WO2011105721A2 - 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드 - Google Patents

항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드 Download PDF

Info

Publication number
WO2011105721A2
WO2011105721A2 PCT/KR2011/001126 KR2011001126W WO2011105721A2 WO 2011105721 A2 WO2011105721 A2 WO 2011105721A2 KR 2011001126 W KR2011001126 W KR 2011001126W WO 2011105721 A2 WO2011105721 A2 WO 2011105721A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
slide
reactive protein
solution
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2011/001126
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011105721A3 (ko
WO2011105721A9 (ko
Inventor
김남수
조용진
김종태
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Food Research Institute KFRI
Original Assignee
Korea Food Research Institute KFRI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Food Research Institute KFRI filed Critical Korea Food Research Institute KFRI
Priority to EP11747611.9A priority Critical patent/EP2541248B1/en
Priority to US13/261,437 priority patent/US20130029428A1/en
Priority to CN201180019524XA priority patent/CN102859359A/zh
Publication of WO2011105721A2 publication Critical patent/WO2011105721A2/ko
Publication of WO2011105721A9 publication Critical patent/WO2011105721A9/ko
Publication of WO2011105721A3 publication Critical patent/WO2011105721A3/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4737—C-reactive protein

Definitions

  • the present invention provides a method for preparing a protein chip by immobilizing a C-reactive protein on a slide, mixing an antibody that specifically binds to a protein to be analyzed with striptevidin and labeling it with fluorescent nanoparticles.
  • the present invention relates to a method for producing an antigen-immobilized immunofluorescence slide comprising an immunoreaction step and an analysis with a fluorescence camera, and an immunofluorescence slide produced thereby.
  • Biochip is an immobilization of various types of probes on the surface of a solid-phase support of a unit area.By using such a biochip, a small amount of sample can be used to diagnose disease, high throughput screening (HTS), and enzyme activity measurement. Experiments can be easily performed on a large scale.
  • HTS high throughput screening
  • three-dimensional immobilization methods have been developed in an attempt to increase the amount of probes immobilized and maintain the activity of the probes (Gill and Ballesteros, Trends in Biotechnology 18: 282, 2000).
  • a three-dimensional immobilization method using Packard Bioscience's Hydrogel ® coating slide, Biocept's polyethylene glycol-based hydrogel, LG Chem's Solgel, and the like can be mentioned.
  • the slide for the immunosensor is selected from the group consisting of glass, silicone, hydrogel, metal, ceramic, porous membrane.
  • antibodies or antigen probe-plates on which an antibody or antigen is immobilized on a substrate based on the specific reactivity of the corresponding antigen or antibody are widely used for detection.
  • Three representative kits for this use are rapid test kits, routine test kits and biochip kits.
  • reactors are combined into one probe-plate, each of which comprises a test strip that detects an antigen or an antibody, respectively.
  • the functional evaluation of food includes in vitro functional evaluation, in vivo functional evaluation and clinical trials using rats such as rats.
  • rats such as rats.
  • the necessity of developing an in vivo functional retrieval technology using laboratory animals to efficiently and quickly perform functional evaluation of food materials and functional foods is increasing.
  • Korean Patent No. 10-921237 discloses a new method for evaluating in vivo functionality that can quickly detect cardiovascular functionality of food materials and functional foods, and is a major biomarker for coronary artery disease and hypertension. It is known as a pentameric protein with a molecular mass of about 118 kilodaltons (kDa), which is synthesized by induced stimulation by interleukin-6 and interleukin-1 ⁇ in mammalian liver.
  • C-reactive protein Biosensors and Bioelectronics , Vol. 19, p. 1193, 2004; Clinical Chemistry , Vol. 47, p. 403, 2001; New England Journal of Medicine , Vol. 340, p. 448, 1999; Biochemical Journal , Vol. 327, p. 425, 1997), a high sensitivity detection method using a quartz crystal microbalance immunosensor has been described.
  • the above method is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), one of the existing methods for measuring C-reactive protein ( American Journal of Cardiology , Vol. 1, p. 155, 2005; American Journal of Veterinary Research , Vol. 1, p. 62, 2005; Journal of Clinical Laboratory Analysis , Vol. 18, p. 280, 2004).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the present invention provides a protein, antibody and fluorescence to be analyzed by immobilizing a certain volume of antigen on a slide using a micro dispensing pipette without using complicated devices such as a biochip arrayer or a micro-array scanner for the fabrication and measurement of biochips.
  • Immune reactions between conjugates of nanoparticles or immobilized antigens and mixtures of fluorescent nanoprobes and specific target molecules were carried out at the antigen-coated sites on the immunofluorescent slide, followed by nanoprobes specifically bound to the slide surface by immunoreaction.
  • the present invention aims to provide a slide for a single-use immunosensor with high sensitivity of a sensor that can easily measure fluorescence intensity or number of fluorescent particles by a fluorescence microscope, and as a result, know the concentration of a specific target molecule such as a biomarker.
  • the present invention is to fix a protein (antigen) to be analyzed on a slide, to label the antibody specifically binding to the antigen with a fluorescent material, and to analyze the protein to be collected from a sample.
  • a protein antigen
  • the mixed mixture is reacted with the antigenic site immobilized on the slide, the unreacted antibody and antigen are washed with distilled water, the slide is placed in an incubator and dried, followed by fluorescence A microscope is used to measure the fluorescence intensity or the number of fluorescent particles.
  • Slide for immunosensor used in the present invention is selected from the group consisting of glass, silicon, hydrogel, metal, ceramic, porous membrane and has a horizontal and vertical dimensions of 20 ⁇ 40X70 ⁇ 80mm.
  • C-reactive protein (hereinafter referred to as "CRP") was used as a sample to be analyzed, but a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs may use the method of other food functional biomarker ELD.
  • Blood loss biomarkers such as LDL, fibrinogen, angiotensin II, and cardiac troponin, anti-aging, cancer prevention, obesity prevention, immunomodulation, gastrointestinal disorders It will be readily understood that biomarker proteins related to prophylaxis and the like can be used.
  • the C-reactive protein antibody may be any one selected from antibodies prepared using C-reactive proteins derived from mammals such as rats, mice, rabbits, monkeys, and humans.
  • the sample collected from the sample may be any one selected from tissue extracts such as standard solution in which C-reactive protein is dissolved in the reaction buffer solution, blood, serum, plasma, saliva, body fluid, and liver.
  • the solution used to block the sites that did not react with the antigen on the slide surface where the antigen is immobilized includes 1-5% of Bovine serum albumin (BSA), Rat serum albumin (RSA), and Human serum albumin (HSA). Any one selected from MSA (Mouse serum almumin) and GSA (goat serum albumin) solutions can be used.
  • BSA Bovine serum albumin
  • RSA Rat serum albumin
  • HSA Human serum albumin
  • Immobilization of the C-reactive protein as an antigen on the slide of the present invention can be carried out by selecting one of the following two methods.
  • an antigen is immobilized using 3-aminopropyltrimethoxysilane (hereinafter referred to as "APTMS").
  • APTMS 3-aminopropyltrimethoxysilane
  • the prepared slides subjected to surface washing are placed in a Petri dish containing APTMS solution dissolved in acetone at a concentration of 5 to 15%, and reacted at room temperature for 30 to 90 minutes. Rinse sequentially with acetone, 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8), distilled water, 3-4 times in front of the slide, and soak for 1 to 60 minutes in a beaker containing distilled water. Take this out and dry it at room temperature for 20 ⁇ 120 minutes on Kimwipes, heat it for 3 ⁇ 7 hours at 30 ⁇ 150 °C convection oven, cool it and store it in desiccator until it is used.
  • the slides modified with APTMS are hydrated by soaking in distilled water for 10-20 minutes. Take out the immersed slide, put it in a petri dish containing glutaraldehyde 1-4% solution, and react for 30-90 minutes to activate the protein to bind to the slide surface. Wash the front and back of activated slide 3-4 times with 30-70mM phosphate buffer (pH 6.5-7.8). Dip the slide for 1 to 60 minutes in a beaker of distilled water. Take it out and place the slide on Kimwipes for 20 to 120 minutes at room temperature.
  • Glutaraldehyde used in the above is prepared by adding 1 to 4 ml of glutaraldehyde in a concentration of 30-70% to 46 to 49 ml of distilled water and applying it to 30 to 70 ml.
  • C-reactive protein In order to immobilize the protein to be analyzed, for example, C-reactive protein, first, the C-reactive protein was dissolved in a concentration of 0.01-0.5 mg / ml in 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) to prepare an antigen solution for immobilization. do. Place Petri dishes containing glutaraldehyde-activated slides on a grid spotting guide, 1-100 ⁇ l of the antigen solution prepared previously, and spot the lid on the slide corresponding to the dropping point on the spotting guide.
  • MPTMS-GMBS (3-Mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma-maleimidobutyryloxy succinimide ester) method is used.
  • HCl: MtOH 1: 1 ⁇ 1: 2, volume ratio
  • the slides are washed with distilled water at 85 ⁇ 95 °C, placed on Kimwipes and dried at room temperature for 20 ⁇ 120 minutes.
  • 1 ⁇ 3mM GMBS solution is prepared as follows. Dissolve 14-42 mg of GMBS sample in 100 ⁇ l of DMF (N, N-Dimethylformamide; Sigma-Aldrich, USA) and add 49.9 mL of ethanol. The silanized slide was put in a Petri dish containing GMBS solution and reacted at room temperature for 30 to 90 minutes. Wash the front and back of the slide three to four times with distilled water and 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8). The slides are then placed in Kimwipes and allowed to dry at room temperature for 20 to 120 minutes.
  • Immobilization of the CRP antigen is performed as follows. First, the immobilized antigen solution is prepared by dissolving C-reactive protein in a concentration of 0.01-0.5 mg / ml in a 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8). Place petri dishes containing GMBS activation slides on the spotting guide and spot 1-100 ⁇ l of the antigen solution prepared on the spotting guide on the slide corresponding to the dropping point on the spotting guide. After immobilization, rinse the front and back sides 3 ⁇ 4 times with 30-70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) and immerse the slide in beaker containing distilled water for 1 ⁇ 60 minutes.
  • 30-70mM phosphate buffer solution pH 6.5-7.8
  • FIG. 1 A schematic representation of the two methods is shown as FIG. 1.
  • an antibody that specifically binds to an antigen immobilized on the slide is labeled.
  • Labeling the antibody uses a highly sensitive and reproducible fluorescence staining method, and for this purpose, fluorescent silica nanoparticles (hereinafter referred to as "FSNP”) are used in the present invention.
  • FSNP fluorescent silica nanoparticles
  • FSNP fluorescent silica nanoparticles
  • the organic fluorescent dyes include dichlorotris (1,10-phenanthroline) ruthenium (II) monohydrate (dichlorotris (1,10-phenanthroline) ruthenium (II) hydrate), fluorescein, rhoda Rhodamine B, 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine (5 (6) -Carboxytetramethylrhodamine) and the like can be used, and as an activated organic fluorescent dye, Fluorescein isothiocyanate, 5 ( 6) -carboxytetramethylrodamine N-succinimidyl ester (5 (6) -Carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester), tetramethylrhodamine 5-isothiocyanate, bis (2,2 ' -Bipyridine) -4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester hex
  • the (3-aminopropyl) triethoxy silane ((3-Aminopropyl) triethoxysilane) and the like can be used, the organosilane compound carboxylate (Carboxylate), amine (Amine), amine / phosphonate (Amine / Compounds having phosphonate, poly (ethylene glycol), octadecyl, and carboxylate / octadecyl functional groups can be used.
  • FSNP streptavidin
  • SA streptavidin
  • MTMS 3-mercaptopropyltrimethoxy silane
  • Maleimide-activated SA is added to thiol-modified FSNP to prepare SA-attached FSNP. More specifically, 0.1-0.5 mg of SA-maleimide and 3-7 ml of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) were added to a 10-70 ml cap tube to dissolve the SA-maleimide solution. . 0.5 to 2.0 ml of the thiol-modified FSNP solution prepared above was added thereto and the mixture was stirred at a low speed of 30 to 200 rpm for 1 to 3 hours at room temperature. The precipitate is taken by centrifugation at 7000-17000 rpm for 20-40 minutes at 3-10 ° C.
  • the precipitate taken in the above step is washed 1 to 5 times with 30 ⁇ 70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) and centrifuged under the same conditions after each wash to obtain a precipitate.
  • the precipitate washed in this step is resuspended in 1-5 mL of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8). This is wrapped in an aluminum foil in a cap tube and refrigerated to react with the biotinylated antibody described below.
  • Biotinylation of C-reactive protein antibodies can be carried out using either of the following two methods.
  • a carbonic acid buffer solution is added to a C-reactive protein antibody to obtain a carbonic acid buffer solution containing a C-reactive protein antibody, and biotin dissolved in dimethyl formamide, an organic solvent. Reacting the biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester (NHS-LC-biotin) solution with the carbonate buffer solution of the above step, the solution obtained in the step And dialysis in sodium chloride solution to remove unreacted biotinylation reagent.
  • NHS-LC-biotin biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester
  • a carbonic acid buffer solution to the C-reactive protein antibody to obtain a carbonic acid buffer solution having a concentration of the C-reactive protein antibody of 1.0 ⁇ 3.0mg / ml, dissolved in 1 ⁇ 5mg / ml concentration in dimethyl formamide Reacting 30-100 ⁇ l of NHS-LC-biotin solution with 25-75 ⁇ l of carbonic acid buffer solution of the above step under ice water for 1-5 hours, 75-175 ⁇ l of the solution obtained in the above step is 0.1-0.3 M Dialysis overnight in sodium chloride solution removes unreacted biotinylation reagent.
  • phosphate buffered saline is added to C-reactive protein antibody to obtain phosphate-buffered saline containing C-reactive protein antibody, and sulfosuccinimidyl-6- (bioti, a water-soluble biotinylation reagent dissolved in re-distilled water).
  • Amido) hexanoate (Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate, sulfo-NHS-LC-biotin) solution is reacted with phosphate buffered saline of the above step, the solution obtained in the step of dialysis in phosphate buffered saline
  • the method which consists of removing a reaction biotinylation reagent is mentioned.
  • phosphate-buffered saline is added to the C-reactive protein antibody to obtain phosphate-buffered saline having a concentration of 0.5-3.0 mg / ml of the C-reactive protein antibody.
  • Sulfo-NHS- 5 to 20 ⁇ l of LC-Biotin solution is reacted with 30 to 800 ⁇ l of phosphate buffered saline in the above step for 1 to 5 hours under ice water. Dialysis against phosphate buffered saline overnight to remove unreacted biotinylation reagent.
  • an antibody to which a nanomaterial is attached is prepared.
  • the SA-modified FSNP prepared above and the biotinylated antibody are added and mixed, the biotin is specifically bound to SA, thereby producing an antibody labeled with a fluorescent material.
  • the SA-modified FSNP solution prepared above was sonicated for 10-30 minutes, 200-600 ⁇ l of the biotinylated antibody solution 1-3 prepared at the concentration of 0.05-0.25 mg / ml prepared above. Add ml and react for 1 to 3 hours at room temperature while stirring for 2 to 7 minutes at a low speed of 30 to 200 rpm at 30 minute intervals. Centrifuge at 7000-17000rpm for 20-40 minutes at 3 ⁇ 10 °C, discard supernatant and take off precipitate.
  • the precipitate taken in the above step is washed 1 ⁇ 5 times with 30 ⁇ 70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8), and after each washing, the precipitate is obtained by centrifugation under the same conditions as above.
  • the precipitate washed in this step is resuspended in 0.4-1.2 ml of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8).
  • FIG. 2 A schematic method of labeling an antibody specifically binding to CRP of the present invention with a fluorescent substance is shown as FIG. 2.
  • the protein to be collected from the sample is mixed with the labeled antibody as described above.
  • each concentration of C-reactive protein sample prepared by diluting stepwise using 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) in an Eppendorf tube by specific binding of biotin and SA As the nano-material prepared as described above, an equal amount of FSNP-attached C-reactive protein antibody solution was added and mixed, followed by standing at room temperature for 5 to 300 minutes.
  • the next step is to react the mixture as described above with the antigenic site immobilized on the slide.
  • the biotransducer immobilized C-reactive protein as an antigen by the glutaraldehyde process or the MPTMS-GMBS process and minimizing non-selective protein adsorption by a BSA (bovine serum albumin) blocking process.
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 3 illustrates how the antigens immobilized on the slides of the present invention and the fluorescently labeled antibodies bind by indirect competition.
  • the 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5) is used instead of the C-reactive protein taken from the sample. -7.8) was mixed with the labeled antibody as described above, and then dropped into the site where the antigen on the slide was immobilized to change the number of fluorescent particles bound to the slide when antigen / antibody reaction was performed over time. .
  • Fluorescence microscopy is used to measure fluorescence intensity and number of fluorescent particles. If the CRP concentration in the sample is high, it reacts with the fluorescently labeled antibody so that the number of antigens immobilized on the slide and the fluorescently labeled antibody are less likely to bind. As described above, the antigens immobilized on the slides and the antigens in the sample show different fluorescence through competitive interaction with the fluorescently labeled antibody, so that the CRP can be easily measured in a short time.
  • 1 is a schematic representation of two methods of immobilizing C-reactive protein to antigen.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a method of labeling an antibody that specifically binds CRP with a fluorescent substance.
  • FIG. 3 is a view illustrating a method in which an antigen immobilized on a slide of the present invention and a fluorescently labeled antibody bind by indirect competition.
  • Figure 4 shows the time-dependent antigen by dropping 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) instead of the C-reactive protein collected from the sample with the labeled antibody according to the present invention to the site where the antigen on the slide is immobilized.
  • a graph showing the change in the number of fluorescent particles bound to a slide when an antibody reaction was performed.
  • a, b, and c are diagrams showing that the inhibitory spots of contaminants such as impurities present on the surface of the slide before the treatment of the piranha solution are removed by the piranha treatment, and the inhibition of the fluorescence image even after silencing by APTMS Figure showing that no spots are observed.
  • 5D is a diagram showing that no inhibitory spots are detected by taking a fluorescence image by treating a substrate treated with a glutaraldehyde 2.5% solution.
  • 5E shows that no inhibition spots were found on the surface of the BSA blocking slide after antigen immobilization.
  • Figure 5f is a diagram showing the fluorescence spot of the fluorescent silica nanoparticle-labeled antibody bound to the slide surface subjected to indirect competition by the method of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the calibration curve of antigen-immobilized immunofluorescence slides and FSNP labeled antibody based C-reactive protein.
  • Recombinant histidine tagged rat CRP (pure state) expressed in mouse myeloma cell line (NSO) was obtained from R & D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, United States) and used throughout the experiment. Its homopentameric structure consists of three non-covalent and two covalently bonded subunits. Monoclonal anti-rat CRP antibodies generated from hybridomas derived from fusion of mouse myeloma with purified, B-cells from mice immunized with recombinant rat CRP obtained from NSO-derived were also obtained from the above R & D Systems Inc. . Glass slides were obtained from Coring Inc. (Kennebunk, ME, United States).
  • Aqueous biotylation reagent (sulfosuccinimidyl-6- (biothiamidido) hexanoate (sulfo-NHS-LC-biotin) was purchased from Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, United States).
  • Fixing the antigen to the slide was prepared by the following procedure.
  • FIG. 5 a, b and c fluorescence images
  • the immobilized antigen solution was prepared by dissolving C-reactive protein at a concentration of 0.1 mg / ml in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4). Place Petri dishes containing glutaraldehyde-activated slides on a grid spotting guide, and place 20 ⁇ l of the prepared antigen solution on the slide corresponding to the dropping point on the spotting guide. After the lid was capped and reacted for 1 hour to fix the antigen, the front and rear surfaces of the slide were washed three times with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) and immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute.
  • 50 mM phosphate buffer solution pH 7.4
  • the slide was placed in a dish and the lid was covered for 1 hour.
  • the slides were washed three times in the front and the back with 50mM phosphate buffer (pH 7.4), immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute, placed on a Kimwipe, dried at room temperature for 30 minutes, and photographed for fluorescence imaging. No inhibition spots were also found on the surface of the BSA blocking slide after antigen immobilization (FIG. 5E).
  • Fixing the antigen to the slide was prepared by the following procedure. That is, the surface was immersed for 30 minutes in a solution of concentrated hydrochloric acid (35%) and methanol (70%) in a volume ratio of 1: 1 for surface cleaning, and then washed the slide three times with distilled water. After immersing in concentrated sulfuric acid for 30 minutes, the front and rear sides of the slides were washed three times with distilled water, the slides were washed with boiling distilled water, and placed on a Kimwipers and dried at room temperature for 30 minutes.
  • GMBS GMBS phosphate buffer
  • DMF N, N-Dimethylformamide, chromosllvr ® Plus, St. Louis, MO, United States, HPLC ⁇ 99.9%
  • 2 mM GMBS solution was prepared by adding thereto.
  • the silanized slides were placed in a Petri dish containing 2 mM GMBS solution and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the front and rear surfaces of the slides were washed three times with distilled water and 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) and dried at room temperature for 30 minutes in Kimwipes.
  • the immobilized antigen solution was prepared by dissolving C-reactive protein at a concentration of 0.1 mg / ml in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4). Place petri dishes containing GMBS activation slides on the spotting guides, and add 20 ⁇ l of the antigen solution previously prepared to the slide site corresponding to the dropping point on the spotting guide, cover the lid, and react for 1 hour to immobilize the antigen. It was. The slides were washed three times in front of the slides with a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) and immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute.
  • a 50 mM phosphate buffer solution pH 7.4
  • Fluorescence images were taken on slides subjected to surface cleaning, silanization, activation, antigen immobilization and BSA blocking, which are the stages of the antigen immobilization process on the MTS-GMBS treatment slide. , Volume ratio) No inhibition spot was detected on the slide surface except for the slide before treatment.
  • SA-maleimide solution was prepared by dissolving 0.25 mg of SA-maleimide and 5 ml of 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) in a 25 ml cap tube. 1 ml of the thiol-modified FSNP solution was added thereto, followed by reaction at room temperature for 2 hours while stirring was continued at a low speed of 100 rpm. The precipitate was taken by centrifugation at 10000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. The precipitate taken in the above step was washed three times with 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4), and after each washing, the precipitate was obtained by centrifugation under the same conditions as above.
  • the precipitate washed in this step was resuspended in 2 ml of 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4). This was wrapped in aluminum foil in a cap tube and refrigerated to react with the biotinylated antibody described below.
  • the reaction mixture was placed in a Slide-A-lyzer kit (Pierce Biotechnology, Inc), and then dialyzed overnight with 0.1 M phosphate buffered saline (pH 7.2) to remove the unreacted reagent, and the contents of the dialysis membrane were recovered.
  • Biotinylated antibodies were prepared by adjusting the total volume to 1 ml using saline.
  • the Petri dishes containing the slides as biotransducers immobilizing the C-reactive protein as an antigen and minimizing non-selective protein adsorption by the BSA blocking process according to Examples 1 and 2 above were placed on a lattice spotting guide. Place it on the slide where the antigen on the slide is immobilized and mix as above and let stand for 1 hour at room temperature. Accurately add 20 ⁇ l of the mixture of the protein to be analyzed and the labeled antibody as described above, and close the lid. The reaction was carried out at room temperature for 2 hours to perform an indirect competition reaction between the antibody labeled with FSNP and the antigen immobilized on the slide and the protein to be analyzed. After the reaction, the unreacted antibody and antigen were washed three times before and after the slide using distilled water, and then, the slide was immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute and removed.
  • Example 7 The slide of Example 7 subjected to indirect competition was placed in an incubator and dried. The dried slides were analyzed by fluorescence microscopy to measure fluorescence intensity and number of fluorescence particles.
  • FIG. 6 shows a device for fluorescence analysis, and the fluorescence spots of the FSNP-labeled antibody bound to the slide surface subjected to indirect competition were confirmed by taking fluorescence image photographs (FIG. 5 f).
  • Figure 7 shows the calibration curve prepared by measuring the relative fluorescence from the concentration-dependent fluorescence image of the C-reactive protein using the FSNP-labeled antibody.
  • the degree of fluorescence was low due to the decrease in the degree of binding to the labeled antibody and the linearity in the concentration range of very low C-reactive protein.
  • the limit of detection for CRP measurement by immunofluorescent slide was 0.1 ⁇ 1.0 ng / ml. The sensitivity was very high.
  • An immunofluorescent slide was prepared by modifying the slide surface with maleimidobutyryloxy succinimide ester and containing 1-100 ⁇ l of C-reactive protein at a concentration of 0.01-0.5 mg / ml.
  • C-reactive protein which is known as one of the major biomarkers for coronary artery disease, hypertension and inflammation, can be measured at nanomolar levels by coating a slide on a slide and reacting an antibody bound with fluorescent nanoprobes.
  • a slide for an immunosensor that can easily measure the biomarker, an indicator of food functionality in vivo, with high sensitivity.
  • the present invention in addition to the C-reactive protein in the future ultra-high sensitivity for biomarkers present in various concentration ranges in the blood of experimental animals such as low density lipoprotein (LDL), fibrinogen, angiotensin II (angiotensin II) Underlying techniques for evaluating food functionality required for high-speed simultaneous measurements can be established.
  • LDL low density lipoprotein
  • fibrinogen fibrinogen
  • angiotensin II angiotensin II

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명에 의하여, C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 스트렙트아비딘과 혼합하여 형광나노입자로 표지시키는 단계, 상기 항체를 혼합경쟁적으로 면역반응시키는 단계, 형광카메라로 분석하는 단계에 있어서, 상기 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정화하기 위하여, 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 제조하는 단계, 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 수화하는 단계, 글루타르 알데히드 용액을 사용하여 상기 개질된 슬라이드를 활성화시키는 단계, 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01-0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하는 단계, 스포팅 가이드 상에 상기 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 상기 제조한 항원용액을 1-100㎕ 적하점에 스포팅하는 단계, 및 상기 단계에 의하여 준비된 슬라이드를 1-6시간 반응시켜 항원을 고정화하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 이에 의하여 제조되는 면역형광 슬라이드가 개시된다.

Description

항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
본 발명은 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 스트립트아비딘과 혼합하여 형광나노입자로 표지시키는 단계, 상기 항체를 혼합경쟁적으로 면역반응시키는 단계, 형광카메라로 분석하는 단계로 이루어지는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드에 관한 것이다.
바이오칩(Biochip)은, 다양한 종류의 프로브를 단위 면적의 고체상 지지체의 표면에 고정화한 것으로, 이러한 바이오칩을 이용하면 소량의 시료로 질병의 진단, 고효율 스크리닝(High Throughput Screening; HTS), 효소활성측정 등의 실험을 대규모로 손쉽게 실시할 수 있다.
프로브를 슬라이드나 슬라이드에 고정시키는 방법의 대부분은 코팅물질로 표면을 전처리한 유리 슬라이드 상에 프로브를 고정시킴으로써 제작된다. 이를 위해 다양한 표면화학물질이 제안되었으며, 대표적으로 자기조립 단분자층(Self-assembled monolayer)등의 기술이 적용된다(대한민국 특허공개 제 2003-0038932호).
이에 대해, 고정화되는 프로브의 양을 증대시키고 프로브의 활성을 유지하기 위한 시도로서 3 차원 고정화 방법이 개발되었다(Gill 및 Ballesteros, Trends in Biotechnology 18:282, 2000). 예컨대, 패커드 바이오사이언스(Packard Bioscience)의 히드로겔®(Hydrogel) 코팅 슬라이드, 바이오셉트사의 폴리에틸렌글리콜계 히드로겔, 및 LG화학의 솔겔 등을 이용한 3 차원의 고정화 방법을 예로 들 수 있다.
면역센서용 슬라이드로서는 유리, 실리콘, 히드로겔, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인으로 구성된 그룹에서 선택된다.
현재, 대응되는 항원 또는 항체의 특이적 반응성에 기초하여, 항체 또는 항원이 기재 상에 고정화된 항체 또는 항원 프로브-플레이트가, 검출하기 위해 널리 사용되고 있다. 이러한 사용을 위한 세 종류의 대표적 키트는, 래피트(rapid) 테스트 키트, 루틴(routine) 테스트 키트 및 바이오칩 키트이다.
이들은 고정화된 항체 프로브 또는 항원 프로브에 대응하는 타겟 항원 또는 타겟 항체를 검출하기 위해 사용된다.
일부 경우에는 여러 반응기들이 한 프로브-플레이트로 조합되는데, 상기 반응기들 각각은 항원 또는 항체를 검출하는 테스트 스트립을 각각 포함한다
한편, 최근 건강기능식품법이 발효되면서 국내에서도 천연물을 기반으로 식품소재 및 가공식품을 제조하고 이를 건강기능식품으로 인정받을 수 있는 문호가 개방되었다. 그러나 이를 위해서는 건강기능식품의 기능성, 예를 들면 심혈관계 질환예방, 노화억제, 암 예방, 비만방지, 면역조절, 위·장관 질환예방 등의 건강기능식품의 기능성을 과학적으로 입증하는 자료를 제시해야 하므로 식품기능성 평가의 중요성은 점점 증대되고 있고 그 결과로서 기능성평가 분야의 사업화 가능성도 매우 높은 실정이다.
식품의 기능성평가는 위의 6대 기능성 유형을 중심으로 생체외(in vitro) 기능성 평가, 쥐(rat)와 같은 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 기능성 평가 및 임상실험을 망라하고 있는데, 식품산업의 측면에서 볼 때 식품소재 및 기능성식품의 기능성평가를 효율적이고 신속하게 행하기 위한 실험동물을 이용한 생체내 기능성 검색기술 개발의 필요성이 증대되고 있다.
기능성 식품으로서 인정되기 위해서는 심혈관계 기능성과 같은 목적하는 기능성이 과학적으로 입증되어야 하는데, 식품에 대한 기능성의 평가의 중요성은 아무리 강조해도 지나침이 없다(Kim 등, 직접결합 수정진동자 면역센서에 의한 C-reactive protein 검출, 한국생물공학회지, Vol. 22, p. 443, 2007). 임상실험에 앞서서 전 단계로서 행해지는 실험동물을 이용한 생체내 기능성 평가는 종래로부터 체중, 혈압, 및 기관 형태와 같은 신체적 요소의 변화를 측정하는 것이었다. 그러나, 이러한 방법은 불균일한 결과를 초래할 뿐만 아니라 평가 프로토콜의 다양성,숙련된 전문가 및 값 비싼 분석기구 등이 필요하다는 단점이 있다. 생체내 식품 기능성에 대한 균일한 평가방법은 래트와 같은 실험동물 체내에서 특정 질환이나 대사증상과 관련된 특정 바이오마커 단백질의 상승 및 하강을 측정하는 것이다. 이 경우는 기능성 식품으로 인정받고자 하는 식품을 포함하는 것을 실험동물에 투여하게 된다.
대한민국 등록특허 10-921237호에서는 식품소재 및 기능성식품의 심혈관계 기능성을 신속하게 검색할 수 있는 생체내 기능성 평가를 위한 새로운 방법의 하나로서, 관상동맥질환, 고혈압 등에 대한 주요 바이오마커(biomarker)의 하나로 알려지고 있으며 포유동물의 간에서 인터류킨-6(interleukin- 6) 및 인터류킨-1베타(interleukin-1β)에 의한 유도자극으로 합성되는 분자질량 118 킬로달톤(killodalton, kDa) 정도의 펜타머 단백질인 C-반응성 단백(C-reactive protein)(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19, p. 1193, 2004; Clinical Chemistry, Vol. 47, p. 403, 2001; New England Journal of Medicine, Vol. 340, p. 448, 1999; Biochemical Journal, Vol. 327, p. 425, 1997)을 수정진동자 면역센서(quartz crystal microbalance immunosensor)를 이용하여 고감도로 검출하는 측정방법에 대하여 기술하였다.
상기의 방법은 C-반응성 단백을 측정하기 위한 기존방법의 하나인 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(American Journal of Cardiology, Vol. 1, p. 155, 2005; American Journal of Veterinary Research, Vol. 1, p. 62, 2005; Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 18, p. 280, 2004)에 비하여 착색물질에 의한 측정저해를 받지 않으면서도 간편하게 사용할 수 있는 장점이 있고 측정감도도 기존의 다른 센서측정법에 비하여 우수하거나 비슷한 수준으로 나타났다(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, p. 973, 2007; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1987, 2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1631, 2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1141, 2006; Analytical Biochemistry, Vol. 328, p. 210, 2004).
최근에 이르러 바이오센서를 이용한 센서계측에 금속 콜로이드(metallic colloid), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 형광 실리카 나노입자(fluorescent silica nanoparticle), 반도체 양자점(semiconductor quantum dot)과 같은 나노소재를 이용하는 빈도가 증가하고 있으며 그 적용을 통하여 센서신호의 감응성, 안정성, 선택성 등을 증진한 연구결과가 다수 보고되고 있다(Analytical Chemistry, Vol. 79, p. 630-707, 2007; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1900, 2006; Langmuir, Vol. 22, p. 4357, 2006; Nano Letters, Vol. 5, p. 113, 2005; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 20, p. 2454, 2005; Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 100, p. 4984, 2003; Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 274, p. 817, 2000).
바이오센서에 의하여 실험동물의 혈액 중에 존재하는 바이오마커로서의 C-반응성 단백을 측정하여 식품의 생체내 심혈관계 기능성을 평가하고자 할 때, 센서 감도의 증대는 여전히 중요하며 또한 간편하게 측정할 필요성이 끊임없이 제기되어 왔다.
본 발명은 바이오칩의 제작 및 측정에 바이오칩 어레이어나 마이크로-어레이 스캐너와 같이 복잡한 장치의 사용 없이 사용자가 마이크로 디스펜싱 피펫을 사용하여 슬라이드 상에 일정부피의 항원을 고정화하여 분석하고자 하는 단백질과 항체 및 형광나노입자의 접합체간의 면역반응 혹은 고정화된 항원과 형광성 나노프루브 및 특정 표적분자의 혼합물의 면역반응을 면역형광 슬라이드 상의 항원 코팅부위에서 행한 후 면역반응에 의하여 특이적으로 슬라이드 표면에 결합된 나노프루브를 형광현미경에 의하여 간편하게 형광강도나 형광입자 수를 측정하고 그 결과로서 생체지표와 같은 특정 표적분자의 농도를 알 수 있게 하는 센서의 감도가 높은 1회용 면역센서용 슬라이드를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 분석하고자 하는 단백질(항원)을 슬라이드에 고정시키고, 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지시키고, 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 세척시키고, 상기 슬라이드를 인큐베이터에 위치시켜 건조한 후, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하는 단계로 이루어진다.
시료를 분석하기 위하여 본 발명에서는 간접경합방법(indirect-competitive assay format)을 사용하는 것을 보여주고 있지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 직접경합방법(direct-competitive assay format)이나 샌드위치방법(sandwich assay format)에 의하여 행할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용되는 면역센서용 슬라이드는 유리, 실리콘, 히드로겔, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인으로 구성된 그룹에서 선택되어지며 20~40X70~80mm의 가로, 세로 규격을 가진다.
본 발명에서는 분석하고자 하는 시료로서 C-반응성 단백(이하 "CRP"라 칭한다)을 사용하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 방법을 기타의 식품기능성 바이오마커인 엘디엘(LDL), 피브리노겐(fibrinogen), 안기오텐신 II(angiotensin II), 카디악 트로포닌(cardiac troponin) 등의 실혈관계 바이오마커와 노화억제, 암 예방, 비만 방지, 면역조절, 위ㆍ장관 질환예방 등과 관련된 바이오마커 단백질을 사용할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
C-반응성 단백 항체는 쥐(rat), 마우스(mouse), 토끼, 원숭이, 사람 등 포유동물 유래의 C-반응성 단백을 사용하여 제조한 항체 중에서 선택된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.
검체에서 채취되는 시료는 C-반응성 단백이 반응완충용액에 용해된 표준용액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 체액, 간 등의 조직추출물 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
항원이 고정화된 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹(blocking) 하기 위하여 사용되는 용액으로는 1-5%의 BSA(Bovine serum albumin), RSA(Rat serum albumin), HSA(Human serum albumin), MSA(Mouse serum almumin), GSA(goat serum albumin) 용액 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 각 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 슬라이드에 항원인 C-반응성 단백의 고정화는 하기의 두 가지 방법중 하나를 선택하여 실시할 수 있다.
첫째, 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane, 이하 "APTMS"라 칭한다)을 이용하여 항원을 고정화하는 방법이다. 이 방법을 이용하기 위하여 먼저, APTMS로 개질된 슬라이드를 제조한다. 상기 개질을 위하여 피란하 용액(Piranha solution, H2SO4:H2O2 = 2:1~4:1, 부피비율)에 슬라이드를 5~15분 침지한 후 꺼내 증류수로 헹군 다음 증류수내에서 3~10분간 초음파처리 하고 85~95℃의 열수로 30~90분간 수화시켜 세척한 후 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20~120분간 실온건조한다. 표면세척을 행한 준비된 슬라이드를 아세톤에 5~15% 농도로 용해된 APTMS 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 30~90분간 반응시킨다. 아세톤, 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8), 증류수로 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회씩 순차적으로 헹구고 증류수가 담긴 비커에서 1~60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에서 20~120분간 실온건조한 후 30~150℃ 대류오븐에서 3~7시간 열처리한 후 방냉하고 사용할 때까지 데시게이터에 건조한 상태로 보관한다.
APTMS로 개질된 슬라이드를 증류수에 10~20분간 침지하여 수화시킨다. 침지된 슬라이드를 꺼내서 글루타르알데히드 1~4% 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어서 30~90분간 반응시켜 슬라이드 표면에 단백질이 결합할 수 있도록 활성화시킨다. 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 활성화된 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한다. 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20~120분간 실온건조한다.
상기에서 사용되는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)는 46~49㎖의 증류수에 30-70% 농도의 글루타르 알데히드 1~4㎖를 가하여 30~70㎖로 정용하여 제조한다.
분석하고자 하는 단백질, 예컨대, C-반응성 단백을 고정화하기 위하여 먼저 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01~0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조한다. 격자로 된 스포팅 가이드(Spotting guide)상에 글루타르알데히드 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 1~100㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅한 후 뚜껑을 덮고 1~6시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시킨다. 항원의 고정화를 행한 글루타르알데이드 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹하기 위하여 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 용해된 1~5% BSA 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1~5시간 반응시키며, 반응이 끝난 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 BSA 블로킹된 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1-60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20-120분간 실온건조한다.
둘째, MPTMS-GMBS(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma- maleimidobutyryloxy succinimide ester)방법으로 고정화하는 방법을 사용한다. 먼저 표면세척을 위하여 슬라이드를 진한염산(18-36%)과 메탄올(50-100%)의 혼합용액(HCl:MtOH = 1:1~1:2, 부피비율)에 15~45분 침지시킨 후 증류수로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 헹군다. 85~95℃의 증류수로 슬라이드를 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 실온에서 20~120분간 건조한다.
이렇게 준비된 슬라이드를 실란화시키기 위하여 1-3%의 톨루엔, 디메틸 포름아미드, 및 아세톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유기용매 용액에 용해된 MPTMS 용액 50~500㎖를 준비한다. 상기 용액이 담긴 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 상기의 MPTMS 용액의 조제에 사용된 동일한 유기용매로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 20~120분간 실온건조한다.
슬라이드 표면을 활성화시키기 위하여 1~3mM GMBS용액을 다음과 같이 제조한다. GMBS시료 14~42㎎을 100㎕의 DMF(N,N-Dimethylformamide; 시그마알드리치사, 미국)에 녹인 후 에탄올 49.9㎖를 가한다. 상기 실란화 단계를 거친 슬라이드를 GMBS용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 30~90분간 반응시킨다. 증류수와 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한다. 그 후 슬라이드를 킴와이프스에 놓고 20~120분간 실온건조한다.
CRP 항원의 고정화는 다음과 같이 실시한다. 먼저 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01~0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화 항원용액을 제조한다. 상기의 스포팅 가이드 위로 GMBS 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 1~100㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅한 후 뚜껑을 덮고 1~6시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 헹구고 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시킨다. 분석의 정확도를 높이기 위하여 1~5% BSA용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1~5시간 반응시킨다. 상기와 같은 인산버퍼용액을 사용하여 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한다. 증류수가 담긴 비커에 1~60분간 침지시킨 후, 킴와이프스 위에 슬라이드를 위치시키고 20~120분간 실온건조한다.
상기 두 가지 방법을 개략적으로 나타낸 것을 도 1로서 나타내었다
본 발명의 면역센서용 슬라이드를 이용하여 특정 단백질을 분석함에 있어서는 슬라이드에 고정되는 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 표지시킨다. 상기 항체를 표지시키는 것은 민감성과 재현성이 높은 형광염색방법을 사용하며, 이를 위하여 본 발명에서는 형광 실리카 나노입자(Fluorescent silica nanoparticle, 이하 "FSNP"라 칭한다)를 사용한다.
형광 실리카 나노입자(FSNP)를 제조하는 방법에 대하여 개략적으로 기술한다. 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 표지하는데 사용되는 FSNP는 유기형광색소를 실리카 구조내로 포함시키는 포괄법(Dye entrapment), 활성화 유기형광색소를 아미노실란(Amino silane) 화합물과 공유결합 시킨 후 이를 실리카 구조내로 포합시키는 코어-쉘법(Core shell method), 유기형광색소를 실리카 구조내로 포합시켜 형성된 입자를 유기실란 (Organosilane) 화합물과 반응시켜 관능기를 도입하여 기능화하는 역 코어-쉘법(Inverted core shell method) 등에 의하여 제조된 것을 사용할 수 있다. 이 때 유기형광색소로는 디클로로트리스(1,10-페난트롤린) 루테니움(II)일수화물(Dichlorotris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II)·hydrate), 플루오레신(Fluorescein), 로다민 B(Rhodamine B), 5(6)-카르복시테트라메틸로다민(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine) 등을 사용할 수 있고, 활성화 유기형광색소로는 플루오레신 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate), 5(6)-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester), 테트라메틸로다민 5-이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine 5-isothiocyanate), 비스(2,2'-비피리딘)-4'-메틸-4-카르복시비피리딘-루테니움 N-숙신이미딜 에스테르 헥사 플루오로포스페이트 (Bis(2,2'-bipyridine)-4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis(hexafluorophosphate)), 비스(2,2'-비피리딘)- 4,4'-디카르복시비피리딘-루테니움 디(N-숙신이미딜 에스테르)비스(헥사플루오로포스페이트)(Bis(2,2'-bipyridine)-4,4'-dicarboxybipyridine ruthenium di(N-Succinimidyl ester)bis(hexafluorophosphate)) 등을 사용할 수 있으며, 아미노실란 화합물로는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-Aminopropyl)triethoxysilane) 등을 사용할 수 있으며, 유기실란 화합물로는 카르복실레이트(Carboxylate), 아민(Amine), 아민/포스포네이트(Amine/phosphonate), 폴리(에틸렌글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 옥타데실(Octadecyl), 카르복실레이트/옥타데실(Carboxylate/ octadecyl) 관능기를 지닌 화합물을 사용할 수 있다.
FSNP를 사용하여 항체를 표지시키는 방법을 설명한다. 우선, FSNP를 비오틴(Biotin)과 특이적으로 결합하는 스트렙트아비딘(Streptavidin, 이하 "SA"라 칭한다)으로 개질하는 것이 필요한데, 이는 이하에서 설명하는 SA가 부착된 FSNP를 비오티닐화된 항체와 결합시키기 위함이다. FSNP를 SA로 개질하기 위하여 3-머캅토프로필트리메톡시 실란 ((3-Mercaptopropyl)trimethoxy silane, 이하 "MPTMS"라 칭한다)과 반응시켜 티올-개질된 FSNP를 먼저 제조한다. 10~70㎖ 용량의 캡 튜브에 상기의 FSNP 1~5㎎과 에탄올, 메탄올, 프로판올 등의 알코올 5~15㎖를 가하여 잘 흔들어 준 후 FSNP를 알코올에 완전히 용해시키기 위하여 10~30분간 초음파처리 한다. 이 후 캡 튜브에 MPTMS 30-70~200㎕를 첨가하고 실온에서 30-200rpm의 저속으로 교반하면서 2~6시간 반응시킨다. 반응혼합물을 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 반응에 사용된 동일한 알코올을 사용하여 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻는다. 튜브의 캡을 분리하고 알루미늄호일을 살짝 덮어 실온건조한다. 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 2~6㎖에 재용해하여 티올-개질된 FSNP 용액을 제조한다.
티올-개질된 FSNP에 말레이미드 활성화된(Maleimide-activated) SA를 부가하여 SA가 부착된 FSNP를 제조한다. 보다 구체적으로, 10-70㎖ 용량의 캡 튜브에 SA-말레이미드 0.1~0.5㎎과 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 3~7㎖를 가하여 용해시켜 SA-말레이미드 용액을 제조한다. 여기에 상기에서 제조한 티올-개질된 FSNP용액 0.5~2.0㎖를 가하여 30~200rpm의 저속으로 계속 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 침전물을 취한다. 상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻는다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 1~5㎖에 재현탁시킨다. 이를 캡 튜브에 담아 알루미늄호일을 감싼 후 냉장보관하여 이하에서 설명하는 비오티닐화된 항체와 반응시킨다.
C-반응성 단백 항체의 비오티닐화는 다음 두 가지 방법 중의 어느 하나를 이용하여 실시 할 수 있다.
첫 번째 방법으로서, C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액(Carbonate- bicarbonate buffer)을 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 탄산완충용액을 얻는 단계, 유기용매인 디메틸 포름아미드(Dimethyl formamide)에 용해한 비오틴화 시약인 비오틴아미도헥사노익산 N-히드록시석신이미드 에스테르(Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 탄산완충용액과 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 염화나트륨 용액에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어지는 방법을 들 수 있다.
보다 구체적으로, C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액을 가하여 C-반응성 단백 항체의 농도가 1.0~3.0㎎/㎖인 탄산완충용액을 얻는 단계, 디메틸 포름아미드에 1~5㎎/㎖ 농도로 용해한 NHS-LC-비오틴 용액 30~100㎕를 상기 단계의 탄산완충용액 25~75㎕와 1 내지 5시간 얼음물 하에서 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액 75~175㎕를 0.1~0.3M 염화나트륨 용액에서 하룻밤 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어진다.
두 번째 방법으로서, C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 인산완충식염수를 얻는 단계, 재증류수에 용해한 수용성 비오틴화 시약인 설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 인산완충식염수와 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 인산완충식염수에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어지는 방법을 들 수 있다.
보다 구체적으로, C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체의 농도가 0.5~3.0㎎/㎖인 인산완충식염수를 얻는 단계, 재증류수에 2~20mM 농도로 용해한 설포-NHS-LC-비오틴 용액 5~20㎕를 상기 단계의 인산완충식염수 30~800㎕와 얼음물 하에서 1 내지 5시간 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액 55~820㎕를 0.05~0.25M 인산완충식염수에 대하여 하룻밤 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어진다.
다음 단계로서 나노물질이 부착된 항체를 제조한다. 상기에서 제조한 SA 개질된 FSNP와 비오틴화된 항체를 가하여 혼합하면 비오틴이 SA와 특이적으로 결합하기 때문에 형광물질로 표지된 항체가 제조된다.
보다 구체적으로, 상기에서 제조한 SA-개질된 FSNP 용액을 10~30분간 초음파처리 한 후 이 중 200~600㎕를 상기에서 제조한 0.05~0.25㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 1~3㎖에 가하여 30분 간격으로 30~200rpm의 저속으로 2~7분씩 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 취한다. 상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻는다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 0.4~1.2㎖에 재현탁시킨다.
본 발명의 CRP와 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지하는 개략적인 방법을 도 2로서 나타내었다.
본 발명의 면역센서용 슬라이드를 이용하여 특정 단백질을 분석함에 있어서 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질을 상기와 같이 표지된 항체와 혼합시킨다.
보다 구체적으로, 에펜도르프 튜브에 있는 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 사용하여 단계별로 희석하여 제조한 각각의 농도별 C-반응성 단백 시료용액에 비오틴과 SA의 특이적 결합에 의하여 상기와 같이 제조한, 나노물질로서 FSNP가 부착된 C-반응성 단백 항체용액을 동량 가하여 혼합시킨 후 실온에서 5~300분간 정치시킨다.
다음 단계로 상기와 같이 혼합된 혼합물을 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시킨다.
보다 구체적으로, 상기의 글루타르알데히드 공정이나 MPTMS-GMBS 공정에 의하여 항원인 C-반응성 단백을 고정화하고 BSA(bovine serum albumin) 블로킹 공정에 의하여 비선택적인 단백질 흡착을 최소화한 바이오트랜스듀서(bio-transducer)로서의 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 격자로 된 스포팅 가이드 위에 올려놓고 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 상기와 같이 혼합하여 실온에서 5~300분간 정치시킨 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질과 상기와 같이 표지된 항체의 혼합물 1~100㎕를 정확히 스포팅 한 후 뚜껑을 덮고 실온에서 0.5~16시간 반응시켜 FSNP로 표지된 항체 및 슬라이드상에 고정된 항원과 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질간의 간접경합반응을 행한다. 반응이 끝난 후 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시켜 제거한다.
본 발명 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 간접경합방식에 의하여 결합하는 방식을 설명하는 모양을 도 3에 나타내었으며, 검체에서 채취한 C-반응성 단백 대신 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 상기와 같이 표지된 항체와 혼합한 후 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 적하하여 경시적인 항원·항체반응을 행하였을 때 슬라이드에 결합된 형광입자수의 변화를 도 4에 나타내었다.
상기 슬라이드를 인큐베이터에 넣고 20~120분간 건조한다.
형광현미경을 사용하여 형광강도 및 형광입자 수를 측정한다. 검체 중의 CRP 농도가 높으면 형광표지된 항체와 반응을 많이 하기 때문에 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 결합하는 수가 적어 형광강도와 형광입자 수가 줄기 때문에 형광이 낮게 나타난다. 이와 같이 슬라이드에 고정된 항원과 검체 중의 항원은 형광표지된 항체와 경쟁적인 상호작용을 통하여 형광도가 다르게 나타나기 때문에 CRP를 단시간내에 간단히 측정할 수 있게 된다.
도 1은 C-반응성 단백을 항원에 고정시키는 두 가지 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 CRP와 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 간접경합방식에 의하여 결합하는 방식을 설명하는 도이다.
도 4는 검체에서 채취한 C-반응성 단백 대신 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 본 발명에 의한 표지된 항체와 혼합한 후 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 적하하여 경시적인 항원·항체반응을 행하였을 때 슬라이드에 결합된 형광입자수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5의 a, b, c는 피란하용액 처리전 슬라이드의 표면에 존재하는 불순물 등 오염물질의 저해반점이 피란하처리를 통하여 제거됨을 나타내는 도로서, APTMS에 의한 실란화을 거친 후에도 형광영상상의 저해반점이 관찰되지 않음을 나타내는 도이다. 도 5의 d는 글루타르알데히드 2.5% 용액으로 처리한 기판을 처리하여 형광영상 사진을 찍어 저해반점이 발견되지 않음을 나타낸 도이다. 도 5의 e는 항원 고정화 후 BSA 블로킹 슬라이드 표면에서 저해반점은 발견되지 않음을 나타낸 도이다. 도 5의 f는 본 발명의 방법에 의하여 간접경합반응을 행한 슬라이드 표면에 결합한 형광 실리카 나노입자 표지항체의 형광반점을 나타낸 도이다.
도 6은 형광분석을 위한 장치를 나타낸 그림이다.
도 7은 항원고정화 면역형광 슬라이드 및 FSNP 표지항체 기반 C-반응성 단백의 검량선을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 설명한다. 그러나 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되지 아니한다.
본 실험에서 사용되는 재료는 다음과 같다:
마우스 골수종 세포주(NSO)에서 발현된 재조합 히스티딘 태그된 래트 CRP(순수한 상태)는 R&D Systems, Inc.(미니아폴리스, MN, 미합중국)에서 입수하여 본 실험 전 과정에서 사용하였다. 이의 호모펜타메릭(homopentameric)구조는 세 개의 비공유 및 두 개의 공유결합된 서브유니트로 이루어져 있다. 마우스 골수종과 정제된, NSO-유래로부터 얻어진 재조합 래트 CRP로 면역된 마우스로부터 얻은 B셀을 융합한 것으로부터 나온 하이브리도마로부터 생성된 단일클론 항-래트 CRP항체도 상기 R&D Systems Inc.로부터 입수하였다. 글라스 슬라이드는 Coring Inc.(Kennebunk, ME, 미합중국)에서 입수하였다. 수용성 비오틸화 시약(설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(설포-NHS-LC-비오틴)은 Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, IL, 미합중국)으로부터 구입하였다. 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 글루타르알데히드 및 소 혈청 알부민(BSA)은 Sigma- Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, 미합중국)에서 입수하였다. 모든 다른 화합물들은 다양한 공급자로부터 보증된 것들이며 실험의 전 과정에서 이중 증류수를 사용하였다.
실시예 1: APTMS-GA 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화
항원을 슬라이드에 고정하는 것은 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비하였다. 즉, 표면클리닝을 위하여 슬라이드를 피란하 용액(H2SO4:H2O2 = 3:1, 부피비율)에 10분간 침지한 후, 증류수로 헹군 다음 증류수내에서 5분간 초음파처리 하고 90℃의 열수로 1시간 수화시켜 세척한 후 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 30분간 실온건조하였다.
항원의 고정화에 필요한 반응기인 아미노기(-NH2)를 슬라이드 표면에 도입하기 위한 실란화를 행하기 위하여 표면세척을 행한 준비된 슬라이드를 아세톤에 10% 농도로 용해된 APTMS 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 아세톤, 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4), 증류수로 슬라이드 앞, 뒤를 3회씩 순차적으로 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에서 30분간 실온건조한 후 120℃ 대류오븐에서 5시간 열처리한 후 방냉하고 형광영상 사진을 찍었다(도 5의 a, b, c). 도 5의 a, b, c에서 볼 수 있는 것처럼 피란하처리 전 슬라이드의 표면에 존재하는 불순물 등 오염물질의 저해반점이 피란하처리를 통하여 제거됨을 알 수 있었고 APTMS에 의한 실란화를 거친 후에도 형광영상상의 저해반점이 관찰되지 않음을 알 수 있었다.
APTMS로 개질된 슬라이드를 활성화시키기 위하여 증류수에 15분간 침지하여 수화시켰다. 침지된 슬라이드를 꺼내서 글루타르알데히드 2.5% 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어서 1시간 반응시켜 슬라이드 표면에 단백질이 결합할 수 있도록 활성화시켰다. 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 활성화된 슬라이드 앞, 뒤를 3회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1분간 침지시켰다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 30분간 실온건조하였으며, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 GA활성화 슬라이드 표면에서도 저해반점은 발견되지 않았다(도5의 d).
항원(CRP, C-반응성 단백)을 슬라이드상에 고정시키기 위하여 먼저 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 C-반응성 단백을 0.1㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하였다. 격자로 된 스포팅 가이드(Spotting guide)상에 글루타르알데히드 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 20㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅(적하, spotting)한 후 뚜껑을 덮고 1시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 항원의 고정화를 행한 글루타르 알데히드 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹(blocking)하기 위하여 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 용해된 1% BSA(bovine serum albumin) 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1시간 반응시켰다. 이 슬라이드를 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 앞, 뒤를 3회 세척하고, 증류수가 담긴 비커에 1분간 침지시키고, 킴와이프스 위에 위치시킨 후 30분간 실온건조하였으며, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 항원 고정화 후 BSA 블로킹 슬라이드 표면에서도 저해반점은 발견되지 않았다(도5의 e).
실시예 2: MTS-GMBS 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화
항원을 슬라이드에 고정하는 것은 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비하였다. 즉, 표면클리닝을 위하여 슬라이드를 진한염산(35%)과 메탄올(70%)이 1:1의 부피비율로 혼합된 용액에 30분간 침지한 후, 증류수로 슬라이드를 3회 세척하였다. 진한황산에 30분 침지한 후 증류수로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고, 끓는 증류수로 슬라이드를 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 실온에서 30분간 건조하였다.
항원의 고정화에 필요한 반응기인 티올기(-SH)를 슬라이드 표면에 도입하기 위한 실란화를 행하기 위하여 톨루엔 98㎖에 MPTMS ((3-Mercaptopropyl)trimethoxy silane) 2㎖을 첨가하여 2% MPTMS 용액을 제조하였다. 상기의 용액이 담긴 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이 후 톨루엔으로 슬라이드를 3회 세척한 후, 킴와이프스에 슬라이드를 위치시키고 30분간 실온에서 건조하였다.
MPTMS로 개질된 슬라이드를 활성화시키기 위하여 28㎎의 GMBS를 100㎕의 DMF(N,N-Dimethylformamide, chromosllvr®Plus, St. Louis, MO, 미합중국, HPLC≥99.9%)에 용해한 후 여기에 에탄올 49.9㎖를 가하여 2mM GMBS용액을 제조하였다. 실란화된 슬라이드를 2mM GMBS용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 증류수와 50mM 인산완충용액(pH 7.4)로 슬라이드의 앞, 뒤를 3회 세척하고 킴와이프스에서 30분간 실온건조하였다.
항원(CRP, C-반응성 단백)을 슬라이드상에 고정시키기 위하여 먼저 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 C-반응성 단백을 0.1㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하였다. 상기의 스포팅 가이드 위에 GMBS 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 20㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 적하한 후 뚜껑을 덮고 1시간 반응시켜 항원의 고정화를 행하였다. 이 슬라이드를 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 항원의 고정화를 행한 GMBS 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹하기 위하여 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 용해된 1% BSA 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1시간 반응시켰다. 이 슬라이드를 50mM 인산완충용액(pH 7.4)으로 앞, 뒤를 3회 세척하고, 증류수가 담긴 비커에 1분간 침지시키고, 킴와이프스 위에 위치시킨 후 30분간 실온건조시켰다.
MTS-GMBS 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화과정의 각 단계인 표면클리닝, 실란화, 활성화, 항원 고정화 및 BSA 블로킹을 행한 슬라이드에 대하여 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 진한염산과 메탄올 혼합용액(1:1, 부피비율) 처리전 슬라이드의 경우를 제외하고는 슬라이드 표면에서 센서계측을 저해하는 저해반점은 발견되지 않았다.
실시예 3: SA로 개질된 FSNP의 제조
25㎖ 용량의 캡 튜브에 상기의 FSNP 2㎎과 에탄올 10㎖를 가하여 잘 흔들어 준 후 FSNP를 에탄올에 완전히 용해시키기 위하여 15분간 초음파처리 하였다. 이 후 캡 튜브에 MPTMS 100㎕를 첨가하고 실온에서 100rpm으로 저속교반하면서 4시간 반응시켰다. 반응혼합물을 4℃에서 30분간 13000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 에탄올로 3회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 튜브의 캡을 분리하고 알루미늄호일을 살짝 덮어 실온건조시켰다. 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 4㎖에 재용해하여 티올-개질된 FSNP 용액을 제조하였다.
25㎖ 용량의 캡 튜브에 SA-말레이미드 0.25㎎과 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 5㎖를 가하여 용해시켜 SA-말레이미드 용액을 제조하였다. 여기에 상기의 티올-개질된 FSNP용액 1㎖를 가하여 100rpm의 저속으로 계속 저어주면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 4℃에서 20분간 10000rpm으로 원심분리하여 침전물을 취하였다. 상기 단계에서 취한 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 3회 세척하고, 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH7.4) 2㎖에 재현탁시켰다. 이를 캡 튜브에 담아 알루미늄호일을 감싼 후 냉장보관하여 이하에서 설명하는 비오티닐화된 항체와 반응시켰다.
실시예 4: 항체의 비오티닐화
냉장보관하는 수용성 비오틴화 시약인 설포석신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS- LC-비오틴) 1㎎ 바이알(vial)을 실험 당일 냉장고에서 꺼내 실온조건으로 옮겨주고 단일클론 항-래트 CRP항체 30-700㎍ 바이알에 0.1M 인산완충식염수(pH 7.2) 30-700㎕를 가하여 용해시켰다. 상기의 설포-NHS-LC-비오틴 1㎎ 바이알에 증류수 180㎕를 가하여 10mM 설포-NHS-LC-비오틴 용액을 제조한 후 이 중 6.67㎕를 상기의 항체용액에 가하여 비오틴과 항체의 분자비율을 20:1로 조정하였다. 반응혼합물이 담긴 바이알을 가볍게 흔들어 섞어준 후 에펜도르프 튜브 랙에 담아 얼음물에 넣어 2시간 반응시켰다. Slide-A-lyzer kit(Pierce Biotechnology, Inc)에 반응혼합물을 넣은 후 0.1M 인산완충식염수(pH 7.2)에 대하여 하룻밤 투석하여 미반응시약을 제거하고, 투석막내의 내용물을 회수한 후 동일한 인산완충식염수를 사용하여 총 부피를 1㎖로 조절하여 비오티닐화 항체를 제조하였다.
실시예 5: 나노물질이 부착된 항체의 제조
SA-개질된 FSNP 용액을 15분간 초음파처리 한 후 이 중 400㎕를 0.1㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 2㎖에 가하여 30분 간격으로 100rpm의 저속으로 5분씩 저어주면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 4℃에서 20분간 10000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 취하였다. 상기 단계에서 취한 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH7.4)으로 3회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 0.8㎖에 재현탁시켰다.
실시예 6: 검체용액과 표지항체의 혼합
에펜도르프 튜브에 있는 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)을 사용하여 단계별로 희석하여 제조한 각각의 농도별 C-반응성 단백 시료용액에 비오틴과 SA의 특이적 결합에 의하여 상기와 같이 제조한, 나노물질로서 FSNP가 부착된 C-반응성 단백 항체용액을 동량 가하여 혼합시킨 후 실온에서 1시간 정치시켰다.
실시예 7: 간접경합반응
상기의 실시예 1과 실시예 2에 의하여 항원인 C-반응성 단백을 고정화하고 BSA 블로킹 공정에 의하여 비선택적인 단백질 흡착을 최소화한 바이오트랜스듀서로서의 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 격자로 된 스포팅 가이드위에 올려놓고 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 상기와 같이 혼합하여 실온에서 1시간 정치시킨, 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질과 상기와 같이 표지된 항체의 혼합물 20㎕를 정확히 적하한 후 뚜껑을 덮고 실온에서 2시간 반응시켜 FSNP로 표지된 항체 및 슬라이드상에 고정된 항원과 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질간의 간접경합반응을 행하였다. 반응이 끝난 후 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 슬라이드 앞, 뒤를 3회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1분간 침지시켜 제거하였다.
실시예 8: 형광영상 분석
간접경합반응을 행한 실시예 7의 슬라이드를 인큐베이터에 넣고 건조하였다. 건조한 슬라이드를 형광현미경을 사용하여 형광영상 분석을 행하고 형광강도 및 형광입자 수를 측정하였다. 도 6은 형광분석을 위한 장치를 나타내고, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 간접경합반응을 행한 슬라이드 표면에 결합한 FSNP 표지항체의 형광반점을 확인할 수 있었다(도 5의 f). 도 7은 FSNP 표지항체를 이용한 C-반응성 단백의 농도 의존적 형광영상으로부터 상대형광도를 측정하여 작성한 검량선을 나타내는데, 검체 중의 CRP 농도가 증가하면 표지항체와의 반응정도가 높아지므로 슬라이드에 고정화된 항원과 표지항체와의 결합정도는 줄어들어 형광이 낮게 나타났으며, 매우 낮은 C-반응성 단백의 농도범위에서 직선성을 보여주어 본 면역형광 슬라이드에 의한 CRP 계측 시의 검출한계가 0.1~1.0 ng/㎖에 이를 정도로 감도가 매우 높음을 알 수 있었다.
실시예 9: 면역형광 슬라이드 제조
실시예 1내지 8의 방법을 적용하여 30X70mm의 가로, 세로 규격을 지닌 투명한 현미경용 슬라이드를 사용하여 1회용의 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필트리메톡시실란-N-감마 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르로 슬라이드 표면이 개질되고, 0.01-0.5㎎/㎖의 농도인 C-반응성 단백을 1-100㎕ 포함하는 면역형광 슬라이드를 제조하였다.
본 발명에 의하여 관상동맥질환, 고혈압 및 염증에 대한 주요한 바이오마커의 하나로 알려지고 있는 C-반응성 단백을 슬라이드에 코팅하고 형광성 나노프로브와 결합되어 있는 항체를 반응시킴으로서 나노몰 수준으로 측정할 수 있어 특정한 생체내 식품기능성의 지표인 해당 바이오마커를 고감도로 간편하게 측정할 수 있는 면역센서용 슬라이드가 제공된다.
본 발명은 C-반응성 단백 이외에 향후 엘디엘(low density lipoprotein, LDL), 피브리노겐(fibrinogen), 안기오텐신 II(angiotensin II) 등 실험동물의 혈액 등에 다양한 농도범위로 존재하는 바이오마커에 대한 초고감도 고속 동시측정에 필요한 식품기능성 평가와 관련된 기반기술을 확립할 수 있다.

Claims (8)

  1. C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 상기 C-반응성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광나노입자로 표지시키는 단계, 검체에서 채취한 상기 C-반응성 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하여 분석하는 단계에 있어서,
    상기 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정화하기 위하여,
    3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 제조하는 단계;
    3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 수화하는 단계;
    글루타르 알데히드 용액을 사용하여 상기 개질된 슬라이드를 활성화시키는 단계;
    30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 상기 분석하고자 하는 단백질을 0.01-0.5mg/ml 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하는 단계;
    스포팅 가이드 상에 상기 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 상기 제조한 항원용액을 1-100㎕ 적하점에 스포팅하는 단계; 및
    상기 단계에 의하여 준비된 슬라이드를 1-6시간 반응시켜 항원을 고정화함을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
  2. C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 상기 C-반응성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광나노입자로 표지시키는 단계, 검체에서 채취한 상기 C-반응성 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하여 분석하는 단계에 있어서,
    상기 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정화하기 위하여,
    슬라이드를 진한염산과 메탄올의 혼합용액(HCl:MtOH = 1:1~1:2, 부피비율)에 15~45분 침지시켜 세척하는 단계;
    1-3%의 톨루엔, 디메틸 포름아미드, 및 아세톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 유기용매 용액에 용해된 3-머캅토프로필트리메톡시실란을 준비하여 3-머캅토프로필트리메톡시실란 용액의 조제에 사용된 동일한 유기용매로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척하여 슬라이드를 실란화시키는 단계;
    1~3mM의 N-감마-말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르용액을 사용하여 슬라이드 표면을 활성화시키는 단계;
    30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01-0.5mg/ml 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하는 단계;
    스포팅 가이드 상에 상기 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 상기 제조한 항원용액을 1-100㎕ 적하점에 스포팅하는 단계; 및
    상기 단계에 의하여 준비된 슬라이드를 1-6시간 반응시켜 항원을 고정화함을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
  3. C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 상기 C-반응성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광나노입자로 표지시키는 단계, 검체에서 채취한 상기 C-반응성 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하여 분석하는 단계에 있어서,
    항체를 형광 나노입자로 표지시키기 위하여,
    3-머캅토프로필트리메톡시 실란을 형광 실리카 나노입자와 반응시켜 티올-개질된 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계;.
    상기 티올-개질된 형광 실리카 나노입자에 말레이미드 활성화된 스트렙트아비딘을 부가하여 스트렙트아비딘이 부착된 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계;
    C-반응성 단백 항체를 비오티닐화하는 단계; 및
    상기 스트렙트아비딘 개질된 형광 실리카 나노입자와 비오틴화된 항체를 가해서 혼합하여 형광물질로 표지된 항체를 제조하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서,상기 C-반응성 단백 항체를 비오티닐화하는 것은
    C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액을 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 탄산완충용액을 얻는 단계;
    디메틸 포름아미드(Dimethyl formamide)에 용해한 비오틴화 시약인 비오틴아미도헥사노익산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 탄산완충용액과 반응시키는 단계, 및 상기 단계에서 얻은 용액을 염화나트륨 용액에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
  5. 제 3항에 있어서,상기 C-반응성 단백 항체를 비오티닐화하는 것은
    C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 인산완충식염수를 얻는 단계;
    재증류수에 용해한 수용성 비오틴화 시약인 설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 인산완충식염수와 반응시키는 단계; 및 상기 단계에서 얻은 용액을 인산완충식염수에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
  6. C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 상기 C-반응성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광나노입자로 표지시키는 단계, 검체에서 채취한 상기 C-반응성 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하여 분석하는 단계에 있어서,
    항체를 형광 나노입자로 표지시키기 위하여,
    스트렙트아비딘-개질된 형광 실리카 나노입자 용액을 10~30분간 초음파처리 하는 단계;
    상기 단계에서 제조한 용액 200~600㎕를 0.05~0.25 ㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 1~3㎖에 가하여 30분 간격으로 30~200rpm의 저속으로 2~7분씩 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시키는 단계;
    3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 수득하는 단계;
    상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 수득하는 단계; 및
    상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 0.4~1.2㎖에 재현탁시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
  7. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필트리메톡시실란-N-
    감마 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르로 슬라이드 표면이 개질되고, 0.01-0.5㎎/㎖의 농도인 C-반응성 단백을 1-100㎕ 포함하는 면역형광 슬라이드.
  8. 제 8항에 의한 면역형광 슬라이드를 사용하여 검체중의 C-반응성 단백질을 측정하는 방법.
PCT/KR2011/001126 2010-02-23 2011-02-21 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드 Ceased WO2011105721A2 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11747611.9A EP2541248B1 (en) 2010-02-23 2011-02-21 Preparation method of antigen-immobilized immunofluorescence slide, and immunofluorescence slide prepared thereby
US13/261,437 US20130029428A1 (en) 2010-02-23 2011-02-21 Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and immuno-fluoroscence slide prepared thereby
CN201180019524XA CN102859359A (zh) 2010-02-23 2011-02-21 固定有抗原的免疫荧光载片的制备方法和由该方法制备的免疫荧光载片

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2010-0016157 2010-02-23
KR1020100016157A KR101140029B1 (ko) 2010-02-23 2010-02-23 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2011105721A2 true WO2011105721A2 (ko) 2011-09-01
WO2011105721A9 WO2011105721A9 (ko) 2012-04-19
WO2011105721A3 WO2011105721A3 (ko) 2012-06-07

Family

ID=44507349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2011/001126 Ceased WO2011105721A2 (ko) 2010-02-23 2011-02-21 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130029428A1 (ko)
EP (1) EP2541248B1 (ko)
KR (1) KR101140029B1 (ko)
CN (4) CN104316698A (ko)
WO (1) WO2011105721A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106093427A (zh) * 2016-06-02 2016-11-09 滨州医学院 同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的新方法

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011077838A1 (ja) * 2009-12-25 2011-06-30 コニカミノルタエムジー株式会社 蛍光物質内包シリカナノ粒子及び生体物質標識剤
AU2012284097B2 (en) 2011-07-18 2017-08-03 President And Fellows Of Harvard College Engineered microbe-targeting molecules and uses thereof
WO2014144325A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for improving detection and/or capture of a target entity
JP6649250B2 (ja) 2013-05-21 2020-02-19 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 操作されたヘム結合性構成物およびその使用
CN105723220A (zh) * 2013-11-12 2016-06-29 光州科学技术院 能够测定广泛浓度范围的生物物质浓度的免疫层析条状传感器
US10513546B2 (en) 2013-12-18 2019-12-24 President And Fellows Of Harvard College CRP capture/detection of gram positive bacteria
CN106105376A (zh) * 2013-12-30 2016-11-09 意大利电信股份公司 用于管理无线个人区域通信网络中的节点关联的方法
CN103941017B (zh) * 2014-03-18 2016-01-20 北京普恩光德生物科技开发有限公司 C反应蛋白检测试剂盒
EP3690443A1 (en) * 2014-12-12 2020-08-05 Konica Minolta, Inc. Diluent for fluorescent nano particles, kit for immunofluorescent staining which utilizes same, solution for immunofluorescent staining, immunofluorescent staining method, and gene staining method
CN104678105A (zh) * 2015-01-16 2015-06-03 镇江市第一人民医院 检测Cripto-1的酶联免疫试剂盒及其制备方法
WO2016145174A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Quantitation of functional groups on solid supports
TWI547693B (zh) * 2015-05-07 2016-09-01 希華晶體科技股份有限公司 感測方法及感測晶片
EP3331549B1 (en) 2015-08-06 2020-12-23 President and Fellows of Harvard College Improved microbe-binding molecules and uses thereof
CN106896094B (zh) * 2017-04-11 2023-07-14 中国农业科学院饲料研究所 一种同时检测cle、rac和sbl的方法及其专用纸芯片
CN109900895A (zh) * 2017-12-11 2019-06-18 北京和杰创新生物医学科技有限公司 细胞爬片用玻璃薄片表面的粘附处理方法
CN110763834B (zh) * 2018-07-25 2023-06-30 福建广生堂药业股份有限公司 一种检测免疫标志物含量的方法、试剂和试剂盒
CN108918856B (zh) * 2018-07-31 2021-11-09 济南大学 一种双MOFs材料猝灭型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用
CN109490525B (zh) * 2018-11-08 2021-09-07 南京光声超构材料研究院有限公司 一种溴化银膜sers免疫基底的制备方法
CN109633174B (zh) * 2019-01-09 2022-04-26 昆明医科大学海源学院 一种基于生物素量子点探针的c反应蛋白超敏检测方法
CN111686826B (zh) * 2019-03-15 2023-05-23 国家纳米科学中心 分层结构的微流控芯片及其应用
CN110333341A (zh) * 2019-07-04 2019-10-15 浙江理工大学 一种基于蛋白质芯片技术鉴别丝织品文物样的方法
CN110646607A (zh) * 2019-07-12 2020-01-03 广东工业大学 一种介孔二氧化硅包裹的正电荷纳米金偶联抗体及其制备方法和应用
CN111024468A (zh) * 2019-12-20 2020-04-17 天津金域医学检验实验室有限公司 一种呼吸道病原体免疫荧光检测中样本的处理方法
CN113030479B (zh) * 2019-12-25 2023-09-12 洛阳中科生物芯片技术有限公司 一种蛋白质芯片的点样溶液
CN111208295A (zh) * 2020-02-29 2020-05-29 济南德亨医学科技有限公司 一种阴道加德纳菌量子点免疫检测方法
CN111208288A (zh) * 2020-02-29 2020-05-29 济南德亨医学科技有限公司 一种阴道毛滴虫量子点荧光免疫检测方法
CN111266141B (zh) * 2020-03-19 2022-07-08 京东方科技集团股份有限公司 一种检测芯片及其修饰方法
CN115989412A (zh) * 2020-04-27 2023-04-18 西西欧艾(杭州)生物医药有限责任公司 使用共价固定化自组装多肽的快速简便的抗体检测
CN112014369B (zh) * 2020-08-25 2024-02-09 上海市皮肤病医院 超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法
CN112986580B (zh) * 2021-02-10 2024-03-01 天津中新科炬生物制药股份有限公司 一种新型冠状病毒中和抗体检测方法及试剂盒
CN113567660A (zh) * 2021-07-22 2021-10-29 中南大学湘雅二医院 一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法
CN115494236B (zh) * 2022-09-09 2025-04-22 河北特温特生物科技发展有限公司 一种荧光免疫分析仪质控卡及其制备方法及其应用
CN115754281B (zh) * 2022-11-28 2023-08-15 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种荧光纳米粒子在免疫荧光组化染色中的应用
CN116626291B (zh) * 2023-05-29 2025-10-10 北京协同创新研究院 用于检测新污染物的生物传感元件及其制作方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030038932A (ko) 2001-11-09 2003-05-17 바이오인포메틱스 주식회사 회전코팅법을 이용한 고체표면기질 상의 균일한 고분자층형성방법
KR100921237B1 (ko) 2007-12-31 2009-10-12 한국식품연구원 Ｃ-반응성 단백 측정용 수정진동자 면역센서 측정장치 및수정진동자 면역센서를 이용한 ｃ-반응성 단백의 고감도측정방법

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61272661A (ja) * 1985-05-29 1986-12-02 Hitachi Ltd イムノアツセイ法
JP3493543B2 (ja) * 1998-04-28 2004-02-03 大塚製薬株式会社 抗体測定方法
EP1532449B1 (en) * 2002-08-27 2010-05-12 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Membrane-based assays using time-resolved fluorescence
CN1298807C (zh) * 2002-11-01 2007-02-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用
CN1173182C (zh) * 2002-12-18 2004-10-27 陕西超英生物医学研究开发有限公司 糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片、其制备及检测方法
CN1781020A (zh) * 2003-04-25 2006-05-31 捷时雅株式会社 生物芯片和生物芯片试剂盒,及其制造方法和使用方法
CN1265197C (zh) * 2003-07-04 2006-07-19 中国科学院大连化学物理研究所 β－二酮－三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用
CN1588070A (zh) * 2004-09-06 2005-03-02 南开大学 多组分生物微阵列芯片的制备方法
KR100620959B1 (ko) * 2005-06-30 2006-09-08 서강대학교산학협력단 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 표지 및 이의용도
US7829347B2 (en) * 2005-08-31 2010-11-09 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits with improved detection accuracy
CN101008644A (zh) * 2006-01-27 2007-08-01 陈云 功能性中枢神经损伤诊断检测用蛋白芯片及其制造方法
US20100209946A1 (en) * 2007-04-19 2010-08-19 Naiyong Jing Uses of water-dispersible silica nanoparticles for attaching biomolecules
CN101216491B (zh) * 2008-01-08 2012-06-06 广州益善生物技术有限公司 结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法
WO2009134822A2 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Fluorescent organic nanoparticles
CN100585388C (zh) * 2008-05-26 2010-01-27 湖南大学 采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法
CN101526535B (zh) * 2009-04-14 2011-04-20 河南省豫康生物工程技术有限公司 多种肿瘤标志物联合检测液相芯片及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030038932A (ko) 2001-11-09 2003-05-17 바이오인포메틱스 주식회사 회전코팅법을 이용한 고체표면기질 상의 균일한 고분자층형성방법
KR100921237B1 (ko) 2007-12-31 2009-10-12 한국식품연구원 Ｃ-반응성 단백 측정용 수정진동자 면역센서 측정장치 및수정진동자 면역센서를 이용한 ｃ-반응성 단백의 고감도측정방법

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMERICAN JOURNAL OF C ARDIOLOGY, vol. 1, 2005, pages 155
AMERICAN JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, vol. 1, 2005, pages 62
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 328, 2004, pages 210
ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 79, 2007, pages 630 - 707
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 274, 2000, pages 817
BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 327, 1997, pages 425
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 19, 2004, pages 1193
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 20, 2005, pages 2454
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 21, 2006, pages 1141
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 21, 2006, pages 1631
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 21, 2006, pages 1900
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 21, 2006, pages 1987
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 22, 2007, pages 973
CLINICAL CHEMISTRY, vol. 47, 2001, pages 403
GILL; BALLESTEROS, TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 18, 2000, pages 282
JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS, vol. 18, 2004, pages 280
KIM ET AL.: "Detecting C-reactive protein by using direct binding quartz crystal microbalance immunosensor", JOURNAL OF THE KOREAN SOCIETY FOR BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 22, 2007, pages 443
LANGMUIR, vol. 22, 2006, pages 4357
NANO LETTERS, vol. 5, 2005, pages 113
NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, vol. 340, 1999, pages 448
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 100, 2003, pages 4984
See also references of EP2541248A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106093427A (zh) * 2016-06-02 2016-11-09 滨州医学院 同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的新方法
CN106093427B (zh) * 2016-06-02 2018-04-13 滨州医学院 同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的新方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104316678A (zh) 2015-01-28
EP2541248A4 (en) 2013-09-04
CN102859359A (zh) 2013-01-02
WO2011105721A3 (ko) 2012-06-07
EP2541248A2 (en) 2013-01-02
KR101140029B1 (ko) 2012-06-21
US20130029428A1 (en) 2013-01-31
WO2011105721A9 (ko) 2012-04-19
CN104316698A (zh) 2015-01-28
KR20110096739A (ko) 2011-08-31
EP2541248B1 (en) 2017-07-12
CN104316697A (zh) 2015-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101140029B1 (ko) 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
US5851840A (en) Biotinsilane compounds and a binding matrix containing these compounds
US6080423A (en) Three dimensional colorimetric assay assemblies
EP0809803A4 (en) THREE-DIMENSIONAL COLORIMETRIC TEST ARRANGEMENTS
JPH09509056A (ja) 生物反応について高度に特異的な表面、それらの作製方法、およびそれらの使用方法
CZ297165B6 (cs) Zpusob výroby zarízení s pevnou fází k provádení multianalytních rozboru
Salama et al. Chemiluminescent optical fiber immunosensor for detection of autoantibodies to ovarian and breast cancer-associated antigens
JP3214795B2 (ja) ビオチンシラン化合物及びこれらの化合物を含む結合マトリックス
EP3243076B1 (en) Methods for detecting a marker for active tuberculosis
WO2017052285A1 (ko) 표면-증강 라만 산란 기반의 고감도 측면유동 면역분석용 스트립 및 이를 이용한 검출방법
WO2013176458A1 (ko) 광학 바이오센서
KR101195253B1 (ko) 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
Ma et al. Sensitivity-enhanced nanoplasmonic biosensor using direct immobilization of two engineered nanobodies for SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain detection
RU2597768C2 (ru) Способ функционализации поверхностей для выявления аналитов
CN104374921B (zh) 一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用
Qi et al. Phage M13KO7 detection with biosensor based on imaging ellipsometry and AFM microscopic confirmation
NL2017204B1 (en) Solid substrate comprising antigens immobilised thereto, biosensor comprising said solid substrate and method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample
KR101195254B1 (ko) 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
JP2014062814A (ja) 抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びそれにより製造される免疫蛍光スライド
CN105548577B (zh) 一种琥珀酰‑β‑环糊精修饰的莱姆病检测用蛋白质芯片及其制备与应用
KR20110104461A (ko) 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
CN111273027B (zh) 一种用于检测肝癌血清糖链的spdp修饰凝集素芯片及其制备与应用
JP3774460B2 (ja) 物質の検出方法
CN120641752A (zh) 用于电化学阻抗免疫测定的胶束分枝菌酸酯涂覆的碳电极
Shriver-Lake et al. Immobilization of biomolecules onto silica and silica-based surfaces for use in planar array biosensors

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201180019524.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11747611

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012554897

Country of ref document: JP

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2011747611

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13261437

Country of ref document: US

Ref document number: 2011747611

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP