WO2011132955A2 - 종양 억제 타겟으로서 Hades의 용도 - Google Patents

종양 억제 타겟으로서 Hades의 용도 Download PDF

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WO2011132955A2
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Definitions

  • the present invention relates to the use of Hades as a tumor suppression target, and more particularly to a composition for inhibiting tumors containing an inhibitor of expression or action of Hades protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • P53 a tumor suppressor
  • the function of p53 in the nucleus is well known to play an important role in cell homeostasis and organic survival [Dulic et al. , Cell 76, 1013-1023 (1994); Lowe et al. , Nature 362, 847-849 (1993); Lane DP Cancer. Nature 358, 15-16 (1992); Raycroft et al. , Science 249, 1049-1051 (1990)], and also transcript ion-independent mechanisms such as exMiuclear mechanisms outside the nucleus are important for maintaining the tumor suppressor function of p53 [Green et al.
  • p53 is located in the cytoplasm and mitochondria upon DNA damage [Marchenko et al. , J Biol Chem. 275, 16202 (2000)], binds to Bcl—xl and Bad in the cytoplasm [Mihara et al. , Molecular Cell 11, 577-590 (2003). This inhibits the interaction between the pn ⁇ apoptotic Be 1-2 protein and the anti-apoptotic Be 1-2 protein and promotes oligomerization of the pro-apoptotic Be 1-2 protein. Chipuk et ah, Science 303, 1010-1014 (2004); Jiang et al. , Mol Cell Biol. 26, 9071-9082 (2006); Tomita et al. , J Biol Chem. 281, 8600-8606 (2006).
  • p53 ubiquitination inhibits the interaction between p53 and Bcl-2 proteins.
  • Hades is located in the mitochondria and binds to p53 and cytoplasm, and also overexpressed Hades protein in tumor cells, the overexpression This is the first time that Hades protein interacts with the DNA binding domain of p53 to inhibit the function of p53.
  • the main object of the present invention is to provide a composition for inhibiting tumors containing as an active ingredient an inhibitor of Hades protein expression or action having an effect of inhibiting the interaction of Hades protein with p53.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening an anticancer agent that inhibits the interaction of Hades with p53.
  • Another object of the present invention is to provide an anticancer composition containing the drug screened by the screening method according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention has an amino acid sequence
  • a composition for inhibiting tumor which contains an inhibitor of expression or action of Hades protein as an active ingredient.
  • Hades is a negative regulator of p53
  • the Hades is a protein that binds to p53, a TM (transmembrane) domain or a single peptide region at the N-terminus, a second TM domain at the middle and a RING-finger domain (eg, an E3 ligase domain) at the C-terminus. It is located in the mitochondria.
  • the Hades is characterized in that it is overexpressed in tumor cells. More specifically, in the embodiment of the present invention, the expression level of Hades was observed in human tumor tissue, and the expression of Hades mRNA was more than two times higher in tumor tissue than normal tissue adjacent to the tumor tissue (see FIG. 5K).
  • the Hades protein expression or action inhibitors may be used any known materials or methods to inhibit the expression or action of the protein, but preferably transcription or translation of the Hades gene To downregulate or provides a composition for inhibiting tumor, characterized in that to inhibit the action of Hades protein quality.
  • downregulation of transcription or translation of the Hades gene includes all downregulation, such as binding to the Hades gene promoter to downregulate transcription, degrade post-transcriptional mRNA, or inhibit translation.
  • inhibiting the action of the Hades protein includes inhibiting the activity of the protein, competitively binding on the binding portion of the protein that interacts with the protein, and interferes with the action.
  • RNA interference is a method of post-transcriptional gene regulation conserved in many eukaryotes. RNAi is induced by short double-stranded RNA (dsRNA) molecules present in cells [Fire et al. , Nature 391: 806-811 (1998).
  • RNA induced silencing RNA induced silencing
  • the present invention relates to a fragment comprising short double-stranded RNA consisting of about 17 nucleotides to about 25 nucleotides that target the mRNA of the Hades gene.
  • the siRNA comprises a sense RA strand and a complementary antisense RNA strand, both of which are annealed to each other by standard Watson-Crick base pair interactions.
  • the sense strand comprises a nucleic acid sequence identical to the target sequence in the target mRNA. Techniques for selecting the target sequence of siRNA are described, for example, in Tusch et al. , "The siRNA User Guide” revised Oct. 11 (2002).
  • the Hades target sequence used to prepare the siRNA of the present invention is two portions of 5'-GGGAUUUUUAUCUCGAGACC-3 'and 5'-CGUGUGUGUAGAGGAC A-3' among the untranslated portions near Hades mRNA 3 ',
  • the Hades siRNA sequences are the 5'- GCCUCGAGAUMAMUCCCtg-3 '(antisense sequence: SEQ ID NO: 4) and the 5'- GGGAUUUUUAUCUCGAGGCtt-3' (sense sequence), the latter 5'-UUUGUCCUCUACACACACGGtg-3 '(antisense sequence: sequence Nos. 5) and 5'-CGUGUGUGUAGAGGACAAAtt-3 '(sense sequence).
  • siRNA has the form of a double strand, and the strand that can bind to the target region of the double target is expressed as the anti-sense strand, otherwise the strand is expressed as the sense strand.
  • the strand that can bind to the target region of the double target is expressed as the anti-sense strand, otherwise the strand is expressed as the sense strand.
  • siRNAs To intracellularly inject siRNAs, they must be synthesized in the double strand form or they will not be recognized in the cells.
  • the sense and antisense strands of the siRNA of the present invention are two complementary, single chain
  • shRNA short hairpin RNA
  • the shRNA has a single strand of about 50-70 nucleotides in length and forms a st em-loop structure in vivo.
  • Complimentary 19-29 nucleotides of long RNA complement both sides of the 5-10 nucleotide loop region to form a double stranded st em.
  • shRNAs are generally synthesized in vivo by transcription of complementary DNA sequences from Pol m promoters.
  • Pol- ⁇ -induced transcription starts at a well-defined start site and consists of four or more thymidines. Termination at the second residue of (- ⁇ -) yields a non-poly (A) transcript.
  • Pol ⁇ promoter is active in all cells and is capable of expressing shRNA. After transcription, shRNAs are cleaved by Dicer and interact with RISCs like siRNAs (see Tuschl et al. , Cell 110 (5): 56374 (2002)].
  • siRNA of the present invention can be obtained using a number of techniques known to those skilled in the art.
  • siRNA belongs to the present invention It can be chemically synthesized using methods known in the art or produced by recombinant methods.
  • the siRNA of the present invention can be obtained by chemical synthesis. That is, the bases are made one after the other chemically attached one by one, after which PAGE purification is performed to finally obtain only high purity siRNA.
  • siRNA can be synthesized as two RNA molecules that are complementary and separated or as one RNA molecule having two complementary regions.
  • siRNAs can be expressed from recombinant DNA plasmids using appropriate promoters. Suitable promoters for expressing siRNAs of the invention from plasmids include, for example, the U6 or HI RNA pol m promoter sequence and cytomegalovirus promoters.
  • the recombinant plasmid of the present invention may comprise an inducible or controllable promoter for expressing siRNA in specific tissues or specific intracellular environments.
  • the siRNA of the present invention can be expressed as two RNA molecules that are complementary and separated from the recombinant plasmid or as one RNA molecule having two complementary regions.
  • Appropriate plasmids for expressing siRNAs of the present invention Methods for inserting nucleic acid sequences for expressing siRNAs into plasmids and for delivering recombinant plasmids to desired cells are within the skill of the art. See, eg, Tuschl et al., Nat. Biotechnol, 20: 446-448 (2002)]; Brumelkamp et al. , Science 296: 550-553 (2002)]; Miyagishi et al. , Nat. Biotechnol.
  • the Hades protein expression inhibitor is Hades si RNA (short interfering) having a nucleotide sequence complementary to the mR A of the Hades gene, more preferably, SEQ ID NO: 4 or 5 Or a gene for transcription thereof,
  • the expression or action inhibitor of the Hades protein is characterized by inhibiting the interaction of Hades with p53.
  • An example of the Hades-p53 interaction inhibitor may be an anti-Hades-antibody that can specifically bind to the p53-binding site of Hades (C-terminal RING-finger domain).
  • the interaction between Hades and p53 inhibits DNA binding, transcriptional activity, stress-induced cell death and p53-induced cell death of p53. All.
  • the function of p53 refers to the process of repairing DNA damage by stopping the growth of cells in the cell cycle G1 phase when DNA damage is induced in the cell, thereby preventing cancer cells from forming.
  • the programmed cell death which causes the transformed cells to die on their own, triggers apoptosis that removes abnormal cells from the tissues. It includes all of the general anti-cancer mechanisms of p53 known in the art, including preventing this from progressing.
  • the interaction between the Hades and p53 is characterized by inducing a ubiquitination of p53.
  • Hades interacts with p53 in the cytoplasm, by which Hades induces the degradation of cytoplasmic p53, and specifically targets the N-terminal 24th lysine residue. It was confirmed to induce ubiquitination of p53 (see FIG. 3J).
  • the Hades protein expression or action inhibitor is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl
  • the present invention provides a method for screening an anticancer agent, comprising the following steps:
  • the animal cells may be intentionally transformed with a plasmid overexpressing Hades.
  • whether the expression is reduced is RNA level or Western blot through RT-PCR. Can be measured at the protein level, such as by lotting.
  • the present invention provides a method for screening an anticancer agent comprising the following steps:
  • anti-cancer agent that inhibits interaction means that Hades inhibits the function of p53, thereby treating and preventing cancer.
  • the "inhibition of interaction” includes both inhibiting and eliminating interaction between Hades and p53, and inhibiting interaction may inhibit the interaction between Hades and p53 itself, This includes acting separately to inhibit interactions.
  • the Hades fragment is characterized in that it comprises a p53-binding site (C-terminal RING-finger domain) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the interaction between Hades and p53 in the step (b) shows the DNA-binding degree of p53-binding site (C-terminal RING-finger domain) and p53. It is characterized by what happens between the mains.
  • the interaction of Hades and p53 in the step (b) is immunoprecipitation
  • the "immunoprecipitation assay” is one of the currently widely used immunochemical techniques, and uses antigen affinity of an antibody to specificize an antigen (or substance having an affinity with an antigen) from a solution. It is a technique to separate. This technique is used to determine the molecular weight of antigens, to study protein interactions, to measure specific enzyme activity, to monitor post-transcriptional changes of proteins, and to determine the amount and presence of proteins.
  • the immunoprecipitation assay method extracts proteins from cells or tissues using an appropriate lysis buffer and then either the primary antibody or Protein A-, G- or L-. agarose or secondary antibody— Combines with agarose.
  • the secondary ant i body— agarose texture The conjugation technique allows for the separation of other proteins that do not bind to antibodies of a particular protein.
  • the choice of agarose is determined by the isotype and species origin of the primary antibody against the desired protein (antigen).
  • Immunoprecipitation assays are also used to detect other proteins that bind specific proteins in non-denaturing conditions.
  • the "GST pull-down analysis” is used to test the interaction between a tagged protein or the bait (eg, GST, His6, biotin, etc.) and another protein (test protein, or prey). It's a simple technique. bait is purified on an appropriate expression system (eg, Escherichia coli) and immobilized on a glutathione affinity gel. bait is used as a secondary affinity support to identify new protein partners or to identify proteins that were previously expected to be protein partners.
  • the "colony-forming assay” is a technique for analyzing and testing the growth ability of cells based on the ability of one cell to grow to form colonies. At this time, the colony is defined as composed of 50 or more cells.
  • cancer cells have the characteristic of infinite proliferation, and after introducing a specific gene into cancer cells, only the introduced cells are selectively cultured to measure the presence and number of colonies to evaluate the gene's ability to inhibit cancer cell growth. Can be.
  • the present invention provides an anticancer composition
  • an anticancer composition comprising a medicament screened by the screening method as an active ingredient.
  • the anticancer agent composition according to the present invention may include any material that can inhibit the interaction between Hades and p53, and more specifically, to include or remove any one to remove and inhibit the interaction between Hades and p53. Can be.
  • the anticancer agent composition also inhibits the interaction between Hades and p53 itself or inhibits the interaction between Hades and p53 separately.
  • compositions of the present invention are commonly used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, Nate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil And the like, but not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and can be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intratumoral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intramyocardial administration or local administration. have.
  • ovarian cancer intraperitoneally and liver cancer in the portal vein can be administered by infusion method
  • brain cancer, head and neck cancer and breast cancer can be administered by injection directly into the tumor mass, in the case of colon cancer It can be administered by injection directly into the enema, and in the case of bladder cancer can be administered directly into the catheter.
  • Appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on various factors such as disease type and severity, age, sex, weight, sensitivity to drugs, type of current treatment, administration method, target cell, etc. It can be easily determined by experts in the field. Preferably, it is preferable to administer 2-5 mg / kg for siRNA, and 0.1-1 g / kg for Hades agonist. It is important to administer the composition of the present invention in consideration of all of the above factors to obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • Is prepared in unit dose form or formulated in a multi-dose container by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of axles, powders, granules, tablets or accelerators, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • compositions of the present invention may be used as a monotherapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiotherapy, and in the case of the combination therapy, cancer treatment may be more effectively performed.
  • Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide , Ifosf amide, melphalan
  • the invention provides a screening kit of an anticancer agent that inhibits the interaction of Hades with p53, comprising:
  • the kit is preferably a binding affinity between the p53-binding site of Hades and the test drug before step (a) in the screening method of the present invention, thereby increasing the possibility of anticancer drugs.
  • the method may further include selecting a medicament, and may be used to implement a screening method including the step.
  • the invention provides the use of an inhibitor of the expression or action of a Hades protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 for the preparation of a tumor suppressor composition.
  • the invention provides a method for inhibiting tumors comprising administering to a subject in need thereof an inhibitor of the expression or action of a Hades protein having a pharmaceutically effective amount of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • La is a screening procedure used to identify partners interacting with p53.
  • Figure 1 shows the transformed S_labeled proteins in vitro
  • Figure lc shows the domain of Hades
  • Figure Id shows the results of observing the position of Hades in the U20S cells by confocal microscopy (upper panel: Control GFP plasmid; lower panel: transformed GFP-Hades)
  • Figure le is the result of confirming the interaction of p53 and Hades by in vitro pull-down analysis
  • Figure If is N-terminal to confirm the p53 binding region of Hades Or the result of measuring the interaction between the C-terminus and p53
  • Figure lg is a result of confirming the interaction of Hades and p53 in MCF7 cells by in vitro pull-down analysis (lane 2: GST culture; lane 3: GST) Cultured with Hades)
  • Figure lh shows the interaction of Hades with p53 in H1299 cells by in vivo immunoprecipitation assay.
  • Figure li shows the interaction of Hades with p53 in MCF10A and NHLF cells by in vivo immunoprecipitation assay.
  • Fig lj is a view showing the result of Hades and p53 showing that co-exist (colocalized) through a confocal microscope.
  • Figure 2a is a view showing a change in the expression level of p53 according to the expression of Hades
  • Figure 2b is a diagram showing a change in the expression level of p53 according to the expression of Hades in MCF10A and NHLF cells
  • Figure 2c Figure 2d is a result showing the self-ubiquitination activity
  • Figure 2d is a result confirming the p53 expression reduction activity of the RIN-finger domain of Hades
  • Figure 2e is a diagram showing the result that the reduction of p53 expression by Hades is recovered by MG132 treatment
  • FIG. 2F is a diagram showing the result of the expression of p53 is recovered when Hades is knocked down using Hades shRNA
  • FIG 2G is a diagram showing the results of the mechanical analysis of p53 stabilization by Hades silencing in CHX-treated cells
  • Figure 2h is a measure of the expression level of p53 in the nucleus and cytoplasm when knocking down Hades
  • Figure 2i is a p53 reduced expression by Hades LMB treatment
  • FIG 2j is a view wild-type p53 and mutant according to the expression of Hades showing the p53 expression level changes in p53.
  • FIG. 3A is a diagram showing that Hades also interacts with the mutant p53
  • FIG. 3B is a diagram showing that Hades ubiquitizes p53
  • FIG. 3C is determined by Hades or Mdm2 through in vitro ubiquitination analysis.
  • Figure 3d shows the induction of ubiquitination of p53
  • Figure 3d is a diagram showing that ubiquitination of p53 is induced by Hades through in vitro ubiquitination analysis and immunoblotting analysis
  • Figure 3e is an in vivo ubiquitin
  • Figure 3f shows that ubiquitination of p53 is induced by Hades through oxidative analysis
  • Figure 3f is a diagram showing that the degradation of p53 by Hades is not dependent on Mdm2.
  • 3g is a diagram showing the ubiquitination of p53 by Hades in MEF p53 — / _ ; mdm2— cells in which GST-Hades RP is present, and FIG. 3h shows that Mdm2 has no effect on ubiquitination of p53 by Hades.
  • 3i shows whether p53 lysine residues affect the ubiquitination of p53 by Hades
  • FIG. 3j shows the N-terminal 24th lysine residue of p53 in ubiquitination of p53 by Hades.
  • 3k shows that ubiquitination by Hades does not affect the mutant p53 K24R.
  • FIG. 4A is a diagram showing that p53-dependent metastasis activity is inhibited by Hades
  • FIG. 4B is a diagram showing that p53-dependent metastasis activity by Hades is not inhibited in the presence of LMB (leptomycin B).
  • 4C is a diagram showing that degradation of mutant p53 lacking metastasis is mediated by Hades, so that degradation of p53 by Hades is independent of metastasis
  • FIG. 4D shows inhibition of p53 cell growth by overexpressed Hades.
  • Figure 4e is a view showing the inhibition of growth suppression
  • Figure 4e is a diagram showing that Hades inhibits the cell growth inhibition function of p53 through colony-forming analysis
  • Figure 4f is a knockdown (knockdown) through colony-forming analysis
  • FIG. 4G shows that Hades knockdown inhibits cell viability under various stress conditions.
  • FIG. 5A shows that pEYFP-mito-p53 is located in the mitochondria in U20S cells transformed with pEYFP-mito-p53
  • FIG. 5B shows pEYFP-mito-p53 by overexpressed Hades
  • FIG. 5C is a diagram showing that colony formation is inhibited by Hades overexpressed in H1299 cells transformed with pEYFP-mito-p53 through colony-forming analysis.
  • 5D shows that colony formation is not inhibited by Hades overexpressed in MEF cells (p53—; Mdm2— ⁇ ) transformed with mutant pEYFP-mito-p53 (K24R) via colony-forming analysis.
  • FIG. 5E is a diagram showing that Hades reduces the level of p53 expression induced by CPT
  • FIG. 5F is a diagram showing the inhibition of the interaction between p53 and Bcl-2 in CPT treated cells
  • FIG. 5G is Cell death induced by CPT treatment ( Hades inhibits apoptosis
  • FIG. 5H shows that knockdown of Hades in CPT-treated cells
  • 5i is a diagram showing that the interaction between p53 and Bcl-2 is not inhibited.
  • FIG. 5i is a diagram showing that knockdown of Hades does not inhibit apoptosis in CPT treated cells.
  • Is a diagram showing that knockdown of Hades in CPT-treated cells stimulates mitochondrial damage induced by CPT
  • FIG. 5K measures Hades expression levels in normal tissues adjacent to human primary hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. It is a figure which shows one result.
  • HCC human primary hepatocellular carcinoma
  • HCT116 P53 cells and MEF p53 / _ and MEF p53 _ / —; Mdm2— cells were placed in DMEM medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1) penicillin (penici 1 ⁇ ) / streptomycin. Maintained. Stable pSuper-Hades MCF7 cells were then maintained in DMEM supplemented with 103 ⁇ 4> FBS and 500 g / ml G418 (neomycin). Transient transfection was performed using Hi lymax (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions, followed by RNAimax (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions for siRNA transformation.
  • Hi lymax Invitrogen
  • RNAimax Invitrogen
  • Mock siRNA was obtained from Ambion (USA), the sequence of which is as follows: Hades siRNA, GGGAUUUUUAUCUCGAGGC and CGUGUGUGUAGAGGACAAA; mock siRNA, AUGAACGUGAAUUGCUCAAG.
  • anti-goat IgG-HRP (sc-2020), normal mouse IgG (sc— 2025), ant i -mouse IgG— Texas Red (sv— 2781) and protein A agarose (sc-2001) and protein G agorose (sc-2002) were purchased from Santa Cruz Technologies (USA).
  • Rabbit polyclonal antibodies against Hades were prepared from Labfrontier (Korea) using peptide sequences of N-SGERPKGIQETEEM-C and N-SRAKPEDRESLKSAOC.
  • Anti- ⁇ -actin antibody (A5441) was purchased from Sigma, anti-mouse IgG-HRP (7076) was purchased from Cell Signaling Technology (USA), ant i -cytochrome C (556433) and Tom 20 ( 612278) antibody was purchased from BD Pharmingen (USA) and polyubiquitin chain (FK-1) antibody was purchased from BioMol (USA).
  • the Hades gene was isolated from HeLA cell cDNA by RT-PCR using the following primers and subcloning into the following vector.
  • shRNA expression plasmids targeting Hades The oligomer was subcloning to the pSuper-GFP-neo vector, and the primers used are shown in Table 3 below. Inserting the subcloned shRNA expression plasmid into the cell causes the plasmid to produce only shRNA by itself. More specifically, once the DNA sequence corresponding to the shRNA is cloned into the vector, the combined vector is injected into the cell to generate the shRNA. The shRNA vector was created in this way because it could reduce the additional synthesis cost when using siRNA, and at the same time can selectively culture only cells into which the shRNA vector was injected.
  • p53 mutation (C135Y) From Carl G. Maki (University of Chicago, USA), the p53 lysine mutation Randy Y. C. Poon (Hong Kong Iniversity of Science and Technology, Hong Kong).
  • P53 N24KR mutation was prepared by inducing point mutagenesis by PCR using pcDNA p53-FLAG (forward: GACCTATGGAGACTACTTCCTG, reverse: CAGGAAGTAGTCTCCATAGGTC).
  • PGL3-Bax reporter plasmid From Anastasis Stephanou (Unuversity College London, UK), pPV-PUMA FLAG2-Luc PCI_Bcl_2 was provided by Dr, Hiroyuki Osada (Discovery Research Institute, RIKEN, Japan) from Bert Vogelstein (Johns Hopkins Medical Institutions, USA).
  • TRIZ0L reagent Invitrogen, USA
  • To prepare a standardized full-length cDNA library SMART cDNA library cons trust ion kit (Clontech, USA) and TRI ER-cDNA normalization kit (Evrogen, Russia) were used according to the manufacturer's instructions.
  • SPIN-400 cohimn was used to classify. Two different restriction enzyme sites were modified to insert all cDNAs greater than 500 bp into the MCS and linked into the pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen).
  • the cells were then transformed into T0P10 Escherichia Invitrogen.
  • Lysate System (Pr omega, USA) was used to in vitro transcription and translation.
  • the protein ixx) l was confirmed to be positive in the in vitro binding assay, the corresponding cDNA ⁇ ) 1 was partitioned, and again performed in the same manner until a single positive cDNA clone was obtained.
  • the positive clones were then sequenced (Bionics, Korea) and the NCBI gene database was searched and compared with known sequences.
  • Mdm2 protein was induced by treating the cells with 0.1 mM IPTG for 2 hours at 37 ° C. or overnight at 25 ° C. Subsequently, the cells were placed in a bacterial lysis buffer (30 mM TrisCl pH 8, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 1% NP40), sonicated and lysed, and then glutathione-sepharose (SepharoseKAmersham Bioscience). The protein was purified using).
  • S-labeled protein obtained by in vitro transcription / translation was bound to the binding buffer (30 mM Tris—HC1 pH 8,0, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% NP-40, and 0.5 mM PMSF) and incubated with glutathione—Sepharose 4B—bound GST, GST-p53 or GSE-Hades recombinant protein of 5 at 37 ° C. for 3 hours.
  • SDS-sample buffer 60 mM Tris-Cl pH6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue. The bound protein was then separated by SDS-PAGE and observed by autoradiography.
  • reaction composition 15 ⁇ ZnCl 2 was added to 20 ⁇ l and incubated at 30 ° C. for 2 hours. After completion of the culture, the reaction composition was analyzed by SDS-PAGE, followed by autoradiography or immunoblotting (i ⁇ unoblotting).
  • MCF7 cells were collected and dispersed in ubiquitination buffer for endogenous p53 ubiquitination assays.
  • the dispersed sample was sonicated for a while and then centrifuged. The supernatant was then incubated at 30 ° C for 2 hours with the same amount of GST, GST-Hades, or GST-Hades MT, using an anti-p53 antibody.
  • Immunoprecipitation was performed and immunoblotting was performed with immunoprecipitates using anti-ubiquitin antibodies.
  • Lysates were obtained after transformation for 48 hours with pcDNA myc / His-p53 expression plasmid. Lysates were then incubated at 30 ° C for 2 hours with GST, GST-Hades or GSTHades MT. Thereafter, immunoprecipitates were obtained by immunoprecipitation with an anti-P53 antibody, or pull-down with Ni + -conjugated beads, followed by immunoblotting.
  • ⁇ i3i> For in vivo p53 ubiquitination assay, HFP116 53 _ / " or H1299 cells were GFP,
  • Transformation was performed with GFP-Hades or GFP-Hades RING MT for 48 hours. After completion of transfection, cells were treated with 10 ⁇ of MG132 for 4 hours. Cells were then lysed with SDS-containing lysis buffer and heated for 10 minutes. Thereafter, after immunization with ⁇ 40 lysis buffer 10 times in order to immunoprecipitate with anti- ⁇ 53 antibody, it was immunoprecipitated. Anti- ⁇ 53 immunoprecipitates were analyzed by immunoblotting using anti-polyubiquitin antibodies.
  • RNA was isolated from the tissue using RNeasy mini kit CQiagen, Germany) according to the manufacturer's instructions. Hades mRNA expression values were then determined using IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, USA) and CFX96 real time system (Bio-Rad). It was quantified by real-time PCR. The same amount of RNA complexes isolated from five different normal liver tissues except cirrhosis and fibrosis were further included in real-time PCR, and 18S rRNA was RT-PCR and real-time.
  • Hades mRNA was amplified using the following primers: Forward; GATCATTCATCAGAGGACCAACACAG and Reverse; AGCACTCGCACAGCCACATC. And 18S rRNA sequences were amplified using the following primers: Forward; GGAGAGGGAGCCTGAGAAACG and Reverse TTACAGGGCCTCGMAGAGTTC. Then, the expression level of Hades mRNA was analyzed by CFX Manager Sofrware (Bio-Rad).
  • ⁇ i4i> Transformed cells grown on glass coverslip were fixed with 4% paraformaldehyde for 5 minutes at room temperature, then washed twice with PBS, and washed with permeation buffer (permeabilization buffer; 0.5% Triton X-100 in PBS) for 3 minutes. After incubation, cells were stopped for 30 minutes with PBS containing 53 ⁇ 4 BSA and 2% Goat serum and incubated overnight at 4 ° C. with anti-p53 antibody (1: 200 in PBS). Then, washed three times with PBS, and further incubated for 1 hour with fluorescein Texas red-labeled secondary antibody (1: 500 in PBS).
  • permeation buffer 0.5% Triton X-100 in PBS
  • the cell lysates were centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes and the resulting supernatant was transferred to a new tube and centrifuged again at 12,000 rpm for 30 minutes. The supernatant obtained from the second centrifugation was collected into a cytoplasmic fraction.
  • the crude nuclear pellet was dispersed in 1 ml CLB buffer and washed three times.
  • the resulting nuclear and cytoplasmic fractions were placed in SDS-sample buffer.
  • fractionation of the mitochondria was carried out as previously described [Shirangi et al., FASEB J. 16, 420-422 (2002)], and after washing the obtained mitochondrial fraction (pellet) three times with the same buffer, SDS-sample was placed in a buffer and bathed at 100 ° C for 10 minutes, and then analyzed by immunoblotting.
  • Mdm2 _ / " cells were plated in 60-mm dishes and transformed with 500 ng of each labeled plasmid for 24 hours, after which cells were selected for 14 days with 500 yg / ml of G418. After fixation and staining with crystal violet for colony counting.
  • PGL plasmid containing promoter p53 binding sites for Bax and Puma 100 ng of p53 plasmid and 200 ng of Hades or Hades MT plasmid were transformed. After 48 hours of transformation, cells were collected and 50 ⁇ , indirect lysis buffer (Pr omega) was added to prepare cell extracts. The luciferase activity was then measured using a Biotek synergy HT microplate reader, and the relative luciferase activity was normalized by measuring ⁇ -galactosidase activity using Luminescent ⁇ -galactosidase detection kit II (Takara—Clontech).
  • Hades expression plasmid (GFP (green fluorescent protein) -Hades plasmid) was transformed into U20S cells for 24 hours to excessively induce Hades expression, and immunoblotting with anti-GFP and anti-p53 antibodies.
  • GFP green fluorescent protein
  • FIG. 2a it can be seen that the expression level of p53 is reduced by the over-expressed Hades, which is dependent on the throughput of GFP-Hades. This decreased expression of p53 was also observed in MCF10A and NHLF cells transformed with GFP, GFP- tagged wild-type Hades or GFP-tagged mutant Hades (FIG. 2B).
  • RING mutant Hades After 6 washes and immunoblotting using anti-ubiquitin antibody, ubiquitination activity was observed in the presence of E1 / E2 except RING mutant Hades (FIG. 2C).
  • H1299 cells were transformed with a plasmid expressing p53, GFP-tagged Hades or FLAG-tagged mutant Hades for 24 hours, and immunoblotting with anti-P53 antibody to observe p53 expression level, RING mutant Hades was not able to inhibit the expression level of p53 (FIG. 2D).
  • the RING mutant Hades did not induce the degradation of p53 induced by Hades, and the wild type (WT) Hades did not function as p53. It is known to be downregulated.
  • Hades mRNA expression was measured by RT-PCR by select ion for 14 days in medium (500 yg / ml), and immunoblotting was performed using anti-p53 and anti-Hades antibodies. It was confirmed that p53 was stabilized due to silencing of Hades (FIG. 2F).
  • p53 was stabilized due to silencing of Hades (FIG. 2F).
  • CHX cycloheximide
  • Hades shRNA pSuper-Hades compared to the control panel (upper panel) The half-life of the p53 protein was higher in the transformed cells (lower panel) (FIG. 2G).
  • Example 2-2 The inventors performed an auto-ubiquitination assay in Example 2-2 to determine whether Hades is directly involved in p53 ubiquitination.
  • peptides containing fixed full-length Hades (lane 2, GST-Hades) and RING-finger domains (aa 271-351) (lane 4, GST-Hades RP) exhibited autoubiquitination, while RING Mutant peptides (lane 6, C302S / C305S; GST-Hades RP MT) were confirmed to show no autoubiquitination (FIG. 2C).
  • the present inventors have identified plasmids expressing p53 (l yg) and GFP-Hades or GFP-Hades MT (1 yg). After transforming MEF cells (MEF p53 / _ ; mdm2 cells) deficient in both p53 and Mdm2, the levels of p53 expression were determined by immunoblotting and transformed into MEF ⁇ 53— ⁇ ⁇ transformed with GFP-Hades for 24 hours. It was confirmed that the expression level of ⁇ 53 is reduced in / _ cells (Fig. 3f, lane 2).
  • MEF p53 _ / ; mdm2 — / _ cells were transformed with His_p53 plasmid for 24 hours, then cell lysates were collected, and in vitro ubiquie for 2 hours with lysate containing GST, GST- Hades RP or GST ⁇ Hades RP MT. Chitinization analysis was performed. At this time, p53 was pulled down with Ni + conjugated beads (left panel) or immunoprecipitated with anti-p53 antibody (right panel).
  • p53 was ubiquitinated when MEF p53 _ / —; mdm2— / _ cells were transformed with GFP-Hades RP, but p53 was not ubiquitinated when GFP-Hades RP MT was transformed ( 3G), as well as co-transformation of MEF p53 / _ ; mdm2 / _ cells with GFP-Hades and Mdm2 plasmids when transformed for 24 hours with respective plasmids expressing p53, GFP-Hades and Mdm2 P53 ubiquitin effect was better in the cells than the cells transformed with GFP-Hades alone (FIG. 3H).
  • the above data shows that Mdm2 is not involved in the ubiquitination of p53 by Hades.
  • 3I p53 lysine mutations were prepared: 5NKR, 5 N-terminal lysine residues (aa 101 120 132, 139, 164) mutations; 6NKR, 6 N-terminal lysine residues (aa 24, 101, 120, 132 139, 164) mutations; 6CKR, 6 O-terminal lysine residues (aa 370 372, 373, 381 382, 386) mutations; And N24KR, N-terminal lysine residues (aa 24) mutations.
  • the 24th lysine residue at the N-terminus of p53 plays an important role in ubiquitination and p53 degradation by Hades. It was confirmed that (Fig. 3j). To specifically identify the effect of the 24th lysine residue on p53 ubiquitination by Hades, In
  • Mutant p53 (N24KR) substituted with (arginine) was incubated in ubiquitin buffer with GST, GST-Hades RP or GST-Hades RP MT, and analyzed by SDS-PAGE and autoradiography. As a result, it was confirmed that wild type p53 was ubiquitinated by Hades, but mutant p53 (N24KR) was not ubiquitized by Hades (Fig. 3K) and also GST full-down analysis (puU-down). As a result, non-ubiquitination of the p53 K24R mutant was observed, which may be due to the inability to interact with Hades (FIG. 3K (B)).
  • Mdm2 is not involved, indicating that the 24th lysine residue of p53 plays an important role in the degradation of ubiquitin-dependent p53.
  • E3 ligase (Hgase) activity is essential for p53 ubiquitination and is known to modulate the function of p53 [Dornan et al. , Nature 429, 86-92 (2004); Leng et al., Cell 112, 779-791 (2003).
  • the impact of Hades was investigated. First, to determine whether Hades affects p53-mediated transcriptional activity using lucifer erase reporter assay, H1299 cells were tested for p53 and GFP, GFP-Hades or GFP-Hades MT. The plasmid expressing with and Z?
  • a Bax-luc) or / zra (Puma-luc) reporter plasmid was transformed together for 24 hours and the relative luciferase activity was measured by luminometer.
  • Figure 4a it was confirmed that the activity of Bax-luc and PUMA-luc is reduced by Hades, through which it can be seen that p53-mediated trans ivat ion is inhibited by Hades .
  • H1299 cells were mixed transformed with plasmids expressing p53 and GFP, GFP-Hades or GFP-Hades MT with ba Bax-luc) or / 3 ⁇ 4zwa (Puma-luc) reporter plasmids for 24 hours.
  • HCT116 p53 + / + and p53 null HCT116 p53 _ / " cells 1
  • the cells cultured for 14 days in a medium containing G418 (500 yg / ml) were observed by colony-forming assay, resulting in HCT116 due to knockdown of Hades.
  • p53-dependent growth inhibition was restored in p53 + / + cells, but not in HCT116 p53 _ / _ cells (FIG. 4F). Also, remove Hades
  • Knockdown stable MCF7 cells (gray bar) and control MCF7 cells (black bar) were treated with ⁇ 202 (10 ⁇ ), actinomycin D (act inomycin D, 1 ⁇ ) or doxorubisin (500 nM). After incubation for a time, MTS cell proliferation assay was performed, and it was confirmed that the cell growth inhibitory activity of p53 by Hades was restored in MCF7 cells from which Hades was removed (FIG. 4G).
  • P183 therefore acts as a central switch for inducing cell death and cell cycle arrest in response to various cellular signals [Dulic et al. , Cell 76, 1013-1023 (1994); Lowe et al. , Nature 362, 847-849 (1993); Lane DP, Nature 358, 15-16 (1992)], from these data it can be seen that Hades negatively regulates p53-dependent growth inhibition. Thus, Hades acts as a negative regulator of p53 and protects the cells from cell death caused by various stress conditions.
  • MEF p53 _ / —; mdm2— cells were co-transformed with EYFP-mito-p53 or EYFP-mito_p53 mutant (K24R) expression plasmids for 14 days with GFP or GFP-Hades expression plasmids, followed by colony-forming analysis.
  • EYFP-mito-p53 or EYFP-mito_p53 mutant (K24R) expression plasmids for 14 days with GFP or GFP-Hades expression plasmids, followed by colony-forming analysis.
  • K24R EYFP-mito_p53 mutant
  • MCF cells were transformed with GFP or GFP-Hades RING MR expression plasmids for 24 hours, treated with 5 ⁇ CPT for 6 hours, and nuclear and cytoplasmic fractions were collected to measure ⁇ 53 expression levels. ⁇ 53 expression was accumulated in the nucleus and cytoplasm by CPT treatment, and cytoplasmic expression of p53 was reduced by Hades (FIG. 5E, lower panel).
  • MCF cells were transformed with GFP or GFP-Hades RING MT expression plasmids for 24 hours, the cells were treated with 1 ⁇ CPT for 24 hours, and the cell lysates were immunoprecipitated with anti- ⁇ 53 antibody.
  • RNA interference system After MCF7 cells were transformed with pSuper or pSuper-Hades, the cells were treated with 1 ⁇ CPT for 24 hours. Cell lysates were then immunoprecipitated with anti- ⁇ 53 antibody and immunoblotting was performed using anti-Bcl-2 and anti-p53 antibodies. As a result, the expression of p53-Bcl-2 complex was more increased after CPT treatment in stable MCF7 cells that had Hades removed than control cells (Fig. 5H, lane 3 vs 4), and the expression of p53 was also significantly increased.
  • ⁇ i9i> We further observed the negative role of Hades on p53-dependent cell death using FACS analysis. After transforming MCF7 cells with pSuper or pSuper-Hades, the cells were treated with 1 ⁇ CPT for 24 hours, and sub-GO fractions of MCF7 cells were analyzed by FACS to remove Hades compared to control cells. More apoptotic cells were observed with CPT treatment in knockdown MCF7 cells (FIG.
  • HCT116 p53 + / + and HCT116 p53 _ / " cells were transformed with 40 nM pSuper or pSuper- Hades for 24 hours, treated with 1 ⁇ CPT for 24 hours, and then cells were collected and 30 minutes While staining with JC-1 and analyzed by FACS, a detectable loss of mitochondrial membrane potential was induced after CPT treatment in cells with p53, but not in cells without p53 (FIG. 5J). In cells treated with CPT, Hades interacted rapidly with p53, impairing the interaction between Be 1-2 and p53, weakening the exogenous mechanism of p53.
  • the nuclear release mechanism of p53 performs the function of tumor suppression and [Talos et al. Cancer Res. 65, 9971-9981 (2005)], and other ligases are known to ubiquitize highly expressed p53 in other tumor tissues [Dornan et al. Cancer Res. 64, 7226-7230 (2004); Wenrui et al. , Journal of the National Cancer Institute 96, 1718-1721 (2004)]
  • the present inventors observed the expression level of Hades in human tumor tissues.
  • the expression level of Hades mRNA was determined by quantitative RT-PCR (human hepatocellular carcinoma). And 28 pairs of liver biopsies from adjacent normal tissues.
  • Hades as a protein that interacts with p53.
  • Hades is possible as an E3 ligase for p53's exonuclear mechanism and degrades p53 via the ubiquitin-dependent pathway.
  • Previous studies have shown that Hades is a RING-finger domain located predominantly in the mitochondria (FIG. Id) and has been shown to sumoylat ion drp_l (dynamin ⁇ related protein 1), which regulates mitochondrial activity [Li et al. . , PLOS ONE 3, el 487 (2008); Braschi et al. , EMBO Rep. 10, 748-754 (2009).
  • cytotoxicity induced by Hades via the JNK pathway has been reported [Zhang et al. , Cell Res.
  • Hades has the ability to regulate p53.
  • the immunofluorescence assays show that Hades interacts with p53 that is present outside the nucleus (FIG. Lj), and that ectopic-expressed Hades causes degradation of cytoplasmic p53 (FIG. 5e, lower panel). Based on the results observed, we found that p53 ubiquitination by Hades in the cytoplasm of both the cytoplasmic and mitochondrial compartments; It has been shown to reduce the expression level of p53.
  • Mdm2 reduces p53 expression in the nucleus [Shirangi et ah, FASEB J. 16, 420-422 (2002)], while Hades reduces p53 expression in the cytoplasm (FIG. 5E, lower panel), Mdm2- P53 is ubiquitinated by an independent method (FIG. 3F).
  • the N-terminal lysine residue of p53 was not studied in ubiquitination by Mdm2, but it was confirmed in the present invention that it is a very important residue for ubiquitination by Hades (Fig. 3K ((A))).
  • Hades does not have a negative feedback loop. UV emission or overexpression of p53 is A549 or. It does not induce an increase in Hades mRNA in HCT119 cells.
  • Several cytoplasmic E3 ligase targeting p53 has been studied as E3 ligase in steady state, including ARF-bpl and p300 [Chen et al., Cell 121, 1071-1083 (2005). ; Shi et al. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 16275-16280 (2009).
  • Hades modulates the nuclear release mechanism of p53. Hades inhibits the tumor suppressor function of p53 located in the mitochondria and interferes with the interaction of p53 with Bcl-2 in the transformed model (FIG. 5B). Recent studies have shown that cytoplasmic and mitochondrial p53 binds members of the Bcl-2 family in response to CPT and directly promotes cell death in mitochondria [Mihara et al. , Molecular Cell 11, 577—590 (2003). However, this study confirmed that Hades inhibits the accumulation of p53 induced by CPT (FIG. 5E) and blocks the interaction between p53 and Bcl-2 (FIG. 5F).
  • FIG. 5H FACS Analysis showed that when CPT was exposed to stable MCF7 cells from which Hades was removed compared to the control group, apoptosis was increased in the sub-G0 cell fraction (FIG. 5I). CPT by inhibiting p53's exonuclear mechanism through degradation by dependent proteasomes It has been shown that it can protect the cell death induced by. Based on the above results, we propose that Hades negatively regulates the nuclear release mechanism of p53.
  • Hades is an E3 ligase (Hgase) for p53 tumor suppression, and presented five results for the regulation of p53 in the cytoplasm and the regulation of exonuclear mechanism of p53.
  • Hades plays a unique role in the p53 nuclear release pathway, which acts as a new regulator in the p53-dependent mitochondrial cell death pathway. Will discount. Further research on Hades' physiological functions will be needed.
  • Hades interacts with p53 and inhibits p53's exonuclear mechanism, thereby inhibiting p53's tumor suppression function, and knocking down Hades.
  • Hades was first identified as a negative regulator of p53. Therefore, inhibition of Hades' overexpression in tumor cells would effectively trigger tumor suppression by p53.
  • inhibitors it is possible to develop inhibitors to regulate the expression of Hades protein or to inhibit the action of Hades, as well as to derive new drug candidates that inhibit the interaction of Hades with p53.

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Abstract

본 발명은 종양 억제 타겟으로서 Hades의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적 으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 과발현된 Hades가 p53과 상호작용하여 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 저해함으로써, p53의 종양 억제 기능을 저해시키고, Hades의 제거(knockdown)가 p53의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, Hades가 p53의 부 정적(negative) 조절자임을 처음으로 밝혀냈다. 따라서 종양 세포에서 과발현하는 Hades의 기능을 억제하면 p53에 의한 종양 억제 기능이 효과적으로 일어날 것이다. 즉, Hades 단백질의 발현을 조절하거나, Hades의 작용을 억제하는 억제제를 개발할 수 있으며, 뿐만 아니라 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 신약 후보물질을 도출 하여 항암제로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
종양 억제 타겟으로서 H a d e s의 용도 【기술분야】
<ι> 본 발명은 종양 억제 타겟으로서 Hades의 용도에 관한 것으로， 더욱 구체적 으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물에 관한 것이다.
<2>
【배경기술】
<3> 종양 억제자인 p53은 DNA 손상 및 저산소증 (hypoxia) 등을 포함하는 다양한 세포 신호에 대해 반응하여 세포사멸 (apoptosis) 및 세포 주기 정지 (arrest)를 유 도하는 중앙 스위치 역할을 한다. 핵 (nucleus) 내에서 p53의 기능은 세포의 항상성 유지 (eel hilar homeostasis) 및 유기적 생존 (organismal survival)에서 중요한 역 할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있으며 [Dulic et al. , Cell 76， 1013-1023 (1994)； Lowe et al . , Nature 362, 847-849 (1993)； Lane DP Cancer . Nature 358, 15-16 (1992)； Raycroft et al . , Science 249, 1049-1051 (1990)]， 또한 핵 외부에 서 핵방줄 (exMiuclear) 기전과 같은 transcript ion- independent mechanism은 p53의 종양 억제 기능을 유지하는데에 중요하다 [Green et al . , Nature 458, 1127-1130 (2009)]. ρ53의 핵방출 (exonuclear) 기전은 단백질 합성 및 유전자 전사 (transcription)의 부재에서 p53-의존적인 세포사멸 [Wagner et al .， Genes Dev. 8, 2817-2830 (1994)] 및 전사적으로 결함이있는 p53 돌연변이에 의한 세포사멸의 유도 [Caelles et al , , Nature 370, 220-223 (1994)； Haupt et al . , Genes Dev. 9, 2170-2183 (1995)]를 포함한다. 또한， 무세포계 (eel 1-f ree system)에서 세포질 p53( cytoplasmic p53)의 활성은 미토콘드리아 시토크롬 (Xmitochondrial cytochrome C)의 방출을 유도한다 [Schuler et al. , J Biol Che . 275, 7337-7342 (2000)]. p53은 DNA 손상시 세포질 및 미토콘드리아에 위치하고 [Marchenko et al. , J Biol Chem. 275， 16202 (2000)], 세포질에서 Bcl—xl 및 Bad에 결합한다 [Mihara et al . , Molecular Cell 11, 577-590 (2003)]. 이로인해 pn^apoptotic Be 1-2 단백질 및 항-세포사멸 (anti-apoptotic) Be 1-2 단백질 사이의 상호작용을 억 제하고, pro-apoptotic Be 1-2 단백질의 올리고머화 (oligomerization)를 촉진한다 [Chipuk et ah, Science 303, 1010-1014 (2004)； Jiang et al . , Mol Cell Biol. 26, 9071-9082 (2006)； Tomita et al. , J Biol Chem. 281, 8600-8606 (2006)].
<4> 세포질 p53의 조절 메커니즘 및 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전은 부분적으 로 설명되어져왔다. p53의 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 p53의 위치 및 핵방출 (exonuclear) 기전을 조절하는 것으로 생각되었다 [Geyer et al .， Nat Cell Biol. 2， 569-573 (2000); Marchenko et al . , EMBO J. 26, 923-934 (2007)]. p53의 유비 퀴틴화된 형태는 Bax에 결합하지 못하는 반면, 유비퀴틴—특이적 프로테아제 (protease)인 HAUSP에 의한 p53의 탈유비퀴틴화 (deubiquitination)는 BH3-도메인 단백질에 대해 p53을 결합하도록 하며， 미토콘드리아 투과성 및 세포 사멸을 증가 시킨다 [Marchenko et al . , Cell Cycle 6, 1718-1723 (2007)]. 따라서， p53 유비퀴 틴화는 p53과 Bcl-2 단백질 사이의 상호작용을 억제한다. 상기의 결과들은 p53 유 비퀴틴화가 프로테아좀 (proteasomal) 분해와 같은 p53의 핵-세포질 셔를링 (shuttling) 및 핵방출 (exonuclear) 기전에서 중요한 역할을 수행하는 것을 의미한 다. 하지만， p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 조절하는 메커니즘은 아직 정확하게 완전히 밝혀지지 않았다。
<5> 이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, Hades가 미토콘드리아에 위치하여 p53과 세포질에서 결합하는 것을 확인하였으며, 또한 종양 세포에서 Hades 단백질이 과발현되고， 상기 과발현 된 Hades 단백질이 p53의 DNA 결합 도메인과 상호작용하여 p53의 기능을 억제하는 것을 처음으로 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다ᅳ
<6>
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
<?> 따라서 , 본 발명의 주된 목적은 Hades 단백질과 p53의 상호작용을 억제하는 효과를 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물을 제공하는 데 있다。
<8> 본 발명의 다른 목적은 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 항암제의 스크리 닝 방법을 제공하는데 있다.
<9> 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 약제를 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는데 있다.
<10>
【기술적 해결방법】
<π> 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성 물을 제공한다. 본 발명에서는 Hades가 p53의 음성적 조절자임을 밝힘으로써 상기 Hades의 발현이나 작용을 억제하면 p53의 기능을 촉진하여 종양 억제를 강화할 수 있음을 처음으로 제시하였다.
<12> 상기 Hades는 p53에 결합하는 단백질로써， N-말단에 TM( transmembrane) 도메 인 또는 단일 펩타이드 영역， 중간 부분에 두 번째 TM 도메인 및 C-말단에 RING- finger 도메인 (예컨대, E3 ligase 도메인)을 가지고 있으며， 미토콘드리아에 위치 한다.
<13> 본 발명에 따르면， 상기 Hades는 종양 세포에서 과발현되는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 본 발명의 실시예에서는， 인간 종양 조직에서 Hades의 발현 수준을 관찰하였으며， 종양 조직에 인접한 정상 조직에 비해 종양 조직에서 2배 이 상높은 Hades mRNA 발현이 관찰되었다 (도 5k 참조).
<14> 본 발명에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 기존에 단 백질의 발현이난 작용을 억제하기위해 알려진 어떤 물질이나 방법도 사용될 수 있 으나, 바람직하게는 Hades 유전자의 전사 또는 번역을 하향조잘하거나, Hades 단백 질의 작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물을 제공한다. 여기 서, Hades 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절한다는 것은 Hades 유전자의 프로모 터에 결합하여 전사를 하향조절하거나, 전사후 mRNA를 분해하거나， 번역을 저해하 는 등의 모든 하향조절을 포함한다. 또한, Hades 단백질의 작용을 억제한다는 것은 상기 단백질의 활성을 억제하거나， 상기 단백질과 상호작용하는 단백질의 결합 부 위에 경쟁적으로 결합하여 작용을 방해하는 것 등을 포함한다.
<15> 상기 Hades 단백질의 발현 억제제의 예로는， Hades 유전자의 RNA 간섭 (RNA interference)을 이용한 siR A( short interfering RNA) 또는 shRNA( short hairpin RNA)를 들 수 있다. RNA 간섭 (이하 "RNAi" 로 약칭함)은 많은 진핵생물에서 보존 된 전사후 유전자 조절의 한 방법이다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은 이중나선 RNA(dsRNA) 분자에 의해서 유도된다 [Fire et al . , Nature 391： 806-811 (1998)].
"siRNA" 라고도 불리우는 이러한 짧은 dsRNA 분자는 단일가닥으로 분리된 후 " RNA-유도 침묵 복합체 (RNA induced silencing; RISC)" 에 결합하여 표적화된 mRNA 를 절단하거나 번역을 저해한다 [Elbashir et aL , Genes Dev, 15： 188-200 (2001)].
<i6> 그러므로, 본 발명은 Hades 유전자의 mRNA를 표적화하는 약 17 개의 뉴클레 오티드 내지 약 25 개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 이중쇄 RNA를 포함하는 분 리된 siRNA를 제공한다. 상기 siRNA는 센스 R A 가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가 닥을 포함하고， 이들 두 가닥은 표준 왓슨 -크릭 염기쌍 상호작용에 의해서 서로 결 합 (annealing)한다. 상기 센스가닥은 표적 mRNA 내의 표적서열에 동일한 핵산서열 을 포함한다. siRNA의 표적서열을 선택할 수 있는 기술은 예컨대, 문헌 [Tuschl et al. , "The siRNA User Guide" revised Oct. 11 (2002)]에 기재되어 있다.
<17> 본 발명의 siRNA를 제조하는데 사용된 Hades 표적 서열은 Hades mRNA 3' 부 근의 비번역 부분 중 5'-GGGAUUUUUAUCUCGAGGC-3' 및 5 ' -CGUGUGUGUAGAGGAC A-3 '의 두 부분이여， 이에 해당하는 Hades siRNA 서열은 전자는 5'- GCCUCGAGAUMAMUCCCtg-3' (안티센스 서열: 서열번호 4) 및 5'- GGGAUUUUUAUCUCGAGGCtt-3' (센스 서열)이며, 후자는 5'-UUUGUCCUCUACACACACGtg-3' ( 안티센스 서열: 서열번호 5)과 5'-CGUGUGUGUAGAGGACAAAtt-3' (센스 서열) 이다. siRNA는 double strand의 형태를 가지고 있으며， 이중 타겟하는 유전자 서열 부분 과 결합할 수 있는 strand를 anti-sense strand라 표현하며, 그렇지 않는 strand를 sense strand라 표현한다. siRNA를 세포내 주입하기 위해서는， 반드시 double strand 형태로 합성하여야 하며， 그렇지 않으면 세포내에서 siRNA를 인식하지 못하 게 된다.
<18> 본 발명의 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 두 개의 상보적이고, 단일쇄
(single-stranded)의 RNA 분자를 포함하거나， 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 형 성하고 단일쇄의 "머리핀 (hairpin)" 영역에 의해서 공유결합된 단일 분자를 포함 할 수 있다. 상기 후자의 경우를 shRNA(short hairpin RNA)라고 하며， 상기 shRNA 는 single strand로 약 50—70 뉴클레오티드 (nucleot ide) 길이이며 , in vivo상에서 st em- loop 구조를 이루고 있다. 5-10 뉴클레오티드의 loop 부위 양쪽으로 상보적으 로 19-29 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 st em을 형성한다 . shRNA는 일반적으로 in vivo 상에서 Pol m promoter에서부터 상보적인 DNA sequence의 전사에 의해 합성된다, Pol-ΙΠ로 유도된 전사는 well-defined start site에서 시작되어 4개 이상의 티미딘 (thymidine)으로 이루고 있는 선상 (-ΓΠΤ-)의 second residue에서 종결되어 non-poly (A) transcript를 생성한다. Pol ΠΙ promoter는 모든 세포에서 활성되며 shRNA의 발현이 가능하다. 전사 후 shRNA는 Dicer에 의해 loop가 절단되고 siRNA처럼 RISC와 작용하게 된다 [참조, Tuschl et al. , Cell 110(5)： 56374 (2002)].
<ΐ9> 본 발명의 si RNA는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 알려진 많은 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 예컨대， siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법에 의해서 생 산될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 siRNA는 화학적으로 합성하여 얻을 수 있 다. 즉, 염기를 차례로 하나한 화학적으로 붙여나가면서 만들며, 이후 PAGE 정제를 수행하여 고순도의 siRNA만을 최종적으로 얻는다.
<20> siRNA는 상보적이고 분리된 두 개의 RNA 분자 또는 두 개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 또한 다른 방법으로서， siRNA는 적절 한 프로모터를 이용하여 재조합 DNA 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 플라스미드 로부터 본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적절한 프로모터는 예컨대， U6 또는 HI RNA pol m 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 또한 본 발 명의 재조합 플라스미드는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키 기 위해서 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
<2i> 본 발명의 siRNA는 재조합 플라스미드로부터 상보적이고 분리된 두 개의 RNA 분자 또는 두 개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 발현될 수 있다. 본 발명의 siRNA를 ^현시키는데 적절한 플라스미드꾀 선택 siRNA를 발현시키기 위한 핵산서열을 플라스미드 내로 삽입하는 방법 및 재조합 플라스미드를 목적하는 세포로 전달하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 기술 범위 내에 있다. 예컨대， 문헌 [Tuschl et alᅳ , Nat. Biotechnol, 20: 446-448 (2002)]； [Brummelkamp et al. , Science 296： 550-553 (2002)]； [Miyagishi et al. , Nat. Biotechnol. 20： 497-500 (2002)]； [Paddison et al . , Genes Dev. 16： 948-958 (2002)]； [Lee NS et al. , Nat. Biotechno 20: 500-505 (2002)]； 및 [Paul et al., Nat. Biotechnol. 20： 505-508 (2002)]를 참고할 수 있다.
<22> 본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 Hades 단백질의 발현 억제제는 Hades 유전자의 mR A와 상보적인 염기서열， 더욱 바람직하게는 서열번호 4 또는 5의 염기 서열을 갖는 Hades si RNA (short interfering) 또는 이를 전사하는 유전자인 것을 특징으로 한다,
<23> 본 발명의 종양 억제 조성물에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 상기 Hades와 p53의 상호작용 (interact ion)을 저해하는 것을 특징으로 한 다. 상기 Hades와 p53 상호작용 억제제의 예로는 Hades의 p53-결합부위 (C-말단 RING-finger 도메인)와 특이적으로 결합할 수 있는 항 -Hades-항체 등이 될 수 있 다。
<24> 본 발명에 있어서 , 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 DNA 결합, 전사 활 성 , 스트레스 -유발 세포 사멸 및 p53-유발 세포 사멸을 저해하는 것을 특징으로 한 다.
<25> 본 발명의 실시예에서는， 구체적으로 Hades와 p53의 상호작용에 의해 상기 열거된 것과 같은 P53의 기능을 저해하는 것을 밝혀내었다. 여기서， "p53의 기능 " 이란 세포내에 DNA 손상이 유발된 경우， 세포의 성장을 세포 주기 G1 기에 멈추 게 하여 DNA 손상을 복구 (repair)하는 과정이 이루어지게 함으로써 암세포가 생성 되지 못하도록 작용하는 것은 물론, 이미 암세포가 성장하여 급격히 커진 경우， 형 질전환된 세포가 스스로 사멸되도록 하는 프로그램 (programmed cell death; PCD)을 작동시켜 이상 세포를 조직 내에서 제거하는 세포 사멸 (apoptosis)이 유발되도록 작용하여 암이 진행되는 것을 막는 것을 포함하는 당업계에 공지된 p53의 전반적인 항암 기작을 모두 포함한다.
<26> 또한, 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 유비퀴틴화 (ubiquitination)를 ᅳ 유도하는 것을 특징으로 한다.
<27> . 본 발명의 실시예에서는， Hades가 p53과 세포질에서 상호작용하는 것을 확인 하였으며， 상기 상호작용에 의해 Hades가 cytoplasmic p53의 분해를 유도하고， 특 히 N-말단 24 번째 라이신 (lysine) 잔기를 타켓으로 p53의 유비퀴틴화를 유도하는 것을 확인하였다 (도 3j 참조).
<28> 본 발명에 있어서， 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades의
C-말단 RING-finger 도메인을 표적하는 것을 특징으로 한다.
<29> 본 발명의 실시예에서는, Hades의 C-말단 RING-finger 도메인이 p53의 DNA- 결합도메인과 결합함을 밝혀내었다 (도 If 참조). 따라서， 상기 Hades의 p53 결합 부위를 표적하여 특이적으로 결합하여 Hades와 p53의 상호작용을 경쟁적으로 저해 할 수 있는 템타이드를 디자인할수 있다.
<30>
<31> 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다:
<32> (a) Hades 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
<33> (b) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Hades 단백 질의 발현이 감소되는지 여부를 결정하는 단계.
<34> 상기 (a) 단계에서， 상기 동물세포는 의도적으로 Hades를 과발현하는 플라스 미드로 형질전환 시킬 수도 있다。 상기 (b) 단계에서, 발현 감소여부는 RT-PCR을 통한 RNA수준 또는 웨스턴 블롯팅 등을 통한 단백질 수준에서 측정할 수 있다。
<35> <36> 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다:
<37> 하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법 :
<38> (a) 시험 약제의 존재하에 p53-결합부위를 함유하는 Hades 단백질 또는 그 단편과 p53을 접촉시키는 단계 ; 및
<39> (b) 시험 약제가 없는 대조군과 비교하여 Hades와 p53의 상호작용이 저해되 는지 여부를 결정하는 단계.
<40> 본 발명의 상기 "상호작용을 저해하는 항암제" 는 Hades가 p53의 기능을 저 해하는 것을 억제하여, 암을 치료 및 예방하는 것을 의미한다.
<4i> 또한， 상기 "상호작용을 저해" 는 Hades와 p53 간의 상호작용을 억제, 제거 하는 것을 모두 포함하며， 상호작용 저해에는 Hades와 p53 상호간의 작용 자체를 저해할 수도 있으나 Hades와 p53 각각에 별도로 작용하여 상호간의 작용을 저해하 는 것도 포함된다.
<42> 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서， 상기 Hades의 단편은 서열번호 3의 아미 노산 서열을 갖는 p53-결합부위 (C-말단의 RING-finger 도메인)을 포함하는 것을 특 징으로 한다.
<43> 또한, 상기 스크리닝 방법에 있어서， 상기 (b) 단계에서 Hades와 p53의 상호 작용은 Hades의 p53-결합부위 (C-말단의 RING-finger 도메인)와 p53의 DNA-결합 도. 메인 사이에서 일어나는 것을 특징으로 한다.
<44> 본 발명에 있어서， 상기 (b) 단계의 Hades와 p53의 상호작용은 면역침전
(immunoprecipitation) 분석 , GST 풀 -다운 (pul 1-down) 분석 및 콜로니 (colony)-형 성 분석에 의해 측정하는 것을 특징으로 하나， 이에 한정되지 않으며 당업계에 공 지된 다양한 방법으로 응용하여 측정할 수 있다.
<45> 상기 "면역침전 (immunoprecipitation) 분석" 은 현재 널리 사용되고 있는 면역화학적 기술 중 하나로써, 항원과 항체의 친화성을 이용하여 용액으로부터 항 원 (또는 항원과 친화성을 가진 물질)을 특이적으로 분리하는 기술이다. 이 기술은 항원의 분자량의 결정， 단백질의 상호작용 연구， 특정 효소 활성의 측정, 단백질의 전사후 변화 모니터링과 단백질의 양과 존재 유무 등을 알 수 있는 기술이며, 탐지 하기 어려운 소량의 단백질도 면역침강으로 10,000 배까지 농축할 수 있어 탐지가 가능하다ᅳ 면역침전 분석 방법은， 세포나 조직에서 적절한 용해 버퍼 (lysis buffer)를 이용하여 단백질들을 추출한 다음, 일차 항체와 Protein A-, G- 또는 L- agarose 또는 2차 antibody— agarose와 결합시킨다. 상기 2차 ant i body— agarose 결 합 기술은 특정 단백질의 항체와 결합하지 않은 다른 단백질과의 분리를 가능하게 한다. 여기서， agarose의 선택은 원하는 단백질 (항원)에 대한 일차 항체의 isotype 과 종 기원에 의해 결정된다. 또한 면역침강 분석은, non-denaturing 조건에서 특 정 단백질과 결합하는 다른 단백질을 검출할 목적으로 사용되기도 한다.
<46> 상기 "GST풀-다운 (pull-down) 분석" 은 tagged protein 이나 the bait (예 컨대， GST, His6, biotin 등)와 다른 단백질 (test protein, or prey) 간의 상호작 용을 시험하기 위한 간단한 기술이다. bait는 적절한 발현 시스템 (eg, Escherichia coli)에서 정제된 것으로 글루타치온 친화성 겔에서 고정된다. bait는 새로운 단백 질 파트너를 구별해내거나 이전에 단백질 파트너로 예상되었던 단백질을 확인하기 위해 2차 친화성 지지체로 쓰인다.
<47> 상기 "콜로니 (colony)-형성 분석 " 은 하나의 세포가 콜로니를 형성하도록 성장하는 능력에 기초하여 세포의 성장능력을 분석 및 시험하기 위한 기술이다. 이 때， 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성됨으로 정의한다. 특히 암세포의 경우 무한 증식을 할 수 있는 특징을 가지고 있으며， 특정 유전자를 암세포내에 도입한 후， 도입된 세포만을 선택적으로 배양시켜 콜로니의 형성 유무 및 갯수를 측정하여 유 전자의 암세포 성장 억제 능력을 평가할 수 있다.
<48>
<49> 본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리 닝된 약제를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.
<50> 본 발명에 따른 상기 항암제 조성물은 Hades와 p53의 상호작용을 저해할 수 있는 물질이라면 어떤 것이든 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 Hades와 p53의 상호작용을 제거, 억제하기 위한 어떤 것이든 포함될 수 있다. 항암제 조성물은 Hades와 p53 상호간의 작용 자체를 저해하거나， Hades와 p53 각각에 별도로 작용하 여 상호간의 작용을 저해하는 것도 포함된다。
<51> 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상 적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비를， 만니를, 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트， 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈, 셀를로스， 물, 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함 하나, 이에 한정되는 것은 아니다。
<52> 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제， 향미제， 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. <53> 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고， 예컨대 정맥내 투 여, 복강내 투여, 종양내 투여， 근육내 투여, 피하 투여, 심근내 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 뇌암， 두경부암 및 유 방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테터 내로 직접 주 사하여 투여할수 있다.
<54> 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도， 연력, 성별， 체중， 약물에 대한 민감도， 현재 치료법의 종류， 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며， 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결 정될 수 있다. 바람직하게는 siRNA의 경우 2-5 mg/kg을 투여하는 것이 바람직하고， Hades 작용 억제제의 경우 0.1-1 g/kg을 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조 성물은 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며， 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다, <55> 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 / 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용 량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용 액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제, 분말제, 과립제， 정제 또는 갑셀제 형 태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
<56> 본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상 적인 화학 요법 또는 방사 2요법과 함께 이용될 수도 있으며， 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함 께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin) , 프로카르바진 (procarbazine)， 메클로레타민 (mechlorethamine) , 시 클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosf amide) , 멜팔란
(melphalan), 클로라부실 (chlorambuci 1 ) , 비술판 (bisulfan) , 니트로소우레아 (nitrosourea) , 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin) , 독소 루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin)， 플리코마이신 (pi icomycin)， 미토 마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide)， 탁목시펜 (t amoxifen) , 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5—플루오로우라실 (5-f luorouraci 1 )， 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblast in) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포 함한다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는 Hades와 p53의 상 호작용을 저해하는 항암제의 스크리닝 키트를 제공한다:
(a) Hades의 p53-결합부위 (C-말단 RING-finger 도메인)를 함유하는 폴리펩타 이드;
(b) p53의 DNA-결합 도메인을 함유하는 폴리펩타이드; 및
(c) 상기 폴리펩타이드들 사이의 상호작용을 검출하는 시약.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 바람직하게는 본 발명의 스크리닝 방법에 있 어서 (a) 단계 전에， Hades의 p53-결합부위와 시험약제 사이의 결합 친화성 (binding affinity)을 측정하여 항암제 가능성이 높은 약제를 선별하는 단계를 더 포함할 수도 있는바, 상기 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 구현하기 위하여 사용 될 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 종양 억제용 조성물을 제조하기 위 한 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제의 용도를 제공한다。 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 필요한 개체에 약제학적 유효량의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제를 투여 하는 것을 포함하는 종양 억제 방법을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명자들은 과발현된 Hades가 p53과 상호작용하여 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 저해함으로써, p53의 종양 억제 기능을 저해시키고, 또한 Hades의 제거 (knockdown)는 p53의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, Hades가 p53의 부정적 (negative) 조절자임을 처음으로 밝혀내었다。 따라서 종양 세포에서 과발현하는 Hades의 기능을 억제하면 p53에 의한 종양 억제 기능이 효과적으로 일 어날 것이다ᅳ
【도면의 간단한 설명】
도 la는 p53과 상호작용하는 파트너를 확인하기 위해 사용된 스크리닝 절차 의 모식도를 나타낸 도면이며， 도 lb는 cDNA 라이브러리를 이용한 p53과 상호작용
_ 35
하는 In vitro형질전환된 S_labeled 단백질들을 나타낸 도면이며， 도 lc는 Hades 의 도메인을 나타낸 도면이며, 도 Id는 U20S 세포에서 Hades의 위치를 공초점 현미 경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이며 (upper panel： Control GFP plasmid; lower panel: 형질전환 시킨 GFP-Hades), 도 le는 In vitro 풀 -다운 분석으로 p53과 Hades의 상호작용을 확인한 결과이며， 도 If는 Hades의 p53 결합 영역을 확인하기 위해 N-말단 또는 C-말단과 p53의 상호작용을 측정한 결과이며， 도 lg는 In vitro 풀 -다운 분석으로 MCF7 세포에서 Hades와 p53의 상호작용을 확인한 결과이며 (lane 2： GST로 배양; lane 3： GST-Hades로 배양)， 도 lh는 In vivo 면역침강 분석으로 H1299 세포에서 Hades와 p53의 상호작용을 확인한 결과이며， 도 li는 In vivo면역 침강 분석으로 MCF10A 및 NHLF 세포에서 Hades와 p53의 상호작용을 확인한 결과이 며， 도 lj는 공초점 현미경을 통해 Hades와 p53이 공존 (colocalized)함을 보여주는 결과를 나타낸 도면이다.
<71>
<72> 도 2a는 Hades의 발현량에 따른 p53의 발현 수준 변화를 나타낸 도면이며, 도 2b는 MCF10A 및 NHLF 세포에서 Hades의 발현량에 따른 p53의 발현 수준 변화를 나타낸 것이며， 도 2c는 Hades의 자가 -유비퀴틴화 활성을 나타낸 도면이며， 도 2d 는 Hades의 RIN-finger 도메인의 p53 발현 감소 활성을 확인한 결과이며, 도 2e는 Hades에 의한 p53 발현 감소가 MG132 처리에 의해 회복되는 결과를 보여주는 도면 이며， 도 2f는 Hades shRNA를 이용하여 Hades를 제거 (knockdown) 시키는 경우 p53 의 발현이 회복되는 결과를 보여주는 도면이며， 도 2g는 CHX를 처리한 세포에서 Hades silencing에 의한 p53 안정화의 역학적 분석 결과를 나타낸 도면이며， 도 2h 는 Hades를 제거 (knockdown) 시키는 경우 핵과 세포질에서의 p53 발현 수준을 측정 한 도면이며， 도 2i는 Hades에 의해 발현이 감소된 p53이 LMB 처리에 의해 회복되 는 결과를 보여주는 도면이며， 도 2j는 Hades의 발현에 따른 야생형 p53 및 돌연변 이 p53에서의 p53 발현 수준 변화를 나타낸 도면이다.
<73>
<74> 도 3a는 Hades가 돌연변이 p53과도 상호작용함을 보여주는 도면이며， 도 3b 는 Hades가 p53을 유비퀴틴화 시킴을 보여주는 도면이며, 도 3c는 In vitro유비퀴 틴화 분석을 통해 Hades 또는 Mdm2에 의해 p53의 유비퀴틴화가 유도됨을 보여주는 도면이며, 도 3d는 In vitro유비퀴틴화 분석 및 면역블롯팅 분석을 통해 p53의 유 비퀴틴화가 Hades에 의해 유도됨을 보여주는 도면이며， 도 3e는 In vivo 유비퀴틴 화 분석을 통해 Hades에 의해 p53의 유비퀴틴화가 유도됨을 보여주는 도면이며, 도 3f는 Hades에 의한 p53의 분해는 Mdm2에 의존적이지 않음을 보여주는 도면이며， 도
3g는 GST-Hades RP가 존재하는 MEF p53— /_ ;mdm2— 세포에서 Hades에 의한 p53의 유비 퀴틴화가 일어남을 보여주는 도면이며, 도 3h는 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에 서 Mdm2가 영향을 미치지 않음을 보여주는 도면이며, 도 3i는 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 p53 라이신 잔기가 영향을 미치는지 여부를 보여주는 도면이며， 도 3j는 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 p53의 N-말단 24 번째 라이신 잔기가 영 향을 미침을 보여주는 도면이며， 도 3k는 Hades에 의한 유비퀴틴화는 돌연변이 p53 K24R에서는 영향을 미치지 않음을 보여주는 도면이다.
<75>
<76> 도 4a는 Hades에 의해 p53-의존적 전이활성이 억제됨을 보여주는 도면이며， 도 4b는 LMB(leptomycin B)가 존재하는 상태에서는 Hades에 의한 p53-의존적 전이 활성이 억제되지 않음을 보여주는 도면이며， 도 4c는 전이활성이 결핍된 돌연변이 p53의 분해는 Hades에 의해 매개되므로 Hades에 의한 p53의 분해는 전이활성과 무 관함을 보여주는 도면이며, 도 4d는 과발현된 Hades에 의해 p53의 세포 성장 억제 (growth suppression) 기능을 저해함을 보여주는 도면이며， 도 4e는 콜로니 -형성 분석을 통해 Hades가 p53의 세포 성장 억제 기능을 저해함을 보여주는 도면이며, 도 4f는 콜로니 -형성 분석을 통해 Hades 제거 (knockdown)에 의한 p53의 회복을 관 찰한 도면이며, 도 4g는 Hades 제거 (knockdown)는 다양한 스트레스 조건에서 세포 생존 능력 (cell viability)을 저해함을 보여주는 도면이다.
<77>
<78> 도 5a는 pEYFP-mito-p53로 형질전환된 U20S 세포에서 pEYFP-mito-p53이 미토 콘드리아에 위치함을 보여주는 도면이며， 도 5b는 과도하게 발현된 Hades에 의해 pEYFP-mito-p53 및 Bcl-2 사이의 상호작용이 저해됨을 보여주는 도면이며, 도 5c는 콜로니 -형성 분석을 통해 pEYFP-mito-p53로 형질전환된 H1299 세포에서 과발현된 Hades에 의해 콜로니 형성이 저해됨을 보여주는 도면이며， 도 5d는 콜로니 -형성 분 석을 통해 돌연변이 pEYFP-mito-p53(K24R)로 형질전환된 MEF 세포 (p53— ;Mdm2—一)에 서 과발현된 Hades에 의해 콜로니 형성이 저해되지 않음을 보여주는 도면이며, 도 5e는 Hades가 CPT에 의해 유도된 p53 발현 수준을 감소시킴을 보여주는 도면이며， 도 5f는 CPT 처리된 세포에서 p53 및 Bcl-2 사이의 상호작용을 억제함을 보여주는 도면이며， 도 5g는 CPT 처리에 의해 유도된 세포 사멸 (apoptosis)을 Hades가 억제 함을 보여주는 도면이며， 도 5h는 CPT 처리된 세포에서 Hades의 제거 (knockdown)는 p53 및 Bcl-2 사이의 상호작용을 저해하지 못함을 보여주는 도면이며， 도 5i는 CPT 처리된 세포에서 Hades의 제거 (knockdown)는 세포 사멸 (apoptosis)을 저해하지 못 함을 보여주는 도면이며， 도 5j는 CPT 처리된 세포에서 Hades의 제거 (knockdown)는 CPT에 의해 유도되는 미토콘드리아 손상을 자극함을 보여주는 도면이며， 도 5k는 HCC( human primary hepatocellular carcinoma) 조직과 인접한 정상 조직에서의 Hades 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
<79>
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
<80> 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<81>
<82> 실시예 1. 시약 및 실험방법
<83> 1-1. 세포 배양 및 형질전환 (transfection)
<84> 본 실험에서 사용될 MCF7, A549, U20S 및 HeLa 세포를 Korean Cell Line
Bank(Korea)에서 구입하였으며, MEF p53_/" 및 MEF p53^;Mdm2_/" 세포는 Dr. Wei
Gu(Columbia University, USA)로부터 조달받았다. MCF7, 293, 293T, HCT116 p53+/+,
HCT116 P53 세포들과， MEF p53 /_ 및 MEF p53_/— ;Mdm2— 세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1 ) 페니실린 (penici 1 Πη)/스트렙토마이신 (streptomycin)이 포함 된 DMEM 배지에 유지시켰다. 그리고, 안정한 pSuper-Hades MCF7 세포를 10¾> FBS 및 500 g/ml G418(neomycin)이 보충된 DMEM에 유지시켰다. 일시적 주입법 (transient transfection)은 제조사의 지시에 따라 Hi lymax(Invitrogen)를 이용하여 수행하였 다, 이후 siRNA 형질전환을 위해， RNAimax(Invitrogen)을 제조사의 지시에 따라 사 용하였다。 Hades를 위한 siRNA 및 mock siRNA는 Ambion(USA)으로부터 얻었으며, 그 의 서열은 다음과 같다: Hades siRNA, GGGAUUUUUAUCUCGAGGC 및 CGUGUGUGUAGAGGACAAA; mock siRNA, AUGAACGUGAAUUGCUCAAG .
<85>
<86> 1-2. 항체 (Antibodies) 및 시약 (Reagents)
<87> p53(Do-l), 튜뷸린 (tubulin; B7), Bcl-2(C2) 및 유비퀴틴 (P4D1)에 대한 각각 의 마우스 단클론 항체 및 라민 (lamin; C20)에 대한 염소 다클론 항체인 anti-goat IgG-HRP (sc-2020) , normal mouse IgG (sc— 2025)， ant i -mouse IgG— Texas Red (sv— 2781) 및 protein A agarose (sc-2001)와 protein G agorose (sc-2002)는 Santa Cruz Technologies(USA)로부터 구매하였다. Hades에 대한 토끼 다클론 항체는 N- SGERPKGIQETEEM-C 및 N-SRAKPEDRESLKSAOC의 펩타이드 서열을 이용하여 Labfrontier (Korea)로부터 제조하였다. Anti-^-actin 항체 (A5441)는 시그마 (Sigma)로부터 구매하였으며, anti-mouse IgG-HRP (7076)는 Cell Signaling Technology(USA)로부터 구매하였으며, ant i -cytochrome C (556433) 및 Tom 20 (612278) 항체는 BD Pharmingen(USA)로부터 구매하였으며， polyubiquitin chain(FK-l) 항체는 BioMol (USA)로부터 구입하였다. In vitro 유비퀴틴화 분석을 위해， El (Ubel), E2 (UbcHl, UbcH2, UbcH3. UbcH5a, Ubc5Hb, Ubc5Hc, UbcH6, UbcH7, UbcH8, UbcH9, UbcHlO) 및 Hismbiquitin을 Boston Biochem(USA)로부터 구 입하였다. 캄토테신 (Camptothecin; CPT), 액티노마이신 D(Act inomycin D), 크리스 탈 바이올렛 (crystal violet), 프로피디움 요오드화물 (prop id him iodine) 및 DAPI 는 Sigma로부터 구입하였으며， Biopure(Canada)로부터 시클로핵시미드 (cycloheximide)를， Calbiochem(USA)로부터 MG132 (474791)를 구입하였다. JC-1 염 색 키트 및 Nutlin 3은 Cayman Chemical (USA)로부터 구입하였다. 아넥신 V(Annexin V)는 BD Pharmingen(USA)로부터， 랩토마이신 B(Leptomycin)는 Alexis Biochemical (USA)로부터 구입하였다.
<88>
<89> 1-3. 플라스미드 (Plasmid) 제조
<90> 하기의 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 HeLA 세포 cDNA로부터 Hades 유전자를 분리하고， 다음의 백터 내로 subcloning 하였다.
<91> 【표 1】
백터 및 프라이더
Figure imgf000017_0001
<94>
<95> RING 비활성 돌연변이 (C302S/C305S)를 제조하기 위해， 점변이 돌연변이
(site-directed mutagenesis)를 pGEX— Hades Ring protein(RP) 또는 pEGFP—Hades를 이용하여 수행하였으며， 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.
<97> 【표 2】
점변이 1:연변이 위한 프라이머
Figure imgf000017_0002
Hades를 타켓하는 shRNA 발현 플라스미드를 제조하기 위해, shRNA에 해당하 는 올리고머를 pSuper-GFP-neo vector에 subcloning 하였으며, 이때 사용된 프라이 머는 하기 표 3과 같다. 상기 서브클로닝된 shRNA 발현 플라스미드를 세포 내에 삽 입시키게 되면， 플라스미드가 자체적으로 shRNA 만을 과도하게 생성하게 된다. 더 구체적으로, 일단 shRNA에 해당하는 DNA 서열을 백터에 클로닝한 후, 합쳐진 백터 를 세포내로 주입하게 되면 shRNA가 생성된다. 이러한 방법으로 shRNA 백터를 만든 이유는 siRNA를 이용할 때의 추가적인 합성 비용을 절감할 수 있으며， 동시에 shRNA 백터가주입된 세포만을 선택적으로 배양시킬 수 있기 때문이다.
하기 두 종류의 프라이머를 사용한 이유는， 한 종류의 프라이머만을 사용하 였을 때보다 Hades의 발현 억제 효과가 높았기 때문이다.
<103> 【표 3]
shRNA 발현 플라스미드 제초위한 프라이머
Figure imgf000018_0001
<105>
<i06> P53 단편 (1—185 및 185— 393)을 포함하는 pcDNA HA-p53 플라스미드는 Dr,
Gerald M„ Cohen(Leicester University, UK)로부터 제공받았다.
<i07> 또한 pCDNA-p53 Myc/His, pEYFP mito-p53 및 pEGX— p53은 PCR로 pcDNA HA-p53 을 이용하여 subcloning을 수행하였으며， 이때 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나 타내었다ᅳ
<108> 【표 4】
프라이머
Figure imgf000019_0001
<111>
<ii2> p53 돌연변이 (C135Y)는 Dr. Carl G. Maki (University of Chicago, USA)로부 터， p53 라이신 (lysine) 돌연변이는 Dr. Randy Y. C. Poon(Hong Kong Iniversity of Science and Technology, Hong Kong)로부터 제공받았다. 그리고， p53 N24KR 돌 연변이는 pcDNA p53-FLAG( forward: GACCTATGGAGACTACTTCCTG, reverse: CAGGAAGTAGTCTCCATAGGTC)를 이용하여 PCR로 점 돌연변이 (point mutagenesis)를 유 발하여 제조하였다ᅳ pGL3-Bax 리포터 (reporter) 플라스미드는 Dr. Anastasis Stephanou(Unuversity College London, UK)로부터， pPV-PUMA FLAG2-Luc는 Dr. Bert Vogelstein( Johns Hopkins Medical Institutions, USA)로부터， pCI_Bcl_2는 Dr, Hiroyuki Osada(Discovery Research Institute, RIKEN, Japan)로부터 제공받았다.
<113>
<ιΐ4> 1-4. 인간 fuU-length cDNA 라이브러리의 제조
<ii5> 먼저， 전체 RNA를 제조사의 지시에 따라 TRIZ0L 시약 (Invitrogen, USA)을 이 용하여 HeLa 및 정상 간세포 (Chang cell)로부터 분리하였다. 표준화된 full-length cDNA 라이브러리를 제조하기 위해, SMART cDNA library cons trust ion kit(Clontech, USA) 및 TRI匪 ER-cDNA normalization kit(Evrogen, Russia)를 제조 사의 지시에 따라 사용하였다。 이후 cDNA를 CHROMA SPIN-400 cohimn(Contech)올 이 용하여 분류하였다。 500 bp 이상의 모든 cDNA를 MCS에 삽입하기 위해 두 개의 서로 다른 제한 효소 자리를 변형시키고， pcDNA3.1(+) 백터 (Invitrogen) 내로 연결
(ligation)하였다。 이후 T0P10 Escherichia Invitrogen) 내로 형질전환시켰 다。
<116>
<ιΐ7> 1-5. p53-상호작용 단백질의 스크리닝
<ii8> HeLa 및 정상 간세포 (Chang cell)로부터 얻은 모든 유전자를 갖는 인간 cDNA 를 S-methionine(Perkin Elmer, USA) 존재 하에서 TnT Coupled Reticulocyte
Lysate Sy s t em (Pr omega, USA)를 이용하여 in vitro 전사 및 번역하였다. In vitro binding assay에서 단백질 ixx)l이 양성으로 확인되었을 때, 해당되는 cDNA ιχχ)1을 구획 분할하고， 단일 양성 cDNA 클론 (clone)이 얻어질때까자 동일한 방법으로 다시 수행하였다. 이후, 양성 클론을 시퀀싱 (Bionics, Korea)하고, NCBI 유전자 데이터 베이스를 서치하여 알려진 서열과 비교하였다.
<119>
<120> 1-6. GST-융합 단백질 정제
<i2i> BL21 세포에서 GST-융합된 재조합 p53, Hades (WT, FL, RP, 및 RP MT) 및
Mdm2 단백질의 발현은 상기 세포에 0.1 mM IPTG를 37 °C에서 2 시간 동안 또는 25 °C에서 밤새도록 처리함으로써 유도하였다. 이후， 세포를 세균 용해 버퍼 (30 mM TrisCl pH 8， 100 mM NaCl , 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 및 1% NP40)에 넣고 초음파 처 리하여 용해시킨 후， 글루타치온 (glutathione)-세파로즈 (SepharoseKAmersham Bioscience)를 이용하여 단백질을 정제하였다.
<122> 또한 His-tagging P53 및 p53(K24R) 돌연변이의 발현은 BL21 세포를 0.1 mM
IPTG로 37 °C에서 4 시간 동안 처리하여 유도한 후， His-tagging p53 및 p53 돌연 변이를 Ni-NTA 비즈 (beads)를 이용하여 정제하였다.
<123>
<124> 1-7. In vitro binding assay
35
<i25> In vitro 전사 /번역으로 얻은 S-labeled 단백질을 결합 버퍼 (binding buffer; 30 mM Tris— HC1 pH 8,0, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% NP-40, and 0.5 mM PMSF)에 넣고 5 의 글루타치온—세파로즈 4B—결합된 GST, GST-p53 또 는 GSE-Hades 재조합 단백질로 37 °C에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후， 5번 세척하고, SDS-sample 버퍼 (60 mM Tris-Cl pH6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14 mM 2-mercaptoethanol , 0.1% bromophenol blue)에서 중탕하였다. 이후, 결합된 단 백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 자기방사법 (autoradiography)으로 관찰하였다.
<126>
<127> 1-8. 유비퀴틴화 분석 (Ubiquitination assay)
35
<i28> In vitro p53 유비퀴틴화 분석을 위해， in vitro 전사된 S-labeled 단백질
1 μ 1를 1 의 indicated E3 1 igase, 150 ng의 purified El, 150 ng의 E2 enzymes , 및 10 의 ubiquitin을 포함하는 유비퀴틴화 버퍼 (ubiquit inat ion buffer; 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 0.06 % NP40, 5 mM MgCl2, 및
15 μΜ ZnCl2) 20 μ 1에 넣고 30 °C에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후， 반 응 조성물을 SDS-PAGE로 분석한 후， 자기방사법 (autoradiography) 또는 면역블로팅 검사법 (i醒 unoblotting)으로 분석하였다.
<129> 또한, 내생적 (endogenous) p53 유비퀴틴화 분석을 위해， MCF7 세포를 수집하 고 유비퀴틴화 버퍼에 분산시켰다. 분산된 시료를 잠시동안 초음파 처리한 후 원심 분리하였다ᅳ 이후 상층액을 동일한 양의 GST, GST-Hades 또는 GST-Hades MT로 30 °C에서 2 시간 동안 배양시킨 후， 항 -p53 항체를 이용하여 면역침강 (immunoprecipitation) 시키고, 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역침전물 (immunoprecipitate)을 면역블로팅검사하였다.
<130> 그리고, MEF p53— zᅵ; Mdm2— 세포에서 p53 유비퀴틴화 분석을 위해， 세포를
pcDNA myc/His-p53 발현 플라스미드로 48 시간 동안 형질전환 시킨 후 용해물을 얻 어내었다. 이후 용해물을 GST, GST-Hades 또는 GSTHades MT로 30 °C에서 2 시간 동 안 배양시켰다. 이후 항 -P53 항체로 면역침강하여 면역침전물을 획득하거나， Ni+-결 합된 비즈 (beads)로 풀 -다운 (pull-down) 시킨 후, 면역블로팅검사로 분석하였다. <i3i> In vivo p53 유비퀴틴화 분석을 위해， HCT116 53_/" 또는 H1299 세포를 GFP,
GFP-Hades 또는 GFP-Hades RING MT로 48 시간 동안 형질전환 시켰다. 형질전화 완 료 후， 세포를 10 μΜ의 MG132로 4 시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 SDS-함유하 는 용해 버퍼로 용해시키고， 10 분 동안 가열하였다. 이후 항 -ρ53 항체로 면역침강 시키기 위해 ΝΡ40 용해 버퍼로 10 번 회석한 후， 면역침강 시켰다. 항 -ρ53 면역침 전물을 항-폴리유비퀴틴 (polyubiquitin) 항체를 이용하여 면역블로팅검사로 분석하 였다.
<132>
<133> 1-9ᅳ 면역침강 (Immunoprecipitation) 및 면역블로팅검사 (Immunoblotting)
<134> 세포를 SDS-함유하는 버퍼 (20 mM Tris-Cl pH 7.4, 1% SDS, 및 2 mM EDTA)로
5분 동안 아이스 (ice) 상태에서 용해시켰다. 용해물을 재현탁 버퍼 (20 mM Tris-Cl pH 7.4 NP40 0.5%, 150 mM NaCl , 및 2 mM EDTA)로 10배 희석한 후, 30 분 동안 1,200 rpi으로 원심분리하였다。 상층액을 항체 (분석하고자하는 유전물질에 대한 항 체)로 4 °C에서 밤새도록 배양시켰다. 배양 후， 단백질 A 또는 단백질 G가 결합된 아가로스 (agarose)로 2 시간 동안 배양한 후， 비즈 (beads)를 재현탁 버퍼로 6번 세 척한 후, SDS-sample 버퍼를 첨가하여 10 분 동안 중탕하였다. <i35> 면역블로팅 분석은 이전에 설명된 방법 [Brooks et al., Molecular Cell 21,
307-315 (2006)]과 동일하게 수행하였다.
<136>
<137> 1-10. 정량적 실시간 PCR(Quantitative real-time PCR)
<138> 인간 HCC에서
Figure imgf000022_0001
mRNA의 발현 수준을 측정하기 위해， 윤리 위원회의 승인 을 받은 Seoul National University School of Medicine(Seoul , Korea)에 있는 환 자로부터 28 HCC, 인접 간조직 및 정상 간조직을 획득하였다. RNA를 제조사의 지시 에 따라 RNeasy mini kitCQiagen, Germany)를 이용하여 조직으로부터 분리하였다, 이후 Hades mRNA의 발현 값은 IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, USA) 및 CFX96 real time system(Bio-Rad)를 이용하여 real-time PCR으로 정량하였다. 간경화 (cirrhosis) 및 간섬유증 (fibrosis)을 제외한 5 개의 서로 다른 정상 간 조직으로 부터 분리한 동일양의 RNA 흔합물을 real-time PCR에 더 포함시켰으며， 18S rRNA는 RT-PCR 및 real-time PCR 분석에서 참조 제어 (reference control)로써 사용되었다. Hades mRNA는 다음의 프라이머를 이용하여 증폭하였다: Forward; GATCATTCATCAGAGGACCAACACAG 및 Reverse; AGCACTCGCACAGCCACATC . 그리고 18S rRNA 서열은 다음의 프라이머를 이용하여 증폭하였다: Forward; GGAGAGGGAGCCTGAGAAACG 및 Reverse TTACAGGGCCTCGMAGAGTTC . 이후, Hades mRNA의 발현 수준은 CFX Manager Sofrware(Bio-Rad)로 분석하였다.
<139>
<140> 1-11。 면역형광 분석 (Immunofluorescence assay)
<i4i> 유리 덮개 (glass coverslip) 위에 성장시킨 형질전환된 세포를 상온 (room temperature)에서 5 분 동안 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정시켰 다, 이후 PBS로 두 번 세척하고, 투과 버퍼 (permeabilization buffer; 0.5% Triton X-100 in PBS)로 3 분 동안 배양하였다. 배양 완료 후， 세포를 5¾ BSA 및 2% Goat serum이 함유된 PBS로 30 분 동안 정지시키고, 항 -p53 항체 (1:200 in PBS)로 4 °C 에서 밤새도록 (overnight) 배양하였다, 배양 완료 후， PBS로 세 번 세척하고， 플루 오레세인 텍사스 red- labeled 이차 항체 (fluorescein Texas red- labeled secondary antibodies; 1:500 in PBS)로 1 시간 동안 더 배양하였다. 이후, 유리덮개를 뒤집 고, 슬라이드 위에 Vectashield(Vector Laboratories, USA)를 장착한 후, 네일 폴 리시 (nail polish)로 고정시켰다. 이후, 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy; FV-1000 spectral , Olympus, Japan)을 이용하여 형광 을 관찰하였다. <142>
<143> 1-12. 아세포 분류 (Subcellular fractionation)
<i44> PBS로 세척하여 세포를 수집하고 펠렛 (pel let)으로 만든 후, 세포를 CLB 버 퍼 (10 mM HEPES, 5 mM NaHC03, 10 mM NaCl , 1 mM CaCl2, 1 mM K¾P04, 0.5 mM MgCl2, 및 5 mM EDTA)에 분산시켰다. 이후， 아이스 (ice) 상태에서 5 분 동안 세포를 팽창 시킨 후， NP40을 0.5%의 최종농도 (final concent rat ion)로 보층하여 2 분 동안 아 이스 상태에서 배양하였다. 세포 용해물을 1,300 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담아 12,000 rpm에서 30 분 동안 다시 원심분 리하였다. 상기 두 번째 원심분리로부터 얻은 상층액을 세포질 분획 (cytoplasmic fraction)으로 수거하였다. 정제하지 않은 핵 펠렛 (nuclear pellet)을 1 ml의 CLB 버퍼에 분산시키고, 세 번 세적하였다. 얻어진 핵 및 세포질 분획을 SDS-sample 버 퍼에 넣었다. 그리고 미토콘드리아의 분획화는 이전에 설명된 것 [Shirangi et al., FASEB J. 16, 420-422 (2002)]과 같이 수행하고， 얻어진 미토콘드리아 분획 ( 펠렛)을 동일한 버퍼로 세 번 세척한 후, SDS-sample 버퍼에 넣고， 100 °C에서 10 분 동안 중탕하였다, 이후 면역블롯팅검사로 분석하였다.
<145>
<146> 1-13. 세포 생존력 분석 (Cell viability assay)
<i47> MTS 분석을 위해， 세포를 CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell
Proliferation Assay reagent (Pr omega, USA)로 1 시간 동안 배양한 후， 490 nm에서 0.D를 측정하였다. 세포사멸 (apoptosis), DNA 함량 및 미토콘드리아 막 전위는 이 전에 설명된 것 [Shirangi et al . , FASEB J. 16， 420-422 (2002)]과 같이 각각 annex in V-PE, 프로피디움 요오드화물 (propidium iodine) 및 JC-1 staining을 이용 하여 유세포분석 (flow cytometry)으로 측정하였다.
<148>
<149> 1-14. 콜로니 형성 측정 (Colony formation assay)
<150> 5X103 또는 1X104의 HCT 116 P53+/+ 또는 HCT 116 p53_/", H1299 또는 p53一 /_
； Mdm2_/" 세포를 60-mm 디쉬 (dish)에 도말한 후, 500 ng의 표지된 각각의 플라스미 드로 24 시간 동안 형질전환 시켰다, 이후 세포를 500 yg/ml의 G418로 14일 동안 selection한 후， 고정시키고 콜로니 계수를 위해 크리스탈 바이을렛 (crystal violet)으로 염색하였다.
<151> <i52> 1-15. 루시퍼라제 분석 (Lucif erase assay)
<153> 5X104 세포를 24-웰 (well) 플레이트에 접종한 후， 각각의 웰에 500 ng의
Bax 및 Puma에 대한 프로모터 p53 결합 부위를 함유하는 pGL 플라스미드， 100 ng의 p53 플라스미드 및 200 ng의 Hades 또는 Hades MT 플라스미드를 첨가하여 형질전환 시켰다. 형질전환 48 시간 후, 세포를 수집하고， 50 μΐ의 간접 용해 버퍼 (Passive lysis buffer, Pr omega)를 첨가하여 세포 추출물올 제조하였다. 이후 루시퍼라제 활성은 Biotek synergy HT microplate reader를 이용하여 측정하였으며 , 상대적 루 시퍼라제 활성은 Luminescent β -galactosidase detection kit II(Takara— Clontech)를 이용하여 β-galactosidase 활성을 측정함으로써 표준화하였다.
<154>
<155> 1-16. 통계 분석 (Statistical analysis)
<156> 통계 분석은 two-tailed Student' t test를 이용하여 수행하였으며， 통계적 유의성은 PO.05 일때로 측정하였다.
<157>
<158> 실시예 2. 실험결과
<159> 2-1. P53 결합 단백질
<i60> p53 결합 단백질을 확인하기 위해， 본 발명자들은 HeLa 및 정상 간 세포로부 터 인간 full-length cDNA 라이브러리를 분리하였다. p53 결합 단백질을 스크리닝 하기 위해 상기 cDNA 라이브러리로부터 in vitro 전사 및 번역된 단백질 po 을 사 용하였으며, 이때 변형된 SMART technology (도 la)을 이용하였다. 100 이상의 서로
35 35 다른 단백질들을 S-labeled 단백질 po 에 포함시켰다. 9600 개의 서로 다른 S- labeled 단백질을 체계적으로 확인하고， GST-p53과 상호작용을 위해 양성 cDNA po 을 분리하였다. 단백질 po이에서 잠재적으로 p53과 상호작용하는 단백질을 확 인한 후 (pool #D5 in 도 lb), 이에 대응하는 cDNA po 을 점차적으로 세분화하고， 상기와 동일한 방법을 계속 수행하여 단일 양성 cDNA 클론을 얻어내었다. 상기 분 리된 양성 cDNA 클론들 중 하나의 클론을 p53-결합 파트너로 결정하였으며， 상기 단백질을 "Hades" 라 명명하였다. 상기 Hades는 예측된 기능적 도메인을 포함한다 (도 lc): N-말단에서 TM(tansmembrane) 도메인 또는 단일 펩타이드， 단백질 한가운 데에는 두 번째 TM(tansmembrane) 도메인 및 C-말단에는 RING-finger 도메인 (예컨 대, signature E3 ligase domain). Hades의 위치를 관찰하기 위해, 대조군 GFP 플 라스미드 (upper panel) 및 GFP-Hades( lower panel)를 미토트랙커 (Mitotracker)와 함께 U20S 세포에 공동-형질전환((；0-^31 6^1위 시킨 후 공초점 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과 Hades가 미토콘드리아에서 뚜렷하게 위치되어 있음을 관찰하 였다 (도 Id).
<i6i> 이후, 본 발명자들은 Hades 단백질이 In vitro 및 In w o에서 bona fide
35
p53-상호작용 단백질임을 증명하였다. 먼저， In vitro 형질전환된 S-labeled p53
_ 35 을 GST-Hades와 상호작용시키고 (left panel), In vitro 형질전환된 S— labeled
Hades를 GST— p53과 상호작용시킨 (right panel) 후, In vitro 풀 -다운 분석으로 분 석한 결과, 도 le에 보이는 바와 같이 GST-p53은 In vitro 형질전환된 Hades와 상 호작용하며, GST-Hades는 in vitro 형질전환된 p53과 상호작용하는 것을 알 수 있 다. 또한， p53 및 Hades 사이의 결합 사이트를 확인하기 위해ᅳ In vitro 형질전환
35
된 S-labeled N-말단 p53(aa 1-186) 또는 C-말단 p53(aa 187-393)을 GST- Hades (GST-tagged full-length Hades)와 상호작용시킨 후， 자기방사법 (autoradiography)으로 결합 단백질을 검출한 결과, GST-N-p53(aa 1-186)은 고정화 된 GST-Hades와 상호작용하지만， GST-C-p53(aa 187-393)은 GST-Hades와 상호작용 하지 않음을 확인하였다 (도 If). 뿐만 아니라, MCF7 세포 용해물을 GST(lane2) 또 는 GST-Hades (lane 3)로 배양한 후， p53의 발현 수준을 항 -p53 항체를 이용하여 면 역블롯팅 분석하고 In vitro GST 풀 -다운 분석한 결과, MCF7 세포에서 Hades와 p53 이 상호작용함을 확인하였다 (도 lg). Hades 및 p53 사이의 In vivo상호작용을 확 인하기 위해, H1299 p53 null 세포를 p53 및 GFP—Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 공동-형질전환시킨 후, 항 -GFP 항체로 면역침강시키고 항 -p53 항체를 이용하 여 면역블롯팅을 수행한 결과， GFP-Hades 결합 복합체가 면역침강됨을 관찰하였으 며， 이를 통해 Hades가 p53과 In vivo 상호작용함을 확인하였다 (도 lh). 그리고, p53 및 Hades 사이의 In vivo상호작용은 MG132를 12 시간 동안 처리한 MCF10A (정 상 유방 세포) 및 NHLHCnormal human lung fibroblast) 세포의 용해물을 항 -p53 항 체 또는 항 -Hades 항체로 면역침전시킨 후， 면역블롯팅으로 Hades 및 p53 발현을 관찰하여 확인하였다. 그 결과， 상기 두 세포 모두에서 Hades 및 p53의 상호작용이 관찰되었다 (도 li). 또한， U20S 세포를 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동 안 형질전환시키고, 정상 조건 (upper panel) 또는 MG132 존재 (lower panel) 하에서 4 시간 동안 배양한 후， 배양된 세포를 항 -p53 항체로 고정 및 탐지하고， Texas Red-컨쥬게이트된 마우스 이차 항체를 이용하여 세포 내의 p53 발현을 시각화 하고 이를 공초점 현미경을 이용하여 이미지화한 결과, p53은 MG132-처리된 Hades 비형 질전환된 U20S 세포에서 핵 내에 주요하게 분포하지만, 도 lj의 병합된 이미지에 보이는 바와 같이 다수의 p53이 핵 외부에도 위치되어 있음을 알 수 있다. 정량적 으로, MG132-처리된 Hades 발현 세포에서 p53과 Hades는 30% 이상 공존 (co- localize)하는 것으로 분석되었다 (도 lj bottom). 상기의 결과는 Hades 및 p53이 미토콘드리아에 공존함을 의미한다ᅳ
<162> 총체적으로， 상기의 결과들은 Hades 및 p53이 In vitro및 In vivo모두에서 상호작용함을 보여주는 결과이다,
<163>
<164> 2-2。 RING ligase 활성에 의한 p53의 발현 수준
<i65> p53에 대한 Hades의 조절 기능의 가능성을 연구하기 위해， U20S 세포에서 내 재성 (endogenous) p53 발현 수준에 대한 Hades의 효과를 측정하였다. 먼저, U20S 세포 내로 Hades 발현 플라스미드 (GFP(green fluorescent protein)-Hades 플라스미 드)를 24 시간 동안 형질전환시켜 Hades의 발현을 과도하게 유도하고, 항—GFP 및 항 -p53 항체로 면역블롯팅 수행하여 내재성 p53의 발현 수준을 평가한 결과， 도 2a 에 나타낸 바와 같이 , 과도하게 발현된 Hades에 의해 p53의 발현 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있으며， 이는 GFP-Hades의 처리량에 의존적이다. 이러한 p53의 발 현 감소는 GFP, GFP— tagged wild-type Hades 또는 GFP-tagged 돌연변이 Hades로 형 질전환 시킨 MCF10A 및 NHLF 세포에서도 관찰되었다 (도 2b).
<166> 또한, Hades의 E3 ligase 활성이 p53 발현의 감소를 매개하는 지에 대해 알 아보기 위해, Hades, Hades RING peptide(RP), 돌연변이 Hades 및 Mdm2의 자가유비 퀴틴화 (autoubiquitination) 활성을 연구하였다. 먼저, GST, GST-Hades , GST-Hades RING peptide, GST-Hades RING-mutant peptide(C302S/C305S) [Wu et al. , Nat Genet. 14, 430-440 (1996)] 및 GST-Mdm2를 유비퀴틴화 버퍼에 넣고 El/E2(UbcH5c) 의 존재 또는 부재하에서 30 2 시간 동안 배양시킨 후， 글루타치온-비즈에 결 합된 단백질을 유비퀴틴화 버퍼로 6번 세척하고 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 수행한 결과, RING 돌연변이 Hades를 제외하고 E1/E2가 존재하는 상태에 서 모두 유비퀴틴화 활성을 보였다 (도 2c). 또한， H1299 세포를 p53, GFP-tagged Hades 또는 FLAG-tagged mutant Hades를 발현하는 플라스미드로 24 시간 동안 형질 전환시킨 후 항 -P53 항체로 면역블롯팅 수행하여 p53 발현 수준을 관찰하는 경우， RING 돌연변이 Hades는 p53의 발현 수준을 저해하지 못함을 확인하였다 (도 2d)。 따라서， RING 돌연변이 Hades는 Hades에 의해 유도되는 p53의 분해를 유도하지 못 하며 , 야생형 (wild type; WT) Hades는 p53의 기능을 하향조절 (downregulated) 함을 알 수 있다。 <i67> 본 발명자들은 p53을 하향조절시키는 Hades의 기능을 더 자세히 분석하기 위 해, Hades에 의한 p53의 안정성 조절을 관찰하였다. 먼저， H11299 세포를 각각의 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 한 후， 10 μΜ의 MG132로 4 시간 동안 처리 또는 미처리 한 결과, Hades에 의한 p53 발현 감소가 MG132의 처리에 의해 회복됨 을 알 수 있다 (도 2e). 또한, Hades shRNA를 이용하여 Hades를 제거 (knockdown)시 킨 안정한 MCF7 세포를 제조하기 위해, 상기 세포를 pSuper Hades 1 또는 2(Hades 를 타겟하는 shRNA의 발현 플라스미드)로 형질전환시킨 후， G418을 함유하는 배지 (500 yg/ml)로 14일 동안 select ion하여 RT-PCR로 Hades mRNA 발현을 측정하고， 동시에 항 -p53 및 항 -Hades 항체를 이용하여 면역블롯팅을 수행한 결과, Hades shRNA에 의한 Hades의 silencing으로 인해 p53이 안정화됨을 확인하였다 (도 2f). 뿐만 아니라， Hades shRNA를 이용하여 Hades를 제거 (knockdown)시킨 안정한 MCF7 세포에 시클로핵시미드 (cycloheximide; CHX, 150 yg/ml)를 처리하는 경우， 대조군 (upper panel)과 비교하여 pSuper-Hades로 형질전환된 세포 (lower panel)에서 p53 단백질의 반감기 (half-life)가 더 높았다 (도 2g).
<168> 이후， 본 발명자들은 Hades를 제거 (knockdown)한 세포에서의 p53 위치를 관 찰하였다, Hades를 제거 (knockdown)시킨 안정한 MCF7 세포에서 p53의 발현이 대조 군에 비해 높음을 확인한 후 (upper panel), 상기 안정한 MCF7 세포의 분획별 추출 물에서 p53의 발현을 측정한 결과, 핵 및 세포질 모두에서 p53이 축적됨을 확인하 였다 (도 2h). 그리고, 핵 외부에서 p53 및 Hades가 공존함 (도 lj)을 확인한 후， p53과 Hades의 세포질 공존시 p53의 발현 수준 감소에 있어서 Hades가 영향을 미치 는지에 알아보기 위해， H1299 세포를 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades 돌연 변이를 발현하는 플라스미드로 형질전환 시킨 후， Crml 억제자인 렙토마이신 Bdeptomycin B; LMB)로 처리하는 경우， Hades에 의한 p53 발현 감소 (lane 2)가 LMB 처리로 인해 회복됨 (lane 5)을 확인하였다 (도 2i). 이는 LMB의 처리로 Hades 에 의해 매개되는 p53의 핵방출이 차단되고 p53의 발현이 회복된 것으로 사료된다. 또한， 이전 연구에서 p53 돌연변이 (C153Y)를 암호화 (encoding)하는 p53 발현 플라 스미드를 이용하는 경우, p53이 주로 세포질에 위치해 있고 핵에는 위치되어 있지 않음을 확인하였다 [Nie et alᅳ， J Biol Chem. 282, 14616-14625 (2007)]. 이에 본 발명자들은 과발현된 야생형 (WT) p53 및 돌연변이 p53(C135Y)의 면역블롯 분석을 수행하였다. H1299 세포를 0.5 야생형 p53 또는 돌연변이 p53(C135Y) 플라스미 드와 GFP— Hades 플라스미드 (0， 0.2, 0.5， 1.0, 2,0 또는 4.0 yg)로 24 시간 동안 공동-형질전환시킨 후 면역블롯팅으로 과발현된 야생헝 p53 및 돌연변이 p53의 발 현 수준을 측정한 결과， 동일양의 GFP-Hades 플라스미드로 형질전환시킨 상태에서 야생형 p53을 발현하는 H1299 세포에서보다 돌연변이 p53(C135Y)을 발현하는 H1299 세포에서 p53 발현 수준이 더 낮았다 (도 2j).
<169> 상기의 결과들은 Hades가 유비퀴틴-의존적인 분해 경로를 통해 세포질 p53을 하향조절함을 의미한다.
<170>
<171> 2-3. Hades에 의한 p53의 폴리유비퀴틴화 (polyubiquitination) 촉진
<172> 본 발명자들은 Hades가 p53 유비퀴틴화 (ubiquitination)에 직접적으로 관여 하는지에 대해 알아보기 위해， 상기 실시예 2-2에서 자가유비퀴틴화 분석 (auto- ubiquitination assay)을 수행하였다. 그 결과, 고정된 full— length Hades (lane 2， GST-Hades) 및 RING-finger 도메인 (aa 271— 351)을 포함하는 펩타이드 (lane 4, GST- Hades RP)는 자가유비퀴틴화를 보이는 반면， RING 돌연변이 펩타이드 (lane 6， C302S/C305S; GST-Hades RP MT)는 자가유비퀴틴화를 보이지 않음을 확인하였다 (도 2c).
<173> 이후, 본 발명자들은 돌연변이 p53과 Hades의 상호작용을 확인한 후， In
35
vitro유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 먼저， //? vitro형질전환된 S-labeled 야생 형 p53(laen 1-3) 또는 돌연변이 p53(5NKR: lane 4-6； 6NKR: 7-9； 및 K24R: lane 10-12)을 GST 또는 GST-Hades로 배양한 후, GST 풀 -다운 분석을 수행한 결과, Hades가 여러 돌연변이 p53과 상호작용 함을 밝혀내었다 (도 3a).
<174> 이후, 본 발명자들은 이전의 연구를 통해 E2-결합 효소가 유비퀴틴에 의해 매개되는 분해에 관여함 [Smalle et al., Annu Rev Plant Biol. 2004, 555-590 (2004)]을 확인하고, 본 발명에서 E2 효소가 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에 관
_ 35
여하는지를 확인하였다, In vitro 형질전환된 S—labeled p53을 ATP, His-tagged 유비퀴틴 El 및 여러 E2 효소 중 하나가 존재하는 상태에서 GST-Hades RING-finger
35 peptide (GST-Hades RP)와 배양한 후, 자기방사법 및 SDS-PAGE로 분석한 결과, S- labeled p53이 UbcH5a 또는 UbcH5c가 존재하는 상태에서 폴리유비퀴틴화됨을 확인
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하였다 (lanes 5 and 7， 도 3b). 또한, In vitro 형질전환된 S-labeled p53을
ATP, His-tagged 유비퀴틴 El 및 E2(UbcH5c)가 존재하는 상태에서 GST, GST-Hades RP 또는 GST-Mdm2로 배양한 후， 항 -p53 항체를 이용하여 면역블롯팅으로 p53의 유 비퀴틴화를 분석한 결과, Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화는 Mdm2에 의해 매개되는 유비퀴틴화와 유사하게 일반적인 유비퀴틴에 의해 매개되는 분해에 관여함을 확인 하였다 (도 3c). 그리고, p53 유비퀴틴화에서 Hades의 직접적인 역할을 확인하기
35
위해, In vitro 형질전환된 S-labeled p53을 ATP, His-tagged 유비퀴틴 El 및
E2(UbcH5c)가 존재하는 상태에서 GST, GST-Hades, GST-Hades RP 또는 GST-Hades RP 돌연변이로 배양한 후, 항 -p53 항체를 이용하여 면역블롯팅으로 p53의 유비퀴틴화 를 분석한 결과, p53의 유비퀴틴화는 Hades에 의해서만 유도됨을 확인하였다 (도 3d). 또한， 본 발명자들은 In vivo유비퀴틴화 분석을 위해， p53 null H1299 세포 를 p53(2 yg) 및 GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT (4 yg)를 발현하는 플라스미드로 24 시간 동안 공동-형질전환시킨 후， 정상 조건 또는 MG12(10 μΜ)이 존재하는 조 건에서 4 시간 동안 더 배양하였다. 이후 세포를 용해하고， 전체 세포 추출물을 항 -Ρ53 항체로 면역침강시키고, 유비퀴틴-컨쥬게이트된 ρ53 단백질을 항 -폴리유비퀴 틴 항체를 이용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 그 결과， 폴리유비퀴틴화된 ρ53은 MG132를 처리한 GFP-Hades 형질전환된 세포에서만 검출되었다 (도 3e).
<175> 본 발명자들은 Hades에 의한 p53 유비퀴틴화 메커니즘이 Mdm2에 의한 p53 유 비퀴틴화와 다른지 확인하기 위해, p53(l yg)과 GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT (1 yg)를 발현하는 플라스미드를 p53 및 Mdm2 모두 결핍된 MEF 세포 (MEF p53 /_ ;mdm2 세포)에 형질전환시킨 후, p53 발현 수준을 면역블롯팅으로 측정한 결과, GFP- Hades로 24 시간 동안 형질전환된 MEF ρ53— ^ίηάη /_ 세포에서 ρ53의 발현 수준이 감 소됨을 확인하였다 (도 3f, lane 2). 또한， MEF p53_/ ; mdm2— /_ 세포를 His_p53 플라 스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 세포 용해물을 수집하고， GST, GST- Hades RP 또는 GSTᅳ Hades RP MT를 포함하는 용해물로 2 시간 동안 In vitro유비퀴 틴화 분석을 수행하였다. 이때, p53을 Ni+ 컨쥬게이트된 비즈로 풀 -다운 시키거나 (left panel), 항 -p53 항체를 이용하여 면역침강시켰다 (right panel). 그 결과, MEF p53_/— ;mdm2— /_ 세포를 GFP-Hades RP로 형질전환시킨 경우에는 p53이 유비퀴틴화 되었으나， GFP-Hades RP MT로 형질전환시킨 경우에는 p53이 유비퀴틴화 되지 않았 다 (도 3g), 뿐만 아니라, MEF p53 /_ ;mdm2 /_ 세포를 p53, GFP-Hades 및 Mdm2를 발현 하는 각각의 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시키는 경우， GFP-Hades 및 Mdm2 플라스미드로 공동-형질전환시킨 세포에서 GFP-Hades 단독 형질전환 시킨 세포보다 p53 유비퀴틴 효과가 더 좋게 나타났다 (도 3h). 상기의 데이터들을 통해 Hades에 의한 p53의 유비퀴틴화에서 Mdm2가 관여하지 않음을 알 수 있다.
<176> 이전의 연구에 따르면, p53의 C-말단에서 Mdm2에 의해 유비퀴틴화되는 주요 부위가 6 개의 특이적 라이신 (lysine) 잔기임이 밝혀졌다 [Rodriguez et al . , Mol Cell Biol. 20, 8458-8467 (2000)]. 이에， 본 발명자들은 Hades에 의해 매개되는 p53의 유비퀴틴화에 대해서 라이신 잔기가 중요하게 관여하는지 확인하였다. 먼저 도 3i에 나타낸 바와 같이, p53 라이신 돌연변이를 제조하였다: 5NKR, 5 개의 N-말 단 라이긴 잔기 (aa 101 120 132, 139, 164) 돌연변이; 6NKR, 6 개의 N-말단 라이 신 잔기 (aa 24, 101, 120, 132 139, 164) 돌연변이 ; 6CKR, 6 개의 Ο말단 라이신 잔기 (aa 370 372, 373, 381 382, 386) 돌연변이; 및 N24KR, N-말단 라이신 잔기 (aa 24) 돌연변이. 이후 In vitro 형질전환된 p53(WT, 5NKR, 6NKR 또는 6CKR)을 GST 또는 GST-Hades RP로 유비퀴틴 버퍼에서 배양한 후, 면역블롯팅으로 p53 발현 수준을 측정하였다. 그 결과， 상기 6 개의 C-말단 라이신 잔기 중 어느 하나도 Hades에 의한 유비퀴틴-의존적 분해에 필수적이지 않았으며， 6 개의 라이신 잔기로 돌연변이된 6CKR도 여전히 유비퀴틴화될 수 있는 형태의 p53 이었다 (도 3j). 하지 만， N—말단에서 5 또는 6 개의 라이신으로 치환한 p53 돌연변이 (5NKR 또는 6NKR)와 비교하는 경우， p53의 N-말단에서 24 번째 라이신 잔기가 Hades에 의한 유비퀴틴화 및 p53 분해에 있어서 중요한 역할을 함을 확인하였다 (도 3j). Hades에 의한 p53 유비퀴틴화에서 상기 24 번째 라이신 잔기의 영향을 구체적으로 확인하기 위해, In
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vitro 형질전환된 S-labeled 야생형 p53 또는 24 번째 라이신 잔기를 아르기닌
(arginine)으로 치환한 돌연변이 p53(N24KR)를 GST, GST-Hades RP 또는 GST-Hades RP MT로 유비퀴틴 버퍼에서 배양한 후, SDS-PAGE 및 자가방사법으로 분석하였다. 그 결과， 야생형 p53은 Hades에 의해 유비퀴틴화 되었으나， 돌연변이 p53(N24KR)은 Hades에 의해 유비퀴틴화 되지 못함을 확인하였다 (도 3k의 (Α))· 또한 GST 풀-다 운 (puU-down) 분석 결과, p53 K24R 돌연변이의 비-유비퀴틴화가 관찰되었으며， 이 는 Hades와상호작용을 하지 못하기 때문인 것으로 사료된다 (도 3k의 (B)).
<Π7> 상기의 결과들은 Hades에 의해 매개되는 p53의 폴리유비퀴틴화에 있어서
Mdm2가 관여하지 않으며， p53의 24 번째 라이신 잔기는 유비퀴틴-의존적인 p53의 분해에 중요한 역할을 함을 나타낸다。
<178>
<179> 2-4. p53-의존적 성장 억제 (growth suppression) 및 세포사멸 (apoptosis)에 대한 Hades의 영향
<i80> E3 리가아제 (Hgase) 활성은 p53 유비퀴틴화에 대해 필수적이며， p53의 기능 도 조절하는 것으로 알려져있다 [Dornan et al. , Nature 429, 86-92 (2004)； Leng et al., Cell 112, 779-791 (2003)]。 이에 본 발명자들은 p53-의존적 성장 억제에 대하여 Hades가 미치는 영향을 조사하였다. 첫째로， 루시퍼라제 리포터 분석 (lucif erase reporter assay)을 이용하여 Hades가 p53에 의해 매개되는 전사 활성 에 영향을 미치는 지에 대해 확인하기 위해， H1299 세포를 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드와 Z?a Bax-luc) 또는 / zra(Puma-luc) 리 포터 플라스미드로 함께 24 시간 동안 흔합 형질전환 시킨 후， 루미노미터로 상대 적인 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과 도 4a에 나타낸 바와 같이, Bax-luc 및 PUMA-luc의 활성이 Hades에 의해 감소됨을 확인하였으며， 이를 통해 p53에 의해 매개되는 전이활성 (transact ivat ion)이 Hades에 의해 저해됨을 알 수 있다. 하지 만， H1299 세포를 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미 드와 ba Bax-luc) 또는 /¾zwa(Puma-luc) 리포터 플라스미드로 함께 24 시간 동안 흔합 형질전환 시킨 후， 루시퍼라제 활성을 측정하기 전에 LMB(20 nM)로 4 시간 동 안 처리하는 경우, LMB 처리로 Hades에 의한 p53 전이활성이 감소되지 않았으며ᅳ 돌연변이 Hades에 의해서도 p53 하위 (downstream) 유전자인 BAX 및 PIMA의 발현이 감소되지 않았다 (도 4b). 또한， H1299 세포를 p53 돌연변이 (전이활성 결핍) 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드와 bay(Bax-luc) 또는 MZ/a(Puma-luc) 리포터 플라스미드로 함께 24 시간 동안 흔합 형질전환 시킨 후， 루시퍼라제 활성 및 p53 발현 수준을 측정한 결과， 전이활성이 결핍된 돌연변이 p53의 분해는 Hades에 의해 매개되는 것을 확인할 수 있으며， 따라서 Hades에 의한 p53의 분해는 전이활성과 무관함을 알수 있다 (도 4c).
<i8i> p53의 축적은 세포의 성장 억제 (growth suppression)를 유도한다고 연구되어 있어 [Finlay et al., Cell 57， 1083-1093 (1989)], 본 발명자들은 Hades가 p53-의 존적 성장 억제 (growth suppress ion)를 조절하는 지에 대해 MTS 분석을 이용하여 연구하였다. 각각의 세포 (HeLa, MEF 53_/";mdm2^( MCF7 및 H1299)를 500 ng의 p53 및 GFP, GFP-Hades 또는 GFP-Hades MT를 발현하는 플라스미드로 72 시간 동안 공동 -형질전환시킨 후， MTS 세포 증식 분석을 수행한 결과, Hades가 p53에 의해 매개되 는 세포 성장 억제 (growth suppression)를 저해하는 것으로 나타났다 (도 4d). 또 한 H1299 세포를 p53 및 GFP 또는 GFP-Hades를 발현하는 플라스미드로 공동-형질전 환 시킨 후， G418(500 yg/ml)을 포함하는 배지로 14일 동안 배양시킨 세포를 콜로 니 -형성 분석으로 관찰한 결과, Hades가 p53에 의해 매개되는 세포 성장 억제를 저 해함을 확인하였다 (도 4e),
<182> 다음으로， RNA 간섭 시스템을 이용하여 Hades가 p53에 의한 성장 억제를 감 소시키는지에 대해 확인하였다. HCT116 p53+/+ 및 p53 null HCT116 p53_/" 세포를 1 의 pSuper 또는 pSuper-Hades로 형질전환 시킨 후， G418(500 yg/ml)을 포함하 는 배지로 14일 동안 배양시킨 세포를 콜로니 -형성 분석으로 관찰한 결과, Hades의 제거 (knockdown)로 인해 HCT116 p53+/+ 세포에서 p53-의존적 성장 억제가 회복되는 반면， HCT116 p53_/_ 세포에서는 회복시키지 못하였다 (도 4f). 또한， Hades를 제거
(knockdown)한 안정한 MCF7 세포 (gray bar) 및 대조군 MCF7 세포 (black bar)를 Η202(10 μΜ), 액티노마이신 D(act inomycin D, 1 μΜ) 또는 독소루비신 (doxorubisin, 500 nM)로 처리하여 24 시간 동안 배양한 후, MTS 세포 증식 분석을 수행한 결과, Hades를 제거한 MCF7 세포에서 Hades에 의한 p53의 세포 성장 억제 활성이 회복되었음을 확인하였다 (도 4g).
<183> 따라서 p53은 다양한 세포 신호에 대한 반응에서 세포 사멸 및 세포 주기 정 지를 유도하기 위한 중앙 스위치로싸 역할을 하며 [Dulic et al. , Cell 76, 1013- 1023 (1994)； Lowe et al . , Nature 362, 847-849 (1993)； Lane DP, Nature 358, 15-16 (1992)], 상기 데이터들을 통해 Hades는 p53-의존적 성장 억제를 부정적으로 (negatively) 조절함을 알 수 있다. 따라서 Hades는 p53의 부정적 조절자 (negative regulator)로써 역할을 하며， 다양한 스트레스 조건에 의한 세포 사멸로부터 세포 를 보호하는 역학을 한다.
<184>
<185> 2-5 Hades에 의한 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전 조절
<186> 최근의 연구에 따르면， p53은 정상 상태에서 핵 및 세포질에 걸쳐 분포되어 있는 것으로 나타났다 [Shaulsky et al . , Oncogene 5, 1707-1711 (1990)； Martinez et al. , Genes Dev. 5, 151-159 (1991)]. 게다가 본 연구에서도 Hades가 핵 외부에 존재하는 p53과 상효작용함을 보였다 (도 lj). 특히, 세포질 및 미토콘드리아 p53 은 Bcl-2 family와의 상호작용에 의해 다양한 스트레스 하에서 세포 사멸을 유도하 며 [Green et al. , Nature 458, 1127-1130 (2009)], 이는 Hades가 p53에 의해 매개 되는 세포 죽음을 조절하기 위한 특정 조건에서 p53과 상호작용함을 의미한다.
<187> 따라서 본 발명자들은 pEYFP( enhanced yellow fluorescent protein)-mito- p53로 형질전환된 U20S 세포를 이용하여 Hades가 미토콘드리아의 p53을 조절하는지 에 대해 관찰하였다。 U2S0 세포를 pEYFP-mito-p53으로 24 시간 동안 형질전환시킨 후, 세포를 공초점 현미경을 관찰하였다. 그 결과, pEYFP-mito-p53이 미토콘드리아 내에 위치함을 확인하였다. 이후, p53과 Hades 간의 상호작용을 확인하기 위해, HEK293 세포를 FLAG-Hades 및 FLAG—Hades MT가 존재 또는 부재한 상태에서 EYFP- mito-P53 및 pCI-Bcl-2 발현 플라스미드로 공동-형질전환 시킨 후, 세포 용해물을 Be 1-2 항체로 면역침강시킨 결과， MG132 처리한 상태에서 Hades가 p53과 Be 1-2의 상호작용을 저해함을 확인하였다 (도 5b, lane 3). 하지만， RING-finger 도메인을 제거한 돌연변이 Hades로 형질전환 시킨 세포에서는 p53과 Bcl-2 사이의 상호작용 에 영향을 끼치지 못하였다 (도 5b, lane 4).
<188> 본 발명자들은 또한, 세포 증식 (cell proliferation)에 대한 Hades의 영향을 콜로니 -형성 분석을 통해 관찰하였다. H1299 세포를 EYFP-mito— p53을 발현하는 플 라스미드와 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 공동-형질전환 시킨 후， 세포를 G418(500 yg/ml)을 포함하는 배지로 14일 동안 배양하였다. 이후 콜로니 -형성 분 석을 수행한 결과, EYFP-mito-p53 및 GFP-Hades 발현 플라스미드로 형질전환된 세 포의 콜로니 형성이 감소됨을 확인하였다 (도 5c). 또한， MEF p53_/— ;mdm2— 세포를 EYFP-mito-p53 또는 EYFP-mito_p53 돌연변이 (K24R) 발현 플라스미드와 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 14일 동안 공동-형질전환 시킨 후， 콜로니 -형성 분석 을 통해 세포 성장을 확인한 결과, EYFP— mito-p53 돌연변이를 발현하는 세포에서는 Hades에 의한 세포 성장 억제가 저해되지 않음을 확인하였다 (도 5d).
<189> 이전 연구에서는， p53의 핵방출 (exonuclear) 기전이 CPT(camptothecin)를 처 리하는 경우 빠르게 미토콘드리아로 전위되는 것으로 나타났다 [Mihara et al., Molecular Cell 11, 577-590 (2003)]. 이에 본 발명자들은 CPT 처리에 의한 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전이 Hades에 의해 약화되는지에 대해 알아보았다. MCF7 세 포를 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후， 세포 를 1 μΜ 또는 5 μΜ의 CPT로 6 시간 동안 처리한 결과, CPT 처리로 축적된 ρ53 발 현이 Hades에 의해 저해되었다 (도 5e, upper panel). 또한 MCF 세포를 GFP 또는 GFP-Hades RING MR 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후, 세포를 5 μΜ의 CPT로 6 시간 동안 처리한 후， 핵 및 세포질 분획을 수집하여 ρ53 발현 수준 을 측정한 결과， CPT 처리로 ρ53 발현이 핵 및 세포질에 축적되었으며， Hades에 의 해 p53의 세포질 발현이 감소되었다 (도 5e, lower panel). 그리고, MCF 세포를 GFP 또는 GFP-Hades RING MT 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후， 세포를 1 μΜ의 CPT로 24 시간 동안 처리한 후， 세포 용해물을 항 -ρ53 항체를 면역 침강 시키고， 면역블롯팅을 통해 Bcl-2 및 p53 발현 수준을 측정한 결과， CPT 처리 에 의해 p53 발현 축적이 관찰되었으며 , Hades에 의해 Bcl-2 및 p53 사이의 상호작 용이 저해되었다 (도 5f). CPT에 의해 유도되는 세포 사멸에 대한 Hades의 영향을 확인하기 위해, MCF7 세포를 GFP 또는 GFP-Hades 발현 플라스미드로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후， 1 μΜ의 CPT로 24 시간 동안 세포에 처리한 후， 유세포 분석기 를 통해 세포 사멸 수를 관찰하였다. 그 결과， CPT에 의해 유도된 세포 사멸이 Hades에 의해 저해됨을 확인하였다 (도 5g) .
<190> 다음으로, RNA 간섭 시스템을 이용하여 상기의 효과들을 확인하였다. MCF7 세포를 pSuper 또는 pSuper-Hades로 형질전환 시킨 후， 세포를 1 μΜ의 CPT로 24 시간 동안 처리하였다. 이후 세포 용해물을 항 -ρ53 항체로 면역침강 시키고， 항- Bcl-2 및 항 -p53 항체를 이용하여 면역블롯팅 검사를 수행하였다. 그 결과， p53- Bcl-2 복합체의 발현이 대조군 세포보다 Hades 제거시킨 안정한 MCF7 세포에서 CPT 처리 후 더 증가되었으며 (도 5h, lane 3 vs 4), p53의 발현도 상당히 증가되었다. Hades 제거 (knockdown) MCF7 세포에 1 μΜ CPT 처리 후， 미토콘드리아 분획으로부 터 시토크름 CXcytochrome C)의 방출을 항―시토크롬 C 항체를 이용하여 면역블롯팅 으로 분석한 결과， CPT 처리 후 미토콘드리아로부터 시토크롬 C의 방출이 유도됨을 확인하였다 (도 5h, lower panel).
<i9i> 본 발명자들은 p53-의존적 세포 사멸에 대한 Hades의 부정적 역할을 FACS 분 석을 이용하여 더 관찰하였다. MCF7 세포를 pSuper 또는 pSuper-Hades로 형질전환 시킨 후， 세포를 1 μΜ의 CPT로 24 시간 동안 처리한 후, MCF7 세포의 sub-GO 분획 을 FACS로 분석한 결과, 대조군 세포에 비해 Hades를 제거 (knockdown)시킨 MCF7 세 포에서 CPT 처리로 세포 사멸 세포 (apoptotic cell)가 더 많이 관찰되었다 (도
' 5i). 또한, HCT116 p53+/+ 및 HCT116 p53_/" 세포를 40 nM의 pSuper 또는 pSuper- Hades로 24 시간 동안 형질전환 시킨 후， 1 μΜ의 CPT로 24 시간 동안 처리한 후， 세포를 수집하고 30분 동안 JC-1로 염색하여 FACS로 분석한 결과, p53이 존재하는 세포에서는 CPT 처리 후 탐지가능한 미토콘드리아 막 전위의 손실이 유도되었으나， p53이 부재한 세포에서는 유도되지 않았다 (도 5j). 이러한 결과는 CPT를 처리한 세포에서 Hades가 p53과 빠르게 상호작용하고， Be 1-2 및 p53 사이의 상호작용을 저 해함으로써 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 약화시킴을 의미한다.
<192> 이전 연구에 따르면, p53의 핵방출 (exonuclear) 기전은 종양 억제의 기능을 수행하고 [Talos et al . , Cancer Res. 65， 9971-9981 (2005)], 다른 리가아제들은 다른 종양 조직에서 높게 발현된 p53을 유비퀴틴화시킨다고 알려져 있다 [Dornan et al. , Cancer Res. 64, 7226-7230 (2004)； Wenrui et al. , Journal of the National Cancer Institute 96， 1718-1721 (2004)]ᅳ 이에 본 발명자들은 인간 종양 조직에서 Hades의 발현 수준을 관찰하였다。 Hades mRNA의 발현 수준은 정량적 RT- PCR로 HCC(human hepatocellular carcinoma) 및 인접한 정상 조직으로부터 28 쌍의 간 생체검사 (liver biopsies)로 평가하였다. 그 결과， 2 배 이상의 높은 Hades mRNA 발현이 인접한 정상 조직과 비교하여 HCC에서 관찰되었다 (도 5k). 상기 결과 는 발현이 증가된 Hades는 p53 활성을 감소시킴으로써 간 종양 형성에 영향을 미칠 것 이라는 가설과 일치하였다. 이와 함께， 상기 결과들은 p53의 유비퀴틴화 후 프 로테아좀 분해를 통한 p53의 핵방출 (exonuclear) 종양 억제 기전을 Hades가 억제함 을 나타낸다.
<193>
<194> 본 발명자들은 p53과 상호작용하는 단백질로써 Hades를 발견하였으며， 상기
Hades는 p53의 핵방출 (exonuclear ) 기전에 대한 E3 리가아제 (ligase)로써 가능하 며， 유비퀴틴-의존적 경로를 통해 p53을 분해한다. 이전 연구에 따르면, Hades는 미토콘드리아에 주로 위치하는 RING-finger 도메인이며 (도 Id), 미토콘드리아의 활동을 조절하는 Drp_l(dynamin一 related protein 1)을 서모화 (sumoylat ion)시키는 것으로 알려졌다 [Li et al. , PLOS ONE 3, el487 (2008)； Braschi et al . , EMBO Rep. 10， 748-754 (2009)]. 최근에는， JNK 경로를 통해 Hades에 의해 유도된 세포 독성이 보고되었다 [Zhang et al . , Cell Res. 18， 900-1000 (2008)], 하지만, 본 발명자들은 Hades가 p53을 조절하는 기능을 갖음을 새롭게 발견하였다. 본 발명의 실시예 증 면역형광 검사를 통해 Hades가 핵 외부에 존재하는 p53과 상호작용함을 관찰할 수 있으며 (도 lj), 과발현 (ectopic expression)된 Hades는 세포질 p53의 분해를 유발한다 (도 5e, lower panel). 관찰된 결과들을 기초로, 본 발명자들^ 세포질에서 Hades에 의한 p53 유비퀴틴화는 세포질 및 미토콘드리아 구획 모두에서; p53의 발현 수준을 감소시킴을 제시하였다.
<i95> p53을 타겟하는 Mdm2를 포함하는 몇몇 E3 리가아제 (ligase)에 대해 연구되었 음에도 불구하고 [Dornan et al . , Nature 429, 86-92 (2004)； Leng et al . , Cell 112， 779-791 (2003)], 본 발명자들은 다음의 이유로 Hades가 Mdm2에 대한 다른 메 커니즘을 갖는 것으로 제시한다. 첫째, Mdm2는 핵 내에서 p53 발현을 감소시키지만 [Shirangi et ah, FASEB J. 16， 420-422 (2002)], Hades는 세포질에서 p53의 발현 을 감소시키고 (도 5e, lower panel), Mdm2-비의존적 방법에 의해 p53을 유비퀴틴 화 시킨다 (도 3f). 두 번째, p53의 N-말단 라이신 잔기 (24 번째 lysine 잔기)는 Mdm2에 의한 유비퀴틴화에서 연구되지 않고, Hades에 의한 유비퀴틴화에 매우 중요 한 잔기임을 본 발명에서 확인하였다 (도 3k의 (Α))· 세 번째， Hades는 부정적 피 드백 루프 (negative feedback loop)를 갖지 않는다. p53의 UV 발광 또는 과발현 (ectopic express ion)은 A549 또는. HCT119 세포에서 Hades mRNA의 증가를 유도하지 않는다. <196> p53을 타켓하는 몇몇의 세포질 E3 리가아제 (ligase)는 ARF-bpl 및 p300을 포 함하는 정상 상태에서 E3 리가아제로써 연구되었다 [Chen et al., Cell 121， 1071- 1083 (2005); Shi et al . , Proc Natl Acad Sci USA. 106， 16275-16280 (2009)]. 그러나， 본 발명자들은 다른 E3 리가아제 경로 또한 Hades에 의해 매개되는 p53 조 절에 기여할 것이라는 가능성을 배제하지 않았다.
<197> 흥미롭게도， 본 발명자들은 Hades를 제거시키는 경우 핵 및 세포질에서 p53 의 축적이 나타남을 발견하였다 (도 2h). p53의 단백질 안정성 및 전이활성이 다양 한 생물화학적 메커니즘에 의해 강하게 조절되는 것은 잘 알려져 있다. 최근 연구 에 따르면， 유비퀴틴화된 세포질 p53은 위치화 (localization)에 의해 안정화된다. p53의 유비퀴틴화 형태는 핵으로의 수송을 위한 임포틴 (importin)과 상호작용하지 않으며 [Marchenko et al . , Cell Death Differ. 17， 255-267 (2010)], Usp 10에 의 한 p53의 탈유비퀴틴화 (deubiquitination)는 p53 핵 수송 및 활성의 결과를 초래한 다. 이는, 본 발명의 Hades의 제거에 의해 핵 및 세포질에서 p53이 축적되는 것과 유사하다 (도 2h),
<198> 본 발명의 결과에서 가장 중요한 부분은， Hades가 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 조절한다는 것이다. Hades는 미토콘드리아에 위치한 p53의 종양 억제 기능 을 저해하며, 형질전환된 모델에서 p53과 Bcl-2의 상호작용을 방해한다 (도 5b). 최근의 연구는 세포질 및 미토콘드리아 p53이 CPT에 대한 반응으로 Bcl-2 family의 구성원과 결합하고， 미토콘드리아에서 세포 죽음을 직접적으로 촉진시킴을 보였다 [Mihara et al . , Molecular Cell 11， 577—590 (2003)]. 하지만, 본 연구에서는 Hades가 CPT에 의해 유도된 p53의 축적을 저해하고 (도 5e), p53과 Bcl-2 사이의 상호작용을 차단함을 확인하였다 (도 5f). 또한 이전의 연구에서는 p53과 Bcl-2 단 백질의 상호작용을 확인하였으며, 상호작용 후 미토콘드리아 막 전위의 손실은 p53 에 의해 활성화된 전사-비의존적 세포 죽음 메커니즘의 특징임을 확인하였다 [Tomita et al., J Biol Chem. 281, 8600-8606 (2006)]. 본 발명에서는 Hades를 제 거시킨 세포에 CPT를 노출시키는 경우 미토콘드리아로부터 시토크롬 C cytochrome
C)의 방출 (도 5h) 및 HCT116 p53+/+ 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 손실을 확인 하였으며, HCT116 p53_/" 세포에서는 막 전위 손실이 야기되지 않음을 확인하였다 ( 도 5j). 또한, FACS 분석을 통해 대조군과 비교하여 Hades를 제거한 안정한 MCF7 세포에 CPT를 노출시키는 경우， sub-G0 세포 분획에서 세포 사멸 (apoptotic)이 증 가됨을 확인하였다 (도 5i). 그리고 본 발명은 Hades가 유비퀴틴에 의존적인 프로 테아좀에 의한 분해를 통해 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 억제시킴으로써 CPT 에 의해 유도되는 세포 죽음을 보호할 수 있음을 보였다. 상기의 결과에 기초하여 본 발명자들은 Hades가 p53의 핵방출 기전을 부정적으로 조절하는 것으로 제안한 다.
<199> 세포질 p53의 과도한 유비퀴틴화 형태는 신경모세포증 (neuroblastoma)과 같 은 일부 암에서 보고되었다 [Becker et al . , Cell Death Differ. 14， 1350-1360 (2007)]. 특정 조건하에서 p53의 종양 억제 역할을 명확히 하기 위해 p53에 대한 핵방출 (exonuclear) 기전을 층분히 연구한 결과， 유비퀴틴화에 의한 p53의 핵방출 기전의 저해는 종양형성 (tumorigenesis)과 관련되는 것으로 나타났다 [Talos et al. , Cancer Res. 65， 9971-9981 (2005)； Palacios et al. , Cell Cycle 7， 2584- 2590 (2008)]. 본 발명자들은 HCC 환자의 간 생체검사에서 정상 조직에 비해 2 배 이상의 Hades mRNA의 발현을 확인하였다 (도 5k) · 이는 p53의 핵방출 기전의 조절 이 종양형성에 영향을 미침을 나타내는 첫 번째 증명 결과이다. 비록 본 발명자들 은 과도한 Hades 발현이 p53의 핵방출 기전을 억제시킴으로써 종양 형성을 촉진사 킨 정확한 메커니즘에 대해서는 현재까지 밝혀내지 못하였지만， p53 종양 억제 활 성에 대한 Hades의 대체 기능을 발견하였다.
<200> 결론적으로, 본 발명은 Hades가 p53 종양 억제에 대한 E3 리가아제 (Hgase) 임을 제시하며, 세포질에서의 p53 조절 및 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전 조절에 대한 다섯가지 결과를 제시하였다. Hades는 p53의 핵방출 경로에서 고유의 역할을 하며， 이는 p53-의존적 미토콘드리아 세포 죽음 경로에서 새로운 조절자로서의 역. 할인 것이다. 더 나아가 Hades의 생리학적 기능에 대한 연구가 더 필요할 것이다.
<201>
【산업상 이용가능성】
<202> 이상 설명한 바와 같이， 본 발명자들은 과발현된 Hades가 p53과 상호작용하 여 p53의 핵방출 (exonuclear) 기전을 저해함으로써， p53의 종양 억제 기능을 저해 시키고， 또한 Hades의 제거 (knockdown)는 p53의 발현을 증가시키는 것을 확인함으 로써， Hades가 p53의 부정적 (negative) 조절자임을 처음으로 밝혀내었다. 따라서 종양 세포에서 과발현하는 Hades의 기능을 억제하면 p53에 의한 종양 억제 기능이 효과적으로 일어날 것이다. 즉, Hades 단백질의 발현을 조절하거나， Hades의 작용 을 억제하는 억제제를 개발할 수 있으며, 뿐만 아니라 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 신약후보물질을 도출하여 항암제로 사용할 수 있을 것으로사료된다。

Claims

【청구의 범위】
【청구항 II
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제 를 유효성분으로 함유하는 종양 억제용 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 Hades는 종양 세포에서 과발현되는 것올 특징으로 하 는 종양 억제용 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades 유전 자의 전사 또는 번역을 하향조절하거나， Hades 단백질의 작용을 억제하는 것을 특 징으로 하는 종양 억제용 조성물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서， 상기 Hades 단백질의 발현 억제제는 서열번호 4 또는 5의 염기서열을 갖는 Hades siRNAC short interfering RNA) 또는 이를 전사하는 유전자 인 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades와 p53의 상호작용 (interact ion)을 저해하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
【청구항 6]
제 5항에 있어서， 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 DNA 결합, 전사 활 성 , 스트레스 -유발 세포 사멸 및 p53-유발 세포 사멸을 저해하는 것을 특징으로 하 는 종양 억제용 조성물.
[청구항 7]
제 5항에 있어서， 상기 Hades와 p53의 상호작용은 p53의 유비퀴틴화 (ubiquitination)를 유도하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
【청구항 8]
제 1항에 있어서, 상기 Hades 단백질의 발현 또는 작용 억제제는 Hades의 C- 말단 RING— finger 도메인을 표적하는 것을 특징으로 하는 종양 억제용 조성물.
【청구항 9】
하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법:
(a) Hades 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Hades 단백 질의 발현이 감소되는지 여부를 결정하는 단계 .
【청구항 10)
하기의 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법:
(a) 시험 약제의 존재하에 p53-결합부위를 함유하는 Hades 단백질 또는 그 단편과 p53을 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 시험 약제가 없는 대조군과 비교하여 Hades와 p53의 상호작용이 저해되 는지 여부를 결정하는 단계.
【청구항 11】
제 10항에 있어서 , 상기 Hades의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 p53-결합부위 (C_말단의 RIGN-finger 도메인)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 제의 스크리닝 방법 .
【청구항 12】
제 10항에 있어서 , 상기 Hades와 p53의 상호작용은 Hades의 p53-결합부위 (C- 말단의 RING-finger 도메인)와 p53의 DNA-결합 도메인 사이에서 일어나는 것을 특 징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법。
【청구항 13]
제 10항에 있어서， 상기 (b) 단계에서 Hades와 p53의 상호작용은 면역침전 (i腿 unoprecipitation) 분석， GST 풀 -다운 (puU-down) 분석 및 콜로니 (colony)-형 성 분석에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제의 스크리닝 방법.
【청구항 14]
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 스크리닝 방법에 의해 스크리닝 된 약제를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물.
【청구항 15]
하기를 포함하는 Hades와 p53의 상호작용을 저해하는 항암제의 스크리닝 키 트：
(a) Hades의 p53-결합부위 (C-말단 RING-finger 도메인)를 함유하는 폴리펩타 이드；
(b) p53의 DNA-결합 도메인을 함유하는 폴리펩타이드; 및
(c) 상기 폴리펩타이드들 사이의 상호작용을 검출하는 시약.
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