en un sujeto basadas en el uso conjunto de ApoA, interleuquina 15 y del dominio sushi de la cadena alfa del receptor de IL 15, así como al uso de estas composiciones para estimular la respuesta inmune en un paciente y en métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades infecciosas y neopláicas.

Description

NUEVOS CONJUGADOS Y COMPOSICIONES PARA INMUNOTERAPIA Y TRATAMIENTO ANTI-TUMORAL
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del ámbito de la inmunología y, más concretamente, en el campo de composiciones que presentan capacidad de promover tanto la respuesta inmune innata como de la respuesta inmune adaptativa en un sujeto. Estas composiciones son de utilidad para el tratamiento de todas aquellas enfermedades que requieran de una mayor actividad del sistema inmune como, por ejemplo, tumores y enfermedades infecciosas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interleuquina 15 (IL15 o IL15) es una citoquina imprescindible para la actividad de células NK, NKT y linfocitos T CD8 memoria. Ejerce su función por medio de un receptor que consta de 3 subunidades denominadas α, β y γ. Las subunidades β y γ son comunes al receptor de IL-2. La cadena α del receptor de IL15 es único para la IL15 y es necesario para la salida al medio extracelular de la citoquina [Duitman, E.H., et al, Mol Cell Biol, 2008. 28:4851-61] y "presenta" la IL15 a las subunidades IL15RP y IL15Ry.
Debido a las propiedades estimulantes del sistema inmune, esta interleuquina tiene propiedades anti-tumorales dependientes de la presencia de células NK (Suzuki, 2001, J.Leuokoc.BioL, 69:531-537) y de células T (Hazama, 1999, Br.J.Cancer., 80: 1420- 1426, Meazza, 2000, Int.J.Cancer, 87:574-581 y Klebanoff, 2004, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2004, 101 : 1969-1974). IL 15 también está implicada en la protección frente a infecciones virales y en la expansión y mantenimiento de una respuesta basada en células T en la inmunización y desarrollo de células dendríticas.
Por tanto, IL15 puede ser un agente terapéutico útil en el tratamiento de enfermedades en las que se encuentra involucrado el sistema inmune. Sin embargo, los estudios in vivo para caracterizar la función de IL15 se han visto impedidos debido en parte a la falta de disponibilidad de IL15 recombinante y al bajo nivel de secreción observado cuando IL15 se expresa a partir del gen nativo. Adicionalmente, la mayor parte de las citoquinas tienen vidas medias en plasma muy reducidas dado que se producen in vivo de forma local y transitoria. Por tanto, el uso de IL15 in vivo requiere el uso de dosis relativamente altas y administraciones frecuentes, lo que resulta en distintos efectos secundarios que pueden resultar en que pacientes que sufren de cáncer no pueden tolerar el tratamiento. Con el fin de evitar estas desventajas, IL15 ha sido utilizada en terapia antitumoral en combinación con otros tratamientos como anticuerpos anti-CD40, IL-7 o IL-6 [Chou, P.C., et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol, 130:25-34; Lin, C.Y., et al., Cáncer Lett, 2008. 272(2): p. 285-95 ; Zhang, M., et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2009, 106:7513-8 and Cha, E., et al., Breast Cáncer Res Treat, 2009]. Estas combinaciones muestran un efecto sinérgico lo que permite alcanzar efectos similares con menores dosis de IL15.
Otra posibilidad de aumentar la actividad de IL15 consiste en su co-administración con una proteína de fusión que comprende la región constante de una inmunoglobulina y la región soluble de la cadena α del receptor de IL15, lo que resulta en un aumento de 50 veces en la actividad de IL15 (Rubinstein M.P. et al, 2006, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:9166-71 y Stoklasek T.A. et al, 2006, J. Immunol; 177:6072-80).
Recientemente se ha demostrado que un polipéptido formado por los aminoácidos 1 al 77 del extremo amino terminal de la cadena α del receptor de IL15 (el llamado
"dominio sushi") es un agonista de la IL15 [Mortier, E., et al., J Biol Chem, 2006.
281(3): p. 1612-9]. Así, la administración de una proteína de fusión que contiene dicho dominio e IL15 muestra un efecto antitumoral superior al de IL15 y que resulta en la disminución del 65% en el número de metástasis en pulmón del tumor B16F10 y en la disminución del número de metástasis de tumor HCT-116 humano implantado en el intestino ciego de ratones nude [Bessard, A., et al, Mol Cáncer Ther, 2009. 8(9): p.
2736-45]. Otra alternativa para conseguir mejorar el efecto de IL15 sin incurrir en efectos secundarios indeseados consiste en modificar la molécula con el fin de aumentar su vida media. Así, US2006257361 describe proteínas de fusión que comprenden la región constante de una inmunoglobulina e IL15 que presentan vidas medias en suero tras su administración superiores a IL15 no modificada.
No obstante, existe una necesidad en el estado de la técnica de formulaciones alternativas de IL15 en las que la proteína mantenga su actividad promotora de la respuesta inmune pero que permitan reducir al máximo los efectos secundarios asociados con IL15.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende, juntos o separados,
(i) un primer componente seleccionado del grupo de
(a) un polipéptido que comprende un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA y
(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA y
(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de
IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con IL15 y un polinucleótido que codifica IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70%) de identidad con IL1 y
(iii) un tercer componente seleccionado del grupo de
(a) el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 y
un polmucleótido que codifica el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende
(i) una región A formada por un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo mismo que presenta, al menos, un 70%) de identidad con dicho polipéptido ApoA,
(ii) una región B formada por IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70%> de identidad con IL15 y
(iii) una región C formada por el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15.
En sucesivos aspectos, la invención se relaciona con un polmucleótido que codifica una proteína de fusión de la invención, con un vector o una construcción génica que comprende un polinucleótido de la invención, con una célula huésped que comprende una proteína de fusión de la invención, con un polinucleótido de la invención, con un vector de la invención o una construcción génica de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector o una construcción génica de la invención, una célula huésped de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para promover la expansión de linfocitos T específicos de un antígeno que comprende poner en contacto una población de linfocitos previamente expuestos in vivo a dicho antígeno con una composición de la invención, una pro teína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector o una construcción génica de la invención, una célula huésped de la invención.
Adicionalmente, la invención se relaciona con una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector o una construcción génica de la invención, una célula huésped de la invención para su uso en medicina o para el tratamiento de enfermedades que requieran de la estimulación de la respuesta inmune de un sujeto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Cinética de la expresión de hIL15 (ng/mL) en el tiempo t (h: horas). Grupos de Ratones C57B 16 recibieron una inyección hidrodinámica con los plásmidos, pApo-hIL15 + pSushi, pApo-hIL15, phIL15 + pSushi, phIL15, pApo o solución salina (S). A las 8, 24, 96, 168 y 240 horas se extrajo sangre y se analizó mediante ELISA la concentración sérica de hIL15. Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 2-3 animales por grupo . Los resultados se compararon estadísticamente mediante ANOVA de medidas repetidas, seguido de un test de Bonferroni. Se observan diferencias significativas entre los niveles de hIL15 a las 8 y 24h del grupo tratados con pApo-hIL15 con respecto al resto de los grupos (p<0,001).
Figura 2. Ensayo funcional de proliferación de pApo-hIL15 coadministrado con pSushi mediante inyección hidrodinámica. Se cultivaron células CTLL2 con diluciones seriadas de sueros obtenidos a las 24h de tratar ratones con pApo-hIL15 y pApo-hIL15 + pSushi. A las 48h se estudió la incorporación de timidina tritiada a células CTLL2 como índice de proliferación (c.p.m.) y se observó que los sueros de los ratones tratados simultáneamente con pApo-hIL15 y pSushi inducían una mayor proliferación que los sueros de ratones tratados únicamente con pApo-hIL15 (p<0,001). Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 4-5 animales por grupo. Los resultados se compararon estadísticamente mediante ANO VA de medidas repetidas.
Figura 3. Aumento del número total y porcentaje de células T CD8+ respecto a los esplenocitos totales en el tiempo (t (d), en días). Grupos de ratones C57B16 recibieron mediante inyección hidrodinámica las distintas construcciones plasmídicas y a los 3, 4, 5, 6 y 7 días se sacrificaron y se extirparon los bazos. Se analizó el número de células T CD8+ (A), el porcentaje de células T CD8+ respecto a esplenocitos totales (B), el número de células T memoria CD8 CD44+ (C) y el porcentaje de células T memoria CD8+CD44+ respecto a esplenocitos totales (D). El grupo de ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL 15 y pSushi (■) presentan mayor número de células T CD8+ que el resto de los grupos: pApo-hIL15 (□), phIL15 + pSushi (A), phIL15 (Δ), pApo (o) y vehículo salino (*). Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 2 animales por grupo. Los datos se analizaron mediante ANO VA de medidas repetidas seguido de un test de Bonferroni comparando el grupo de pApo-hIL15 + pSushi y el grupo phIL15 + pSushi * p<0,05; ** p<0,001; *** p<0,0001.
Figura 4. Aumento del porcentaje de células T CD8+ respecto a los linfocitos totales del hígado en el tiempo (t (d), en días). Ratones C57B16 recibieron por vía hidrodinámica las distintitas construcciones. A los 3, 4, 5, 6 y 7 días se sacrificaron y se aislaron los hígados. Se analizó el porcentaje de células T CD8+ respecto a los linfocitos totales. El grupo de ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi (■) presentaron mayor porcentaje de células T CD8+ que el resto de los grupos: pApo-hIL15 (□), phIL15 + pSushi (A ), phIL15 (Δ), pApo (·) y vehículos salino (*). Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 2 animales por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas seguido de un test de Bonferroni comparando el grupo de pApo-hIL15 + pSushi y el grupo phIL15 + pSushi * p<0,05; ** p<0,001; *** p<0,0001. Figura 5. Aumento del número total y porcentaje de células T CD8 respecto a los linfocitos de sangre periférica. Ratones C57B16 recibieron por vía hidrodinámica las distintitas construcciones con phIL 15. A los 3, 4, 5 y 6 días se obtuvo sangre y se estudió el porcentaje de linfocitos T CD8+ (A), el de células T memoria CD8+CD44+ (B), y los porcentajes de células memoria efectoras CD8 CD44 CD62L" (C) y centrales CD8+CD44+CD62L+ (D). En todas las poblaciones estudiadas, el grupo de ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi (■) presentaron mayor porcentaje de células T CD8+ que el resto de los grupos: pApo-hIL15 (□), phIL15 + pSushi ( A ), phIL15 (Δ), pApo (·), pSushi (□) y vehículo salino (*). Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 3 animales por grupo. Los datos se analizaron mediante ANO VA de medidas repetidas seguido de un test de Bonferroni comparando el grupo de pApo-hIL15 + Sushi y el grupo phIL15 + pSushi * p<0,05; ** p<0,001; *** p<0,0001.
Figura 6. Efecto antitumoral en el tiempo (t (d), en días) de las construcciones en el modelo de tumor subcutáneo CT26. Ratones Balb/c recibieron por vía subcutánea 5xl05 células CT26 y a los 3 días fueron tratados por vía hidrodinámica con pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo o con solución salina (S). Se midieron los tumores en mm2 con un calibre digital cada 2 días (A), y se observó el tiempo de supervivencia (% SV) de los animales (B). Se vio que los ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi presentaron un retraso en el crecimiento de los tumores y una mayor supervivencia que los ratones del resto de los grupos. Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 8 animales por grupo.
Figura 7. Efecto antitumoral en el tiempo (t (d): en días) de los plásmidos en el modelo de tumor subcutáneo MC38. Ratones C57B 16 recibieron por vía subcutánea 5xl 05 células MC38 y a los 6 días fueron tratados por vía hidrodinámica con pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo o con solución salina (S). Se midieron los tumores en mm2 con un calibre digital cada 2 días (A), y se observó el tiempo de supervivencia (% SV) de los animales (B). Se vio que los ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi presentaron un retraso en el crecimiento de los tumores. Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo. Figura 8. Efecto antimetastásico de los distintos plásmidos en el modelo de tumor intraesplénico MC38. Ratones C57B16 recibieron por vía intraesplénica 5xl05 células MC38 y al día siguiente fueron tratados por vía hidrodinámica con pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo o con solución salina (S). A los 19 días se sacrificaron los ratones y se dividieron los ratones en 3 grupos: I, ratones fallecidos debido a las metástasis hepáticas o con metástasis generalizada; II, ratones que presentan metástasis en parte del tejido hepático; III, ratones libres de metástasis hepática. Se muestran datos de un experimento representativo.
Figura 9. Efecto de los distintos plásmidos en ratones "knock out" para el receptor α de IL15. Cuatro ratones carentes del receptor α de IL15 fueron tratados por hidrodinámica con los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi, phIL15 y pSushi, pApo y pApo-hIL15. Se sacrificaron a los 5 días, se extrajo el bazo y se estudiaron las poblaciones esplénicas de células NK y linfocitos T CD8+ memoria mediante citometría de flujo usando el marcador CD3 para su diferenciación. En la figura se incluye además las poblaciones de NK y T CD8+ memoria de un ratón C57B 16 no mutado. Se muestra el porcentaje de células NK (A) de los ratones estudiados, los linfocitos T CD8+ (B) y la subpoblación CD8+CD44+ (C). Se indican los porcentajes de células respecto a los esplenocitos totales. Figura 10. Aumento del número total de esplenocitos y de células T CD8+ y NK1.1. Grupos de ratones C57B16 fueron tratados por inyección hidrodinámica con los plásmidos: 1) pmSushi-mIL15-mApo; 2 ) pApo-hIL 15 en combinación con pSushi (pApo-hIL15 + pSushi); 3) pApo-hIL15; 4) phIL15 en combinación con pSushi (phIL15 + pSushi); 5) phIL15 y 6) pApo. A los 6 días se sacrificaron y se extirparon los bazos. Se estudiaron mediante citometría de flujo A) la población de esplenocitos totales; B) los linfocitos T CD8+ memoria (CD8+CD3+); y C) de células NK (NK1.1+CD3+) . El grupo de ratones a los que se les administró pmSushi-mIL15-mApo presentaron mayor número de células T CD8 respecto a los esplenocitos totales que el resto de los grupos. Se muestra la media y el error estándar de la media de un experimento representativo con 2-3 animales por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de un test de Bonferroni comparando el grupo de pmSushi-mIL15-mApo con el resto de los grupos inyectados con plásmidos codificantes de las proteínas indicadas * p<0,05; ** p<0,001; *** p<0,0001.
Figura 11. Efecto comparativo de la iso forma humana o murina de IL15 en el aumento del número total de esplenocitos y en el porcentaje de células T CD8+ y células NK respecto a los esplenocitos totales. Grupos de ratones C57BL/6 fueron tratados por inyección hidrodinámica con los plásmidos: 1) pmIL15; 2) phIL15; 3) pmIL 15 en combinación conpSushi; y 4) phIL15 en combinación con pSushi. A los 4 días se sacrificaron y se aislaron los bazos y se contaron los esplenocitos totales (A), las células T CD8 respecto al númeo de esplenocitos totales (B), y las células NK respecto al número de esplenocitos totales (C). Se muestra la media y el error estándar de la media (en su caso) de un experimento representativo con 1-2 animales por grupo. Los datos se analizaron mediante test Kruskall-Wallis seguido de un test de comparación múltiple de Dunn's. Las figuras muestran que mIL15 y hIL15 estimulan el número de esplenocitos y células T CD8 y NK en bazo de forma similar.
Figura 12. Efecto de la fusión de mSushi con mIL 15 y ApoAI en el porcentaje de células NK en bazo (A) y en hígado (B). Grupos de ratones C57BL/6 fueron tratados por inyección hidrodinámica con los plásmidos : 1 ) pmSushi-mIL15-mApo, administrados a distintas dosis de 1 μg/ratón, 2,5 μg/ratón, y 5 μg/ratón respectivmante; y 2) pmSushi-mIL15 en combinación con pApo, administrados ambos a las 3 mismas dosis. A los 4 días se sacrificaron y se aislaron los bazos (A) y los hígados (B) y se marcaron las células NK (NK1.1+CD3+). En todas las dosis estudiadas, el grupo de ratones a los que se les administró el plásmido pmSushi-mIL15-mApo presentó mayor porcentaje de células NK que el resto de los grupos. Se muestra cada replicado y la media de un experimento representativo con 2-3 animales por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía. Figura 13. Efecto antitumoral de la fusión de mSushi con mIL15 y ApoAI en el modelo de tumor subcutáneo MC38. Ratones C57B 16 recibieron por vía subcutánea 5xl 05 células MC38 y a los 8 y 19 días fueron tratados por vía hidrodinámica con los plásmidos: 1) pApo; 2) pmSushi-mIL15-mApo y 3) pApo-hIL15 en combinación con pSushi (pApo-hIL15 + pSushi). Se midieron los tumores en mm2 con un calibre digital cada 2-3 días. Se vió que los ratones a los que se les administró pmSushi-mIL15-mApo presentaron un retraso en el crecimiento de los tumores. Se muestra la media y el error estándar de un experimento representativo con 5-9 animales por grupo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han observado que, de forma sorprendente, la coadministración de una ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende IL15 fusionada a la proteína ApoA junto con el dominio sushi de la cadena α del receptor de IL15 (en adelante IL15 R-sushi) resulta en una actividad de IL15 superior a la observada cuando se administran conjuntamente IL15 e IL15 R-sushi. Dicha actividad superior es resultado no sólo de los mayores y más duraderos niveles circulantes de IL15 obtenidos tal y como se observa en el ejemplo 3 de la presente invención, sino en la capacidad de inducir la proliferación de células CTLL2 (ejemplo 4 de la presente invención), la capacidad de promover la proliferación de linfocitos T CD8 y CD8 memoria intraesplénicos, de linfocitos T CD8 intrahepáticos y de linfocitos T CD8 en sangre (ejemplo 5 de la presente invención) y en un mayor efecto antitumoral en dos modelos experimentales de tumores (ejemplo 7 de la presente invención) y en un efecto anti-metastático (ejemplo 8 de la presente invención).
Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que el efecto sinérgico resultante de la administración de IL15 en forma de proteína de fusión con ApoA resulta de la acción de IL15 en tejidos diana que expresan en su superficie receptores para ApoA, de forma que IL15 puede ejercer su efecto en tejidos distintos o complementarios a los que se pensaba hasta la fecha. Esta hipótesis se sustenta en que el efecto sinérgico se observa también en ratones delecionados para el gen del receptor α de IL15. Más sorprendente aún resulta la observación de que la administración de un ácido nucléico que codifica y permite la expresión de una proteína de fusión triple que comprende la proteína ApoAl fusionada a IL 15 y a IL15aR-sushi produce una proliferación de linfocitos CD8 y células NK muy superior a la que se obtiene con la administración de un ácido nucléico que codifica IL15, bien sea solo o combinado con otro que codifica IL15aR-sushi, o con un ácido nucléico que codifica la proteína de fusión de ApoAl con IL15, bien sea solo o combinado con otro que codifica IL15 R-sushi.
COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN
Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende, juntos o separados,
(i) un primer componente seleccionado del grupo de
(a) un polipéptido que comprende un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA y
(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA y
(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de
IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con IL15 y un polinucleótido que codifica IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70%) de identidad con IL1 y
(iii) un tercer componente seleccionado del grupo de
el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 y (a) un polinucleótido que codifica el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante f ncionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15.
El término "composición", según se usa en la presente invención, se refiere a una composición de materia que comprende los componentes indicados, es decir, el polipéptido Apo A, IL15 y el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 así como cualquier producto resultante, directa o indirectamente, de la combinación de los distintos componentes en cualquier cantidad de los mismos. El experto en la materia apreciará que la composición puede venir formulada como una única formulación o puede presentarse como formulaciones de cada uno de los componentes por separado que pueden combinarse para su uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes en donde cada uno de los componentes se formula y empaqueta de forma separada.
El término "proteína", usado aquí indistintamente con polipéptido, se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud en donde los distintos aminoácidos se encuentran unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o por puentes disulfuro.
El término "polinucleótido", según se usa en la presente invención, se refiere a un polímero formado por un número variable de monómeros en donde los monómeros son nucleótidos, incluyendo tanto ribonucleótidos como deoxiribonucleótidos. Los polinucleótidos incluyen monómeros modificados mediante metilación o así como formas no modificadas. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente invención e incluyen mRNA, cDNA y polinucleótidos recombinantes. Según se usa en la presente invención, los polinucleótidos no están limitados a polinucleótidos tal y como aparecen en la naturaleza, sino que incluye polinucleótidos en los que aparecen análogos de nucleótidos y enlaces internucleotídicos no naturales. Ejemplos no limitantes de este tipo de estructuras no naturales incluyen polinucleótidos en los que el azúcar es distinto a la ribosa, polinucleótidos en los que aparecen enlaces fosfodiester 3 '-5 ' y 2 '-5', polinucleótidos en los que aparecen enlaces invertidos (3 '-3 ' y 5 '-5 ') y estructuras ramificadas. Adicionalmente, los polinucleótidos de la invención incluyen enlaces internucleotídicos no naturales tales como péptidos ácidos nucleicos (PNA o peptide nucleic acids), ácidos nucleicos cerrados (LNA or locked nucleic acids), enlaces C1-C4 alquilfosfonato del tipo de metilfosfonato, fosforamidato, C1-C6 alquilfosfotrioester, fosforotioato y fosforoditioato. En cualquier caso, los polinucleótidos de la invención mantienen la capacidad de hibridar con ácidos nucleicos diana de forma similar a polinucleótidos naturales.
Primer componente de la composición de la invención
El primer componente de la invención se selecciona del grupo de un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente de la misma y un acido nucleico que codifica un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
El término "polipéptido ApoA", según se usa en la presente invención se refiere a cualquier miembro de la familia Apo A que forma parte de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y que es capaz de interaccionar de forma específica con receptores en la superficie de las células hepáticas garantizando de esta manera su capacidad de vehiculizar a este órgano las moléculas de interés acopladas a dicha proteína Apo A. Preferiblemente, las moléculas de Apo A que pueden ser utilizadas en la presente invención se seleccionan del grupo de ApoA-I, ApoA-II, ApoA-III, ApoA-IV y ApoA- V o de variantes funcionalmente equivalentes de las mismas.
En una forma preferida de realización, la proteína Apo A que se utiliza en la presente invención es la proteína ApoA-I. Por ApoA-I se entiende, en el contexto de la presente invención, la forma madura de la proteina pre-proApoA-I que forma parte de las lipoproteínas de alta densidad (HDL). La ApoA-I se sintetiza como un precursor (pre- proApoA-I) que contiene una secuencia señal de secreción que se elimina para dar lugar al precursor. La secuencia señal consta de 18 amino ácidos, el propéptido de 6 y la forma madura de la proteína de 243 amino ácidos. Preferiblemente se utiliza la forma madura de la proteína carente de péptido señal y procesada. En una forma preferida de realización, la proteína ApoA-I es de origen humano y su secuencia de amino ácidos es la mostrada en SEQ ID NO: l (número de acceso en UniProt P02647). En otra forma preferida de realización, la proteína ApoA-I es de origen murino, en particular de ratón, y su secuencia de amino ácidos es la mostrada en SEQ ID NO:2 (número de acceso en UniProt Q00623). En otra forma preferida de realización, la proteína ApoA-1 es de origen murino, en particular de rata, y su secuencia de amino ácidos es la mostrada en SEQ ID NO: 3 (número de acceso en UniProt P04639). Por "variante funcionalmente equivalente de ApoA-I" se entiende todas aquellos polipéptidos que resultan de la inserción, sustitución o deleción de uno o más amino ácidos de la secuencia de ApoA-I mencionada anteriormente y que mantienen sustancialmente intacta la capacidad de interaccionar con el denominado "scavenger receptor de clase B tipo I" (SR-BI) que forma el receptor de HDL presente en las células hepáticas. La capacidad de interaccionar con el receptor de HDL se determina esencialmente tal y como ha sido descrito por Monaco et al (EMBO J., 1987, 6:3253- 3260) bien mediante estudios de unión de ApoA-I a las membrana de hepatocitos o bien mediante la determinación de la capacidad de ApoA-I o de su variante de inhibir la unión de HDL a los receptores de las membranas de los hepatocitos. Preferiblemente, la constante de disociación de la unión de la variante de ApoA-I a las membranas de hepatocitos es de al menos 10"8 M, 10"7 M, 10"6 M, 10"5 M o 10"4 M.
Variantes de ApoA-I contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos un 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, ó 95% de similitud o identidad con los polipéptidos de ApoA-I. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410). Preferiblemente, las variantes de ApoA-I utilizadas en el contexto de la invención presentan una vida media en suero elevada con respecto a las ApoA-I mencionadas anteriormente, lo que permite alcanzar niveles de ApoA-I en suero superiores a los que se observan con ApoA-I. Métodos para determinar la vida media de una proteína en suero y, en particular de ApoA-I, son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, usando los métodos basados en mareajes metabólicos con proteínas marcadas descritos por Eisenberg, S. et al (J.Lipid Res., 1973, 14:446-458), por Blum et al. (J. Clin. Invest, 1977, 60:795-807) y por Graversen et al (J Cardiovasc Pharmacol., 2008, 51 : 170-177). Un ejemplo de dicha variantes que muestra una mayor vida media es, por ejemplo, la variante denominada Milano (que contiene la mutación R173C).
El primer componente de la invención puede ser un ácido nucleico que codifica al menos una de las ApoA y variantes de Apo A mencionadas anteriormente. Así, en el caso de que el ácido nucleico codifique ApoA, este puede ser de origen humano correspondiente a la secuencia con número de acceso X02162 en NCBI (SEQ ID NO:4), de origen murino correspondiente a la secuencia con número de acceso X64262 en NCBI (SEQ ID NO: 5), de rata correspondiente a la secuencia con número de acceso MOOOOlen NCBI (SEQ ID NO:6). El experto en la materia apreciará que el ácido nucleico que forma el primer componente de la invención debe de ser expresado en el interior de una célula y eventualmente secretado al medio, para lo cual, la secuencia que codifica ApoA o una variante funcionalmente equivalente de la misma puede presentar en un extremo 5 ' una secuencia que codifica una señal secretora. La expresión "secuencia señal secretora", según se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de amino ácidos que es capaz de promover el acceso a la vía secretora celular de todas aquellas proteínas que presentan dicha secuencia en su extremo N-terminal. Secuencias señal adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, entre otras, la secuencia señal de activador de plasminógeno tisular (tPA), de la hormona del crecimiento, GM-CSF y de las inmunoglobulina y, en particular, de IgK o de IgVx. Preferiblemente, la secuencia señal que forma parte del componente A de la invención es la propia secuencia señal de Apo A tal y como se definió anteriormente. Alternativamente, el primer componente de la invención puede ser un ácido nucleico que muestra una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%), al menos 85%, al menos 90%>, al menos 91%>, al menos 92%, al menos 93%>, la menos 94%>, al menos 95%, al menos 96%>, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%o de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina mediante el uso de un algoritmo del tipo GAP, BESTFIT o FASTA cuya implementación informática aparece en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7 (Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) y en el que se usan los algoritmos locales de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2:482), de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48: 443) o de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 1988, 85:2444) usando los valores por defecto para los distintos parámetros.
Alternativamente, el primer componente de la composición de la invención es un polinucleótido que codifica ApoA o una variante de la misma y que es capaz de hibridar específicamente con cualquiera de las secuencias correspondientes a ApoA nativas de distintos mamíferos definidas anteriormente. Por "polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con un polinucleótido diana" se entiende, en el contexto de la presente invención, aquellos polinucleótidos que son capaces de hibridar en condiciones estrictas, entendiéndose por condiciones estrictas, las condiciones que permiten la hibridación específica de dos ácidos nucleicos a temperaturas de en torno a 65°C por ejemplo, en una solución de 6 X SSC, SDS al 0,5%, solución de Denhardt al 5%y ADN no específico desnaturalizado a una concentración de 100 μ^ιηΐ cualquier otra solución con una fuerza iónica equivalente y tras una etapa de lavado a 65 °C en presencia de una solución de, por ejemplo SSC al 0,2% y SDS al 0.1% y cualquier otra solución con una fuerza iónica equivalente. No obstante, las condiciones estrictas pueden ser adaptadas por el experto en la materia en función del tamaño de la secuencia a ser hibridada, en función del contenido en GC y en función de otros parámetros. Métodos adecuados para la selección de las condiciones de hibridación adecuadas se han descrito por Sambrook y cois., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3r Edition, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Segundo componente de la composición de la invención
El segundo componente de la invención se selecciona del grupo de IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma y de un acido nucleico que codifica IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. El término "IL15" o "IL-15", según se usa en la presente invención, se refiere a una citoquina cuyo aislamiento, clonaje y secuencia se describe en Grabstein et al. (US5747024 y Grabstein et al, 1994, Science 246: 965-968). El término IL15 incluye cualquier forma polipeptídica con una secuencia de aminoácidos de una IL15 natural. Ejemplos de IL15 que pueden ser usados formando parte de las composiciones y proteínas de fusión de la presente invención incluyen, IL15 de roedores (ratón, rata, hámster), humana, primate, canina, felina, porcina, equina, bovina, ovina, y similares. Polipéptidos IL15 de mamíferos que pueden formar parte de las composiciones y proteínas de fusión de la invención incluyen, sin limitación, IL15 de origen humano y cuya secuencia de amino ácidos es la mostrada en P40933 (SEQ ID NO: 7); IL15 de ratón y cuya secuencia de aminoácidos es la mostrada en P48346 (SEQ ID NO: 8), IL15 de rata y cuya secuencia de aminoácidos es la mostrada en P97604 (SEQ ID NO:9), IL15 de gato y cuya secuencia de aminoácidos es la mostrada en 097687 (SEQ ID NO: 10) e IL15 bovina cuya secuencia de aminoácidos es la mostrada en Q28028 (SEQ ID NO: l l).
Por "variante funcionalmente equivalente de IL15" se entienden todas aquellos polipéptidos que resultan de la inserción, sustitución o deleción de uno o más amino ácidos de la secuencia de cualquiera de las secuencias de IL15 mencionada anteriormente y que mantienen sustancialmente intacta al menos una de las funciones de IL15, en donde dicha función se selecciona de:
la capacidad de promover la proliferación de células T CD8+ determinado, por ejemplo, mediante el método descrito por Montes, et al, (Clin. Exp. Immunol, 2005, 142:292-302) basado en la incubación de una población de células mononucleares de sangre periférica con un péptido antigénico en presencia de la variante de IL15 seguido de la determinación del porcentaje de células que pueden ser marcadas con anticuerpos específicos frente a CD8),
- la capacidad de promover la activación de células NK tras ser presentada en trans por las células dendríticas. Esta capacidad puede ser determinada mediante la medida de la incorporación de timidina tritiada por parte de las células NK CD56+ en presencia de IL15 o mediante la medida de la secreción por parte del las células NK de la citoquina GM-CSF. Métodos para determinar ambas funcionalidades de IL15 han sido descritos por Carson, W. et al. (J.Exp.med.,
1994, 180: 1395-1403), macrófagos y neutrófilos.
La capacidad de IL15 de inhibir la apoptosis mediada por Fas en células precursoras de células B, tal y como ha sido descrito por Demirci et al. (Cell Mol Immunol. 2004, 1 : 123-8.), que puede ser determinado usando técnicas estándar de determinación de apoptosis tales como TUNEL o la determinación de la fragmentación de ADN mediante electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio.
Variantes de IL15 contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos un 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, ó 95% de similitud o identidad con los polipéptidos de IL15 de mamíferos mencionados anteriormente. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410).
El segundo componente de la invención puede ser un ácido nucleico que codifica al menos una de las IL15 nativas y variantes de IL15 mencionadas anteriormente. Los ácidos nucleicos que codifican IL15 de mamíferos pueden ser recuperados de los repositorios de ácidos nucleicos e incluyen, sin limitación, polinucleótidos cuyas secuencias vienen definidas por los números de acceso U14407 (humana, SEQ ID NO: 12), U14332 (ratón, SEQ ID NO: 13), U69272 (rata, SEQ ID NO.14), AF108148 (gato, SEQ ID NO;15) y U42433 (bovina, SEQ ID NO: 16). Dichos polmucleótidos incluyen aquellos que muestran una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 75%>, al menos 80%>, al menos 85%>, al menos 90%>, al menos 91%o, al menos 92%>, al menos 93%>, la menos 94%>, al menos 95%>, al menos 96%>, al menos 97%>, al menos 98%> o al menos 99%> de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina mediante el uso de un algoritmo de entre los mencionados anteriormente.
Alternativamente, los polinucléotidos que forman el segundo componente de la invención son polinucléotidos capaces de hibridar de forma específica con los polmucleótidos definidos anteriormente. Métodos para determinar la capacidad de un polinucleótido de hibridar de forma específica con una secuencia diana se han descrito con detalle en el contexto del primer componente de la invención.
El experto en la materia apreciará que el ácido nucleico que forma el segundo componente de la invención puede encontrarse operativamente acoplado a una secuencia señal lo que permite la secreción al medio de la IL15 o de la variante funcionalmente equivalente. Secuencias señal adecuadas para su uso en la presente invención incluyen las mencionadas anteriormente en el contexto del primer componente de la composición de la invención. Preferiblemente, la secuencia señal que forma parte del segundo componente de la composición de la invención es la propia secuencia señal de IL15 tal y como se definió anteriormente o la secuencia señal de una las inmunoglobulina, en particular, de IgK o de IgVx.
Tercer componente de la composición de la invención El tercer componente de la invención se selecciona del grupo del dominio sushi de la cadena alpha del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo. La expresión "dominio sushi de la cadena alfa del receptor de IL15" (en adelante IL15Ra-sushi), según se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de amino ácidos que aparece en la región extracelular de la cadena alfa del receptor de IL15 y que corresponde a la secuencia que comienza con la primera cisterna que aparece en el primer exón del gen de la cadena alfa del receptor de IL15 y que concluye con la cisteína codificada por el exón 4 del gen de la cadena alfa del receptor de IL15. Alternativamente, el dominio sushi se define como la secuencia que comienza en el primer resto de cisteína de la cadena alfa del receptor de IL15 tras la secuencia señal y que concluye con el cuarto resto de cisteína tras la secuencia señal en dicha secuencia. Dominios sushi adecuados para su uso en la presente invención incluyen el dominio sushi que procede de la cadena alfa del receptor de IL15 de origen humano, correspondiente a la secuencia con número de acceso NP 002180 en UniProt y cuyo dominio Sushi corresponde a la secuencia
CPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKC (SEQ ID NO: 17) y el dominio sushi que procede de la cadena alfa del receptor de IL15 de ratón correspondiente a la secuencia con número de acceso Q60819 en Swiss-Prot y cuyo dominio Sushi corresponde a la secuencia
CPPPV SIEHADIRVK NYSVNSRERY VCNSGFKRKA GTSTLIECVI NKNTNVAHWT TPSLKC (SEQ ID NO: 18);
Por "variante funcionalmente equivalente del dominio sushi de la cadena alfa del receptor de IL15" se entienden todos aquellos polipéptidos que resultan de la inserción, sustitución o deleción de uno o más amino ácidos de la secuencia de cualquiera de las secuencias de los dominios sushi de origen humano o murino mencionadas anteriormente y que mantienen sustancialmente intacta la capacidad de unirse a IL15 y de incrementar el efecto proliferativo de IL15 en células que expresan el receptor de IL15 de baja afinidad (por ejemplo, células de la líneas Mo-7e o 32ϋβ) tal y como ha sido descrito por Mortier et al. (J.Biol.Chem., 2006, 281 : 1612-1619).
Variantes de IL15Ra-sushi contempladas en el contexto de la presente invención incluyen polipéptidos que muestran al menos un 70%, 72%>, 74%>, 76%>, 78%>, 80%>, 90%o, ó 95%o de similitud o identidad con los polipéptidos mencionados anteriormente. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410).
El tercer componente de la invención puede ser un ácido nucleico que codifica al menos un dominio sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 nativas y variantes del mismo mencionadas anteriormente. Los ácidos nucleicos que codifican IL15Ra-sushi de mamíferos pueden ser recuperados a partir de las secuencias de las cadenas alfa correspondientes que se encuentran en los repositorios de ácidos nucleicos e incluyen, sin limitación, las secuencias que codifican IL15Ra-sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 humano (números de acceso en NCBI corresponden a U31628, SEQ ID NO: 19) y de ratón (número de acceso en NCBI: U22339, SEQ ID NO:20).
Dichos polinucleótidos incluyen aquellos que muestran una identidad de secuencia de al menos al menos 70%>, al menos 75%>, al menos 80%, al menos 85%>, al menos 90%>, al menos 91 %>, al menos 92%>, al menos 93%>, la menos 94%>, al menos 95%>, al menos 96%o, al menos 97%>, al menos 98%> o al menos 99%> de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente en donde el porcentaje de identidad se determina mediante el uso de un algoritmo de entre los mencionados anteriormente. Alternativamente, los polinucléotidos que forman el tercer componente de la invención son polinucleótidos capaces de hibridar de forma específica con los polinucleótidos definidos anteriormente. Métodos para determinar la capacidad de un polinucleótido de hibridar de forma específica con una secuencia diana se han descrito con detalle en el contexto del primer componente de la invención.
El experto en la materia apreciará que el ácido nucleico que forma el segundo componente de la invención puede encontrarse operativamente acoplado a una secuencia señal lo que permite la secreción al medio del dominio sushi o de su variante funcionalmente equivalente. Secuencias señal adecuadas para su uso en la presente invención incluyen las mencionadas anteriormente en el contexto del primer componente de la composición de la invención. Preferiblemente, la secuencia señal que forma parte del segundo componente de la composición de la invención es la propia secuencia señal de la cadena alfa del receptor de IL15 tal y como se definió anteriormente o la secuencia señal de una las inmunoglobulina, en particular, de IgK o de IgV%. En una forma preferida de realización, el tercer componente de las composiciones de la invención es un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia identificada como SEQ ID NO: 21 y que codifica un polipéptido que comprende el dominio Sushi del receptor IL 15RA humano, precedido de su propio péptido señal (SEQ ID NO: 22).
Las composiciones de la invención pueden estar formadas por polipéptidos o polinucleótidos procedentes de distintas especies. No obstante, en una realización preferida los tres componentes se originan de una misma especie animal. En una forma preferida de realización, los tres componentes son de origen humano. En otra forma preferida de realización, los tres componentes son de origen murino.
Composiciones en las que el primer y el segundo componente forman una única molécula Los autores de la presente invención han observado que es posible obtener el efecto sinérgico sobre la actividad antitumoral de IL15 cuando el primer y el segundo componente de la composición de la invención forman parte de una única molécula. En este caso, las composiciones de la invención son composiciones binarias formadas por un primer componente que a su vez comprende el primer y segundo componente definidos anteriormente, y un segundo componente, que se corresponde al tercer componente definido anteriormente. El experto en la materia apreciará que si el primer y segundo componentes de la composición son polipéptidos, dicha única molécula es una proteína de fusión que comprende (i) un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente de la misma y (ii) IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. El término "proteína de fusión", según se usa en la presente invención, se refiere a polipéptidos que comprenden dos o más regiones que proceden de proteínas distintas o heterólogas.
Alternativamente, en el caso de que tanto el primer como el segundo componentes de la composición sean polinucleótidos, dicha única molécula es un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende (i) un polipéptido que comprende un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo y (ii) IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. En este caso, cuando el primer y segundo componente son de naturaleza peptídica, la invención contempla composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición N terminal con respecto al segundo componente y composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición C terminal con respecto al segundo componente.
En el caso de que el primer y segundo componente sean de naturaleza polinucleotídica, la invención contempla composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición 5' con respecto al segundo componente y composiciones en las que el primer componente se encuentra en posición 3' con respecto al segundo componente.
En ambos casos, es posible que el primer y segundo componente estén asociados directamente, esto es, que el extremo C-terminal del primer componente se encuentre asociado al extremo N-terminal del segundo componente o que el extremo C-terminal del segundo componente se encuentra asociado al extremo N-terminal del primer componente o que el extremo 3 ' del primer componente se encuentra asociado al extremo 5 ' del segundo componente y composiciones en las que el extremo 3 ' del segundo componente se encuentra asociado al extremo 5' del primer componente.
Alternativamente, en otro aspecto, la invención contempla composiciones en las que la fusión del primer y del segundo componente se lleva a cabo a través de un enlazador peptídico (en el caso de que el primer y segundo componente son de naturaleza polipeptídica) o de una secuencia que codifica un enlazador peptídico (en el caso de que el primer y segundo componente sean de naturaleza polinucleotídica).
El término "enlazador peptídico", "enlazador", "conector", "espaciador" o sus equivalentes gramaticales, según se usa en la presente invención, se refiere a una molécula que conecta dos moléculas y que frecuentemente permite que las moléculas conectadas adquieran una configuración funcional. El péptido enlazador preferiblemente comprende al menos dos aminoácidos al menos tres aminoácidos, al menos cinco aminoácidos, al menos diez aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, al menos 40 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos.
Enlazadores adecuados para su uso en la presente invención incluyen:
- Enlazadores que comprenden 2 aminoácidos o más seleccionados del grupo que consiste en glicina, serina, alanina y treonina tales como, sin limitación, los enlazadores de secuencia SGGTSGSTSGTGST (SEQ ID NO:23), AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO:24), GGSGGAP (SEQ ID NO:25) y GGGVEGGG (SEQ ID NO: 26) descritos por Muller, K.M. et al. ((Methods. Enzimology, 2000, 328: 261-281).
- Enlazadores basados en los residuos 53-56 de la tetranectina, que en la tetranectina forma una lámina β, y los residuos 57-59 que forman un giro en la tetranectina (Nielsen, B.B. et al, FEBS Lett. 412: 388-396, 1997) tales como el enlazador de secuencia GTKVHMK (SEQ ID NO:27),
Enlazadores basados en una subsecuencia de la lámina de conexión 3 de la fibronectina humana, correspondiente a los aminoácidos 1992-2102 tales como el enlazador PGTSGQQPSVGQQ (SEQ ID NO: 28) correspondiente a los aminoácidos número 2037-2049, y dentro de esa subsecuencia el fragmento GTSGQ (SEQ ID NO: 29) correspondiente a los residuos de aminoácidos 2038- 2042 es más preferible.
- Enlazador basado en la secuencia de 10 residuos de aminoácidos de la región bisagra superior de la IgG3 murina tales como el enlazador de secuencia
PKPSTPPGSS (SEQ ID NO: 30) que ha sido usado para la producción de anticuerpos dimerizados mediante una hélice enrollada (Pack P. y Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31 : 1579-1584),
- El péptido enlazador de secuencia APAETKAEPMT (SEQ ID NO: 31)
- El péptido enlazador de secuencia GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO:32)
- El péptido enlazador de secuencia GAP.
Alternativamente, los dos componentes de los conjugados de la invención pueden estar conectados por un péptido cuya secuencia contiene una diana de corte para una proteasa, permitiendo de esta manera la separación de ApoA-I del componente (ii) Los sitios de corte de proteasas adecuados para su incorporación en los polipéptidos de la invención incluyen enteroquinasa (sitio de corte DDDDK SEQ ID NO:33), factor Xa (sitio de corte IEDGR, SEQ ID NO:34), trombina (sitio de corte LVPRGS, SEQ ID NO:35), proteasa TEV (sitio de corte ENLYFQG, SEQ ID NO :36), proteasa PreScission (sitio de corte LEVLFQGP, SEQ ID NO:37), internas y similares. En una forma preferida de realización., el sitio de corte es el de una proteasa que se expresa en tejidos tumorales, en tejidos inflamados o en hígado de forma que la separación de Apo A y del componente (ii) tenga lugar una vez que el conjugado ha llegado al hígado. En una forma preferida de realización, el enlazador contiene un sitio de reconocimiento de la metaloproteasa de matriz 9 (sitio de corte LFPTS, SEQ ID NO:38). Aunque la invención se ha ejemplificado con composiciones en las que tanto el componente resultante de la fusión de primer y segundo componente (la proteína de fusión de Apo A con IL15) como el tercer componente (el dominio Sushi de la cadena α del receptor de IL15) se emplean en forma de ácido nucleico, la invención no está limitada a composiciones en las que ambos componentes sean ácidos nucleicos sino que contempla, alternativamente, composiciones en las que el primer y/o el segundo componente son polipéptidos. Así, la invención contempla composiciones formadas por:
- Un polipéptido que comprende una proteína de fusión formada por Apo A e IL 15 y un polipéptido que comprende el dominio sushi de la cadena α del receptor de IL15.
- Un polipéptido que comprende una proteína de fusión formada por Apo A e IL15 y un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende el dominio sushi de la cadena α del receptor de IL15.
- Un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una proteína de fusión formada por Apo A e IL15 y un polipéptido que comprende el dominio sushi de la cadena α del receptor de IL15.
- Un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una proteína de fusión formada por Apo A e IL 15 y un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende el dominio sushi de la cadena α del receptor de IL15.
La relación entre los componentes que forman parte de las composiciones de la invención dependerá del agente inductor de primer y segundo componente usado en cada caso en particular, así como de la indicación deseada. Así, la invención contempla composiciones en los que la relación entre las cantidades de los dos componentes puede oscilar entre 50: 1 y 1 :50, en particular entre 20: 1 y 1 :20, entre 1 : 10 y 10: 1, ó entre 5: 1 y 1 :5.
En el caso de las composiciones en las que el primer y segundo componente formen una única molécula, cada uno de los componentes puede proceder de una especie distinta, aunque se prefiere que los componentes que forman una única molécula procedan de la misma especie. Así, en una forma preferida de realización, Apo A o la variante funcionalmente equivalente de la misma es de origen humano e IL15 o la variante funcionalmente equivalente de la misma es de origen humano. En otra forma preferida de realización, Apo A o la variante funcionalmente equivalente de la misma es de origen murino e IL15 o la variante funcionalmente equivalente de la misma es de origen murino.
En una forma preferida de realización, la molécula única que forma el primer componente de la composición está formada por el polipéptido ApoAI de origen humano e IL15 de origen humano, separados por un enlazador que presenta la secuencia GAP. El polinucleótido que codifica dicha fusión presenta una secuencia identificada en la presente invención como SEQ.ID.NO: 39.
En otra forma preferida de realización, la molécula única que forma el primer componente de la composición está formada por el polipéptido ApoAI de origen murino e IL15 de origen humano, separados por un enlazador que presenta la secuencia GAP. El polinucleótido que codifica dicha fusión presenta una secuencia identificada en la presente invención como SEQ.ID.NO: 40.
En otra forma preferida de realización, la molécula única que forma el primer componente de la composición está formada por el polipéptido ApoAI de origen murino e IL15 de origen murino, separados por un enlazador que presenta la secuencia GAP. El polinucleótido que codifica dicha fusión presenta una secuencia identificada en la presente invención como SEQ.ID.NO: 41. El polipéptido que comprende el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o la variante funcionalmente equivalente del mismo puede ser de origen humano o de origen murino. No obstante, si los componentes que forman la molécula única son ambos de origen humano, se prefiere que el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o la variante funcionalmente equivalente del mismo sea también de origen humano. Alternativamente, si los componentes que forman la molécula única son ambos de origen murino, se prefiere que el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o la variante funcionalmente equivalente del mismo sea también de origen murino.
En otro aspecto, la invención contempla una proteína de fusión que comprende ApoA o una variante funcionalmente equivalente del mismo e IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo. Los términos "ApoA" , "IL15" , "variante funcionalmente equivalente de ApoA", "variante funcionalmente equivalente de IL15" han sido explicados en detalle con anterioridad y se emplean esencialmente de la misma manera en el caso de las proteínas de fusión.
Las proteínas de fusión pueden presentar el polipéptido ApoA en posición N-terminal con respecto a IL-15 o el polipéptido IL-15 en posición N-terminal con respecto a Apo A. Asimismo, ambos componentes pueden encontrarse unidos directamente o a través de un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores mencionados en la presente invención. Asimismo, los componentes pueden ser de origen humano o murino, de forma que la invención contempla fusiones de ApoA e IL15 de origen humano, fusiones de ApoA el IL15 de origen murino y fusiones de ApoA e IL15 en donde ApoA es de origen humano e IL15 es de origen murino y fusiones de ApoA e IL15 en donde ApoA es de origen murino e IL15 de origen humano.
En formas preferidas de realización, las proteínas de fusión de Apo A e IL 15 corresponden a los polipéptidos con secuencia SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41. PROTEÍNA DE FUSIÓN DE LA INVENCIÓN
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende
(i) una región A formada por un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA, (ii) una región B formada por IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70% de identidad con IL15 y
(iii) una región C formada por el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL 15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15. La región A de la proteína de fusión coincide esencialmente con el primer componente de las composiciones de la invención por lo que ha sido descrito en detalle anteriormente.
La región B de la proteína de fusión coincide esencialmente con el segundo componente de las composiciones de la invención por lo que ha sido descrito en detalle anteriormente.
La región C de la proteína de fusión coincide esencialmente con el tercer componente de las composiciones de la invención por lo que ha sido descrito en detalle anteriormente.
El experto en la materia apreciará que la proteína de fusión de la invención puede presentar distintos ordenamientos de las regiones A, B y C . Así, la invención contempla:
- una proteína de fusión en la que la región A se encuentra en posición N-terminal, la región B se encuentra en posición central y la región C se encuentra en posición C-terminal,
- una proteína de fusión en la que la región A se encuentra en posición N-terminal, la región C en posición central y la región B en posición C-terminal,
- una proteína de fusión en la que la región B se encuentra en posición N-terminal, la región A se encuentra en posición central y la región C se encuentra en posición C-terminal, - una proteína de fusión en la que la región B se encuentra en posición N-terminal, la región C se encuentra en posición central y la región A se encuentra en posición C-terminal,
una proteína de fusión en la que la región C se encuentra en posición N- terminal, la región A se encuentra en posición central y la región B se encuentra en posición C-terminal y
- una proteína de fusión en la que la región C se encuentra en posición N-terminal, la región B se encuentra en posición central y la región A se encuentra en posición C-terminal.
Asimismo, las regiones A, B y/o C pueden encontrarse asociadas directamente, esto es, en donde el aminoácido C-terminal de una región se encuentra unido a través de un enlace peptídico con el aminoácido N-terminal de otra región. Alternativamente, las distintas regiones se encuentra unidas entre si a través de un enlazador peptídico. Enlazadores adecuados para la proteína de fusión de la invención son esencialmente los mismos que se usan en la composición de la invención y han sido descritos en detalle anteriormente. El experto en la materia apreciará que la proteína de fusión puede contener uno o dos enlazadores peptídicos dependiendo de si únicamente dos de las tres regiones se encuentran asociadas entre sí a través de un enlazador o si las tres regiones se encuentran asociadas a través de enlazadores.
En una forma preferida de realización, la proteína de fusión presenta un ordenamiento del tipo C-B-A, es decir, comprende, en sentido N- a C terminal, el dominio Sushi de IL15Ra (región C), IL15 (región B) y ApoAI (región A). En una forma de realización aún más preferida, las regiones C y B se encuentran separadas por un enlazador del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO:32). En otra forma de realización, las regiones B y A se encuentran separadas por un enlazador del tipo GAP. En una forma de realización aún más preferida, las regiones C y B se encuentran separadas por un enlazador del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO:32) y las regiones B y A se encuentran separadas por un enlazador del tipo GAP. Aunque las proteínas de fusión de la invención se ejemplifican con proteínas de fusión en las que las regiones A, B y C son de origen murino, el experto en la materia apreciará que la invención contempla proteínas de fusión en donde cada una de las regiones A, B y C puede ser de un origen distinto de entre las distintas variantes de las regiones mencionadas anteriormente.
Así, en una forma preferida de realización, la proteína de fusión comprende una región A de origen humano o de origen murino, una región B de origen humano o de origen murino una región C de origen humano o de origen murino. En una forma aún más preferida, las tres regiones proceden del mismo organismo. Así, en una forma aún más preferida, las regiones A, B y C son de origen murino, En otra forma de realización preferida, las regiones A, B y C son de origen humano.
En una forma preferida de realización, la proteína de fusión presenta un ordenamiento del tipo C-B-A en donde los tres componentes son de origen humano y en donde tanto las regiones C y B como las regiones B y A se encuentran conectadas por enlazadores peptídicos. En una forma preferida de realización, la proteína de fusión comprende, en sentido N- a C- terminal, el dominio sushi de IL15Ra humano (región C), IL15 humana (región B) y ApoAI humano (región A). En una forma de realización aún más preferida, las re giones C y B s e encuentran s ep aradas por un enlazador del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ. En otra forma de realización, las regiones B y A se encuentran separadas por un enlazador del tipo GAP. En una forma de realización aún más preferida, las regiones C y B se encuentran separadas por un enlazador del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ y las regiones B y A se encuentran separadas por un enlazador del tipo GAP. En una forma preferida de realización, la proteína de fusión comprende la secuencia definida por SEQ ID NO:42.
En otra forma preferida de realización, la proteína de fusión comprende, en sentido N- a C terminal, el dominio sushi de IL15Ra murino (región C), IL15 murino (región B) y ApoAI murino (región A). En una forma de realización aún más preferida, las regiones C y B se encuentran separadas por un enlazador del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ. En otra forma de realización, las regiones B y A se encuentran separadas por un enlazador del tipo GAP. En una forma de realización aún más preferida, las regiones C y B se encuentran separadas por un enlazador del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ y las regiones B y A se encuentran separadas por un enlazador del tipo GAP. En una forma preferida de realización, la proteína de fusión comprende la secuencia definida por SEQ ID NO:43.
POLINUCLEÓTIDOS, CONSTRUCCIONES GÉNICAS, VECTORES Y CÉLULAS HOSPED ADORAS DE LA INVENCIÓN En otro aspecto, la invención contempla un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención. Dado que la proteína de fusión de la invención ejerce su función desde el medio extracelular, es conveniente que el polinucleótido codifique una fusión de la proteína de fusión de la invención con una secuencia señal que permita el acceso de la proteína de fusión a la ruta secretora y la secreción al medio de la proteína de fusión. Secuencias señal adecuadas para su uso junto con la proteína de fusión incluyen tanto la secuencia señal de cualquiera de los componentes de la proteína de fusión (la secuencia señal de Apo A, la secuencia seña de IL15 o la secuencia señal de la cadena α del receptor de IL15) o cualquiera de las secuencias señal mencionadas anteriormente en el contexto del primer componente de la composición de la invención, es decir, secuencias señal adecuadas del activador de plasminógeno tisular (tPA), de la hormona del crecimiento, de GM-CSF y de las inmunoglobulinas y, en particular, las secuencias señal de IgK o de IgVx.
En una forma preferida de realización, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia identificada como SEQ.ID.NO. 44 que codifica una proteína de fusión o conjugado que comprende el dominio Sushi de origen humano, IL15 de origen humano y ApoAl de origen humano, en donde el dominio Sushi e IL15 se encuentran separados por un enlazador de secuencia GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ, en donde IL15 y ApoAl se encuentran separados por un enlazador de secuencia GAP y en donde la fusión va precedida por la secuencia señal de la cadena alpha del receptor de IL-15 de origen humano. En una forma preferida de realización, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia identificada como SEQ.ID.NO. 45 que codifica una proteína de fusión o conjugado que comprende el dominio Sushi de origen murino, IL15 de origen murino y ApoAl de origen murino, en donde el dominio Sushi e IL15 se encuentran separados por un enlazador de secuencia GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ, en donde IL 15 y ApoAl se encuentran separados por un enlazador de secuencia GAP y en donde la fusión va precedida por la secuencia señal de la cadena alpha del receptor de IL-15 de origen murino. El polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención puede encontrarse operativamente asociado a una región reguladora de la expresión dando lugar así a una construcción génica. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende un polinucleótido de la invención. Preferiblemente, la construcción comprende el polinucleótido de la invención situado bajo el control operativo de secuencias que regulan la expresión del polinucleótido de la invención. El experto en la materia apreciará que los polinucléotidos de la invención deben acceder al núcleo de un tejido diana y allí transcribirse y traducirse para dar lugar a la proteína de fusión biológicamente activa. En principio, cualquier promotor puede ser utilizado para las construcciones génicas de la presente invención siempre que dicho promotor sea compatible con las células en las que se desea expresar el polinucleótido. Así, promotores adecuados para la realización de la presente invención incluyen, sin estar necesariamente limitados, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la inmuno globuina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen EF-1 alpha así como promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o de una señal exógena, tales como el sistema tetraciclina, el sistema NFKB/IUZ UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico , los promotores regulables de la ARN polimerasa II descritos en WO/2006/135436 así como promotores específicos de tejido.
Las polinucleótidos de la invención o las construcciones génicas que las constituyen pueden estar formando parte de un vector. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende un polinucleótido o una construcción génica de la invención. El experto en la materia apreciará que no existe limitación en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado ya que dicho vector puede ser un vector de clonaj e adecuado para la propagación y para obtener los polinucleótidos o construcciones génicas adecuadas o vectores de expresión en distintos organismos heterólogos adecuados para la purificación de los conjugados. Así, vectores adecuados de acuerdo a la presente invención incluyen vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, fagos y vectores "shuttle" tales como pSA3 and pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 mieras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores bien basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y lentivirus) así como vectores no virales tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1 , pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER- HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl.
El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrook et al, 2001, citado supra).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende un polinucleótido, una construcción génica o un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con una construcción o vector proporcionado por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook et al., 2001, citado supra). En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula animal transfectada o infectada con un vector apropiado.
Células huésped adecuadas para la expresión de los conjugados de la invención incluyen, sin estar limitado, células de mamíferos, plantas, insectos, de hongos y de bacterias. Células bacterianas incluyen, sin estar limitado, células de bacterias Gram positivas tales como especies del género Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus y células de bacterias Gram negativas tales como células del género Escherichia y Pseudomonas. Células de hongos incluyen, preferiblemente, células de levaduras tales como Saccharomyces, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. Células de insectos incluyen, sin limitación, células de Drosophila y células Sf9. Células de plantas incluyen, entre otros, células de plantas de cultivos tales como cereales, plantas medicinales, ornamentales o de bulbos. Células de mamíferos adecuadas para la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales (porcinas, etc.), líneas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), células gliales (murinas, etc.), líneas celulares hepáticas (de mono, etc.). células CHO (Chínese Hámster Ovary), células COS, células BHK, células HeLa, 91 1 , AT I 080, A549, 293 o PER.C6, células ECCs humana NTERA-2, células D3 de la línea de mESCs, células troncales embrionarias humanas tales como HS293 y BGVOl, SHEFl, SHEF2 y HS181, células NIH3T3, 293T, REH y MCF-7 y células hMSCs. MÉTODOS IN VITRO DE LA INVENCIÓN
Se ha descrito la capacidad de IL15 de promover la proliferación de linfocitos T sensibilizados por un antígeno. Así, se ha demostrado que la puesta en contacto de una población de linfocitos aislados previamente expuestos a un determinado antígeno con IL15 resulta en un aumento en la proliferación de los linfocitos. Esta población expandida de linfocitos puede ser utilizada en una inmunoterapia adoptiva para lo cual es posteriormente re-administrada al paciente del que se han obtenido dicha población inicial. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para promover la expansión de linfocitos T específicos de un antígeno que comprende poner en contacto una población de linfocitos previamente expuestos a dicho antígeno con una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una construcción génica de la invención o una célula huésped de la invención.
La expresión "expansión" se usa en la presente invención indistintamente con proliferación y debe ser entendida como división celular o crecimiento celular. La expansión puede ser determinada usando métodos ampliamente conocidos como, por ejemplo, los métodos descritos en Transplantation (1999) 67: 605-613.
La expresión "linfocitos T específicos de un antígeno", según se usa en la presente invención, se refiere a una población de linfocitos que es capaz de reconocer a un determinado antígeno. Típicamente, los linfocitos son aislados de un paciente que ha sido expuesto a dicho antígeno. Alternativamente, el antígeno puede ser puesto en contacto con la población de linfocitos en un sistema artificial de presentación antigénica tal y como ha sido descrito en las patentes estadounidenses US6828150 o US6787154.
El término "antígeno", según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier sustancia que es capaz de desencadenar una respuesta inmune en un sujeto que no es tolerante a dicho antígeno. El antígeno puede proceder del propio sujeto, en cuyo caso se trata de un autoantígeno, o puede ser un aloantígeno, es decir, un antígeno derivado de un individuo de la misma especie. Alternativamente, el antígeno puede ser un xenoantígeno, es decir, un antígeno derivado de un individuo de una especie diferente.
Los linfocitos que pueden ser usados en el método de la presente invención incluyen, sin limitación los linfocitos T citotóxicos (CTL), las células T helper, células activadas por linfoquinas, linfocitos que infiltran el tumor (TILS), las células NK, las células naive, las células de memoria, las células de gammadeltaT, las células NKT así como poblaciones celulares que comprenden cantidades variables de una o más de las células mencionadas anteriormente. En una forma preferida de realización, los linfocitos son CTL. Métodos adecuados para la obtención de CTLs para su posterior expansión in vitro usando el método de la invención son ampliamente conocidos para un experto en la materia e incluyen, sin limitación, el aislamiento a partir de sangre periférica, a partir de la sangre del cordón umbilical, a partir de tejidos que contiene linfocitos. En una forma preferida de realización, los linfocitos se aislan mediante drenaje de ganglios linfáticos en pacientes que sufren una determinada enfermedad.
Una vez que se han aislado los linfocitos, estos son puestos en contacto con una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, una construcción génica de la invención o una célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para que se produzca la expansión de los linfocitos. Las condiciones generales para la expansión de CTL específicos de antígeno pueden ser establecidas de acuerdo a método conocidos [por ejemplo, Cárter J. et al. , Inmunología, 57 ( 1 ), 123-129, (1996)] y pueden ser optimizadas de forma rutinaria por el experto en la materia. Típicamente, la puesta en contacto de los linfocitos con la composición, la proteína de fusión, el polinucleótido, el vector, la construcción génica o la célula huésped de la invención se lleva a cabo mediante el cultivo de los linfocitos en un medio adecuado para dichas células. Las células pueden ser cultivadas bajo condiciones convencionales en cualquier medio adecuado para hacer crecer linfocitos que incluyen un Medio Esencial Mínimo o Medio RPMI 1640. Con el fin de promover el crecimiento de las células, se pueden agregar factores necesarios para la proliferación y la viabilidad de éstos incluyendo suero, por ejemplo, suero de becerro fetal o suero humano y antibióticos, por ejemplo, penicilina, estreptomicina. Los linfocitos se mantienen bajo condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura apropiada de alrededor de 37°C y una atmósfera, por ejemplo, aire más 5% de C02. En una forma preferida de realización, los linfocitos pueden ser tratados previamente a la estimulación con los compuestos de la invención para promover su activación in vitro, para lo cual los linfocitos se ponen en contacto con el antígeno frente al que son específicos. Esto es particularmente necesario en el caso de pacientes con tumores que producen sustancias inmunosupresoras. Para ello, es necesario estimular el cultivo de linfocito con el antígeno adecuado. Típicamente, el antígeno es presentado a la célula T de tal forma que la señal es disparada en la célula T a través del complejo TCR/CD3. Preferiblemente, el antígeno se puede presentar a la célula T mediante una célula que presenta antígeno. La expresión "célula presentadora de antígeno", según se usa en la presente invención, se refiere a una célula que contribuye a la generación de la respuesta inmune mediante la presentación de antígeno a los linfocitos T. Las células presentadoras de antígeno incluyen células dendríticas, fagocitos mononucleares, linfocitos B o células de Langerhans. Las células presentadoras de antígeno pueden ser aisladas, por ejemplo, de la médula ósea, de la sangre, del timo, de la epidermis, del hígado o del hígado fetal.
En el caso de que el antígeno sea un antígeno tumoral, es posible usar un extracto de tumor autológo y/o un antígeno de tumor recombinante. En el caso de un antígeno procedente de un patógeno, la activación de los linfocitos previa a su expansión se puede llevar a cabo usando una célula infectada con un patógeno, por ejemplo un virus que presenta antígenos del patógeno.
En el método para la expansión de CTL específicos de antígeno de la presente invención, es preferible que el tratamiento de las células con las composiciones, proteínas de fusión de la invención sea llevado a cabo en presencia de un anticuerpo anti-CD3 y, preferiblemente, con un anticuerpo anti-CD3 monoclonal humano, y más preferentemente con OKT3. La concentración de los anticuerpos anti-CD3 durante el proceso de expansión no es especialmente limitado, y es, por ejemplo, 0,001 a 100 mg/mL, y más preferentemente 0,01 a 100 mg/mL. Adicional o alternativamente, las células pueden ser más co-cultivadas con un anticuerpo anti-CD28 , y más preferiblemente con un anticuerpo anti-CD28 monoclonal humano. Adicional o alternativamente, las células se pueden co-cultivar con un factor estimulante de los linfocitos, como una lectina. Además, uno o más estos componentes se puede inmovilizar a una fase sólida.
Además, en el método para la expansión de CTLs antígeno-específicos de la presente invención, las células pueden ser co-cultivadas con células alimentadoras de acuerdo con las circunstancias. En principio, no existe limitación en cuanto al tipo de células alimentadoras que pueden ser usadas siempre y cuando dichas células alimentadoras cooperen con la proteína o composición de la invención o con los agentes mencionados en el párrafo anterior en la capacidad de promover la proliferación de CTLs. Preferiblemente, células alimentadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células EBV-B autólogas o no autólogas. Normalmente, las células de alimentación son tratadas una vez que se han utilizado para eliminar su capacidad de proliferación, preferiblemente mediante tratamiento con rayos X o con agentes citotóxicos como la mitomicina. La actividad citotóxica de la población de linfocitos obtenida mediante el método de la invención puede ser determinada usando métodos conocidos. Por ejemplo, es posible determinar la capacidad de los linfocitos de provocar la lisis de una célula diana marcada y determinar la liberación del material marcado. Alternativamente, la actividad citotóxica puede ser determinada mediante la determinación del nivel de citoquinas (por ejemplo, GM-CSF e IFN-γ) producidas por los linfocitos o por la célula diana. Alternativamente, la actividad citotóxica puede ser determinada mediante la puesta en contacto de los linfocitos con un anticuerpo específico de linfocitos citotóxicos marcados con una primera molécula fluorescente y con un complejo formado por el péptido antigénico y el complejo mayor de histocompatibilidad marcado con una segunda molécula fluorescente seguido de la detección de células marcadas con ambas moléculas mediante citometría de flujo. Las poblaciones de linfocitos expandidas de acuerdo a los métodos de la presente invención son particularmente útiles para su uso en inmunoterapia adoptiva, es decir, para la re-administración a sujetos que requieren una mayor respuesta inmune frente a un determinado antígeno. Preferiblemente, los linfocitos T se usan de forma autóloga, es decir, se re-administran al sujeto del que fueron extraídos originalmente.
COMPOSICIONES FARMACEUTICAS DE LA INVENCIÓN
Las composiciones, polinucleótidos y proteínas de fusión de la invención resultan de utilidad para el tratamiento de enfermedades que requieren una dosis prolongada de IL15. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una preparación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición, una proteína de fusión, un polinucleótido, una construcción génica, un vector o una célula hospedadora de acuerdo a la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas y proteínas. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (por ejemplo comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, sólidos estériles cristalinos o amorfos que pueden reconstituirse para proporcionar formas líquidas etc.), líquida (por ejemplo soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, lociones, ungüentos etc.) o semisólida (geles, pomadas, cremas y similares). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993 y en Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20a edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000) Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos en el estado de la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales conocidos en el estado de la técnica.
Alternativamente, las composiciones y compuestos de la invención pueden formularse como nanolipopatículas en aquellos casos en la composición comprende una proteína ApoA o una fusión de ApoA y un segundo componente (IL15 o dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15) o en aquellos casos en los que la invención contempla una proteína fusión que comprende Apo A, IL15 y el dominio sushi de IL15RA). La formación de nanolipopárticula se basa que ApoA es el componente mayoritario de las lipoproteñinas de alta densidad (HDL).
En el contexto de la presente invención, el término "nanolipopárticula" es equivalente a los términos "lipoproteína" o "partícula de lipoproteína" y pueden emplearse indistintamente. Por nanolipopárticula se entiende cualquier partícula hidrosoluble, formada por un núcleo de lípidos apolares (tales como colesterol esterificado y triglicéridos) cubiertos con una capa externa polar formada por apoproteínas, fosfolípidos y colesterol libre.
Las nanolipopartículas o lipoproteínas se clasifican en función de su densidad en quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDs), lipoproteínas de densidad intermedia (IDLs), lipoproteínas de baja densidad (LDLs) y lipoproteínas de alta densidad (HDLs). Las diferentes características de las lipoproteínas se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Densidad Diámetro % % % %
Clase
(g/mL) (nm) proteína colesterol fosfolípido triacilglicerol
>1.063 HDL 5-15 33 30 29 8
1.019-1.063 LDL 18-28 25 50 21 4 1.006-1.019 IDL 25-50 18 29 22 31
0.95-1.006 VLDL 30-80 10 22 18 50
<0.95 quilomicrones 100-1000 <2 8 7 84
En una realización más particular, la nanolipopartícula es una lipoproteína de tipo HDL caracterizada por presentar una composición como la indicada en la tabla anterior y porque, las apolipopro teínas que forman la fracción proteica son la Apo A, Apo C, Apo D y Apo E.
Las nanolipopartículas pueden obtenerse mediante métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. A modo ilustrativo, las nanolipopartículas pueden obtenerse in vitro mediante la adición de colesterol y fosfatidilcolina a la proteína de fusión tal como se describe en Lerch et al. (Vox Sang, 1996, 71 : 155-164) o in vivo mediante el empleo de un animal no-humano que expresa en el hígado el conjugado de la invención dando lugar a la formación de nanolipopartículas que son secretadas al suero, de donde pueden ser aisladas. En el caso de que la composición farmacéutica de la invención comprenda ácidos nucleicos (los polinucleótidos de la invención, los vectores o las construcciones génicas), la invención contempla composiciones farmacéuticas especialmente preparadas para la administración de dichos ácidos nucleicos. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender dichos ácidos nucleicos en forma desnuda, es decir, en ausencia de compuestos que protejan a los ácidos nucleicos de su degradación por las nucleasas del organismo, lo que conlleva la ventaja de que se elimina la toxicidad asociada a los reactivos usados para la transfección. Rutas de administración adecuadas para los compuestos desnudos incluyen intravascular, intratumoral, intracraneal, intraperitoneal, intraesplénica, intramuscular, subretinal, subcutánea, mucosa, tópica y oral (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21 :857-867). Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden administrarse formando parte de liposomas, conjugadas a colesterol o conjugados a compuestos capaces de promover la translocación a través de membranas celulares tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HIV-1, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D.melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex, oligómeros de arginina y péptidos tales como los descritos en WO07069090 (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21 :99- 103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21 :45-48, Lundberg, M et al, 2003, Mol. Therapy 8: 143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21 :389-393). Alternativamente, el polinucléotido puede administrarse formando parte de un vector plasmídico o de un vector viral, preferiblemente vectores basados en adenovirus, en virus adenoasociados o en retrovirus, tales como virus basados en el virus de la leucemia murina (MLV) o en lentivirus (HIV, FIV, EIAV).
En otra forma de realización, las composiciones, proteínas de fusión y polinucleótidos de la invención se administran mediante la llamada "administración hidrodinámica" según ha sido descrito por Liu, F., et al., (Gene Ther, 1999, 6: 1258-66). Según dicho método, los compuestos se introducen en el organismo por vía intravascular a alta velocidad y volumen, lo que resulta en unos elevados niveles de transfección con una distribución más difusa. Se ha demostrado que la eficacia del acceso intracelular depende de forma directa del volumen de fluido administrado y de la velocidad de la inyección (Liu et al, 1999, Science, 305: 1437-1441). En ratones, la administración se ha optimizado en valores de lml/10 g de peso corporal en un periodo de 3-5 segundos (Hodges et al, 2003, Exp.Opin.Biol.Ther, 3 :91-918). El mecanismo exacto que permite la transfección celular in vivo con polinucleótidos tras su administración hidrodinámica no es del todo conocido. En el caso de ratones, se piensa que la administración por la vena de la cola tiene lugar a un ritmo que excede el ritmo cardiaco, lo que provoca que el fluido administrado se acumule en la vena cava superior. Este fluido accede posteriormente a los vasos en los órganos y, posteriormente, a través de fenestraciones en dichos vasos, accede al espacio extravascular. De esta forma, el polinucléotido entra en contacto con las células del órgano diana antes de que se mezcle con la sangre reduciendo así las posibilidades de degradación por nucleasas. Las composiciones de la invención pueden ser administradas en dosis de menos de 10 mg por kilogramo de peso corporal, preferiblemente menos de 5, 2, 1, 0,5, 0,1 , 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ó 0,00001 mg por cada kg de peso corporal y menos de 200 nmol de agente, es decir, en torno a 4.4 x 1016 copias por kg de peso corporal o menos de 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15 ó 0,075 nmol por Kg de peso corporal. La dosis unitaria se puede administrar por inyección, por inhalación o por administración tópica. Las composiciones y polinucleótidos bif ncionales de la invención pueden ser administradas directamente en el órgano en el que se exprese el AR m diana en cuyo caso se administran dosis de entre 0,00001 mg a 3 mg por órgano, o preferiblemente entre 0,0001 y 0,001 mg por órgano, en torno a 0,03 y 3,0 mg por órgano, en torno a 0, 1 y 3,0 mg por órgano o entre 0,3 y 3,0 mg por órgano.
La dosis depende de la severidad y respuesta de la condición a tratar y puede variar entre varios días y varios meses o hasta que se observe que la condición remite. La dosificación óptima se puede determinar realizando mediciones periódicas de las concentraciones de agente en el organismo del paciente. La dosis óptima se puede determinar a partir de los valores de EC50 obtenidos mediante ensayos previos in vitro o in vivo en modelos animales. La dosis unitaria se puede administrar una vez al día o menos de una vez al día, preferiblemente, menos de una vez cada 2, 4, 8 o 30 días. Alternativamente, es posible administrar una dosis inicial seguida de una o varias dosis de mantenimiento, generalmente de menos cantidad que la dosis inicial. El régimen de mantenimiento puede implicar tratar al paciente con dosis que oscilan entre 0,01 μg y 1,4 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo, 1, 0,1, 0,01, 0,001, o 0,00001 mg por kg de peso corporal por día. Las do sis de mantenimiento se administran, preferiblemente, como mucho una vez cada 5, 10 ó 30 días. El tratamiento se debe continuar durante un tiempo que variará según el tipo de alteración que sufra el paciente, su severidad y el estado del paciente. Tras el tratamiento, se debe monitorizar la evolución del paciente para determinar si se debe incrementar la dosis en caso de que la enfermedad no responda al tratamiento o si se debe disminuir la dosis en caso de observar una mejora de la enfermedad o efectos secundarios indeseados. La dosis diaria se puede administrar en una única dosis o en dos o más dosis según las circunstancias particulares. Si se desea una administración repetida o administraciones frecuentes, es aconsejable la implantación de un dispositivo de administración tal como una bomba, un catéter semipermanente (intravenoso, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un reservorio.
USOS TERAPEUTICOS DE LAS COMPOSICIONES Y PROTEINAS DE FUSION DE LA INVENCIÓN
En un aspecto adicional, la invención se refiere también a las composiciones, proteínas de fusión y polinucleótidos de la invención para su uso en medicina. Las composiciones de la invención son capaces de promover la proliferación de linfocitos CD8 intraesplénicos, hepáticos y de sangre periférica in vivo (véase ejemplo 5 de la invención), presentan efecto antitumoral en distintos modelos de adenocarcinoma colorectal (véase ejemplos 6 y 7) y muestran efecto antimetastásico (veánse ejemplo 8). Estos efectos junto con las evidencias de la capacidad de IL15 de promover la actividad de células NK permiten el uso de los compuestos y composiciones de la invención en el tratamiento de pacientes que puedan beneficiarse de una estimulación de la respuesta inmune innata (mediada por células NK) o adaptativa (mediada por linfocitos CD8).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector o una construcción génica de la invención, o una célula huésped de la invención para su uso en la estimulación de la respuesta inmune de un sujeto.
Preferiblemente, la composición de la invención, la proteína de fusión de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector o la construcción génica de la invención, o la célula huésped de la invención se usan para el tratamiento de enfermedad que requiera una activación del sistema inmune en respuesta a un antígeno.
Alternativamente, la invención se relaciona con el uso de una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector o una construcción génica de la invención, o una célula huésped de la invención para la preparación de un medicamento para la estimulación de la respuesta inmune de un sujeto a un antígeno o para el tratamiento de enfermedad que requiera una activación del sistema inmune.
Alternativamente, la invención se relaciona con un método para promover la estimulación de la respuesta inmune de un sujeto a un antígeno o para el tratamiento de una enfermedad que requiera una activación del sistema inmune que comprende la administración a dicho sujeto de una composición de la invención, una proteína de fusión de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector o una construcción génica de la invención, o una célula huésped de la invención.
La expresión "estimulación de la respuesta inmune de un sujeto", según se usa en la presente invención, se refiere a la iniciación de una respuesta inmune contra un antígeno determinado en un individuo en donde dicha respuesta tiene lugar por primera vez como la reactivación de la respuesta inmune en sujetos en donde dicha respuesta inmune ya ha tenido lugar. Se entiende que la respuesta inmune puede implicar tanto una respuesta inmune innata como adaptativa, y puede implicar una respuesta de tipo humoral como celular.
Por tanto, la capacidad de los compuestos y composiciones de la invención de aumentar la respuesta inmune de un sujeto a un determinado antígeno puede ser de utilidad para el tratamiento de enfermedades asociadas a la presencia de dicho antígeno en el organismo, lo que incluye enfermedades causadas por infecciones virales si se trata de un antígeno viral, enfermedades causadas por infecciones bacterianas si se trata de un antígeno bacteriano, enfermedades causadas por infecciones fúngicas si se trata de un antígeno fúngico, alergias si se trata de un alérgeno, enfermedades causadas por una infestación parasitaria si se trata de un antígeno parasitario y/o un tumor si se trata de un antígeno específico de células tumorales. Por tanto, en formas preferidas de realización, la enfermedad que requiere una activación del sistema inmune se selecciona del grupo de una enfermedad infecciosa y una enfermedad neoplásica.
Enfermedades causadas por infecciones virales que pueden ser tratadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, sin limitación, enfermedades causadas por la infecciones por el virus VIH-1 (SIDA), por el herpesvirus humanos tales como el virus del herpes simple (herpes simple, herpes genital), citomegalovirus (mononucleosis, retitinis, hepatitis), el virus de Epstein Barr (mononucleosis infecciosa, el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo) y el virus de la varicela zóster (varicela, herpes zóster); por los virus de la hepatitis tales como virus de la hepatitis B o virus de la hepatitis C, por paramixovirus tales como virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza virus de la rubéola, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humano; flavivirus tales como el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue, el virus de la encefalitis transmitido por garrapatas o el virus de la encefalitis japonesa) y rotavirus. Otro tipo de infecciones virales que pueden ser tratadas con los compuestos y combinaciones de la presente invención se describen en detalle en Fundamental Virology, segunda edición, eds. Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, Nueva York, 1991). Enfermedades causadas por infecciones bacterianas que pueden ser tratadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, sin limitación, enfermedades causadas por microorganismos del género Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, histeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Heamophilus o Bordetella.
Enfermedades causadas por infecciones fúngicas que pueden ser tratadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, sin limitación, candidiasis, aspergilosis, histoplasmosis, meningitis criptocócica y similares.
Infestaciones parasitaras que pueden ser tratadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, sin limitación, paludismo, infección por Pneumocystis jiroveci, neumonía, enfermedad del sueño, leishmaniosis, criptosporidiosis, toxoplasmosis y tripanosoma. Trastornos de tipo alérgico que pueden ser tratados con los compuestos y composiciones de la invención incluyen, sin limitación, alergias causadas por exposición al polen (alérgenos del polen de árboles, hierba, maleza y césped), alergias causadas por exposición a alérgenos de insectos (alérgenos inhalables, de la saliva y del veneno), a alérgenos de la caspa y del pelo de animales y a alérgenos de la comida.
Los conjugados y composiciones de la invención también son adecuados para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas. La expresión "enfermedad proliferativa", según se usa en la presente invención, se refiere a enfermedades que están causadas o resultan de niveles inapropiadamente altos de división celular, de niveles inapropiadamente bajos de apoptosis o de ambos e incluye tanto tumores primarios como metástasis. El término "tumor primario" se refiere a un tumor que se encuentra en el sitio primario en el que se originó dicho tumor. El término "metástasis", según se usa en la presente invención, se refiere al proceso por el que un tumor se extiende a tejidos del organismo distintos al sitio primario de origen del tumor.
En el contexto de la invención, se entiende por "tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa" o "tratamiento de un tumor" la administración de los compuestos y composiciones de la invención para prevenir o retrasar la aparición de síntomas, complicaciones o indicaciones bioquímicas del cáncer o tumor, para aliviar sus síntomas o para detener o inhibir su desarrollo y progresión tal como, por ejemplo, la aparición de metástasis. El tratamiento puede ser un tratamiento profiláctico para retrasar la aparición de la enfermedad o para prevenir la manifestación de sus síntomas clínicos o subclínicos o un tratamiento terapéutico para eliminar o aliviar los síntomas después de la manifestación de la enfermedad o en relación con su tratamiento quirúrgico o con radioterapia.
El cáncer que va a tratarse en el contexto de la presente invención puede ser cualquier tipo de cáncer o tumor. Estos tumores o cáncer incluyen, y no se limitan a, neoplasias ubicadas en colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenales, paratiroideas, hipófisis, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax y aparato genitourinario y, más particularmente, leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal, cáncer hepatocelular en adultos (primario), cáncer de hígado en adultos (primario), leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia mieloide aguda en adultos, enfermedad de Hodgkin en adultos, linfoma de Hodgkin en adultos, leucemia linfocítica en adultos, linfoma no de Hodgkin en adultos, cáncer de hígado en adultos primario, sarcoma del tejido blando en adultos, linfoma relacionado con el SIDA, tumores malignos relacionados con el SIDA, cáncer de ano, astrocitoma, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, glioma del tallo cerebral, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de la pelvis renal y uréter, linfoma del sistema nervioso central (primario), linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer hepatocelular infantil (primario), cáncer de hígado infantil (primario), leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda infantil, glioma del tallo cerebral infantil, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, tumores de células germinales extracraneales infantiles, enfermedad de Hodgkin infantil, linfoma de Hodgkin infantil, glioma de la vía óptica y e hipotalámico infantil, leucemia linfoblástica infantil, meduloblastoma infantil, linfoma no de Hodgkin infantil, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineales infantiles, cáncer de hígado primario infantil, rabdomio sarcoma infantil, sarcoma del tejido blando infantil, glioma hipotalámico y de la vía óptica infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, linfoma de células T cutáneo, carcinoma de células de los islotes del páncreas endocrino, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer epitelial, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing y tumores relacionados, cáncer de páncreas exocrino, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragodanales, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo, cáncer de mama en la mujer, enfermedad de Gaucher, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores gastrointestinales, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, hipergammaglobulinemia, cáncer hipofaríngeo, cánceres intestinales, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, cáncer pancreático de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de laringe, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, trastornos linfoproliferativos, macroglobulinemia, cáncer de mama en el hombre, mesotelioma maligno, timoma maligno, meduloblastoma, melanoma, mesotelioma, cáncer metastásico escamoso de cuello con primario oculto, cáncer metastásico escamoso de cuello primario, cáncer metastásico escamoso de cuello, mieloma múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndrome mielodisplásico, leucemia mielógena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin durante el embarazo, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer metastásico escamoso de cuello con primario oculto, cáncer bucofaríngeo, osteosarcoma-Z fibroso maligno, osteosarcoma-W histiocitoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de bajo potencial maligno de ovario, cáncer pancreático, paraproteinemias, púrpura, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, feocromocitoma, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, linfoma del sistema nervioso central primario, cáncer de hígado primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivares, sarcoidosis, sarcomas, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma del tejido blando, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago, tumores pineales y neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular, timoma, cáncer tiroideo, cáncer de la pelvis renal y uréter de células de transición, cáncer de pelvis renal y uréter de transición, tumores trofoblásticos, cáncer de células de uréter y pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma de útero, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de la vía óptica, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, ubicada en un sistema de órgano enumerado anteriormente. COMPOSICIONES VACUNALES DE LA INVECCIÓN
Los compuestos y composiciones de la invención son útiles también como adyuvantes en vacunas para aumentar la respuesta de un paciente a un antígeno. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición vacunal que comprende un antígeno y una composición, una proteína de fusión, un polinucleótido, una construcción génica, un vector o una célula hospedadora de acuerdo a la invención
El término "vacuna" o "composición vacunal", según se usa en la presente invención, se refiere a una composición que comprende al menos un antígeno de interés y que permite activar la respuesta inmune de un sujeto a dicho antígeno. El objetivo de las vacunas es activar la inmunidad tanto mediada por células como por anticuerpos. Preferiblemente, la inmunidad mediada por células incluye la estimulación de una respuesta de células T, principalmente, una respuesta mediada por CD4+, y/o una respuesta de las células T CD8+.
El término "adyuvante", según se usa en la presente invención, se refiere a un agente inmunológico que es capaz de activar el sistema inmune permitiendo obtener una respuesta inmune de mayor intensidad y más eficiente a una vacuna que la que se obtendría como resultado de administrar la vacuna sin adyuvante. Respuestas adyuvantes típicas incluyen, sin limitación, la activación, proliferación y/o diferenciación de células del sistema inmune (células B, células T, células dendríticas, células presentadoras de antígeno, macrófagos, células NK), aumento o disminución en la expresión de marcadores y citoquinas, estimulación de los títulos de IgA, IgM y/o IgG, esplenomegaila (aumento de la celularidad esplénica), hiperplasia, formación de infiltrados en distintos órganos y otro tipo de respuestas que pueden ser cuantificadas por el experto en la materia usando tecnología estándar.
Así, las vacunas que pueden ser usadas en combinación con las combinaciones y compuestos de la invención incluyen vacunas que presentan uno o más antígenos seleccionados del grupo de un antígeno viral, un antígenos bacteriano, un antígeno fúngico, un alérgeno o un antígeno medioambiental y un antígeno tumoral. Antígenos virales adecuados para su uso en vacunas que pueden ser usadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen antígenos del VIH-1, (tales como tat, nef, gp l 20 o gp l 60, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), virus del herpes humanos, (tales como gH, gL gM gB gC gK gE o gD o derivados de los mismos) o proteína temprana inmediata tales como ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 de VHS1 o VHS2, citomegalo virus, especialmente humano, (tales como gB o derivados de los mismos), virus de Epstein Barr (tales como gp350 o derivados de los mismos), virus de la varicela zóster (tales como gpl, II, 111 y IE63), o de un virus de la hepatitis tales como virus de la hepatitis B (por ejemplo antígeno de superficie de la hepatitis B o antígeno de núcleo de la hepatitis), virus de la hepatitis C (por ejemplo antígenos de núcleo, El, NS3 o NS5), de paramixovirus tales como virus respiratorio sincitial (tales como proteínas F y G o derivados de las mismas), de virus parainfluenza, de virus de la rubéola (tales como proteínas El y E2), virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humanos (por ejemplo HPV6, 11, 16, 18, eg LI, L2, El, E2, E3, E4, E5, E6, E7), flavivirus (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o células infectadas con virus influenza, tales como proteínas HA, NP, NA o M, o combinaciones de las mismas), antígenos de rotavirus (tales como VP7sc y otros componentes de rotavirus), y similares (véase Fundamental Virology, segunda edición, eds. Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, Nueva York, 1991 ) para ejemplos adicionales de antígenos virales).
Antígenos bacterianos o derivados adecuados para su uso en vacunas que pueden ser usadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen antígenos de
Neisseria spp, incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis (proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión a lactoferrina, PilC y adhesinas); antígenos de S. pyogenes (tales como proteínas M o fragmentos de las mismas y proteasa C5A); antígenos de S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M catarrhalis, también conocido como Branhamella catarrhalis (tales como adhesinas e invasinas de alto y de bajo peso molecular); antígenos de Bordetella spp, incluyendo B. pertussis (por ejemplo Parapertussis y B. bronchiseptica (tal como pertactina, toxina de la tosferina o derivados de los mismos, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias); antígenos de Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuber culo sis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; (por ejemplo ESAT6, antígeno 85 A, -B o -C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSPIO, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, PPD de 19kDa [Rv3763], PPD de 38kDa [Rv0934]); antígenos de Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina termolábil o derivados de la misma, toxina termoestable o derivados de la misma), antígenos de E. coli enterohemorrágica y E. coli enteropatógena (por ejemplo toxina similar a la toxina Shiga o derivados de la misma); antígenos de Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la misma); antígenos de Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo una proteína Yop); antígenos de Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C.jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas); antígenos de Salmonella spp, incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; histeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolizante); antígenos de Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E.faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina tetánica y derivado de la misma); antígenos de C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivado de la misma), antígenos de C. difficile (por ejemplo toxinas del clostridium A o B y derivados de las mismas); antígenos de Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina del ántrax y derivados de la misma); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina diftérica y derivados de la misma); antígenos de Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB); antígenos de B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), antígenos de B. andersonfi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), antígenos de B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la ehrlichiosis granulocítica humana; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina); antígenos de Chlamydia pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), antígenos de C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas de la membrana exterior poco comunes), antígenos de T. denticola, T. hyodysenteriae; antígenos de Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp. y T. gondii (por ejemplo SAG2, SAGS, Tg34); antígenos de Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; leishmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, Antígenos de o derivados de levaduras tales como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans; antígenos de M. tuberculosis (tales como Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rvl884c, Rv2389c, Rv2450, Rvl009, aceA (Rv0467), PstSl , (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c de 16 kDal, Tb Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1 , Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC l); antígenos de Chlamydia (tales como la proteína de alto peso molecular (HWMP), ORF3 (documento EP 366 412) y posibles proteínas de membrana (Pmp); antígenos de Streptococcus spp, incluyendo S. pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina, el antígeno proteico neumolisina, y derivados detoxificados mutantes de los mismos); antígenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo); antígenos de H. influenzae no clasificable (tales como OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y peptidos derivados de fimbrina, o variantes de múltiples copias o las proteínas de fusión de las mismas); antígenos derivados de Plasmodium falciparum (tales como RTS.S, TRAP, MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PffiXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp.)
Antígenos fúngicos adecuados para su uso en vacunas que pueden ser usadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, componentes de antígeno fúngico de Candida; antígenos fúngicos de Histoplasma tales como proteína de choque térmico 60 (HSP60) y otros componentes de antígeno fúngico de Histoplasma; antígenos fúngicos de criptococos tales como polisacáridos capsulares y otros componentes de antígeno fúngico de criptococos; antígenos fúngicos de coccidios tales como antígenos de esférula y otros componentes de antígeno fúngico de coccidios; y antígenos fúngicos de Tinea tales como tricofitina y otros componentes de antígeno fúngico de coccidios.
Antígenos protozoarios adecuados para su uso en vacunas que pueden ser usadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, antígenos de Plasmodium falciparum tales como antígenos de superficie de merozoitos, antígenos de superficie de esporozoitos, antígenos de circumsporozoitos, antígenos de superficie de gametocitos/gametos, antígeno de estadio en sangre pf, 55/RESA y otros componentes de antígenos de plasmoides; antígenos de Toxoplasma tales como SAG-I, p30 y otros componentes de antígeno de Toxoplasma; antígenos de esquistosoma tales como glutatión-S-transferasa, paramiosina y otros componentes de antígeno de esquistosoma; el antígeno de Leishmannia y otros antígenos de Leishmania tales como gp63, lipofosfoglicano y su proteína asociada y otros componentes de antígeno de Leishmania; y antígenos de Trypanosoma cruzi tales como el antígeno de 75-77 kDa, el antígeno de 56 kDa y otros componentes de antígeno de Trypanosoma.
Alérgenos o antígenos medioambientales adecuados para su uso en vacunas que pueden ser usadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a un antígeno derivado de alérgenos que se producen de manera natural tales como alérgenos del polen (alérgenos del polen de árboles, hierba, maleza y césped), alérgenos de insectos (alérgenos inhalables, de la saliva y del veneno), alérgenos de la caspa y el pelo de animales, y alérgenos de la comida. Alérgenos del polen importantes de árboles, césped y hierbas se originan a partir de órdenes taxonómicos de Fágales, Oléales, Piñales y Platanaceae incluyendo entre otros abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano (Platanus), el orden de Poales incluyendo entre otros céspedes de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales incluyendo entre otros hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros antígenos alergénicos que pueden utilizarse incluyen alérgenos de ácaros del polvo doméstico de los géneros Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento por ejemplo Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, los de cucarachas, mosquillas y pulgas por ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, los de mamíferos tales como gato, perro y caballo, pájaros, alérgenos de veneno incluyendo los que se originan de picaduras o mordeduras de insectos tales como los del orden taxonómico de Hymenoptera incluyendo abejas (superfamilia Apidae), avispas y hormigas (superfamilia Formicoidaé). Todavía otros antígenos alergénicos que pueden utilizarse incluyen alérgenos por inhalación de hongos tales como de los géneros Alternaría y Cladosporium. Antígenos tumorales adecuados para su uso en vacunas que pueden ser usadas con los compuestos y combinaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a MAGE, MART-l/Melan-A, gp l OO, dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno asociado colorrectal (CRC)- 0017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos antigénicos CAP- 1 y CAP-2, etv6, amll, antígeno específico de la próstata (PSA) y sus epítopos antigénicos PSA-1 , PSA-2, y PSA-3, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), receptor de células T/cadena CD3- , familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, M AGE-A 10, MAGE-A11 , MAGE-A12, MAGE- Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteína, E- cadherina, α-catenina, 13-catenina, γ-catenina, pl20ctn, gplOOPmel 117, PRAME, NY- ESO-1 , cdc27, proteína de poliposis adenomatosa del colon (APC), fodrina, Conexina 37, idiotipo Ig, pl 5, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, P IA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-l , glucógeno fosforilasa del cerebro, SSX-1 , SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c- erbB-2, leucemia linfoblástica aguda (etv6, amll, ciclofilina b), linfoma de células B (idiotipo Ig), glioma (E-cadherina, a-catenina, 13-catenina, 7-catenina, pl20ctn), cáncer de vejiga (p21ras), cáncer biliar (p21ras), cáncer de mama (familia MUC, HER2/neu, c- erbB-2), carcinoma de cuello uterino (p53, p21ras), carcinoma de colon (p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, familia MUC), cáncer colorrectal (antígeno asociado colorrectal (CRC)-0017-1A/GA733, APC), corio carcinoma (CEA), cáncer de células epiteliales (ciclofilina b), cáncer gástrico (HER2/neu, c-erbB-2, glucoproteína ga733), cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkins (lmp-1, EBNA-1 ), cáncer de pulmón (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b), melanoma (proteína p 15, gp75, antígeno oncofetal, gangliósidos GM2 y GD2, Melan-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gplOOPmel 117), mieloma (familia MUC, p21ras), carcinoma de pulmón de células no pequeñas (HER2/neu, c-erbB-2), cáncer nasofaríngeo (lmp-1, EBNA-1), cáncer de ovarios (familia MUC, HER2/neu, c-erbB-2), cáncer de próstata (antígeno específico de la próstata (PSA) y sus epítopos antigénicos PSA-1 , PSA-2 y PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, glucoproteína ga733), cáncer renal (HER2/neu, c- erbB-2), cánceres de células escamosas del cuello uterino y del esófago (productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano), cáncer de testículos (NY- ESO-1) y leucemia de células T (epítopos del VLTH-1).
Los componentes de las composiciones de la invención, en concreto, la fusión de Apo A e IL15 o el polinucleótido que codifica dicha fusión y el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o el ácido nucleico que codifica dicho dominio pueden presentarse como una única formulación (por ejemplo, como un comprimido o cápsula que comprende una cantidad fija de cada uno de los componentes) o, por el contrario, puede presentarse como formulaciones separadas para posteriormente combinarlos para su administración conjunta, secuencial o separada. Las composiciones de la invención también contemplan la formulación como un kit-de-partes en donde los componentes se formulan separadamente pero se empaquetan en un mismo contenedor.
El experto en la materia apreciará que la formulación del primer y segundo componente de las composiciones de la invención pueden ser similares, es decir, formulados de manera semejante (por ejemplo, en comprimidos o en tabletas), lo que permite su administración por la misma vía. En una realización en la que los distintos componentes de la invención se formulan separadamente, los dos componentes se pueden presentar en blíster. Cada blíster contiene los medicamentes que tienen que ser consumidos a lo largo de un día. Si los medicamentos tienen que ser administrados varias veces al día, se pueden disponer los medicamentes correspondientes a cada administración en distintas secciones del blíster, preferiblemente anotando en cada sección del blíster el momento del día en el que deben ser administrados. Alternativamente, los componentes de la composición de la invención pueden ser formulados de forma distinta de manera que los distintos componentes se administren de forma distinta. Así, es posible, por ejemplo, que el primer componente se formule como comprimido o cápsula para su administración oral y que el segundo componente se formule para su administración intravenosa.
Las composiciones de la invención se administran mediante los métodos conocidos para un experto en la materia, incluyendo, sin limitación, intravenosa, oral, nasal, parenteral, tópica, transdérmica, rectal y similares.
La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos que tienen un carácter meramente ilustrativo y no limitativo del ámbito de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Origen y construcción de los plásmidos 1.1 Extracción de RNA
El RNA total de hígado de ratón fue aislado de muestras individuales usando TRI reagent (Sigma, Madrid, España). La concentración y pureza de las muestras fue determinada por la absorbancia a 260 y 280nm con corrección de fondo a 320nm en espectro fotómetro (Biophotometer, Eppendorf).
1.2 RT-PCR síntesis de cDNA total
El RNA total (3μg) fue tratado con DNasa I y retrotranscrito a cDNA con M-MLV RT en la presencia de RNase OUT (todos los reactivos de Invitrogen, Carfsbed, CA). Se obtuvieron 25 μΐ de cDNA total de hígado. La reacción fue incubada 1 h a 37°C, desnaturalizada 1 min a 95°C y llevada a 4°C. Las muestras fueron usadas inmediatamente para PCR o almacenadas a -20°C.
1.3 Clonaje de cDNA de la Apolipoproteína A-I murina (mApoAl) y obtención del plásmido pCMV-mApoAl pCMV-mApoAl (pApo), comprende una secuencia SEQ.ID.NO. 1 que codifica un polipéptido que comprende la apolipoproteína A-I (Apoal) murina precedida por su propio péptido señal, y que está operativamente unida al promotor del citomegalovirus; Se diseñó el cebador sentido FwATGmApoAl : 5 ' - ATGAAAGCTGTGGTGCTGGC-3 ' (SEQ.ID.NO. 46),
y el cebador antisentido RvTGAmApoAl : 5 '-TCACTGGGCAGTCAGAGTCT-3 ' (SEQ.ID.NO. 47) . Se amplificó el cDNA de mApoAl (795 nucleótidos totales, 72 nucleótidos codificantes para el péptido señal y 723 nucleótidos codificantes para la proteína nativa) mediante PCR sobre el cDNA total de hígado, usando BioTaq DNA polimerase (Bioline, Londres, Reino Unido): 5 min 94°C, 30 ciclos de 40 seg a 94°C, 40 seg a 55°C y 40 seg a 72°C, seguido de 7 min a 72°C en termociclador 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). El producto de PCR fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El cDNA purificado de mApoAl fue clonado, siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante, en el vector de expresión pcDA¾™3.1/V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Carfsbed, CA), que denominaremos pCMV-mApoAl o también pApo. Finalmente, se confirmó la secuencia obtenida mediante secuenciación.
1.4 Clonaj e de Interleuquina 15 humana (hIL15) y obtención del plásmido pCMV-hIL15 pCMV-hIL15 (phIL15), comprende una secuencia SEQ.ID.NO. 2 que codifica un polipéptido que comprende la IL15 humana precedida por el péptido señal de la cadena IgVx, y que está operativamente unida al promotor del citomegalovirus;
Se diseñó el cebador sentido FwAscIhIL15:
5 -AATAATGGCGCGCCGAACTGGATAGATG-3 ' (SEQ.ID.NO. 48),
que introduce la secuencia de 9 nucleótidos (GGCGCGCCC) que constituye un sitio de restricción para la enzima AscI en 5';
y el cebador antisentido RvNotIhIL15:
5 '-GTTCATCAACACGTCCTGAGCGGCCGC-3 ' (SEQ.ID.NO. 49),
que introduce la secuencia de 8 nucleótidos (GCGGCCGC) que constituye un sitio de restricción para la enzima Notl en 5 ' .
Se amplificó el cDNA de hIL15 (345 nucleótidos totales) mediante PCR sobre el plásmido de expresión pVkL/IL-15IRESneo (Meazza et al. Eur. J. Immunol. 1997; 27: 1049-1054). Este plásmido contiene la secuencia codificante de la IL15 madura humana precedida de la cadena IgVx, bajo el control del promotor del citomegalovirus. Se usará el término pCMV-hIL5 o phIL15 para referirse a él. La PCR se realizó usando EasyA high fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene, Cedar Creek,TX, EEUU). Las condiciones de amplificación fueron: 2 min 95°C, 30 ciclos de 40 seg a 95 °C , 30 seg a 57°C y 45 seg a 72°C , seguido de 7 min a 72°C en termociclador 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems Foster City, EE.UU.). El producto de PCR fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El cDNA purificado de hIL15 fue clonado, siguiendo las instrucciones provistas, en el vector de expresión pTrcHis2 TOPO® TA (Invitrogen, Carfsbed, CA), que denominaremos pTrcHis2-hIL 15. Finalmente, se confirmó la secuencia obtenida mediante secuenciación.
1.5 Construcción del plásmido pCMV-Apo-hIL15 (pApo-hIL15) que codifica la fusión génica de mApoAl y hIL15 pCMV-Apo-hIL15 (pApo-hIL15), comprende una secuencia SEQ.ID.NO. 40, que codifica una proteína de fusión que comprende la apolipoproteína A-I murina, unida a la IL15 humana mediante un enlazador GAP (linker), y que está operativamente unida al promotor del citomegalo virus; y Se diseñó el cebador antisentido RvAscImApoAl :
5'-GGCGCGCCCTGGGCAGTCAGAGTCTCGC-3' (SEQ.ID.NO.50),
que introduce la secuencia de 9 nucleótidos (GGCGCGCCC) que constituye un sitio de restricción para la enzima AscI en 3 ' del gen ApoA l y elimina el codón de terminación. Esta secuencia de restricción añadida se traducirá en un péptido de unión corto GAP, que dará cierta movilidad a las proteínas constituyentes.
Se amplificó por PCR, usando como molde el pCMV-mApoAl (ver ejemplo 1.3), y los cebadores FwATGmApoA l y RvAscImApoAl , con la enzima BioTaq DNA polimerase (Bioline, Londres, Reino Unido), 5 min 94°C, 30 ciclos de 40 seg a 94°C, 40 seg a 57°C y 40 seg a 72°C, seguido de 7 min a 72°C en termociclador 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems Foster City, EE.UU.). El producto de PCR (804 nucleótidos) fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El DNA purificado de mApoAl-AscI fue clonado, siguiendo las instrucciones provistas, en el vector de expresión pcDNA™3.1/V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Carfsbed, CA), que denominaremos pCMV-mApoAl-AscI. Finalmente, se confirmó la secuencia obtenida mediante secuenciación.
Paralelamente usando como molde el pTrcHis2-hIL 15 (ver ejemplo 1.4) se digirió 50 min a 37°C con la enzima AscI y Buffer 4 (New England Biolabs). El producto de digestión fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El DNA purificado AscI-hIL15- pTrcHis2 fue seguidamente digerido 50 min a 37°C con la enzima Notl, lxBSA y Buffer 3 (New England Biolabs). El producto de digestión fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA), obteniendo el DNA purificado AscI-hIL15-NotI (345 nucleótidos).
Para realizar la fusión génica el plásmido pCMV-mApoAl-AscI se digirió 50 min a 37°C con la enzima AscI y Buffer 4 (New England Biolabs). El producto de digestión fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El DNA purificado pCMV-mApoAl fue seguidamente digerido 50 min a 37°C con la enzima Notl, lxBSA y Buffer 3 (New England Biolabs) aprovechando el sitio de restricción presente en el esqueleto del pcDNA 3.1 V5-His TOPO® TA. El producto de digestión fue migrado en gel de agarosa 1 % Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Se ligó el vector abierto por AscI y Notl pCMV-mApoAl con el inserto AscI-hIL15-NotI en un ratio 1 :3 (vector: inserto) usando la ligasa T4 DNA ligase High Concentration y como solución tampón el 2X Rapid Ligation Buffer (Promega Madison, Wl, U.S.A.), incubando la mezcla 10 min a temperatura ambiente. Se transformaron posteriormente bacterias ToplO (Invitrogen, Carfsbed, CA). Las bacterias transformadas se seleccionaron por su crecimiento en placas de Petri con medio LB con ampicilina, ya que el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico. Se extrajo el ADN plasmídico de las bacterias positivas mediante la técnica de MiniPrep (Qiagen, Alemania) para, posteriormente, digerir 2 μg de dicho plásmido con las enzimas Ascl/Pmel (New England Biolabs) y separar por electro foresis el resultado de dicha digestión en un gel de agarosa al 1% para comprobar la presencia del inserto. El plásmido resultante de 6669 nts se denominará en adelante pCMV-Apo-hIL15 o también pApo-hIL15.
I .6 Origen del plásmido pSushi
El plásmido que en el contexto de esta invención denominamos pCMV-Sushi (pSushi) se corresponde con el plásmido IL-15RAMD descrito previamente por Duitmann y cois. (Duitman, E.H., et al., Mol Cell Biol, 2008; 28 : 4851-4861), que fue amablemente proporcionado por los autores de este trabajo. pCMV-Sushi (pSushi), que contiene una secuencia SEQ ID NO:20 que codifica un polipéptido que comprende el dominio Sushi de la cadena α de receptor de la IL15 murino (IL15ra), precedido por un péptido señal de IgK, y que está operativamente unida al promotor del citomegalovirus. 1.7 Clonaje de cDNA de Interleuquina 15 murina (mIL15) y obtención del plásmido pCMV-mSushi-mIL15 (pmSushi-mIL 15) pCMV-mSushi-mIL15 (pmSushi-mIL15), comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende el dominio Sushi de la cadena α de receptor de la IL15 murino (IL15ra), unido a la IL 15 murina mediante un enlazador flexible del tipo GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ (SEQ ID NO:32).
El gen que codifica el dominio Sushi fusionado a la IL15 murina seguido de dos codones de terminación flanqueados por un sitio de restricción Nhel 3 ' y otro Xhol en 5' fue sintetizado por GENEART AG (GENEART AG, BioPark, Josef-Engert- StraBe
I I, 93053 Regensburg, Germany) e introducido en el plásmido pSecTag2/Hygro A (Invitrogen, Frankfurter StraBe 129B, 64293 Darmstadt, Germany). La expresión del dominio Sushi fusionado a la IL15 murina está bajo el control del promotor del citomegalovirus y su secreción es dirigida bajo el peptido señal IgK-de cadenaV-J2 .
1.8 C o n s t r u c c i ó n d e l p l á s m i d o p C M V-mSushi-mIL15-mApoAl
(pmSushi-mIL15-mApo) que codifica la fusión génica de mSushi, mIL15 y mApoAl pCMV-mSushi-mIL15-mApoAl, comprende una secuencia SEQ ID NO:45 que codifica una proteína de fusión que comprende el dominio Sushi de la cadena α del receptor de IL15 murino (IL15ra), la IL15 murina, y la apolipoproteína A-I murina.
Se diseñaron cebadores para amplificar la secuencia Sushi fusionado a la IL15 murina y unirle al mismo tiempo la secuencia de 9 nucleótidos (GGCGCGCCC) que constituye un sitio de restricción para la enzima AscI en 3' del gen y elimina el codón de terminación. Esta secuencia de restricción añadida permitirá el clonaje con una secuencia de Apo que contiene la secuencia AscI en 5 ' y se traducirá en un péptido de unión corto GAP, que dará cierta movilidad a las proteínas constituyentes. Los cebadores fueron:
Fw Sushi 5 '-ATGGAGACAGACACCCTGCTG-3 ' (SEQ ID NO: 51)
Rv IL15 AscI: 5 '-GGGCGCGCCGCTGGTGTTGATGAACAT-3 ' (SEQ ID NO: 52)
Se amplificó la secuencia por PCR, usando como molde el pmSushi-mIL15 descrito en el ejemplo anterior, y los cebadores Fw Sushi y Rv IL15 AscI, con la enzima BioTaq DNA polimerase (Bioline, Londres, Reino Unido), 1 min 94°C, 30 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 58°C y 45 seg a 72°C, seguido de 2 min a 72°C en termociclador 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems Foster City, EE.UU.). El producto de PCR fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y purificado el fragmento de gel mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El DNA purificado fue clonado, siguiendo las instrucciones provistas, en el vector de expresión pcDNA™3.1/V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Carfsbed, CA), que denominaremos pCMV-mSushi-mIL15-AscI. Finalmente, se confirmó la secuencia obtenida mediante secuenciación.
Para realizar la fusión génica el plásmido pCMV-mIFN-AscI-mApo (descrito en la solicitud de patente WO2009150284 y que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión entre mlFN y mApo), se digirió 50 min a 37°C con las enzimas AscI y Ncol en Buffer 4 (New England Biolabs). El producto de digestión fue migrado en gel de agarosa 1% Agarose D-l low EEO (Pronadisa, Madrid, España), y la banda superior que contenía el vector abierto sin la secuencia IFN fue purificada del gel mediante QlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Se realizó la digestión del plásmido pCMV-mSushi-mIL15-AscI utilizando las mismas enzimas y condiciones. En este caso se purificó la banda inferior que contenía el fragmento mSushi-mIL15. Se ligaron ambos fragmentos purificados en un ratio 1 :3 (vector: inserto) usando la ligasa T4 DNA ligase High Concentration y como solución tampón el 2X Rapid Ligation Buffer (Promega Madison, Wl, U.S. A.), incubando la mezcla 10 min a temperatura ambiente. Se transformaron posteriormente bacterias ToplO (Invitrogen, Carfsbed, CA). Las bacterias transformadas se seleccionaron por su crecimiento en placas de Petri con medio LB con ampicilina, ya que el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico. Se extrajo el ADN plasmídico de las bacterias positivas mediante la técnica de MiniPrep (Qiagen, Alemania) para, posteriormente, digerir 2 μg de dicho plásmido con las enzimas Ascl/Pmel (New England Biolabs) y separar por electroforesis el resultado de dicha digestión en un gel de agarosa al 1% para comprobar la presencia del inserto. El plásmido resultante se denominará en adelante pCMV-mSushi-mIL 15- mApoAl o también pmSushi-mIL 15 -mApo.
Ejemplo 2. Modelos experimentales
2.1 Animales Los experimentos han sido realizados en ratones inmunocompetentes BALB/c y C57BL/6 hembras entre 5-7 semanas (Harían, Barcelona, Spain). Se utilizaron ratones "knock-out" para el gen IL 15Ra (Lodolce et al. IL15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 1998; 9: 669-676). Los animales fueron tratados según normas éticas de experimentación animal, bajo condiciones específicas libres de patógenos externos. 2.2 Manipulación animal
Cada plásmido de DNA (10 μg) fue resuspendido en 1 ,8 mi de suero salino 0,9% (Braun) introducido por la vena de la cola mediante inyección hidrodinámica, usando agujas 27.5G y jeringuillas 2.5ml (Becton-Dickinson, España). Se obtuvieron muestras de sangre por vía retroorbital, previa anestesia vía inhalatoria con isofluorano (Forane, Abbott). El suero fue recuperado mediante dos centrifugaciones consecutivas a 9,lxg durante 5 minutos y almacenados a -20°C. La anestesia parenteral se realizó por inyección intraperitoneal de 200 μΐ/raton con una mezcla 9: 1 de ketamina (Imalgene) y xilacina (Rompun).
2.3 Líneas celulares
La línea celular CT26 deriva de un adeno carcinoma colorectal de ratón BALB/c y fue inducida por el carcinógeno N-nitroso-N-metil-uretano.
La línea MC38 proviene de un adenocarcinoma murino.
Ambas fueron cultivadas en medio RPMI-1640 completo (Gibco-BRL, Paisley, UK), suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS) inactivado a 56°C, glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 mg/ml, 1% β-mercaptoetanol 5.10-3. Las células descritas fueron cultivadas en cámaras incubadoras humidificadas a 37°C y en una atmósfera al 5% de C02. Las placas y botellas de cultivo son de Greiner Bio-one (Essen, Alemania). 2.4 Determinación de hIL15
Los niveles séricos de hIL15 se midieron por ELISA en placas 96 pocilios planos NUNC maxisorp. Con un kit de ELISA (Set Human IL15, BD Biosiences, San Diego, CA, EEUU), según las instrucciones provistas por el fabricante.
2.5 Citometría de flujo
El estudio de las poblaciones celulares se realizó por medio de citometría de flujo. Para ello se partió de sangre obtenida por vía retroorbital, del bazo y el hígado de los animales. Los órganos sólidos se incubaron durante 15 min con una solución de colagenasa y DNAsa para facilitar la disgregación celular, que se llevó a cabo con la ayuda de un Cell Strainer© (BC Falcon, Bedford, MA, EEUU). Los linfocitos hepáticos se aislaron mediante centrifugación de la suspensión celular en una disolución de Percoll© (GE Heathcare, Uppsala, Suecia) al 35%. Para cada hígado se utilizaron los siguientes reactivos: l ,6mL de PBS 10X, 15,8mL de Percoll©, 200U de Heparina (Mayne Pharma, Madrid, España) y 28 mL de RPMI (Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, EEUU). Todas las suspensiones celulares estudiadas fueron tratadas con búfer Tris NH4C1 durante 5 minutos para lisar los eritrocitos.
Las células fueron resuspendidas en 50 de PBS y se incubaron durante 10 min a 4°C en oscuridad con la mezcla de anticuerpos correspondientes. Posteriormente se realizaron dos lavados y se analizaron en un citómetro FACScalibur© (BD Bioscience, San Diego, CA, EEUU). El análisis posterior de los datos se realizó con el programa Flow Jo Versión 5.7.2.
Los anticuerpos usados fueron NK1.1-PE, CD3-FITC, CD8-PE, CD44-APC, CD62L- PE, CD8-PECy7 y NK1.1-APC (BD-Pharmamingen, BD Bioscience, San Diego, CA, EEUU). 2.6 Análisis estadístico de los datos
El análisis estadístico de los datos se realizó usando el programa informático Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Los datos de aparición tumoral se representaron en gráficos de Kaplan-Meier. Los datos estudiados a distintos tiempos se analizaron mediante ANO VA de medidas repetidas seguido del test de Bonferroni. Se consideraron valores significativos p<0,05.
Ejemplo 3. Niveles circulantes de hIL15 tras administración hidrodinámica de construcciones plasmídicas
Para estudiar los niveles de niveles de hIL15 humana en suero de ratón, se dispusieron grupos de 2-3 ratones y se administró a cada ratón 10 μg del correspondiente plásmido (o combinación de plásmidos) mediante inyección hidrodinámica. Los plásmidos inyectados a los diferentes grupos fueron: pApo-hIL15, pApo-hIL15 + pSushi, phIL15, phIL15 + pSushi, pApo ó vehículo salino (S).
Se obtuvieron muestras de suero a las 8, 24, 96, 168 y 240 horas y se determinó la concentración de hIL15 en ellos mediante un ELISA sándwich. Los sueros de los ratones que recibieron el plásmido control que expresa la ApoAl no contenían niveles detectables de hIL15 (Figura 1). Los ratones que habían sido inyectados con el plásmido que expresa hIL 15 presentaron concentraciones máximas de hIL 15 a las 8h que disminuían rápidamente (Figura 1). En cambio, los ratones que recibieron los plásmidos que codifican para el ApoAl-hIL15 (con o sin coinfección del plásmido pSushi) presentaron concentraciones más altas de hIL15 sérica a las 8h, que siguieron aumentando hasta las 24h. A las 168h se podía detectar hIL15 en los ratones tratados con pApo-hIL15 por contraposición a los que se observa ratones inyectados con phIL15 (Figura 1). Por lo tanto, las construcciones que expresan las proteínas de fusión ApoAl-hIL15 consiguen niveles circulantes superiores y más duraderos de hIL15. En conclusión, la administración hidrodinámica del plásmido pApo-hIL15 induce altas concentraciones de hIL15 sérica muy superiores a la producida por la administración de phIL15. Ejemplo 4. Ensayo funcional en células CTLL2
Para estudiar los efectos farmacodinámicos del plásmido pApo-hIL15 se realizó un ensayo funcional con células CTLL2 que requieren IL-2 o IL15 para proliferar (Meazza et al. Expression of two interleukin-15 mRNA isoforms in human tumors does not correlate with secretion: role of different signal peptides. Eur J Immunol 1997; 27: 1049-1054).
Se administraron los plásmidos mediante inyección hidrodinámica y se obtuvieron muestras de suero a las 24h. El suero se descomplementó mediante desnaturalización térmica (45 minutos 56°C) y se añadió a cultivos de células CTLL2. Durante 48h y se midió con timidita tritiada la proliferación celular. La concentración de hIL15 en el suero se midió mediante un ELISA sándwich comercial. En términos de cantidades equimolares de hIL15, el suero del ratón tratado con pApo-hIL15 + pSushi indujo una proliferación más intensa de las células CTLL2 (Figura 2).
Por tanto se concluye que la coadministración del plásmido pSushi con pApo-hIL15 aumenta su efecto biológico. Las construcciones plasmídicas de ApoAl fusionada con hIL15 presentan un mayor efecto inductor de la proliferación de células CTLL2 que cuando son administradas junto a un plásmido que codifica el dominio sushi (pSushi) de IL15Ra.
Ejemplo 5. Estimulación de proliferación de linfocitos CD8
Para estudiar la posible actividad inmunoestimuladora de las construcciones expresadas en el hígado mediante inyección hidrodinámica, en primer lugar se analizó el aumento del número de linfocitos T CD8 en el bazo. Para ello, se inyectaron los plásmidos mediante inyección hidrodinámica y 3, 4, 5, 6 y 7 días más tarde, se disgregaron los bazos para obtener una suspensión unicelular, se contaron las células totales y, tras marcar los linfocitos T CD8 con anticuerpos anti-CD3, anti-CD8 y anti-CD44 se analizaron mediante citometría de flujo de múltiples colores. La inyección conjunta de los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi aumentó el número de linfocitos T CD8 del bazo en mayor medida que el resto de los tratamientos (Figura 3A). Lo mismo ocurrió con el número de linfocitos T CD8 memoria determinados como células CD3+, CD8+, CD44hi (Figura 3C). El porcentaje de células T CD8 y CD8 memoria respecto a los esplenocitos totales también fue superior en el grupo de los ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi si se comparan con el resto de los grupos (Figuras 3B y 3D).
Se analizó también el porcentaje de linfocitos T CD8 respecto a los linfocitos presentes en el hígado de los ratones tratados con los diferentes plásmidos. Para ello, se inyectaron los plásmidos mediante inyección hidrodinámica y a día 3, 4, 5, 6 y 7 se disgregaron los hígados, se aislaron los linfocitos mediante centrifugación en una solución de Percoll© y, tras marcar los linfocitos T CD8 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8, se analizaron mediante citometría de flujo. Los ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi conjuntamente presentaron un porcentaje de linfocitos T CD8 en el hígado superior a los ratones del resto de los grupos (Figura 4).
Posteriormente se analizó el porcentaje de linfocitos T CD8 respecto a los linfocitos presentes en sangre periférica de los ratones tratados con los diferentes plásmidos. Para ello, se inyectaron los plásmidos mediante inyección hidrodinámica y a día 3, 4, 5 y 6 se obtuvieron muestras de sangre y se marcaron los linfocitos T CD8 con anticuerpos anti- CD3, anti-CD8, anti-CD44 y anti-CD62L. Se analizaron mediante citometría de flujo. Los ratones a los que se les administraron los plásmidos pApo-hIL 15 y pSushi conjuntamente presentaron un porcentaje de linfocitos T CD8 en sangre periférica superior a los ratones del resto de los grupos los días 5 y 6 después del tratamiento (Figura 5A). También se observó un porcentaje mayor de linfocitos T CD8 memoria (CD8+ CD44+) en este grupo (Figura 5B) y dentro de las subpoblaciones de células T CD8 efectoras memoria (CD8+ CD44+ CD62L-) y CD8 centrales memoria (CD8+ CD44+ CD62L+) (Figuras 5C y 5d).
Los estudios del número y porcentaje de linfocitos T CD8 demuestran que la administración de pApo-hIL15 y pSushi induce poblaciones más abundantes de linfocitos T CD8 en bazo, hígado y sangre periférica que la administración de los otros plásmidos. Específicamente, la administración de pApo-hIL15 y pSushi resulta en una población significativamente mayor de linfocitos T CD8 en bazo, hígado y sangre que la administración de las construcciones phIL15 y pSushi.
Ejemplo 6. Efecto antitumoral de las construcciones basadas ApoAl y hIL15 en el modelo de CT26 subcutáneo.
Para estudiar el efecto antitumoral de las construcciones basadas en ApoAl y hIL15 inyectadas mediante inyección hidrodinámica, se eligió un modelo de tumor subcutáneo en ratones Balb/c inducido por la línea celular CT26 deriva de un adenocarcinoma colorectal. Se inyectaron 5x105 células por ratón por vía subcutánea y se trataron a los 3 días con las diferentes construcciones basadas en ApoAl, hIL15 y Sushi. Se midió el tamaño de los tumores calculando el producto de 2 diámetros 2 veces por semana con un calibre digital. Los ratones se sacrificaron cuando su tamaño era superior a 246 mm2.
En el grupo de ratones tratados con pApo-hIL15 y pSushi se observó un retraso en el crecimiento de los tumores que no resultó estadísticamente significativo (Figura 6A). El 25% de los ratones tratados con pApo-hIL15 y pSushi sobrevivió los 50 días de la inoculación del tumor y no presentaban tumor visible (Figura 6B). El 14% de los ratones tratados con el plásmido pApo sobrevivió, al igual que el 1 1% de los ratones tratados con pApo-hIL15. Ningún ratón de los otros grupos de tratamiento sobrevivió al tumor. Estos datos indican que el tratamiento con pApo-hIL15 y pSushi tiene ciertos efectos antitumorales en el modelo de tumor subcutáneo CT26. Ejemplo 7. Efecto antitumoral de las construcciones basadas en ApoAl y hIL15 en el modelo de MC38 subcutáneo
Para continuar el estudio del efecto antitumoral de las construcciones basadas en ApoAl y hIL15 se eligió otro modelo de tumor subcutáneo. En ratones C57B16 se inyectaron 5x105 células de la línea MC38 por vía subcutánea y se trataron a los 6 días con las diferentes construcciones basadas en ApoAl , hIL15 y Sushi a los ratones portadores de nodulos tumorales. Se midió el tamaño de los tumores calculando el producto de 2 diámetros 2 veces por semana con un calibre digital y los ratones se sacrificaron cuando su tamaño era superior a 246mm2.
En el grupo de ratones tratados con pApo-hIL15 y pSushi se observó un retraso en el crecimiento de los tumores que no resultó estadísticamente significativo (Figura 7a). El 37,6% de los ratones tratados con pApo-hIL15 y pSushi sobrevivió los 64 días de la inoculación del tumor y no presentaban tumor visible (Figura 7b). El 16,7% de los ratones tratados con el plásmido pApo sobrevivió, al igual que el 40% de los ratones tratados con pApo-hIL 15 , 17% de los tratados con phIL 15 y el 33% de los que recibieron únicamente vehículo salino (S). Ningún ratón del grupo de phIL15 + pSushi sobrevivió.
Estos datos indican que el tratamiento con pApo-hIL15 y pSushi tiene ciertos efectos antitumorales en el modelo de tumor subcutáneo MC38.
Ejemplo 8. Efecto antimetastásico de las construcciones basadas en ApoAl y hIL15 en el modelo de MC38 intraesplénico
Se continuó el estudio del efecto antitumoral de las construcciones basadas en ApoAl y hIL15 con un modelo de inyección intraesplénica de las células tumorales que produce metástasis hepáticas. En ratones C57B 16 se inyectaron 5xl05 células de la línea MC38 por ratón por vía intraesplénica y se trataron al día siguiente con las diferentes construcciones basadas en ApoAl, hIL15 y pSushi. A los 19 días se sacrificaron los ratones y se observó el número de metástasis presentes en el hígado. De acuerdo con el número de metástasis los ratones se agruparon en 3 grupos: I ratones fallecidos debido a las metástasis hepáticas masivas o con metástasis generalizada (no es posible ver tejido sano en el hígado a simple vista); II ratones que presentan metástasis en parte del tejido hepático; III ratones libres de metástasis hepática.
En el grupo de ratones tratados con pApo-hIL15 y pSushi un 71% presentó un hígado libre de metástasis, frente al 30% de ratones tratados con pApo-hIL 15, el 25% en tratados con phIL15 + pSushi, 20% de los que recibieron salino (S) y 0% de los grupos de phIL 15 y p Apo (Figura 8) .
De estos datos se concluye que la administración de pApo-hIL15 y pSushi tiene efectos antimetastásicos más eficientes que el resto de las construcciones estudiadas en el modelo de tumor MC38 intraesplénico.
Ejemplo 9. Efecto de la administración de las construcciones basadas en ApoAl y hIL15 en ratones "knock out" para el receptor α de IL15
Se continuó el estudio de los efectos inmunoestimuladores de las contrucciones basadas en ApoAl y hIL15 en ratones carentes del receptor α de IL15. Estos ratones presentan un fenotipo característico, ya que carecen de células NK y tienen una pequeña cantidad de células T CD8 memoria (Lodolce et al. Immunity 1998; 9: 669-676).
El objetivo de este experimento fue observar si pApo-hIL15 y pSushi podían modificar este fenotipo. Se inyectaron cuatro ratones, uno con los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi, otro con phIL15 y pSushi, otro con pApo y finalmente otro con pApo-hIL15. A los cinco días de sacrificaron los ratones, se extrajo el bazo y se estudiaron las poblaciones esplénicas de células NK y linfocitos T CD8 memoria mediante citometría de flujo (Figura 9).
Los ratones tratados con los plásmidos pApo-hIL15 y pSushi presentaron un porcentaje de células NK de 1,02%, muy superior al del ratón tratado con pApo (0,39%>). En cuanto a los linfocitos T CD8 memoria, de aquellos ratones tratados con pApo-hIL15 y pSushi tenía un 1 ,47% de células CD8+ CD44+ respecto al total de los esplenocitos. Este porcentaje es similar al alcanzado con la construcción pApo-hIL15 sola. Este experimento indica que el tratamiento con las construcciones pApo-hIL15 y pSushi recupera parcialmente el fenotipo de los ratones "knock out" para el receptor α de IL15, obteniendo porcentajes esplénicos de células NK y T CD8 memoria superiores a los obtenidos con el resto de construcciones estudiadas.
Ejemplo 10. Efecto de la administración de una construcción triple, basada en la fusión de Sushi, IL15 y ApoAl.
P ara estudiar la po sib l e actividad inmuno e stimuladora de l plásmido pmSushi-mIL15-mApo con la construcción triple descrito en el ejemplo 1.8., se realizó un nuevo ensayo de proliferación de linfocitos CD8, de modo semejante a como se describe en el ejemplo 5.
Para ello, se establecieron grupos de ratones C57BL/6 (2-3 animales por grupo de tratamiento), a los que se inyectó, mediante inyección hidrodinámica, el plásmido a ensayar (2,5 μg/ratón). Seis días más tarde, se disgregaron los bazos para obtener una suspensión unicelular, se contaron las células totales y, tras marcar los linfocitos T CD8 con anticuerpos anti-CD3, anti-CD8 y anti-CD44 y las células NK con anticuerpos anti- CD3, anti-NKl . l, se analizaron mediante citometría de flujo de múltiples colores.
Los plásmidos a ensayar en los distintos grupos de tratamiento fueron:
- pmSushi-mIL15-mApo;
- pApo-hIL15 en combinación con pSushi (pApo-hIL15 + pSushi);
- pApo-hIL15; - phIL15 en combinación con pSushi (phIL15 + pSushi);
-phIL15; y
- pApo. En este ensayo, para el grupo de animales tratados con el plásmido pmSushi-mIL15-mApo, que codifica la proteína de fusión triple, se observó una proliferación del número de células esplénicas notablemente mayor que la observada para el resto de grupos de tratamiento (Figura 10A). Igualmente, el tratamiento con pmSushi-mIL15-mApo indujo una proliferación del número de linfocitos T CD8 (Figura 10B) y de células NK (Figura 10C) muy significativamente mayor que la observada con el resto de tratamientos.
Ejemplo 11. Efecto sobre la estimulación de proliferación de células T CD8 y NK en el bazo de ratón de las construcciones que codifican para la IL15 murina y para la IL15 humana.
Se estudió comparativamente la actividad estimuladora sobre el número de esplenocitos de las construcciones que codifican para las moléculas mIL15 y hIL15 mediante la administración de los plásmidos correspondientes por inyección hidrodinámica (10 μg/ratón) co-administrados o no con el plásmido pSushi. Cuatro días después se disgregaron los bazos para obtener una suspensión unicelular, se contaron las células totales y, tras marcar los linfocitos T CD8 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8 y las células NK con anticuerpos anti-NKl . l y anti-CD-3, se analizaron mediante citometría de flujo de múltiples colores. La inyecciones del plásmido pmIL15 y del plásmido phIL 15 indujeron un número similar de esplenocitos, así como porcentajes similares de células T CD8 y NK (Figura 1 1). Así mismo al coadministrar los plásmidos de pmIL15 o phIL15 con pSushi, se observó que los bazos de los ratones inyectados con el plásmido codificante para la proteína humana presentaban un mayor porcentaje de células T CD8 y NK, aunque esta tendencia no resultó estadísticamente significativa (test de Rruskall-Wallis). Ejemplo 12. Efecto de la fusión de mSushi con mIL15 y Apo en el porcentaje de células NK en bazo y en hígado.
El plásmido pmSushi-mIL15-mApo, que codifica la proteína de fusión triple, aumenta el número de células NK en el bazo y en el hígado en mayor medida que el plásmido pmSushi-mIL15 coadministrado con el plásmido pApo.
Se establecieron grupos de ratones C57BL/6, a los que se inyectó, mediante inyección hidrodinámica, el plásmido a ensayar:
- pmSushi-mIL15-mApo, a una dosis de 1 μg/ratón;
- pmSushi-mIL15-mApo, a una dosis de 2,5 μg/ratón;
- pmSushi-mIL15-mApo, a una dosis de 5 μg/ratón;
- pmSushi-mIL15 en combinación con pApo, a una dosis de 1 μg/ratón;
- pmSushi-mIL15 en combinación con pApo, a una dosis de 2,5 μg/ratón; y
- pmSushi-mIL15 en combinación con pApo, a una dosis de 5 μg/ratón;
Cuatro días después se disgregaron los bazos para obtener una suspensión unicelular y se aislaron las células linfoides del hígado por centrifugación con Percoll©. Se marcaron las células NK con anticuerpos anti-NKl . l y anti-CD-3 se analizaron mediante citometría de flujo de múltiples colores. La inyección de pmSushi-mIL15- mApo indujo la presencia de un mayor porcentaje de células NK en el bazo y en el hígado que la coadministración de pmSushi-mIL 15 y pApo (pSushi-mIL-15 + pApo) (Figura 12).
Ejemplo 13. Efecto antitumoral de una construcción triple, basada en la fusión de Sushi, IL15 y ApoAl en el modelo de MC38 subcutáneo.
Para continuar el estudio del efecto antitumoral del plásmido pmSushi-mIL15-mApo con la construcción triple descrito en el ejemplo 1.8., se eligió el modelo de tumor subcutáneo. En ratones C57B16 se inyectaron 5xl05 células de la línea MC38 por vía subcutánea y se trataron a los 8 y 19 días con las diferentes construcciones. Los plásmidos a ensayar en los distintos grupos de tratamiento fueron:
- pApo; - pmSushi-mIL15-mApo;
- pApo-hIL15 en combinación con pSushi (pApo-hIL15 + pSushi);
Para ello, se establecieron grupos de ratones C57BL/6 portadores de nodulos tumorales: 5 ratones fueron tratados con pApo; 8 ratones fueron tratados con pmSushi-mIL15-mApo y 9 ratones fueron tratados con pApo-hIL15 + pSushi a los que se inyectó, mediante inyección hidrodinámica, el plásmido a ensayar pApo (1 μg/ratón), pmSushi-mIL15-mApo (1 μg/ratón) y pApo-hIL15 + pSushi (10 μg/ratón de cada uno). Se midió el tamaño de los tumores calculando el producto de 2 diámetros 2 veces por semana con un calibre digital y los ratones se sacrificaron cuando su tamaño era superior a 246mm .
En el grupo de ratones tratados con pmSushi-mIL15-mApo, que codifica la proteína de fusión triple, se observó un retraso en el crecimiento de los tumores que no resultó estadísticamente significativo (Figura 13). El 33,3% de los ratones tratados con pmSushi-mIL15-mApo no presentaba tumor visible al final del estudio (a los 29 días de la inoculación) y solo el 33,3% presentaba tumores de superficie >40mm2. El 20% de los ratones tratados con el plásmido pApo presentaba tumor visible el día del sacrificio (29 días) y el 80% de los ratones presentaba un tumor >40mm2, mientras ningún ratón tratado con pApo-hIL15+ pShushi estaba libre de tumor al final del estudio (día 29) y el 80%) de los ratones tenía un tumor >40mm2 pese a que recibieron una dosis 10 veces mayor de los plásmidos por separado que de la triple fusión.
Estos datos indican que el tratamiento con pmSushi-mIL15-mApo tiene ciertos efectos antitumorales en el modelo de tumor subcutáneo MC38.

Claims

REIVINDICACIONES
Una composición que comprende, juntos o separados,
(i) un primer componente seleccionado del grupo de
(a) un polipéptido que comprende un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA y
(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA y
(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de
(a) IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70%> de identidad con IL15 y
(b) un polinucleótido que codifica IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70%) de identidad con IL15 y
(iii) un tercer componente seleccionado del grupo de
(a) el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 y
(b) un polinucleótido que codifica el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15.
Una composición según la reivindicación 1 en donde el primer y segundo componente forman parte de una única molécula y en donde
a. si el primer y segundo componentes son polipéptidos, dicha única molécula es una proteína de fusión que comprende un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70% de identidad con dicho polipéptido ApoA e IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70% de identidad con IL15 y
b. si el primer y segundo componentes son polinucleótidos, dicha única molécula es un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende un polipéptido que comprende un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70%) de identidad con dicho polipéptido ApoA e IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70% de identidad con IL 15.
3. Una composición según la reivindicación 2 en donde el ordenamiento del primer y segundo componente en dicha única molécula se selecciona del grupo consistente en
a. el primer componente se encuentra en posición N terminal o 5' con respecto al segundo componente y
b. el primer componente se encuentra en posición C terminal o 3 ' con respecto al segundo componente. 4. Una proteína de fusión que comprende
(i) una región A formada por un polipéptido Apo A o una variante funcionalmente equivalente del mismo mismo que presenta, al menos, un 70%) de identidad con dicho polipéptido ApoA,
(ii) una región B formada por IL15 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70%> de identidad con IL15 y
(iii) una región C formada por el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta, al menos, un 70%> de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15.
5. Una proteína de fusión según la reivindicación 4 en donde el ordenamiento de las regiones A, B y C en sentido N- a C-terminal en dicha proteína de fusión se selecciona del grupo consistente en A-B-C, A-C-B, B-A-C, B-C-A, C-A-B y C-B- A.
6. Una proteína de fusión según las reivindicaciones 4 ó 5 en donde al menos una de las uniones entre las regiones A, B y C se establece a través de un enlazador peptídico. 7. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en donde
a. Apo A o la variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70% de identidad con Apo A es de origen humano o de origen murino,
b. IL15 o la variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 70% de identidad con IL15 es de origen humano o de origen murino y/o
c. el polipéptido que comprende el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15 o una variante funcionalmente equivalente del mismo que presenta,al menos, un 70%> de identidad con el dominio Sushi de la cadena alfa del receptor de IL15es de origen humano o de origen murino.
8. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
9. Un vector o una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 8.
10. Una célula huésped que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, un vector según la reivindicación 9 o una construcción génica según la reivindicación 9. Una composición farmacéutica que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7, una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, un vector o una construcción génica según la reivindicación 9 o una célula huésped según la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Método in vitro para promover la expansión de linfocitos T específicos de un antígeno que comprende poner en contacto una población de linfocitos previamente expuestos in vivo a dicho antígeno con una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7, una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, un vector o una construcción génica según la reivindicación 9 o una célula huésped según la reivindicación 10.
Método según la reivindicación 12 en donde los linfocitos se someten previamente a una activación in vitro mediante la puesta en contacto de los linfocitos con el antígeno al que han sido expuestos dichos linfocitos T.
Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7, una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, un vector o una construcción génica según la reivindicación 9 o una célula huésped según la reivindicación 10 para su uso en medicina.
Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7, una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, un vector o una construcción génica según la reivindicación 9 o una célula huésped según la reivindicación 10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que requiere la estimulación de la respuesta inmune de un sujeto. Uso según la reivindicación 15 en donde la enfermedad que requiere la estimulación de la respuesta inmune se selecciona del grupo consistente en una enfermedad infecciosa y de una enfermedad neoplásica. 17. Uso según la reivindicación 16 en donde la enfermedad neoplásica se selecciona del grupo de un tumor y una metástasis.
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