WO2011081164A1 - 抗ｃｄ２７抗体 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention specifically recognizes a polypeptide encoded by a CD27 gene containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound, and a humanized antibody or antibody fragment that binds to the extracellular region of the polypeptide, A hybridoma that produces the humanized antibody, a DNA encoding the humanized antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by transforming the vector, a humanized antibody using the hybridoma or transformant, or The present invention relates to a method for producing the antibody fragment, and a diagnostic agent containing the humanized antibody or antibody fragment, or a therapeutic agent containing the humanized antibody or antibody fragment as an active ingredient.
  • Tn antigen that is one of O-linked (serine threonine type) sugar chain antigens that are expressed in more than 80% of human cancer types, and sialic acid is included in the Tn antigen. Is the expression of the sialyl-Tn antigen to which is added (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 1 Specific sugar chain antigens are known to be hardly expressed in normal cells, and research for application to medicine as a target molecule for cancer-specific vaccine therapy has been made (Non-patent Document 1). Expression of these cancer-specific sugar chain antigens is controlled by enzyme activities that constitute complex sugar chain biosynthetic pathways and sugar chain metabolic pathways existing in vivo. As an example, there is known an example in which the sugar chain biosynthetic pathway is interrupted in the middle as a result of a change in the expression mode of a gene encoding a protein involved in the sugar chain biosynthetic pathway in cancer cells.
  • Tn antigen is known as an intermediate product of the biosynthetic pathway of O-linked sugar chains in normal cells, and is present in the side chain of specific serine (Ser) or threonine (Thr) residues in protein amino acid sequences.
  • Ser serine
  • Thr threonine residues in protein amino acid sequences.
  • N-acetylgalactosamine (GalNAc) is ⁇ -bonded to the hydroxyl group (GalNAc ⁇ -Ser / Thr).
  • Tn antigen expression is commonly observed in multiple cancer types, abnormalities in the intracellular sugar chain biosynthetic pathway or sugar chain metabolic pathway indicate that sugars added to many different glycoproteins expressed in the cell It is thought to be the main cause of the common changes in chain structure.
  • IgA nephropathy is known as a disease that is known to be closely related to changes in sugar chain structure and progression of disease state.
  • IgA nephropathy is a chronic glomerulonephritis characterized by a pathological image in which immunoglobulin A (IgA), a kind of immunoglobulin, is deposited in the mesangial region of the glomerulus and is first developed by Berger in 1968.
  • IgA immunoglobulin A
  • IgA nephropathy is a typical nephritis that accounts for about half of the number of chronic glomerulonephritis patients in Japan. It is said that about 40% of patients diagnosed with IgA nephropathy shift to end stage renal failure within 20 years, and are forced to undergo artificial dialysis and kidney transplantation. Thus, despite the fact that IgA nephropathy is generally recognized as a disease with a poor prognosis, a clinically proven therapeutic method has not yet been established.
  • IgA1 is mainly deposited in the kidney among two types of IgA isotypes (IgA1 and IgA2). Also, as one of the causes of the deposition, the structure of the O-linked sugar chain added to the hinge region present in the IgA1 molecule but not in the IgA2 molecule has changed from the normal type to the Tn antigen or sialyl Tn antigen. It has been reported (Non-patent document 3, Non-patent document 4).
  • Non-Patent Document 5 When galactose is deleted from the O-linked sugar chain added to the IgA1 hinge region and changed to Tn antigen or sialyl Tn antigen, the self-aggregation ability of IgA1 molecule is enhanced, and the deposition of IgA1 molecule on the renal mesangial region is enhanced.
  • Non-patent Document 6 a decrease in core 1 ⁇ 3 galactosyltransferase activity due to a decrease in the expression level of Cosmc has been reported.
  • IgA is produced by B cells in blood or plasma cells differentiated from B cells.
  • Plasma cells are the final stage of B cell differentiation and are distributed in secondary lymphoid tissues, systemic mucosal tissues and bone marrow to produce large amounts of antibodies, but plasma cells that produce IgA are mainly found in mucosal tissues. It is known to be distributed.
  • memory B cells or plasma cells are differentiated and distributed to the target organs throughout the body. Is known to continue producing.
  • CD27 is known as one of molecules to which O-linked sugar chains bind (Non-patent Document 7).
  • the CD27 molecule is a type I membrane protein having a molecular weight of about 55 kDa belonging to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily, and exists as a dimer in which two monomers are linked by a disulfide bond (Non-patent Document 8).
  • TNFR tumor necrosis factor receptor
  • CD27 is known to be expressed in a part of T lymphocytes in addition to plasma cells and B cells. In particular, during differentiation of B cells, CD27 is differentiated into memory B cells and plasma cells. It is known that expression increases. It is known that CD27 to which an O-linked sugar chain is bound is expressed in these differentiation process cells, but the amino acid residue to which the sugar chain is bound has not been clarified (Non-patent Document 9). ).
  • CD70 which is one of TNF family is known as a ligand molecule of CD27.
  • CD70 is known to bind to CD27 expressed in some B cells or T cells and introduce a cell proliferation signal or promote B cell antibody production (Non-patent Document 10).
  • CD27 is increased not only in normal cells but also in some cancer cells.
  • Various types of cancer that express CD27 include various types of non-human diseases such as mantle cell lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, small lymphocytic leukemia, Burkitt lymphoma, follicular lymphoma, malt lymphoma, diffuse large cell lymphoma and plasmacytoma. Hodgkin lymphoma has been reported (Non-patent Document 11).
  • Non-patent Document 8 As an antibody specifically recognizing CD27, S152 antibody obtained by immunizing leukemia cells isolated from a patient with Sezary syndrome has been reported (Non-patent Document 8). However, the S152 antibody has been shown to have affinity for normal B cells and T cells. Until now, no antibody has been known that specifically recognizes a CD27 molecule containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound.
  • HAMA Human Anti Mouse Antibody
  • HAMA reacts with the administered mouse antibody to cause side effects (Non-Patent Documents 12 to 15), accelerates the disappearance of the mouse antibody from the body (Non-Patent Documents 16 to 18), and reduces the therapeutic effect of the mouse antibody. It is known that it will cause (Non-patent Documents 19 and 20).
  • Humanized antibodies have various advantages over administration to humans compared to non-human antibodies such as mouse antibodies. For example, in experiments using monkeys, it has been reported that immunogenicity is reduced compared to mouse antibodies, and the blood half-life is extended (Non-patent Documents 21 and 22). That is, humanized antibodies are expected to have fewer side effects in humans than non-human antibodies, and their therapeutic effects last for a long time.
  • humanized antibodies are produced using gene recombination techniques, they can be produced as various forms of molecules.
  • H chain human antibody heavy chain
  • C region constant region
  • ADCC activity humanized antibody having a high effector function such as cytotoxic activity
  • the Fc region antibody weight of the antibody
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • ADCC activity cytotoxic activity
  • human therapy it is desirable to use human chimeric antibodies, humanized antibodies or humanized antibodies in order to exert cytotoxic activity (Non-patent Documents 25 and 26).
  • humanized antibodies are Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain antibodies (hereinafter referred to as scFv) (Non-patent Document 27), 2 due to recent advances in protein engineering and genetic engineering.
  • Peptide containing a merified V region fragment hereinafter referred to as Diabody
  • dsFv disulfide-stabilized V region fragment
  • Non-patent document 29 a disulfide-stabilized V region fragment
  • CDR Non-patent document
  • an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically recognizes CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound and binds to the extracellular region of CD27, or a method of using the same.
  • the present invention relates to (1) to (23).
  • the VH of the antibody is a VH including the amino acid sequences of CDR1 to 3 represented by SEQ ID NOs: 58 to 60, and the VL of the antibody includes the amino acid sequence of CDR1 to 3 represented by SEQ ID NOs: 61 to 63
  • a humanized antibody or antibody fragment thereof that recognizes and binds to an extracellular region of a polypeptide encoded by the CD27 gene, which is a VL and contains an O-linked sugar chain to which galactose is not bound.
  • the VH of the humanized antibody is such that the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn, the 48th Val is Ile, the 49th Ser is Ala, and the 77th Asn is Gly contains an amino acid sequence into which at least one modification selected from a modification in which 93rd Val is replaced with Thr, 97th Ala is replaced with Thr, and 117th Thr is replaced with Val, and is a humanized antibody
  • the 21st Ile is Leu
  • the 40th Pro is Leu
  • the 58th Val is Ile
  • the 85th Thr is Ala
  • the 87th The humanized antibody or antibody fragment thereof according to (1), comprising an amino acid sequence into which at least one modification selected from the modification of substituting Tyr for Pyr is introduced.
  • the humanized antibody VH contains the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 96, 105 and 107
  • the humanized antibody VL contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 Antibody or antibody fragment thereof.
  • a transformed strain obtained by introducing the recombinant vector according to (5) into a host cell.
  • the transformed strain according to (6) is cultured in a medium, and the humanized antibody or the antibody fragment according to any one of (1) to (3) is produced and accumulated in the culture, The method for producing a humanized antibody or the antibody fragment according to any one of (1) to (3), wherein the antibody or the antibody fragment is collected from the culture.
  • the diagnostic agent according to (10), wherein the disease involving CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is IgA nephropathy.
  • the diagnostic agent according to (10), wherein the disease involving CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is cancer.
  • the therapeutic agent according to (13), wherein the disease involving CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is IgA nephropathy.
  • the therapeutic agent according to (13), wherein the disease involving CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is cancer.
  • a cell expressing CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is detected or A method for diagnosing a disease involving CD27 comprising an O-linked sugar chain to which galactose is not bound, comprising measuring.
  • Use of the humanized antibody or antibody fragment thereof according to (20) or (21), wherein the disease involving CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is IgA nephropathy.
  • Use of the humanized antibody or the antibody fragment thereof according to (20) or (21), wherein the disease involving CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is cancer.
  • the humanized antibody or the antibody fragment of the present invention specifically recognizes an extracellular region of a polypeptide encoded by the CD27 gene (hereinafter referred to as CD27) containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound.
  • CD27 a polypeptide encoded by the CD27 gene
  • a disease associated with sugar chain-deficient CD27 can be diagnosed.
  • the humanized antibody or the antibody fragment of the present invention can bind to the extracellular region of the sugar chain-deficient CD27 polypeptide, it is suitably used for detection of cells expressing the polypeptide.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof can bind to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27, analysis of flow cytometry for detecting CD27 expressed with a natural three-dimensional structure on the cell membrane is detected. Is preferably used.
  • the humanized antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and the antibody having the effector activity or the antibody fragment damages a cell expressing a sugar chain-deficient CD27 polypeptide in vivo and in vitro.
  • a humanized antibody or antibody fragment of the present invention is particularly effective as a therapeutic agent because it can damage and reduce sugar chain-deficient CD27 polypeptide-expressing cells in vivo.
  • FIG. 1 shows a method for preparing plasmid vector pCR2.1 CD27 containing a DNA sequence encoding human CD27 protein.
  • FIG. 2 shows a method for producing a plasmid vector pCR CD27axb containing a DNA sequence encoding the extracellular region of human CD27 protein.
  • FIG. 3 shows a method for preparing a plasmid vector pBShC ⁇ 4SP having a mutant human IgG4Fc region in which amino acid substitutions have been made in the human IgG4 constant region.
  • FIG. 4 shows a method for preparing a plasmid vector pCR IgG4Fc BamHISalI containing a DNA sequence in which a restriction enzyme recognition sequence is inserted into the DNA sequence of the mutant human IgG4Fc region.
  • FIG. 5 shows a method for preparing pKANTEX XhoI / SalI into which the DNA sequence of CD27-Fc is inserted.
  • FIG. 6 shows a method for preparing the CD27-Fc protein expression vector pKANTEX CD27-hIgG4Fc.
  • 7 (a) and 7 (b) show the results of SDS-PAGE analysis of CD27-Fc protein in which CHO / DG44 cells and Lec8 cells were expressed as host cells.
  • FIG. 7A shows a non-reduced state in which ⁇ -mercaptoethanol is not added
  • FIG. 7B shows a reduced state in which ⁇ -mercaptoethanol is added.
  • FIGS. 7 (a) and (b) show the fraction of markers, Lec8 cells and CHO / DG44 cells from the left.
  • FIG. 8 (a) shows the results of SDS-PAGE analysis of CD27-Fc protein expressed using CHO / DG44 cells and Lec8 cells as host cells.
  • FIG. 8 (b) shows the result of Western blotting of CD27-Fc protein expressed using CHO / DG44 cells and Lec8 cells as host cells.
  • FIGS. 8 (a) shows the results of SDS-PAGE analysis of CD27-Fc protein expressed using CHO / DG44 cells and Lec8 cells as host cells.
  • FIG. 8 (b) shows the result of Western blotting of CD27-Fc protein expressed using CHO / DG44 cells and Lec8 cells as
  • FIG. 8 shows markers, CHO / DG44 cells, and Lec8 cell samples from the left lane. Western blot was stained with anti-RCAS1 antibody 22-1-1 antibody.
  • FIG. 9 shows a method for preparing a plasmid vector pCR CD27 axc containing DNA encoding a CD27 protein for animal cell expression.
  • FIG. 10 shows a method for preparing the animal cell expression vector pKANTEX CD27.
  • 11 (a) and 11 (b) show the results of a flow cytometer of an anti-CD27 monoclonal antibody against CD27-expressing CHO / DG44 cells and CD27-expressing Lec8 cells.
  • FIG. 11A shows the histogram for CD27 / Lec8-4, and FIG.
  • FIG. 11B shows the histogram for CD27 / DG44-8.
  • the vertical axis represents the number of cells and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • FIGS. 12 (a) and 12 (b) show the binding activity of anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibodies KM4030 and KM4031 to Lec8 cells, CD27 / Lec8-4 cells and CD27 / DG44-8 cells using a fluorescent cell staining method. The measurement results are shown.
  • FIG. 12 (a) shows the measurement results using the ABI cellular detection system, where the vertical axis indicates the fluorescence intensity and the horizontal axis indicates the reacted antibody.
  • FIGS. 13 (a) and (b) show the results of a competitive ELISA of anti-sugar chain deficient CD27 monoclonal antibodies KM4030 and KM4031.
  • FIG. 13 (a) shows the reactivity of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4030
  • FIG. 13 (b) shows the reactivity of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4031.
  • the vertical axis represents cell growth and the horizontal axis represents antibody concentration.
  • FIG. 14 (a) and (b) show the gene cloning method of anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody.
  • FIG. 15 shows a construction method of an anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody expression vector.
  • FIG. 16 shows the construction method of an anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody expression vector.
  • FIG. 17 shows a construction method of an anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody expression vector.
  • FIG. 18 shows a construction method of an anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody expression vector.
  • FIGS. 19A and 19B show the results of measuring the binding activity of the commercially available anti-CD27 antibody O323 ( ⁇ ) to CD27 / Lec8-4 cells using a flow cytometer (FCM).
  • the vertical axis represents the average fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the final concentration of the reacted antibody.
  • FIG. 19 (B) (a) shows CD27 / DG44- of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies chimeric KM4026 ( ⁇ ), chimeric KM4028 ( ⁇ ), chimeric KM4030 ( ⁇ ), and chimeric KM4031 ( ⁇ ).
  • FCM flow cytometer
  • FIGS. 19B and 19B show the results of measuring the binding activity of commercially available anti-CD27 antibody O323 ( ⁇ ) to CD27 / DG44-4 cells using a flow cytometer (FCM).
  • the vertical axis represents the average fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the final concentration of the reacted antibody.
  • FIG. 19 (C) (a) shows the binding of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies chimeric KM4026 ( ⁇ ), chimeric KM4028 ( ⁇ ), chimeric KM4030 ( ⁇ ), and chimeric KM4031 ( ⁇ ) to Lec8 cells.
  • the result of having measured activity using the flow cytometer (FCM) is shown.
  • FIGS. 19C and 19B show the results of measuring the binding activity of the commercially available anti-Tn antibody 22-1-1 ( ⁇ ) to Lec8 cells using a flow cytometer (FCM).
  • the vertical axis represents the average fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the final concentration of the reacted antibody.
  • FIG. 20 shows antibody dependence of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies chimeric KM4026 ( ⁇ ), chimeric KM4028 ( ⁇ ), chimeric KM4030 ( ⁇ ) and chimeric KM4031 ( ⁇ ) on CD27 / Lec8-4 cells. Shows cytotoxic activity (ADCC activity). The vertical axis represents the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the final concentration of each antibody.
  • FIG. 21 shows complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity) of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies chimeric KM4026, chimeric KM4028, chimeric KM4030, and chimeric KM4031 on CD27 / Lec8-4 cells.
  • FIG. 22 shows a construction method of plasmid vector pCR mfCD27 containing DNA encoding cynomolgus monkey CD27 protein.
  • FIG. 23 shows a method for constructing a plasmid vector mfCD27His containing DNA encoding cynomolgus monkey CD27 protein.
  • FIG. 24 shows a method for preparing the cynomolgus monkey CD27 expression vector pKANTEX mfCD27His.
  • FIG. 25 shows the binding activity of cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cells or cynomolgus monkey CD27 / DG44 cells of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies chimeric KM4026, chimeric KM402, chimeric KM4030, chimeric KM4031 and commercially available anti-CD27 antibody O323.
  • FCM flow cytometer
  • FIG. 26 shows the antibody dependency of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies chimeric KM4026 ( ⁇ ), chimeric KM4028 ( ⁇ ), chimeric KM4030 ( ⁇ ) and chimeric KM4031 ( ⁇ ) on cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cells. Cytotoxic activity (ADCC activity) is shown. The vertical axis represents the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the final concentration of each antibody.
  • FIG. 27 shows antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) of cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cells ( ⁇ ) or human CD27 / Lec8 cells ( ⁇ ) of various anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibodies KM4030.
  • the vertical axis represents the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the final concentration of each antibody.
  • FIG. 28 (A) (a) shows a Biacore sensorgram of binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4026 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 28 (A) (b) shows a Biacore sensorgram of binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4027 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 28 (A) (c) shows a Biacore sensorgram of binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4028 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 28 (A) (d) shows a Biacore sensorgram of the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KKM4030 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 28 (A) (e) shows a Biacore sensorgram of binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4031 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc.
  • the vertical axis represents RU (resonance unit).
  • the horizontal axis represents the reaction time (seconds).
  • FIG. 28 (B) (a) shows a Biacore sensorgram of the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4026 to sialyl Tn antigen type CD27-Fc.
  • FIGS. 28B and 28B show Biacore sensorgrams for the binding of various anti-sugar chain-deficient CD27 antibodies KM4027 to sialyl Tn antigen type CD27-Fc.
  • FIG. 28 (B) (c) shows a Biacore sensorgram of the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4028 to sialyl Tn serotype CD27-Fc.
  • FIG. 28 (B) (d) shows a Biacore sensorgram of the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4030 to sialyl Tn antigen type CD27-Fc.
  • FIG. 28 (B) (e) shows a Biacore sensorgram of binding of anti-sugar chain-deficient CD27 antibody KM4031 to sialyl Tn antigen type CD27-Fc.
  • the vertical axis represents RU (resonance unit), and the horizontal axis represents reaction time (seconds).
  • FIG. 29 (a) shows a Biacore sensorgram of binding of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 29 (b) shows a Biacore sensorgram of the binding of humanized antibody HV0LV0 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 29 (c) shows a Biacore sensorgram of the binding of humanized antibody HV5LV0 to sugar chain-deficient CD27-Fc (Tn antigen type CD27-Fc).
  • FIG. 30 (A) shows the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 ( ⁇ ) and anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0 ( ⁇ ), HV5LV0 ( ⁇ ), and HV7LV0 ( ⁇ ) to CD27 / Lec8-M19 cells. The result of having measured activity using the flow cytometer (FCM) is shown.
  • FIG. 30 shows the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 ( ⁇ ) and anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0 ( ⁇ ), HV5LV0 ( ⁇ ), and HV7LV0 ( ⁇ ) to CD27 / DG44-4 cells.
  • FCM flow cytometer
  • FIG. 31 shows the antibody dependency of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 ( ⁇ ) and anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0 ( ⁇ ), HV5LV0 ( ⁇ ), and HV7LV0 ( ⁇ ) on CD27 / Lec8-M19 cells. Cytotoxic activity (ADCC activity) is shown. The vertical axis represents the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the final concentration of each antibody.
  • FIG. 32 shows complement dependency of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 ( ⁇ ) and anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0 ( ⁇ ), HV5LV0 ( ⁇ ), and HV7LV0 ( ⁇ ) on CD27 / Lec8-M19 cells. Shows sexual cytotoxic activity (CDC activity). The vertical axis represents the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the reacted antibody.
  • FIG. 33 shows the binding activity of cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cells of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 ( ⁇ ) and anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0 ( ⁇ ), HV5LV0 ( ⁇ ), and HV7LV0 ( ⁇ ). Shows the results of measurement using a flow cytometer (FCM).
  • FCM flow cytometer
  • FIG. 33 (B) shows the binding activity of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 ( ⁇ ) and anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0 ( ⁇ ), HV5LV0 ( ⁇ ), and HV7LV0 ( ⁇ ) to cynomolgus monkey CD27 / DG44 cells. Shows the results of measurement using a flow cytometer (FCM).
  • FCM flow cytometer
  • the vertical axis represents the average fluorescence intensity
  • the horizontal axis represents the final concentration of the reacted antibody.
  • the vertical axis represents the average fluorescence intensity
  • the horizontal axis represents the reacted antibody.
  • the present invention specifically recognizes an extracellular region of a polypeptide encoded by the CD27 gene (hereinafter also referred to as CD27) containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound, and contains the extracellular region in the extracellular region.
  • CD27 a polypeptide encoded by the CD27 gene
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that binds (hereinafter also referred to as a humanized antibody of the present invention or an antibody of the present invention).
  • the CD27 gene may be any gene that encodes CD27, but includes a gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the CD27 gene of the present invention includes a gene that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a polypeptide having a CD27 function.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions is a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, and a DNA microarray method using the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a probe.
  • the hybridizable DNA obtained by the above.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of sodium chloride is present using a hybridized colony or plaque-derived DNA, or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • an SSC solution having a concentration of 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution of 1 time concentration includes 150 mmol / L sodium chloride and 15 mmol / L sodium citrate) was used. Examples thereof include DNA that can be identified by washing a filter or a slide glass under a condition of 65 ° C.
  • the hybridizable DNA is preferably DNA having at least 60% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably DNA having 80% or more homology, and 95% or more homology. More preferably, it has DNA.
  • the CD27 gene used in the present invention includes a gene having a slight mutation in the base sequence due to the polymorphism of the gene.
  • CD27 includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has the function of CD27. And an amino acid sequence having a homology of preferably 60% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And a polypeptide having the function of CD27.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor) Laboratory Press, 1989] and Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)], etc., for example, introducing a site-specific mutation into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Can be obtained.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • the numerical value of homology described in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, but for the base sequence, BLAST [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)], for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997); Genome Res. , 7, 649 (1997); http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Education / BLASTinfo / information3. numerical values calculated using default parameters in [html].
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for) nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y (Dropoff (X) for blast extensions) in bits) is 20 for blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X (X dropoff value for If the gap alignment in bits) is 15 and -Z (final X dropoff value for gapd alignment in bits) is blastn, then it is 50, and if it is a program other than blastn, it is http://www.vn.cn. /Blast/html/
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art, for example, a part of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is deleted. And a transformant introduced with an expression vector containing the same can be cultured.
  • polypeptide or DNA thus prepared, it has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by the same method as described above.
  • a polypeptide can be obtained.
  • Examples of the extracellular region of CD27 include a region corresponding to the 1st to 171st extracellular domains predicted in the literature [The Journal of Immunology, 147, 3165 (1991)].
  • the extracellular region of a polypeptide encoded by a CD27 gene containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is any CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound. It may be. Specifically, for example, the extracellular region of CD27 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound.
  • the O-linked sugar chain refers to a structure in which a sugar chain is bonded to the serine (Ser) or threonine (Thr) amino acid residue of a protein via an —OH group contained in each amino acid side chain.
  • O-linked sugar chains an O-linked sugar chain in which N-acetylgalactosamine (GalNAc) is bonded to the —OH group of Ser or Thr amino acid side chain on a polypeptide is called a mucin-type sugar chain.
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • Specific examples of the O-linked sugar chain include T antigen, sialyl T antigen, Tn antigen, and sialyl Tn antigen (Table 1).
  • an O-linked sugar chain to which galactose is not bound refers to N-acetylgalactosamine (GalNAc) bound via the —OH group of the Ser or Thr amino acid residue of a protein to galactose (Gal).
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • An O-linked sugar chain that is not bonded Specific examples include the above Tn antigen and sialyl Tn antigen.
  • O-linked sugar chains to which galactose is not bound are intermediates in the synthesis pathway of normal O-linked sugar chains, and are usually hardly present in glycoproteins in normal cells, such as cancer and nephropathy. Expression is confirmed in certain diseases.
  • an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is referred to as an abnormal sugar chain
  • a protein to which the abnormal sugar chain is bound is referred to as a sugar chain-deficient protein
  • CD27 to which the abnormal sugar chain is bound is referred to as a sugar chain-deficient CD27.
  • amino acid residues in a polypeptide to which an O-linked sugar chain binds include serine (Ser) and threonine (Thr) amino acid residues in the amino acid sequence of the extracellular region of CD27 protein.
  • the amino acid residue in the polypeptide to which the O-linked sugar chain binds represents the O-linked sugar chain binding consensus sequence as NetOGlyc3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/). It can be confirmed using sequence search software such as Alternatively, a specific sugar chain binding site can be identified by performing mass spectrometry (MS) analysis of a glycoprotein having an O-linked sugar chain.
  • MS mass spectrometry
  • an O-linked sugar chain binds to any Ser or Thr residue in the amino acid sequence of CD27 protein.
  • the 118th Thr, 127th Ser, 129th Thr, 132th Ser, 133th Ser, 137th Ser, and 143rd of the CD27 protein represented by SEQ ID NO: 2 are obtained.
  • Examples include a sugar chain binding site consisting of at least one amino acid residue selected from Thr, 149th Ser, 156th Thr, 162th Thr, 173th Thr, 175th Ser, and 176th Thr.
  • the number of O-linked sugar chains that bind to the extracellular region per molecule of CD27 protein may be as long as the O-linked sugar chain is bound to at least one Ser residue or Thr residue.
  • the number of chains is not limited.
  • sugar chain-deficient CD27 As a method for obtaining a cell expressing CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound (hereinafter referred to as sugar chain-deficient CD27) according to the present invention, for example, in an O-linked sugar chain synthesis process, An enzyme that adds Gal to N-acetylgalaxamine (GalNAc) bound to Ser / Thr on a polypeptide, a protein involved in the activity of the enzyme, or uridine 5′-diphosphate-galactose (UDP-galactose) By introducing DNA encoding CD27 into a cell line in which the activity of the protein involved is reduced or deleted, a sugar chain-deficient CD27-expressing cell can be produced.
  • GalNAc N-acetylgalaxamine
  • UDP-galactose uridine 5′-diphosphate-galactose
  • CD27 expression having an O-linked sugar chain to which galactose is not bound is caused by allowing a sugar chain cleaving enzyme such as sialidase and galactosidase to act on cells expressing CD27 containing a normal O-type sugar chain. It is also possible to produce cells.
  • a sugar chain cleaving enzyme such as sialidase and galactosidase
  • an enzyme that adds Gal to GalNAc bound to Ser or Thr on a polypeptide include ⁇ 1,3-galactosyltransferase [The Journal of Biological Chemistry, 277, 178-186 (2002)].
  • CD27-expressing cells derived from patients with IgA nephropathy encode an enzyme that adds Gal to GalNAc bound to Ser / Thr on a polypeptide, a protein involved in the activity of the enzyme, a protein involved in UDP-galactose transport, etc. Since the activity of the enzyme is reduced or lost due to addition, deletion or substitution in the DNA to be used, it can be used as a CD27-expressing cell.
  • proteins involved in UDP-galactose transport include UDP-galactose transporter.
  • As cell lines in which the activity of UDP-galactose transporter is reduced or deficient for example, Lec8 cells [Glycobiology. 1,307-14 (1991)].
  • the cell expressing sugar chain-deficient CD27 is obtained by, for example, a cell endogenously present in the human body, a cell line established from a cell endogenously present in the human body, or a gene recombination technique. Cells.
  • an enzyme that adds Gal to GalNAc bound to Ser / Thr on a polypeptide, a protein involved in the activity of the enzyme, or UDP-galactose transport Examples include cell lines that have reduced or deficient activities such as proteins involved, and cells that have similar properties and exist endogenously in the human body.
  • Cells endogenously present in the human body include enzymes that add Gal to GalNAc bound to Ser / Thr on a polypeptide, proteins involved in the activity of the enzyme, or UDP- A cell line in which the activity of a protein involved in the transport of galactose is reduced or lost is preferred.
  • cells in which CD27 protein is expressed in an IgA nephropathy patient body or a cancer patient body can be mentioned.
  • the cells include cells expressing CD27 protein among immune-related cells or tumor cells obtained by biopsy or the like.
  • Cells obtained by gene recombination technology include, for example, an enzyme that adds Gal to GalNAc bound to Ser / Thr on a polypeptide, a protein involved in the activity of the enzyme, or UDP in an O-linked sugar chain synthesis process.
  • -Expressing sugar chain-deficient CD27 by preparing a host cell with reduced or deficient activity such as protein involved in galactose transport, and introducing an expression vector containing cDNA encoding the polypeptide of interest into the host cell Cells.
  • the enzyme activity is reduced.
  • IgA antibody-expressing cells derived from a deficient IgA nephropathy patient can be mentioned.
  • examples of a method for producing a sugar chain-deficient CD27 protein include a method for expressing and purifying a sugar chain-deficient CD27 protein using the above-mentioned CD27-expressing cells.
  • a sugar chain-deficient CD27 protein for example, it can be obtained by expressing it as a fusion protein of CD27 protein and another substance and purifying it.
  • Examples of the substance to be fused with the CD27 protein include polypeptides such as antibody constant region, antibody Fc region, GST tag, histidine tag (also referred to as His tag), and Myc tag.
  • the fusion protein can be separated and purified by using an affinity column such as Protein A, a nickel column and a specific antibody column.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention has binding activity against the sugar chain-deficient CD27 cells or sugar chain-deficient CD27 obtained as described above.
  • the binding of the antibody of the present invention or the antibody fragment to a sugar chain-deficient CD27 protein can be achieved by, for example, using a known immunological detection method, preferably a fluorescent cell staining method, etc. It can be confirmed by a method for confirming the binding property of an antibody to a specific antigen.
  • Examples of the monoclonal antibody in the present invention include an antibody produced by a hybridoma and a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • the hybridoma is prepared, for example, by using cells expressing the above-mentioned sugar chain-deficient CD27 as an antigen, inducing antibody-producing cells having antigen specificity from an animal immunized with the antigen, and further, the antibody-producing cells and myeloma cells. And can be prepared.
  • a sugar chain-deficient CD27 antibody can be obtained by culturing the hybridoma or administering the hybridoma cell to an animal to cause the animal to undergo ascites tumor, and separating and purifying the culture medium or ascites.
  • the antibody of the present invention also includes an antibody produced by a hybridoma prepared by obtaining a cell capable of producing an antibody from such an animal, immunizing the cell in vitro, and then fusing it with a myeloma cell. Is done.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by an antibody-producing cell of a single clone, recognizes only one epitope (also referred to as an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody. .
  • epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure consisting of amino acid sequences, a three-dimensional structure consisting of amino acid sequences to which sugar chains are bound, and amino acid sequences to which sugar chains are bound.
  • the epitope of the monoclonal antibody of the present invention includes the three-dimensional structure of the sugar chain-deficient CD27 protein.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be any antibody as long as it recognizes and binds to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27.
  • monoclonal antibody KM4026 produced by hybridoma KM4026, monoclonal antibody that competes with monoclonal antibody KM4026 and binds to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27, and sugar chain-deficient CD27 to which monoclonal antibody KM4026 binds
  • monoclonal antibody that binds to an epitope present in the extracellular region can be mentioned.
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include the monoclonal antibody KM4027 produced by the hybridoma KM4027, the monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody KM4027 and binds to the extracellular region of the sugar chain-deficient CD27, and the sugar chain to which the monoclonal antibody KM4027 binds. Also included are monoclonal antibodies that bind to an epitope present in the defective extracellular region of CD27.
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include, for example, the monoclonal antibody KM4028 produced by the hybridoma KM4028, the monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody KM4028 and binds to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27, and the sugar chain to which the monoclonal antibody KM4028 binds. Also included are monoclonal antibodies that bind to an epitope present in the defective extracellular region of CD27.
  • monoclonal antibody KM4030 produced by hybridoma KM4030
  • monoclonal antibody that competes with monoclonal antibody KM4030 and binds to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27 and monoclonal antibody KM4030 binds.
  • a monoclonal antibody that binds to an epitope present in the extracellular region of the sugar chain-deficient CD27 is also included.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes the monoclonal antibody KM4031 produced by the hybridoma KM4031, the monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody KM4031 and binds to the extracellular region of the sugar chain-deficient CD27, and the sugar chain to which the monoclonal antibody KM4031 binds. And monoclonal antibodies that bind to an epitope present in the defective extracellular region of CD27.
  • the monoclonal antibody that binds to the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds include monoclonal antibodies that bind to an epitope existing in the extracellular region of the sugar chain-deficient CD27 recognized by various monoclonal antibodies as described above. It is done.
  • Hybridoma KM 4030 is based on the Budapest Treaty dated June 5, 2008, and is a FERM BP at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (305-6586, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan). -Deposited as 10976.
  • gene recombinant antibodies include antibodies produced by gene recombination techniques such as human chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and antibody fragments. Recombinant antibodies having antigen binding activity, low antigenicity, and extended blood half-life are preferred as therapeutic agents.
  • the human chimeric antibody is a non-human antibody heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and light chain variable region (hereinafter referred to as VL) and a human antibody heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH). ) And a light chain constant region (hereinafter referred to as CL).
  • VH non-human antibody heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CH human antibody heavy chain constant region
  • CL a light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention can be produced as follows. That is, the monoclonal antibody that specifically recognizes sugar chain-deficient CD27 and binds to the extracellular region of the present invention, or the monoclonal antibody that specifically recognizes sugar chain-deficient CD27 and binds to the extracellular region.
  • CDNAs encoding VH and VL are obtained from the produced hybridomas and inserted into expression vectors for animal cells having genes encoding human antibodies CH and CL to construct human chimeric antibody expression vectors. It can be prepared by introducing an antibody into the antibody and expressing the antibody.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class. Furthermore, any of subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to the hIgG class can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • Examples of the human chimeric antibody of the present invention include the following human chimeric antibodies (1) to (5).
  • a human chimeric antibody in which the VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 and the VL of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 (2) The VH of the antibody is SEQ ID NO: 26
  • Examples of the human chimeric antibody of the present invention include the following human chimeric antibodies (1) to (5).
  • the VH of the antibody is a VH including the amino acid sequences of CDR1 to 3 represented by SEQ ID NOs: 40 to 42, and the VL of the antibody includes the amino acid sequences of CDR1 to 3 represented by SEQ ID NOs: 43 to 45
  • Human chimeric antibody (2)
  • VL is a VH in which the VH of the antibody includes the amino acid sequences of CDR1 to 3 represented by SEQ ID NOs: 46 to 48, and the VL of the antibody is a CDR1 represented by SEQ ID NOs: 49 to 51
  • the human chimeric antibody (3) which is a VL comprising the amino acid sequence of ⁇ 3
  • the VH of the antibody is a VH comprising the amino acid sequence of CDR1 to 3 represented by SEQ ID NOs: 52 to 54, and the VL of the antibody is SEQ ID NO: 55
  • a humanized antibody refers to an antibody in which the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of a non-human antibody are transplanted to appropriate positions of VH and VL of a human antibody, and is also referred to as a human-type CDR-grafted antibody or a reshaped antibody (reshaped antibody). .
  • the humanized antibody of the present invention is a VH and VL of a non-human antibody produced from a hybridoma that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and produces a monoclonal antibody that binds to the extracellular region.
  • a cDNA encoding an antibody variable region (hereinafter referred to as V region) in which the CDR amino acid sequence is grafted on the VH and VL frameworks (hereinafter referred to as FR) of any human antibody is constructed, and the human antibody CH
  • FR VH and VL frameworks
  • the VH and VL FR amino acid sequences of the human antibody of the present invention may be any amino acid sequences as long as they are human antibody-derived VH and VL FR amino acid sequences.
  • human antibody VH and VL FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, or Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. The common amino acid sequence of each subgroup of VH and VL of human antibodies described in Health and Human Services (1991) and the like are used.
  • the CH of the humanized antibody of the present invention may be any as long as it belongs to hIg, but is preferably of the hIgG class. Furthermore, any of subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to the hIgG class can be used.
  • the CL of the humanized antibody of the present invention may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • humanized antibody of the present invention examples include the following humanized antibodies (1) to (5).
  • Humanized antibody in which CDR1 to 3 of antibody VH are amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 40 to 42, and CDR1 to 3 of antibody VL are amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 43 to 45 (2) A humanized antibody in which CDRs 1 to 3 of the VH of the antibody are amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 46 to 48 and CDRs 1 to 3 of the VL of the antibody are amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 49 to 51
  • the humanized antibody of the present invention is preferably a humanized antibody containing at least one of the following (a) VH and (b) VL.
  • the number of modifications to be introduced is not limited.
  • B The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97, or the 21st Ile, 40th Pro, 58th Val, 85th Thr, and 87th Tyr in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 Is a VL comprising an amino acid sequence substituted with another amino acid residue
  • VH contained in the humanized antibody of the present invention include 30th Ser, 48th Val, 49th Ser, 77th Asn, and 97th amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96.
  • VH including an amino acid sequence in which 48th Val, 49th Ser, and 97th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 are substituted with other amino acid residues
  • VH including an amino acid sequence in which the 30th Ser and 97th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 are substituted with other amino acid residues
  • the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Gly.
  • An amino acid sequence into which at least one modification selected from substitutions in which the 93rd Val is replaced with Thr, the 97th Ala is replaced with Thr, and the 117th Thr is replaced with Val is introduced.
  • amino acid sequence of the VH include an amino acid sequence into which the following 1 to 7 modifications are introduced.
  • amino acid sequence of VH into which seven modifications have been introduced include, for example, the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 as Asn, the 48th Val in Ile, 49 An amino acid sequence in which the 1st Ser is replaced with Ala, the 77th Asn is replaced with Gly, the 93rd Val is replaced with Thr, the 97th Ala is replaced with Thr, and the 117th Thr is replaced with Val.
  • amino acid sequence of VH into which six modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (7).
  • the 30th Ser is Asn
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Gly
  • the 93rd Val In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, Asn in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, Val in 48th in Ile, and 49th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 Is replaced with Ala
  • 77th Asn is Gly
  • 93rd Val is replaced with Thr
  • 117th Thr is replaced with Val.
  • Val is replaced with Ile
  • the 77th Asn is set to Gly
  • the 93rd Val is replaced with Thr
  • the 97th Ala is replaced with Thr
  • the 117th Thr is replaced with Val.
  • the 30th Ser is Asn
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Gly
  • the 93rd Val is replaced with Val.
  • amino acid sequence of VH into which five modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (21).
  • the 49th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Ala
  • the 77th Asn is Gly
  • the 93rd Val is Thr
  • the 97th Ala is Thr
  • the 117th Amino acid sequence in which Thr is replaced with Val
  • the 48th Val is Ile
  • the 77th Asn is Gly
  • the 93rd Val is Thr
  • 97th Ala the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96
  • the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Ile
  • the 49th Ser is replaced with Ala
  • the 93rd Val is replaced with Thr
  • the 117th Thr is replaced with Val.
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Gly
  • the 93rd Val is Thr
  • the 117th Thr is Val.
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Gly
  • the 93rd Val is Thr
  • the amino acid sequence in which 97th Ala is substituted with Thr (7)
  • the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn
  • 30 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 The amino acid sequence in which the No. Ser is replaced with Asn, the No. 49 Ser with Ala, the No.
  • the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn
  • the 49th Amino acid sequence in which Ser is replaced with Ala, 77th Asn is replaced with Gly, 93rd Val is replaced with Thr, and 97th Ala is replaced with Thr.
  • the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn, and the 48th Val. Is replaced with Ile, 77th Asn is Gly, 93rd Val is replaced with Thr, and 97th Ala is replaced with Thr.
  • the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is represented by Asn and the 48th Val. Is replaced by Ile, 49th Ser by Ala, 77th Asn by Gly, and 117th Thr by Val.
  • amino acid sequence of VH into which four modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (35).
  • Sequence (13) An amino acid in which the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Ile, the 49th Ser with Ala, the 77th Asn with Gly, and the 117th Thr with Val.
  • Sequence (14) An amino acid in which the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is substituted with Ile, the 49th Ser with Ala, the 77th Asn with Gly, and the 97th Ala with Thr Sequence (15) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, 48th Val is Ile, 49th Ser is Ala, 77th As In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, Asn in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, Thr in the 93rd Val, and 97th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, Asn in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
  • 117 Thr with Val (30) is represented by 30 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 Replace the Ser with Asn, the 49th Ser with Ala, the 93rd Val with Thr, and the 97th Ala with Thr.
  • the 30th Ser is replaced with Asn, the 49th Ser with Ala, the 77th Asn with Gly, and the 117th Thr with Val.
  • the 30th Ser is replaced with Asn, the 49th Ser with Ala, the 77th Asn with Gly, and the 97th Ala with Thr.
  • the 30th Ser is replaced with Asn, the 49th Ser with Ala, the 77th Asn with Gly, and the 93rd Val with Thr.
  • the 30th Ser in Asn, the 48th Val in Ile The amino acid sequence represented by (7) SEQ ID NO: 96 in which the 7th Ala is replaced with Thr and the 117th Thr with Val is 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, 48th Val is Ile,
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 in which the 93rd Val is replaced with Thr and the 117th Thr is replaced with Val is the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, the 48th Val is the Ile
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 in which the 93rd Val is replaced with Thr and the 97th Ala is replaced with Thr is the 30th
  • the 30th Ser is replaced with Asn
  • the 48th Val is replaced with Ile
  • the 77th Asn is replaced with Gly
  • the 93rd Val is replaced with Thr
  • Thr represented by SEQ ID NO: 96
  • the 30th Ser is replaced with Asn
  • the 48th Val is replaced with Ile
  • the 49th Ser is replaced with Ala
  • the 117th Thr is replaced with Val (SEQ ID NO: 96).
  • the 30th Ser is Asn, the 48th Val is Ile, the 49th Ser is Ala, and the 97th Ala.
  • the amino acid sequence substituted with Thr 34)
  • the 30th Ser is Asn
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 93rd Val is The amino acid sequence substituted with Thr (35)
  • the 30th Ser is Asn
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Amino acid sequence substituted with Gly
  • amino acid sequence of VH into which three modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (35).
  • amino acid sequences (1) to (35) An amino acid sequence in which the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Asn, the 48th Val is replaced with Ile, and the 49th Ser is replaced with Ala (2) represented by SEQ ID NO: 96
  • the 30th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 The amino acid sequence in which Ser in Asn, 48th Val is replaced by Ile, and 93rd Val is replaced by Thr (4) The 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn, and the 48th position. The amino acid sequence in which Val is replaced with Ile and the 97th Ala is replaced with Thr (5) The 30th Se in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 Is replaced with Asn, 48th Val is replaced with Ile, and 117th Thr is replaced with Val.
  • the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn
  • the 30th Ser is replaced with Asn
  • the 49th Ser is replaced with Ala
  • the 97th Ala is replaced with Thr.
  • the 30th Ser is Asn, the 49th Ser is Ala, and the 117th The amino acid sequence in which Thr is replaced with Val (10)
  • the 30th Ser is replaced with Asn, the 77th Asn is replaced with Gly, and the 93rd Val is replaced with Thr SEQ ID NO: 11 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, wherein the 30th Ser is replaced with Asn, the 77th Asn is replaced with Gly, and the 97th Ala is replaced with Thr (12) with SEQ ID NO: 96
  • the 30th Ser is replaced with Asn, the 77th Asn is replaced with Gly, and the 117th Thr is replaced with Val.
  • the amino acid sequence in which the 30th Ser in the sequence is substituted with Asn, the 97th Ala with Thr, and the 117th Thr with Val is substituted (16)
  • the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is designated as Ile
  • the 49th Ser is designated as Ile.
  • the 48th amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 Amino acid sequence in which al is replaced with Ile, 49th Ser is replaced with Ala, and 97th Ala is replaced with Thr (19)
  • the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Ile, 49th Amino acid sequence in which Ser is replaced with Ala and 117th Thr is replaced with Val (20)
  • the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Ile, the 77th Asn is Gly, and the 93rd The amino acid sequence in which Val is substituted with Thr (21)
  • the 48th Val is replaced with Ile, the 77th Asn is replaced with Gly, and the 97th Ala is replaced with Thr Sequence (22)
  • the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 Amino acid sequence in which al is replaced with Ile, 49th Ser is replaced with Ala, and 97th Ala is replaced
  • Substituted amino acid sequence (24) Amino acid sequence (25) in which the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Ile, the 93rd Val is replaced with Thr, and the 117th Thr is replaced with Val
  • Amino acid sequence represented by substituting Thr for Thr and 117th Thr for Val (31) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 in which the 49th Ser in Ala, the 97th Ala in Thr, and the 117th Thr in Val is replaced with Gly
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 the 93rd Val in Thr and the 93rd Val in Thr and the 97th Ala in Thr are replaced with Gly.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 the 77th Asn is Gly, the 97th Ala is Thr, and the 117th Thr is Val.
  • the 93rd Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 was replaced with Thr, the 97th A A to Thr, and the amino acid sequence obtained by replacing 117 th Thr with Val
  • amino acid sequence of VH into which two modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (21).
  • amino acid sequences (1) to (21). An amino acid sequence in which the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Asn and the 48th Val is replaced with Ile (2) the 30th amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 was replaced with Asn, and the 77th Asn was replaced with Gly.
  • Amino acid sequence (4) An amino acid sequence in which the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Asn and the 93rd Val is replaced with Thr (5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 An amino acid sequence in which the 30th Ser is replaced with Asn and the 97th Ala is replaced with Thr. (6) 3 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 The amino acid sequence in which the No. Ser is replaced with Asn and the 117th Thr is replaced with Val. (7) The 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Ile, and the 49th Ser is replaced with Ala.
  • Amino acid sequence (8) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, the 48th Val is replaced with Ile and the 77th Asn is replaced with Gly (9) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96, the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 was replaced with Ile, and the 97th Ala was replaced with Thr.
  • the amino acid sequence substituted with (11) The 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 was replaced with Ile and # 117 In the amino acid sequence (12) of SEQ ID NO: 96, in which Thr was substituted with Val, the 49th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 and the amino acid sequence (13) of SEQ ID NO: 96 in which 77th Asn was substituted with Gly
  • the 49th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 in which the 49th Ser is replaced with Ala and the 93rd Val is replaced with Thr and the Ala
  • Amino acid sequence in which 97th Ala is replaced with Thr (15) Amino acid sequence in which 49th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Ala and 117th Thr is replaced with Val (16) SEQ ID NO: In the amino acid sequence represented by 96, the 77th Asn is substituted with Gly, and the 93
  • amino acid sequence of VH into which one modification has been introduced include the following amino acid sequences (1) to (7).
  • An amino acid sequence in which the 30th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is substituted with Asn (2) An amino acid sequence in which the 48th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is substituted with Ile (3) Amino acid sequence in which the 49th Ser in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is substituted with Ala (4) Amino acid sequence in which the 77th Asn in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is substituted with Gly (5) Amino acid sequence in which the 93rd Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Thr (6) Amino acid sequence in which the 97th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is replaced with Thr (7) Amino acid sequence in which Thr at 117th in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96
  • More specific amino acid sequences of VH of the humanized antibody of the present invention include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 96, 105 and 107.
  • VL contained in the humanized antibody of the present invention include, for example, 21st Ile, 40th Pro, 58th Val, 85th Thr, and 87th in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97. VL including an amino acid sequence in which Tyr is substituted with another amino acid residue. *
  • the 40th Pro, 58th Val, and 87th Tyr in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 are substituted with other amino acid residues.
  • the amino acid sequence made is preferred.
  • the 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is Leu
  • the 40th Pro is Leu
  • the 58th Val is Ile
  • the 85th Thr is Ala.
  • an amino acid sequence into which at least one modification selected from a modification in which the 87th Tyr is substituted with Phe is introduced.
  • amino acid sequence of VH include an amino acid sequence into which the following 1 to 5 modifications are introduced.
  • amino acid sequence of VL into which five modifications are introduced is, for example, 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 as Leu, 40th Pro as Leu, 58
  • amino acid sequence of VL into which four modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (5).
  • amino acid sequence of VL into which three modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • the amino acid sequence in which the 21st Ile is replaced with Leu, the 40th Pro is replaced with Leu, and the 85th Thr is replaced with Ala
  • 21st in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 The amino acid sequence in which the Ile was replaced with Leu, the 40th Pro replaced with Leu, and the 87th Tyr replaced with Phe (4)
  • the 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 was replaced with Leu, and the 58th
  • the amino acid sequence in which Val is replaced with Ile and the 85th Thr is replaced with Ala (5) 21st Il in the amino acid sequence represented
  • the 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is replaced with Leu, and the 85th Thr. Is replaced with Ala, and the 87th Tyr is replaced with Phe.
  • the 40th Pro in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is Leu, the 58th Val is Ile, and the 85th Amino acid sequence in which Thr is replaced with Ala (8)
  • the 40th Pro is replaced with Leu
  • the 58th Val is replaced with Ile
  • the 87th Tyr is replaced with Phe.
  • the 58th Val in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is Ile, the 85th Thr is Ala, and the 87th The amino acid sequence obtained by replacing yr in Phe
  • amino acid sequence of VL into which two modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (10).
  • amino acid sequences (1) to (10) An amino acid sequence in which the 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is replaced with Leu, and the 40th Pro is replaced with Leu
  • the 21st amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97, the 21st Ile was replaced with Leu, and the 85th Thr was replaced with Ala.
  • Amino acid sequence (4) Amino acid sequence in which 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is replaced with Leu and 87th Tyr is substituted with Phe (5)
  • the amino acid sequence of the VL into which one modification is introduced is an amino acid sequence in which the 21st Ile in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is replaced with Leu, and the 40th Pro is changed to Leu.
  • Examples include a substituted amino acid sequence, an amino acid sequence in which the 58th Val is replaced with Ile, an amino acid sequence in which the 85th Thr is replaced with Ala, and an amino acid sequence in which the 87th Tyr is replaced with Phe.
  • VL of the humanized antibody of the present invention include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97.
  • humanized antibody of the present invention include the following antibodies (1) to (5).
  • Human antibodies originally refer to antibodies that exist endogenously in the human body, but human antibody phage libraries and human antibody productions created by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • human lymphocytes can be cultured by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, and cloning.
  • the antibody can be purified from Seiyo.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule consisting of two complete heavy and light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and generating it.
  • a human antibody production method from a human antibody-producing transgenic animal is obtained by obtaining and culturing a human antibody-producing hybridoma by a hybridoma production method performed in a normal non-human animal. Production can be accumulated.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited. Molecular Cloning 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc., and the number that can be deleted, substituted, or added by known techniques such as site-directed mutagenesis.
  • the number is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the above antibody indicates the following. It means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in any and one or more amino acid sequences in the same sequence. In addition, deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added may be either a natural type or a non-natural type.
  • natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and L-cysteine.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • ADCC activity examples include ADCC activity, CDC activity, antibody-dependent phagocytic activity (ADCP), and opsonization effect, and can be controlled by various methods.
  • ADCP antibody-dependent phagocytic activity
  • Examples of the method for controlling effector activity include a method for controlling a sugar chain bound to an Fc region of an antibody, a method for modifying an amino acid residue of an Fc region of an antibody, and the like.
  • a method for controlling a sugar chain bound to the Fc region of an antibody for example, a method of reducing ADCC and CDC activity by removing the 297th sugar chain of an IgG antibody [Molecular Immunology, 32, 1311, (1995) , WO 2008/030564] and a method for reducing CDC activity by reducing the binding of galactose to the Fc region of an antibody.
  • the N of the base to which the sugar chain is bound -A method for producing an antibody containing a sugar chain in which fucose is not bound to acetylglucosamine (GlcNAc) (US7, 214, 775, US6, 946, 292), producing an antibody containing a sugar chain in which bisecting GlcNAc is bound [Nature Biotechnology, 17, 176, (1999)], a method of producing an antibody having a sugar chain bound to galactose (Gal) bound to a non-reducing end [Hum. Antibody. Hybridomas, 5, 143-151, (1994)].
  • GlcNAc acetylglucosamine
  • Examples of a method for altering amino acid residues in the Fc region of an antibody include a method of controlling effector activity by altering the amino acid of an Fc region of an antibody (JBC, 277, 26733-26740, 2002). , US 6,737,056, US 7,297,775, US 2007/0020260, WO 2005/070963), and a method for controlling effector activity by performing domain exchange between subclasses of the Fc region of an antibody (International Publication No. 2007/011041).
  • antibody fragment of the present invention examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody, and dsFv.
  • antibody fragment of the present invention examples include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, scFv, diabody, dsFv, and a peptide containing CDR.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain), and about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonds. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody specifically recognizing the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binding to the extracellular region with the proteolytic enzyme papain. Alternatively, it can be produced by inserting a DNA encoding the Fab of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • F (ab ′) 2 has a molecular weight of about 100,000, which is obtained by decomposing the lower part of two disulfide bonds in the hinge region of IgG with the enzyme pepsin, and is composed of two Fab regions joined at the hinge portion. It is a fragment having the antigen binding activity.
  • the F (ab ′) 2 of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody specifically recognizing the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binding to the extracellular region with the proteolytic enzyme pepsin.
  • Fab ′ described below can be prepared by thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • the Fab ′ of the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binds to the extracellular region with a reducing agent dithiothreitol.
  • a DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to be expressed and produced. it can.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P), and has antigen-binding activity. It is an antibody fragment having
  • the scFv of the present invention specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and obtains cDNAs encoding VH and VL of monoclonal antibodies that bind to the extracellular region, and constructs DNA encoding scFv
  • the DNA can be expressed and produced by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • Diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains a monoclonal antibody that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binds to the extracellular region, and the scFv-encoding DNA has a length of 8 amino acid sequences of P. Constructed so that there are no more than the residues, and the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic organisms to be expressed and produced. Can do.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
  • the dsFv of the present invention specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and obtains cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody that binds to the extracellular region, and constructs a DNA encoding dsFv
  • the DNA can be expressed and produced by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide comprising the CDR of the present invention constructs DNA encoding the CDRs of VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binds to the extracellular region, Can be expressed and produced by inserting the expression vector into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • a monoclonal antibody or antibody fragment that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binds to the extracellular region is chemically or genetically engineered with a drug, protein, radioisotope, or the like. Conjugates with antibodies conjugated to
  • the conjugate of the present invention specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binds to the extracellular region on the N-terminal side or C-terminal side of the H or L chain of the monoclonal antibody or antibody fragment thereof.
  • Chemical techniques [Introduction to antibody engineering, Osamu Kanemitsu, chemical drugs, proteins, radioisotopes, etc., on appropriate substituents or side chains in antibodies or antibody fragments thereof, and sugar chains in antibodies or antibody fragments thereof, etc. It can be manufactured by combining with the Jinshoshokan (1994)].
  • a DNA encoding a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 protein of the present invention and binds to the extracellular region and a DNA encoding the protein to be bound are linked and expressed. It can also be produced by genetic engineering techniques such as inserting into a vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic host cell.
  • Examples of the drug include a chemotherapeutic agent, an antibody drug, an immunostimulant, and a polymer drug.
  • proteins examples include cytokines, growth factors, and toxin proteins.
  • the drug to be bound to the antibody or the antibody fragment may be in the form of a prodrug.
  • the prodrug in the present invention refers to a drug that is chemically modified by an enzyme or the like present in a tumor environment and converted into a substance having an action of damaging cancer cells.
  • chemotherapeutic agents include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, plant-derived alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapeutic agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P glycoprotein inhibitors Any chemotherapeutic agent such as an agent, platinum complex derivative, M phase inhibitor and kinase inhibitor is included.
  • chemotherapeutic agents include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU).
  • Doxorubicin (adriamycin), doxorubicin lipo (doxyl), epirubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, daunorubicin lipo (daunosome), procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, methotrexine, 5-fluorouracilin, brasurabin , Pepomycin, estramustine, paclitaxel (Taxo ), Docetaxel (taxotea), aldesleukin, asparaginase, busulfan, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, cladribine, camptothecin, CPT-11, 10-hydroxy-7-ethyl-camptothecin (SN38), floxuridine, fludarabine, hydroxyurea , Ifosfamide, idarubicin, mesna, irinotecan, nogitecan
  • Examples of the method of binding the chemotherapeutic agent and the antibody include, for example, a method of binding between the amino group of the chemotherapeutic agent and the antibody via glutaraldehyde, and an amino group of the chemotherapeutic agent and the antibody via water-soluble carbodiimide. And the like, and the like.
  • Examples of the antibody drug include an antigen against which apoptosis is induced by antibody binding, an antigen involved in tumor pathogenesis or an antigen that regulates immune function and an antigen involved in angiogenesis of a lesion site.
  • antigens whose apoptosis is induced by antibody binding include, for example, Cluster of differentiation (hereinafter referred to as CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, Examples include CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA) -Class II, and EGFR.
  • CD Cluster of differentiation
  • Antigens involved in tumor pathogenesis or antigens that regulate immune function include, for example, CD4, CD40, CD40 ligand, B7 family molecules (eg, CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 and B7-H4, etc.), B7 family molecule ligands (eg CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 and BTLA, etc.), OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor necrosis factor (TNF) receptor family Molecules (eg, DR4, DR5, TNFR1 and TNFR2), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL) family molecules, TRAIL family molecule receptor family -(TRAIL-R1) TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANK), RANK ligand, CD25, folate receptor 4, cytokines
  • antigens for antibodies that inhibit angiogenesis of a lesion site include, for example, vascular electrical growth factor (VEGF), anangiopoietin, fibroblast growth factor (FGF), EGF, and platelet-derived GF. IGF), erythropoietin (EPO), TGF ⁇ , IL-8, Ephilin, SDF-1, and the like, and their receptors.
  • VEGF vascular electrical growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF fibroblast growth factor
  • IGF erythropoietin
  • TGF ⁇ IL-8
  • Ephilin Ephilin
  • SDF-1 SDF-1
  • the immunostimulant may be a natural product known as an immunoadjuvant, and specific examples include ⁇ -1,3-glucan (for example, lentinan and schizophyllan), ⁇ -galactosylceramide ( KRN7000), microbial cell powder (for example, picibanil and BCG), and microbial cell extract (for example, krestin).
  • ⁇ -1,3-glucan for example, lentinan and schizophyllan
  • KRN7000 ⁇ -galactosylceramide
  • microbial cell powder for example, picibanil and BCG
  • microbial cell extract for example, krestin
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide.
  • PEG polyethylene glycol
  • albumin dextran
  • polyoxyethylene polyoxyethylene
  • styrene maleic acid copolymer polyoxyethylene
  • polyvinyl pyrrolidone polyvinyl pyrrolidone
  • pyran copolymer examples include hydroxypropyl methacrylamide.
  • Examples of a method for binding PEG to an antibody include a method of reacting with a PEGylation modifying reagent [Bioconjugate pharmaceutical, Yodogawa Shoten (1993)].
  • PEGylation modifying reagents include lysine ⁇ -amino group modifiers (JP-A 61-178926, JP), aspartic acid and glutamic acid carboxyl group modifiers (JP-A 56-23587, JP). And guanidino group modifier of arginine (Japanese Patent Laid-Open No. 2-117920).
  • the cytokine or growth factor may be any cytokine or growth factor that enhances cells such as NK cells, macrophages, and neutrophils.
  • cytokine or growth factor that enhances cells such as NK cells, macrophages, and neutrophils.
  • IFN interferon
  • INF- ⁇ interferon
  • INF- ⁇ cytokine or growth factor that enhances cells
  • IL-2 interferon
  • IL-12 IL-15
  • IL-18 IL-21
  • IL-23 granulocyte stimulating factor
  • G-CSF granulocyte stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte / macrophage stimulating factor
  • M-CSF macrophage stimulating factor
  • toxin protein examples include ricin, diphtheria toxin, ONTAK, and the like, and also include protein toxins in which mutations are introduced into the protein to control toxicity.
  • radioactive isotopes examples include 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 199Tc, 77Lu, 211At, Re186, Re188, and In111.
  • the radioactive isotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like. Further, a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody. Examples of the chelating agent include methylbenzyldiethylene-triaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • the antibody used in the present invention and one or more other drugs can be administered in combination, or radiation irradiation can be combined.
  • other drugs include the chemotherapeutic agents, antibody drugs, immunostimulants, cytokines or growth factors described above.
  • Radiation irradiation includes photon (electromagnetic wave) irradiation such as X-ray and ⁇ -ray, particle beam irradiation such as electron beam, proton beam and heavy particle beam.
  • photon electromagnetic wave
  • particle beam irradiation such as electron beam, proton beam and heavy particle beam.
  • the method of administration in combination may be simultaneous administration with the antibody used in the present invention, or may be administered before or after administration of the antibody used in the present invention.
  • Examples of the detection method, quantification method, detection reagent, quantification reagent or diagnostic agent of the present invention include a method in which a specific label is labeled with the antibody of the present invention.
  • Examples of the label include those used in usual immunological detection or measurement methods, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase and luciferase, luminescent substances such as acridinium ester and lophine, fluorescein isothiocyanate (FITC) And fluorescent substances such as trimethylrhodamine (RITC).
  • an expression vector containing cDNA encoding CD27 full-length or a partial length thereof is converted into Ser / Thr on the polypeptide in the O-linked sugar chain synthesis process.
  • a yeast, insect cell, animal cell or the like in which the activity of the enzyme that adds Gal to GalNAc bound to, the protein involved in the activity of the enzyme or the protein involved in UDP-galactose transport is reduced or deleted, A sugar chain-deficient CD27 serving as an antigen or a cell expressing a sugar chain-deficient CD27 can be obtained.
  • a method of preparing an antigen by purifying sugar chain-deficient CD27 from various human-derived cultured cells, human tissues, etc. that express a large amount of sugar chain-deficient CD27 in a cell membrane or in a culture solution, or sugar chain-deficient CD27 A synthetic peptide having the partial sequence of can be prepared and used as an antigen.
  • a sugar chain-deficient CD27 can be obtained by adding a sugar chain to CD27 expressed and purified using a prokaryote such as Escherichia coli having no sugar chain addition ability in a test tube.
  • an expression vector containing cDNA encoding CD27 full-length or a partial length thereof into a host cell such as yeast, insect cell, animal cell or the like having a normal O-linked sugar chain synthesis process, Cells expressing CD27 having normal O-linked sugar chains can be obtained, and CD27 protein having normal O-linked sugar chains can be purified from the cells.
  • the protein or expression cell of CD27 having a sugar chain-deficient CD27 and a normal O-linked sugar chain obtained as described above is used. Can be used.
  • Polypeptides used in the present invention include Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Current Protocols IN Molecular & Bio7, etc.
  • the polypeptide-encoding DNA can be used and expressed in a host cell.
  • a recombinant vector is prepared by inserting cDNA encoding the full-length polypeptide downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion based on the full-length cDNA may be prepared, and the DNA fragment may be used in place of the full-length cDNA.
  • a transformant producing a polypeptide can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • any Escherichia coli, yeast, insect cell, animal cell, or the like can be used as long as it has an ability to add an O-linked sugar chain and can express a target gene.
  • the expression vector one that can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome and contains an appropriate promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed is used.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the polypeptide used in the present invention can autonomously replicate in the prokaryote, and at the same time, a promoter, ribosome A vector containing a binding sequence, DNA used in the present invention, and a transcription termination sequence is preferred.
  • the recombinant vector may further contain a gene that controls the promoter.
  • expression vectors include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega-8), pQE- QIAGEN), pKYP10 (Japanese Laid-Open Patent Publication No. 58-110600), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)), pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli and phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter and T7 promoter can be mentioned.
  • artificially modified promoters such as a tandem promoter, tac promoter, lac T7 promoter, let I promoter, etc. in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases) as the recombinant vector.
  • the base sequence of the DNA encoding the polypeptide used in the present invention can be substituted so as to be an optimal codon for expression in the host, thereby reducing the production rate of the target polypeptide. Can be improved.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for gene expression in the above recombinant vector, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, E. coli DH5 ⁇ and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia such as E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, E. coli DH5 ⁇ and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • expression vectors include, for example, pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979] Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3 -3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen), pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen) ), PAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93 [International Publication No. 97/10354], and the like.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus promoter e.g., SV40 early promoter
  • Metallothionein promoter e.g., Metallothionein promoter
  • heat shock promoter e.g., heat shock promoter
  • SR ⁇ promoter e.g., Moloney murine leukemia virus promoter and enhancer
  • an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • an enzyme that adds Gal to N-acetylgalaxamine (GalNAc) bound to Ser / Thr on a polypeptide in a sugar chain synthesis pathway, a protein involved in the activity of the enzyme, or uridine 5'-diphosphate Any cell line may be used as long as the activity of a protein involved in the transport of galactose (UDP-galactose) is reduced or deleted.
  • a Lec8 mutant [ACS Symp. Which is a Chinese hamster cell (CHO cell) deficient in UDP-galactose transporter. Ser. 128, 214] (1980)).
  • UDP-galactose transporter also known as UDP-galactose translocator; UGALT
  • core 1 synthase glycoprotein-n-acetylgalactosamine.
  • Examples of cells that do not lack the activity of enzymes and transport proteins related to the sugar chain synthesis pathway include (Namalwa) cells, COS cells that are monkey cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japan). JP-A 63-299).
  • Examples of the target enzyme group include the following.
  • Examples of methods for reducing gene function include, for example, antisense method, ribozyme method [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 96, 1886 (1999)], homologous recombination method [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring HarborPrev (1994), GeneTraP. )], RNA-DNA oligonucleotide (RDO) method, RNA interference (RNAi) method [Nature, 391, 806 (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 15502, (1998), Nature, 395, 854, (1998),] Proc. Natl. Acad. Sci.
  • any method for introducing a vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2.
  • -227075 calcium phosphate method
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a polypeptide can be produced by culturing a transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the polypeptide in the culture, and collecting the polypeptide from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host As a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host, a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122 , 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)] or a medium obtained by adding FCS or the like to these mediums.
  • the culture is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and the presence of 5% CO 2 .
  • transformants derived from microorganisms, animal cells, and the like that possess a recombinant vector incorporating the DNA encoding the polypeptide used in the present invention are cultured according to a normal culture method to produce and accumulate the polypeptide.
  • the polypeptide used in the present invention can be produced by collecting from the culture.
  • Polypeptide production methods include a method for production in a host cell, a method for secretion outside the host cell, and a method for production on the host cell outer membrane.
  • the gene product can be secreted outside the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • Polypeptides can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cells are collected by centrifugation after the completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then suspended by an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. To obtain a cell-free extract.
  • a usual enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical) and cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Method, hydrophobic chromatography method using resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, and electrophoresis method such as isoelectric focusing To obtain a purified preparation It can be.
  • a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical) and
  • the cell When the polypeptide is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is similarly collected and then crushed and centrifuged to collect the insoluble substance of the polypeptide as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble substance of the polypeptide is solubilized with a protein denaturant. After the solubilized solution is diluted or dialyzed to return the polypeptide to a normal three-dimensional structure, a purified product of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide used in the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation.
  • Immunization is performed by administering the antigen subcutaneously or intravenously or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant [for example, Freund's complete adjuvant and aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine, etc.] .
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant and aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine, etc.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) and KLH (Keyhole Lime Hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole Lime Hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen by using an enzyme immunoassay [Antibodies-Alarmoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). A mouse, rat or hamster whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is provided as a source of spleen cells.
  • the spleen In the fusion of spleen cells and myeloma cells, 3 to 7 days after the final administration of the antigen substance, the spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the spleen cells are collected.
  • the spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, and 1 with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65). Treat for ⁇ 2 minutes to remove red blood cells, wash 3 times with MEM medium and provide as spleen cells for fusion.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used.
  • the cell line consists of 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 ⁇ 10 ⁇ 5 M), gentamicin (10 ⁇ g / mL) and fetal calf serum (FCS).
  • 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 ⁇ 10 ⁇ 5 M), gentamicin (10 ⁇ g / mL) and fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • HAT medium hypoxanthine (10 ⁇ 4 mol / L) in normal medium
  • thymidine 1.5 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / L
  • aminopterin 4 ⁇ 10 ⁇ 7 mol / L
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method [first time is HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium is used], and stable and strong antibody titer is obtained. Those found are selected as monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
  • mice Ascites was collected from the mice, centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes) to remove solids, salted out with 40-50% ammonium sulfate, caprylic acid precipitation method, DEAE-Sepharose column, protein A- Purification is carried out using a column or gel filtration column, and the IgG or IgM fraction is collected and used as a purified monoclonal antibody.
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is calculated from the Raleigh method and absorbance at 280 nm.
  • an expression vector containing cDNA encoding the CD27 polypeptide used in the present invention is introduced into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc. by the method described in this section (1). Or a purified polypeptide or a partial peptide obtained from a gene-transfected cell or a recombinant protein obtained in the above, or a human tissue.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) and KLH (Keyhole limpet hemocyanin) is prepared and used.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • antigens are dispensed into a 96-well plate and immobilized, and then the immunized animal serum, the culture supernatant of a hybridoma producing a monoclonal antibody, or a purified antibody is dispensed and reacted as the first antibody.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • a reaction is performed according to the labeling substance of the second antibody.
  • An antibody that recognizes CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound and competes with a monoclonal antibody that binds to the extracellular region is reacted by adding a test antibody to the above-described binding assay system. You can get it. That is, a monoclonal antibody that competes with the acquired monoclonal antibody for binding to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27 is obtained by screening for an antibody that inhibits the binding of the monoclonal antibody when a test antibody is added. Can do.
  • An antibody that recognizes sugar chain-deficient CD27 and binds to an epitope recognized by a monoclonal antibody that binds to the extracellular region is identified by identifying the epitope of the antibody obtained by the above-described binding assay system, These can be obtained by preparing and immunizing a partial sugar chain-binding peptide or a sugar chain-binding peptide mimicking the three-dimensional structure of an epitope.
  • a recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which DNAs encoding CH and CL of a human antibody are incorporated. It can be constructed by cloning DNAs encoding human antibodies CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • Examples thereof include CH of ⁇ 1 subclass and CL of ⁇ class of human antibodies.
  • DNA encoding CH and CL of human antibodies chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, or cDNA can be used, but cDNA is preferred.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol. , 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSG1bd2-4 [Cytotechnol. , 4, 173 (1990)]
  • pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol. , 13, 79 (1993)].
  • promoters used in animal cell expression vectors include the SV40 early promoter [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)], LTR of Moloney murine leukemia virus [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149,960 (1987)] and immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)].
  • an enhancer used for the expression vector for animal cells an enhancer [Cell, 33,717 (1983)] etc. are mentioned, for example.
  • Recombinant antibody expression vectors can be used with either the type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors, or the type on the same vector (tandem type). Tandem-type recombinant antibody expression in terms of ease of construction of antibody expression vector, ease of introduction into animal cells, and balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells Vector is preferred [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)].
  • tandem recombinant antibody expression vectors include pKANTEX93 [International Publication No. 97/10354] and pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)].
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into vectors such as phages and plasmids to prepare a cDNA library.
  • Recombinant phages or recombinant plasmids having cDNA encoding VH or VL are isolated from the library using DNA encoding the C region portion or V region portion of the mouse antibody as a probe.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence.
  • Any animal other than a human can be used as long as hybridoma cells such as mice, rats, hamsters, and rabbits can be produced.
  • RNA easy kit made by QIAGEN
  • Examples of a method for preparing mRNA from total RNA include an oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring) Harbor Laboratory Press, 1989]].
  • Examples of the kit include OligoTM-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (manufactured by Takara).
  • kits for preparing mRNA from hybridoma cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) and Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from hybridoma cells as a template can be incorporated.
  • Any Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger, F.
  • a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene)
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger, F.
  • the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] and the like, and a base sequence automatic analyzer such as A. L. F.
  • the nucleotide sequence of the cDNA can be determined by analysis using a DNA sequencer (Pharmacia) or the like.
  • the base sequence of the connecting part encodes an appropriate amino acid.
  • VH and VL cDNAs designed to be appropriate restriction enzyme recognition sequences.
  • the cDNAs of VH and VL thus prepared were appropriately upstream of the respective genes encoding the human antibody CH or CL of the humanized antibody expression vector described in (1) of this section 2.
  • Each vector can be cloned so as to be expressed, and a human chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • cDNAs encoding the non-human antibody VH or VL were amplified by PCR using synthetic DNAs having appropriate restriction enzyme recognition sequences at both ends, and the respective genes described in (1) of this section 2 It can also be cloned into a recombinant antibody expression vector.
  • cDNA encoding V Region of Humanized Antibody can be constructed as follows. First, the amino acid sequence of the VH or VL framework region (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is transplanted is selected.
  • the amino acid sequence of the FR to be selected may be any as long as it is derived from a human antibody.
  • FR amino acid sequences of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, common amino acid sequences of each subgroup of FRs of human antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • an FR amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the FR amino acid sequence of VH or VL of the original antibody is selected.
  • the VH or VL FR amino acid sequence of the selected human antibody is grafted with the original antibody CDR amino acid sequence, respectively, and the humanized antibody VH or VL amino acid sequence is designed.
  • the humanized antibody VH can be easily added to the humanized antibody expression vector constructed in (1) of this section 2.
  • cDNA encoding VL can be cloned.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 2, and the desired humanized antibody A plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is obtained.
  • a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene)
  • the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 2, and the desired humanized antibody
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is obtained.
  • a humanized antibody can only have its antigen-binding activity by transplanting only the VH and VL CDRs of a non-human antibody into the VH and VL FRs of a human antibody. [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • humanized antibodies interact directly with the amino acid residues of CDRs or the amino acid residues involved in binding to the antigen in the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies.
  • Amino acid residues and the amino acid residues that maintain the three-dimensional structure of the antibody and are indirectly involved in antigen binding are identified, and those amino acid residues are replaced with the amino acid residues of the original non-human antibody.
  • the lowered antigen binding activity is increased [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • the amino acid residues of human antibody VH and VL FRs can be modified by performing the PCR method described in (4) of this section 2 using synthetic DNA for modification.
  • the base sequence of the amplified product after PCR is determined by the method described in (2) of this section 2, and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • Transient expression of recombinant antibodies can be performed using antibody expression vectors or modified expression vectors. Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which an expression vector is introduced.
  • COS-7 cells (ATCC CRL1651) are generally used because of their high expression level [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991)].
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are determined by enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter referred to as ELISA); Monoclonal Antibodies-Principles, Third Edition, Academic Press ( 1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)], and the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as the host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • mouse SP2 / 0-Ag14 cells (ATCC CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cells (ATCC CRL1580), two types of Chinese hamster ovary cells, CHO / dhFr-cells (ATCC CRL9096) and CHO / DG44 cells [ Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)], Lec13 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)] that has acquired lectin resistance, CHO cells lacking the ⁇ 1,6-fucose transferase gene (international) Publication No. 05/35586, International Publication No. WO 02/31140) and rat YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 cells (ATCC CRL1662) and the like.
  • proteins such as enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex sugar chain, position 1 of fucose is ⁇ -linked
  • a host cell in which the activity of a protein such as an enzyme involved in sugar chain modification or a protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced or deleted, preferably WO 05/35586 CHO cells lacking the ⁇ 1,6-fucose transferase gene described in WO 02/31140 and the like can also be used.
  • G418 sulfate (hereinafter referred to as G418: SIGMA) according to the method disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891. It can be selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as
  • FCS Hybridoma-SFM medium
  • FCS fetal calf serum
  • the recombinant antibody By culturing the obtained transformant in a medium, the recombinant antibody can be expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA method or the like.
  • the transformed strain can increase the expression level of the recombinant antibody using a DHFR amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • the recombinant antibody can be purified from the culture supernatant of the transformed strain using a protein A column [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A LaboratorySports]. Harbor Laboratory (1988)).
  • purification methods usually used in protein purification can be used.
  • it can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration and the like.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain or the whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter referred to as SDS-PAGE: Nature, 227, 680 (1970)] and Western blotting [Monoclonal]. Measurements can be made at Antibodies-Principles and practices, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (1988).
  • the reaction specificity of the purified antibody or antibody fragment of the present invention can be evaluated as follows.
  • Cells expressing normal sugar chains, and enzymes that add Gal to GalNAc bound to Ser / Thr on a polypeptide, protein involved in the activity of the enzyme or uridine 5′- in an O-linked sugar chain synthesis process Production of CD27-expressing cells in which a CD27-encoding nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) is expressed using a cell line in which the activity of a protein involved in transport of diphosphate-galactose (UDP-galactose) is reduced or deleted, as a host Can do.
  • SEQ ID NO: 1 a CD27-encoding nucleotide sequence
  • each of the extracellular domains of CD27 is expressed in the above host cells as a solubilized product such as a fusion protein, and purified under appropriate conditions, thereby preparing a CD27 soluble protein that retains the three-dimensional structure. Can do.
  • the fusion protein examples include those obtained by fusing the CD27 protein with another polypeptide such as an antibody constant region (also referred to as Fc), a GST tag, a histidine tag (also referred to as His tag), or a Myc tag.
  • an antibody constant region also referred to as Fc
  • GST tag a GST tag
  • His tag a histidine tag
  • Myc tag a Myc tag.
  • the fusion protein can be separated and purified by using an affinity column such as Protein A, nickel column or specific antibody column.
  • the reactivity between these purified CD27 soluble protein and the purified antibody can also be measured by BIAcoreTM, ELISA method and immunoprecipitation method using surface plasmon resonance (SPR) [Monoclonal Antibodies-Principles and Principles, Third edition] , Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • SPR surface plasmon resonance
  • Cytotoxic activity against a cultured cell line expressing sugar chain-deficient CD27 is determined by a known method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)].
  • Method for diagnosing disease using monoclonal antibody antibody or antibody fragment thereof that specifically recognizes sugar chain-deficient CD27 of the present invention and binds to the extracellular region By detecting or quantifying cells in which CD27 or the polypeptide is expressed, a disease associated with sugar chain-deficient CD27 can be diagnosed.
  • the disease involving sugar chain-deficient CD27 includes any disease in which cells expressing a sugar chain-deficient CD27 polypeptide are found in vivo. Specific examples include IgA nephropathy or cancer. Examples of cancer include cancers derived from B or T cell differentiation processes.
  • non-Hodgkin lymphomas such as mantle cell lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, small lymphocytic leukemia, Burkitt lymphoma, follicular lymphoma, malt lymphoma, diffuse large cell lymphoma and plasmacytoma. Can be mentioned.
  • the biological sample to be detected or measured for the sugar chain-deficient CD27 polypeptide may contain the polypeptide such as tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid and culture fluid. There is no particular limitation as long as there is.
  • diagnosis of IgA nephropathy can be performed as follows.
  • Detection or measurement of a sugar chain-deficient CD27 polypeptide is performed on a biological sample collected from a plurality of healthy individuals using the antibody of the present invention or the antibody fragment or derivative thereof using the following immunological technique. To confirm the expression level of the polypeptide in the biological sample of a healthy person.
  • the expression level of the polypeptide is also examined in the biological sample of the subject, and the expression level is compared with the expression level of a healthy person.
  • the expression level of the polypeptide in the subject is increased as compared with that of a healthy subject, it can be diagnosed that the subject has IgA nephropathy or is likely to develop IgA nephropathy in the future.
  • cancer can be diagnosed as follows.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment, or a derivative thereof is used to detect or measure sugar chain-deficient CD27 using the following immunological technique, The expression level of the polypeptide in the biological sample of a healthy person is confirmed.
  • the expression level of the polypeptide is also examined in the biological sample of the subject, and the expression level is compared with the expression level of a healthy person.
  • the expression level of the polypeptide in the test subject is increased compared to that of a healthy subject, it can be diagnosed that the cancer is positive.
  • the diagnostic agent containing the antibody of the present invention or the antibody fragment or derivative thereof may contain a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • a reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • Reagents for detection such as antibodies or antibody fragments, or derivatives thereof, labeled secondary antibodies that recognize these derivatives, substrates of labeled substances, etc. Is mentioned.
  • any known method may be used as a method for detecting or measuring the amount of sugar chain-deficient CD27.
  • Examples include immunological detection and measurement methods.
  • the immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • Immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, western blot method And physicochemical methods (for example, TIA, LAPIA, PCIA, etc.).
  • Radioactive substance labeled immunoantibody method includes, for example, reacting an antibody of the present invention or an antibody fragment thereof with an antigen or a cell expressing the antigen, and further subjecting the anti-immunoglobulin antibody or binding fragment to which a radiolabel has been applied.
  • An example is a method of measuring with a scintillation counter after the reaction.
  • an enzyme immunoassay for example, an antigen or antigen-expressing cell is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is reacted. Then, a method of measuring the coloring dye with an absorptiometer is exemplified, and for example, a sandwich ELISA method or the like is used.
  • any known enzyme label edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School
  • any known enzyme label edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School
  • alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, biotin label and the like can be used.
  • the sandwich ELISA method is a method in which an antibody to be bound to a solid phase, an antigen to be detected or measured is trapped, and a second antibody is reacted with the trapped antigen.
  • two types of antibodies or antibody fragments recognizing an antigen to be detected or measured and having different antigen recognition sites are prepared, and one of the antibodies or antibody fragments is pre-plated in a plate (for example, 96 wells). Plate) and the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, biotin and the like.
  • the antigen concentration in the test sample can be calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used for the sandwich ELISA method for example, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, F (ab) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, or a combination of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies or antibody fragments.
  • Fluorescence immunoassay is described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Third edition, Academic Press (1996); Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like. It is done.
  • any known fluorescent label (Akira Kawao, fluorescent antibody method, Soft Science) can be used as described above.
  • FITC label and RITC label can be used.
  • luminescent immunoassay examples include, for example, [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Science, 198, etc. Can be used.
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include, as described above, any known [Imai Kazuhiro, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Laboratory 42 (1998)].
  • any known Imai Kazuhiro, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Laboratory 42 (1998)].
  • an acridinium ester label and a lophine label can be used.
  • a cell or tissue expressing a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is lysed, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the migrated protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with PBS containing 1% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) for 30 minutes at room temperature to perform a blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1% BSA
  • the monoclonal antibody of the present invention is reacted, washed with PBS containing 0.05% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG is reacted at room temperature for 2 hours.
  • Tween-PBS PBS containing 0.05% Tween-20
  • peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG is reacted at room temperature for 2 hours.
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the monoclonal antibody is bound using ECLTM Western blotting detection reagents (manufactured by Amersham). .
  • an antibody used for detection by Western blotting an antibody capable of binding to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method comprises using the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, CD27 binding an O-type sugar chain lacking the antigen galactose and the antibody of the present invention or the antibody fragment. An aggregate is formed by binding, and this aggregate is detected.
  • physicochemical methods include, for example, capillary method, one-dimensional immunodiffusion method, immunoturbidimetric method, and latex immunoturbidimetric method [Proposal for clinical testing method, Kanbara Publishing, 499 (1998)].
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used, and an antigen-antibody reaction is caused by the corresponding antigen or antibody.
  • the scattered light inside increases and the transmitted light decreases.
  • the antigen concentration and the like in the test sample can be measured.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment can bind to the extracellular region of a sugar chain-deficient CD27 polypeptide, it is preferably used for detection of cells expressing the polypeptide.
  • Known immunological detection methods can be used to detect cells in which the polypeptide is expressed, but immunoprecipitation, immunocytostaining, immunohistochemical staining, and the like are preferably used.
  • a fluorescent antibody staining method using an FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can also be used.
  • cells expressing the polypeptide are reacted with the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention, and then a carrier having specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen.
  • a carrier having specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen.
  • This is a method of precipitating an antibody complex.
  • the following method can be used.
  • the above-described antibody of the present invention or the antibody fragment is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS. If the antibody is not purified, such as a hybridoma strain culture supernatant, the anti-mouse immunoglobulin or rat immunoglobulin or protein A or G is preliminarily immobilized on an ELISA 96-well plate. After phasing and blocking with BSA-PBS, the hybridoma strain culture supernatant is dispensed and bound.
  • antigen-expressing cells or tissues are treated with a surfactant and methanol, etc., in some cases to improve antibody passage, and then the antibody of the present invention is reacted. Furthermore, after reacting an anti-immunoglobulin antibody or binding fragment with a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, a biotin label, etc., the label is visualized and viewed under a microscope, or a fluorescent label This is a fluorescent antibody staining method (flow cytometry) in which the antibody and cells are reacted and analyzed with a flow cytometer.
  • a fluorescent label such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase, a biotin label, etc.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof can bind to the extracellular region of sugar chain-deficient CD27, analysis of flow cytometry for detecting CD27 expressed with a natural three-dimensional structure on the cell membrane is detected. Is preferably used.
  • the amount of antigen or antibody can be measured without separating the antigen.
  • Method for treating diseases using a monoclonal antibody or antibody fragment that specifically recognizes and binds to a sugar chain-deficient CD27 polypeptide of the present invention and a cell that specifically recognizes the sugar chain-deficient CD27 polypeptide of the present invention and A monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that binds to the outer region can be used for the treatment of a disease involving a sugar chain-deficient CD27 polypeptide.
  • the disease involving the sugar chain-deficient CD27 polypeptide may be any disease in which cells expressing the polypeptide are found in vivo, and examples thereof include IgA nephropathy and cancer.
  • diseases that develop IgA nephropathy and present nephrotic syndrome and those that exhibit renal failure can also be mentioned as diseases.
  • cancer examples include hematopoietic tumors (also called blood cancers) and epithelial solid cancers.
  • hematological cancers include leukemia and lymphoma (Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma) multiple myeloma.
  • Non-Hodgkin lymphomas include, for example, mantle cell lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, small lymphocytic leukemia, Burkitt lymphoma, follicular lymphoma, malt lymphoma, diffuse large cell lymphoma and plasmacytoma .
  • solid cancer examples include breast cancer, uterine cancer, colon cancer, stomach cancer, ovarian cancer, lung cancer, kidney cancer, rectal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, small intestine cancer, prostate cancer and pancreatic cancer. Can be mentioned.
  • Examples of the therapeutic agent of the present invention include cancer therapeutic agents containing the antibody of the present invention or the antibody fragment as an active ingredient. Cancer therapeutic agents having effector activities such as ADCC activity and CDC activity, cancer therapeutic agents by apoptosis-inducing action, and the like are also included as therapeutic agents of the present invention.
  • the antibody or the antibody fragment of the present invention can recognize the sugar chain-deficient CD27 polypeptide expressed in the cell membrane, it recognizes cells expressing the sugar chain-deficient CD27 polypeptide present in the living body. be able to.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof and the antibody having the effector activity or the antibody fragment can injure cells expressing the sugar chain-deficient CD27 polypeptide in vivo and in vitro.
  • an antibody or antibody fragment of the present invention can be used particularly effectively as a therapeutic agent because it can damage and reduce sugar chain-deficient CD27 polypeptide-expressing cells in vivo.
  • the therapeutic agent containing the antibody of the present invention or the antibody fragment or derivative thereof may contain only the antibody or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient, but is usually pharmacological. It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous can be mentioned.
  • parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous
  • intravenous administration is preferable.
  • administration forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, and tapes.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Preservatives such as esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives.
  • Capsules, tablets, powders and granules, etc. include excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin can be used as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin can be used as additives.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • the injection is prepared using a carrier comprising a salt solution and a glucose solution, and a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the antibody or antibody fragment itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that disperses the antibody or antibody fragment as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • formulations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 8 mg / kg per day for an adult.
  • Example 1 Preparation of soluble CD27 extracellular domain containing O-linked sugar chain to which galactose is not bound (hereinafter sometimes referred to as sugar chain-deficient CD27) (1) Cloning of human CD27 gene A gene encoding CD27 was isolated from a human peripheral blood-derived cDNA library purchased from Clontech by the following procedure. A reaction solution containing 1-fold concentration of BD Advantage PCR buffer (Clontech) and 1-fold concentration of attached dNTP was added to human peripheral blood mononuclear cell-derived single-stranded cDNA 25 ng, 0.2 ⁇ mol / L cd27fw (SEQ ID NO: 3).
  • 0.2 ⁇ mol / L cd27809B (SEQ ID NO: 4) and 1-fold Advantage 2 PCR polymerase Mix (manufactured by Clontech) were used to make a total of 50 ⁇ L, and the PCR reaction was performed.
  • Reaction conditions were 30 cycles of 98 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 30 seconds.
  • the reaction solution was separated by 2% agarose gel electrophoresis, the PCR product of about 1 kbp was inserted into the pCR-2.1 vector using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual.
  • Escherichia coli is transformed with a plasmid inserted with a PCR amplified fragment, and a plasmid obtained from each clone is prepared.
  • pCR 2.1 CD27 having the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 is obtained. (FIG. 1).
  • reaction solution containing 1 ng of plasmid pBShC ⁇ 4 as a template [10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 200 ⁇ M dNTPs, 0.5 ⁇ M Primer 1 (SEQ ID NO: 7) ), 0.5 ⁇ M Primer 2 (SEQ ID NO: 8) and 2 units of TaKaRa Ex Taq DNA polymerase] were prepared using GeneAmp PCR system 9700 (manufactured by PerkinElmer) at 94 ° C. for 2 minutes and at 55 ° C. for 2 minutes. 30 cycles of 2 minutes at 72 ° C. were performed.
  • GeneAmp PCR system 9700 manufactured by PerkinElmer
  • the reaction solution was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the attached instruction manual, treated with restriction enzyme EcoT14I (Takara Bio), separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, The amplified fragment was recovered using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instruction manual.
  • Reaction conditions were 98 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 30 seconds in 25 cycles.
  • a PCR product of about 700 bp was introduced into a pCR-Blunt vector using Zero Blunt PCR Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual.
  • This plasmid was designated as pCRIgG4FcBamHISalI (FIG. 4).
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from a plurality of ampicillin resistant colonies obtained using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), and the restriction enzyme NotI (Takara Bio Inc.) was removed from the expression unit of the antibody L chain. Manufactured) and KpnI (Takara Bio) digestion.
  • the plasmid was named pKANTEX XhoI / SalI (FIG. 5).
  • CD27-Fc The gene sequence of a soluble CD27-Fc fusion protein encoded by the plasmid (hereinafter sometimes referred to as CD27-Fc) is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Escherichia coli transformed with the expression vector was inoculated on 100 mL of LB medium, collected after overnight culture, and the plasmid was purified using Qiafilter Plasmid midi kit (Qiagen) according to the attached protocol.
  • plasmid vector was linearized by digestion with restriction enzyme AatII. After linearization, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were performed and dissolved in 1/10 concentration TE buffer (1 mM Tris HCl, 0.1 mM EDTA). Then, the DNA concentration was measured and used for gene introduction.
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium supplemented with a basic medium [10% fetal bovine dialysis serum (Invitrogen) and 50 ⁇ g / mL Gentamycin (Nacalai Tesque) and 1 ⁇ HT supplement (Invitrogen)] DG44 cells passaged in (Invitrogen)] were added to K-PBS buffer [137 mmol / L KCl, 2.7 mmol / L NaCl, 8.1 mmol / L Na 2 HPO 4 , 1.5 mmol / L KH 2 PO 4. In 4.0 mmol / L MgCl 2 ] to 8 ⁇ 10 6 cells / mL, a cell suspension was prepared.
  • the cell DNA mixture was transferred to Gene Pulser Cuvette (distance between electrodes: 2 mm) (BIO-RAD), and then a gene introduction device Gene Pulser (BIO-RAD) was used. Pulse voltage 0.35 KV, electric capacity Gene transfer was performed under the condition of 250 ⁇ F.
  • the cell suspension was added to HT-medium [Iscove's Modified Dulbecco's Medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine dialysis serum (Invitrogen) and 50 ⁇ g / mL Gentamycin (Nacalai Tesque). It was mixed with 10 mL, seeded in a flask for 75 cm 2 adherent cells (manufactured by Greiner), and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After culturing for 3 days, G418 (manufactured by Sigma) was added to a final concentration of 0.5 mg / mL, and further cultured for 10 days.
  • HT-medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine dialysis serum (Invitrogen) and 50 ⁇ g / mL Gentamycin (Nacalai Tesque). It was mixed with 10 mL,
  • the cells were passaged to a flask for 182 cm 2 adherent cells (manufactured by Greiner), and the culture was continued until confluent.
  • the medium was changed to serum-free medium EXCELL301 (manufactured by JRH Bioscience), and after culturing for 1 week, the culture supernatant was collected and purified by the method described below.
  • the carrier was equilibrated by washing sequentially with 2.0 mL of 0.1 M citrate buffer (pH 3.5) and 1.5 mL of borate buffer.
  • the culture supernatant was passed through a column and washed with 3.0 mL of borate buffer.
  • the antibody adsorbed on the carrier was eluted using 1.25 mL of 0.1 M citrate buffer (pH 3.5).
  • the elution was obtained by dividing 250 ⁇ L into 5 fractions. Next, SDS-PAGE analysis of the obtained purified fraction was performed, and the fractions in which elution of the target protein was confirmed were collected and dialyzed overnight at 4 ° C. using a PBS buffer.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE analysis of the eluted fraction for each protein.
  • CD27-Fc was observed at a molecular weight of about 65 kDa when DG44 was used as a host and at a molecular weight of about 48 kDa when Lec8 was used as a host.
  • each band was observed at a position showing a molecular weight approximately twice that of the band observed under reducing conditions, indicating that CD27-Fc exists as a dimer. It could be confirmed.
  • PVDF membrane (Millipore Immobilon, Cat. No. IPVH304F0) was performed using an ATTO horizon blot at 180 mA for 90 minutes.
  • the transferred membrane was soaked in PBS containing 10% BSA (hereinafter referred to as 10% BSA-PBS) and allowed to stand overnight at 4 ° C. for blocking.
  • 10% BSA-PBS 10% BSA-PBS
  • the anti-RCAS1 antibody clone 22-1-1 (manufactured by MBL) Cat. was prepared to 5 ⁇ g / mL using 1% BSA-PBS. No. D060-3) was added and reacted at room temperature for 2 hours. After washing with 0.05% Tween-20-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Cat. No. 167-1515) for 30 minutes at room temperature, secondary antibody peroxidase label diluted 2000 times with 1% BSA-PBS The mixture was reacted with rabbit anti-mouse immunoglobulin (DAKO, Cat. No. P0161) at room temperature for 1 hour.
  • DAKO rabbit anti-mouse immunoglobulin
  • the molecular weight of DG44-derived CD27-Fc is larger than that of Lec8-derived CD27-Fc.
  • the anti-RCAS1 antibody 22-1-1 has been shown to recognize the Tn antigen, which is an O-linked sugar chain, and is known as an anti-Tn antibody [J. B. C. , 278, 22998-23007, (2003)].
  • the anti-RCAS-1 antibody clone 22-1-1 which is an anti-Tn antibody, did not bind at all to DG44-derived CD27-Fc, but specifically bound to Lec8-derived CD27-Fc. It was confirmed that CD27-Fc produced by Lec8 was bound with a Tn antigen, which is an O-type sugar chain to which galactose was not bound.
  • Example 2 Construction of CHO cells expressing CD27 on the cell membrane (1) Construction of CD27 expression plasmid pKANTEX CD27 A cDNA fragment obtained by removing a cDNA portion unnecessary for gene expression from pCR 2.1 CD27 prepared in Example 1 is shown below. Produced by the PCR reaction shown.
  • Reaction conditions were 98 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 30 seconds in 25 cycles. After separation of the reaction solution by 2% agarose gel electrophoresis, an approximately 800 bp PCR product was introduced into a pCR-Blunt vector using Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen) according to the attached instruction manual. PCR27axc having the DNA sequence of No. 1 was obtained (FIG. 9).
  • an approximately 780 bp DNA fragment obtained by digesting pCR27axc with restriction enzyme NotI and restriction enzyme SalI is obtained by digesting pKANTEX XhoI / SalI prepared in Example 1 with restriction enzyme NotI and restriction enzyme SalI.
  • a plasmid pKANTEX CD27 for expressing CD27 was constructed by ligation to a DNA fragment of about 8.9 kbp (FIG. 10).
  • the CD27 gene sequence encoded by this plasmid is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence translated from the gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • E. coli transformed with the expression vector was seeded in 100 mL of LB medium and cultured overnight. After the culture, the cells were collected, and the plasmid was purified using Qiafilter Plasmid midi kit (Qiagen) according to the attached protocol.
  • plasmid vector was linearized by digestion with restriction enzyme AatII. After linearization, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were performed, and after dissolving in 1/10 concentration TE buffer (1 mM Tris HCl, 0.1 mM EDTA), the concentration was measured and gene introduction was performed.
  • CD27 expression plasmid pKANTEX CD27 prepared in (1) above is introduced into Lec8 cells and CHO / DG44 cells to establish Lec8 cells and DG44 cells that express CD27. Went. The procedure was as described in Example 1 except that pKANTEXCD27 was used as the plasmid to be introduced.
  • the cells after gene transfer were suspended in 30 mL of HT-medium and seeded in three 96-well plates at 100 ⁇ L / well. Two days after sowing, the medium was replaced with a subculture medium containing 500 ⁇ g / mL G418 and cultured for 10 days. Ten days later, the HT-medium containing 50 nM MTX (manufactured by Sigma Aldrich) was exchanged to obtain an MTX resistant strain.
  • the CD27 expression strain derived from the Lec8 strain was named CD27 / Lec8-4, while the DG44 cell-derived CD27 expression cell was named CD27 / DG44-8.
  • CD27-expressing cells 1 to 5 ⁇ 10 6 CD27-expressing cells are collected in a 15 mL tube (Becton Dickinson), centrifuged (1500 rpm, 5 minutes), the supernatant is removed, and 50 ⁇ L of 1% bovine serum albumin is contained. It was suspended in a PBS buffer [hereinafter referred to as 1% BSA-PBS (manufactured by Kojin Bio)].
  • 1% BSA-PBS manufactured by Kojin Bio
  • Example 3 Preparation of monoclonal antibody against CD27 containing O-linked sugar chain to which galactose is not bound (hereinafter referred to as anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody) (1) Preparation of immunogen Lec8 strain production CD27 obtained in Example 1 -Fc 50 ⁇ g with 2 mg of aluminum hydroxide adjuvant (Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99, 1988) and pertussis vaccine (Chiba Serum Research Institute) 1 ⁇ 10 9 cells, 4 weeks old female SD rat Three animals were administered.
  • the spleen was shredded in a MEM (Minimum Essential Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with tweezers, and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). Red blood cells were removed by adding Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.6) to the resulting precipitate fraction and treating for 1 to 2 minutes. The obtained precipitate fraction (cell fraction) was washed 3 times with MEM medium and used for cell fusion.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • binding ELISA The antigens used in the binding ELISA were the Lec8 strain-producing CD27-Fc and the DG44 cell-producing CD27-Fc obtained in Example 1, respectively.
  • the above-mentioned CD27-Fc protein was dispensed at 5 ⁇ g / mL and 50 ⁇ L / well on a 96-well ELISA plate (Greiner) and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption.
  • 1% BSA-PBS was added at 100 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. After standing, 1% BSA-PBS was discarded, and immunized animal antiserum or hybridoma culture supernatant was dispensed to the plate as a primary antibody at 50 ⁇ L / well and left for 2 hours.
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [(ICI trademark Tween 20 equivalent: manufactured by Wako Pure Chemical Industries)]-PBS (hereinafter referred to as Tween-PBS), and then secondary 50 ⁇ L / well of peroxidase-labeled rabbit anti-rat immunoglobulin (Zymed) was added as an antibody and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (ICI trademark Tween 20 equivalent: manufactured by Wako Pure Chemical Industries)]-PBS (hereinafter referred to as Tween-PBS)
  • secondary 50 ⁇ L / well of peroxidase-labeled rabbit anti-rat immunoglobulin (Zymed) was added as an antibody and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] substrate solution [1 mmol / L ABTS-0.1 mol / L citrate buffer (pH 4. 2), 0.1% H 2 O 2 ] was added to develop color, and the absorbance at OD 415 nm was measured using a plate reader (Emax; Molecular Devices).
  • CD27 / Lec8-4 and CD27 / DG44-8 prepared in Example 2 were used as assay cells.
  • CD27 / Lec8-4 and CD27 / DG44-8 passaged with passage medium supplemented with 50 nM MTX and 500 ng / mL G418 were peeled off with 0.05% Trypsin solution (manufactured by Invitrogen) and black 96 well plate for ABI8200 Were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L Medium / well and cultured overnight.
  • rat antiserum or hybridoma culture supernatant was dispensed at 10 ⁇ L / well as a primary antibody, and ALEXA647-labeled anti-rat immunoglobulin G (H + L) (manufactured by Invitrogen) was added at 100 ⁇ L / well as a secondary antibody. And left for 4 hours in the dark.
  • the fluorescence of 650 to 685 nm excited with laser light 633 He / Ne was measured with an ABI 8200 cellular detection system (Applied Bio).
  • CD27 / Lec8-4 and CD27 / DG44-8 prepared in Example 2 were used as assay cells. After stripping CD27 / Lec8-4 and CD27 / DG44-8 passaged using HT-medium supplemented with 50 nM MTX and 500 ⁇ g / mL G418 using 0.02% EDTA solution (Nacalai Tesque) Each cell was washed with PBS.
  • bovine serum albumin bovine serum albumin
  • mouse IgG1 isotype control (manufactured by Cosmo Bio)
  • rat IgG2a isotype control (manufactured by Cosmo Bio) were used as negative controls
  • anti-RCAS1 antibody 22-1-1 (manufactured by MBL) was used as a positive control.
  • an anti-CD27 mouse monoclonal antibody (manufactured by Beckman Coulter, Inc.).
  • ALEXA488-labeled anti-rat immunoglobulin G H + L (manufactured by Invitrogen) was added as a secondary antibody at 50 ⁇ L / well, and protected from light at ice temperature. The reaction was allowed to proceed for 30 minutes. The cells were washed again by centrifugation twice using PBS, and then suspended in 500 ⁇ L of 1% BSA-PBS, and the fluorescence of 510 to 530 nm excited by laser light 488 nm argon was flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter, Inc.) , Cytomics FC500 MPL).
  • mice 8-Azaguanine resistant mouse myeloma cell line P3X63Ag8U. 1 (P3-U1: purchased from ATCC) was cultured in normal medium (10% FCS RPMI medium), and 2 ⁇ 10 7 cells or more were secured at the time of cell fusion, and used as a parent strain for cell fusion.
  • the suspension was centrifuged (900 rpm, 5 minutes), and the cells of the obtained precipitate fraction were loosened gently. Then, the cells were sucked and sucked out with a pipette, and gently put into a HAT medium [10% fetal bovine serum. Suspended in 100 mL of medium added with HAT Media Supplement (manufactured by Invitrogen) in added RPMI medium].
  • HAT medium 10% fetal bovine serum.
  • HAT Media Supplement manufactured by Invitrogen
  • the suspension was dispensed into a 96-well culture plate at 200 ⁇ L / well and cultured at 37 ° C. for 8-10 days in a 5% CO 2 incubator. After culturing, the wells that react with CD27 / Lec8-4 and do not react with CD27 / DG44-8 and Lec8 cells are selected from the culture supernatant using the fluorescent cell staining method described in (3) and (4) above. Then, cloning by limiting dilution was performed twice from the cells contained in the wells to obtain single cell clones.
  • hybridomas KM4030 and KM4031 producing monoclonal antibodies KM4030 or KM4031 that specifically bind to sugar chain-deficient CD27 were established (FIG. 12).
  • hybridomas KM4026, KM4027, and KM4028 producing monoclonal antibodies KM4026, KM4027, or KM4028 that specifically react with sugar chain-deficient CD27 were established.
  • Hybridomas that produce monoclonal antibodies that specifically bind to these sugar chain-deficient CD27s have reduced or deficient activities of DG44 strain and UDP-galactose transporter that are not deficient in enzymes related to the sugar chain synthesis pathway and transport proteins.
  • the recombinant Lec8 strain is used to produce recombinant cells expressing normal sugar chain CD27 and sugar chain-deficient CD27, respectively, and does not bind to normal sugar chain CD27-expressing cells and Lec8 strain, A system capable of screening a monoclonal antibody that specifically binds only to the expressed cells was devised, and obtained by conducting a screening assay of about 6000 well scale.
  • the purified IgG monoclonal antibody was obtained by purification by a caprylic acid precipitation method [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • the determination of the subclass of the monoclonal antibody was performed by a binding ELISA using a subcluster epityping kit (rat monoclonal antibody isotyping kit, manufactured by DS Pharma Biomedical). *
  • each antibody is rat IgG2a class for anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4026, rat IgG2b class for anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4027, rat IgG1 class for anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4028, anti-sugar
  • chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4030 is of the rat IgG2a class and the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4031 is of the rat IgG1 class.
  • Example 4 Examination of reactivity of anti-sugar chain-deficient CD27-specific monoclonal antibody The reaction specificity of anti-glycan-deficient CD27 monoclonal antibodies KM4030 and KM4031 was examined using the competitive ELISA system shown below.
  • the Lec8 strain-produced CD27-Fc obtained in Example 1 was dispensed at a concentration of 5 ⁇ g / mL in a 96-well ELISA plate (manufactured by Greiner) at 50 ⁇ L / well and left at 4 ° C. overnight. Adsorbed.
  • 1% BSA-PBS was added at 200 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. After standing, 1% BSA-PBS was discarded, and diluted anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4030 purified antibody or KM4031 purified antibody was dispensed to the plate at 50 ⁇ L / well as a primary antibody.
  • Lec8-producing CD27-Fc protein, DG44-producing CD27-Fc protein or human immunoglobulin is added as a binding competitor at a concentration of 20, 2, 0.2, 0.02 ⁇ g / mL. Coexisted.
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [(ICI trademark Tween 20 equivalent: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)]-PBS (hereinafter referred to as Tween-PBS)
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • the peroxidase-labeled rabbit anti-rat immunoglobulin was added as a secondary antibody at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] substrate solution [1 mmol / L ABTS-0.1 mol / L citrate buffer (pH 4. 2), 0.1% H 2 O 2 ] was added for color development, and the absorbance at OD 415 nm was measured using a plate reader (Emax; Molecular Devices).
  • FIG. 13 shows the results of a competitive ELISA of anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibodies KM4030 and KM4031.
  • DG44-produced CD27-Fc and human immunoglobulin did not inhibit the binding of anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibodies KM4030 and KM4031 to Tn antigen-binding CD27-Fc, but Tn antigen-binding CD27-Fc inhibited it. It was revealed.
  • FIGS. 28A and 28B show the binding activity of anti-glycan-deficient CD27 monoclonal antibodies KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 and KM4031 to the sugar-deficient CD27-Fc of Biacore by anti-glycan-deficient CD27 chimeric antibody.
  • the evaluation results are shown.
  • the binding activity was measured using Biacore T100 (manufactured by GE Healthcare Bioscience) using the surface plasmon resonance method (SPR method).
  • An anti-human IgG4 antibody (Pharmingen) was immobilized on a CM5 sensor chip (GE Healthcare Biosciences) by an amine coupling method using Amine Coupling Kit (Biacore) according to the attached protocol.
  • measurement samples (anti-glycan-deficient CD27 monoclonal antibodies KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, and KM4031) diluted in 5 steps from 20000 ng / mL are flowed on the chip at a flow rate of 30 ⁇ L / min to obtain sensorgrams of respective concentrations. Then, analysis was performed using analysis software Biacore T100 Evaluation software (manufactured by Biacore) attached to the apparatus.
  • the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody showed binding activity to Tn antigen type CD27-Fc and sialyl Tn antigen type CD27-Fc. From the above, it was revealed that the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody of the present invention binds to both Tn antigen and sialyl Tn antigen.
  • Example 5 Isolation and analysis of cDNA encoding variable region of anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody (1) Preparation of mRNA from anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody-producing hybridoma cells Each hybridoma KM4026, KM4027, KM4028 obtained in Example 3 , KM4030 and KM4031, respectively, from 5 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 cells, using RNAeasy Mini kit (manufactured by QIAGEN) and OligotexTM-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (manufactured by TaKaRa) According to the instruction manual, mRNA of each anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody was prepared.
  • a primer specific to rat IgG1 (SEQ ID NO: 14), a primer specific to rat IgG2a (SEQ ID NO: 15), a primer specific to rat IgG2b (SEQ ID NO: 16), or rat CH1 specific PCR reaction was performed using a typical primer (SEQ ID NO: 17) to amplify a cDNA fragment of the heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) of each antibody.
  • PCR was performed using rat Ig ( ⁇ ) -specific primers (SEQ ID NO: 18) and (SEQ ID NO: 19) in place of each antibody subclass-specific primer, and the light chain variable region of each antibody (hereinafter referred to as VL). ) CDNA fragment was amplified.
  • the PCR reaction for amplifying VL and VH of KM4026, KM4030, and KM4031 was performed using Advantage 2 PCR kit (Clontech), and the PCR reaction for amplifying VL and VH of KM4027 and KM4028 was performed using KOD Plus Polymerase (Toyobo). And manufactured according to the attached instruction manual.
  • the obtained PCR products are separated by agarose gel electrophoresis, and the PCR products derived from KM4026, KM4030, and KM4031 are used using TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), KM4027, The KM4028-derived PCR product was inserted into a pCR vector using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual.
  • Escherichia coli was transformed with a plasmid in which a PCR amplified fragment was inserted, plasmids obtained from each clone were prepared, and the DNA sequence was confirmed.
  • a plasmid containing a full-length VH cDNA and a plasmid containing a VL cDNA in which an ATG sequence presumed to be the initiation codon at the 5 'end of the cDNA was obtained.
  • the outline of cloning is shown in FIG.
  • VH and VL CDRs of each monoclonal antibody were identified by comparing with the amino acid sequences of known antibodies.
  • the amino acid sequences of VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4026 are SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42, and the amino acid sequences of VL CDR1, CDR2 and CDR3 are SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, respectively.
  • the amino acid sequence of VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4027 is SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48, and the amino acid sequence of CDR of VL, CDR2, CDR2 and CDR3 is SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51, respectively.
  • amino acid sequences of VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4028 are SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54, and the amino acid sequences of VL CDR1, CDR2 and CDR3 are SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57, respectively.
  • amino acid sequences of VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4030 are SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60, and the amino acid sequences of VL CDR1, CDR2 and CDR3 are SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63, respectively.
  • SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 66 are the amino acid sequences of VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the anti-sugar chain-deficient CD27 monoclonal antibody KM4031, and SEQ ID NO: 67 are the amino acid sequences of CDR, CDR2 and CDR3 of VL. 68 and SEQ ID NO: 69, respectively.
  • Example 6 Preparation of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody (1) Construction of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody expression vector The chimeric antibody prepared in the present invention is the heavy chain of the anti-CD27 rat monoclonal antibody obtained in Example 5 (3). And the light chain constant region of human IgG1 and the light chain constant region of human kappa disclosed in US97 / 10354, respectively, to the variable region of the light chain.
  • a pCR vector containing VL or VH of each monoclonal antibody obtained in Example 5 (3), a heavy chain constant region of human IgG1 described in US97 / 10354, and a light chain of human ⁇ were used.
  • an antibody expression vector pKANTEX93 containing a chain constant region an anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody expression vector was constructed as follows (FIGS. 15, 16, 17, and 18).
  • KM4026 VL primer is SEQ ID NO: 70 and 71
  • VH primer is SEQ ID NO: 72 and 73
  • KM4027 VL primer is SEQ ID NO: 74 and 75
  • VH primer is SEQ ID NO: 76 and 77
  • KM4028 VL primer is SEQ ID NOs: 78 and 79
  • VH primers are SEQ ID NOs: 80 and 81
  • KM 4030 VL primers are SEQ ID NOs: 82 and 83
  • VH primers are SEQ ID NOs: 84 and 85
  • KM4031 VL primers are SEQ ID NOs: 86 and 87
  • VH primers are shown in SEQ ID NOs: 88 and 89.
  • Each PCR reaction product is separated by 1% agarose gel electrophoresis, and then a specific PCR amplification band is recovered and pCR Blunt-TOPO using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual. Inserted into vector.
  • VL of each antibody was digested with restriction enzymes EcoRI (manufactured by New England Biolabs) and BsiWI (manufactured by New England Biolabs) to obtain an EcoRI-BsiWI fragment of VL. Further, VH of each antibody was digested with restriction enzymes NotI (New England Biolabs) and ApaI (New England Biolabs) to obtain NotI-ApaI fragments.
  • Each VL EcoRI-BsiWI fragment of anti-CD27 monoclonal antibodies KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 or KM4031 and a DNA fragment obtained by digesting pKANTEX93 with restriction enzymes EcoRI and BsiWI are used with Ligation High (manufactured by Toyobo). They were linked according to the attached instruction manual.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed with the ligated DNA fragment, plasmids obtained from each clone are prepared, and attached using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems). After the reaction according to the instruction manual, the base sequence was analyzed with the company's sequencer ABI PRISM 3700.
  • each NotI-ApaI fragment of VH of anti-CD27 monoclonal antibody KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 or KM4031, and pKANTEX93 into which each VL of the anti-CD27 monoclonal antibody is inserted are digested with restriction enzymes NotI and ApaI.
  • the DNA fragments were ligated using Ligation High (Toyobo Co., Ltd.) according to the attached instruction manual.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed with the ligated DNA fragment, plasmids obtained from each clone are prepared, and attached using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems). After the reaction according to the instruction manual, the base sequence was analyzed with the company's sequencer ABI PRISM 3700.
  • an anti-CD27 chimeric antibody expression vector into which cDNAs encoding VL and VH of the anti-CD27 monoclonal antibodies KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 or KM4031 were respectively obtained was obtained.
  • FUT8 knockout CHO cell As an animal cell line to be expressed, a CHO / DG44 cell line (hereinafter referred to as FUT8 knockout CHO cell) in which the ⁇ 1,6-fucosyltransferase (FUT8) gene was double knocked out was used. It is known that fucose is not added to the core part of the N-linked complex sugar chain of the antibody expressed in this host cell line (WO 2002/31140).
  • Example 7 Evaluation of activity of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody
  • the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody chimeric type KM4026, chimeric type KM4028, chimeric type KM4030 and chimeric type KM4031 obtained in Example 6 were used. The activity was evaluated.
  • the Lec8-derived CD27-Fc obtained in Example 1 (7) was immobilized on a CM5 sensor chip (GE Healthcare Bioscience) by the amine coupling method.
  • Measurement samples (chimera KM4026, chimera KM4028, chimera KM4030, and chimera KM4031) prepared in 5 concentrations by stepwise dilution from 9 ⁇ g / mL to 3 times dilution on a chip immobilized with CD27-Fc According to the automatic program of Tick, it was measured by continuously adding from the lowest concentration.
  • Biacore T100 Evaluation software manufactured by Biacore
  • analysis was performed with the Bivalent Analyte model, and the binding rate constant ka and the dissociation rate constant kd of each antibody to human sugar chain-deficient CD27-Fc were calculated.
  • the binding rate constant ka1, dissociation rate constant kd1 and dissociation constant KD (kd1 / ka1) of each antibody obtained as a result are shown in Table 3.
  • anti-RCAS1 mouse antibody 22-1-1 manufactured by MBL
  • anti-CD27 mouse antibody O323 manufactured by Santa Cruz biotechnology
  • the cells are washed by centrifugation twice with PBS, and ALEXA Fluoro 488-labeled anti-human immunoglobulin G (H + L), ALEXA Fluoro 488-labeled anti-mouse immunoglobulin G (H + L) or ALEXA is used as the secondary antibody.
  • Fluoro 488-labeled anti-human immunoglobulin M ( ⁇ ) was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react for 30 minutes under ice temperature and light shielding.
  • the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody chimeric type KM4026, chimeric type KM4028, chimeric type KM4030 and chimeric type KM4031 of the present invention specifically recognize sugar chain-deficient CD27 expressed on the cell surface. It became clear that
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • a mono-poly separation solution manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.
  • a mono-poly separation solution dispensed 3 mL each into a 15 mL tube
  • 3.5 mL of collected peripheral blood is gently layered, under the conditions of 400 ⁇ g, brake-off, and room temperature.
  • the mononuclear cell layer was separated by centrifugation for 20 minutes.
  • the thus obtained mononuclear cell fraction was washed twice with an ADCC medium, adjusted to an optimal number of cells with the same medium, and used as an effector cell suspension.
  • ADCC activity (%) ⁇ ([Absorbance of specimen]-[Absorbance of spontaneous release of target cell]-[Absorption of spontaneous release of effector cell]) / ([Absorbance of total release of target cell]-[Absorbance of spontaneous release of target cell] ]) X 100
  • anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody chimera type KM4026, chimera type KM4028, chimera type KM4030, and chimera type KM4031 in which core fucose is not bound to the N-linked complex sugar chain of the Fc region of the antibody are all CD27 / Lec8. -4 cells showed high ADCC activity.
  • the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody chimeric KM4026, chimeric KM4028, chimeric KM4030 and chimeric KM4031 of the present invention all have high ADCC activity against cells expressing sugar-deficient CD27. It became clear.
  • CD27 / Lec8-4 cells were washed with PBS, washed with RPMI1640 medium containing 10% dFBS, adjusted to the optimum concentration with the same medium, and used as a target cell suspension.
  • Anti-glycan-deficient CD27 chimera prepared by dispensing the target cell suspension to a 96-well flat-bottom plate (manufactured by Greiner) at 50 ⁇ L / well so as to obtain 5 ⁇ 10 4 cells per well.
  • Antibody solution and human complement manufactured by SIGMA were added to prepare a total volume of 150 ⁇ L / well.
  • reaction well containing no antibody (0% cytotoxic activity well) was prepared as a negative control
  • a reaction well containing no cells (100% cytotoxic activity well) was prepared as a positive control.
  • the reaction was performed in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 2 hours.
  • Example 8 Construction of CHO cells expressing cynomolgus monkey CD27 on the cell membrane (1) Cloning of cynomolgus monkey CD27 gene A gene encoding CD27 was isolated from cynomolgus monkey peripheral blood-derived RNA by the following procedure. Using 3.3 ⁇ g of RNA isolated from cynomolgus monkey peripheral blood using Trizol (manufactured by Invitrogen) as a template, 1 ⁇ L of oligo dT attached to SuperScriptIII first strand kit (manufactured by Invitrogen), and 1 ⁇ L of dNTP Mix A solution consisting of 5 ⁇ L was prepared.
  • the reverse transcriptase was inactivated by heating at 85 ° C. for 5 minutes, and then 1 ⁇ L of RNase H attached to the SuperScriptIII first strand kit was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes to completely degrade the RNA.
  • the cynomolgus monkey peripheral blood-derived single-stranded cDNA was stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the prepared solution was heated at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of PCR reaction at 94 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 2 minutes. After separation of the reaction solution by 1% agarose gel electrophoresis, an approximately 800 bp PCR product was inserted into the pCR Blunt-TOPO vector using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual. did.
  • E. coli DH5 ⁇ (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed using a vector in which a PCR amplified fragment is inserted, plasmids obtained from each clone are prepared, and BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems) is used. After the reaction according to the attached instruction manual, the base sequence was analyzed by the sequencer ABI PRISM 3700. As a result, a plasmid pCR mfCD27 in which cDNA (SEQ ID NO: 92) encoding cynomolgus monkey CD27 was cloned was obtained (FIG. 22).
  • the prepared solution was heated at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of PCR reaction at 94 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 2 minutes. After separation of the reaction solution by 1% agarose gel electrophoresis, an approximately 800 bp PCR product was inserted into the pCR Blunt-TOPO vector using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual. did.
  • E. coli DH5 ⁇ (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed using a vector in which a PCR amplified fragment is inserted, plasmids obtained from each clone are prepared, and BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems) is used. After the reaction according to the attached instruction manual, the base sequence was analyzed by the sequencer ABI PRISM 3700.
  • a plasmid pCR mfCD27His was obtained, in which a cDNA (SEQ ID NO: 95) encoding cynomolgus monkey CD27 with a His tag added at the C-terminus was cloned (FIG. 23).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed with the ligated DNA fragment, plasmids obtained from each clone are prepared, and attached using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems). After the reaction according to the instruction manual, the base sequence was analyzed with the company's sequencer ABI PRISM 3700.
  • DH5 ⁇ (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) transformed with pKANTEX mfCD27His was seeded in 200 mL of LB medium and cultured overnight. After culturing, the cells were collected, and the plasmid was purified using QIAfilter Plasmid Midi kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instruction manual. 50 ⁇ g of the purified plasmid was linearized by digestion with restriction enzyme AatII (manufactured by New England Biolabs).
  • Example 1 The procedure was as described in Example 1 (6) except that pKANTEX mfCD27His was used as the plasmid to be introduced. However, the cells after gene transfer were suspended in 30 mL of HT-medium and seeded in three 96-well plates at 100 ⁇ L / well.
  • the cynomolgus monkey CD27-expressing strain derived from the Lec8 strain is referred to as cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cell
  • the cynomolgus monkey CD27-expressing cell derived from DG44 cell is referred to as cynomolgus monkey CD27 / DG44 cell.
  • Example 9 Cross-reactivity evaluation of anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody to monkey CD27 protein Cynomolgus monkey CD27 / DG44 cells and cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cells prepared in Example 8 were used as assay cells.
  • anti-CD27 mouse antibody O323 As a positive control, anti-CD27 mouse antibody O323 was used. After the reaction, the cells were washed by centrifugation twice with PBS, and ALEXA Fluoro 488-labeled anti-human immunoglobulin G (H + L) or ALEXA Fluoro 488-labeled anti-mouse immunoglobulin G (H + L) (as a secondary antibody) (Manufactured by BioLegend) was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react for 30 minutes under ice temperature and light shielding.
  • CD27 chimeric antibody chimeric type KM4026, chimeric type KM4028, chimeric type KM4030, and chimeric type KM4031 are cynomolgus CD27 / Lec8 cells (sugar chain) containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound. It showed ADCC activity against deficient cynomolgus monkey CD27 cells).
  • the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody chimeric KM4026, chimeric KM4028, chimeric KM4030 and chimeric KM4031 of the present invention all show cross-reactivity to sugar-deficient cynomolgus CD27 cells. became. The reactivity of each anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody to sugar chain-deficient cynomolgus CD27 was found to be strong and weak, suggesting a difference in the recognized epitope.
  • the sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody chimeric KM4030 exhibits equivalent ADCC activity to cynomolgus monkey CD27 / Lec8 cells and human CD27 / Lec8 cells.
  • Example 10 Preparation of humanized antibody (1) Design of amino acid sequences of VH and VL of anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody The amino acid sequence of VH of anti-glycan-deficient CD27 humanized antibody was designed as follows. First, the amino acid sequence of FR of human antibody VH for grafting the amino acid sequence of CDR1-3 of anti-sugar chain-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030VH represented by SEQ ID NOs: 58, 59 and 60, respectively, was selected.
  • GCG Package Genetics Computer Group
  • an amino acid database of an existing protein is obtained with the anti-glycan-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 by BLASTP method (Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997)). Human antibodies with high homology were searched.
  • the amino acid sequence of CDR of VH of anti-glycan-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 shown by SEQ ID NOs: 58 to 60 was transplanted to the appropriate position of the FR amino acid sequence of the human antibody determined as described above.
  • the amino acid sequence HV0 of VH of the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody represented by SEQ ID NO: 96 was designed.
  • amino acid sequence of VL of the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody was designed as follows.
  • the homology of HSGI, HSGII, HSGIII, and HSGIV was 86.3%, 60.0%, 73.8%, and 73.8%, respectively. Therefore, the FR amino acid sequence of KM4030VL had the highest homology with subgroup I.
  • the amino acid sequence of the CDR of the VL of the anti-sugar chain-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 was transplanted to the appropriate position of the FR amino acid sequence of the consensus sequence of subgroup I of the human antibody VL.
  • the 124th Leu in the amino acid sequence of VL of the anti-sugar chain-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 set forth in SEQ ID NO: 38 is most used at the site corresponding to the amino acid sequence of the human antibody FR mentioned by Kabat et al. Although it is not a high-frequency amino acid residue, it is an amino acid residue that is used at a relatively high frequency, so the amino acid residue found in the amino acid sequence of the anti-sugar chain-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 was used. .
  • amino acid sequence LV0 of the VL of the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody represented by SEQ ID NO: 97 was designed.
  • the amino acid sequence HV0 and VL amino acid sequence LV0 of the VH of the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody designed above are the amino acid sequence of CDR of the anti-glycan-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 in addition to the FR amino acid sequence of the selected human antibody. It is the arrangement which transplanted only.
  • the binding activity is often lowered only by transplanting the amino acid sequence of the CDR of the rat antibody to the FR of the human antibody. Therefore, in order to avoid a decrease in the binding activity, the amino acid residues considered to affect the binding activity among the amino acid residues of FR that are different between the human antibody and the rat antibody together with the grafting of the CDR amino acid sequence. Modifications are being made.
  • amino acid residues of FR that are thought to affect the binding activity were identified as follows.
  • HV0LV0 a three-dimensional structure of the antibody V region consisting of the amino acid sequence HV0 of VH and the amino acid sequence LV0 of VL of the anti-glycan-deficient CD27 humanized antibody designed above was constructed using a computer modeling technique.
  • the three-dimensional structure coordinate production and the three-dimensional structure display were performed using software Discovery Studio (manufactured by Accelrys) according to the attached instruction manual.
  • a computer model of the three-dimensional structure of the V region of the anti-sugar chain-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 was also constructed in the same manner. Furthermore, in the amino acid sequences of VH of HV0LV0 and FR of VL, an amino acid residue different from anti-sugar chain-deficient CD27 rat antibody KM4030 is selected and modified to the amino acid residue of anti-glycan-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 A three-dimensional structural model was constructed in the same manner.
  • the amino acid residues of FR0 of HV0LV0 As a result, among the amino acid residues of FR0 of HV0LV0, the three-dimensional structure of the antigen binding site is changed, and the amino acid residues that are thought to affect the binding activity of the antibody are 30th Ser, 48th Val, 49th Ser, 77th Asn, 93th Val, 97th Ala and 117th Thr, 21st Ile, 40th Pro, 58th Val, 85th Thr in LV0, And 87th Tyr were selected respectively.
  • At least one amino acid sequence is modified to an amino acid residue present at the same site of the anti-sugar chain-deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030, and VH of humanized antibodies having various modifications And VL were designed.
  • the 30th Ser of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 96 is Asn
  • the 48th Val is Ile
  • the 49th Ser is Ala
  • the 77th Asn is Gly.
  • at least one of the amino acid modifications in which the 93rd Val was replaced with Thr, the 97th Ala with Thr, and the 117th Thr with Val was introduced.
  • the 21st Ile of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97 is Leu
  • the 40th Pro is Leu
  • the 58th Val is Ile
  • the 85th Thr is Ala
  • 87 At least one modification among the amino acid modifications substituting the second Tyr with Phe was introduced.
  • amino acid sequences of the variable regions of HV2LV0, HV3LV0, HV5LV0, and HV7LV0 in which at least one amino acid residue is present in the FR of HV0LV0, are designed, and the amino acid sequences of the heavy chain variable regions HV2, HV3, HV5, and HV7 Are shown in SEQ ID NOs: 101, 103, 105, and 107, respectively.
  • the DNA encoding the variable region amino acid sequence of anti-glycan deficient CD27 humanized antibody is the amino acid of VH or VL of anti-glycan deficient CD27 rat monoclonal antibody KM4030 When the amino acid modification was performed using the codon used in the DNA encoding the sequence, it was prepared using a codon frequently used in mammalian cells.
  • DNA sequences encoding the amino acid sequences of HV0 and LV0 of the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody are shown in SEQ ID NOs: 98 and 99, respectively, and the variable regions HV2, HV3, HV5, and HV7 in which amino acid modification was performed DNA sequences encoding amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 100, 102, 104, and 106, respectively.
  • the anti-glycan-deficient CD27 humanized antibody HV0LV0 consisting of the antibody VH HV0 and VL LV0, the antibody VH HV5, VL LV0 HV5LV0, and the antibody VH HV7 VL LV0 LV7LV0 The following three types were produced.
  • Example 11 Activity evaluation of anti-glycan-deficient CD27 humanized antibody
  • the anti-glycan-deficient CD27 chimeric antibody KM4030 obtained in Example 6 and the anti-glycan-deficient CD27 obtained in Example 10 were used.
  • Activity evaluation of humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0 and HV7LV0 was performed.
  • the binding rate constant Ka1, dissociation rate constant Kd1 and dissociation constant KD (Kd1 / Ka1) of each antibody obtained as a result are shown in Table 4.
  • a sensorgram is shown in FIG.
  • the humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0 and HV7LV0 all showed a high affinity of 2 ⁇ 10 ⁇ 9 mol / L and retained the same antigen binding activity as the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric antibody KM4030. It was.
  • Primary antibodies are anti-glycan-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0 or HV7LV0 with final concentrations of 0.0001, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 1 and 10 ⁇ g. / ML was prepared and used. The results are shown in FIGS. 30 (A) and 30 (B).
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity of anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibody
  • the ADCC activity of anti-glycan-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0 and HV7LV0 is the same as in Example 7 (3).
  • As the target cells CD27 / DG44-4 cells and CD27 / Lec8-M19 cells prepared by the same method as in Example 2 were used.
  • the experiment was performed at a ratio of effector cells (E) to target cells (T) of 12.5: 1. The result is shown in FIG.
  • the humanized antibody HV0LV0 had a slightly reduced ADCC activity than the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric KM4030 antibody, but the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV5LV0 and HV7LV0 were anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric type.
  • the ADCC activity was almost equal to or higher than that of the KM4030 antibody.
  • the anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0, and HV7LV0 obtained in the present invention showed stronger CDC activity than the anti-sugar chain-deficient CD27 chimeric KM4030 antibody.
  • anti-sugar chain-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0 and HV7LV0 bound to cynomolgus monkey CD27 / DG44 cells.
  • anti-glycan-deficient CD27 humanized antibodies HV0LV0, HV5LV0, and HV7LV0 reacted to cynomolgus CD27 / Lec8 cells expressing sugar-deficient CD27 in the same manner as the anti-glycan-deficient CD27 chimeric KM4030 antibody.
  • a monoclonal antibody or an antibody fragment that specifically recognizes CD27 containing an O-linked sugar chain to which galactose is not bound and binds to the extracellular region a hybridoma that produces the antibody, and an encoding of the antibody DNA, a vector comprising the DNA, a transformant obtained by transforming the vector, a method of producing an antibody or antibody fragment using the hybridoma or transformant, and the antibody or antibody fragment as an active ingredient

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Abstract

　本発明は、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を特異的に認識し、該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体およびその使用方法を提供することにある。　本発明によれば、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を特異的に認識し、該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、並びに該抗体または抗体断片を有効成分として含有するＣＤ２７が関与する疾患の診断薬または治療薬を提供することができる。

Description

抗ＣＤ２７抗体
　本発明は、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７遺伝子によりコードされるポリペプチドを特異的に認識し、該ポリペプチドの細胞外領域に結合するヒト化抗体または該抗体断片、該ヒト化抗体を産生するハイブリドーマ、該ヒト化抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは形質転換体を用いるヒト化抗体または該抗体断片の製造方法、並びに該ヒト化抗体または抗体断片を含む診断薬、または該ヒト化抗体または抗体断片を有効成分として含有する治療薬に関する。
　近年、種々の疾患の発症または病態の進行に伴い、その疾患または病態に関わる細胞が発現するタンパク質に付加された糖鎖構造に変化が起こる事例が報告されている。この事例のなかで代表的なものは、８０％を超えるヒトの癌種において発現が認められるＯ結合型（セリンスレオニン型）糖鎖抗原の１つであるＴｎ抗原と、該Ｔｎ抗原にシアル酸が付加されたシアリルＴｎ抗原の発現である（非特許文献２）。
　これらの糖鎖抗原は正常細胞にはほとんど発現が認められないことが知られており、癌特異的ワクチン療法の標的分子として医療に応用するための研究がなされている（非特許文献１）。これらの癌特異的な糖鎖抗原の発現は、生体内に存在する複雑な糖鎖生合成経路と糖鎖代謝経路を構成する酵素活性により制御されている。その一例として、癌細胞において、糖鎖生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現様式が変化した結果、糖鎖生合成経路が途中で遮断される例などが知られている。
　Ｔｎ抗原は、正常細胞におけるＯ結合型糖鎖の生合成経路の中間産物として知られており、タンパク質アミノ酸配列中の特定のセリン（Ｓｅｒ）残基またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖に存在する水酸基に、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）がα結合した構造である（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）。
　Ｔｎ抗原の非還元末端側に、コア１β３ガラクトース転移酵素（ｃｏｒｅ１β３Ｇａｌ－Ｔ，Ｔ－ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）の活性によってガラクトースが１分子転移されることにより、正常型のＯ結合型糖鎖（ＴＦ抗原など）の生合成が進行する。複数種の癌細胞株において、細胞内のコア１β３ガラクトース転移酵素の活性が低下した結果、糖鎖の生合成経路が遮断され、Ｔｎ抗原またはシアリルＴｎ抗原が発現すると考えられている。
　癌細胞内でコア１β３ガラクトース転移酵素の活性が低下する機構は複雑であり、現在でも完全には解明されていない。しかし、その機構のひとつに、コア１β３ガラクトース転移酵素の活性発現に必要な特定のシャペロンタンパク質（Ｃｏｓｍｃ）をコードする遺伝子が変異した結果、細胞内のコア１β３ガラクトース転移酵素活性が大幅に低下する、という機構が推定されている（非特許文献６）。
　複数の癌種で共通してＴｎ抗原の発現が認められることから、細胞内の糖鎖生合成経路または糖鎖代謝経路における異常は、その細胞内で発現する多くの異なる糖タンパク質に付加した糖鎖構造に共通した変化を生じさせる主たる原因と考えられている。
　糖鎖構造の変化と病態の進行が密接に関わっていることが知られている疾患の代表的は癌である。また、癌以外に糖鎖構造の変化と病態の進行が密接に関わっていることが知られている疾患として、ＩｇＡ腎症が知られている。ＩｇＡ腎症とは、免疫グロブリンの一種であるイムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）が腎糸球体のメサンギウム領域に顆粒状に沈着した病理像が特徴的な慢性糸球体腎炎であり、１９６８年にＢｅｒｇｅｒによって初めて報告された（非特許文献２）。
　ＩｇＡ腎症は、日本国内の慢性糸球体腎炎患者数の約半数を占める代表的な腎炎である。ＩｇＡ腎症と診断された患者の約４割はその後２０年以内に末期腎不全に移行し、人工透析および腎移植などを余儀なくされるといわれている。このようにＩｇＡ腎症は一般的に予後不良の疾患として認識されているにもかかわらず、臨床で有効性が証明された治療法は未だ確立していない。
　ＩｇＡ腎症の患者体内では、２種類のＩｇＡアイソタイプ（ＩｇＡ１とＩｇＡ２）のうち、主にＩｇＡ１が腎臓に沈着することが知られている。また、その沈着の原因のひとつとして、ＩｇＡ２分子には無く、ＩｇＡ１分子に存在するヒンジ領域に付加されたＯ結合型糖鎖の構造が、正常型からＴｎ抗原またはシアリルＴｎ抗原に変化していることが報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。
　ＩｇＡ１ヒンジ領域に付加したＯ結合型糖鎖からガラクトースが欠損してＴｎ抗原またはシアリルＴｎ抗原に変化するとＩｇＡ１分子の自己凝集能が亢進すること、並びにＩｇＡ１分子の腎メサンギウム領域への沈着が亢進することが証明されている（非特許文献５）。
　さらに、ＩｇＡ腎症患者から単離したＩｇＡ産生細胞において、Ｃｏｓｍｃの発現量低下に起因したコア１β３ガラクトース転移酵素活性の低下が報告されている（非特許文献６）。
　すなわち、ＩｇＡ腎症患者体内のＩｇＡ産生細胞では糖鎖生合成経路が途中で遮断された結果、正常型糖鎖を持つＩｇＡ１の産生ができなくなり、代わりに糖鎖不全型のＩｇＡ１が産生される。ＩｇＡ腎症の発症機構のひとつとして、この糖鎖不全型ＩｇＡ１が腎糸球体に沈着した結果、炎症が惹起されるという機構が提唱されている。
　一般的にＩｇＡは、血液中のＢ細胞、または、Ｂ細胞から分化した形質細胞によって産生される。形質細胞は、Ｂ細胞分化の最終段階であり、二次リンパ組織、全身の粘膜組織および骨髄などに分布して大量の抗体を産生するが、ＩｇＡを産生する形質細胞は、主に粘膜組織に分布することが知られている。
　一方、二次リンパ組織の胚中心において、高親和性のＩｇＡ抗体産生能を獲得したＢ細胞クローンからは、メモリーＢ細胞または、形質細胞が分化し、全身の標的臓器に分布して長期にわたり抗体を産生し続けることが知られている。
　しかしながら、ＩｇＡ腎症の発症に関与する糖鎖不全ＩｇＡを産生する細胞が、Ｂ細胞分化過程のどの段階で発生するのか、また糖鎖不全ＩｇＡを産生するＢ細胞または形質細胞が、体内のどの組織に分布するのかについては、明らかにされていない。
　Ｂ細胞または形質細胞に発現する細胞膜表面分子として知られるタンパク質の中で、Ｏ結合型糖鎖が結合する分子の１つとして、ＣＤ２７が知られている（非特許文献７）。ＣＤ２７分子は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する分子量が約５５ｋＤａのＩ型膜タンパク質であり、２つの単量体がジスルフィド結合により連結したダイマーとして存在する（非特許文献８）。
　ＣＤ２７は、形質細胞、Ｂ細胞の他にＴリンパ球の一部に発現していることが知られているが、特にＢ細胞の分化過程において、メモリーＢ細胞および形質細胞へ分化する際に、発現が上昇することが知られている。これらの分化過程の細胞には、Ｏ結合型糖鎖が結合したＣＤ２７が発現していることが知られているが、糖鎖が結合するアミノ酸残基は明らかにされていない（非特許文献９）。
　ＣＤ２７のリガンド分子としてはＴＮＦファミリーのひとつであるＣＤ７０が知られている。ＣＤ７０は、一部のＢ細胞またはＴ細胞に発現するＣＤ２７に結合し、細胞増殖シグナルを導入すること、またはＢ細胞の抗体産生を促すことが知られている（非特許文献１０）。
　また、ＣＤ２７は正常細胞だけではなく、いくつかの癌細胞において発現が亢進していることが知られている。ＣＤ２７を発現している癌種としては、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、モルトリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫および形質細胞腫等の種々の非ホジキンリンパ腫が報告されている（非特許文献１１）。
　多くの癌細胞では、先述のようにＴｎ抗原またはシアリルＴｎ抗原などの糖鎖を含む、糖鎖不全タンパク質を発現していることが知られている。
　ＣＤ２７を特異的に認識する抗体としては、Ｓｅｚａｒｙ症候群患者から単離した白血病細胞を免疫することにより得られたＳ１５２抗体が報告されている（非特許文献８）。しかし、Ｓ１５２抗体は、正常Ｂ細胞およびＴ細胞に対しても親和性を有することが示されている。これまでにガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７分子を特異的に認識するような抗体は知られていない。
　一般に非ヒト抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が誘導されることが知られている。
　ＨＡＭＡは、投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献１２～１５）、マウス抗体の体内からの消失を速め（非特許文献１６～１８）、マウス抗体の治療効果を低下させてしまうことが知られている（非特許文献１９、２０）。
　これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用して、非ヒト抗体からヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製が試みられている。
　ヒト化抗体は、マウス抗体などの非ヒト抗体と比較して、ヒトへの投与を行う上で、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（非特許文献２１、非特許文献２２）。すなわち、ヒト化抗体は、非ヒト抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
　また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）（Ｈ鎖Ｃ領域を、ＣＨと表記する）としてγ１サブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）などのエフェクター機能の高いヒト化抗体を作製することができ（非特許文献２３）、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（非特許文献２４）。
　特に、体内からＴｎ抗原型ＣＤ２７陽性細胞を除去する治療においては、抗体を介してエフェクター細胞を標的細胞の近傍に集積させ、標的細胞を特異的に傷害するために、抗体のＦｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）およびＡＤＣＣ活性等の細胞傷害活性が重要である。ヒトの治療においては、細胞傷害活性を発揮させるために、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト化抗体を用いることが望ましい（非特許文献２５、２６）。
　さらに、ヒト化抗体は、最近のタンパク質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（非特許文献２７）、２量体化Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）（非特許文献２８）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（非特許文献２９）およびＣＤＲを含むペプチド（非特許文献３０）などの、分子量の小さい抗体断片としても作製できる。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている（非特許文献３１）。
Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｏｎｃｏｇ．，６，５７（１９９５） Ｊ　Ｕｒｏｌ　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，７４，６９４（１９６８） Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１００，４７０（１９９５） Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈ．，７，９５５（１９９６） Ｎｅｐｈｒｏｌ　Ｄｉａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１７，５０（２００２） Ｊ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ．，２５８，４６７（２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１７，２７５（２００５） Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２１（１９８８） Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，４４７（１９９２）） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４．６３４６（１９９７） Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ．，４３，１８５５（２００２） Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，３８，５６４（２００７） Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，３６，８８６（２００５） ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，５７９，６１７９（２００５） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，６５，７３７８（２００５） Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，３６，８８６（２００５） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，２３２８（２００６） Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　Ａｒｃｈ．，４４８，５２（２００６） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１３８２（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２）
　上記したように、これまでにガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７分子を特異的に認識するような抗体は知られていない。ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７分子を特異的に認識する抗体は、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関連する疾患の診断および治療等に非常に有効である。
　したがって、本発明の目的はガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を特異的に認識し、ＣＤ２７の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその使用方法を提供することにある。
　本発明は、（１）～（２３）に関する。
（１）抗体のＶＨが配列番号５８～６０で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号６１～６３で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＬであり、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含む、ＣＤ２７遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域を認識して結合する、ヒト化抗体またはその抗体断片。
（２）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつヒト化抗体のＶＬが、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む（１）のヒト化抗体またはその抗体断片。
（３）ヒト化抗体のＶＨが、配列番号９６、１０５および１０７のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつヒト化抗体のＶＬが、配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む（１）のヒト化抗体またはその抗体断片。
（４）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（５）（４）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（６）（５）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（７）（６）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片の製造方法。
（８）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７の免疫学的検出または測定方法。
（９）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７の検出試薬。
（１０）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断薬。
（１１）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、（１０）に記載の診断薬。
（１２）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が癌である、（１０）に記載の診断薬。
（１３）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または抗体断片を有効成分として含有する、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の治療薬。
（１４）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、（１３）に記載の治療薬。
（１５）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が、癌である、（１３）に記載の治療薬。
（１６）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を用いて、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が発現した細胞を検出または測定することを含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断方法。
（１７）（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を用いて、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を検出または測定することを含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断方法。
（１８）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、（１６）または（１７）に記載の診断方法。
（１９）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が癌である、（１６）または（１７）に記載の診断方法。
（２０）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断薬を製造するための、（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
（２１）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の治療薬を製造するための、（１）～（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
（２２）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、（２０）または（２１）に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
（２３）ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が癌である、（２０）または（２１）に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
　本発明のヒト化抗体または該抗体断片は、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含む、ＣＤ２７遺伝子によってコードされるポリペプチド（以下、ＣＤ２７と記載する）の細胞外領域を特異的に認識し、該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体である。
　本発明のヒト化抗体または該抗体断片を用いて糖鎖不全ＣＤ２７または該ポリペプチドが発現した細胞を検出または定量することにより、糖鎖不全ＣＤ２７が関連する疾患を診断することができる。
　また、本発明のヒト化抗体または該抗体断片は、糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドの細胞外領域に結合できるため、該ポリペプチドが発現している細胞の検出に好適に用いられる。特に、本発明の抗体または該抗体断片は、糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合できるため、細胞膜上に天然型の立体構造を保持して発現しているＣＤ２７を検出するフローサイトメトリーの解析に好ましく用いられる。
　さらに、本発明のヒト化抗体または該抗体断片であって、かつエフェクター活性を有する抗体または該抗体断片は、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを発現している細胞を傷害することができる。また、このような本発明のヒト化抗体または該抗体断片は、生体内の糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチド発現細胞を傷害し、減少させることができるので、治療剤として特に有効に用いられる。
図１は、ヒトＣＤ２７タンパク質コードするＤＮＡ配列を含む、プラスミドベクターｐＣＲ２．１　ＣＤ２７の作製方法を示す。 図２は、ヒトＣＤ２７タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を含む、プラスミドベクターｐＣＲ　ＣＤ２７ａｘｂの作製方法を示す。 図３は、ヒトＩｇＧ４定常領域のアミノ酸置換を行った変異型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を有するプラスミドベクターｐＢＳｈＣγ４ＳＰの作製方法を示す。 図４は、変異型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域のＤＮＡ配列に制限酵素認識配列を挿入したＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターｐＣＲ　ＩｇＧ４Ｆｃ　ＢａｍＨＩＳａｌＩの作製方法を示す。 図５は、ＣＤ２７－ＦｃのＤＮＡ配列を挿入する、ｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩの作製方法を示す。 図６は、ＣＤ２７－Ｆｃタンパク質発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７－ｈＩｇＧ４Ｆｃの作製方法を示す。 図７（ａ）および（ｂ）は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＬｅｃ８細胞を宿主細胞として発現させたＣＤ２７－Ｆｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。図７（ａ）は、βメルカプトエタノールを添加していない非還元状態、図７（ｂ）は、βメルカプトエタノールを添加した還元状態を示す。図７（ａ）および（ｂ）のいずれも、左からマーカー、Ｌｅｃ８細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のフラクションを示す。 図８（ａ）は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＬｅｃ８細胞を宿主細胞として発現させたＣＤ２７－Ｆｃタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析した結果を示す。また、図８（ｂ）は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＬｅｃ８細胞を宿主細胞として発現させたＣＤ２７－Ｆｃタンパク質を、ウエスタンブロットした結果を示す。図８（ａ）および（ｂ）のいずれも、左のレーンから、マーカー、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＬｅｃ８細胞のサンプルを示す。ウエスタンブロットは、抗ＲＣＡＳ１抗体２２－１－１抗体を用いて染色を行った。 図９は、動物細胞発現用のＣＤ２７タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＣＲ　ＣＤ２７　ａｘｃの作製方法を示す。 図１０は、動物細胞発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７の作製方法を示す。 図１１（ａ）および（ｂ）は、ＣＤ２７発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、およびＣＤ２７発現Ｌｅｃ８細胞に対する、抗ＣＤ２７モノクローナル抗体のフローサイトメーターの結果を示す。図１１（ａ）が、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４に対するヒストグラム、図１１（ｂ）が、ＣＤ２７／ＤＧ４４－８に対するヒストグラムの結果を示す。いずれのヒストグラムも、縦軸が細胞数、横軸が蛍光強度を示す。 図１２（ａ）および（ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１の、Ｌｅｃ８細胞、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞およびＣＤ２７／ＤＧ４４－８細胞に対する結合活性を、蛍光細胞染色法を用いて測定した結果を示す。図１２（ａ）は、ＡＢＩセルラーディテクションシステムを用いた測定結果を示し、縦軸は蛍光強度、横軸は反応させた抗体を示す。図１２（ｂ）は、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いた測定結果を示し、縦軸が平均蛍光強度、横軸が反応させた抗体を示す。 図１３（ａ）および（ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１の競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。図１３（ａ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０の反応性、図１３（ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３１の反応性を示す。縦軸が細胞増殖、横軸が抗体濃度を示す。 図１４（ａ）および（ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体の遺伝子クローニング方法を示す。 図１５は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターの造成方法を示す。 図１６は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターの造成方法を示す。 図１７は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターの造成方法を示す。 図１８は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターの造成方法を示す。 図１９（Ａ）（ａ）および（ｂ）は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６（◇）、キメラ型ＫＭ４０２８（△）、キメラ型ＫＭ４０３０（○）、キメラ型ＫＭ４０３１（□）のＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。また、図１９（Ａ）（ｂ）は、市販抗ＣＤ２７抗体Ｏ３２３（●）のＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。 図１９（Ｂ）（ａ）は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６（◇）、キメラ型ＫＭ４０２８（△）、キメラ型ＫＭ４０３０（○）、キメラ型ＫＭ４０３１（□）のＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。また、図１９（Ｂ）（ｂ）は、市販抗ＣＤ２７抗体Ｏ３２３（●）のＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。 図１９（Ｃ）（ａ）は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６（◇）、キメラ型ＫＭ４０２８（△）、キメラ型ＫＭ４０３０（○）、キメラ型ＫＭ４０３１（□）のＬｅｃ８細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。また、図１９（Ｃ）（ｂ）は、市販抗Ｔｎ抗体２２－１－１（■）のＬｅｃ８細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。 図２０は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６（◇）、キメラ型ＫＭ４０２８（△）、キメラ型ＫＭ４０３０（○）およびキメラ型ＫＭ４０３１（□）の、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は各抗体の終濃度を示す。 図２１は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１のＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対する補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は反応させた抗体を示す。 図２２は、カニクイザルＣＤ２７タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＣＲ　ｍｆＣＤ２７の造成方法を示す。 図２３は、カニクイザルＣＤ２７タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターｍｆＣＤ２７Ｈｉｓの造成方法を示す。 図２４は、カニクイザルＣＤ２７発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓの作製方法を示す。 図２５は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２、キメラ型ＫＭ４０３０、キメラ型ＫＭ４０３１および市販抗ＣＤ２７抗体Ｏ３２３の、カニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞またはカニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体を示す。 図２６は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６（◆）、キメラ型ＫＭ４０２８（▲）、キメラ型ＫＭ４０３０（●）およびキメラ型ＫＭ４０３１（■）の、カニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は各抗体の終濃度を示す。 図２７は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０３０の、カニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞（●）もしくはヒトＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞（○）に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は各抗体の終濃度を示す。 図２８（Ａ）（ａ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０２６の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ａ）（ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０２７の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ａ）（ｃ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０２８の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ａ）（ｄ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＫＭ４０３０の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ａ）（ｅ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０３１の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。縦軸はＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅユニット）を、横軸は反応時間（秒）を示す。 図２８（Ｂ）（ａ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０２６のシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ｂ）（ｂ）は、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０２７のシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ｂ）（ｃ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０２８のシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ｂ）（ｄ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０３０のシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２８（Ｂ）（ｅ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７抗体ＫＭ４０３１のシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。縦軸はＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅユニット）を、横軸は反応時間（秒）を示す。 図２９（ａ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２９（ｂ）は、ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２９（ｃ）は、ヒト化抗体ＨＶ５ＬＶ０の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。図２９（ｄ）は、ヒト化抗体ＨＶ７ＬＶ０の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃ（Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃ）に対する結合のビアコアセンサーグラムを示す。縦軸はＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅユニット）を、横軸は反応時間（秒）を示す。 図３０（Ａ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０（○）および抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０（□）、ＨＶ５ＬＶ０（△）、ＨＶ７ＬＶ０（◇）のＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。 図３０（Ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０（○）および抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０（□）、ＨＶ５ＬＶ０（△）、ＨＶ７ＬＶ０（◇）のＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。 図３１は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０（○）および抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０（□）、ＨＶ５ＬＶ０（△）、ＨＶ７ＬＶ０（◇）の、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は各抗体の終濃度を示す。 図３２は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０（○）および抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０（□）、ＨＶ５ＬＶ０（△）、ＨＶ７ＬＶ０（◇）の、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞に対する補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を示す。縦軸は細胞傷害活性（％）を、横軸は反応させた抗体を示す。 図３３（Ａ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０（○）および抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０（□）、ＨＶ５ＬＶ０（△）、ＨＶ７ＬＶ０（◇）のカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体を示す。 図３３（Ｂ）は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０（○）および抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０（□）、ＨＶ５ＬＶ０（△）、ＨＶ７ＬＶ０（◇）のカニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞に対する結合活性を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて測定した結果を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体の終濃度を示す。縦軸は平均蛍光強度を、横軸は反応させた抗体を示す。
　本発明は、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含む、ＣＤ２７遺伝子によってコードされるポリペプチド（以下、ＣＤ２７とも記載する）の細胞外領域を特異的に認識し、該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体（以下、本発明のヒト化抗体，、本発明の抗体ともいう）に関する。
　ＣＤ２７遺伝子としては、ＣＤ２７をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。また、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣＤ２７の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子なども本発明のＣＤ２７遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法およびＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニーまたはプラーク由来のＤＮＡ、もしくは該配列を有するＰＣＲ産物もしくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む）を用い、６５℃条件下でフィルターもしくはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９］、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９５）］などに記載されている方法に準じて行うことができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡが好ましく、８０％以上の相同性を有するＤＮＡがより好ましく、９５％以上の相同性を有するＤＮＡがさらに好ましい。
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられるＣＤ２７遺伝子には、遺伝子の多型によって塩基配列にわずかに変異を生じた遺伝子も包含される。
　ＣＤ２７としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ２７の機能を有するポリペプチド、並びに配列番号２で示されるアミノ酸配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＣＤ２７の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９］およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）；Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ（Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／　ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
　また、こうして作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
　ＣＤ２７の細胞外領域とは、文献［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４７，３１６５（１９９１）］で予測されている細胞外ドメインの１～１７１番目に相当する領域等が挙げられる。
　本発明において、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７遺伝子によってコードされるポリペプチドの細胞外領域とは、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７であればいずれのものでもよい。具体的には、例えば、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含む、配列番号１で示される塩基配列によってコードされるＣＤ２７の細胞外領域が挙げられる。
　Ｏ結合型糖鎖とは、タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）のアミノ酸残基において、各アミノ酸側鎖に含まれる－ＯＨ基を介して糖鎖が結合した構造をいう。
　Ｏ結合型糖鎖の中でも、ポリペプチド上におけるＳｅｒまたはＴｈｒアミノ酸側鎖の－ＯＨ基に、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合したＯ結合型糖鎖を、ムチン型糖鎖という。Ｏ結合型糖鎖の具体例としては、Ｔ抗原、シアリルＴ抗原、Ｔｎ抗原およびシアリルＴｎ抗原などが挙げられる（表１）。
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　本発明において、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖とは、タンパク質のＳｅｒまたはＴｈｒのアミノ酸残基の－ＯＨ基を介して結合したＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に、ガラクトース（Ｇａｌ）が結合していないＯ結合型糖鎖のことをいう。具体的には、例えば、上記のＴｎ抗原およびシアリルＴｎ抗原が挙げられる。
　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖は、正常Ｏ結合型糖鎖の合成経路における中間体であり、通常、正常細胞における糖タンパク質には殆んど存在せず、癌および腎症などのある特定の疾患において発現が確認される。
　以下、本発明において、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を異常糖鎖、異常糖鎖が結合したタンパク質を糖鎖不全タンパク質および異常糖鎖が結合したＣＤ２７を糖鎖不全ＣＤ２７と記載することがある。
　Ｏ結合型糖鎖が結合するポリペプチドにおけるアミノ酸残基としては、例えば、ＣＤ２７タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列中のセリン（Ｓｅｒ）およびスレオニン（Ｔｈｒ）のアミノ酸残基が挙げられる。
　また、Ｏ結合型糖鎖が結合するポリペプチドにおけるアミノ酸残基は、Ｏ結合型糖鎖結合コンセンサス配列を、ＮｅｔＯＧｌｙｃ３．１　Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）などの配列検索ソフトを用いて確認することができる。または、Ｏ結合型糖鎖を有する糖タンパク質のマススペクトルメトリー（ＭＳ）解析を行うことで、具体的な糖鎖結合部位を特定することができる。
　本発明において、ＣＤ２７タンパク質上のＯ結合型糖鎖が結合するポリペプチドにおけるアミノ酸残基としては、ＣＤ２７タンパク質のアミノ酸配列のうち、いずれのＳｅｒまたはＴｈｒ残基にもＯ結合型糖鎖が結合し得るが、好ましくは、配列番号２で表されるＣＤ２７タンパク質の、１１８番目のＴｈｒ、１２７番目のＳｅｒ、１２９番目のＴｈｒ、１３２番目のＳｅｒ、１３３番目のＳｅｒ、１３７番目のＳｅｒ、１４３番目のＴｈｒ、１４９番目のＳｅｒ、１５６番目のＴｈｒ、１６２番目のＴｈｒ、１７３番目のＴｈｒ、１７５番目のＳｅｒおよび１７６番目のＴｈｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基からなる糖鎖結合部位が挙げられる。
　ＣＤ２７タンパク質１分子あたりの細胞外領域に結合するＯ結合型糖鎖の数としては、少なくとも１つのＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基にＯ結合型糖鎖が結合していればよく、Ｏ結合型糖鎖の数は限定されない。
　本発明の、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７（以下、糖鎖不全ＣＤ２７と記載する）を発現した細胞を取得する方法としては、例えば、Ｏ結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＮ－アセチルガラクサミン（ＧａｌＮＡｃ）にＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはｕｒｉｄｉｎｅ　５’－ｄｉｐｈｏｓｐａｔｅ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ（ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の輸送に関わるタンパク質などの活性を、低下または欠損させた細胞株にＣＤ２７をコードするＤＮＡを導入することにより、糖鎖不全ＣＤ２７発現細胞を作製することができる。
　また、例えば、正常Ｏ型糖鎖を含むＣＤ２７を発現する細胞に対して、シアリダーゼおよびガラクトシダーゼ等の糖鎖切断酵素を作用させることにより、ガラクトースの結合していないＯ結合型糖鎖を有するＣＤ２７発現細胞を作製することも可能である。
　ポリペプチド上におけるＳｅｒまたはＴｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素の具体例としては、β１，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７，１７８－１８６（２００２）］などが挙げられる。
　また、ポリペプチド上におけるＳｅｒまたはＴｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素の活性に関与するタンパク質としては、該酵素のタンパク質フォールディングに関与するシャペロンであるＣｏｓｍｃ［Ｐｒｏｃｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，９９，１６６１３－１６６１８（２００２）］などが挙げられる。
　ＩｇＡ腎症の患者由来のＣＤ２７発現細胞は、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅの輸送に関わるタンパク質などをコードするＤＮＡに付加、欠失または置換などが生じることで酵素の活性が低下または欠損していることから、ＣＤ２７発現細胞として利用することができる。
　ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅの輸送に関わるタンパク質としては、例えば、ＵＤＰ－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒなどが挙げられる。ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの活性が低下または欠損した細胞株としては、例えば、Ｌｅｃ８細胞［Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１，３０７－１４（１９９１）］などが挙げられる。
　本発明において、糖鎖不全ＣＤ２７を発現した細胞としては、例えば、ヒト体内に内在的に存在する細胞、ヒト体内に内在的に存在する細胞から樹立された細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。
　好ましくは、上述のような、Ｏ結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅの輸送に関わるタンパク質などの活性を、低下または欠損した細胞株、同様な性質を有しヒト体内に内在的に存在する細胞などが挙げられる。
　ヒト体内に内在的に存在する細胞としては、Ｏ結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅの輸送に関わるタンパク質などの活性が、低下または欠損した細胞株が好ましい。
　具体的には、例えば、ＩｇＡ腎症患者体内または癌患者体内においてＣＤ２７タンパク質が発現している細胞が挙げられる。当該細胞としては、例えば、バイオプシーなどで得られた免疫関連細胞または腫瘍細胞のうちでＣＤ２７タンパク質が発現している細胞が挙げられる。
　遺伝子組換え技術により得られる細胞としては、例えば、Ｏ結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅの輸送に関わるタンパク質などの活性を、低下または欠損させた宿主細胞を作製し、目的のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、糖鎖不全ＣＤ２７を発現した細胞が挙げられる。
　宿主細胞としては、具体的には、例えば、ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの活性が低下したＬｅｃ８細胞、またはβ１，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたは本酵素活性に関与するＣｏｍｓｃシャペロンタンパク質の異常により、酵素の活性が低下または欠損しているＩｇＡ腎症患者由来のＩｇＡ抗体発現細胞などが挙げられる。
　更に、糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を作製する方法としては、例えば、上述のＣＤ２７発現細胞を用いて、糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を発現および精製する方法などが挙げられる。
　糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を取得する方法としては、例えば、ＣＤ２７タンパク質と他の物質との融合タンパク質として発現させ、精製することで取得することができる。
　ＣＤ２７タンパク質と融合させる物質としては、例えば、抗体定常領域、抗体Ｆｃ領域、ＧＳＴタグ、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグともいう）およびＭｙｃタグなどのポリペプチドなどが挙げられる。該融合タンパク質は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ニッケルカラムおよび特異的抗体カラムなどの、アフィニティーカラムを用いることにより分離精製することができる。
　上述のようにして得られた糖鎖不全ＣＤ２７細胞または糖鎖不全ＣＤ２７に対して本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は結合活性を有する。
　本発明の抗体または該抗体断片が糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質に結合することは、例えば、公知の免疫学的検出法、好適には蛍光細胞染色法等を用いて、特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を確認する方法により確認することができる。
　また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
　本発明におけるモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　ハイブリドーマは、例えば上記の糖鎖不全ＣＤ２７を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより糖鎖不全ＣＤ２７抗体を取得することができる。
　抗原を免疫する動物としてはハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどが好適に用いられる。またこのような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である。
　エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体のエピトープとしては、糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質の立体構造が挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域を認識し、かつ結合するモノクローナル抗体であればいずれの抗体でもよいが、具体的には、例えば、モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１などが挙げられる。
　より具体的には、例えば、ハイブリドーマＫＭ４０２６により生産されたモノクローナル抗体ＫＭ４０２６、モノクローナル抗体ＫＭ４０２６と競合して糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体ＫＭ４０２６が結合する糖鎖不全ＣＤ２７細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体が挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、例えば、ハイブリドーマＫＭ４０２７により生産されたモノクローナル抗体ＫＭ４０２７、モノクローナル抗体ＫＭ４０２７と競合して糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体ＫＭ４０２７が結合する糖鎖不全ＣＤ２７細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体も挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、例えば、ハイブリドーマＫＭ４０２８により生産されたモノクローナル抗体ＫＭ４０２８、モノクローナル抗体ＫＭ４０２８と競合して糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体ＫＭ４０２８が結合する糖鎖不全ＣＤ２７細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体も挙げられる。
　また、本発明のモノクローナル抗体としては、例えば、ハイブリドーマＫＭ４０３０により生産されたモノクローナル抗体ＫＭ４０３０、モノクローナル抗体ＫＭ４０３０と競合して糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体ＫＭ４０３０が結合する糖鎖不全ＣＤ２７細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体も挙げられる。
　更に、本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＫＭ４０３１により生産されたモノクローナル抗体ＫＭ４０３１、モノクローナル抗体ＫＭ４０３１と競合して糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体ＫＭ４０３１が結合する糖鎖不全ＣＤ２７細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体と競合反応するモノクローナル抗体としては、具体的には上述のように各種モノクローナル抗体と糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に存在するエピトープに対して競合反応を有するもモノクローナル抗体が挙げられる。
　また本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体としては、具体的には上述のように各種モノクローナル抗体が認識する糖鎖不全ＣＤ２７細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体が挙げられる。
　ハイブリドーマＫＭ４０３０は平成２０年６月５日付でブダペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（３０５－８５６６　日本国　茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）にＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９７６として寄託されている。
　遺伝子組換え抗体としては、例えば、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および該抗体断片などの、遺伝子組換え技術により製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、抗原結合活性を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
　ヒト型キメラ抗体は、非ヒト抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）および軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記する）および軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記する）とからなる抗体をいう。
　本発明のヒト型キメラ抗体は、以下のようにして製造することができる。すなわち、本発明の、糖鎖不全ＣＤ２７を特異的に認識、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、もしくは糖鎖不全ＣＤ２７を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して抗体を発現させて作製することができる。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
　また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト型キメラ抗体としては、以下の（１）～（５）のヒト型キメラ抗体が挙げられる。
（１）抗体のＶＨが配列番号２５で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬが配列番号３５で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体
（２）抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬが配列番号３６で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体
（３）抗体のＶＨが配列番号２７で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬが配列番号３７で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体
（４）抗体のＶＨが配列番号２８で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬが配列番号３８で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体
（５）抗体のＶＨが配列番号２９で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬが配列番号３９で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体
　また、本発明のヒト型キメラ抗体としては、以下の（１）～（５）のヒト型キメラ抗体が挙げられる。
（１）抗体のＶＨが配列番号４０～４２で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号４３～４５で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＬであるヒト型キメラ抗体
（２）抗体のＶＨが配列番号４６～４８で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号４９～５１で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＬであるヒト型キメラ抗体
（３）抗体のＶＨが配列番号５２～５４で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号５５～５７で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（４）抗体のＶＨが配列番号５８～６０で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号６１～６３で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＬであるヒト型キメラ抗体
（５）抗体のＶＨが配列番号６４～６６で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号６７～６９で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＬであるヒト型キメラ抗体
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいい、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）ともいう。
　本発明のヒト化抗体は、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生される非ヒト抗体の、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと記す）に移植した抗体可変領域（以下、Ｖ領域と記す）をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに、それぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　本発明のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）などに記載の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
　本発明のヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
　また、本発明のヒト化抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト化抗体としては、以下の（１）～（５）のヒト化抗体が挙げられる。
（１）抗体のＶＨのＣＤＲ１～３が配列番号４０～４２で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１～３が配列番号４３～４５で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体
（２）抗体のＶＨのＣＤＲ１～３が配列番号４６～４８で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１～３が配列番号４９～５１で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体
（３）抗体のＶＨのＣＤＲ１～３が配列番号５２～５４で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１～３が配列番号５５～５７で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体
（４）抗体のＶＨのＣＤＲ１～３が配列番号５８～６０で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１～３が配列番号６１～６３で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体
（５）抗体のＶＨのＣＤＲ１～３が配列番号６４～６６で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１～３が配列番号６７～６９で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体
　更に、本発明のヒト化抗体としては、具体的には、以下の（ａ）ＶＨおよび（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が好ましい。なお、以下の（ａ）および（ｂ）において、導入される改変の数に制限はない。
（ａ）配列番号９６で表されるアミノ酸配列、または配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒ、４８番目のＶａｌ、４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａおよび１１７番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（ｂ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列、または配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅ、４０番目のＰｒｏ、５８番目のＶａｌ、８５番目のＴｈｒ、および８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
　本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、例えば、配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒ、４８番目のＶａｌ、４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、および９７番目のＡｌａが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨが挙げられる。
　中でも、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）および（２）が好ましい。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌ、４９番目のＳｅｒ、および９７番目のＡｌａが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒ、および９７番目のＡｌａが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
　前記ＶＨのアミノ酸配列としては、配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　前記ＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の１～７個の改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
　６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
　５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（２１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
　４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（３５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（３５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および４９番目のＳｅｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
　２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（２１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、および４８番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、および４９番目のＳｅｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および４９番目のＳｅｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
　１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の４９番目のＳｅｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の７７番目のＡｓｎをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の９７番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換したアミノ酸配列
　より具体的な本発明のヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列としては、配列番号９６、１０５及び１０７で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、例えば、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅ、４０番目のＰｒｏ、５８番目のＶａｌ、８５番目のＴｈｒ、および８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ挙げられる。　　　
　中でも、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏ、５８番目のＶａｌ、および８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列が好ましい。
　上記のＶＬのアミノ酸配列としては、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　前記ＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の１～５個の改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列などが挙げられる。
　４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
　３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、および５８番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
　２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、および４０番目のＰｒｏをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、および５８番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、および５８番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の５８番目のＶａｌをＩｌｅに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
　１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに置換したアミノ酸配列、５８番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列、８５番目のＴｈｒをＡｌａに置換したアミノ酸配列、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列、が挙げられる。
　より具体的な本発明のヒト化抗体のＶＬとしては、配列番号９７で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
　また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、以下の（１）～（５）の抗体が挙げられる。
（１）配列番号９６で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＨ鎖および配列番号９７で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＬ鎖の少なくとも一方を含むヒト化抗体
（２）配列番号１０１で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＨ鎖および配列番号９７で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＬ鎖の少なくとも一方を含むヒト化抗体
（３）配列番号１０３で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＨ鎖および配列番号９７で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＬ鎖の少なくとも一方を含むヒト化抗体
（４）配列番号１０５で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＨ鎖および配列番号９７で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＬ鎖の少なくとも一方を含むヒト化抗体
（５）配列番号１０７で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＨ鎖および配列番号９７で示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＬ鎖の少なくとも一方を含むヒト化抗体　
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に内在的に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的および発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に内在的に存在する抗体としては、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖およびＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
　上述の抗体または抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体またはその抗体断片と同様な活性を有する抗体またはその抗体断片も、本発明の抗体またはその抗体断片に包含される。
　欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。
　上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンおよびＬ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本抗体のエフェクター活性としては、例えば、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、抗体依存性貪食活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＣＰ）およびオプソニン化効果などが挙げられ、種々の方法で制御することができる。
　エフェクター活性を制御する方法としては、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖を制御する方法、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基をアミノ酸改変する方法などが挙げられる。
　抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖を制御する方法としては、例えば、ＩｇＧ抗体の２９７番目の糖鎖を除去することでＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低下させる方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２，１３１１，（１９９５），国際公開第２００８／０３０５６４号］および抗体のＦｃ領域へのガラクトースの結合を低下させてＣＤＣ活性を低下させる方法などが挙げられる。
　また、抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖を制御する方法としては、例えば、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギンに結合したＮ結合型糖鎖において、糖鎖が結合している基部のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に、フコースが結合していない糖鎖を含む抗体を生産する方法（ＵＳ７，２１４，７７５、ＵＳ６，９４６，２９２）、ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ　ＧｌｃＮＡｃを結合させた糖鎖を含む抗体を生産させる方法［Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１７６，（１９９９）］、非還元末端に結合したガラクトース（Ｇａｌ）を結合させた糖鎖を有する抗体を生産させる方法［Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，１４３－１５１，（１９９４）］などの方法を挙げることができる。
　抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基をアミノ酸改変する方法としては、例えば、抗体のＦｃ領域のアミノ酸改変を行うことでエフェクター活性を制御する方法（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７７，２６７３３－２６７４０，２００２、ＵＳ６，７３７，０５６、ＵＳ７，２９７，７７５、ＵＳ２００７／００２０２６０、国際公開第２００５／０７０９６３号）、および抗体のＦｃ領域の各サブクラス間のドメイン交換を行うことでエフェクター活性を制御する方法（国際公開第２００７／０１１０４１号）などが挙げられる。
　本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙおよびｄｓＦｖなどが挙げられる。
　本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦａｂは、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素ペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
　本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させ、作製することができる。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦａｂ’は、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のｓｃＦｖは、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
　本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　本発明のｄｓＦｖは、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
　本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）およびｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明には、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または抗体断片に、薬剤、タンパク質および放射性同位元素などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体とのコンジュゲートを包含する。
　本発明のコンジュゲートは、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらには抗体またはその抗体断片中の糖鎖などに薬剤、タンパク質、放射性同位元素などを化学的手法［抗体工学入門、金光修著、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
　また、本発明の糖鎖不全ＣＤ２７タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたいタンパク質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを、原核生物または真核生物の宿主細胞へ導入するという遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
　薬剤としては、例えば、化学療法剤、抗体医薬、免疫賦活剤および高分子の薬剤などが挙げられる。
　タンパク質としては、例えば、サイトカイン、増殖因子および毒素タンパク質などが挙げられる。
　さらに、抗体または該抗体断片に結合させる薬剤は、プロドラッグの形態でもよい。本発明におけるプロドラッグとは、腫瘍環境に存在する酵素などによって化学的な修飾を受け、癌細胞を傷害する作用を有する物質に変換される薬剤をいう。
　化学療法剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤およびキナーゼ阻害剤などのいかなる化学療法剤も包含される。
　化学療法剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノゾーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ－１１、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、Ｆｌｔ３阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｏｔｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、イレッサおよびタルセバなど）ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（例えば、ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（例えば、アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、１３１トシツテマブ、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセートおよびＭａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ並びにその誘導体などが挙げられる。
　化学療法剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して化学療法剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、および水溶性カルボジイミドを介して化学療法剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等が挙げられる。
　抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原および病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
　抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩおよびＥＧＦＲなどが挙げられる。
　腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４など）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１およびＢＴＬＡなど）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（例えば、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２など）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン［例えば、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１α（以下、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎをＩＬと記す）、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）βおよびＴＮＦα等］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣおよびＣＴＡＣＫ等）並びにこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
　病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ－８、ＥｐｈｉｌｉｎおよびＳＤＦ－１など、並びにこれらの受容体が挙げられる。
　免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤として、β－１，３－グルカン（例えば、レンチナンおよびシゾフィランなど）、αガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）、菌体粉末（例えば、ピシバニールおよびＢＣＧなど）、菌体抽出物（例えば、クレスチンなど）が挙げられる。
　高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマーおよびヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
　これらの高分子薬剤を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
　ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、例えば、リジンのε－アミノ基の修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）およびアルギニンのグアニジノ基の修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　サイトカインまたは増殖因子としては、ＮＫ細胞、マクロファージおよび好中球などの細胞を亢進するサイトカインまたは増殖因子であればいかなるものでもよいが、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびマクロファージ刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
　毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシンおよびＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
　放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、１９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１等が挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法等によって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　本発明においては、本発明で用いられる抗体と、１つ以上の他の薬剤とを組み合わせて投与すること、または放射線照射とを組み合わせることもできる。他の薬剤としては、上述の化学療法剤、抗体医薬、免疫賦活剤、サイトカインまたは増殖因子などが挙げられる。
　放射線照射としては、Ｘ線およびγ線などの光子（電磁波）照射、電子線、陽子線および重粒子線などの粒子線照射などが含まれる。
　組み合わせて投与する方法としては、本発明で用いられる抗体との同時投与でもよいし、また、本発明で用いられる抗体の投与と前後して投与しても構わない。
　本発明の検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬は、特定の標識体を本発明の抗体に標識して用いる方法が挙げられる。標識体としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、フルオレシン・イソチアネート（ＦＩＴＣ）、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　以下に、本発明の抗体の製造方法について、具体的に説明する。
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　下記に記載の方法により、ＣＤ２７全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、Ｏ結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与する蛋白質またはＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅの輸送に関わるタンパク質などの活性が低下または欠損した酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入することにより、抗原となる糖鎖不全ＣＤ２７もしくは糖鎖不全ＣＤ２７を発現させた細胞を得ることができる。
　また、糖鎖不全ＣＤ２７を細胞膜上または培養液中に多量に発現している各種ヒト由来培養細胞、ヒト組織などから、糖鎖不全ＣＤ２７を精製して抗原を調製する方法、または糖鎖不全ＣＤ２７の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原として用いることもできる。更に、糖鎖付加能のない大腸菌等の原核生物を用いて発現、精製したＣＤ２７に、試験管内で糖鎖を付加することで、糖鎖不全ＣＤ２７を得ることができる。
　また、同様にして、正常なＯ結合型糖鎖合成プロセスを有する酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞に、ＣＤ２７全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを導入することで、正常なＯ結合型糖鎖を有するＣＤ２７を発現させた細胞を取得することができ、該細胞から正常なＯ結合型糖鎖を有するＣＤ２７タンパク質を精製することができる。
　上述のようにして得られた、糖鎖不全ＣＤ２７、正常Ｏ結合型糖鎖を有するＣＤ２７のタンパク質または発現細胞は、目的の抗体のスクリーニング、取得された抗体の抗原に対する反応性を確認するために、使用することができる。
　本発明で用いられるポリペプチドとしては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ＩＮ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）などに記載された方法等を用い、該ポリペプチドコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　例えば、以下の方法により、製造することができる。まず、全長ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際もし必要であれば、全長ｃＤＮＡをもとにしてポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、上記全長ｃＤＮＡの代わりに該ＤＮＡ断片を使用してもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞等、Ｏ結合型糖鎖を付加する能力を有し、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれをも用いることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
　大腸菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合には、本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明において用いられるＤＮＡ及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。該組換えベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１　［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０　［大腸菌　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２　［大腸菌　ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報）、ｐＧＫＡ２［大腸菌　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１，ＵＳ４９３９０９４，）ＵＳ５１６０７３５］、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０））、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３等を挙げることができる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃ　Ｔ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
　また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とするポリペプチドの生産率を向上させることができる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　宿主細胞としては、エシェリヒア属等に属する微生物、例えば、大腸菌　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌　ＤＨ１、大腸菌　ＭＣ１０００、大腸菌　ＫＹ３２７６、大腸菌　Ｗ１４８５、大腸菌　ＪＭ１０９、大腸菌　ＨＢ１０１、大腸菌　Ｎｏ．４９、大腸菌　Ｗ３１１０、大腸菌　ＮＹ４９および大腸菌　ＤＨ５α等を挙げることができる。
　組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
　動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報］Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８　［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［国際公開第９７／１０３５４号］などを挙げることができる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）のプロモーターおよびエンハンサー等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、糖鎖合成経路のうちポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＮ－アセチルガラクサミン（ＧａｌＮＡｃ）にＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはｕｒｉｄｉｎｅ　５’－ｄｉｐｈｏｓｐａｔｅ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ（ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の輸送に関わるタンパク質などの活性を、低下または欠損させた細胞株であればいかなるものでもよい。具体的には、ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒが欠損したチャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞）であるＬｅｃ８変異体［ＡＣＳ　Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．１２８，２１４　］（１９８０））が挙げられる。
　更に、糖鎖合成経路に関連する酵素、輸送タンパク質の活性が欠損していない細胞であっても、ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（別名ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ；ＵＧＡＬＴ）または、ｃｏｒｅ　１　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ　３－ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，（Ｃ１ＧＡＬＴ１、別名ｃｏｒｅ　１　ｂｅｔａ－３－ｇａｌ－ｔ、ｔ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）またはＣ１ＧＡＬＴ１－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅ　１（ｃ１ｇａｌｔ１ｃ１、別名ｃｏｒｅ　１　ｂｅｔａ－３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅ（ＣＯＳＭＣ）、Ｃ１ＧＡＬＴ２）などの酵素、輸送タンパク質の機能を、低下もしくは欠損させた細胞株を用いることができる。
　糖鎖合成経路に関連する酵素、輸送タンパク質の活性が欠損していない細胞としては、たとえば（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－２９９号公報）等が挙げられる。
そのような対象となる酵素群としては、などが挙げることができる。
　遺伝子機能を低下させる方法としては、例えば、アンチセンス法、リボザイム法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，１８８６（１９９９）］、相同組換え法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　］Ｐｒｅｓｓ（１９９３）］、ＲＮＡ－ＤＮＡ　ｏｌｏｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）法［Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５，１５５０２，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ，３９５，８５４，（１９９８）、］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，５０４９，（１９９９）、Ｃｅｌｌ，９５，１０１７，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４５１，（１９９９）　ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１３９５９，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ）Ｂｉｏｌ．，２，７０，（２０００）］、レトロウイルスを用いた方法およびトランスポゾンを用いた方法［Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５，３５，（２０００）］等が挙げられる。
　ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）およびリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを挙げることができる。
　遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている方法等に準じて、分泌生産および融合タンパク質発現等を行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
　以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ポリペプチドを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］又はこれら培地にＦＣＳ等を添加した培地等を用いることができる。
　培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％　ＣＯ２存在下等の条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　上記のとおり、本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞等由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養して該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より採取することにより、本発明において用いられるポリペプチドを製造することができる。
　遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。　
　ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、および生産させるポリペプチドの構造などを変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ポリペプチドが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、］Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））、又は日本国特開平０５－３３６９６３号公報および国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を用いることで、該遺伝子産物を宿主細胞外に分泌させることができる。また、日本国特開平２－２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
　ポリペプチドは、例えば、以下のようにして単離・精製することができる。
　ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法およびＳ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、並びに等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　また、ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ポリペプチドの不溶体を回収する。回収した該ポリペプチドの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）およびｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ－Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＣＤ２７ノックアウト動物を被免疫動物として用いる方法もある。
　免疫は、動物の皮下若しくは静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＦＲｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）および水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど］とともに抗原を投与することにより行う。
　抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを脾臓細胞の供給源として提供する。
　脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３～７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス－塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１～２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾臓細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、－ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが用いられる。
　前記細胞株は、８－アザグアニン培地［ＲＰＭＩ－１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２－メルカプトエタノール（５×１０－５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８－アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
　前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３　ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００　ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）２ｇ、ＭＥＭ　２ｍＬおよびジメチルスルホキシド　０．７ｍＬの混液　０．２～１ｍＬ／１０８　抗体産生細胞を加え、１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。
　遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０－７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地］１００ｍＬ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％　ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部をとり後で述べるバインディングアッセイなどにより、本発明において用いられるポリペプチドを含む抗原に反応し、ポリペプチドを含まない抗原に反応しないものを選択する。
　また、ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ］０．５　ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ＣＤ２７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６～５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。
　前記マウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０～５０％　硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）バインディングアッセイ
　抗原としては、本項（１）に記載の方法により、本発明において用いられるＣＤ２７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得た遺伝子導入細胞またはリコンビナントタンパク質、またはヒト組織から得た精製ポリペプチドまたは部分ペプチドを用いる。
　抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
　これら抗原を９６ウェルプレートに分注し固相化した後、第１抗体として、被免疫動物血清、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体を分注して反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物等で標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行う。
　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体と競合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
　また、糖鎖不全ＣＤ２７を認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な糖鎖結合ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた糖鎖結合ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬ用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどが挙げられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることも、ｃＤＮＡを用いることもできるが、ｃＤＮＡを用いるのが好ましい。
　動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）］およびｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）〕などが挙げられる。
　動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４万９９６０（１９８７）〕、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］が挙げられる。また、動物細胞用発現ベクターに用いるエンハンサーとしては、例えば、エンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］などが挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプ、または同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、並びに動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターの方が好ましい［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］。
　タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［国際公開第９７／１０３５４号］およびｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）］などが挙げられる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡは以下の様にして取得することができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ファージおよびプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。
　組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどのハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、例えば、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］等が挙げられる。また、キットとしては、例えば、ＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等が挙げられる。
　全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、例えば、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９］］等が挙げられる。また、キットとしては、例えば、ＯｌｉｇｏＴＭ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）等が挙げられる。
　ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、例えば、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＱｕｉｃｋ　Ｐｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。
　ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、例えば、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９］；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３４）が挙げられる。また、市販のキットとしては、例えば、Ｓｕｐｅｒ　ＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等が挙げられる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
　例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３　１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。
　例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープまたは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９］］により選択することができる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３４］により、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
　決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認することができる。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。
　また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
　更にＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴおよびＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎ等に対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］等の配列の相同性検索を行い、用いるアミノ酸配列が新規なものであるかどうかを確認することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　本項２の（１）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計した、ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。
　作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、それぞれを本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項２の（１）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでもよい。
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］等が挙げられる。
　抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。
　設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
　また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにそれぞれクローニングし、本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下してしまうことが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。
　この原因としては、元の非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬでは、ＣＤＲだけでなく、ＦＲ内のアミノ酸残基が直接的または間接的に抗原結合活性に関与しているため、ヒト化により非ヒト抗体のＦＲのアミノ酸残基が、ヒト抗体のＦＲのアミノ酸残基に置換されると、結抗原合活性が低下してしまうと考えられている。
　この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。
　ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］またはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。
　これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項２の（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　本項２の（１）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、本項２の（４）及び（５）でヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングすることができる。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項２の（３）及び（６）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
　中でも、好ましくは、その発現量の高さから、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入法としては、例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等が挙げられる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は、酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］等により測定できる。
（８）遺伝子組換え抗体の安定発現
　本項２の（３）及び（６）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等が挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
　例えば、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８０）、２種類のチャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ｄｈＦｒ－細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ９０９６）及びＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第０５／３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）並びにラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６６２）などが挙げられる。
　上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくは国際公開第０５／３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号等に記載のα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、日本国特開平２－２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する：ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。
　動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。
　得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、日本国特開平２－２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ増幅系等を利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。
　また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］およびウエスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で測定することができる。
３．本発明の抗体または抗体断片の活性評価
　精製した本発明の抗体または抗体断片の反応特異性は、下記のようにして評価することができる。
　正常型糖鎖を発現する細胞、およびＯ結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したＧａｌＮＡｃにＧａｌを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはｕｒｉｄｉｎｅ　５’－ｄｉｐｈｏｓｐａｔｅ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ（ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の輸送に関わるタンパク質などの活性が、低下または欠損した細胞株を宿主として、ＣＤ２７コードする塩基配列（配列番号１）を発現させたＣＤ２７発現細胞をそれぞれ作製することができる。
　このようにして、正常Ｏ結合型糖鎖を有するＣＤ２７を発現した細胞、糖鎖不全ＣＤ２７を発現した細胞を作製し、それぞれのＣＤ２７を発現する細胞株と精製抗体との反応性を、ＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］などで測定することができる。
　また、ＣＤ２７の細胞外ドメインを融合タンパク質などの可溶化体として上述の宿主細胞にそれぞれ発現させ、適切な条件下で精製することで、立体構造を保持したＣＤ２７可溶型タンパク質をそれぞれ調製することができる。
　融合タンパク質としては、ＣＤ２７タンパク質を、抗体定常領域（Ｆｃともいう）、ＧＳＴタグ、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグともいう）またはＭｙｃタグなどの別のポリペプチドと融合したものが挙げられる。該融合タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、ニッケルカラム、特異的抗体カラムなどの、アフィニティーカラムを用いることにより分離精製することができる。
　これら精製ＣＤ２７可溶型タンパク質と精製抗体との反応性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したＢＩＡｃｏｒｅＴＭ、ＥＬＩＳＡ法および免疫沈降法等により測定することもできる［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。
　糖鎖不全ＣＤ２７を発現している培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性等を、公知の方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］で測定し、評価することができる。
４．本発明の糖鎖不全ＣＤ２７を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体抗体またはその抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明の抗体または該抗体断片を用いて糖鎖不全ＣＤ２７または該ポリペプチドが発現した細胞を検出または定量することにより、糖鎖不全ＣＤ２７が関連する疾患を診断することができる。
　糖鎖不全ＣＤ２７が関与する疾患としては、生体内において糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドが発現している細胞が見出される疾患であればいかなるものも包含する。具体的にはＩｇＡ腎症または癌が挙げられる。癌としては、例えば、ＢまたはＴ細胞分化過程由来の癌が挙げられる。
　具体的には、例えば、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、モルトリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫および形質細胞腫等の種々の非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。
　本発明において糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを検出または測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液および培養液など、該ポリペプチドを含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　糖鎖不全ＣＤ２７が関連する疾患のうち、例えばＩｇＡ腎症の診断は以下のようにして行うことができる。
　複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドの検出または測定を行い、健常者の生体試料中の該ポリペプチドの発現量を確認する。
　被験者の生体試料中についても同様に該ポリペプチドの発現量を調べ、その発現量を健常者の発現量と比較する。被験者の該ポリペプチドの発現量が健常者と比較して増加している場合には、ＩｇＡ腎症である、または将来ＩｇＡ腎症を発症する可能性が高いと診断することができる。
　糖鎖不全ＣＤ２７が関連する疾患のうち、例えば癌の診断は以下のようにして行うことができる。
　複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、糖鎖不全ＣＤ２７の検出または測定を行い、健常者の生体試料中の該ポリペプチドの発現量を確認する。
　被験者の生体試料中についても同様に該ポリペプチドの発現量を調べ、その発現量を健常者の発現量と比較する。被験者の該ポリペプチドの発現量が健常者と比較して増加している場合には、癌が陽性であると診断することができる。
　本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断方法に応じて、抗原抗体反応を行うための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行うための試薬としては、例えば、緩衝剤および塩などが挙げられる。
　検出用試薬としては、抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、標識物の基質など、通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　本発明において糖鎖不全ＣＤ２７の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出および測定方法などが挙げられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット法および物理化学的手法（例えば、ＴＩＡ、ＬＡＰＩＡおよびＰＣＩＡなど）などが挙げられる。
　放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法が挙げられる。
　酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法が挙げられ、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などが用いられる。
　酵素免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識およびビオチン標識などを用いることができる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定したい抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、一方の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンなどで標識しておく。
　上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。
　前記方法により、被験サンプル中の抗原濃度を測定する場合には、濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出することができる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）としては、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法が挙げられる。
　蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社）の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ標識およびＲＩＴＣ標識などを用いることができる。
　発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）としては、例えば、［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法を用いて行うことができる。
　発光免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査４２（１９９８）］の発光体標識が挙げられる。例えば、アクリジニウムエステル標識およびロフィン標識などを用いることができる。
　ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法である。ウエスタンブロット法の一例を以下に示す。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞または組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
　ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬＴＭＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出することができる。
　ウエスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法とは、具体的には、本発明の抗体または該抗体断片を用いて、抗原であるガラクトースを欠損したＯ型糖鎖を結合するＣＤ２７と本発明の抗体または該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。
　この他に物理化学的手法としては、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法およびラテックス免疫比濁法等が挙げられる［臨床検査法提要、金原出版，４９９（１９９８）］。
　例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックス等の担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定することができる。
　本発明の抗体または該抗体断片は、糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドの細胞外領域に結合できるため、該ポリペプチドが発現している細胞の検出に好適に用いられる。該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、免疫細胞染色法、および免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）を用いる蛍光抗体染色法なども用いることができる。
　免疫沈降法とは、該ポリペプチドを発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体または抗体断片と反応させた後、プロテインＧ－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。または以下のような方法によっても行うことができる。
　ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明の抗体または該抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が精製されていない状態の例えばハイブリドーマ株培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン若しくはラットイムノグロブリンまたはプロテインＡ若しくはＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化しＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ株培養上清を分注して結合させる。
　ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞または組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウエスタンブロッティングにより検出を行う。
　免疫細胞染色法および免疫組織染色法とは抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤およびメタノールなどで処理した後、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡するか、または蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ－サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）である。
　例えば、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法を用いて行うことができる。
　特に、本発明の抗体または該抗体断片は、糖鎖不全ＣＤ２７の細胞外領域に結合できるため、細胞膜上に天然型の立体構造を保持して発現しているＣＤ２７を検出するフローサイトメトリーの解析に好ましく用いられる。
　また、蛍光抗体染色法の原理を利用したＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）を用いることにより、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定することができる。
５．本発明の糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明の糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片は、糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。
　糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドが関与する疾患としては、生体内において該ポリペプチドを発現している細胞が見出される疾患であればいかなるものでもよく、例えば、ＩｇＡ腎症および癌などが挙げられる。
　更に、ＩｇＡ腎症を発症し、ネフローゼ症候群を呈する疾患および腎不全を呈するものも、疾患として挙げることができる。
　癌としては、例えば、造血器由来の腫瘍（血液癌ともいう）および上皮由来の固形癌が挙げられる。
　血液癌としては、具体的には、例えば、白血病およびリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ　ｌｙｍｐｈｏｍａ、ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ　ｌｙｍｐｈｏｍａ）多発性骨髄腫などが挙げられる。
　具体的なｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ　ｌｙｍｐｈｏｍａとしては、例えば、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、モルトリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫および形質細胞腫などが挙げられる。
　固形癌としては、具体的には、例えば、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌および膵臓癌などが挙げられる。
　本発明の治療剤としては、本発明の抗体または該抗体断片を有効成分とする癌の治療剤が挙げられる。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性などのエフェクター活性を有するがん治療剤、並びにアポトーシス誘導作用による癌の治療剤等も、本発明の治療剤として包含される。
　本発明の抗体または該抗体断片は、細胞膜に発現している糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを認識することができるので、生体内で存在する糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを発現している細胞を認識することができる。
　従って、本発明の抗体または該抗体断片で、かつエフェクター活性を有する抗体または該抗体断片は、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチドを発現している細胞を傷害することができる。
　また、このような本発明の抗体または該抗体断片は、生体内の糖鎖不全ＣＤ２７ポリペプチド発現細胞を傷害し、減少させることができるので、治療剤として特に有効に用いられる。
　本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与を挙げることができる。抗体またはペプチド製剤の場合、好ましくは静脈内投与を挙げることができる。
　投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などが挙げられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールおよび果糖などの糖類、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油および大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバーおよびペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
　カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖およびマンニトールなどの賦形剤、デンプンおよびアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、並びにグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤および噴霧剤などが挙げられる。注射剤は、塩溶液およびブドウ糖溶液並びに両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体または抗体断片自体、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体または抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
　担体として、具体的には、乳糖、グリセリンなどが例示される。抗体または抗体断片および用いる担体の性質により、エアロゾルおよびドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～８ｍｇ／ｋｇである。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含む可溶型ＣＤ２７細胞外ドメインの作製（以下、糖鎖不全ＣＤ２７と記載することもある）
（１）ヒトＣＤ２７遺伝子のクローニング
　クロンテック社より購入したヒト末梢血由来ｃＤＮＡライブラリーより、以下の手順でＣＤ２７をコードする遺伝子を単離した。１倍濃度のＢＤ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ緩衝液（クロンテック社製）および１倍濃度の添付ｄＮＴＰを含む反応液にヒト末梢血単核球由来一本鎖ｃＤＮＡ　２５ｎｇ、０．２μｍｏｌ／Ｌ　ｃｄ２７ｆｗ（配列番号３）、０．２μｍｏｌ／Ｌ　ｃｄ２７８０９Ｂ（配列番号４）および１倍濃度のＡｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（クローンテック社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。
　反応条件は９８℃　１５秒間、６８℃　３０秒間のサイクルを３０サイクル行った。該反応液を２％アガロースゲル電気泳動で分離後、約１ｋｂｐのＰＣＲ産物をＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ－２．１ベクターに挿入した。ＰＣＲ増幅断片が挿入されたプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調製し、ＤＮＡ配列を確認した結果、配列番号１記載のＤＮＡ配列を有するｐＣＲ　２．１　ＣＤ２７を取得した（図１）。
（２）ヒトＣＤ２７細胞外ドメインを有する遺伝子をクローン化したプラスミドの構築
　次に以下に示すＰＣＲ反応を行うことによりＣ末端側に存在する膜貫通領域を除去したＣＤ２７をコードするｃＤＮＡの単離を行った。０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを含む反応液に、１ｎｇのｐＣＲ　２．１　ＣＤ２７、１μｍｏｌ／Ｌ　ＣＤ２７－Ａ（配列番号５）、１μｍｏｌ／Ｌ　ＣＤ２７－Ｂ（配列番号６）および２．５単位のＫＯＤ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、合計５０μＬとし、９８℃　１５秒間、６８℃　３０秒間のサイクルを２５サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。
　前記反応液を２％アガロースゲル電気泳動で分離後、約６００ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクターに導入した。本ヒトＣＤ２７細胞外ドメインを有する遺伝子をクローン化したプラスミドをｐＣＲＣＤ２７ａｘｂとした（図２）。
（３）変異型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を有するベクターｐＢＳｈＣγ４ＳＰの構築
　国際公開第９７／１０３５４号に記載の野生型ヒトＩｇＧ４サブクラスのＣ領域をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳｈＣγ４を用いて、野生型ヒトＩｇＧ４サブクラスのＣ領域（ヒンジ領域）の１０８番目のＳｅｒがＰｒｏに置換された変異型ヒトＩｇＧ４サブクラスのＣ領域を有するプラスミドｐＢＳｈＣγ４ＳＰを構築した。本改変を行うことによりＩｇＧヒンジ領域を介した２量体形成が安定化することが知られている（モレキュラー・イムノロジー、３０，１０５，１９９３）。
　鋳型としてプラスミドｐＢＳｈＣγ４の１ｎｇを含む５０μＬの反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％　ゼラチン、２００μＭ　ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号７）、０．５μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号８）および２ｕｎｉｔｓのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて２分間、５５℃にて２分間、７２℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行った。
　反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従い精製後、制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉ（タカラバイオ社製）で処理し、０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従い、増幅断片を回収した。
　プラスミドｐＢＳｈＣγ４を制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉで切断後、Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社製）処理により５’末端のリン酸を除去し、同様に０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて添付の使用説明書に従い、プラスミド断片を回収した。回収した増幅断片とプラスミドｐＢＳｈＣγ４由来のプラスミド断片を連結し、目的のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳｈＣγ４ＳＰを構築した（図３）。
（４）ヒトＩｇＧ４Ｆｃの部分配列を含むｃＤＮＡのクローニング
　以下に示すＰＣＲ反応を行うことにより、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素を有するヒトＩｇＧ４ＦｃをコードするＤＮＡ断片を増幅した。０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを含む反応液に上記（３）で構築したｐＢＳｈＣγ４ＳＰ　２５　ｎｇ、１μｍｏｌ／Ｌ　ｇ４Ａ（配列番号９）、１μｍｏｌ／Ｌ　ｇ４Ｂ（配列番号１０）および２．５単位のＫＯＤ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。
　反応条件は９８℃　１５秒間、６８℃　３０秒間のサイクルを２５サイクルで行った。該反応液を２％アガロースゲル電気泳動で分離後、約７００　ｂｐのＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクターに導入した。本プラスミドをｐＣＲＩｇＧ４ＦｃＢａｍＨＩＳａｌＩ（図４）とした。
（５）動物細胞用発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩの構築
　国際公開第９７／１０３５４号に記載されているヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）および制限酵素ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約９．８　ｋｂｐのプラスミド断片を回収した。回収したＤＮＡ断片の５’および３’末端をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。
　得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離し、抗体Ｌ鎖の発現ユニットが除かれていることを制限酵素ＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）およびＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）消化により確認した。該プラスミドをｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩと命名した（図５）。
（６）可溶型ＣＤ２７細胞外ドメイン発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７ＩｇＧ４Ｆｃの作製
　上記（２）で作製したｐＣＲ　２．１　ＣＤ２７ａｘｂを、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化することにより得られる、約６００ｂｐの断片、および上記（３）で作製したｐＣＲＩｇＧ４ＦｃＢａｍＨＩＳａｌＩをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ消化して得られる約７００　ｂｐのＤＮＡ断片を、上記（５）で得られたｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化して得られる約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片に連結することにより、ＣＤ２７－Ｆｃを発現するためのプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７ＩｇＧ４Ｆｃを得た（図６）。
　前記プラスミドにコードされる可溶型ＣＤ２７－Ｆｃ融合タンパク質（以下、ＣＤ２７－Ｆｃと記載することもある）の遺伝子配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に記載した。該発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌を１００ｍＬのＬＢ培地に播種し、一晩培養を行った後に回収し、Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドを精製した。
　精製後、３０μｇのプラスミドベクターを制限酵素ＡａｔＩＩ消化により線状化した。線状化後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、１／１０濃度ＴＥバッファー（１ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した後、ＤＮＡ濃度を測定し、遺伝子導入に供した。
（７）ＣＤ２７－Ｆｃの発現
　ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）、以下、ＤＧ４４と記す）またはＬｅｃ８細胞へのＣＤ２７－Ｆｃ発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７ＩｇＧ４Ｆｃの導入は、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー，　３，　１３３（１９９０）］に準じて、以下の手順で行った。
　まず、基本培地［１０％　ウシ胎児透析血清（インビトロージェン社）および５０μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社）および１×ＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロージェン社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）］で継代したＤＧ４４細胞を、Ｋ－ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０６個／ｍＬとし、細胞懸濁液を調製した。
　調製した細胞懸濁液２００μＬ（１．８×１０６個）を上記（６）で調製した線状化プラスミドｐＫＡＮＴＥＸＣＤ２７ＩｇＧ４Ｆｃ　１０μｇと混和した。但しＬｅｃ８細胞の継代は、１×ＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加しない基本培地（以下、ＨＴ－培地と記す）で行った。
　該細胞ＤＮＡ混和液をＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）へ移した後、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて、パルス電圧０．３５　ＫＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。
　該細胞懸濁液を、ＨＴ－培地［１０％　ウシ胎児透析血清（インビトロージェン社製）および５０μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）］１０ｍＬに混和し、７５ｃｍ２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。３日間培養した後、Ｇ４１８（シグマ社製）を最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して、さらに１０日間培養した。
　１０日後、１８２ｃｍ２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に継代し、コンフルエントになるまで培養を続けた。コンフルエントになった時点で、無血清培地ＥＸＣＥＬＬ３０１（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に培地交換を行い、１週間培養後、培養上清を回収し、下記に記載の方法で精製を行った。
（８）ＣＤ２７－Ｆｃの精製
　（７）で培養を行った培養上清を、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて上清を濾過した。０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）　０．５ｍＬを充填し、精製水　３．０ｍＬおよび０．２Ｍ　ホウ酸－０．１５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ホウ酸バッファーと記す）３．０ｍＬを順次通塔した。
　さらに、０．１Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．０ｍＬおよびホウ酸バッファー１．５ｍＬで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清をカラムに通塔した後、ホウ酸バッファー３．０ｍＬで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１．２５ｍＬを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。
　溶出は２５０μＬずつ、５画分に分けて取得した。次に、得られた精製画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を行い、目的蛋白質の溶出が確認された画分をまとめ、ＰＢＳバファーを用いて、４℃で一昼夜透析を行った。
　透析後、ＣＤ２７－Ｆｃ溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて滅菌濾過した後に、２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０ｎｍ）を、吸光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＵＶ－１７００）を用いて測定し、ＣＤ２７－Ｆｃ濃度を算出した（ＯＤ２８０ｎｍ＝１．０で０．６８ｍｇ／ｍＬと換算；　εＭ＝１３４６５５，ＭＷ＝９２８４０より算出した）。
　各宿主細胞由来のＣＤ２７－Ｆｃ発現細胞、約３００ｍＬの無血清培養液上清から、Ｌｅｃ８由来ＣＤ２７－Ｆｃを３．６ｍｇ、ＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＣＤ２７－Ｆｃを２．２ｍｇ得た。それぞれのタンパク質について、溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥでの解析結果を図７に示す。
　その結果、還元条件下においては、ＤＧ４４を宿主とした場合に、分子量約６５ｋＤａ、Ｌｅｃ８を宿主とした場合に分子量約４８ｋＤａの位置にＣＤ２７－Ｆｃが観察された。一方、非還元条件においては、還元条件でみられたバンドの約２倍の分子量を示す位置に、それぞれのバンドが観察されたことから、ＣＤ２７－Ｆｃは２量体として存在していることが確認できた。
（９）糖鎖構造の確認
　上記（８）で精製したＣＤ２７－ＦｃをＰＢＳで１０倍に希釈した溶液１６μＬに、５倍濃度のＳＤＳサンプルバッファー　４μＬを添加した後、９０℃、５分間処理したものをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。電気泳動は５－２０％　ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルｅ－ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ－Ｔ５２０Ｌ）を使用し、ＡＴＴＯラピダス・ミニスラブ電気泳動槽で２０ｍＡ／枚の電流で、９０分間電気泳動した。
　ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＰＶＨ３０４Ｆ０）への転写は、ＡＴＴＯホライズブロットを使用し、１８０ｍＡ、９０分間の条件で行った。転写後の膜は１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、１０％ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に浸し、４℃で一晩静置することでブロッキングした。
　その後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて５μｇ／ｍＬに調製した、抗ＲＣＡＳ１抗体クローン２２－１－１（ＭＢＬ社製）Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ０６０－３）を加え、室温２時間反応した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０－ＰＢＳ（和光純薬社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６７－１１５１５）を用いて室温３０分間洗浄した後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳにて２０００倍希釈した２次抗体ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０１６１）で室温１時間反応した。
０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０－ＰＢＳを用い室温で３０分間洗浄した後に、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１０６）を用いて検出した。その結果を図８に示す。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果から、ＤＧ４４由来ＣＤ２７－Ｆｃの分子量は、Ｌｅｃ８由来ＣＤ２７－Ｆｃよりも分子量が大きく、ＤＧ４４細胞とＬｅｃ８細胞を宿主細胞とすることで、ＣＤ２７－Ｆｃに結合する糖鎖構造が異なることが明らかになった。
　また、抗ＲＣＡＳ１抗体２２－１－１は、Ｏ結合型糖鎖であるＴｎ抗原を認識することが明らかにされており、抗Ｔｎ抗体として知られている［Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７８，２２９９８－２３００７，（２００３）］。
　抗Ｔｎ抗体である抗ＲＣＡＳ－１抗体クローン２２－１－１は、ＤＧ４４由来ＣＤ２７－Ｆｃには全く結合しないが、Ｌｅｃ８由来のＣＤ２７－Ｆｃには特異的に結合した。Ｌｅｃ８で生産したＣＤ２７－Ｆｃには、ガラクトースが結合していないＯ型糖鎖であるＴｎ抗原が、結合していることが確認された。
［実施例２］
細胞膜上にＣＤ２７を発現するＣＨＯ細胞の造成
（１）ＣＤ２７発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７の構築
　実施例１で作製したｐＣＲ　２．１　ＣＤ２７より、遺伝子発現に不要なｃＤＮＡ部分を除去したｃＤＮＡ断片を、以下に示すＰＣＲ反応により作製した。
　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを含む反応液に１ｎｇのｐＣＲ　２．１　ＣＤ２７、１μｍｏｌ／Ｌ　ＣＤ２７－Ａ（配列番号５）、１μｍｏｌ／Ｌ　ＣＤ２７－Ｃ（配列番号１３）および２．５単位のＫＯＤ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。
　反応条件は９８℃　１５秒間、６８℃　３０秒間のサイクルを２５サイクルで行った。該反応液を２％　アガロースゲル電気泳動で分離後、約８００ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従って、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクターに導入し、配列番号１記載のＤＮＡ配列を有するｐＣＲ２７ａｘｃ取得した（図９）。
　次に、ｐＣＲ２７ａｘｃを制限酵素ＮｏｔＩおよび制限酵素ＳａｌＩで消化して得られる約７８０ｂｐのＤＮＡ断片を、実施例１で作製したｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩを制限酵素ＮｏｔＩおよび制限酵素ＳａｌＩで消化して得られる、約８．９ｋｂｐのＤＮＡ断片に連結することにより、ＣＤ２７を発現するためのプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７を構築した（図１０）。
　本プラスミドにコードされるＣＤ２７遺伝子配列を配列番号１に、該遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。該発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌を、１００ｍＬのＬＢ培地に播種し、一晩培養を行った。培養後に、菌体を回収し、Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドを精製した。
　精製後、３０μｇのプラスミドベクターを制限酵素ＡａｔＩＩ消化により、線状化した。線状化後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、１／１０濃度ＴＥバッファー（１ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した後、濃度を測定し、遺伝子導入を行った。
（２）ＣＤ２７発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７の導入
　上記（１）で作製したＣＤ２７発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７を、Ｌｅｃ８細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に、遺伝子導入することにより、ＣＤ２７を発現するＬｅｃ８細胞およびＤＧ４４細胞の樹立を行った。導入するプラスミドとしてｐＫＡＮＴＥＸＣＤ２７を用いる以外は実施例１に記載の方法で実施した。
　ただし、遺伝子導入後の細胞は、ＨＴ－培地３０ｍＬに懸濁し、１００μＬ／ウェルとなるように３枚の９６ウェルプレートに播種した。播種２日後に５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８を含む継代用培地に交換し、１０日間培養を行った。１０日後、５０　ｎＭ　ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ　ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＨＴ－培地に交換し、ＭＴＸ耐性株を取得した。Ｌｅｃ８株由来のＣＤ２７発現株をＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４、一方、ＤＧ４４細胞由来のＣＤ２７発現細胞をＣＤ２７／ＤＧ４４－８と命名した。
（３）ＣＤ２７発現細胞の確認
　（２）で作製したＣＤ２７発現細胞のＣＤ２７発現を確認するため、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて、下記のように解析を行った。
　ＣＤ２７発現細胞　１～５×１０６個を１５ｍＬチューブ（ベクトンディッキンソン社製）に分取し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を除いて、５０μＬの１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液［以下、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ（コージンバイオ社製）と記載する］に懸濁した。
　１次抗体として、ＰＣ５で標識された抗ＣＤ２７マウスモノクローナル抗体（ベックマンコールター社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．６６０７１０７）、またはＰＣ５標識マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ベックマンコールター、Ｃａｔ．Ｎｏ．６６０７０１２）を１０μＬ添加し、氷温中で６０分間反応させた。反応後、１ｍＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した後、５００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳに細胞を懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣＭ）（ベクトンディッキンソン社製）で蛍光強度を測定した。
　その結果を図１１に示す。図１１に示したように、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４およびＣＤ２７／ＤＧ４４－８は、ほぼ同程度のＣＤ２７を細胞膜上に発現していることが確認された。
［実施例３］
ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７に対するモノクローナル抗体（以下、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体と記す）の作製
（１）免疫原の調製
　実施例１で得られたＬｅｃ８株生産ＣＤ２７－Ｆｃ　５０μｇを、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ９９、１９８８）２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに、４週令雌ＳＤラット３匹に投与した。
　投与２週間後より、Ｌｅｃ８株生産ＣＤ２７－Ｆｃ　５０μｇを１週間に１回、計３回投与した。尾静脈より部分採血し、得られた抗血清の結合活性を、ＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム（アプライドバイオ社製）または、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００　ＭＰＬ、ベックマンコールター社製）を用いた蛍光細胞染色法により測定し、充分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
　脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス－塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１～２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（２）バインディングＥＬＩＳＡ
　バインディングＥＬＩＳＡに用いる抗原には、実施例１で得られたＬｅｃ８株生産ＣＤ２７－ＦｃおよびＤＧ４４細胞生産ＣＤ２７－Ｆｃをそれぞれ用いた。９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社）に、上記のＣＤ２７－Ｆｃタンパク質を５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。
　該プレートを洗浄後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫動物抗血清またはハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し、２時間放置した。
　該プレートを０．０５％　ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ　２０相当品：和光純薬社製）］－ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記）で洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（Ｚｙｍｅｄ社）を５０μＬ／ウェル加えて室温、１時間放置した。
　該プレートをＴｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ〔２．２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾール－６－スルホン酸）アンモニウム〕基質液〔１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＴＳ－０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２），０．１％Ｈ２Ｏ２〕を添加し、発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
（３）蛍光細胞染色法（ＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム解析）
　実施例２で作製したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４およびＣＤ２７／ＤＧ４４－８をアッセイ用細胞として用いた。５０ｎＭ　ＭＴＸ　および５００ｎｇ／ｍＬ　Ｇ４１８を添加した継代用培地で継代したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４およびＣＤ２７／ＤＧ４４－８を０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で剥離し、ＡＢＩ８２００用黒色９６ウェルプレートに１×１０４個／１００μＬ　Ｍｅｄｉｕｍ／ウェルで播種し、１晩培養した。
　該プレートに一次抗体として被免疫ラット抗血清またはハイブリドーマ培養上清を１０μＬ／ウェルで分注し、２次抗体としてＡＬＥＸＡ６４７標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１００μＬ／ウェルで加えて、遮光下で４時間放置した。レーザー光６３３　Ｈｅ／Ｎｅで励起された６５０～６８５ｎｍの蛍光をＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム（アプライドバイオ社製）で測定した。
（４）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター解析）
　実施例２で作製したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４およびＣＤ２７／ＤＧ４４－８をアッセイ用細胞として用いた。５０ｎＭ　ＭＴＸおよび５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８を添加したＨＴ－培地を用いて継代したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４およびＣＤ２７／ＤＧ４４－８を、０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）を用いて剥離した後、各細胞をＰＢＳで洗浄した。
　洗浄後、１～５×１０５個の細胞を５０μＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した後、１次抗体として被免疫ラット抗血清またはハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し、氷温中で３０分間反応させた。
　また、ネガティブコントロールとして、ウシ血清アルブミン、マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（コスモバイオ社製）およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（コスモバイオ社製）を、ポジティブコントロールとして、抗ＲＣＡＳ１抗体２２－１－１（ＭＢＬ社製）および抗ＣＤ２７マウスモノクローナル抗体（ベックマンコールター社製）を用いて、同時に反応させた。
　反応後、ＰＢＳを用いて遠心分離を２回行い細胞を洗浄し、２次抗体としてＡＬＥＸＡ４８８標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、５０μＬ／ウェルで加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。再びＰＢＳを用いて遠心分離を２回行い細胞を洗浄した後、５００μＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍアルゴンで励起される５１０～５３０ｎｍの蛍光をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００　ＭＰＬ）で測定した。
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
　８－アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３－Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を正常培地（１０％　ＦＣＳ　ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（６）ハイブリドーマの作製
　上記（１）で得られたマウス脾臓細胞と上記（５）で得られた骨髄腫細胞とを、１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ，５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）１ｇ、ＭＥＭ培地１ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．３５ｍＬの混液を、１０８個のマウス脾臓細胞あたり０．５ｍＬ加え、該懸濁液に１～２分間毎にＭＥＭ培地１ｍＬを数回加えた後、更にＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。
　該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞をメスピペットによる吸込み吸出して、ゆるやかにＨＡＴ培地［１０％　ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地にＨＡＴ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えた培地］１００ｍＬ中に懸濁した。
　該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、５％　ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で８～１０日間培養した。培養後、培養上清を上記（３）および上記（４）に記載した蛍光細胞染色法を用いて、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４に反応し、ＣＤ２７／ＤＧ４４－８およびＬｅｃ８細胞に反応しないウェルを選択し、そのウェルに含まれる細胞から、限界希釈法によるクローニングを２回行い、シングルセルクローンを取得した。
　その結果、糖鎖不全ＣＤ２７に特異的に結合するモノクローナル抗体ＫＭ４０３０またはＫＭ４０３１を産生するハイブリドーマＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１を確立した（図１２）。同様な方法によって、糖鎖不全ＣＤ２７に特異的に反応するモノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７またはＫＭ４０２８を産生するハイブリドーマＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７およびＫＭ４０２８を確立した。
　これら糖鎖不全ＣＤ２７に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、糖鎖合成経路に関連する酵素、輸送タンパク質の活性が欠損していないＤＧ４４株およびＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの活性が低下または欠損しているＬｅｃ８株を利用することで、正常糖鎖ＣＤ２７および糖鎖不全ＣＤ２７をそれぞれ発現させた組み換え細胞を作製し、正常糖鎖ＣＤ２７発現細胞およびＬｅｃ８株には結合せず、糖鎖不全ＣＤ２７発現細胞にのみに特異的に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすることが可能な系を考案し、約６０００ウェル規模のスクリーニングアッセイを行うことで取得した。
（７）モノクローナル抗体の精製
　プリスタン処理した７週令ヌード雌マウス（ＩＣＲ）に上記（６）で得られたハイブリドーマ株を５～２０×１０６細胞／匹を腹腔内注射した。１０～２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１～８ｍＬ／匹）した。該腹水を、シリンジフィルター（孔径５μｍ）を用いてろ過し、固形分を除去した。
　精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキット（ｒａｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　ｋｉｔ，ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いたバインディングＥＬＩＳＡにより行った。　
　その結果、各抗体のサブクラスは、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６はラットＩｇＧ２ａクラス、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２７はラットＩｇＧ２ｂクラス、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２８はラットＩｇＧ１クラス、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０はラットＩｇＧ２ａクラス、および抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３１はラットＩｇＧ１クラス、であることが明らかになった。
［実施例４］
抗糖鎖不全ＣＤ２７特異的モノクローナル抗体の反応性の検討
　下記に示す競合ＥＬＩＳＡ系を用いて、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１の反応特異性の検討を行った。実施例１で得られたＬｅｃ８株生産ＣＤ２７－Ｆｃを、５μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。
　該プレートを洗浄後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを２００μＬ／ウェルで加え室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として、希釈した抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０精製抗体またはＫＭ４０３１精製抗体を、５０μＬ／ウェルで分注した。
　同時に、結合競合物質として、Ｌｅｃ８生産ＣＤ２７－Ｆｃタンパク質、ＤＧ４４生産ＣＤ２７－Ｆｃタンパク質またはヒトイムノグロブリンを、２０、２、０．２、０．０２μｇ／ｍＬの濃度で加え、抗体と結合競合物質とを共存させた。
　プレートを室温で２時間放置した後、０．０５％　ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ　２０相当品：和光純薬社製）］－ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記）で洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（Ｚｙｍｅｄ社製）を、５０μＬ／ウェルで加えて、室温、１時間放置した。
　該プレートをＴｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ〔２．２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾール－６－スルホン酸）アンモニウム〕基質液〔１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＴＳ－０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２），０．１％　Ｈ２Ｏ２〕を添加し、発色させた後、ＯＤ４１５　ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
　図１３に、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１の競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。その結果、ＤＧ４４生産ＣＤ２７－Ｆｃおよびヒトイムノグロブリンは、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１とＴｎ抗原結合ＣＤ２７－Ｆｃの結合を阻害しなかったが、Ｔｎ抗原結合ＣＤ２７－Ｆｃは阻害すること明らかになった。
　また、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７およびＫＭ４０２８に関しても、同様な結果が得られた。以上のことから、本発明の抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１は、糖鎖不全ＣＤ２７を特異的に認識していることが明らかになった。
　図２８（Ａ）及び（Ｂ）に、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１の、ビアコアによる抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃへの結合活性を評価した結果を示す。結合活性の測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて行った。
　抗ヒトＩｇＧ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、Ａｍｉｎｅ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ビアコア社製）を用い、添付プロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に固定化した。
　実施例１（７）で得られたＤＧ４４産生ＣＤ２７－Ｆｃに対し、Ｐｒｏｚｙｍｅ　Ｇｌｙｃｏ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｄｅｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）およびＰｒｏＯ－Ｌｉｎｋ　Ｅｘｔｅｎｄｅｒ　Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　Ｐｌｕｓ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）のシアリダーゼＡもしくはβ（１－４）ガラクトシダーゼを用いて添付のプロトコールに従って糖鎖消化酵素処理を行った、Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－ＦｃまたはシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃを添加し、抗ヒトＩｇＧ４抗体を固定化したチップ上に２００－２５０ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅユニット）になるようにキャプチャーさせた。
　その後、２００００ｎｇ／ｍＬから５段階に希釈した測定サンプル（抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１）を３０μＬ／ｍｉｎの流速でチップ上に流し、各濃度のセンサーグラムを取得し、装置添付の解析ソフトＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて解析した。
　その結果、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体は、Ｔｎ抗原型ＣＤ２７－ＦｃおよびシアリルＴｎ抗原型ＣＤ２７－Ｆｃに対し結合活性を示すことが明らかとなった。以上のことから、本発明の抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体は、Ｔｎ抗原およびシアリルＴｎ抗原に対し、いずれにも結合することが明らかとなった。
［実施例５］
抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
　実施例３で取得した各ハイブリドーマＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１それぞれ、５×１０７～１×１０８個の細胞より、ＲＮＡｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従い、各抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体のｍＲＮＡを調製した。
（２）抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子クローニング
　実施例５（１）で取得したモノクローナル抗体のｍＲＮＡから、ＢＤ　ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってｃＤＮＡを取得した。
　取得したｃＤＮＡを鋳型として、ラットＩｇＧ１に特異的なプライマー（配列番号１４）、ラットＩｇＧ２ａに特異的なプライマー（配列番号１５）、ラットＩｇＧ２ｂに特異的なプライマー（配列番号１６）、またはラットＣＨ１特異的なプライマー（配列番号１７）を用いて、それぞれＰＣＲ反応を行い、各抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）のｃＤＮＡ断片を増幅した。
　また抗体の各サブクラス特異的プライマーの代わりにラットＩｇ（κ）特異的プライマー（配列番号１８）および（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、各抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）のｃＤＮＡ断片を増幅した。
　ＫＭ４０２６、ＫＭ４０３０、ＫＭ４０３１のＶＬおよびＶＨを増幅するためのＰＣＲ反応はＡｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８のＶＬおよびＶＨを増幅するためのＰＣＲ反応はＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従って行った。
　次に、クローニングして塩基配列を決定するため、取得したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、ＫＭ４０２６、ＫＭ４０３０、ＫＭ４０３１由来ＰＣＲ産物はＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８由来ＰＣＲ産物はＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってｐＣＲベクターに挿入した。
　ＰＣＲ増幅断片が挿入されたプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調製し、ＤＮＡ配列を確認した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＶＨのｃＤＮＡを含むプラスミドおよびＶＬのｃＤＮＡを含むプラスミドが取得された。クローニングの概略を図１４に示した。
（３）抗ＣＤ２７モノクローナル抗体可変領域の遺伝子配列の解析
　実施例５（２）で得られたプラスミドに含まれる、抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０およびＫＭ４０３１のＶＨの全塩基配列を配列番号２０から配列番号２４に、該配列から推定されるシグナル配列を含んだＶＨの全アミノ酸配列を配列番号２５から配列番号２９に、またＶＬの全塩基配列を配列番号３０から配列番号３４に、該配列から推定されるシグナル配列を含んだＶＬの全アミノ酸配列を配列番号３５から配列番号３９にそれぞれ示した。
　また、各モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５にそれぞれ示した。
　抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１にそれぞれ示した。
　抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５２、配列番号５３および配列番号５４に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７にそれぞれ示した。
　抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３にそれぞれ示した。
　抗糖鎖不全ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０３１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９にそれぞれ示した。
［実施例６］
抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の作製
（１）抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターの構築
　本発明で作製するキメラ抗体は、実施例５（３）で得られた抗ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域に、ＵＳ９７／１０３５４に開示されているヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域およびヒトκの軽鎖定常領域をそれぞれ連結したキメラ抗体である。
　方法としては、実施例５（３）で得られた各モノクローナル抗体のＶＬまたはＶＨが含まれているｐＣＲベクターと、ＵＳ９７／１０３５４に記載されているヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域およびヒトκの軽鎖定常領域が含まれる抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３とを用いて、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した（図１５、図１６、図１７、図１８）。
　ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０、ＫＭ４０３１のＶＬまたはＶＨが含まれるｐＣＲベクターを鋳型として１０ｎｇ使用し、１０×ＫＯＤ　Ｐｌｕｓバッファーを２μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰを２μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウムを１μＬ、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を１μＬ、各抗ＣＤ２７モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨに特異的な１０μｍｏｌ／Ｌのプライマーをそれぞれ１μＬずつ含む、全量２０μＬからなる溶液を調製した。該調製溶液を用いて、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１分間、６８℃で２分間の反応を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
　ＫＭ４０２６のＶＬのプライマーは配列番号７０および７１、ＶＨのプライマーは配列番号７２および７３、ＫＭ４０２７のＶＬのプライマーは配列番号７４および７５、ＶＨのプライマーは配列番号７６および７７、ＫＭ４０２８のＶＬのプライマーは配列番号７８および７９、ＶＨのプライマーは配列番号８０および８１、ＫＭ４０３０のＶＬのプライマーは配列番号８２および８３、ＶＨのプライマーは配列番号８４および８５、ＫＭ４０３１のＶＬのプライマーは配列番号８６および８７、ＶＨのプライマーは配列番号８８および８９に示す。
　それぞれのＰＣＲ反応産物は１％アガロースゲル電気泳動で分離後、特異的ＰＣＲ増幅バンドを回収しＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ　Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクターに挿入した。
　得られた各抗体のＶＬは、制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化し、ＶＬのＥｃｏＲＩ－ＢｓｉＷＩ断片を取得した。また、各抗体のＶＨは、制限酵素ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＡｐａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化し、ＮｏｔＩ－ＡｐａＩ断片を取得した。
　抗ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０またはＫＭ４０３１のＶＬの各ＥｃｏＲＩ－ＢｓｉＷＩ断片と、ｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化して得られるＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の使用説明書に従って連結させた。
　連結されたＤＮＡ断片を用いて大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。
　その結果、抗ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０またはＫＭ４０３１のＶＬをコードするｃＤＮＡが挿入された、ｐＫＡＮＴＥＸ９３を取得した。
　続いて、抗ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０またはＫＭ４０３１のＶＨの各ＮｏｔＩ－ＡｐａＩ断片と、抗ＣＤ２７モノクローナル抗体の各ＶＬが挿入されたｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化して得られるＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の使用説明書に従って連結させた。
　連結されたＤＮＡ断片を用いて大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。
　その結果、抗ＣＤ２７モノクローナル抗体ＫＭ４０２６、ＫＭ４０２７、ＫＭ４０２８、ＫＭ４０３０またはＫＭ４０３１のＶＬおよびＶＨをコードするｃＤＮＡがそれぞれ挿入された、抗ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターを取得した。
（２）動物細胞を用いた抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の発現
　上記（１）で得られた抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体発現ベクターを用いて抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行い、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体（キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１）を産生する形質転換株を取得した。
　発現させる動物細胞株としては、α１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株（以下、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞）を用いた。この宿主細胞株で発現させた抗体のＮ－結合型複合型糖鎖のコア部分には、フコースが付加されないことが知られている（国際公開第２００２／３１１４０号）。
（３）精製キメラ抗体の取得
　上記（２）で得られた形質転換株キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した後、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶフィルターを通して濾過滅菌した。
　得られた培養上清から、実施例１（７）と同様の方法により、Ｍａｂ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１を精製した。
（４）抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体のフコース含量測定
　国際公開第２００２／３１１４０号に記載の方法に従い、各抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体のＦｃ領域のＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合を調べた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、実施例６（３）で作製したキメラ抗体にはフコースが付加していないことが明らかになった。
［実施例７］
抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の活性評価
　以下の（１）から（３）では、実施例６で得られた抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１の活性評価を行った。
（１）ビアコアによる抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体のヒト糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃへの結合活性評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８およびキメラ型ＫＭ４０３０のヒト糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合活性を反応速度論的に解析するため、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて結合活性測定を行った。以下の操作は全てＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて行った。
　実施例１（７）で得られたＬｅｃ８由来ＣＤ２７－Ｆｃを、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に固定化した。ＣＤ２７－Ｆｃを固定化したチップに９μｇ／ｍＬから３倍希釈で段階的に希釈して５濃度に調製した測定サンプル（キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１）をシングルカイネティクスの自動プログラムに従い低濃度から順に連続添加して測定した。
　装置添付の解析ソフトＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用い、Ｂｉｖａｌｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｅモデルで解析し、各抗体のヒト糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃに対する結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄを算出した。
　その結果得られた各抗体の結合速度定数ｋａ１、解離速度定数ｋｄ１および解離定数ＫＤ（ｋｄ１／ｋａ１）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１はいずれも、ヒト糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃに対し、１×１０－８から１×１０－９ｍｏｌ／Ｌの高いアフィニティーを示した。　　　　　
（２）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター解析）による抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の反応特異性評価
　実施例２と同様の方法で作製したＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞およびＬｅｃ８細胞をアッセイ用細胞として用いた。５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８添加ＨＴ－培地を用いて継代したＣＤ２７／ＤＧ４４－４および５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＴＸ　および５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８添加ＨＴ－培地を用いて継代したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４を、０．０２％　ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離した後、各細胞をＰＢＳで洗浄した。
　洗浄後、５×１０５個の細胞を５０μＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した後、１次抗体として抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体（キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１）を０．０２、０．２、２および１０μｇ／ｍＬに調製した抗体液を５０μＬ／ウェルで分注し、氷温中で１時間反応させた。
　ポジティブコントロールとして、抗Ｔｎ抗体である抗ＲＣＡＳ１マウス抗体２２－１－１（ＭＢＬ社製）および抗ＣＤ２７マウス抗体Ｏ３２３（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
　反応後、ＰＢＳを用いて遠心分離を２回行って細胞を洗浄し、２次抗体としてＡＬＥＸＡ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗ヒトイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）もしくはＡＬＥＸＡ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗ヒトイムノグロブリンＭ（μ）を、５０μＬ／ウェルで加え、氷温、遮光下で３０分間反応させた。
　再びＰＢＳを用いて遠心分離を２回行い、細胞を洗浄した後、５００μＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍアルゴンで励起される５１０～５３０　ｎｍの蛍光をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００　ＭＰＬ）で測定した。図１９（Ａ）～（Ｃ）に結果を示す。
　その結果、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体はいずれも、Ｌｅｃ８細胞およびＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞には結合しなかったが、糖鎖不全ＣＤ２７を発現したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞にのみ結合が認められた。
　以上のことから、本発明の抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１は、細胞表面に発現している糖鎖不全ＣＤ２７を特異的に認識していることが明らかになった。
（３）抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）の評価
　実施例２で作製したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対する抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１のＡＤＣＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。
（３）－１　標的細胞懸濁液の調製
　５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＴＸ　および５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８添加ＨＴ－培地を用いて継代したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞を、０．０２％　ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離した後、ＰＢＳで洗浄し、５％透析済みウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）（インビトロジェン社製）を含むフェノールレッド不含有ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）（以下、ＡＤＣＣ用培地と記す）で洗浄し、同培地で至適濃度に調製して標的細胞懸濁液とした。
（３）－２　エフェクター細胞懸濁液の調製
　末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注Ｎ「シミズ」（清水製薬社製）を０．５ｍＬ加えたシリンジを用いて、健常人から健常人末梢血５０ｍＬを採血した。
　１５ｍＬチューブに３ｍＬずつ分注したモノ・ポリ分離溶液（ＤＳファーマバイオメディカル社製）の上に、３．５ｍＬの採取した末梢血を静かに重層し、４００×ｇ、ブレーキオフ、室温の条件で２０分間遠心分離して、単核球層を分離した。こうして得られた単核球画分を、ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄し、同培地により至適な細胞数に調製してエフェクター細胞懸濁液とした。
（３）－３　ＡＤＣＣ活性の測定
　ＬＤＨ－Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔｅｓｔ　Ｗａｋｏ（Ｗａｋｏ社製）を用い、付属の説明書に従い以下の手順で測定した。
　９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、各抗体を３０μｇ／ｍＬから１０倍希釈で０．００３μｇ／ｍＬの濃度に希釈した抗体液を、５０μＬ分注し、次に（３）－１で調製した標的細胞懸濁液を１×１０４細胞／５０μＬ／ウェルで分注し、最後に（３）－２で調製したエフェクター細胞懸濁液を２．５×１０５細胞／５０μＬ／ウェルで分注して全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。よって、エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）との比は２５：１で実験を行った。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。結果を図２０に示す。
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（［検体の吸光度］－［標的細胞自然遊離の吸光度］－［エフェクター細胞自然遊離の吸光度］）／（［標的細胞全遊離の吸光度］－［標的細胞自然遊離の吸光度］）｝×１００
　その結果、抗体のＦｃ領域のＮ結合複合型糖鎖にコアフコースが結合していない抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１はいずれも、ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対して、高いＡＤＣＣ活性を示した。
　以上のことから、本発明の抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１はいずれも、糖鎖不全ＣＤ２７を発現した細胞に対し、高いＡＤＣＣ活性を有することが明らかになった。
（４）抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）の評価
　実施例２で作製したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞に対する抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１のＣＤＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。
　ＣＤ２７／Ｌｅｃ８－４細胞をＰＢＳで洗浄後、１０％ｄＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、同培地で至適濃度に調製して標的細胞懸濁液とした。１ウェル当たり５×１０４個となるよう、標的細胞懸濁液を９６　ｗｅｌｌ平底プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、更に、適当な濃度に調製した抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体溶液及びヒト補体（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、全量１５０μＬ／ウェルに調製した。
　また、陰性対照として抗体を含まない反応ウェル（０％細胞傷害活性ウェル）、陽性対照として細胞を含まない反応ウェル（１００％細胞傷害活性ウェル）をそれぞれ用意した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２時間反応を行った。
　反応終了後、各反応ウェルに１５μＬのＷＳＴ－１試薬（ロシュ社製）を加え、３７℃で４時間程度反応させ、各ウェルにおける吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ－ＯＤ６９０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｅｍａｘ）を用いて測定した。各ウェルの吸光度から、以下の式を用いてＣＤＣ活性（細胞傷害活性［％］）を算出した。結果を図２１に示す。
　（式）
ＣＤＣ活性（細胞傷害活性［％］）＝｛１－（反応ウェルの吸光度－１００％Ｌｙｓｉｓウェルの吸光度）／（０％Ｌｙｓｉｓウェルの吸光度－１００％Ｌｙｓｉｓウェルの吸光度）｝×１００
　その結果、本発明で取得した抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１は、いずれもＣＤＣ活性を示した。
［実施例８］
　細胞膜上にカニクイザルＣＤ２７を発現するＣＨＯ細胞の造成
（１）カニクイザルＣＤ２７遺伝子のクローニング
　カニクイザル末梢血由来ＲＮＡより、以下の手順でＣＤ２７をコードする遺伝子を単離した。カニクイザル末梢血よりＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン社製）を用いて単離したＲＮＡを鋳型として３．３μｇ使用し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄキット（インビトロジェン社製）に添付されたオリゴｄＴを１μＬ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを１μＬ含む、全量５μＬから成る溶液を調製した。
　該調製した溶液を６５℃で５分間反応後に氷上で１分間急冷したのち、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄキットに添付された１０×ＲＴバッファーを２μＬ、ＤＴＴを２μＬ、ＲＮａｓｅ　ＯＵＴを１μＬ、ＲＴを１μＬ添加し、５０℃で５０分間逆転写反応を行った。
　反応後、８５℃で５分間加熱し逆転写酵素を失活させたのち、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄキットに添付されたＲＮａｓｅ　Ｈを１μＬ添加し、３７℃で２０分間反応させＲＮＡを完全に分解した。本カニクイザル末梢血由来一本鎖ｃＤＮＡは使用するまで－２０℃で保存した。
　上記で作製したカニクイザル末梢血由来一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として１．２５μＬ使用し、１０×ＫＯＤ　Ｐｌｕｓバッファー２．５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰを２．５μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウムを１μＬ、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を０．５μＬ、アカゲザルＣＤ２７の５’側非翻訳領域配列より設計したｍｆＣＤ２７＿５ＵＴＲ（配列番号９０）とアカゲザルＣＤ２７の３’側非翻訳領域配列より設計したｍｆＣＤ２７＿３ＵＴＲ（配列番号９１）をそれぞれ２０ｐｍｏｌずつ含む、全量２５μＬからなる溶液を調製した。
　該調製溶液を用いて、９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、６８℃で２分間の反応を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液を１％アガロースゲル電気泳動で分離後、約８００　ｂｐのＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ　Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクターに挿入した。
　ＰＣＲ増幅断片が挿入されたベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。その結果、カニクイザルＣＤ２７をコードするｃＤＮＡ（配列番号９２）がクローニングされたプラスミドｐＣＲ　ｍｆＣＤ２７を取得した（図２２）。
（２）サルＣＤ２７発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓの構築
　Ｃ末端にＨｉｓタグを付加したカニクイザルＣＤ２７発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓを以下の方法にて作製した。
　ｐＣＲ　ｍｆＣＤ２７を鋳型として１０ｎｇ使用し、１０×ＫＯＤ　Ｐｌｕｓバッファーを５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰを５μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウムを２μＬ、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を１μＬ、１００μｍｏｌ／ＬのｍｆＣＤ２７ｔｏＫＡＮ＿５（配列番号９３）およびｍｆＣＤ２７ＨｉｓＫＡＮ＿３（配列番号９４）を０．２μＬずつ含む、全量５０μＬからなる溶液を調製した。
　該調製溶液を用いて、９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、６８℃で２分間の反応を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液を１％アガロースゲル電気泳動で分離後、約８００　ｂｐのＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ　Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクターに挿入した。
　ＰＣＲ増幅断片が挿入されたベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。
　その結果、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されたカニクイザルＣＤ２７をコードするｃＤＮＡ（配列番号９５）がクローニングされたプラスミドｐＣＲ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓを取得した（図２３）。
　ｐＣＲ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化して得られる約８００　ｂｐのＤＮＡ断片と、実施例２で作製したｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７を制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化して得られる約１０　ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の使用説明書に従って連結させた。　
　連結されたＤＮＡ断片を用いて大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。
　その結果、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されたカニクイザルＣＤ２７を発現するためのプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓを取得した（図２４）。
　ｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓを用いて形質転換させたＤＨ５α（東洋紡社製）を２００ｍＬのＬＢ培地に播種し、一晩培養を行った。培養後に菌体を回収し、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってプラスミドを精製した。精製したプラスミド５０μｇを制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）消化により、線上化した。
（３）サルＣＤ２７発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓの導入
　上記（２）で作製したカニクイザルＣＤ２７発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７ＨｉｓをＬｅｃ８細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に遺伝子導入することにより、カニクイザルＣＤ２７を発現するＬｅｃ８細胞およびＤＧ４４細胞の樹立を行った。
　導入するプラスミドとしてｐＫＡＮＴＥＸ　ｍｆＣＤ２７Ｈｉｓを用いる以外は実施例１（６）に記載の方法で実施した。ただし、遺伝子導入後の細胞は、ＨＴ－培地３０　ｍＬに懸濁し、１００μＬ／ウェルとなるように３枚の９６ウェルプレートに播種した。
　播種１日後に５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８を含む継代用培地に交換し、１０日間培養を行い、Ｇ４１８耐性クローン株を取得した。Ｌｅｃ８株由来のカニクイザルＣＤ２７発現株をカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞、一方、ＤＧ４４細胞由来のカニクイザルＣＤ２７発現細胞をカニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞と記載する。
［実施例９］
抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体のサルＣＤ２７蛋白質への交差反応性評価
　実施例８で作製したカニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞、カニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞をアッセイ用細胞として用いた。
（１）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター解析）による抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体のサルＣＤ２７発現細胞への反応性評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１のカニクイザルＣＤ２７発現細胞に対する結合活性を、以下の方法に従って測定した。
　５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８添加ＨＴ－培地を用いて継代したカニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞を、０．０２％　ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離した後、各細胞をＰＢＳで洗浄した。
　洗浄後、５×１０５個の細胞を５０μＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁した後、１次抗体として抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体（キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１）を１０μｇ／ｍＬに調製した抗体液を５０μＬ／ウェルで分注し、氷温中で１時間反応させた。
　ポジティブコントロールとして、抗ＣＤ２７マウス抗体Ｏ３２３を用いた。反応後、ＰＢＳを用いて遠心分離を２回行って細胞を洗浄し、２次抗体としてＡＬＥＸＡ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗ヒトイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）もしくはＡＬＥＸＡ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を、５０μＬ／ウェルで加え、氷温、遮光下で３０分間反応させた。
　再びＰＢＳを用いて遠心分離を２回行い、細胞を洗浄した後、５００μＬの１％　ＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍアルゴンで励起される５１０～５３０ｎｍの蛍光をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００　ＭＰＬ）で測定した。図２５に結果を示す。
　その結果、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１は、糖鎖不全ＣＤ２７を発現したカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞に反応することが明らかとなった。
　一方、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６およびキメラ型ＫＭ４０２８のカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞への反応性は軽微であった。また、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体はいずれも、カニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞には結合しないことが確認された。
（２）抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体のサルＣＤ２７発現細胞に対するＡＤＣＣ活性の評価
　５００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８添加ＨＴ－培地を用いて継代したカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞を、０．０２％　ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離した後、ＰＢＳで洗浄した後、ＡＤＣＣ用培地で洗浄して同培地で至適濃度に調製して標的細胞懸濁液とした。また、エフェクター細胞懸濁液の調製およびＡＤＣＣ活性の測定は、実施例７と同様の方法で行った。図２６に結果を示す。
　その結果、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１はいずれも、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞（糖鎖不全カニクイザルＣＤ２７細胞）に対してＡＤＣＣ活性を示した。
　以上のことから、本発明の抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０２６、キメラ型ＫＭ４０２８、キメラ型ＫＭ４０３０およびキメラ型ＫＭ４０３１はいずれも、糖鎖不全カニクイザルＣＤ２７細胞に交差反応性を示すことが明らかとなった。各抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体の糖鎖不全カニクイザルＣＤ２７に対する反応性には強弱が認められ、認識するエピトープの違いが示唆された。
　また、実施例２で作製したヒトＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞および実施例８で作製したカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞のうち、フローサイトメーター解析により細胞表面上のＣＤ２７発現量がほぼ同等であることを確認した細胞を用いて、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０３０のＡＤＣＣ活性を測定した。エフェクター細胞懸濁液は、同一健常人末梢血から調製した。図２７に結果を示す。
　その結果、糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体キメラ型ＫＭ４０３０は、カニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞とヒトＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞に対し、同等のＡＤＣＣ活性を示すことが示唆された。
［実施例１０］
　ヒト化抗体の作製
（１）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
　初めに、配列番号５８，５９および６０でそれぞれ表される抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。
　配列解析システムとしてＧＣＧ　Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ社製）　を用いて、既存の蛋白質のアミノ酸データベースをＢＬＡＳＴＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７））により抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０と相同性の高いヒト抗体を検索した。
　相同性スコアと実際のアミノ酸配列の相同性を比較したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースアクセッションナンバーＢＡＨ０４５２５、Ｔｈｅ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｈ３Ｎ２　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ（以下、ＢＡＨ０４５２５と称す）が８３．９％を示し、最も相同性の高いヒト抗体であったため、この抗体のＦＲのアミノ酸配列を選択した。
　以上のようにして決定したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に配列番号５８～６０で示した抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。このようにして、配列番号９６で表される抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０を設計した。
　次に、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
　配列番号６１～６３でそれぞれ表される抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０ＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。
　カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ　Ｉ～ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ～ＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列と抗糖鎖不全ＣＤ２７ラット抗体ＫＭ４０３０のＶＬのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。
　相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ、およびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ８６．３％、６０．０％、７３．８％、７３．８％であった。従って、ＫＭ４０３０ＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
　以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。
　しかし、配列番号３８に記載の抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＶＬのアミノ酸配列中の１２４番目のＬｅｕは、カバットらが挙げるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記の抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。
　このようにして、配列番号９７で表される抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。
　上記で設計した抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。
　しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体のＦＲへのラット抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多い。このため、結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とラット抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。
　そこで、本実施例でも、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
　まず、上記で設計した抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製および三次元構造の表示にに関してはソフトウェアＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて添付の使用説明書に従い、行った。
　また、抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗糖鎖不全ＣＤ２７ラット抗体ＫＭ４０３０と異なっているアミノ酸残基を選択し、抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。
　これら作製した抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。
　その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＨＶ０では３０番目のＳｅｒ、４８番目のＶａｌ、４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａおよび１１７番目のＴｈｒを、ＬＶ０では２１番目のＩｌｅ、４０番目のＰｒｏ、５８番目のＶａｌ、８５番目のＴｈｒ、および８７番目のＴｙｒをそれぞれ選択した。
　これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。
　具体的には、抗体ＶＨについては、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
　また、ＶＬについては、配列番号９７で表されるアミノ酸配列の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
　ＨＶ０ＬＶ０のＦＲに存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を改変したＨＶ２ＬＶ０、ＨＶ３ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０、およびＨＶ７ＬＶ０の可変領域のアミノ酸配列を設計し、Ｈ鎖可変領域ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ５、およびＨＶ７のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０１、１０３、１０５、および１０７に示した。
（２）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の作製および評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、抗糖鎖不全ＣＤ２７ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０３０のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで用いられているコドンを利用し、アミノ酸改変を行う場合は、哺乳動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて、作製した。
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＨＶ０およびＬＶ０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を配列番号９８、９９にぞれぞれ示し、またアミノ酸改変を行った可変領域ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ５、およびＨＶ７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、配列番号１００、１０２、１０４、および１０６にそれぞれ示した。
（３）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
　本実施例（１）で設計した配列番号９８、１０４および１０６に表される抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０、ＨＶ５およびＨＶ７をコードするｃＤＮＡを全合成にて作製した。
（４）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した配列番号９９に表される抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡを全合成にて作製した。
（５）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体発現ベクターの構築
　国際公開第９７／１０３５４号に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に本実施例（２）および（３）で得られたＨＶ０、ＨＶ５、ＨＶ７のいずれかをコードするｃＤＮＡ、およびＬＶ０をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体発現ベクターを構築した。
（６）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、実施例６（２）および（３）に記載の方法と同様にして行った。
　その結果、抗体のＶＨがＨＶ０、ＶＬがＬＶ０からなる抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ５、ＶＬがＬＶ０からなるＨＶ５ＬＶ０、および抗体のＶＨがＨＶ７、ＶＬがＬＶ０からなるＨＶ７ＬＶ０の３種類を作製した。
［実施例１１］
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の活性評価
　以下（１）から（５）では、実施例６で得られた抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０、および実施例１０で得られた抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０の活性評価を行った。
（１）ビアコアによる抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体およびヒト化抗体のヒト糖鎖不全ＣＤ２７－Ｆｃへの合活性評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のヒト糖鎖不全ＣＤ２７に対する結合活性を反応速度論的に解析するため、ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｔ１００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて実施例７（１）と同様にして測定した。
　その結果得られた各抗体の結合速度定数Ｋａ１、解離速度定数Ｋｄ１および解離定数ＫＤ（Ｋｄ１／Ｋａ１）を表４に示す。また、センサーグラムを図２９に示す。
　表４に示すようにヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０はいずれも、２×１０－９ｍｏｌ／Ｌの高いアフィニティーを示し、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ抗体ＫＭ４０３０と同程度の抗原結合活性を保持していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
（２）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター解析）による抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の反応特異性評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の反応性特異性について実施例７（２）と同様に測定した。細胞株は、実施例２と同様の方法で作製した抗原発現量がほぼ同程度のＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞およびＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞をアッセイ細胞として使用した。
　１次抗体は、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０もしくはＨＶ７ＬＶ０を、終濃度が０．０００１，０．００１，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，１および１０μｇ／ｍＬとなるように調製して用いた。その結果を図３０（Ａ）および図３０（Ｂ）に示す。
　その結果、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０はいずれも、ＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞には結合せず、糖鎖不全ＣＤ２７を発現したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞にのみ結合が認められた。また、糖鎖不全ＣＤ２７を発現したＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞に対する抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の反応性は抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ型ＫＭ４０３０抗体とほぼ同等であった。
（３）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）の評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０のＡＤＣＣ活性を、実施例７（３）と同様に測定した。ターゲット細胞は、実施例２と同様の方法で作製したＣＤ２７／ＤＧ４４－４細胞およびＣＤ２７／Ｌｅｃ８－Ｍ１９細胞を使用した。また、エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）との比は１２．５：１で実験を行った。その結果を図３１に示す。
　その結果、ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ型ＫＭ４０３０抗体よりも若干ＡＤＣＣ活性が低下していたが、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ型ＫＭ４０３０抗体とほぼ同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を示した。
（４）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）の評価
　抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０のＣＤＣ活性を、実施例７（４）と同様の方法で測定した。抗体は、最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。その結果を図３２に示す。
　その結果、本発明で取得した抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ型ＫＭ４０３０抗体よりも強いＣＤＣ活性を示した。
（５）抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体のサルＣＤ２７蛋白質への交差反応性評価
　蛍光細胞染色法（フローサイトメーター解析）による抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０のカニクイザルＣＤ２７発現細胞に対する結合活性を、実施例９（１）と同様に測定した。カニクイザルＣＤ２７発現細胞には、実施例８で作製したカニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞、カニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞を用いた。その結果を図３３（Ａ）および図３３（Ｂ）に示す。
　その結果、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０はいずれも、カニクイザルＣＤ２７／ＤＧ４４細胞には結合しなかった。一方、糖鎖不全ＣＤ２７を発現したカニクイザルＣＤ２７／Ｌｅｃ８細胞に対し、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０は、抗糖鎖不全ＣＤ２７キメラ型ＫＭ４０３０抗体と同様に反応した。以上より、抗糖鎖不全ＣＤ２７ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０およびＨＶ７ＬＶ０はいずれも、糖鎖不全カニクイザルＣＤ２７細胞に交差反応性を示すことが明らかとなった。
　本出願は、２００９年１２月２９日出願の米国特許仮出願６１／２９０５４２に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
　本発明により、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を特異的に認識し、該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、並びに該抗体または抗体断片を有効成分として含有するＣＤ２７が関与する疾患の診断薬または治療薬を提供することができる。
　ＩＰＯＤ　ＦＲＥＭ　ＢＰ－１０９７６
配列番号１－ヒトＣＤ２７　塩基配列
配列番号２－ヒトＣＤ２７　アミノ酸配列
配列番号３－人工配列の記載：ＣＤ２７フォワードプライマー
配列番号４－人工配列の記載：ＣＤ２７８０９Ｂ
配列番号５－人工配列の記載：ＣＤ２７－Ａプライマー
配列番号６－人工配列の記載：ＣＤ２７－Ｂプライマー
配列番号７－人工配列の記載：プライマー１
配列番号８－人工配列の記載：プライマー２
配列番号９－人工配列の記載：ｇ４Ａプライマー
配列番号１０－人工配列の記載：ｇ４Ｂプライマー
配列番号１１－人工配列の記載：ＣＤ２７－Ｆｃタンパク質　塩基配列
配列番号１２－人工配列の記載：ＣＤ２７－Ｆｃタンパク質アミノ酸配列
配列番号１３－人工配列の記載：ＣＤ２７－Ｃプライマー
配列番号１４－人工配列の記載：ラットＩｇＧ１に特異的なプライマー
配列番号１５－人工配列の記載：ラットＩｇＧ２ａに特異的なプライマー
配列番号１６－人工配列の記載：ラットＩｇＧ２ｂに特異的なプライマー
配列番号１７－人工配列の記載：ラットＣＨ１特異的なプライマー
配列番号１８－人工配列の記載：ラットＩｇ（κ）特異的プライマー１
配列番号１９－人工配列の記載：ラットＩｇ（κ）特異的プライマー２
配列番号２０－ＫＭ４０２６　ＶＨ　塩基配列
配列番号２１－ＫＭ４０２７　ＶＨ　塩基配列
配列番号２２－ＫＭ４０２８　ＶＨ　塩基配列
配列番号２３－ＫＭ４０３０　ＶＨ　塩基配列
配列番号２４－ＫＭ４０３１　ＶＨ　塩基配列
配列番号２５－ＫＭ４０２６　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号２６－ＫＭ４０２７　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号２７－ＫＭ４０２８　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号２８－ＫＭ４０３０　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号２９－ＫＭ４０３１　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号３０－ＫＭ４０２６　ＶＬ　塩基配列
配列番号３１－ＫＭ４０２７　ＶＬ　塩基配列
配列番号３２－ＫＭ４０２８　ＶＬ　塩基配列
配列番号３３－ＫＭ４０３０　ＶＬ　塩基配列
配列番号３４－ＫＭ４０３１　ＶＬ　塩基配列
配列番号３５－ＫＭ４０２６　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３６－ＫＭ４０２７　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３７－ＫＭ４０２８　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３８－ＫＭ４０３０　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３９－ＫＭ４０３１　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号４０－ＫＭ４０２６　ＶＨ　ＣＤＲ１
配列番号４１－ＫＭ４０２６　ＶＨ　ＣＤＲ２
配列番号４２－ＫＭ４０２６　ＶＨ　ＣＤＲ３
配列番号４３－ＫＭ４０２６　ＶＬ　ＣＤＲ１
配列番号４４－ＫＭ４０２６　ＶＬ　ＣＤＲ２
配列番号４５－ＫＭ４０２６　ＶＬ　ＣＤＲ３
配列番号４６－ＫＭ４０２７　ＶＨ　ＣＤＲ１
配列番号４７－ＫＭ４０２７　ＶＨ　ＣＤＲ２
配列番号４８－ＫＭ４０２７　ＶＨ　ＣＤＲ３
配列番号４９－ＫＭ４０２７　ＶＬ　ＣＤＲ１
配列番号５０－ＫＭ４０２７　ＶＬ　ＣＤＲ２
配列番号５１－ＫＭ４０２７　ＶＬ　ＣＤＲ３
配列番号５２－ＫＭ４０２８　ＶＨ　ＣＤＲ１
配列番号５３－ＫＭ４０２８　ＶＨ　ＣＤＲ２
配列番号５４－ＫＭ４０２８　ＶＨ　ＣＤＲ３
配列番号５５－ＫＭ４０２８　ＶＬ　ＣＤＲ１
配列番号５６－ＫＭ４０２８　ＶＬ　ＣＤＲ２
配列番号５７－ＫＭ４０２８　ＶＬ　ＣＤＲ３
配列番号５８－ＫＭ４０３０　ＶＨ　ＣＤＲ１
配列番号５９－ＫＭ４０３０　ＶＨ　ＣＤＲ２
配列番号６０－ＫＭ４０３０　ＶＨ　ＣＤＲ３
配列番号６１－ＫＭ４０３０　ＶＬ　ＣＤＲ１
配列番号６２－ＫＭ４０３０　ＶＬ　ＣＤＲ２
配列番号６３－ＫＭ４０３０　ＶＬ　ＣＤＲ３
配列番号６４－ＫＭ４０３１　ＶＨ　ＣＤＲ１
配列番号６５－ＫＭ４０３１　ＶＨ　ＣＤＲ２
配列番号６６－ＫＭ４０３０　ＶＨ　ＣＤＲ３
配列番号６７－ＫＭ４０３１　ＶＬ　ＣＤＲ１
配列番号６８－ＫＭ４０３１　ＶＬ　ＣＤＲ２
配列番号６９－ＫＭ４０３１　ＶＬ　ＣＤＲ３
配列番号７０－人工配列の記載：ＫＭ４０２６　ＶＬ　キメラ　プライマー１
配列番号７１－人工配列の記載：ＫＭ４０２６　ＶＬ　キメラ　プライマー２
配列番号７２－人工配列の記載：ＫＭ４０２６　ＶＨ　キメラ　プライマー１
配列番号７３－人工配列の記載：ＫＭ４０２６　ＶＨ　キメラ　プライマー２
配列番号７４－人工配列の記載：ＫＭ４０２７　ＶＬ　キメラ　プライマー１
配列番号７５－人工配列の記載：ＫＭ４０２７　ＶＬ　キメラ　プライマー２
配列番号７６－人工配列の記載：ＫＭ４０２７　ＶＨ　キメラ　プライマー１
配列番号７７－人工配列の記載：ＫＭ４０２７　ＶＨ　キメラ　プライマー２
配列番号７８－人工配列の記載：ＫＭ４０２８　ＶＬ　キメラ　プライマー１
配列番号７９－人工配列の記載：ＫＭ４０２８　ＶＬ　キメラ　プライマー２
配列番号８０－人工配列の記載：ＫＭ４０２８　ＶＨ　キメラ　プライマー１
配列番号８１－人工配列の記載：ＫＭ４０２８　ＶＨ　キメラ　プライマー２
配列番号８２－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＶＬ　キメラ　プライマー１
配列番号８３－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＶＬ　キメラ　プライマー２
配列番号８４－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＶＨ　キメラ　プライマー１
配列番号８５－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＶＨ　キメラ　プライマー２
配列番号８６－人工配列の記載：ＫＭ４０３１　ＶＬ　キメラ　プライマー１
配列番号８７－人工配列の記載：ＫＭ４０３１　ＶＬ　キメラ　プライマー２
配列番号８８－人工配列の記載：ＫＭ４０３１　ＶＨ　キメラ　プライマー１
配列番号８９－人工配列の記載：ＫＭ４０３１　ＶＨ　キメラ　プライマー２
配列番号９０－人工配列の記載：プライマー　ｍｆＣＤ２７＿５ＵＴＲ
配列番号９１－人工配列の記載：プライマー　ｍｆＣＤ２７＿３ＵＴＲ
配列番号９２－カニクイザルＣＤ２７　ｃＤＮＡ配列
配列番号９３－人工配列の記載：プライマー　ｍｆＣＤ２７ｔｏＫＡＮ＿５
配列番号９４－人工配列の記載：プライマー　ｍｆＣＤ２７ＨｉｓＫＡＮ＿３
配列番号９５－人工配列の記載：Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＣＤ２７　ｃＤＮＡ配列
配列番号９６－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ０　アミノ酸配列
配列番号９７－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＬＶ０　アミノ酸配列
配列番号９８－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ０　塩基配列
配列番号９９－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＬＶ０　塩基配列
配列番号１００－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ２　塩基配列
配列番号１０１－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ２　アミノ酸配列
配列番号１０２－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ３　塩基配列
配列番号１０３－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ３　アミノ酸配列
配列番号１０４－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ５　塩基配列
配列番号１０５－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ５　アミノ酸配列
配列番号１０６－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ７　塩基配列
配列番号１０７－人工配列の記載：ＫＭ４０３０　ＨＶ７　アミノ酸配列

Claims (23)

  1. 　抗体のＶＨが配列番号５８～６０で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＨであり、かつ抗体のＶＬが配列番号６１～６３で表されるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＶＬであり、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含む、ＣＤ２７遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域を認識して結合する、ヒト化抗体またはその抗体断片。
  2. 　ヒト化抗体のＶＨが、配列番号９６で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＡｓｎに、４８番目のＶａｌをＩｌｅに、４９番目のＳｅｒをＡｌａに、７７番目のＡｓｎをＧｌｙに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９７番目のＡｌａをＴｈｒに、および１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含み、かつヒト化抗体のＶＬが、配列番号９７で表されるアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＬｅｕに、４０番目のＰｒｏをＬｅｕに、５８番目のＶａｌをＩｌｅに、８５番目のＴｈｒをＡｌａに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項１のヒト化抗体またはその抗体断片。
  3. 　ヒト化抗体のＶＨが、配列番号９６、１０５および１０７のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつヒト化抗体のＶＬが、配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む請求項１のヒト化抗体またはその抗体断片。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  6. 　請求項５に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  7. 　請求項６に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
  8. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７の免疫学的検出または測定方法。
  9. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７の検出試薬。
  10. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断薬。
  11. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、請求項１０に記載の診断薬。
  12. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が癌である、請求項１０に記載の診断薬。
  13. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または抗体断片を有効成分として含有する、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の治療薬。
  14. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、請求項１３に記載の治療薬。
  15. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が、癌である、請求項１３に記載の治療薬。
  16. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を用いて、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が発現した細胞を検出または測定することを含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断方法。
  17. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を用いて、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７を検出または測定することを含む、ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断方法。
  18. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、請求項１６または１７に記載の診断方法。
  19. ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が癌である、請求項１６または１７に記載の診断方法。
  20. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
  21. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
  22. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患がＩｇＡ腎症である、請求項２０または２１に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
  23. 　ガラクトースが結合していないＯ結合型糖鎖を含むＣＤ２７が関与する疾患が癌である、請求項２０または２１に記載のヒト化抗体または該抗体断片の使用。
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