WO2011105344A1 - カダベリンの製造方法 - Google Patents

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WO2011105344A1
WO2011105344A1 PCT/JP2011/053764 JP2011053764W WO2011105344A1 WO 2011105344 A1 WO2011105344 A1 WO 2011105344A1 JP 2011053764 W JP2011053764 W JP 2011053764W WO 2011105344 A1 WO2011105344 A1 WO 2011105344A1
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lysine
gene
cadaverine
lysine decarboxylase
microorganism
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耳塚　孝
和美 須田
澤井　秀樹
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Toray Industries Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cadaverine.
  • the present invention relates to a method for efficiently producing cadaverine by secreting and producing lysine decarboxylase with a microorganism.
  • Polyamide (PA) is an important polymer group used as a raw material for a series of special plastics used in the automobile industry, sports industry, and lifestyle industry
  • diamine is an important raw material monomer component of this polyamide.
  • Diamines are condensed with dicarboxylic acids to form various polymers. At this time, the polymer properties are determined by the chain length of the diamine and dicarboxylic acid.
  • Non-patent Document 1 diamines are chemically produced from petroleum-derived materials via an intermediate stage of dicarboxylic acid, or produced by chemical decarboxylation of amino acids.
  • Non-patent Document 1 it is desirable to quickly switch to synthesis of diamines from renewable resources by biotechnology methods such as enzymatic reactions and microbial cultures.
  • cadaverine is attracting attention as a diamine that can be produced by a biotechnology method.
  • Cadaverine is another name, 1,5-pentanediamine, which is a compound that can be a raw material monomer for polyamide.
  • Cadaverine is a biogenic amine that exists universally in the living body, and its biosynthetic system is being elucidated (see Non-Patent Document 2).
  • cadaverine is released from lysine.
  • Lysine decarboxylase (LDC) that catalyzes the carbonation reaction is known.
  • LDC Lysine decarboxylase
  • an LDC gene an LDC gene derived from Escherichia coli is known (see Non-Patent Document 3).
  • a method for producing cadaverine by biotechnology methods are roughly divided into a method for producing cadaverine by microbial culture, and a method for producing cadaverine by microbial culture based on the introduction of LDC gene into microorganisms.
  • a method for producing cadaverine by culturing microorganisms a production method by culturing recombinant Escherichia coli (see Patent Document 1), a method of further increasing lysine production ability in coryneform bacteria of lysine-producing microorganisms (see Patent Document 2), A method for blocking a cadaverine degradation system (see Patent Document 3) and a method for blocking a lysine transporter (Patent Document 4) are known.
  • Non-Patent Document 4 When lysine is produced as a byproduct, the yield of cadaverine is not improved despite the fact that the precursor has been produced, and high purity of cadaverine is important in order to use cadaverine as a polyamide raw material. When lysine is produced as a by-product, the load on the purification of cadaverine increases, which is an economic problem.
  • JP 2002-223770 A JP 2004-2222569 A Special table 2009-531042 gazette WO2008 / 092720
  • An object of the present invention is to provide a method for preventing lysine, which is a cadaverine precursor, from remaining in a microorganism culture solution at the end of microorganism culture in a method for producing cadaverine by microorganism culture.
  • the present inventors have cultivated microorganisms that secrete lysine decarboxylase outside the cell, thereby lysine at the end of microbial culture.
  • the present invention includes the following (1) to (6).
  • a method for producing cadaverine comprising culturing a microorganism that secretes lysine decarboxylase outside the cell.
  • microorganism secretes lysine decarboxylase outside the cell by expressing in the cell a protein having a secretory signal peptide added to the N-terminal side of the amino acid sequence of lysine decarboxylase.
  • the microorganism comprises, in the 5 ′ to 3 ′ direction of the nucleic acid sequence, a promoter sequence that functions in the microorganism, a nucleic acid sequence that encodes a secretory signal peptide, and a nucleic acid sequence that encodes lysine decarboxylase
  • lysine in the method for producing cadaverine by microbial culture, lysine does not remain in the culture solution at the end of the microbial culture, so that the yield of cadaverine to sugar is improved as compared to the conventional production method. As a result, it is possible to reduce the load in the purification process when cadaverine is purified.
  • the method of the present invention is a method for producing cadaverine by culturing a microorganism that secretes lysine decarboxylase outside the cell.
  • “secreted” lysine decarboxylase outside the cell means that lysine decarboxylase is transferred outside the microorganism (extracellular), and finally lysine decarboxylase is This is when the medium or culture medium is completely freed.
  • lysine decarboxylase is bound to the surface of the microorganism, it is not included in the secretion.
  • lysine decarboxylase can be secreted extracellularly by a method in which a protein having a secretory signal peptide added to the N-terminal side of the amino acid sequence of lysine decarboxylase is expressed in the cell.
  • the lysine decarboxylase used in the present invention is not particularly limited, but is preferably L-lysine decarboxylase.
  • the origin of lysine decarboxylase is not particularly limited.
  • the secretory signal peptide was originally found as a signal peptide sequence that functions to secrete a secretory protein outside the cell.
  • Secreted proteins are generally translated as prepeptides or prepropeptides, and then become mature proteins.
  • proteases generally signal
  • the secretory signal peptide ("pre-part") is cleaved by peptidase) and converted into a mature peptide or propeptide, which is further cleaved into a mature peptide by protease and then secreted extracellularly
  • the secretory signal peptide not only secretes the secretory protein outside the cell, but also has a function of secreting the nonsecretory protein outside the cell by fusing the nonsecretory protein and the secretory signal peptide.
  • lysine decarboxylase can be efficiently secreted extracellularly by fusing a secretory signal peptide and
  • the secretory signal peptide used in the present invention may be derived from a different microorganism or may be a secretory signal peptide of the microorganism to be used, but is preferably derived from a secretory protein of the microorganism to be used. Furthermore, the secretory signal peptide that can be used for the purpose of the present invention may partially contain the N-terminal amino acid sequence of the natural mature protein from which it is derived. Specific examples of the secretory signal peptide include TorA (trimethylamine N-oxidoreductase) derived from E.
  • TorA trimethylamine N-oxidoreductase
  • coli SufI (suppressor of ftsI; ftsI suppressor), PhoD (phosphoesterase) from Lipid (Bacillus Subtilis), LipA (lipase)
  • Secretory signal peptides such as isomaltoxtranase (IMD) derived from Arthrobacter globiformis (see SEQ ID NOs: 13 to 17, respectively), and secretory signal peptides disclosed in Japanese Patent No. 3711658 (see SEQ ID NO: 18) ), Microbiology (2009), 155, p.
  • the lysine decarboxylase and secretory signal peptide also include proteins in which one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions are included in each amino acid sequence as long as they have their functions.
  • “several” is usually 1 to 7, preferably 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 2.
  • the lysine decarboxylase and secretory signal peptide have an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, as long as it has the function. It may be a protein having
  • amino acid sequence substitution, deletion, insertion or addition as described above is preferably a conservative substitution.
  • Amino acids that replace the original amino acid and are considered conservative substitutions include Ala to Ser or Thr, Arg to Gln, His or Lys, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp Substitution, Asp to Asn, Glu or Gln substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, Ile to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe Substitution, Lys to Asn, Glu, Gln, His or rg, Met to Ile, Leu, Val or Phe, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala, Thr to Ser
  • the nucleic acid sequence may be expressed in the microorganism in the 5 ′ to 3 ′ direction. And a nucleic acid sequence encoding a secretory signal peptide and a nucleic acid sequence encoding lysine decarboxylase.
  • the promoter sequence used in the present invention is not particularly limited and can be generally used as long as it is a promoter sequence that can function in the microorganism to be used, and may be a heterologous promoter.
  • Amino acid biosynthesis systems such as glutamate biosynthesis system glutamate dehydrogenase gene, glutamine synthesis glutamine synthase gene, lysine biosynthesis system aspartokinase gene, threonine biosynthesis homoserine dehydrogenase gene, isoleucine and valine Biosynthetic acetohydroxy acid synthase gene, leucine biosynthetic 2-isopropylmalate synthase gene, proline and arginine biosynthetic glutamate kinase gene, histidine biosynthetic phosphoribosyl-ATP pyrophosphorylase gene Aromatic amino acid biosynthetic systems such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine Deoxyarabinohe
  • the nucleic acid sequence encoding the secretory signal peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it is a nucleic acid sequence capable of translating the secretory signal peptide, and a codon (standard genetic code) of the amino acid sequence of the secretory signal peptide is used. It can be determined for reference (see Horton Biochemistry, 3rd edition, Tokyo Chemical Dojin, p.526), and at that time, the nucleic acid sequence may be redesigned with codons often used for the microorganisms used in the present invention. .
  • TorA trimethylamine N-oxidoreductase derived from Escherichia coli, SufI (suppressor of ftsI; ftsI suppressor), BaDlus subtilis-derived PhoD (phosphoesterase), LipA (lipase), ⁇ Nucleic acid sequences encoding secretory signal peptides such as isomaltoxtranase (IMD) derived from Arthrobacter globiformis (see SEQ ID NOs: 44 to 48, respectively), nucleic acids encoding secretory signal peptides described in Japanese Patent No. 3711658 Sequence (see SEQ ID NO: 49), Microbiology (2009), 155, p.
  • IMD isomaltoxtranase
  • nucleic acid sequence encoding the secretory signal peptide see SEQ ID NO: 69
  • Applied and Environmental Microbiology (2003), 69 (1), p. 358-366
  • nucleic acid sequence encoding the secretory signal peptide see SEQ ID NO: 70
  • Trends in Microbiology (2005), 13 (4), p.
  • a nucleic acid sequence encoding the secretory signal peptide at 175-180 see SEQ ID NOs: 71-74.
  • nucleic acid sequence encoding lysine decarboxylase used in the present invention include nucleic acid sequences encoding the above-mentioned lysine decarboxylase derived from organisms, depending on the codon usage of the microorganism used.
  • the nucleic acid sequence may be redesigned.
  • nucleic acid sequence which codes the above-mentioned biological origin lysine decarboxylase is registered into the database (GenBank).
  • the nucleic acid sequence encoding the secretory signal peptide and the nucleic acid sequence encoding lysine decarboxylase have their functions, substitution or deletion of one or several bases in each nucleic acid sequence. Also included are inserted or added nucleic acid sequences. Here, “several” is usually 1 to 40, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, particularly preferably 1 to 10, and most preferably about 1 to 5. .
  • the nucleic acid sequence encoding the promoter sequence, the secretory signal peptide, and the nucleic acid sequence encoding lysine decarboxylase are not limited to the nucleic acid sequence or its complementary strand, or a part thereof, as long as it has the function.
  • nucleic acid sequences that hybridize under gentle conditions examples include nucleic acid sequences that hybridize under gentle conditions.
  • the “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” means, for example, any one of the continuous sequences of at least 20, preferably 25, more preferably at least 30 of the original base sequence.
  • a known hybridization technique (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al., (1987) Publisher. John Wily & Sons Section 6.3-6.4), etc.
  • stringent conditions include, for example, a hybridization temperature of 37 ° C. in the presence of 50% formamide, 42 ° C. as a more severe condition, and 65 ° C.
  • the sequence identity is usually 85% or more, preferably 90% or more. Further, it may be a nucleic acid sequence having a sequence identity of 95% or more.
  • Such a promoter sequence, a nucleic acid sequence encoding a secretory signal peptide, and a nucleic acid sequence encoding lysine decarboxylase can be obtained from a host other than the original host, and a nucleic acid sequence obtained from the original host can be obtained by those skilled in the art. Can be obtained by well-known in vitro mutation treatment or site-specific mutation treatment.
  • the gene construct used in the present invention includes the promoter sequence, a nucleic acid sequence encoding a secretory signal peptide, and a nucleic acid sequence encoding lysine decarboxylase, and expresses a lysine decarboxylase gene in cells of a microorganism.
  • Necessary control sequences (operators, terminators, etc.) may be placed in appropriate positions so that they can function.
  • the vector that can be used for this construct is not particularly limited as long as it can function in microorganisms, and even if it can autonomously grow outside the chromosome like a plasmid, it can be integrated into a bacterial chromosome. Good. Artificial transposons can also be used.
  • the target gene is introduced into the chromosome by homologous recombination or its own ability to transfer.
  • the construction of the gene construct and the confirmation method thereof are performed by molecular biological techniques well known to those skilled in the art. For example, Sambrook et al. , Molecular Clonig: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Arp., DNACloning: Apollo. M.M. Ausubel et al. (Eds), Current Protocols in Molecular Biology (1994) John Wiley & Sons, Inc. , PCR Technology: Principles and Application for DNA Application, H. Erlich, ed. , Stockton Press, etc. can be referred to.
  • the method for introducing the gene construct into the microorganism is not particularly limited.
  • the protoplast method (Gene, (1985), 39, p. 281-286), the electroporation method (Bio / Technology, (1989), 7, 1067-1070) and the like.
  • the microorganism that secretes lysine decarboxylase outside the cell in the present invention is preferably a microorganism into which the above gene construct can be introduced by genetic recombination.
  • Specific examples include Escherichia coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis, mold, yeast, coryne Among them, E. coli or coryneform bacteria, which are known to efficiently produce lysine, which is a precursor of cadaverine, are more preferable.
  • Escherichia coli As specific examples of Escherichia coli, MC1061 strain, HB101 strain, JM105 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, JE5505 strain and the like can be used.
  • the coryneform bacterium is an aerobic Gram-positive gonococcus and has been conventionally classified into the genus Brevibacterium, but now includes bacteria integrated into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst., Bacteriol., (1981) 41, p.225). In addition, it includes Brevibacterium bacteria that are very closely related to the genus Corynebacterium. Examples of such coryneform bacteria include Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium colactorium, Corynebacterium.
  • Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophyllum, Brevibacterium lactofermentum (Brevacterium lacto) ermentum), Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogeniteria nemmium, Corynebacterium nebium. -Album (Brevacterium album), Brevibacterium cerinum (Brevacterium cerinum), Microbacterium ammoniaphilum (Microbacterium ammoniaphilum).
  • each coryneform bacterium includes Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511, Corynebacterium carnae ATCC 15991, Corynebacterium Umm Glutamicum ATCC13020, ATCC13020, ATCC13060, Corynebacterium lilium ATCC15990, Corynebacterium melacecola ATCC17965, Corynebacterium efficiens AJ12340 (Deposit number: FERM BP-1539), Corynebacterium herculis brevis ATCC13838 Divali Katam ATCC1 020, Brevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (deposit number: FERM BP-2205), Brevibacterium inmariophyllum ATCC14068, Brevibacterium lactoferment
  • coryneform bacteria can be sold, for example, from the American Type Culture Collection. That is, the registration number corresponding to each strain is given, and this registration number is described in the catalog of the American Type Culture Collection, and the distribution of each strain can be received with reference to this number.
  • Corynebacterium glutamicum is preferably used among the aforementioned coryneform bacteria.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum AJ12036 (Deposit number: FERM BP-734) isolated as a streptomycin-resistant mutant of ATCC 13869 (Deposited on FERM BP-734, March 26, 1984, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Compared to its parent strain (wild strain), the Patent Organism Depositary Center) is predicted to have mutations in functional genes involved in protein secretion, and the production capacity for secretion of heterologous proteins is approximately the amount accumulated under optimal culture conditions. Since it is as high as 2 to 3 times, it is suitable as a coryneform bacterium that secretes lysine decarboxylase (see WO02 / 081694).
  • the microorganism As a method for confirming that a microorganism that secretes lysine decarboxylase outside the cell secretes lysine decarboxylase outside the cell, the microorganism was cultured and centrifuged to obtain a culture supernatant and a microorganism. What is necessary is just to confirm the presence or absence by measuring the lysine decarboxylase activity in a culture supernatant.
  • the amount of lysine decarboxylase outside the cell can be quantified by a quantification method using an antigen-antibody reaction such as Western blotting or ELISA.
  • Cultivation of microorganisms that secrete lysine decarboxylase outside the cell can produce and accumulate cadaverine in the culture solution.
  • batch culture fed-batch culture or continuous culture
  • continuous culture it is preferable to perform continuous culture as described in, for example, JP-A-2008-104453.
  • a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like can be used.
  • the carbon source for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose and starch hydrolysate, alcohols such as ethanol, and organic acids such as acetic acid, lactic acid and succinic acid can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate and other inorganic and organic ammonium salts, urea, other nitrogen-containing compounds, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean hydrolysate Nitrogen-containing organic substances such as can be used.
  • potassium monohydrogen phosphate potassium dihydrogen phosphate
  • ammonium sulfate sodium chloride
  • magnesium sulfate calcium carbonate and the like
  • trace nutrient sources such as biotin, thiamine, and vitamin B6 can be added as necessary.
  • micronutrient sources can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
  • lysine in advance, addition of lysine to the culture medium in advance is also a preferred embodiment. If lysine is added to the culture medium in advance, lysine decarboxylase secreted extracellularly in the culture medium is converted into cadaverine using lysine previously added as a substrate. Can be increased.
  • the lysine concentration in the culture medium when lysine is added to the culture medium in advance is not particularly limited, but is preferably a concentration that does not adversely affect the growth of microorganisms and does not inhibit lysine decarboxylase. Is preferably from 0.01 to 2M.
  • the lysine to be added is preferably L-lysine.
  • the lysine to be added may be a free form or a lysine salt, but the lysine salt is preferably a lysine hydrochloride or a lysine / dicarboxylate derived from a dicarboxylic acid described later.
  • lysine / dicarboxylate examples include lysine / adipate, lysine / sebacate, lysine / 1,12-dodecanedicarboxylate, lysine / succinate, lysine / isophthalate, lysine -Although terephthalate is mentioned, a lysine adipate is mentioned as a more preferable specific example.
  • the culture conditions are not particularly limited, and are performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is generally 25 ° C to 42 ° C, preferably 28 ° C to 38 ° C.
  • the culture time is usually 1 day to 6 days.
  • ammonia, hydrochloric acid or dicarboxylic acid is preferably used, and dicarboxylic acid is more preferably used.
  • the culture pH is controlled to 5 to 8, preferably pH 6.5 to 7.5, using these neutralizing agents.
  • limiting in the state of a neutralizing agent It uses by gas, a liquid, solid, or aqueous solution. Particularly preferred is an aqueous solution.
  • the dicarboxylic acid preferably used as a neutralizing agent is a dicarboxylic acid which does not have a functional group substantially other than the said two carboxyl groups.
  • the functional group here means an amino group, a carboxyl group, or the like in a polyamide polymerization reaction (reaction conditions are, for example, a reaction temperature of 250 to 270 ° C., a pressure of 10 to 20 kg / cm 2 and a reaction time of 1 to 5 hours). It is a reactive group that reacts to cause branching of the polymer or lowers the crystallinity of the polymer (crystallinity of 80% or less). For example, amino groups and carboxyl groups fall under this group.
  • the dicarboxylic acid is more preferably a dicarboxylic acid represented by the following general formula (1), (2) or (3).
  • the dicarboxylic acid is more preferably adipic acid, sebacic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid, succinic acid, isophthalic acid, or terephthalic acid.
  • Cadaverine in the culture medium exists as free cadaverine or cadaverine salt.
  • a method for collecting cadaverine in the culture solution first, microorganisms are removed from the culture solution.
  • a separation method it is preferable to use a conventionally known method such as precipitation removal, centrifugation, or membrane filtration separation of microorganisms.
  • cadaverine dicarboxylate As a method of collecting cadaverine from a culture solution containing cadaverine from which microorganisms have been removed, it can be collected by crystallization as cadaverine dicarboxylate as described in JP-A-2009-207495. Further, as described in JP-A-2009-29872, a free form of cadaverine can be purified and collected using an NF membrane. Further, as described in JP-A-2009-28045, a free form of cadaverine can be collected by extraction with a polar organic solvent and distillation.
  • Reference Example 1 (Preparation of Corynebacterium glutamicum capable of producing lysine)
  • a precursor of cadaverine a lysine-producing bacterium was prepared by introducing an effective mutation into aspartokinase.
  • Appl. Microbiol. Biotechnol. (2002), 58, p.
  • Corynebacterium glutamicum AK-1 strain (hereinafter abbreviated as AK-1 strain) strain was prepared by the method described in 217-223. Aspartokinase of this strain is desensitized to feedback inhibition by lysine and threonine. Therefore, lysine can be synthesized by culture.
  • coryneform bacteria (Examples 1 and 2) that secrete lysine decarboxylase outside the cells by genetic recombination of the AK-1 strain, and coryneform bacteria that do not secrete lysine decarboxylase outside the cells (Examples 1 and 2). Comparative Example 1) was prepared.
  • Example 1 (Preparation of Corynebacterium glutamicum that secretes lysine decarboxylase extracellularly) (Part 1: Use of Tat pathway) (1) Cloning of HOM gene A homoserine dehydrogenase was selected as a locus for introducing a lysine decarboxylase gene. The gene corresponding to the 300 amino acid region from the N-terminal of the HOM gene was cloned. Oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) were synthesized with reference to the base sequence of the HOM gene (Accession No. BA00000036) registered in the database (GenBank).
  • PCR method 30 cycles of polymerase chaining using a BioRad thermal cycler under conditions of DNA denaturation at 94 ° C for 30 seconds, primer annealing at 55 ° C for 30 seconds, DNA primer extension at 72 ° C for 3 minutes
  • the reaction was carried out (hereinafter abbreviated as PCR method).
  • the PCR method in this example was performed under these conditions unless otherwise specified.
  • the product obtained by this PCR method was electrophoresed with 1% agarose, and a DNA fragment of about 0.9 kb containing the HOM gene was excised from the gel and purified by Gene Clean Kit (manufactured by BIO101).
  • LDC secretion expression cassette As a promoter for constitutive expression of LDC in Corynebacterium glutamicum, a kanamycin resistance gene promoter is selected, and SufI of Escherichia coli that secretes via the Tat pathway is selected as a secretion signal. Then, E. coli cadA was selected as the LDC gene.
  • Oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) were synthesized with reference to the base sequence of pHSG299 (Accession No. M19415) registered in the database (GenBank).
  • a product obtained by PCR using plasmid pHSG299 as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 3) and (SEQ ID NO: 4) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the promoter region of the kanamycin resistance gene was determined.
  • the 0.3 kb DNA fragment was excised from the gel and purified with the Gene Clean Kit.
  • This fragment was ligated with a ligation kit ver. 2 into a gap in which T base was added to the 3 'end of the EcoRV cleavage site of plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen).
  • a plasmid that became a single fragment of 3.2 kb when digested with the restriction enzymes HindIII and SacII was named pKMP1.
  • oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6) was synthesized with reference to the base sequence of the LDC gene (Accession No. M76411) registered in the database (GenBank).
  • a product obtained by PCR using a genomic DNA solution prepared from E. coli (Escherichia coli ATCC 10798) according to a conventional method as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NOs: 5 and 6) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • a 2.1 kb DNA fragment containing the LDC gene was excised from the gel and purified with the Gene Clean Kit.
  • This fragment was ligated into ligation kit ver. 4 in the gap where T base was added to the 3 'end of the EcoRV cleavage site of plasmid vector pT7blue.
  • a plasmid that became a single fragment of 4.0 kb when digested with HindIII and NcoI was named pCADA.
  • an oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 7) was synthesized in which the base sequence corresponding to the amino acid sequence of SufI of Escherichia coli and the LCD gene were fused.
  • the oligonucleotide primer 3 'side is designed to overlap with the 5' side of the LDC gene.
  • a product obtained by PCR using pCADA as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NOs: 7 and 6) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 2.2 kb DNA fragment containing the LDC gene was excised from the gel. -Purified with a clean kit (LDC gene fragment 1).
  • an oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 8) was synthesized in which a nucleotide sequence corresponding to the SufI amino acid sequence of Escherichia coli and a kanamycin resistance gene promoter were fused as a secretion signal.
  • the oligonucleotide primer 5 'side is designed to overlap with the 3' side of the kanamycin resistance gene promoter.
  • a product obtained by PCR using pKMP1 as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 0.4 kb DNA fragment containing the LDC gene was extracted from the gel. It was purified by excision gene clean kit (kanamycin resistance gene promoter fragment 1).
  • an oligonucleotide primer for designing the restriction enzyme BamHI sequence and an oligonucleotide for designing the restriction enzyme SphI sequence
  • the product obtained by the PCR method using the primer (SEQ ID NO: 10) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 2.6 kb DNA fragment containing the LDC secretion expression cassette was excised from the gel and purified by Gene Clean Kit. did.
  • This fragment was digested with the restriction enzymes BamHI and SphI, and the resulting 2.6 kb BamHI-SphI fragment was ligated to the BamHI / SphI gap of pHOM1, previously digested with BamHI and SphI. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted, and the resulting plasmid was named pTM65.
  • pTM65 was transformed into the AK-1 strain by electroporation [FEMS Microbiology Letters, 65, p. 299 (1989)] and containing kanamycin (25 ⁇ g / ml) LB (tryptone (10 g / l) (Bacto), yeast extract (5 g / l) (Bacto), sodium chloride (10 g / l) )) Selected on agar medium.
  • a genomic DNA solution was prepared from the thus selected transformant according to a conventional method.
  • PCR was performed using an oligonucleotide (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 6) as a primer set, and the resulting product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel. A single band of 3.5 kb was observed. From this, it was confirmed that the selected transformant had the LDC gene inserted into the HOM locus.
  • This transformant was named Corynebacterium glutamicum AK-1 / pTM65 (abbreviated as AK-1 / pTM65 strain).
  • Example 2 (Preparation of Corynebacterium glutamicum that secretes lysine decarboxylase extracellularly) (Part 1: Use of Sec pathway) (1) Preparation of LDC secretion expression cassette Next, a promoter of a kanamycin resistance gene is selected as a promoter for constitutive expression of LDC in Corynebacterium glutamicum, and a subtilisin that is secreted by the Sec pathway is used as a secretion signal. The signal arpE was selected, and E. coli cadA was selected as the LDC gene.
  • an oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 11) in which the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of arpE and the LCD gene were fused was synthesized as a secretion signal.
  • the oligonucleotide primer 3 'side is designed to overlap with the 5' side of the LDC gene.
  • a product obtained by PCR using pCADA as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 2.2 kb DNA fragment containing the LDC gene was extracted from the gel. It was purified by excision gene clean kit (LDC gene fragment 2).
  • an oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 12) was synthesized in which a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of arpE and a kanamycin resistance gene promoter were fused as a secretion signal.
  • the oligonucleotide primer 5 'side is designed to overlap with the 3' side of the kanamycin resistance gene promoter.
  • a product obtained by PCR using pKMP1 as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 0.4 kb DNA fragment containing the LDC gene was extracted from the gel. It was purified by excision gene clean kit (kanamycin resistance gene promoter fragment 2).
  • PCR was performed using this genomic DNA as a template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6) as primer sets, and the resulting product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel. A single band was observed. From this, it was confirmed that the selected transformant had the LDC gene inserted into the HOM locus.
  • This transformant was named Corynebacterium glutamicum AK-1 / pTM66 (abbreviated as AK-1 / pTM66 strain).
  • Comparative Example 1 (Preparation of Corynebacterium glutamicum that does not secrete lysine decarboxylase outside the cell)
  • pKMP1 was digested with HindIII and NcoI, the product was subjected to 1.2% agarose gel electrophoresis, and a 0.3 kb DNA fragment containing the promoter region of the kanamycin resistance gene was excised from the gel and purified by Gene Clean Kit.
  • the HindIII-NcoI fragment thus obtained was ligated to the HindIII / NcoI gap of pCADA previously digested with HindIII and NcoI.
  • the resulting plasmid was named pTM100.
  • pTM100 was digested with SacII, the product was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, and a 2.4 kb DNA fragment containing the LDC expression cassette was excised from the gel and purified by Gene Clean Kit.
  • the SacII fragment thus obtained was ligated to the SacII gap of pHOM1 previously digested with SacII.
  • the resulting plasmid was named pTM101.
  • the plasmid pTM101 was transferred to the AK-1 strain by electroporation [FEMS Microbiology Letters, 65, p. 299 (1989)] and containing kanamycin (25 ⁇ g / ml) LB (tryptone (10 g / l) (Bacto), yeast extract (5 g / l) (Bacto), sodium chloride (10 g / l) )) Selected on agar medium.
  • a genomic DNA solution was prepared from the thus selected transformant according to a conventional method. Using this genomic DNA as a template, PCR was performed using an oligonucleotide (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) as a primer set, and the resulting product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel. A single band of 2.1 kb was observed. From this, it was confirmed that the selected transformant had the LDC gene inserted into the HOM locus. This transformant was named Corynebacterium glutamicum AK-1 / pTM101 (hereinafter abbreviated as AK-1 / pTM101 strain).
  • Example 3 (Confirmation of secretion of lysine decarboxylase activity extracellularly) After culturing AK-1 / pTM65 strain, AK-1 / pTM66 strain and AK-1 / pTM101 strain in BY medium (see J. Bacteriol., 159, p. 306-311 (1984)), centrifugation was performed. Divided into microorganism and culture supernatant. Microorganisms were crushed according to a conventional method, and a microbial disruption solution was prepared. The lysine decarboxylase activity in the culture supernatant and microbial disruption solution thus obtained was measured (see Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, p. 2130-2135, (2007)). Enzyme activity is 1 U when L-lysine is converted to cadaverine at 1 nmol per minute, and the results are shown in Table 1 as specific activity per protein weight.
  • the AK-1 / pTM65 and AK-1 / pTM66 strains have lysine decarboxylase activity in the extracellular culture supernatant, confirming that lysine decarboxylase is secreted outside the cells. It was. In addition, it was confirmed that all the strains had lysine decarboxylase activity in the microbial disruption solution.
  • Examples 4 and 5 and Comparative Examples 2 and 3 microorganism culture: when the microorganism is a coryneform bacterium) AK-1 / pTM65 strain (Example 4), AK-1 / pTM66 strain (Example 5), AK-1 / pTM101 strain (Comparative Example 2) and AK-1 / pTM101 strain + 20 mg purified lysine decarboxylase (special (Comparative Example 3) was cultured, and the productivity of cadaverine was compared.
  • One platinum ear of each strain was inoculated into 5 ml of sterilized BY medium, and cultured at 30 ° C. for 24 hours in advance.
  • This pre-culture liquid was inoculated in a total volume of 50 ml of the same medium as the pre-culture, and cultured for 24 hours at 30 ° C. with an amplitude of 30 cm and 120 rpm for pre-culture.
  • 950 ml of the MMP medium (culture medium) shown in Table 2 was inoculated with the entire amount of the preculture, and sterilized air was vented at 0.07 vvm while stirring at 30 ° C., a stirring blade speed of 800 rpm, and a pH of 6.7.
  • Culturing was carried out for 50 hours while adjusting the temperature.
  • a neutralizing agent sulfuric acid aqueous solution (3M) and aqueous ammonia (3M) were used.
  • 3M sulfuric acid aqueous solution
  • 3M aqueous ammonia
  • 20 mg of purified lysine decarboxylase was added at the start of culture.
  • a synthetic oligonucleotide designed with a part of the target gene on the 5 ′ side of the synthetic oligonucleotide and a part of the antibiotic resistance gene on the 3 ′ side is used as a primer.
  • a gene disruption strain can be constructed in one step.
  • the antibiotic resistance gene incorporated in the gene-disrupted strain can be removed by yeast-derived FLP recombinase.
  • Plasmid pKD3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645) was used as a PCR template.
  • pKD3 is a plasmid in which FRT (FLP recombinase recognition target) which is a recognition sequence of FLP-recombinase and cat gene which is an antibiotic resistance gene are inserted into pMW118 (manufactured by Takara Bio Inc.) in the order of FRT-cat-FRT. Has been inserted.
  • the FRT is shown in SEQ ID NO: 75.
  • sequences corresponding to both ends of this FRT are shown in SEQ ID NOS: 76 and 77 having 50 bases adjacent to the open reading frame (ORF) of the cadA gene, which is a gene to be deleted, at the 5 ′ end of the primer.
  • ORF open reading frame
  • Plasmid pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645) is a gene encoding the Red recombinase of the ⁇ Red homologous recombination system controlled by the arabinose-inducible ParaB promoter.
  • a DNA fragment (GenBank / EMBL accession number J02459, 31088 to 33241) of ⁇ phage including ( ⁇ , ⁇ , e ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ x o genes).
  • a competent cell for electroporation was prepared as follows. That is, E. coli W3110 strain cultured overnight at 30 ° C. in LB medium containing ampicillin was diluted 100 times with SOB medium containing ampicillin and L-arabinose. The resulting dilution was grown with aeration at 30 ° C. until the OD600 was about 0.6, and then washed 3 times with 10% glycerol so that it could be used for electroporation.
  • the cell after electroporation was added with 1 mL of SOC medium and cultured at 37 ° C. for 2.5 hours, then plated on LB agar medium containing chloramphenicol at 37 ° C., and chloramphenicol resistant recombination Selected body.
  • SOC medium 1 mL
  • LB agar medium containing chloramphenicol 1 mL
  • chloramphenicol resistant recombination Selected body was added with 1 mL of SOC medium and cultured at 37 ° C. for 2.5 hours, then plated on LB agar medium containing chloramphenicol at 37 ° C., and chloramphenicol resistant recombination Selected body.
  • pKD46 plasmid was subcultured twice at 42 ° C. on LB agar medium containing chloramphenicol, and the resulting colony was tested for ampicillin resistance. Acquired shares.
  • the deletion of the mutant cadA gene that could be identified by the chloramphenicol resistance gene was confirmed by PCR.
  • the obtained cadA-deficient strain was named W3110 cadA :: FRT-cat-FRT strain.
  • helper plasmid pCP20 was used to remove the FRT-cat-FRT gene introduced into the cadA gene.
  • pCP20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645
  • pCP20 is a plasmid carrying a yeast FLP recombinase and having a temperature-sensitive replication ability.
  • Competent cells of the W3110 cadA were prepared according to a conventional method, transformed with the helper plasmid pCP20, and placed on an LB agar medium containing 50 mg / L ampicillin at 30 ° C. And an ampicillin resistant strain was selected. Next, in order to remove pCP20, the cells were passaged twice at 42 ° C. on an LB agar medium, and the resulting colonies were tested for ampicillin resistance and chloramphenicol resistance. The cat gene and pCP20 were lost. Acquired chloramphenicol and ampicillin sensitive strains. This strain was named W3110 ⁇ cadA.
  • Examples 6 and 7 and Comparative Example 4 Production of Escherichia coli secreting lysine decarboxylase extracellularly (using Sec pathway and Tat pathway) and production of Escherichia coli not secreting extracellular
  • the W3110 ⁇ LDC strain was transformed with plasmids pTM101, pTM65 and pTM66 by a conventional method.
  • Those genetically engineered E. coli strains W3110 ⁇ LDC / pTM101 strain that is not secreted extracellularly
  • Comparative Example 4 W3110 ⁇ LDC / pTM65 strain (extracellular secretory strain: using Tat pathway)
  • Example 6 and 7 and Comparative Example 4 Production of Escherichia coli secreting lysine decarboxylase extracellularly (using Sec pathway and Tat pathway) and production of Escherichia coli not secreting extracellular
  • the W3110 ⁇ LDC strain was transformed with plasmids pTM101, pTM65 and pTM66 by
  • Example 8 (Confirmation of secretion of lysine decarboxylase extracellularly)
  • the W3110 ⁇ LDC / pTM101 strain, W3110 ⁇ LDC / pTM65 strain and W3110 ⁇ LDC / pTM66 were cultured in LB medium containing kanamycin, and then separated into microorganisms and culture supernatants by centrifugation. Microorganisms were crushed according to a conventional method, and a microbial disruption solution was prepared. The lysine decarboxylase activity in the culture supernatant and microbial disruption solution thus obtained was measured. Enzyme activity was 1 U when 1 nmol was converted from L-lysine to cadaverine per minute, and the results are shown in Table 4 as specific activity per protein weight.
  • the W3110 ⁇ LDC / pTM101 strain, the W3110 ⁇ LDC / pTM65 strain, and the extracellular culture supernatant had lysine decarboxylase activity, and it was confirmed that lysine decarboxylase was secreted outside the cell. In addition, it was confirmed that all the strains had lysine decarboxylase activity in the microbial disruption solution.
  • Examples 9 and 10 and Comparative Example 5 microorganism culture: when the microorganism is Escherichia coli) W3110 ⁇ LDC / pTM65 strain (Example 9), W3110 ⁇ LDC / pTM66 strain (Example 10), and W3110 ⁇ LDC / pTM101 strain + 20 m purified lysine decarboxylase (adjusted by the method described in JP-A-2004-000114) (Comparative Example 5) ) Were cultured, and the productivity of cadaverine was compared.
  • Each platinum strain was inoculated into 5 ml of LB medium containing kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 24 hours before shaking.
  • This pre-culture liquid was inoculated in a total volume of 50 ml of the same medium as the pre-culture, and cultured for 24 hours at 30 ° C. with an amplitude of 30 cm and 120 rpm for pre-culture.
  • the whole amount of the preculture was inoculated into 950 ml of MS medium (culture medium) shown in Table 5, and 37 ° C, stirring blade rotation speed 800 rpm, and pH 7.0 while aerated air was aerated at 0.20 vvm. Culturing was carried out for 50 hours while adjusting the temperature.
  • As a neutralizing agent sulfuric acid aqueous solution (3M) and aqueous ammonia (3M) were used.
  • 3M sulfuric acid aqueous solution
  • 3M aqueous ammonia
  • Examples 11 and 12 Comparative Examples 6 and 7 (microbe culture: comparison of effects of lysine addition) W3110 ⁇ LDC / pTM65 strain (Example 11), W3110 ⁇ LDC / pTM66 strain (Example 12), W3110 ⁇ LDC / pTM101 strain (Comparative Example 6) and W3110 ⁇ LDC / pTM101 strain + 20 mg purified lysine decarboxylase (described in JP-A-2004-000114) (Comparative Example 7) was compared for the ability to convert lysine to cadaverine.
  • Each microorganism was cultured in the same test as in Examples 9 and 10, except that 62.5 g / L of L-lysine hydrochloride was added to the MS medium (culture medium). After 50 hours, the microorganism was removed by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the culture supernatant was collected. Cadaverine and lysine in this culture supernatant were analyzed by HPLC. The results are shown in Table 7.
  • Examples 13 and 14 and Comparative Example 8 microorganism culture: comparison with a microorganism in which lysine decarboxylase is bound to the surface of the microorganism
  • Microorganisms that secrete lysine decarboxylase outside the cells hereinafter referred to as LDC-secreting microorganisms
  • microorganisms in which lysine decarboxylase is bound to the surface of the microorganisms hereinafter referred to as LDC cell surface display microorganisms.
  • LDC-secreting microorganisms microorganisms that secrete lysine decarboxylase outside the cells
  • LDC cell surface display microorganisms microorganisms in which lysine decarboxylase is bound to the surface of the microorganisms
  • 950 ml of the entire preculture solution was inoculated into 950 ml of MS medium (culture medium) to which a final concentration of 1 mM isopropyl-thio- ⁇ -D-galactoside was added, and sterilized air was aerated at 0.20 vvm while maintaining the temperature at 37 ° C. Incubation was performed for 50 hours while adjusting the stirring blade speed to 800 rpm and the pH to 7.0.
  • a neutralizing agent sulfuric acid aqueous solution (3M) and aqueous ammonia (3M) were used.
  • the present invention can be suitably applied to the production of cadaverine.

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Abstract

　リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することを特徴とするカダベリンの製造方法により、リジンの副生産が抑制され、従来の製造方法よりもカダベリン対糖収率が向上し、さらにはポリアミド原料としてカダベリンを精製する際の精製工程での負荷低減も可能となる。

Description

カダベリンの製造方法
　本発明は、カダベリンの製造方法に関する。特に、本発明は、リジン脱炭酸酵素を微生物で分泌生産させることによりカダベリンを効率的に製造する方法に関する。
　ポリアミド（ＰＡ）は、自動車産業、スポーツ産業、ライフスタイル産業で使用する一連の特殊プラスチックの原料となる重要なポリマー群であり、ジアミンは、このポリアミドの重要な原料モノマー成分である。ジアミンはジカルボン酸と縮合して種々のポリマーを形成するが、この際、ジアミンとジカルボン酸の鎖長によりポリマーの特性が定まる。
　従来、ジアミンは化学的にはジカルボン酸の中間段階を径由して石油由来の素材から製造されるか、またはアミノ酸の化学的脱カルボキシ反応によって製造される（非特許文献１）。石油価格の高騰を考慮すると、酵素反応や微生物培養などのバイオテクノロジー法による再生可能資源からのジアミンの合成に速やかに切り替えることが望まれる。
　そこで、バイオテクノロジー法により製造が可能なジアミンとして、カダベリンが注目されている。カダベリンとは、別名では１，５－ペンタンジアミンであり、ポリアミドの原料モノマーとなりえる化合物である。また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであって、その生合成系が解明されつつあるが（非特許文献２参照）、その生合成経路の一部として、リジンからカダベリンの脱炭酸反応を触媒するリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）が知られている。そして、ＬＤＣ遺伝子として大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のＬＤＣ遺伝子が知られている（非特許文献３参照）。
　従来のバイオテクノロジー法によるカダベリンの製造方法では、微生物にＬＤＣ遺伝子を導入することを基本として、リジンを基質とする酵素反応による製造方法や、微生物培養によるカダベリンの製造方法に大別される。さらに、微生物培養によるカダベリンの製造方法としては、組換え大腸菌の培養による製造方法（特許文献１参照）や、リジン生産微生物のコリネ型細菌において更にリジン生産能力を上げる方法（特許文献２参照）、カダベリン分解系を遮断する方法（特許文献３参照）、リジン輸送体の遮断する方法（特許文献４）が知られている。しかしながら、特に微生物培養によるカダベリンの製造方法には解決するべき課題は多く、例えば、リジン生産微生物のコリネ型細菌にＬＤＣ遺伝子を導入した微生物を培養する場合、リジンを副生産してしまうという課題もあった（非特許文献４参照）。リジンが副生産すると、前駆体までが製造されているにも関わらず、カダベリンの収率が向上せず、また、カダベリンをポリアミド原料として利用するためにはカダベリンの高純度化が重要であるが、リジンが副生産するとカダベリンの精製に対しても負荷が増加することとなるため、経済的に問題となっていた。
特開２００２－２２３７７０号公報 特開２００４－２２２５６９号公報 特表２００９－５３１０４２号公報 ＷＯ２００８／０９２７２０号
須山、金尾、「薬学雑誌」，１９６５年，第８５巻，ｐ．５１３－５３３ セリアホワイトテーバー（Ｃｅｌｉａ　ｗｈｉｔｅ　ｔａｂｏｒ）、他１名，「マイクロバイオロジカルレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．８１－９９ シユアンメング（Ｓｈｉ－ｙｕａｎｍｅｎｇ）、他１名，「ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１９９２年，第１７４巻，ｐ．２６５９－２６６９ 耳塚孝、他４名、「バイオサイエンス　バイオテクノロジー　アンド　バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２００７年，第７１巻，ｐ.２１３０－２１３５
　本発明は、微生物培養によるカダベリンの製造方法において、微生物培養終了時にカダベリン前駆体であるリジンを微生物培養液中に残存させない方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、微生物培養終了時にリジンが培養液中に残存しないようにするべく鋭意研究した結果、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することで、微生物培養終了時においてリジンが培養液中に残存しなくなることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の（１）～（６）で構成される。
　（１）リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
　（２）前記微生物の培養のための培地にリジンを添加することを特徴とする、（１）に記載のカダベリンの製造方法。
　（３）前記微生物が、リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のＮ末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現することによりリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することを特徴とする、（１）または（２）に記載のカダベリンの製造方法。
　（４）前記微生物が、核酸配列の５’から３’方向に、該微生物中で機能するプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を有することにより、細胞内でリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のＮ末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を発現することを特徴とする、（３）に記載のカダベリンの製造方法。
　（５）分泌シグナルペプチドが配列番号１３から４３のいずれかのアミノ酸配列で表されるペプチドであることを特徴とする、（３）または（４）に記載のカダベリンの製造方法。
　（６）リジン脱炭酸酵素が大腸菌由来であることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
　（７）前記微生物がコリネ型細菌または大腸菌であることを特徴とする、（１）から（６）のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
　本発明によれば、微生物培養によるカダベリンの製造方法において、微生物培養終了時においてリジンが培養液中に残存しなくなるため、従来の製造方法よりもカダベリン対糖収率が向上し、さらにはポリアミド原料としてカダベリンを精製する際の精製工程での負荷低減も可能となる。
　本発明の方法は、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することによるカダベリンの製造方法である。なお、本明細書において、リジン脱炭酸酵素が細胞外に「分泌」されるとは、リジン脱炭酸酵素が微生物外（細胞外）に移送されることをいい、最終的にリジン脱炭酸酵素が培地または培養液中に完全に遊離状態におかれる場合のことである。リジン脱炭酸酵素の一部のみが細胞外に存在している場合や、微生物表層にリジン脱炭酸酵素が結合して存在している場合は、ここでいう分泌には含まれない。
　リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物はこれまで知られていないが、遺伝子組換え技術により望みの微生物にリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌させることが可能である。具体的には、リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のＮ末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現させる方法によって、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌させることができる。
　本発明において使用されるリジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、Ｌ－リジン脱炭酸酵素であることが好ましい。また、リジン脱炭酸酵素の由来についても特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ；大腸菌）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｒｕｍｉｎａｍｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、またはピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）由来のものが好ましく用いられ、より好ましくは安全性の認められている大腸菌由来のものである。これらのリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。
　分泌シグナルペプチドとは、元々、分泌型タンパク質を細胞外に分泌させるために機能するシグナルペプチド配列として見出されたものである。分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、成熟型タンパク質になるが、その際、プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、細胞外への分泌に伴ってプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって分泌シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになり、その後、細胞外に分泌されることが知られている。そして、分泌シグナルペプチドは、分泌型タンパク質を細胞外に分泌させるだけにとどまらず、分泌型でないタンパク質と分泌シグナルペプチドを融合させることにより、分泌型でないタンパク質を細胞外に分泌させる機能を有することが知られており、本発明では、分泌シグナルペプチドとリジン脱炭酸酵素を融合させることで、リジン脱炭酸酵素を効率よく細胞外に分泌させることができる。
　本発明で使用される分泌シグナルペプチドは、異なる微生物に由来する場合であっても、使用する微生物の分泌シグナルペプチドであってもよいが、使用する微生物の分泌型タンパク質に由来することが好ましい。さらに本発明の目的に使用し得る分泌シグナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を一部含んでいてもよい。分泌シグナルペプチドの具体例としては、大腸菌由来のＴｏｒＡ（トリメチルアミンＮ－オキシドレダクターゼ）、ＳｕｆＩ（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ｆｔｓＩ；ｆｔｓＩサプレッサー）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＰｈｏＤ（ホスホエステラーゼ）、ＬｉｐＡ（リパーゼ）、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のイソマルトデキストラナーゼ（ＩＭＤ）等の分泌シグナルペプチド（それぞれ、配列番号１３～１７参照）、特許３７１１６５８号公報にある分泌シグナルペプチド（配列番号１８参照）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（２００９），１５５，ｐ．７４１－７５０にあるコリネバクテリウム・グルタミカム Ｒ 由来の分泌シグナルペプチドであるＣｇＲ００７９、ＣｇＲ０１２０、ＣｇＲ０１２４、ＣｇＲ０９００、ＣｇＲ０９４９、ＣｇＲ１０２３、ＣｇＲ１４４８、ＣｇＲ２１３７、ＣｇＲ２６７７、ＣｇＲ２９２６、ＣｇＲ００４０、ＣｇＲ０７８９、ＣｇＲ０８６５、ＣｇＲ１５２２、ＣｇＲ１８１９、ＣｇＲ２２１３、ＣｇＲ２３８６およびＣｇＲ２５３５（それぞれ、配列番号１９～３６参照）、特開平９－３１６０９５号公報にある分泌シグナルペプチド（配列番号３７参照）、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９５），６１（４），ｐ．１６１０－１６１３にあるサチライシンの分泌シグナルであるａｒｐＥのシグナルペプチド（配列番号３８参照）、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００３），６９（１），ｐ．３５８－３６６にある分泌シグナルペプチド（配列番号３９参照）、ならびにＴｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００５），１３（４），ｐ．１７５－１８０にある分泌シグナルペプチド（配列番号４０～４３参照）が挙げられる。
　なお、前記リジン脱炭酸酵素および分泌シグナルペプチドとしては、その機能を有する限りにおいては、それぞれ各アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加されたタンパク質も含まれる。ここで、「数個」とは、通常１～７個、好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個程度である。また、前記リジン脱炭酸酵素および分泌シグナルペプチドとしては、その機能を有する限りにおいては、アミノ酸配列に対する配列同一性が、通常８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
　上記のようなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、保存的置換であることが好ましい。元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＡｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、およびＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられる。
　遺伝子組換えにより微生物にリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のＮ末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現させる方法としては、核酸配列の５’から３’方向に、該微生物中で機能するプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を微生物に導入する方法が挙げられる。
　本発明で使用されるプロモーター配列は特に限定されず、使用する微生物内で機能し得るプロモーター配列であれば一般に使用でき、更に異種由来のプロモーターであってもよいが、好ましいプロモーターの例として、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の２－イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル－ＡＴＰピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系、例えばホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子の各プロモーター、ならびにｔａｃプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。これらのプロモーター配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。
　本発明で使用される分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列は、前記分泌シグナルペプチドを翻訳しうるような核酸配列であれば特に限定されず、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列のコドン（標準遺伝暗号）を参考に決定することができ（ホートン　生化学　第３版　東京化学同人、ｐ．５２６参照）、その際、本発明に使用する微生物にとって良く利用されているコドンで核酸配列を再設計してもよい。具体的には、大腸菌由来のＴｏｒＡ（トリメチルアミンＮ－オキシドレダクターゼ）、ＳｕｆＩ（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ｆｔｓＩ；ｆｔｓＩサプレッサー）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＰｈｏＤ（ホスホエステラーゼ）、ＬｉｐＡ（リパーゼ）、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のイソマルトデキストラナーゼ（ＩＭＤ）等の分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列（それぞれ、配列番号４４～４８参照）、特許３７１１６５８号公報にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号４９参照）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（２００９），１５５，ｐ．７４１－７５０にあるコリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム Ｒ 由来の分泌シグナルペプチドであるＣｇＲ００７９、ＣｇＲ０１２０、ＣｇＲ０１２４、ＣｇＲ０９００、ＣｇＲ０９４９、ＣｇＲ１０２３、ＣｇＲ１４４８、ＣｇＲ２１３７、ＣｇＲ２６７７、ＣｇＲ２９２６、ＣｇＲ００４０、ＣｇＲ０７８９、ＣｇＲ０８６５、ＣｇＲ１５２２、ＣｇＲ１８１９、ＣｇＲ２２１３、ＣｇＲ２３８６およびＣｇＲ２５３５をコードする核酸配列（それぞれ、配列番号５０～６７参照）、特開平９－３１６０９５号公報にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号６８参照）、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９５），６１（４），ｐ．１６１０－１６１３にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号６９参照）、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００３），６９（１），ｐ．３５８－３６６にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号７０参照）、ならびにおよびＴｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００５），１３（４），ｐ．１７５－１８０にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号７１～７４参照）が挙げられる。
　本発明で使用されるリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、前述の生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列が具体例として挙げられ、その際、使用する微生物のコドン使用頻度に応じて核酸配列を再設計してもよい。なお、前述の生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。
　前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列としては、その機能を有する限りにおいては、それぞれ各核酸配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加された核酸配列も含まれる。ここで、「数個」とは、通常１～４０個、好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、特に好ましくは１～１０個、最適に好ましくは１～５個程度である。また、前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列としては、その機能を有する限りにおいては、該核酸配列もしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列が挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を１つあるいは複数個選択した核酸配列をプローブとして、公知のハイブリダイセーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　６．３－６．４）などを用いて、ハイブリダイズする核酸配列である。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。また、前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列としては、その機能を有する限りにおいては、配列同一性が、通常８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の配列同一性を有する核酸配列であってもよい。このようなプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、本来の宿主以外からも取得され得るし、本来の宿主から得られた核酸配列を、当業者に周知のインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。
　本発明で使用される遺伝子構築物は、前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含むほか、微生物の細胞内でリジン脱炭酸酵素遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有してもよい。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、微生物中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってよい。また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。なお、遺伝子構築物の構築や、その確認方法については当業者に周知の分子生物学的手法になされるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（１９８９）　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ　ａｎｄＩＩ　（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．１９８５）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９４）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ等を参照することができる。
　前記遺伝子構築物の微生物への導入方法は特に限定されず、例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，（１９８５），３９，ｐ．２８１－２８６）、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８９），７，１０６７－１０７０）等により導入することができる。
　本発明におけるリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物としては、前記遺伝子構築物を遺伝子組換えにより導入できる微生物が好ましく、具体例として、大腸菌（エシェリシア・コリ）、枯草菌、カビ、酵母、コリネ型細菌などが挙げられるが、カダベリンの前駆体であるリジンを効率よく生産することが知られている微生物である大腸菌またはコリネ型細菌がより好ましい。
　大腸菌の具体例としては、ＭＣ１０６１株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株及びＪＥ５５０５株などを用いることができる。
　また、コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在、コリネバクテリウム属に統合された細菌も含まれる（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８１）４１,ｐ．２２５）。また、コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｙｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エッフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）、ブレビバクテリウム・セリヌム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｅｒｉｎｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）が挙げられる。
　また、各コリネ型細菌の具体的な菌株として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム　ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム　ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカム　ＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエ　ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラ　ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・エッフィシエンス　ＡＪ１２３４０（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタム　ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７，ＡＪ１２４１８（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム　ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム　ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム　ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム　ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス　ＡＴＣＣ１９２４０、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバム　ＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌム　ＡＴＣＣ１５１１２、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス　ＡＴＣＣ１５３５４が挙げられる。
　前述のコリネ型細菌は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載され、この番号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。
　本発明においては、前述のコリネ型細菌の中でもコリネバクテリウム・グルタミカムが好ましく用いられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３８６９のストレプトマイシン耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＪ１２０３６（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－７３４）（昭和５９年３月２６日原寄託、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２～３倍と極めて高いため、リジン脱炭酸酵素を分泌させるコリネ型細菌として好適である（ＷＯ０２／０８１６９４参照）。
　リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物がリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することの確認方法としては、微生物を培養し遠心分離することで培養上清と微生物に分離して得られた培養上清中のリジン脱炭酸酵素活性を測定し、有無を確認すればよい。また、細胞外へのリジン脱炭酸酵素量は、ウエスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法などの抗原－抗体反応を利用した定量法によって定量することができる。
　リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養すると、培養液中にカダベリンを生成・蓄積させることができる。
　培養方法としては、回分培養、流加培養または連続培養を用いることができる。連続培養の場合、例えば特開２００８－１０４４５３号公報に記載のような連続培養を行うことが好ましい。
　培養培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の栄養培地を用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ビタミンＢ６等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
　なお、本発明では培養培地にリジンを予め添加しておくことも好ましい態様の１つである。培養培地にリジンを予め添加しておけば、培養液中にて細胞外に分泌されたリジン脱炭酸酵素が予め添加されていたリジンを基質にしてカダベリンに変換をするため、カダベリンの製造効率を高めることができる。培養培地に予めリジンを添加する場合の培養培地中のリジン濃度としては特に制限はないが、微生物の増殖へ悪影響がおこらずかつリジン脱炭酸酵素への阻害がおこらない濃度が好ましく、具体的には、０．０１から２Ｍであることが好ましい。
　添加するリジンはＬ－リジンであることが好ましい。また、添加するリジンはフリー体であってもリジン塩であってもよいが、リジン塩としてはリジン塩酸塩または後述のジカルボン酸由来のリジン・ジカルボン酸塩が好ましい。なお、リジン・ジカルボン酸塩の好ましい具体例としては、リジン・アジピン酸塩、リジン・セバシン酸塩、リジン・１，１２－ドデカンジカルボン酸塩、リジン・コハク酸塩、リジン・イソフタル酸塩、リジン・テレフタル酸塩が挙げられるが、より好ましい具体例としてはリジン・アジピン酸塩が挙げられる。
　培養条件には特に制限はなく、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２５℃～４２℃に、好ましくは２８℃～３８℃である。培養時間は、通常１日から６日間である。
　培養ｐＨ調整にはアンモニア、塩酸またはジカルボン酸を使用することが好ましく、ジカルボン酸を使用することがより好ましい。これら中和剤を用いて培養ｐＨを５～８に、好ましくはｐＨ６．５～７．５に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
　中和剤として好ましく使用されるジカルボン酸には特に制限はないが、好ましくは、前記２つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないジカルボン酸である。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応（反応条件としては、例えば、反応温度２５０～２７０℃、圧力１０～２０ｋｇ／ｃｍ２で反応時間１から５時間）の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下（結晶化度８０％以下）させるような反応基であり、例えば、アミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基（スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等）や塩基性基（ヒドラジノ基等）やプロトニックな極性基（水酸基等）や開裂性を有する基（エポシキ基、過酸化基等）やその他反応性の高い基（イソシアナート基等）が該当する。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基、エーテル基、エステル基、アミド基等は反応性が低く、ここでいう官能基には該当しない。
　ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸である。
　ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯＨ　（１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０～１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（但し、一般式（２）において、ｎ，ｏ＝０～１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（但し、一般式（２）において、ｐ，ｑ＝０～１６）。
　また、ジカルボン酸として、更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、１，１２－ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。
　培養液中のカダベリンはカダベリンのフリー体またはカダベリン塩として存在する。培養液中のカダベリンを採取する方法として、まず、培養液中から微生物を除去する。分離方法としては、微生物を沈殿除去・遠心分離・膜ろ過分離など従来から知られている方法を用いることが好ましい。
　微生物が除去されたカダベリンを含む培養液からカダベリンを採取する方法としては、特開２００９－２０７４９５号公報に記載のようにカダベリン・ジカルボン酸塩として晶析して採取することもできる。また、特開２００９－２９８７２号公報に記載のようにＮＦ膜を利用してカダベリンのフリー体を精製し採取することもできる。また、特開２００９－２８０４５号公報に記載のように極性有機溶媒で抽出し、蒸留することによりカダベリンのフリー体を採取することもできる。
　以下、本発明について、実施例、比較例を挙げて詳細に説明する。また、特に断らない限り実施例・比較例で使用した全ての培地、寒天培地および培養培地は通常の滅菌操作（例えば１２１℃、３０分間のオートクレイブ滅菌や０．４５μｍフィルター滅菌）を行い滅菌された状態で利用している。
　（カダベリンおよびリジン濃度のＨＰＬＣによる分析方法）
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として１，４－ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４－ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
　参考例１（リジンを生産できるコリネバクテリウム・グルタミカムの作製）
　カダベリンの前駆体であるリジンを合成できるコリネバクテリウム・グルタミカムを作製するため、アスパルトキナーゼへの有効変異導入によるリジン生産菌を作製した。Ａｐｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００２），５８，ｐ．２１７－２２３に記載の方法により、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＫ－１（以下ＡＫ-１株と略す）株を作製した。本菌株のアスパルトキナーゼは、リジンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。そのためリジンを培養により合成できるようになっている。
　次に、ＡＫ－１株を更に遺伝子組換えにより、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌するコリネ型細菌（実施例１，２）、リジン脱炭酸酵素を細胞外には分泌しないコリネ型細菌（比較例１）を作製した。
　実施例１（リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製）（その１：Ｔａｔ経路利用）
　（１）ＨＯＭ遺伝子のクローニング
　リジン脱炭酸酵素遺伝子を導入する遺伝子座としてホモセリンデヒドロゲナーゼを選択した。ＨＯＭ遺伝子の、Ｎ末端から３００アミノ酸領域に該当する遺伝子のクローニングを行った。データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＨＯＭ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡ００００３６）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１および配列番号２）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（２０ｍＭ）、塩化カリウム（２．５ｍＭ）、ゼラチン（１００μｇ／ｍｌ）、各ｄＮＴＰ（５０μＭ）、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２単位）（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクルポリメラーゼ連鎖反応させた（以下ＰＣＲ法と略す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ＨＯＭ遺伝子を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キット（ＢＩＯ１０１社製）により精製した。この断片を、制限酵素のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片を、予めＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化しておいたｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＨＯＭ１と命名した。
　（２）ＬＤＣ分泌発現カセットの作成
　ＬＤＣをコリネバクテリウム・グルタミカムで構成的に発現させるためのプロモーターとして、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを選択し、分泌シグナルとしてＴａｔ経路による分泌をする大腸菌のＳｕｆＩを選択し、ＬＤＣ遺伝子として大腸菌のｃａｄＡを選択した。
　まず、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターのクローニングを行った。データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているｐＨＳＧ２９９（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ１９４１５）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３および配列番号４）を合成した。プラスミドｐＨＳＧ２９９を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）、（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ切断部位の３’末端にＴ塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて挿入し、得られたプラスミドのうち制限酵素のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩで消化した際に３．２ｋｂの単一断片になるプラスミドをｐＫＭＰ１と命名した。
　次に、ＬＤＣ遺伝子のクローニングを行った。データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬＤＣ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５配列番号６）を合成した。大腸菌（エシェリシア・コリ　ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド（配列番号５、６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ遺伝子を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅのＥｃｏＲＶ切断部位の３’末端にＴ塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて挿入し、得られたプラスミドのうちＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化した際に４．０ｋｂの単一断片になるプラスミドをｐＣＡＤＡと命名した。
　最後に、分泌シグナルとして大腸菌のＳｕｆＩのアミノ酸配列に対応する塩基配列とＬＣＤ遺伝子の融合した、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７）を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー３’側はＬＤＣ遺伝子の５’側と重複する領域を設計している。ｐＣＡＤＡを増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド（配列番号７、６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ遺伝子を含む２．２ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した（ＬＤＣ遺伝子断片１）。同時に、分泌シグナルとして大腸菌のＳｕｆＩのアミノ酸配列に対応する塩基配列とカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの融合した、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８）を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー５’側はカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの３’側と重複する領域を設計している。ｐＫＭＰ１を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド（配列番号３、配列番号８）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ遺伝子を含む０．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した（カナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片１）。
　こうして得られたＬＤＣ遺伝子断片１とカナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片１を増幅鋳型として制限酵素のＢａｍＨＩ配列を設計しているオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号９）および制限酵素のＳｐｈＩ配列を設計しているオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１０）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ分泌発現カセットを含む２．６ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、制限酵素のＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、得られた２．６ｋｂのＢａｍＨＩ-ＳｐｈＩ断片を、予めＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化しておいたｐＨＯＭ１のＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ６５と命名した。
　（４）ｐＴＭ６５の染色体への組み込み
　ＡＫ-１株にプラスミドｐＴＭ６５を、電気穿孔法［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で選択した。こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号：１）（配列番号：６）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、３．５ｋｂの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ＨＯＭ遺伝子座に、ＬＤＣ遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＫ-１／ｐＴＭ６５（ＡＫ－１／ｐＴＭ６５株と略す）と命名した。
　実施例２（リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製）（その１：Ｓｅｃ経路利用）
　（１）ＬＤＣ分泌発現カセットの作成
　次に、ＬＤＣをコリネバクテリウム・グルタミカムで構成的に発現させるためのプロモーターとして、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを選択し、分泌シグナルとしてＳｅｃ経路による分泌をするサチライシンのシグナルであるａｒｐＥを選択し、ＬＤＣ遺伝子として大腸菌のｃａｄＡを選択した。実施例１と同じく分泌シグナルとしてａｒｐＥのアミノ酸配列に対応する塩基配列とＬＣＤ遺伝子の融合した、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１１）を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー３’側はＬＤＣ遺伝子の５’側と重複する領域を設計している。ｐＣＡＤＡを増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド（配列番号１１、配列番号６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ遺伝子を含む２．２ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した（ＬＤＣ遺伝子断片２）。
　同時に、分泌シグナルとしてａｒｐＥのアミノ酸配列に対応する塩基配列とカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの融合した、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２）を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー５’側はカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの３’側と重複する領域を設計している。ｐＫＭＰ１を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド（配列番号３、配列番号１２）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ遺伝子を含む０．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した（カナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片２）。
　こうして得られたＬＤＣ遺伝子断片２とカナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片２を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：９）および（配列番号：１０）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＬＤＣ分泌発現カセットを含む２．６ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、制限酵素のＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、得られた２．６ｋｂのＢａｍＨＩ-ＳｐｈＩ断片を、予めＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化しておいたｐＨＯＭ１のＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ６６と命名した。
　（２）ｐＴＭ６６の染色体への組み込み
　ＡＫ-１株にプラスミドｐＴＭ６６を、電気穿孔法［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で選択した。こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号６）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、３．５ｋｂの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ＨＯＭ遺伝子座に、ＬＤＣ遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＫ-１／ｐＴＭ６６（ＡＫ－１／ｐＴＭ６６株と略す）と命名した。
　比較例１（リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌しないコリネバクテリウム・グルタミカムの作製）
　ｐＫＭＰ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化し、この産物を１．２％アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。こうして得られたＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｃｏＩ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化しておいたｐＣＡＤＡのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１を用い挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１００と命名した。
　次に、ｐＴＭ１００をＳａｃＩＩで消化し、この産物を１．０％アガロースゲル電気泳
動し、ＬＤＣ発現カセットを含む２．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。こうして得られたＳａｃＩＩ断片を、予めＳａｃＩＩで消化しておいたｐＨＯＭ１のＳａｃＩＩ間隙にライゲーションキットｖｅｒ．１を用い挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１０１と命名した。
　ＡＫ－１株にプラスミドｐＴＭ１０１を、電気穿孔法［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で選択した。
　こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号：５）（配列番号：６）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、２．１ｋｂの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ＨＯＭ遺伝子座に、ＬＤＣ遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＫ－１／ｐＴＭ１０１（以下ＡＫ－１／ｐＴＭ１０１株と略す）と命名した。
　実施例３（リジン脱炭酸酵素活性を細胞外に分泌することの確認）
　ＡＫ-１／ｐＴＭ６５株、ＡＫ-１／ｐＴＭ６６株およびＡＫ-１／ｐＴＭ１０１株をＢＹ培地（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，ｐ．３０６－３１１（１９８４）参照）にて培養した後に、遠心分離により微生物と培養上清に分けた。微生物については常法にしたがい破砕し、微生物破砕液を調整した。こうして得られた培養上清および微生物破砕液中のリジン脱炭酸酵素活性を測定した（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，ｐ．２１３０－２１３５，（２００７）参照）。酵素活性を、Ｌ－リジンをカダベリンに１分間に１ｎｍｏｌの変換するとき１Ｕとし、結果をタンパク質重量当たりの比活性で表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＡＫ－１／ｐＴＭ６５株およびＡＫ－１／ｐＴＭ６６株は、細胞外である培養上清にリジン脱炭酸酵素活性を有しており、リジン脱炭酸酵素が細胞外に分泌されていることが確認できた。また、微生物破砕液中にはすべての株がリジン脱炭酸酵素活性を有していることが確認できた。
　実施例４，５、比較例２，３（微生物培養：微生物がコリネ型細菌である場合）
　ＡＫ－１／ｐＴＭ６５株（実施例４）、ＡＫ－１／ｐＴＭ６６株（実施例５）、ＡＫ－１／ｐＴＭ１０１株（比較例２）およびＡＫ－１／ｐＴＭ１０１株＋２０ｍｇ精製リジン脱炭酸酵素（特開２００４－０００１１４号公報に記載の方法で調整）（比較例３）をそれぞれ培養し、カダベリンの生産性を比較した。
　滅菌したＢＹ培地５ｍｌに各株を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１２０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に、表２に示すＭＭＰ培地（培養培地）９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．０７ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを６．７に調整しながら５０時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。比較例３については２０ｍｇの精製リジン脱炭酸酵素を培養開始時に添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをＨＰＬＣにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。カダベリン対糖収率（生産されたカダベリン重量／消費したグルコース重量）×１００（％））を計算し、それら結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、比較例２および３では細胞外にリジン脱炭酸酵素を添加することでリジンの副生産を低減可能であるという予想可能な効果が現れている。一方で、比較例２と実施例４、５を比較すると、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することでリジンの副生産を顕著に低減可能であることが明らかになった。また、リジンの副生産低減によるカダベリンの蓄積濃度向上と対糖収率向上は、比較例３と実施例４、５では差はないものと考えられていたが、驚くべきことに、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養すると、リジン脱炭酸酵素を培養液に添加する場合よりもカダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上することが確認できた。
　参考例２（リジン脱炭酸酵素活性欠損大腸菌の作製）
　（１）大腸菌のリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）遺伝子の削除
　大腸菌にはＬＤＣ遺伝子としてｃａｄＡ遺伝子とｌｄｃＣ遺伝子が存在することが知られている。ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒにより開発された「Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」と呼ばれる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５）に従い、以下の通り大腸菌Ｗ３１１０株のｃａｄＡおよびｌｄｃＣ遺伝子を削除した。「Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの５’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらに酵母由来のＦＬＰレコンビナーゼにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することができる。
　（１－１）ｃａｄＡ遺伝子の削除
　ＰＣＲの鋳型として、プラスミドｐＫＤ３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５）を使用した。ｐＫＤ３は、ｐＭＷ１１８（タカラバイオ社製）にＦＬＰ－レコンビナーゼの認識配列であるＦＲＴ（ＦＬＰ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）と抗生物質耐性遺伝子であるｃａｔ遺伝子を挿入したプラスミドであり、ＦＲＴ－ｃａｔ－ＦＲＴの順で挿入されている。ＦＲＴを配列番号７５に示す。
　このＦＲＴの両端に対応する配列をプライマーの３’末端に、削除する遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する５０塩基をプライマーの５’末端に有する配列番号７６、７７に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
　増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含む大腸菌Ｗ３１１０株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドｐＫＤ４６（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５）は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄ相同組換えシステムのＲｅｄレコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、e x o遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　アクセッション番号　Ｊ０２４５９，第３１０８８番目～３３２４１番目）を含む。
　エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、アンピシリンを含むＬＢ培地中で３０℃、一晩培養した大腸菌Ｗ３１１０株を、アンピシリンとＬ－アラビノースを含んだＳＯＢ培地で１００倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ６００が約０．６になるまで生育させた後、１０％グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。
　エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で平板培養し、クロラムフェニコール耐性組換え体を選択した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、ｐＫＤ４６が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
　クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のｃａｄＡ遺伝子の欠失を、ＰＣＲによって確認した。得られたｃａｄＡ欠損株をＷ３１１０　ｃａｄＡ：：ＦＲＴ－ｃａｔ－ＦＲＴ株と名づけた。
　次に、ｃａｄＡ遺伝子内に導入されたＦＲＴ－ｃａｔ－ＦＲＴ遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０を使用した。ｐＣＰ２０（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５）は、酵母のＦＬＰレコンビナーゼを搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。ｐＣＰ２０導入により、染色体上に存在する２箇所のＦＲＴを認識して組換えを起こしＦＲＴ間の遺伝子を切り出し、染色体上にはＦＲＴのみが残る構造になる。
　上記で得られたＷ３１１０　ｃａｄＡ：：ＦＲＴ－ｃａｔ－ＦＲＴ株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０にて形質転換し、３０℃で５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、ｐＣＰ２０を除去するために、ＬＢ寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、ｃａｔ遺伝子、およびｐＣＰ２０が脱落しているクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をＷ３１１０ΔｃａｄＡと命名した。
　（１－２）ｌｄｃＣ遺伝子の削除
　大腸菌Ｗ３１１０ΔｃａｄＡ株におけるｌｄｃＣ遺伝子の削除は、上記（１－１）の手法に則って、ｌｄｃＣ破壊用プライマーとして、配列番号７８、７９のプライマーを使用して行った。これによって、ｃａｄＡおよびｌｄｃＣ遺伝子が削除された株を得た。構築した菌株をＷ３１１０ΔＬＤＣと命名した。
　実施例６，７、比較例４（リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する大腸菌（Ｓｅｃ経路利用およびＴａｔ経路利用）の作製および細胞外に分泌しない大腸菌の作製）
　Ｗ３１１０ΔＬＤＣ株を常法により、プラスミドｐＴＭ１０１、ｐＴＭ６５およびｐＴＭ６６で形質転換を行った。それらの遺伝子組換え大腸菌をそれぞれ、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ１０１株（細胞外に分泌しない株）（比較例４）、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６５株（細胞外分泌株：Ｔａｔ経路利用）（実施例６）およびＷ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６６株（細胞外分泌株：Ｓｅｃ経路利用）（実施例７）と命名した。
　実施例８（リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することの確認）
　Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ１０１株、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６５株およびＷ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６６を、カナマイシンを含むＬＢ培地にて培養した後に、遠心分離により微生物と培養上清に分けた。微生物については常法にしたがい破砕し、微生物破砕液を調整した。こうして得られた培養上清および微生物破砕液中のリジン脱炭酸酵素活性を測定した。酵素活性を、Ｌ－リジンをカダベリンに１分間に１ｎｍｏｌの変換するとき１Ｕとし、結果をタンパク質重量当たりの比活性で表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ１０１株、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６５株、細胞外である培養上清にリジン脱炭酸酵素活性を有しており、リジン脱炭酸酵素が細胞外に分泌されていることが確認できた。また、微生物破砕液中にはすべての株がリジン脱炭酸酵素活性を有していることが確認できた。
　実施例９，１０、比較例５（微生物培養：微生物が大腸菌である場合）
　Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６５株（実施例９）、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６６株（実施例１０）、およびＷ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ１０１株＋２０ｍ精製リジン脱炭酸酵素（特開２００４－０００１１４号公報に記載の方法で調整）（比較例５）をそれぞれ培養し、カダベリンの生産性を比較した。
　カナマイシンを含むＬＢ培地５ｍｌに各株を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１２０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に、表５に示すＭＳ培地（培養培地）９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．２０ｖｖｍで通気しながら、３７℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７．０に調整しながら５０時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。比較例６については２０ｍｇの精製リジン脱炭酸酵素を培養開始時に添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをＨＰＬＣにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。カダベリン対糖収率（生産されたカダベリン重量／消費したグルコース重量）×１００（％））を計算し、それら結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　比較例５と実施例９、１０を比較すると、驚くべきことにリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養すると、リジン脱炭酸酵素を培養液に添加する場合よりもカダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上することが確認できた。
　実施例１１，１２、比較例６、７（微生物培養：リジン添加の効果比較）
　Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６５株（実施例１１）、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６６株（実施例１２）、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ１０１株（比較例６）およびＷ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ１０１株＋２０ｍｇ精製リジン脱炭酸酵素（特開２００４－０００１１４号公報に記載の方法で調整）（比較例７）によるリジンのカダベリンへの変換能力について比較した。実施例９，１０と同様の試験で各微生物を培養し、ＭＳ培地（培養培地）にＬ－リジン塩酸塩を６２．５ｇ／Ｌ添加する点だけを変更した。５０時間後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをＨＰＬＣにより分析した。本結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　比較例６、７と実施例１１、１２を比較すると、カダベリンの生産効率（生産速度）が、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物のほうが顕著に優れていることを確認できた。このことより、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養する際に、リジンを添加することで、カダベリンの生産効率が向上することが明らかになった。
　実施例１３，１４、比較例８（微生物培養：微生物表層にリジン脱炭酸酵素が結合している微生物との比較）
　リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物（以下、ＬＤＣ分泌微生物という。）と、微生物表層にリジン脱炭酸酵素が結合して存在している微生物（以下、ＬＤＣ細胞表層提示微生物という。）として特開２００４－２９８０３３号公報に記載のＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株をそれぞれ培養した場合のカダベリンの生産性を比較した。
　Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６５株（実施例１３）、Ｗ３１１０ΔＬＤＣ／ｐＴＭ６６株（実施例１４）、およびＪＣＭ１０９／ｐＴＭ１６株（比較例８）について、カナマイシンを含むＬＢ培地５ｍｌ（ＪＣＭ１０９／ｐＴＭ１６株はアンピシリンを含むＬＢ培地）に各株を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１２０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に、終濃度１ｍＭ　イソプロピル－チオ－β－Ｄ－ガラクトシドを添加したＭＳ培地（培養培地）に９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．２０ｖｖｍで通気しながら、３７℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７．０に調整しながら５０時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。
　培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをＨＰＬＣにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。カダベリン対糖収率（生産されたカダベリン重量／消費したグルコース重量）×１００（％））を計算し、それら結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　比較例８と実施例１３、１４を比較すると、驚くべきことにＬＤＣ分泌微生物を培養した場合、ＬＤＣ細胞表層提示微生物を培養した場合よりもカダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上することが確認できた。
　本発明は、カダベリンの製造に好適に適用することが可能である。

Claims (7)

  1. 　リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法。
  2. 　前記微生物の培養のための培地にリジンを添加することを特徴とする、請求項１に記載のカダベリンの製造方法。
  3. 　前記微生物が、リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のＮ末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現することによりリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することを特徴とする、請求項１または２に記載のカダベリンの製造方法。
  4. 　前記微生物が、核酸配列の５’から３’方向に、該微生物中で機能するプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を有することにより、細胞内でリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のＮ末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を発現することを特徴とする、請求項３に記載のカダベリンの製造方法。
  5. 　分泌シグナルペプチドが配列番号１３から４３のいずれかのアミノ酸配列で表されるペプチドであることを特徴とする、請求項３または４に記載のカダベリンの製造方法。
  6. 　リジン脱炭酸酵素が大腸菌由来であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
  7. 　前記微生物がコリネ型細菌または大腸菌であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
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