WO2011097664A2 - Testanordnung - Google Patents

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WO2011097664A2
WO2011097664A2 PCT/AT2011/000074 AT2011000074W WO2011097664A2 WO 2011097664 A2 WO2011097664 A2 WO 2011097664A2 AT 2011000074 W AT2011000074 W AT 2011000074W WO 2011097664 A2 WO2011097664 A2 WO 2011097664A2
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enzyme
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polymer
laccase
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Georg GÜBITZ
Eva WEHRSCHÜTZ-SIGL
Andrea Hasmann
Marc Schröder
Konstantin Schneider
Alexandra Rollett
Franz Kaufmann
Andreas Hafner
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Forschungsholding TU Graz GmbH
Technische Universitaet Graz
Original Assignee
Forschungsholding TU Graz GmbH
Technische Universitaet Graz
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to an arrangement which is suitable, inter alia. To detect microorganisms in a sample.
  • microorganisms in general and the identification of the detected microorganisms in a sample is of considerable importance in many areas.
  • microorganisms may be responsible for the spoilage or short shelf life of food.
  • microorganisms also play an important role in many diseases (e.g., inflammation) of humans and animals. It is therefore of great importance to detect the presence of microorganisms in time to take appropriate action.
  • the state of the art describes various systems and methods which are suitable for determining microorganisms in a sample. Some of these systems can also be used to detect specific substances (e.g., proteins such as enzymes) in a sample.
  • specific substances e.g., proteins such as enzymes
  • systems can use the simple adsorption be used erfor ⁇ countries.
  • a gold surface will be described with immobilized carbohydrates or a corresponding derivative, wherein the binding of Protei ⁇ NEN, viruses or bacterial cells, a detectable signal be ⁇ acts.
  • WO 98/010556 AI inter alia, a method is disclosed by means of which molecules can be bound to binding sites within a gel droplet.
  • molecules which are secreted by cells located within the gel droplet are bound to the free binding sites of the gel droplets.
  • WO 03/033691 AI a microchip is disclosed, with the aid of which the antibacterial activity of antibiotics can be tested.
  • prokaryotic and eukaryotic cells are immobilized in a gel by polymerizing it.
  • US 2006/0233854 A discloses a matrix which consists of a protein "backbone" which is cross-linked with polyethylene glycol, which matrix is particularly suitable for tissue regeneration, wherein the matrix may additionally comprise a biologically active substance which By testing the extent to which this matrix releases the biological active agent contained therein, colored fibrinogen fragments were incorporated into the matrix.
  • Biosens Bioelectron. 24 (8) (2009): 2604-2610) describes biosensors capable of detecting hydrogen peroxide in a sample. These biosensors comprise a polyethylene glycol-based hydrogel, which is additionally mixed with horseradish peroxidase. Finally, in order to directly determine the presence of hydrogen peroxide in a sample at the biosensor, an additional substrate of horseradish peroxidase, namely Amplex Red, is added.
  • US 2008/0057534 A1 describes the visual detection of a ner microbial contamination by the degradation of a top layer consisting of microbe-sensitive dyes. These microbes ⁇ sensitive dyes change color in the presence of microbes in the sample, so that the color is lost either or a color change occurs.
  • the dyes can be applied to any be ⁇ any underlay. A certain, albeit very limited, selectivity is made possible by the nature of the dyes.
  • EP 0 347 771 describes a method of characterizing enzymes of various bacteria which are common in blood and other body fluids. Forty-six different fluorescent substrates can be used in such a test. On the basis of the large number of differently fluorescent substrates and enzymatic reaction profiles, different microorganisms can be identified with this method.
  • Such systems may, e.g. in a system as described in US 2004/0018641 AI, are used.
  • the appearance or disappearance of computer-readable barcodes can indicate contamination in the food sector.
  • the indication is based on the detection of gases, temperature and pH differences, as well as toxins or other metabolites from bacteria.
  • US Pat. No. 6,297,059 B1 describes a method for measuring microbial contamination by means of fluorescence, based on a liquid two-layer membrane.
  • two or more fluorescence quenchers or a transmission of the extinction energy to a fluorescence acceptor are triggered per molecule and thus signal amplification is achieved.
  • Arrangements and devices of the type described above have a number of disadvantages.
  • One of the most significant disadvantages of many of the systems described above is their inertness and low detection sensitivity, since the reactions in these devices, which are triggered by different substances (“triggers”), are not amplified and this leads only slowly to signaling.
  • the present invention relates to an assembly comprising a solid support and a matrix disposed on the solid support comprising at least one enzymatically convertible or modifiable molecule, preferably polymer or oligomer, which matrix is at least one enzyme releasable by reacting or modifying the molecule, preferably polymer or oligomer which is capable of converting at least one color-producing substrate located in the matrix and / or on the solid support.
  • the arrangement according to the invention comprises, in addition to a solid support and an optional semipermeable membrane opposite thereto, a matrix which is arranged on the solid support or optionally between the solid support and the semipermeable membrane.
  • the matrix comprises at least one molecule, preferably polymer, which is degraded, reacted or modified by substances present in the sample (eg enzymes) can be.
  • the degradation, the conversion or the modification of such molecules or polymers in the matrix change their properties.
  • the reaction or modification of the molecule or polymer or oligomer can lead to their structural properties changing, which can lead to a reduction in the degree of crosslinking or viscosity, to change the pores in the polymer or to degradation of the polymer chains.
  • enzymes which assist in the modification, conversion or degradation of the polymer can also be present. These enzymes are either incorporated into the polymer or to the polymer through covalent bonds TIALLY ⁇ . As the polymer degrades, these enzymes are mobilized and can react with their substrate, which is bound to the solid support or in the polymer, to cause a color reaction (eg, formation of color or change in color).
  • Such a system is suitable, for example, for even the smallest amounts of microorganisms, such as bacteria or Mushrooms to prove in a sample.
  • An enzyme secreted by a contaminating bacterium or fungus penetrates the protective, semi-permeable membrane, degrades a matrix applied to a support material (eg, a polysaccharide, an enzyme, or combinations thereof, with or without cross-linking), thus initiating the release of the enzyme.
  • a support material eg, a polysaccharide, an enzyme, or combinations thereof, with or without cross-linking
  • Bioresponsive behavior is imparted to components by coating with biomaterials that can be degraded by extracellular enzymes.
  • Extracellular microbial Extracellular microbial
  • Enzymes can act as so-called triggers and thus initiate the release of active enzymes included and / or bound in the polymer.
  • the type of polymer (polypeptide, polysaccharide, synthetic polymer 7) defines the type of trigger enzymes required.
  • Microorganisms produce one
  • Extracellular enzymes that they deliver to the environment in addition to many other functions, e.g. To digest food components, in order to be able to take these into the cell.
  • Extracellular enzymes thus serve, among other things, the degradation of large molecules and polymers.
  • Hydrolysis of a variety of biopolymers is catalyzed by hydrolases which, depending on the substrate, are converted into lipases, proteases, esterases, glycosidases, and the like. can be divided.
  • polypeptide as used herein includes Lypeptide with a minimum size of 50 amino acids and thus includes proteins.
  • a "polymer-releasable enzyme” (polypeptide) is an enzyme which is incorporated into the polymer of the matrix and which can not diffuse due to cross-linking of the polymer or which is bound to the polymer by covalent and / or non-covalent bonds In both cases, the enzymes are essentially immobilized in the polymer prior to degradation of the polymer or restrictedly mobile due to the degradation, modification or conversion of the polymer whose long-chain or cross-linked chains are shortened or split, so that the enzymes are released in the matrix that is, be more mobile, and be able to diffuse around in it.
  • “Semipermeable membrane” as used herein refers to membranes that allows access of the trigger or enzymes from the outside in the inventive arrangement, but the diffusi ⁇ on the enzymes present in the matrix and the other matrix components prevents outward.
  • the enzyme present in the polymer and the color-producing substrate is chosen so that when contacting both substances, the substrate is reacted and it comes to color formation.
  • the color-producing substrate is reacted by enzymes present in the polymer, resulting in a color formation or color change.
  • enzymes present in the polymer e.g. by cleavage of a chemical group from the, substrate molecule or by changing the Redoxzu- state carried out a color formation.
  • the color formation or - change can also by enzymatic splits in the
  • an in situ synthesis or dye Farbstoffentfärbung can take place by the enzymatic reaction of one or more substrates, such as polymerization or Depoly- merisati 'on a phenol by means of oxidoreductase.
  • the indicator system may also be that the enhancer enzyme is capable of hydrolytically degrading a masking polymer layer to reveal the hidden color layer.
  • Peptidoglyl lysozyme PEG laccase siloxane 3,4 can / alginate dihydroxybenzoic acid
  • Peptidoglylysozyme PEG protease Siloxane -N can / alginate Succinyl Ala-Ala-Pro-Leu-p-Nitroanilide
  • Peptidoglyl lysozyme protease siloxane -N can / alginate succinyl Ala-Ala-Prö-Leu-p-nitroanilide
  • Peptidoglyl lysozyme PVA protease siloxane -N can / alginate succinyl ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide
  • Peptidoglyl lysozyme PEG laccase siloxane cane / agarose ferulic acid
  • Peptidoglyl lysozyme PEG protease Siloxane -N can / Agarose Succinyl Ala-Ala Pro-Leu-p-Nitroanilide
  • Peptidoglyl lysozyme protease siloxane -N can / agarose succinyl ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide
  • Peptidoglyl lysozyme PVA protease silocxan -N can / agarose succinyl ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide
  • Oxidoreductases such as laccases or peroxidases, proteases, lipases, esterases, peptidases, etc. can be used as amplifier enzymes for the amplification of the display.
  • the matrix is arranged as a layer, in the form of capsules or as a hydrogel, on the solid support.
  • the matrix between the solid support and the semipermeable membrane may have different shapes.
  • the matrix can be applied, for example, as a layer or capsules.
  • the use of capsules or multiple layers (at least two, three or four) has the advantage that the capsules and layers can have different compositions.
  • other capsules or layers may comprise enzymes which are capable of converting color-producing substrates.
  • the polymer composition of the various capsules or layers can also vary.
  • the matrix may comprise a degradable, modifiable molecule or polymer which can be degraded or modified by enzymes.
  • a degradable, modifiable molecule or polymer which can be degraded or modified by enzymes.
  • molecules or polymers which are degradable in the course of a pH change or by changing the ionic strength.
  • the enzymatically decomposable, metabolizable or modifiable polymer is preferably a polysaccharide, polypeptide, polyester, polyamide or a combination thereof.
  • the degradable polymer may, for example, be esterified to control the degradation or modification by enzymes present in the sample.
  • the polysaccharide is selected from the group consisting of pectin, amylose, amylopectin, agarose, alginate, carrageenan, chitin, chitosan, dextran, glycogen, guar, locust bean gum, levan, pectin, pollulan, tamarind kernel flour, xanthan gum, Cellulose and xylan.
  • Protein-based polymers which may be used in the present invention may be silk and elastin-like protein polymers.
  • the polymers may be provided with specific sequences (e.g., amino acid or oligosaccharide sequences) which are cleavage sites for particular enzymes. This makes it possible to produce polymers which are cleaved in contact with the substances to be detected (e.g., enzymes).
  • specific sequences e.g., amino acid or oligosaccharide sequences
  • the degradable polymer is selected from the group consisting of gum arabic, agar, agarose, maltodextrins, alginic acid and its salts, in particular sodium alginate or calcium alginate, liposomes, fats, cetyl alcohol, collagen, chitosan, Peptidoglycan, Leithine, gelatin, albumin, shellac, polysaccharides, in particular starch or dextran, cyclodextrins, pectin, carragenan and waxes.
  • the polymer degrading compound is an enzyme.
  • the enzyme which is included in the matrix is preferably selected from the group consisting of the groups of the hydrolases and oxidoreductases, for example proteases, laccases or peroxidases.
  • the color-producing substrate is selected from the group consisting of phenolic compounds and azo dyes such as ferulic acid, caffeic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, reactive blue, indigo carmine, ABTS or guaiacol.
  • the semipermeable membrane is preferably selected from the group consisting of cellulose derivatives, polyamides, polyacrylamides and polyesters.
  • a semipermeable character is achieved by modification of the surface of a page which is e.g. made more hydrophilic or hydrophobic. This can be achieved by e.g. by chemical, physical (plasma) or enzymatic treatment (e.g., Guebitz, G. M., Cavaco-Paulo, A., 2008. Trends in Biotechnology 26, 32-38).
  • plasma physical
  • enzymatic treatment e.g., Guebitz, G. M., Cavaco-Paulo, A., 2008. Trends in Biotechnology 26, 32-38.
  • the solid support comprises a material selected from the group consisting of inorganic materials, preferably silica gel, aluminum, silicon or glass, organic materials, preferably polyester, polystyrene, polyamide, polyacrylamide or polyvinyl alcohol, or biopolymers , preferably paper.
  • inorganic materials preferably silica gel, aluminum, silicon or glass
  • organic materials preferably polyester, polystyrene, polyamide, polyacrylamide or polyvinyl alcohol, or biopolymers , preferably paper.
  • the carrier material can be chemically modified.
  • functional groups are applied to the surface which can then covalently cross-link with constituents of the matrix.
  • trimethylsilyl methacrylate may be mentioned at this point.
  • trimethylsilyl groups with hydroxy groups can form covalent ether bridges on surfaces as they occur in glass but also in other polymers.
  • the methacrylic group can then crosslink with methacrylic groups of the matrix.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of an inventive arrangement for determining the presence and / or characterization of cells, preferably microorganisms, in a sample.
  • microorganisms to be determined and / or characterized are selected from the group consisting of bacteria and mushrooms.
  • the arrangement according to the invention can be used according to a further aspect for the detection of at least one enzyme in a sample.
  • Yet another aspect of the present invention relates to the use of an inventive wound infection detection assembly by determining the presence of at least one sore-specific enzyme.
  • "sore-specific" enzymes are enzymes that commonly occur in infections of wounds
  • Exemplary enzymes are those enzymes secreted by the microorganisms causing the infection or those secreted by the body in response to an infection ,
  • the at least one enzyme is selected from the group of hydrolases consisting of amylase, cellulase, xylanase, mannanase, protease, lysozyme, lipase and esterase, oxidase.
  • Fig. 1 shows the release of Alizarinfarbstoff by means of various microorganisms after 72 hours incubation (Example 3).
  • Fig. 2 shows the time course of the release of proteases from the biopolymer by the action of pectinases (Example 7).
  • Fig. 3 shows the time course of the release of the amplifier enzyme laccase from the biopolymer by the action of a trigger enzyme (pectinases) (Example 7).
  • Fig. 4 shows the release of p-nitroanilide of the immobilized substrate by means of commercial protease (Example 8).
  • Fig. 5 shows the color change of immobilized ferulic acid.
  • the enhancer enzyme laccase
  • Fig. 6 shows the conversion of ABTS (diammonium 2, 2 1 - azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) by laccase in ⁇ follow their release from a peptidoglycan matrix after incubation with lysozyme (5000 U / mL) or Buffer (control) at different times.
  • ABTS diammonium 2, 2 1 - azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
  • Fig. 7 shows a bioresponsive system according to the invention with enzymatic amplification reaction for controlled release and sensor technology.
  • a 5% solution of pectin derived from citrus peel with a degree of esterification of 50-60% was prepared by dissolving in water overnight at 50 ° C.
  • pectin from apple peel with a degree of esterification of .70-75% can be used.
  • 10 g of pectin was suspended in acetone containing 5 mM dye, heated under reflux overnight and washed at ⁇ closing several times with acetone.
  • the pectin solution was Siert auspolymeri- CaCl2 solution by dropwise addition to a 200 mM and the Pektinkugeln obtained were gewa ⁇ rule with water.
  • lg (wet weight) of the biopolymer A was ge ⁇ stained with alizarin and in lOmL buffer (50 mM, pH 6.0) and incubated for 24 hours at room tempera ture ⁇ with gentle shaking, using various com suddenly available ⁇ pectinases. Subsequently the supernatants were adjusted to pH14 with IN NaOH and the Adsorp ⁇ tion measured at 550nm using a UV / VIS photometer.
  • silica gel 10 g were stirred in 30 mL of a 3-9% aminopropyltriethoxysilane in ethanol (95%) for 4 hours at 40 ° C. Subsequently, the aminated silica gel was decanted off, washed 3 times with 70% ethanol and dried in a desiccator to constant weight ⁇ .
  • N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide, N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide or L-leucine p-nitroanilide can be immobilized in the same manner.
  • silica gel 10 g were stirred in 30 ml of a 3-9% mercaptopropyltriethoxysilane in ethanol (95%) for 4 hours at 40.degree. Subsequently, the silica gel was decanted off, washed 3 times with 2-propanol and dried in a desiccator to constant weight. To 5 g pretreated silica gel suspended in 20 mL dichloromethane are added 155 mg ferulic acid and 38 mg dimethylaminopyridine. To the cooled with ice to 0 ° C Discusssmi ⁇ Research 165 mg of DCC were added and stirred for 3 hours. The temperature was raised to room temperature (about 20 ° C) belas ⁇ sen. Then, the solid modified silica gel was abfil ⁇ trated, washed 3 times with dichloromethane and dried overnight in a desiccator.
  • Pectin obtained from citrus peel with a degree of esterification of 50-60%, was dissolved in water with gentle heating overnight. Alginate was added to pectin as the main constituent of the bioresponsive matrix in various concentrations (1- 20%).
  • a mixture consisting of 4.5 g of pectin and 0.5 g of sodium alginate in 100 ml of water was used.
  • the Gelher ⁇ position was made by dropping the pectin alginate solution in a submitted 200mM CaCl2 solution. The resulting pectin beads were washed with water.
  • the polymer was dropped into a 200mM CaCl 2 ⁇ solution and gelled.
  • the polymer beads thus obtained were screened off, washed 3 times with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and yielded in each case 1 g
  • biopolymer B (Example 4) was loaded with a protease of Aspergillus oryzae.
  • the polymer spheres obtained in this way were screened off, washed 3 times with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and portioned with 1 ml of 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 for every 1 g of wet mass in reaction vessels.
  • the enzymatic degradation was started by adding a commercial pectinase. During incubation at room temperature and with shaking, samples were taken from the supernatant at certain time intervals. From these samples, the protease activities were determined by azocasein assay and the protein content (FIG. 2).
  • the biopolymer may be loaded with any other enzyme, such as laccases, from the group of oxidoreductases.
  • laccases any other enzyme, such as laccases, from the group of oxidoreductases.
  • the activity of the released 'by means of ABTS Laccase is then determined according to (Fig. 3).
  • Example 2 10 mg silica gel with immobilized N-succinyl-Ala-Ala-Pro-leu-p-nitroanilide or L-leucine p-nitroanilide or N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide as protease substrates (Example 2) were suspended in 1300 L of 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.3 and incubated with commercially available protease from Aspergillus oryzae or with wound fluid at room temperature. The activity was determined by UV absorption of the cleaved p-nitroanilide in the supernatant at 375 nm or 405 nm (FIG. 4).
  • silica gel with immobilized ferulic acid as Lacca ⁇ sesubstrat (Example 2) or with immobilized Fast Blue RR were suspended in 1300 ⁇ ⁇ 50mM succinate buffer pH4.5 and incubated with laccase from Trametes hirsuta or wound fluid at room temperature. The activity is determined by a Farbmes ⁇ solution (yellow-orange) by means of spectrophotometer.
  • the polymer beads were sieved, 3 times with 50 mM succinate buffer pH 4.5 and washed in portions in a per lg wet mass in Christsge ⁇ Faessen with 5 mL of 50 mM succinate buffer pH 4.5 in the presence of 10mg of immobilized silica gel using ferulic acid as Laccasesubstrat from Example 2.
  • FIG. The enzymatic degradation was started by adding commercially available pectinase at room temperature and with shaking. After incubation of the Farbum ⁇ impact became yellow-orange with a color measurement using Spectro photo meter ⁇ determined (Fig. 5).
  • the biopolymer may be loaded with a protease of Aspergillus oryzae.
  • a protease of Aspergillus oryzae the activity of the protease released by UV absorption of the cleaved p-Nitroanilides in the supernatant at 375 nm is then accordingly be true ⁇ .
  • Enzymatic signaling and its amplification by release of modified proteases by means of pectinases The response of the bioresponsiven polymers can practice the diffusion behavior also set the Ver ⁇ more enzymes both as the trigger.
  • a chemical or genetic modification (eg enlargement) of the enhancer enzymes correspondingly lower degrees of cross-linking of the biopolymer can be used, while simultaneously minimizing the diffusion of the enhancer enzyme.
  • Example 6 the biopolymer was loaded with modifizie ter protease.
  • the polymer spheres thus obtained were screened off, washed 3 times with 50 mM succinate buffer pH4.5 and portioned in each case with 1 g wet mass in reaction vessels with 5 mM 50 mM succinate buffer pH4.5 in the presence of 10 mg silica gel with immobilized ferulic acid as laccase substrate from Example 2.
  • Enzymatic degradation at room temperature and with shaking was started by adding commercial pectinase. After incubation, the color change to yellow-orange was determined by means of a color measurement by means of a spectrophotometer (FIG. 5).
  • the molecular weight of the trigger enzyme can be increased by genetic engineering.
  • a system that can be used in the medical field uses the enzyme lysozyme as a trigger enzyme.
  • This enzyme of the body's native immune response is formed and secreted in the case of infection.
  • the main task of the enzyme is a destruction of bacteria by degradation of peptidoglycan, a component of the bacterial cell wall. It became de showed that increased amounts of enzyme are present in the case of wound infection.
  • 3.12 mg of micrococcus lysodeicticus cell wall from Sigma were suspended with ImL 1% agarose in phosphate buffer pH 7.00. ⁇ of this suspension were mixed in a microtiter plate with 50 L of a PEG modified Lac-case.
  • pectins or / and cellulose derivatives are dissolved in 100 ml of water and coupled with 3 ml of a 97% glycidyl methacrylate solution in the presence of 0.5 ml of 6 M HCl.
  • PES fabric is modified with trimethylsilyl methacrylate and overcoated with a modified with glycidyl methacrylate matrix and polymerized free-radically and covalently cross-linked.
  • Extracellular enzymes such as pectinases or cellulases, can now overcome the PES tissue by diffusion and functional molecules, e.g. Release enzymes, which in turn trigger a color reaction.
  • Another system that can be used in the medical field uses the enzyme elastase as a trigger enzyme.
  • This enzyme is produced and secreted by some types of bacteria, but also by the body's own immune response in the case of infection, whereby almost all types of protein can be cleaved. In the case of wound infection, clearly increased amounts of enzyme were detected in the wound secretions. Thus, this enzyme can be used as a marker enzyme for incipient wound infection.
  • these enzyme were 3.12mg Chitosan with ImL l% agarose in phosphate buffer pH 7.0 suspended. The chitosan was previously activated with GMBS in order to cross-link it on both sides via the SH group of a cysteine and the peptide sequence Ala-Ala-Pro-Val.

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Abstract

Anordnung umfassend einen festen Träger und eine an dem festen Träger angeordnete Matrix umfassend mindestens ein enzymatisch umsetzbares oder modifizierbares Molekül, welche Matrix mindestens ein durch Umsetzung oder Modifikation des Moleküls freisetzbares Enzym umfasst, das in der Lage ist zumindest ein in der Matrix und/oder am festen Träger befindliches farbänderndes Substrat umzusetzen.

Description

Tes tanordnung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung, welche geeignet ist, u.a. Mikroorganismen in einer Probe zu detektie- ren .
Der Nachweis von Mikroorganismen im Allgemeinen und die Identifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen in einer Probe ist in vielen Bereichen von erheblicher Wichtigkeit. So können beispielsweise Mikroorganismen für den Verderb oder die kurze Haltbarkeit von Lebensmitteln verantwortlich sein. Ferner spielen Mikroorganismen auch eine wichtige Rolle bei vielen Erkrankungen (z.B. Entzündungen) des Menschen und der Tiere. Es ist daher von großer Wichtigkeit das Vorhandensein von Mikroorganismen rechtzeitig zu erkennen, um entsprechende Maßnahmen zu setzen .
Im Stand der Technik sind verschiedenste Systeme und Verfahren beschrieben, die geeignet sind Mikroorganismen in einer Probe zu bestimmen. Diese Systeme können teilweise auch dazu eingesetzt werden spezielle Substanzen (z.B. Proteine wie Enzyme) in einer Probe nachzuweisen.
Zur Bestimmung mikrobieller Kontaminationen, beispielsweise, können Systeme eingesetzt werden die simple Adsorption erfor¬ dern. So wird zum Beispiel in der US 2001/017270 AI eine Gold¬ oberfläche mit immobilisierten Kohlenhydraten oder einem entsprechenden Derivat beschrieben, wobei die Bindung von Protei¬ nen, Viren oder Bakterienzellen ein detektierbares Signal be¬ wirkt.
In anderen Systemen werden andere äußere Einflüsse, wie zum Beispiel pH-Wert, ionische Stärke und Polarität zunutze gemacht. Eine durch die Anwesenheit von Mikroorganismen bedingte Änderung dieser Parameter kann z.B. zu einer Farbentwicklung oder - änderung führen.
In der WO 2006/065350 A2 erfolgt die Detektion von Mikroor¬ ganismen mittels eines Farbstoffes, welcher einen sichtbaren Farbwechsel bei Anwesenheit eines oder mehrerer Mikroorganismen zeigt. Dieser Farbwechsel basiert auf Unterschieden in der Polarität des Lösungsmittels bzw. Säure-Base-Reaktionen, Redox- Reaktionen, welche durch die Wechselwirkung zwischen Mikroorganismus und Sensor entstehen.
Ein weiteres, sehr einfaches System basiert auf der Detekti- on einer pH-Wert-Verschiebung während der mikrobiellen Kontamination (IE 20060034) .
In der WO 98/010556 AI wird unter anderem ein Verfahren geoffenbart, mit dessen Hilfe Moleküle an Bindungsstellen innerhalb eines Geltröpfchens gebunden werden können. Dabei werden Moleküle, welche von innerhalb des Geltröpfchens befindlichen Zellen sekretiert werden, an die freien Bindungsstellen der Geltröpfchen gebunden.
In der WO 03/033691 AI wird ein Mikrochip geoffenbart, mit dessen Hilfe die antibakterielle Aktivität von Antibiotika getestet werden kann. Bei der Herstellung eines derartigen Chips werden prokaryotische und eukaryotische Zellen in einem Gel durch dessen Polymerisierung immobilisiert.
In der US 5,366,881 A werden polymerisierbare Lipide und Mischungen davon geoffenbart, in welche Wirkstoffe, Enzyme, fluoreszierende Substanzen und dgl . eingebracht werden können. Durch Stimulantien von außen, wie pH-Änderung oder Ionen, werden die eingekapselten Substanzen freigesetzt.
In der US 2006/0233854 A wird eine Matrix geoffenbart, welche aus einem Protein-„Backbone" besteht, welches mit Polyethyl- englykol quervernetzt ist. Diese Matrix eignet sich insbesondere zur Gewebsregeneration . Die Matrix kann dabei zusätzlich einen biologisch aktiven Wirkstoff umfassen, der durch den Abbau der Matrix am Wirkort an das umliegenden Gewebe abgegeben wird. Um zu testen inwieweit diese Matrix den darin enthaltenen biologischen aktiven Wirkstoff freigibt, wurden gefärbte Fibrinogen- Fragmente in die Matrix aufgenommen.
Yan et al. (Biosens Bioelectron. 24 (8) (2009) : 2604-2610) beschreibt Biosensoren, die geeignet sind Wasserstoffperoxid in einer Probe zu bestimmen. Diese Biosensoren umfassen ein Hydro- gel auf Polyethylenglykolbasis , welche zusätzlich mit Meerret- tichperoxidase versetzt ist. Um schlussendlich am Biosensor direkt die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid in einer Probe zu bestimmen, wird zusätzlich noch ein Substrat der Meerrettichper- oxidase, nämlich Amplex Red, zugesetzt.
Ulijn et al. (Materials Today 10 (4) ( 2007 ) : 40-48 ) befassen sich mit bioresponsiven Hydrogelen. Darin werden verschiedenste Hydrogele diskutiert die je nach Mittel mit denen sie in Kontakt gebracht werden unterschiedliche Eigenschaften aufweisen.
Die US 2008/0057534 AI beschreibt die visuelle Detektion ei- ner mikrobiellen Kontamination durch den Abbau einer Deckschicht bestehend aus mikroben-sensitiven Farbstoffen. Diese mikroben¬ sensitiven Farbstoffe verändern bei Anwesenheit von Mikroben in der Probe die Farbe, so dass die Farbe entweder verloren geht oder ein Farbwechsel erfolgt. Die Farbstoffe können auf jede be¬ liebige Unterlage aufgebracht werden. Eine gewisse, wenn auch sehr eingeschränkte, Selektivität wird durch die Art der Farbstoffe möglich.
Neben den Änderungen der unmittelbaren Umgebung können auch sekretierte Moleküle wie zum Beispiel Metabolite oder Enzyme zur Detektion von Mikroorganismen herangezogen werden. So beschreibt die EP 0 347 771, beispielsweise, ein Verfahren zur Charakterisierung von Enzymen verschiedener Bakterien, welche häufig in Blut und anderen Körperflüssigkeiten vorkommen. Sechsundvierzig verschiedene fluoreszierende Substrate können in einem derartigen Test verwendet werden. Anhand der Vielzahl an unterschiedlich fluoreszierenden Substrate und enzymatisehen Reaktionsprofilen können mit diesem Verfahren unterschiedliche Mikroorganismen identifiziert werden.
Derartige Systeme können, z.B. in einem System wie in der US 2004/0018641 AI beschrieben, zum Einsatz kommen. Durch Erscheinen oder Verschwinden von computerlesbaren Barcodes kann eine im Lebensmittelbereich vorhandene Kontamination aufgezeigt werden. Die Indikation beruht auf dem Nachweis von Gasen, Temperatur- und pH-Wert-Unterschieden, sowie Toxinen oder anderer Metaboliten aus Bakterien.
Neben den visuell sichtbaren Farbstoffen kann auch Fluoreszenz herangezogen werden. Sehr oft werden hier Systeme basierend auf einer PCR Methode genutzt. Das beispielsweise in der
US 2007/0122831 AI beschriebene System nutzt die unterschiedli¬ chen DNA Sequenzen verschiedener Mikroorganismen für die Detektion von mikrobieller Kontamination und zur Identifikation deren Ursprungs in wässrigen Proben.
Die US 6,297,059 Bl beschreibt ein Verfahren zur Messung mikrobieller Kontamination mittels Fluoreszenz aufgebaut auf eine flüssige Zweischichtmembran. Durch das Ansprechen mehrwertiger oder polyvalenter Zielbiomoleküle werden pro Molekül zwei oder mehrere Fluoreszenzquencher bzw. eine Übertragung der Extinktionsenergie auf einen Fluoreszenzakzeptor ausgelöst und somit eine Signalverstärkung erzielt. Anordnungen und Vorrichtungen der oben beschriebenen Art weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Einer der wesentlichsten Nachteile vieler der oben beschriebenen Systeme ist deren Trägheit und geringe Nachweisempfindlichkeit, da die Reaktionen in diesen Vorrichtungen, welche durch unterschiedliche Substanzen („Trigger") ausgelöst werden, nicht verstärkt werden und dies nur langsam zu einer Signalgebung führt.
Weiters ist in vielen Fällen keine Schutzschicht vorhanden, sodass das System nur begrenzt stabil ist. Einfache Anzeigensysteme basierend auf Adsorption oder Verschiebung des pH-Wertes besitzen sehr geringe Selektivität und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber äußeren Einflüssen. Alternativ hierzu können Systeme basierend auf Antikörpern verwendet werden. Diese haben jedoch den Nachteil hoher Kosten und den Bedarf an entsprechenden
Instrumenten .
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Vorrichtungen bzw. Anordnungen zur Verfügung zu stellen, welche die oben genannten Nachteile des Standes der Technik überwinden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung umfassend einen festen Träger und eine an dem festen Träger angeordnete Matrix umfassend mindestens ein enzymatisch umsetzbares oder modifizierbares Molekül, vorzugsweise Polymer oder Oligomer, welche Matrix mindestens ein durch Umsetzung oder Modifikation des Moleküls, vorzugsweise Polymers oder Oligomers, freisetzbares Enzym umfasst, das in der Lage ist zumindest ein in der Matrix und/oder am festen Träger befindliches farberzeugendes Substrat umzusetzen.
Mit der erfindungsgemäßen Anordnung wird ein robustes System zur Verfügung gestellt, mit dessen Hilfe in einer Probe vorhandene Substanzen, insbesondere Enzyme, welche beispielsweise von Mikroorganismen sekretiert werden oder von anderen Quellen, wie beispielsweise dem Immunsystem stammen, zuverlässig detektiert werden können.
Die erfindungsgemäße Anordnung umfasst neben einem festen Träger und einer optionalen diesem gegenüberliegenden semipermeablen Membran eine Matrix, welche auf dem festen Träger bzw. gegebenenfalls zwischen dem festen Träger und der semipermeablen Membran angeordnet ist. Die Matrix umfasst mindestens ein Molekül, vorzugsweise Polymer, welches durch in der Probe vorhandene Substanzen (z.B. Enzyme), abgebaut, umgesetzt bzw. modifiziert werden kann. Durch den Abbau, die Umsetzung bzw. der Modifizierung derartiger Moleküle bzw. Polymere in der Matrix verändern sich deren Eigenschaften. Insbesondere kann die Umsetzung bzw. Modifikation des Moleküls bzw. Polymers oder Oligomers dazu führen, dass sich deren strukturellen Eigenschaften ändern, was zu einer Reduktion des Vernetzungsgrades bzw. der Viskosität, zur Änderung der Poren im Polymer oder zu einem Abbau der Polymerketten führen kann. Durch diese Modifikationen wird das in der Matrix befindliche freisetzbare Enzym mobiler und kann sich in¬ nerhalb der Matrix, insbesondere im Zwischenraum zwischen festem Träger und semipermeabler Membran, freier bewegen bzw. diffundieren. Durch die erhöhte Mobilität des Enzyms innerhalb der Anordnung wird diesem ermöglicht ein in der Matrix und/oder am festen Träger befindliches farberzeugendes Substrat umzusetzen bzw. freizusetzen und/oder das in der Matrix befindliche Molekül bzw. Polymer abzubauen.
Durch das Vorsehen von Enzymen in der erfindungsgemäßen Matrix, welches das Molekül bzw. Polymer in der Matrix umsetzt, abbaut oder modifiziert, wird die Mobilität der Enzyme in der Matrix vergrößert, sobald das Molekül bzw. Polymer durch extrinsi- sche Faktoren aus der Probe abgebaut wird. Es kommt somit zu ei¬ ner Farbreaktion und gegebenenfalls zu einer Verstärkung der De- tektionsreaktion, da die Freisetzung der Molekül- bzw. Polymermodifizierenden bzw. -umsetzenden Enzyme in der Matrix, falls vorhanden, den Abbau des Moleküls bzw. Polymers verstärkt und beschleunigt. Dadurch ist es erstmals möglich geringste Konzent¬ rationen solcher Stoffe bzw. Mikroorganismen in einer Probe nachzuweisen .
In der Matrix bzw. im Polymer können neben den Enzymen, die ein farberzeugendes Substrat umsetzen, auch Enzyme enthalten sein, die die Modifikation, Umsetzung oder den Abbau des Polymers unterstützen. Diese Enzyme sind entweder in das Polymer eingelagert oder an das Polymer über kovalente Bindungen gebun¬ den. Im Zuge des Abbaus des Polymers werden diese Enzyme mobilisiert und können mit deren Substrat, welches am festen Träger gebunden ist oder sich im Polymer befindet, reagieren und eine Farbreaktion (z.B. Bildung von Farbe oder Änderung der Farbe) hervorrufen .
Ein derartiges System eignet sich beispielsweise um bereits geringste Mengen an Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien oder Pilze, in einer Probe nachzuweisen. Dabei durchdringt ein von einem kontaminierenden Bakterium oder Pilz sekretiertes Enzym die schützende, semipermeable Membran, baut eine auf einem Trägermaterial aufgebrachte Matrix (z.B. ein Polysaccharid, ein Enzym oder Kombinationen davon, mit oder ohne Quervernetzung) ab und leitet somit die Freisetzung des Enzyms ein, welches als en- zymatisches Verstärkungssystem, die Freisetzung beschleunigt und/oder die Detektion einer mikrobiellen Kontamination erst ermöglicht .
Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten um das Polymer in der Matrix abzubauen, wie z.B. chemische, physikalische sowie biochemische. Beim chemischen Abbau wie z.B. einer Änderung des pH-Wertes, der ionischen Stärke oder chemischer Reagenzien werden die Wechselwirkungen zwischen den Polymerketten untereinander oder der Ketten mit den Lösungsmitteln auf molekularer Ebene verändert. Bei der physikalischen Stimulation (z.B. Temperatur, elektromagnetisches Feld und mechanischer Stress) erfolgt eine Veränderung molekularer Wechselwirkungen. Generell können biosensible Polymere und Mikrokapseln einfach auf pH-Wert- Änderungen in verschiedenen Umgebungen reagieren (Khayat, Int. J. Pharma 2006 317: 175-186; Li and Szoka Pharmaceutical Res. 2007 24:438-449; Nagareskar J. Biomed. Mater. Res. 2002 62: 195- 203) .
Bioresponsives Verhalten wird Bauteilen durch eine Beschich- tung mit Biomaterialien, welche durch extrazelluläre Enzyme abgebaut werden können, verliehen. Extrazelluläre mikrobielle
Enzyme können als sog. Trigger fungieren und somit die Freisetzung von im Polymer eingeschlossenen und/oder gebundenen aktiven Enzymen initiieren. Dabei definiert die Art des Polymers (Polypeptid, Polysaccharid, synthetisches Polymer...) die Art der benötigten Trigger-Enzyme. Mikroorganismen produzieren eine
Vielzahl extrazellulärer Enzyme, die sie an die Umgebung abgeben um neben vielen anderen Funktionen, z.B. Nahrungsbestandteile, aufzuschließen um diese in die Zelle aufnehmen zu können. Extrazelluläre Enzyme dienen somit -unter anderem dem Abbau von großen Molekülen und Polymeren. Die Hydrolyse einer Vielzahl von Biopolymeren wird von Hydrolasen katalysiert, die je nach Substrat in Lipasen, Proteasen, Esterasen, Glycosidasen, u.a. eingeteilt werden können.
Der Begriff „Polypeptid", wie hier verwendet, umfasst Po- lypeptide mit einer Mindestgröße von 50 Aminosäuren und schließt somit auch Proteine ein.
Ein „durch Abbau des Polymers freisetzbares Enzym" (Polypeptid) ist ein Enzym, welches in das Polymer der Matrix eingelagert ist und aufgrund der Quervernetzung des Polymers nicht diffundieren kann oder welches an das Polymer durch kovalente und/oder nicht kovalente Bindungen gebunden ist. In beiden Fällen sind die Enzyme vor Abbau des Polymers im Wesentlichen im Polymer immobilisiert bzw. nur beschränkt beweglich. Durch den Abbau, die Modifikation bzw. Umsetzung des Polymers werden dessen langkettige bzw. quervernetzte Ketten verkürzt bzw. gespalten, sodass die Enzyme in der Matrix freigesetzt, d.h. beweglicher, werden und darin herumdiffundieren können.
„Semipermeable Membran", wie hier verwendet, bezieht sich auf Membranen, die einen Zugang der Trigger bzw. Enzyme von außen in die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt, aber die Diffusi¬ on der in der Matrix befindlichen Enzyme und anderer Matrixbestandteile nach außen verhindert.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Anordnung wird das im Polymer befindliche Enzym und das farberzeugende Substrat so gewählt, dass bei Inkontaktbringen beider Stoffe das Substrat umgesetzt wird und es dadurch zur Farbbildung kommt.
Das farberzeugende Substrat wird durch im Polymer befindliche Enzyme umgesetzt, wodurch es zu einer Farbbildung oder Farbänderung kommt. So kann z.B. durch Abspaltung einer chemischen Gruppe aus dem ,Substratmolekül oder durch Änderung des Redoxzu- standes eine Farbbildung erfolgen. Die Farbbildung oder - änderung kann auch durch enzymatische Abspaltungen in der
Umgebungsmatrix erfolgen (z.B. durch Abspaltung eines Quenchers, Änderung des pH-Wertes durch Umesterung) .
Weiters kann auch eine in-situ FarbstoffSynthese oder Farbstoffentfärbung durch die enzymatische Umsetzung eines oder mehreren Substraten stattfinden, z.B. Polymerisation oder Depoly- merisati'on eines Phenols mittels Oxidoreduktase .
Das Indikatorsystem kann auch darin bestehen, dass das Verstärker-Enzym in der Lage ist, eine verdeckende Polymerschicht hydrolytisch abzubauen und somit die verdeckte Farbschicht in Erscheinung treten zu lassen.
In der folgenden Tabelle A sind besonders bevorzugte Kombinationen von Polymer (und dessen abbauendes Enzym) , farbändern- des Enzym und dessen Substrat angefüh
Polymer Abbauendes Eingeschlossenes Farbreaktion
Trigger Polypeptid (Verdurch
Enzym stärkerenzym) Umsatz von
bzw. gebundener
Farbstoff
Pektin Pektinase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilid
Pektin Pektinase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilid
Pektin Pektinase PVA -Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilid
Pektin Pektinase Laccase Siloxan- Ferulasäure
Pektin Pektinase Laccase Siloxan- Kaffeesäure
Pektin Pektinase Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure
Pektin Pektinase PEG- Laccase Siloxan- Ferulasäure
Pektin Pektinase PEG- Laccase Siloxan- Kaffeesäure
Pektin Pektinase PEG -Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure
Pektin Pektinase PEG Laccase ABTS
Pektin/Alginat Pektinase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilid Pektin/Alginat Pektinase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Pektin/Alginat Pektinase PVA -Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Pektin/Alginat Pektinase Laccase Siloxan- Ferulasäure
Pektin/Alginat Pektinase Laccase Siloxan- Kaffeesäure
Pektin/Alginat Pektinase Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoesäure
Pektin/Alginat Pektinase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Pektin/Alginat Pektinase PEG Laccase Siloxan- Kaffeesäure
Pektin/Alginat Pektinase PEG Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure
Pektin/Alginat Pektinase PEG Laccase ABTS
Pektin/Alginat Pektinase Laccase ABTS
Peptidogly- Lysozym Laccase ABTS
can/Alginat
Peptidogly- Lysozym PEG-Laccase ABTS
can/Alginat
Peptidogly- Lysozym PEG Laccase Siloxan- can/Alginat Ferulasäure
Peptidogly- Lysozym PEG Laccase Siloxan- can/Alginat Kaffesäure
Peptidogly- Lysozym PEG Laccase Siloxan 3,4, can/Alginat Dihydroxybenzoe- säure
Peptidogly- Lysozym PEG-Protease Siloxan -N can/Alginat Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide Peptidogly- Lysozym Protease Siloxan -N can/Alginat Succinyl Ala-Ala- Prö-Leu-p- Nitroanilide
Peptidogly- Lysozym PVA -Protease Siloxan -N can/Alginat Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Peptidogly- Lysozym Laccase ABTS
can/Agarose
Peptidogly- Lysozym PEG-Laccase ABTS
can/Agarose
Peptidogly- Lysozym PEG Laccase Siloxan- can/Agarose Ferulasäure
Peptidogly- Lysozym PEG Laccase Siloxan- can/Agarose Kaffeesäure
Amylopektin Amylase PEG Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure
Peptidogly- Lysozym PEG-Protease Siloxan -N can/Agarose Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Peptidogly- Lysozym Protease Siloxan -N can/Agarose Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Peptidogly- Lysozym PVA -Protease Silocxan -N can/Agarose Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Elastin/Agarose Elastase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilid
Elastin/Agarose Elastase Protease Silocxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilid Elastin/Agarose Elastase PVA -Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Elastin/Agarose Elastase Laccase Siloxan- Ferulasäure
Elastin/Agarose Elastase Laccase Siloxan- Kaffeesäure
Elastin/Agarose Elastase Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoesäure
Elastin/Agarose Elastase PEG-Laccase ABTS
Elastin/Agarose Elastase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Elastin/Agarose Elastase PEG Laccase Siloxan- Kaffesäure
Elastin/Agarose Elastase PEG Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure
Silk/Agarose Elastase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Silk/Agarose Elastase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Silk/Agarose Elastase PVA -Protease Silocxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Silk/Agarose Elastase Laccase Siloxan- Ferulasäure
Silk/Agarose Elastase Laccase Siloxan- Kaffesäure
Silk/Agarose Elastase Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure Silk/Agarose Elastase PEG-Laccase ABTS
Silk/Agarose Elastase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Silk/Agarose Elastase PEG Laccase Siloxan- Kaffeesäure
Silk/Agarose Elastase PEG Laccase Siloxan 3,4,
Dihydroxybenzoe- säure
Chitosan Lysozym PEG-Laccase ABTS
/Agarose
Chitosan Lysozym PEG Laccase Siloxan- /Agarose Ferulasäure
Chitosan Lysozym PEG Laccase Siloxan- /Agarose Kaffesäure
Chitosan Amylase PEG Laccase Siloxan 3,4, /Agarose Dihydroxybenzoe- säure
Chitosan Lysozym PEG-Protease Siloxan -N
/Agarose Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Chitosan Lysozym Protease Siloxan -N
/Agarose Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Chitosan Lysozym PVA -Protease Siloxan -N
/Agarose Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Gelatine/Agarose Gelatinase Laccase ABTS
Gelatine/Agarose Gelatinase PEG-Laccase ABTS
Gelatine/Agarose Gelatinase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Gelatine/Agarose Gelatinase PEG Laccase Siloxan- Kaffesäure
Gelatine/Agarose Gelatinase PEG Laccase Siloxan
3, , Dihydroxybenz oesäure Gelatine/Agarose Gelatinase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Gelatine/Agarose Gelatinase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Gelatine/Agarose Gelatinase PVA -Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Gelatine/Alginat Gelatinase Laccase ABTS
Gelatine/Alginat Gelatinase PEG-Laccase ABTS
Gelatine/Alginat Gelatinase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Gelatine/Alginat Gelatinase PEG Laccase Siloxan- Kaffesäure
Gelatine/Alginat Gelatinase PEG Laccase Siloxan
3,4, Dihydroxybenz oesäure
Gelatine/Alginat Gelatinase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Gelatine/Alginat Gelatinase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Xylan Xylanase Laccase ABTS
Xylan Xylanase Xylan ABTS
Xylan Xylanase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Xylan Xylanase PEG Laccase Siloxan- Kaffesäure
Xylan Xylanase PEG Laccase Siloxan
3, 4, Dihydroxybenz oesäure Xylan Xylanase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Xylan Xylanase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Cellulose Cellulase Laccase ABTS
Cellulose Cellulase Xylan ABTS
Cellulose Cellulase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Cellulose Cellulase PEG Laccase Siloxan- Kaffesäure
Cellulose Cellulase PEG Laccase Siloxan
3,4, Dihydroxybenz oesäure
Cellulose Cellulase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Cellulose Cellulase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide
Dextran Amylase Laccase ABTS
Dextran Amylase Xylan ABTS
Dextran Amylase PEG Laccase Siloxan- Ferulasäure
Dextran Amylase PEG Laccase Siloxan- Kaffesäure
Dextran Amylase PEG Laccase Siloxan
3, 4, Dihydroxybenz oesäure
Dextran Amylase PEG-Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala- Pro-Leu-p- Nitroanilide Dextran Amylase Protease Siloxan -N
Succinyl Ala-Ala-
Pro-Leu-p-
Nitroanilide
Als Verstärker-Enzyme für die Amplifikation der Anzeige können Oxidoreduktasen wie Laccasen oder Peroxidasen, Proteasen, Li- pasen, Esterasen, Peptidasen, etc. eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Matrix als Schicht, in Form von Kapseln oder als Hydrogel, auf dem festen Träger angeordnet.
Die Matrix zwischen dem festen Träger und der semipermeablen Membran kann unterschiedliche Formen aufweisen. Die Matrix kann beispielsweise als Schicht oder Kapseln aufgebracht werden. Die Verwendung von Kapseln bzw. mehrerer Schichten (mindestens zwei, drei oder vier) hat den Vorteil, dass die Kapseln und Schichten unterschiedliche Zusammensetzungen aufweisen können. So ist es möglich eine Kapselart bzw. eine Schicht zur Verfügung zu stellen, die Enzyme umfassen, die in der Lage sind das Polymer der Matrix abzubauen. Andere Kapseln bzw. Schichten können hingegen Enzyme umfassen, die in der Lage sind farberzeugende Substrate umzusetzen. Auch die Polymerzusammensetzung der verschiedenen Kapseln bzw. Schichten können variieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Matrix ein abbaubares, modifizierbares Molekül bzw. Polymer umfassen, welches durch Enzyme abgebaut bzw. modifiziert werden kann. Selbstverständlich können aber auch Moleküle bzw. Polymere eingesetzt werden, die im Zuge einer pH-Wert- Änderung oder durch Änderung der Ionenstärke abbaubar sind.
Das enzymatisch zersetzbare, umsetzbare oder modifizierbare bzw. abbaubare Polymer ist vorzugsweise ein Polysaccharid, Polypeptid, Polyester, Polyamid oder eine Kombination davon.
Das abbaubare bzw. modifizierbare Polymer kann, um den Abbau bzw. die Modifikation durch in der Probe vorhandenen Enzymen zu steuern, beispielsweise, verestert sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polysaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pektin, Amylose, Amylopektin, Agarose, Alginat, Carrag- henan, Chitin, Chitosan, Dextran, Glycogen, Guar, Johannisbrotkernmehl, Laevan, Pektin, Pollulan, Tamarindenkernmehl , Xanthan, Zellulose und Xylan.
Um eine weitere Variationsmöglichkeit zu besitzen besteht ebenfalls die Möglichkeit das Polymer mit funktionellen Seitenketten zu modifizieren. Diese Seitenketten sind in der Lage duch kovalentes Quervernetzen ein gegen Autohydrolyse stabiles Polymernetzwerk zu bilden. Die Abbaubarkeit durch die bereits beschriebenen Trigger Enzyme wird dadurch nicht beeinflusst. Möglichkeiten für derartige Seitenketten wären radikalisch polyme- risierende Monomere wie Acrylate bzw. Methacrylate .
Polymere auf Proteinbasis, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden können, können Seide und Elastin ähnliche Proteinpolymere sein .
Um eine verbesserte Spezifität der Polymere zu erreichen, können die Polymere mit spezifischen Sequenzen (z.B. Aminosäureoder Oligosaccharidsequenzen) versehen werden, welche Spaltstellen für bestimmte Enzyme darstellen. Damit wird ermöglicht Polymere herzustellen, die in Kontakt mit den nachzuweisenden Substanzen (z.B. Enzymen) gespalten werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das abbaubare Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gummiarabicum, Agar, Agarose, Maltodextri- ne, Alginsäure und deren Salze, insbesondere Natriumalginat oder Calciumalginat , Liposome, Fette, Cetylalkohol , Collagen, Chito- san, Peptidoglycan, Leithine, Gelatine, Albumin, Schellack, Po- lysaccaride, insbesondere Stärke oder Dextran, Cyclodextrine , Pektin, Carragenan und Wachse.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die polymerabbauende Verbindung ein Enzym.
Das Enzym welches in der Matrix umfasst ist, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen der Hyd- rolasen und Oxidoreduktasen wie zum Beispiel Proteasen, Laccasen oder Peroxidasen.
Um die Mobilität der Enzyme im Polymer vor dessen Abbau einzuschränken, um den vorzeitigen Abbau des Polymers zu verhindern bzw. zu unterbinden und um zu verhindern, dass das farberzeugende Substrat vorzeitig umgesetzt wird, ist das durch die Umsetzung oder Modifikation bzw. den Abbau des Moleküls bzw. Polymers freisetzbare Enzym chemisch oder adsorptiv, z.B., an Polyvi- nylalkohol, Polyethylenglykol (PEG) oder Peptide gebunden oder dessen Molekulargewicht genetisch durch Fusion, z.B. mit Elastin oder anderen Peptiden oder Proteinen vergrößert. Durch die Bindung des Polypeptids an diese hochmolekularen Gruppen wird die Diffusion im Polymer im Wesentlichen verhindert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das farberzeugende Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phenolischen Verbindungen und Azo-Farbstoffen wie Ferulasäure, Kaffeesäure, 3, 4-Dihydroxybenzoesäure, Reactive Blue, Indigo Carmine, ABTS oder Guaiacol.
Die semipermeable Membran ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cellulosederivate, Polyamide, Polyacrylamide und Polyester.
Ein semipermeabler Charakter wird durch Modifikation der Oberfläche einer Seite erreicht die z.B. hydrophiler oder hydrophober gemacht wird. Dies kann durch z.B. durch chemische, physikalische (Plasma) oder enzymatische Behandlung erzielt werden (z.B. Guebitz, G.M. , Cavaco-Paulo, A. , 2008. Trends in Biotechnolo- gy 26, 32-38) .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der feste Träger ein Material, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anorganischen Materialien, vorzugsweise Silicagel, Aluminium, Silizium oder Glas, organischen Materialien, vorzugsweise Polyester, Polystyrol, Polyamid, Polyacrylamid oder Polyvinylalkohol , oder Biopolymeren, vorzugsweise Papier.
Um die Bindung zwischen Trägermaterial und Matrix zu verbessern kann das Trägermaterial chemisch modifiziert werden. Bei der Modifikation werden funktionelle Gruppe auf die Oberfläche aufgebracht die anschließend mit Bestandteilen der Matrix kova- lent quervernetzen können. Als Beispiel sei an dieser Stelle Trimethylsilyl methacrylate genannt. Wie an andere Stelle beschrieben können Trimethylsilyl Gruppen mit Hydroxygruppen an Oberflächen wie sie bei Glas aber auch bei andere Polymeren vorkommen kovalente Etherbrücken bilden. Die Metacrylgruppe kann im Anschluss mit Methacrylgruppen der Matrix quervernetzen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Charakterisierung von Zellen, vorzugsweise von Mikroorganismen, in einer Probe.
Die zu bestimmenden und/oder charakterisierenden Mikroorganismen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien und Pilzen.
Die erfindungsgemäße Anordnung kann gemäß einem weiteren Aspekt zur Detektion mindestens eines Enzyms in einer Probe verwendet werden. Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung zur Detektion einer Wundinfektion durch Bestimmen des Vorhandenseins mindestens eines wund-spezifischen Enzyms.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind „wund-spezifische" Enzyme Enzyme, die üblicherweise bei Infektionen von Wunden auftreten. Beispielhafte Enzyme sind solche Enzyme, die von den die Infektion auslösenden Mikroorganismen sekretiert werden oder solche Enzyme, die vom Körper als Antwort auf eine Infektion ausgeschüttet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mindestens eine Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Hydrolasen bestehend aus Amylase, Cellulase, Xylanase, Mannanase, Protease, Lysozym, Lipase und Esterase, Oxidase.
Die gegenständliche Erfindung wird ferner anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher illustriert.
Fig. 1 zeigt die Freisetzung von Alizarinfarbstoff mittels verschiedenen Mikroorganismen nach 72 Stunden Inkubation (Beispiel 3) .
Fig. 2 zeigt den Zeitverlauf der Freisetzung von Proteasen aus dem Biopolymer durch Einwirkung von Pektinasen (Beispiel 7).
Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf der Freisetzung des Verstärkerenzyms Laccase aus dem Biopolymer durch Einwirkung eines Triggerenzyms (Pektinasen) (Beispiel 7).
Fig. 4 zeigt die Freisetzung von p-Nitroanilid des immobilisierten Substrats mittels kommerzieller Protease (Beispiel 8).
Fig. 5 zeigt den Farbumschlag immobilisierter Ferulasäure. Durch Einwirkung des Triggerenzyms (Pektinase) wird das Verstärkerenzym (Laccase) aus dem Biopolymer freigsetzt und induziert die Farbreaktion (Farbgebung durch Oxidation imobilisierter Ferulasäure) (Beispiel 10). Fig. 6 zeigt die Umsetzung von ABTS ( Diammonium-2 , 21 - azinobis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) ) durch Laccase in¬ folge deren Freisetzung aus einer Peptidoglycan Matrix nach Inkubation mit Lysozym (5000 U/mL) oder Puffer (Kontrolle) nach verschiedenen Zeitpunkten.
Fig. 7 zeigt ein erfindungsgemäßes bioresponsives System mit enzymatischer Verstärkungsreaktion zur kontrollierten Freisetzung und Sensorik.
BEISPIELE
Beispiel 1:
Herstellung eines Biopolymers A
Eine 5%ige Lösung aus Pektin, gewonnen aus Citrusschalen mit einem Veresterungsgrad von 50-60%, wurde durch Auflösen in Wasser über Nacht bei 50 °C hergestellt. Alternativ kann auch Pektin aus Apfelschalen mit einem Veresterungsgrad von .70-75% verwendet werden .
Im Vorfeld wurde das Polysaccharid mit verschiedenen Farb¬ stoffen wie' z.B. Alizarin, Cibacrom, Remazol, Viktoriablau oder anderen gefärbt. Dazu wurden 10g Pektin in Aceton mit 5mM Farbstoff suspendiert, über Nacht unter Rückfluss erhitzt und an¬ schließend mehrere Male mit Aceton gewaschen. Die Pektinlösung wurde durch Eintropfen in eine 200mM CaCl2 Lösung auspolymeri- siert und die erhaltenen Pektinkugeln wurden mit Wasser gewa¬ schen .
Enzymatischer Abbau von Biopolymer A
lg (Feuchtmasse) des Biopolymers A wurde mit Alizarin ge¬ färbt und in lOmL Puffer (50mM, pH6,0) für 24h bei Raumtempera¬ tur unter leichtem Schütteln unter Verwendung verschiedener kom¬ merziell erhältlicher Pektinasen inkubiert. Anschließend wurden die Überstände mit IM NaOH auf pH14 eingestellt und die Adsorp¬ tion bei 550nm mit Hilfe eines UV/VIS Photometers gemessen.
Mikrobiologischer Abbau von Biopolymer A
Unterschiedliche potentiell kontaminierende Mikroorganismen wurden mittels Vorkultur angezüchtet. Zu lOOmL der Hauptkultur wurden jeweils lg Feuchtmasse des mit Alizarin gefärbten Biopo¬ lymers A zugegeben und mit 100yL Vorkultur inokuliert. Die Inkubation wurde für 72 Stunden bei 33°C durchgeführt. Anschließend wurde die Biomasse abzentrifugiert und die Absorption des Über- Standes bei geeigneter Wellenlänge gemessen (Fig. 1) .
Beispiel 2:
Siloxanimmobilisierung des Substrats für das Verstärkerenzym Methode A
10g Kieselgel wurden in 30mL einer 3-9% Aminopropy- ltriethoxysilan in Ethanol (95%) für 4 Stunden bei 40°C gerührt. Anschließend wurde das aminierte Kieselgel abdekantiert, 3-mal mit 70% Ethanol gewaschen und im Exsikkator bis zur Gewichts¬ konstanz getrocknet.
50mg N- ( 3-Dimethylaminopropyl ) -N-ethylcarbodiimid hydrochlo- rid, 5mg ( 1-Hydroxybenzotriazole hydrate) und 50mg Ferulasäure wurden in 20mL absolutem Ethanol gelöst. Anschließend wurde 5g aminiertes Kieselgel zugegeben und 30min gerührt. Nach Zentrifu- gation wurde das Kieselgel mit der gekoppelten Ferulasäure mit 70% Ethanol gewaschen und im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Alternativ zur Ferulasäure kann Kaffeesäure, 3,4- Dihydroxybenzoesäure, oder Fast Blue RR etc. verwendet werden. Weiters können auch Proteasesubstrate wie z.B. N-Succinyl-Ala- Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid, N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p- nitroanilid oder L-Leucin-p-nitroanilid auf die gleiche Art und Weise immobilisiert werden.
Methode B
10g Kieselgel wurde in 30mL einer 3-9% Mercaptopropy- ltriethoxysilan in Ethanol (95%) für 4 Stunden bei 40°C gerührt. Anschließend wurde das Kieselgel abdekantiert, 3-mal mit 2- Propanol gewaschen und im Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Zu 5g vorbehandeltem Kieselgel, suspendiert in 20mL Dichlormethan, werden 155mg Ferulasäure und 38mg Dimethylamino- pyridin zugegeben. Zu der mit Eis auf 0°C gekühlten Reaktionsmi¬ schung wurden 165mg DCC zugegeben und über 3 Stunden gerührt. Dabei wurde die Temperatur auf Raumtemperatur (ca. 20 °C) belas¬ sen. Anschließend wurde das feste, modifizierte Kieselgel abfil¬ triert, 3-mal mit Dichlormethan gewaschen und über Nacht im Exsikkator getrocknet.
Beispiel 3:
Herstellung des Biopolymers B
Pektin, gewonnen aus Citrusschalen mit einem Veresterungsgrad von 50-60%, wurde unter leichtem Erhitzen über Nacht in Wasser gelöst. Zum Pektin als Hauptbestandteil der bioresponsi- ven Matrix wurde Alginat in verschiedenen Konzentrationen (1- 20%) beigemengt.
Vorzugsweise wurde eine Mischung bestehend aus 4,5g Pektin und 0,5g Natriumalginat in lOOmL Wasser verwendet. Die Gelher¬ stellung erfolgte durch Eintropfen der Pektin-Alginat-Lösung in eine vorgelegte 200mM CaCl2 Lösung. Die erhaltenen Pektinkugeln wurden mit Wasser gewaschen.
Beispiel 4:
Inkorporation von Enzymen und Proteinen in Biopolymer B
Zu einer Mischung bestehend aus 4,5g Pektin und 0,5g Natriumalginat in lOOmL Wasser wurden 5mL kommerziell erhältlicher Protease von Aspergillus oryzae zugegeben.
Nach dem Vermischen der Polysaccharidlösung mit dem Enzym wurde das Polymer in 200mM CaCl2~Lösung eingetropft und ausgeliert. Die so gewonnenen Polymerkügelchen wurden abgesiebt, 3- mal mit 50mM Tris-HCl Puffer pH7,5 gewaschen und zu je lg
Feuchtmasse in Reaktionsgefäßen mit 5mL 50mM Tris-HCl Puffer pH7,5 portioniert.
Entsprechend können auch andere Enzyme wie z.B. Laccasen verschiedener Trametes sp. immobilisiert werden. Weiters können auch Proteine z.B. Casein, Collagen etc. entsprechend eingebaut werden.
Beispiel 5:
Freisetzung von Enzymen mittels Pektinasen
Als Testpolymer wurde das Biopolymer B (Beispiel 4) mit einer Protease von Aspergillus oryzae beladen.
Die so gewonnenen Polymerkugeln wurden abgesiebt, 3-mal mit 50mM Tris-HCl Puffer pH7,5 gewaschen und zu je lg Feuchtmasse in Reaktionsgefäßen mit 5mL 50mM Tris-HCl Puffer pH7,5 portioniert. Der enzymatische Abbau wurde durch Zugabe einer kommerziellen Pektinase gestartet. Während der Inkubation bei Raumtemperatur und unter Schütteln wurden in bestimmten Zeitintervallen Proben aus dem Überstand genommen. Von diesen Proben wurden die Pro- teaseaktivitäten mittels Azocasein Assay und der Proteingehalt bestimmt (Fig. 2).
Alternativ dazu kann das Biopolymer mit jedem anderen Enzym, wie z.B. Laccasen, aus der Gruppe der Oxidoreduktasen beladen werden. Hier wird dann entsprechend die Aktivität der freigesetzten' Laccase mittels ABTS bestimmt (Fig. 3).
Beispiel 6:
Enzymatische Signalgebung und deren Verstärkung mittels Pro- teasen
10mg Kieselgel mit immobilisiertem N-Succinyl-Ala-Ala-Pro- Leu-p-nitroanilid bzw. L-Leucin-p-nitroanilid oder N-Succinyl- Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid als Proteasesubstrate (Beispiel 2) wurden in 1300 L 50mM Tris-HCl Puffer pH8,3 suspendiert und mit kommerziell erhältlicher Protease von Aspergillus oryzae bzw. mit Wundflüssigkeit bei Raumtemperatur inkubiert. Die Aktivität wurde mittels UV-Absorption des abgespaltenen p-Nitroanilides im Überstand bei 375nm bzw. bei 405nm bestimmt (Fig. 4).
Beispiel 7:
Enzymatische Signalgebung und deren Verstärkung mittels Lac- casen
10mg Kieselgel mit immobilisierter Ferulasäure als Lacca¬ sesubstrat (Beispiel 2) bzw. mit immobilisiertem Fast Blue RR wurden in 1300μΙ^ 50mM Succinat Puffer pH4,5 suspendiert und mit Laccase vom Trametes hirsuta bzw. mit Wundflüssigkeit bei Raumtemperatur inkubiert. Die Aktivität wird anhand einer Farbmes¬ sung (gelb-orange) mittels Spectrophotometer bestimmt.
Beispiel 8:
Enzymatische Signalgebung und deren Verstärkung durch Frei¬ setzung von Laccasen mittels Pektinasen
Als Testpolymer diente das Biopolymer aus Beispiel 4 beladen mit Laccasen verschiedener Trametes sp.
Die Polymerkugeln wurden abgesiebt, 3-mal mit 50mM Succinat Puffer pH4,5 gewaschen und zu je lg Feuchtmasse in Reaktionsge¬ fäßen mit 5mL 50mM Succinat Puffer pH4,5 in Anwesenheit von 10mg Kieselgel mit immobilisierter Ferulasäure als Laccasesubstrat aus Beispiel 2 portioniert. Der enzymatische Abbau wurde durch Zugabe kommerziell erhältlicher Pektinase bei Raumtemperatur und unter Schütteln gestartet. Nach der Inkubation wurde der Farbum¬ schlag zu gelb-orange anhand einer Farbmessung mittels Spectro¬ photometer bestimmt (Fig. 5).
Alternativ dazu kann das Biopolymer mit einer Protease von Aspergillus oryzae beladen werden. Hier wird dann entsprechend die Aktivität der freigesetzten Protease mittels UV-Absorption des abgespaltenen p-Nitroanilides im Überstand bei 375 nm be¬ stimmt .
Beispiel 9:
Enzymatische Signalgebung und deren Verstärkung durch Freisetzung von modifizierten Proteasen mittels Pektinasen Das Ansprechverhalten der bioresponsiven Polymere kann übe das Diffusionsverhalten sowohl der Trigger- als auch der Ver¬ stärkerenzyme eingestellt werden. Durch eine chemische oder genetische Modifikation (z.B. Vergrößerung) der Verstärkerenzyme können entsprechend geringere Vernetzungsgrade des Biopolymers eingesetzt werden, bei einer gleichzeitigen Minimierung der Aus diffusion des Verstärkerenzyms.
Zur chemischen Modifikation von Verstärkerenzymen mit wasserlöslichen Polymeren wurden lg Methoxypolyethylenglykol und 0,4g Cuyanurchlorid in lOOmL trockenem Toluol gelöst und für 40 Stunden bei 40 °C gerührt. Anschließend wurde das aktivierte Polymer in Hexan gefällt, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Durch Verwendung unterschiedlicher Molekulargewichte (350, 550, 1100, 2000, 5000 etc.) kann mittels der Länge des Polymers das Diffusionsverhalten des Konjugates eingestellt werden. Das Poly mer wurde in schwach basischem Medium Boratpuffer pH9,3 an das Enzym gehängt. Nach der Reaktion wurde ungebundenes Polymer mit tels Ultrafiltration entfernt und das Konjugat ohne weitere Aufreinigung verwendet.
Entsprechend Beispiel 6 wurde das Biopolymer mit modifizie ter Protease beladen. Die so gewonnenen Polymerkugeln wurden ab gesiebt, 3-mal mit 50mM Succinat Puffer pH4,5 gewaschen und zu je lg Feuchtmasse in Reaktionsgefäßen mit 5mL 50mM Succinat Puf fer pH4,5 in Anwesenheit von 10mg Kieselgel mit immobilisierter Ferulasäure als Laccasesubstrat aus Beispiel 2 portioniert. Der enzymatische Abbau bei Raumtemperatur und unter Schütteln wurde durch Zugabe kommerzieller Pektinase gestartet. Nach der Inkuba tion wurde der Farbumschlag zu gelb-orange anhand einer Farbmes sung mittels Spectrophotometer bestimmt (Fig. 5). Alternativ hierzu kann das Molekulargewicht des Triggerenzyms gentechnisch erhöht werden.
Beispiel 10:
Enzymatische Signalgebung und deren Verstärkung durch Frei Setzung von modifizierter Laccase mittels Lysozym
Ein System das im medizinischen Bereich zur Anwendung gebracht werden kann benützt das Enzym Lysozym als Trigger Enzym. Dieses Enzym der körpereigenen, nativen Immunantwort wird im Falle von Infektion gebildet und sekretiert. Hauptaufgabe des Enzyms ist eine Zerstörung von Bakterien durch Abbau von Pep- tidoglycan, einem Bestandteil der bakteriellen Zellwand. Es wur de gezeigt, dass erhöhte Enzymmengen im Falle einer Wundinfektion vorliegen. Im folgenden System wurden 3,12mg Mikrokokkus lysodeicticus Zellwand von Sigma mit ImL l%iger Agarose in Phosphat-Puffer pH7,00 suspendiert. ΙΟΟμΙ dieser Suspension wurden in einer Mikrotiterplatte mit 50 L einer PEG modifizierten Lac- case vermischt. Nach Aushärten wird das Polymer mit Puffer gewaschen und ΙΟΟμΙ einer LysozymLösung (200-5000U/mL) aufgetragen. Die Inkubation erfolgte bei 37°C. Alle 30 Minuten wurden 25μ1 des Überstandes entnommen. Laccaseaktivität wurde mittels des ABTS Assays nachgewiesen (1400pL Saccharose Puffer + 45yL 1% H2O2 + 30μΙ, ABTS 40mM) : 25μΙ, Überstand + 75pL ABTS-Lösung) . Eine Grünfärbung trat nach einigen Minuten Inkubation mit Lysozym durch Umsetzung von ABTS durch die freigesetze Laccase auf (Fig. 6) .
Beispiel 11:
Quervernetztes Biopolymer und Freisetzung von Enzymen mittels Pektinasen oder Cellulasen
5 g Pektine oder/und Cellulosederivate werden in 100 mL Wasser gelöst und mit 3 3mL einer 97% Glycidylmethacrylate Lösung in Gegenwart von 0,5 mL 6 M HCl gekoppelt.
PES Gewebe wird mit Trimethylsilyl methacrylate modifiziert und mit einer mit Glycidylmethacrylate modifizierten Matrix überschichtet und radikalisch auspolymerisiert und damit kovalent quervernetzt .
Extrazellulare Enzyme wie Pektinasen oder Cellulasen können nun das PES Geweben durch Diffusion überwinden und durch Abbau der Matrix darin eingeschlossene funktionelle Moleküle wie z.B. Enzyme freisetzen, die ihrerseits eine Farbreaktion auslösen.
Beispiel 12:
Quervernetztes Biopolymer und Freisetzung von Enzymen durch Freisetzung von modifizierten Enzymen mittels Elastase
Ein weiteres System, das im medizinischen Bereich zur Anwendung gebracht werden kann, benützt das Enzym Elastase als Trigger Enzym. Dieses Enzym wird von manchen Bakterienarten, aber auch von der körpereigenen Immunantwort im Falle von Infektion gebildet und sekretiert, wobei fast alle Arten von Protein gespalten werden können. Im Falle von Wundinfektion konnten eindeutig erhöhte Enzymmmengen im Wundsekret nachgewiesen werden. Damit kann dieses Enzym als Markerenzym für beginnende Wundinfektion herangezogen werden. Im folgenden System wurden 3,12mg Chitosan mit ImL l%iger Agarose in Phosphat-Puffer pH 7,0 suspendiert. Das Chitosan wurde zuvor mit GMBS aktiviert, um es beidseits über die SH Gruppe eines Cysteins und der Peptidse- quenz Ala-Ala-Pro-Val querzuvernet zen . ΙΟΟμΙ dieser Suspension wurden in einer Mikrotiterplatte mit 50μΙι einer PEG modifizierten Laccase vermischt. Nach Aushärten wird das Polymer mit Puffer gewaschen und ΙΟΟμΙ einer ElastaseLösung (2-5 U/mL) oder mit Wundsekret aufgetragen. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C. Alle 10 Minuten wurden 25μ1 des Überstandes entnommen. Laccaseaktivi- tät wurde mittels des ABTS Assays nachgewiesen (1400μΙ1. Saccharose Puffer + 5μ1. 1% H202 + 30μί ABTS 40mM) : 25μ1 Überstand + 75μΙ, ABTS-Lösung) . Eine Grünfärbung trat nach einigen Minuten Inkubation mit Elastase durch Umsetzung von ABTS durch die freigesetze Laccase auf. Ohne Elastase wurde keine Farbänderung festgestellt.

Claims

Patentansprüche :
1. Anordnung umfassend einen festen Träger und eine an dem fes¬ ten Träger angeordnete Matrix umfassend mindestens ein enzyma¬ tisch umsetzbares oder modifizierbares Molekül, welche Matrix mindestens ein durch Umsetzung oder Modifikation des Moleküls freisetzbares Enzym umfasst, das in der Lage ist zumindest ein in der Matrix und/oder am festen Träger befindliches farbändern- des Substrat umzusetzen.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix als Schicht, in Form von Kapseln oder als Hydrogel auf den festen Träger angeordnet ist.
3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das enzymatisch umsetzbare oder modifizierbare Molekül ein Polymer ist.
4. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polysaccharid, Polypeptid, Polyester, Polyamid oder eine Kombination davon ist.
5. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pektin, Amylose, Amylopektin, Agarose, Alginat, Carraghenän, Chitin, Chitosan, Dextran, Glycogen, Guar, Johannisbrotkernmehl , Laevan, Pektin, Pollulan, Tamarindenkernmehl , Xanthan und Xylan.
6. Anordnung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe beste¬ hend aus Gummiarabicum, Agar, Agarose, Maltodextrine, Alginsäure und deren Salze, insbesondere Natriumalginat oder Calciumalgi- nat, Liposome, Fette, Cetylalkohol , Collagen, Chitosan, Pep- tidoglycan, Leithine, Gelatine, Albumin, Schellack, Polysaccari- de, insbesondere. Stärke oder Dextran, Cyclodextrine , Pektin, Carragenan und Wachse.
7. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Matrix zusätzlich durch Umsetzung oder Modifikation des Moleküls freisetzbares Enzym umfasst, das in der Lage ist das in der Matrix befindliche Molekül ebenfalls umzusetzen oder zu modifzieren.
8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen der Hydrolasen und Oxidoreduktasen, wie Proteasen, Laccasen oder Peroxidasen .
9. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das durch die Umsetzung oder Modifikation des Moleküls freisetzbare Enzyme an Polyvinylalkohol, Polyethylengly- kol (PEG), Polypeptide, insbesondere Elastin, oder Peptide gebunden ist.
10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das freisetzbare Enzym, welches mittels eines Polypeptids oder Peptids am enzymatisch umsetzbaren oder modifizierbaren Molekül gebunden ist, durch ein Enzym, vorzugsweise einem mikrobiellen Enzym oder einem Enzym des Immunsystems, wie Elastase, freisetzbar ist.
11. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das farberzeugende Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus phenolischen Verbindungen und Azo- Farbstoffen.
12. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das farberzeugende Substrat direkt von Enzymen, vorzugsweise mikrobiellen Enzymen, wie Laccasen oder Peroxidasen oder Enzymen des Immunsystems, wie Myeloperoxidase , umsetzbar ist.
13. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung eine dem festen Träger gegenüberliegende semipermeable Membran aufweist.
14. Anordnung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die semipermeable Membran ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulosederivate , Polyamide, Polyacrylamide und Polyester.
15. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn- zeichnet, dass der feste Träger ein Material umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anorganischen Materialien, vorzugsweise Silicagel, Aluminium, Silizium oder Glas, organischen Materialien, vorzugsweise Polyester, Polystyrol, Polyamid, Polyacrylamid oder Polyvinylalkohol , oder Biopolymeren, vorzugsweise Papier.
16. Anordnung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer, das Enzym und das farbändernde Substrat aus gewählt sind aus Tabelle A.
17. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Charakterisierung von Zellen, vorzugsweise von Mikroorganismen, in einer Probe.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmenden und/oder charakterisierenden Mikroorganismen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien und Pilzen .
19. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Detektion mindestens eines Enzyms in einer Probe.
20. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Detektion einer Wundinfektion durch Bestimmen des Vorhandenseins mindestens eines wund-spezifischen Enzyms.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe der Hydrolasen bestehend aus Amylase, Cellulase, Xylanase, Mannanase, Protease, Lysozym, Elastase, Collagenase, Cathepsin, Myelo- peroxidase, Lipase und Esterase.
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