WO2011151083A2 - Verfahren und vorrichtung zum automatischen und direkten analysieren von "dried spot"-proben mittels lc-ms-system - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for analyzing medical, pharmaceutical, biological, biochemical and chemical samples by means of HPLC or LC-MS system, a device for carrying out the method and preferred uses of methods and apparatus.
  • a filter paper card commonly referred to as a "blood spot card”
  • a blood spot card is completely and uniformly soaked in blood in one or more predetermined fields previously taken from a subject to be tested
  • a small drop of blood which corresponds to approximately ⁇ of blood, is usually sufficient for the examination, and the card thus prepared is then dried for at least one hour at room temperature and must not be heated.
  • this card has to be analyzed the same day.
  • conventional test methods such as the determination of the enzyme activity, colorimetric and immunological, or more recently also tandem mass spectroscopy, are known.
  • Mass spectrometry is coupled with high performance liquid chromatography in an LC / MS / MS system
  • the sample For the analysis of the filter paper cards by means of high-performance liquid chromatography, the sample must be punched out of the filter paper card in the conventional, previously known analysis systems.
  • the known processing methods several complex manual steps are usually required, which include a variety of sources of error.
  • the analytical result can be falsified or even made unusable.
  • Common sources of error are carryover of the sample with the risk of cross or cross contamination, confusion, errors during pipetting and / or dosing.
  • the conventional, hitherto known systems for processing the filter paper cards provided with the "dried blood spots" by means of high-performance liquid chromatography cover only partial areas of the respectively necessary working steps, are too complex and / or not robust.
  • the “dried blood spots” After punching out the “dried blood spots” from the filter paper card, the “dried blood spots” are washed out in a solution so that the analyte passes into the solution.
  • This sample solution is then filtered or centrifuged to allow any particles contained in the solution, e.g. of the filter paper, which does not affect the high performance liquid chromatography (HPLC) apparatus, and e.g. Do not clog the HPLC column.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • further manual steps of sample preparation are now carried out before the sample solution can be injected into the HPLC apparatus.
  • the present invention therefore has for its object to provide a method and an apparatus, which not only such "dried blood spot" samples are processed automatically, safely and quickly and in an HPLC system, preferably in a LC-MS system, can be injected and analyzed there, but with which this analysis method can also be added to completely new uses.
  • This object is achieved according to the invention by a method for the direct analysis of medical, pharmaceutical, biological, biochemical and / or chemical samples by means of HPLC, in which the sample, which has at least one analyte, is applied in liquid form to a sample carrier and dried, then that the sample is located as a "dried spot" on the sample carrier, pressure-tightly clamped between two adapters of an adapter system, the adapters each having a centric cavity in the direction of the clamped blood sample, into the one adapter as an input adapter via a Supply line an extractant supplied and discharged at the other adapter as an output adapter via a derivative and thereby the inserted spanned sample carrier flows through and thus the sample is washed out of the sample carrier.
  • the washed-out sample is filtered in the output adapter.
  • the washed-out sample can be passed through an SPE column before passing through an analytical column and concentrated there. Alternatively, it may also be provided to supply the sample directly to a mass spectrometer.
  • the input and output adapters can be pressed together and sealed pressure-tight via the sample carrier as a sealing washer.
  • the method according to the invention can be carried out fully automatically by feeding or changing the sample carrier (s) to the adapter system via a robot.
  • the sample carrier can be provided to optically detect the sample (s) with the sample carrier and to supply it to an image analysis.
  • One way to visually capture such samples is to use digital cameras. On the one hand, this serves for logistic detection, and on the other hand, the samples can be fed by a previous image analysis pinpoint the output adapter, which can also be referred to as extraction adapter.
  • the invention further relates to a method for the direct analysis of medical, pharmaceutical, biological, biochemical and chemical samples in the form of a "dried spot" on a sample carrier by means of HPLC, in which two adapters of an adapter system as a sample receiving an imaginary common axis respectively be sealed pressure-tight on a sealing surface, and wherein the adapters each having a central cavity, fed to the one adapter as an input adapter via a feed line a detergent and discharged in the other adapter as output adapter via a drain and thereby flow through the cavities, said additionally an internal standard (ISTD) is supplied before or after passing through the adapter system.
  • an internal standard ISD
  • the HPLC flow chamber can be pressure-tightly sealed via the adapter or the adapter system even without the sample carrier with the "dried blood spot" blood samples.
  • This variant is used for purging for cleaning purposes and / or for preparing for the next analysis.
  • the internal standard is tuned in the usual way to the sample to be examined.
  • the criteria essential for this are known per se to those skilled in the art and therefore need not be explained in detail here.
  • the internal standard is supplied via an additional sample loop.
  • the ISTD is added to a liquid sample prior to sample preparation, which would be within the scope of the present invention but the sample extraction. However, this is not readily possible in the analysis of "dried spots.” Since the ISTD is nevertheless to be used with preference because it fundamentally makes it possible to improve the measurement accuracy of the HPLC or LC-MS system, it will now be according to a preferred embodiment Embodiment according to the Benextratation supplied via the additional sample loop. This is associated with a valve circuit, which is essentially provided for rinsing, cleaning with a washing liquid and preparing for the next analysis. Alternatively, it is also possible to add the ISTD via a separate valve.
  • the analysis of the blood samples according to the first-mentioned variant in one of its embodiments and the washing and preparation of the HPLC system according to the second variant for cleaning purposes can be carried out successively, with a time-varying or temporally overlapping.
  • the invention also relates to a device for the direct analysis of medical, pharmaceutical, biological, biochemical and chemical samples in the form of a "dried spot" on a sample carrier by means of HPLC, with an adapter system for receiving the sample, which has an input adapter and an output adapter , which are pressure-tight together closed by a common, imaginary axis and each having a central cavity which opens at the input adapter in a supply line and the output adapter in an output line.
  • a filter is preferably arranged in the central cavity of the output adapter.
  • the sample carrier of the sample is preferably clamped between the input adapter and the output adapter and forms a sealing disk for the pressure-tight sealing of the adapter system.
  • the adapter system is connected to a first valve circuit, via which a connection to a supply of an internal standard (ISTD), a dilution and a washing solution is formed.
  • ISD Internal Standard
  • this additional sample loop is located directly on the first valve circuit.
  • a second valve circuit can be provided, via which a connection to an SPE column for concentrating the analyte in the sample is formed.
  • the second valve circuit may form the forwarding of the sample to an analytical column after concentration of the analyte.
  • the extract from the sample as it was originally as a "dried spot" on the sample carrier, is forwarded to the analysis column.
  • the HPLC system according to the invention may be coupled to a mass spectrometer as LC-MS system.
  • the invention further relates to the use of the previously described apparatus and method according to one of the said embodiments for the direct quantitative or qualitative analysis of dried spof samples in the form of dried blood spof samples by HPLC or LC-MS Examination of drug concentrations in a human or animal blood sample, examination or screening of neonates, children, adolescents and / or adults for metabolic and / or hormonal diseases or other diseases, such as AIDS.
  • the present invention not only has the previous method of analysis of "dried blood spots" been improved and fed to a direct as well as optionally additionally automated application and refined by modern methods of image analysis, but additionally significantly extended to use for the direct quantitative or qualitative analysis of essentially any liquids to be analyzed, including, but not limited to, medical, pharmaceutical, biological, biochemical dry and dry samples and their analysis by HPLC or LC-MS, which may be selected from human and / or animal body fluids, extracts of liver, brain, tissue and / or plant parts, samples chemical processes and / or samples from the chemical process analysis, the list has exemplary character.
  • the present invention can thus be described by the provision of a method and a device with which not only “dried blood spot” blood samples are processed directly but also, according to a particular embodiment, fully automatically, safely and quickly, and directly into the HPLC - or LC-MS system can be injected and analyzed there, but now for the first time, any other samples, which is why the "spots" now in a modification are no longer referred to as “dried blood spot” samples, but to form a new term as "dried spots”.
  • the sample carrier having the dried spot samples is preferably automatically clamped in a high-pressure flow chamber, the analyte is washed out, the ISTD and a dilution solution can be added, and the sample solution can be pumped directly onto an SPE column. This allows the analyte to be concentrated, purified and separated using HPLC column switching. It can also be forwarded to a mass spectrometer (MS system).
  • MS system mass spectrometer
  • the measurement can be done by LC-MS. It is essential that the flow chamber can be closed pressure-tight even without the sample carrier and flushed pressure-tight for cleaning.
  • the individual functions can be superimposed on one another particularly advantageously over time.
  • the sample carriers can also be changed automatically and recorded electronically.
  • Show it: 1 is a schematic view of the analysis station for the direct analysis of "dried spot" samples by means of HPLC,
  • FIG. 3 shows a sectional view of the adapter system according to the invention for the supply of the "dried spot" sample
  • Fig. 3 is a schematic view of a fully automatic analysis station for "dried spot" samples by HPLC.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the embodiment of the HPLC system according to the invention can likewise be used in the field of ultrahigh-performance liquid chromatography (UPLC or UHPLC).
  • UPLC ultrahigh-performance liquid chromatography
  • the UPLC differs from the conventional HPLC separation process by a higher sample throughput, which is essentially due to a higher separation efficiency achieved in the UPLC process.
  • the UPLC refers to a HPLC separation process with greatly enhanced performance.
  • HPLC system has a special adapter system 1, with the "dried spot" samples, which have at least one analyte to be examined and which are arranged on a sample carrier 3 of filter paper, for direct analysis, without prior Punching, into the HPLC System are transferred by the or each of the sample carriers are clamped in succession via the special adapter system 1 in a high-pressure flow chamber.
  • the special adapter system 1 is additionally illustrated in Fig. 2 again in more detail. It has a flexible supply line 5, which leads into an input adapter 7, which cooperates with a further adapter, which is designated as output adapter 9. This output adapter 9 is connected via a flexible output line 11 to the HPLC system.
  • the sample carrier 3 for the respective "dried blood spot" sample is arranged for analysis between the input adapter 7 and the output adapter 9 and simultaneously serves as a sealing washer between the sealing surface 15 of the input adapter 7 and the sealing surface 17 of the output adapter 9.
  • the supply line 5 opens into a central or central cavity 19 of the input adapter 7, which corresponds to a further central or central cavity 21 of the output adapter 9.
  • a filter 23rd In the central or central cavity 21 of the output adapter 9 is a filter 23rd
  • the at least one analyte which is located in the "dried blood spot" sample on the sample carrier 3, washed in the region of the central cavity 19 of the input adapter 7 from the sample carrier 3 and through the filter 23 in The output adapter 9 is flushed into the outlet line 11 and thus into the HPLC analysis system, which will be explained in more detail below.
  • an O-ring 25 which is arranged on the sealing surface 15 of the input adapter 7, serves as a seal between the input adapter 7 and the output adapter 9.
  • the output line 1 1 leads in the illustrated embodiment to a 10-port valve 27, in which in a position A in Fig. 1 with 29 designated connections are active, while in a position B in Fig. 1 denoted by 31 Connections are active.
  • a washing solution 33 is introduced into the outlet line 11 by means of a washing pump 35 provided for this purpose.
  • a loop 37 for an internal standard is also connected, which is now filled with a charge syringe 39 likewise shown in FIG. 1 and via an ISTD feed line 41 with the ISTD.
  • An overflow line 43 ensures that an overflow can flow into a designated waste container 45.
  • the position A is selected in which the connections 29 are active. It is then by means of a charging-Laufstoffs 47 and a designated charge pump 49 of the ISTD the loop 37 through the flexible supply line 5, the input adapter 7, the sample carrier 3 with the examined “dried blood spot” sample, the output adapter 9, the output line 1 1 rinsed by a further connecting line 51 to an SPE column 53.
  • SPE is used as a common shorthand for” solid phase extraction.
  • a 6-port valve 55 is passed, in which connection 57 is open or active.
  • a dilution pump 59 is provided in the system, which is connected to the connecting line 51 to the SPE column via a tee 61.
  • This dilution pump 59 can lead a dilution-running agent from a reservoir 63 into the connecting line 51 and thereby dilute the charge-eluent 47.
  • said 6-port valve 55 is switched so that a connection designated by the reference numeral 65 is open or active.
  • This causes the analyte and ISTD to be purged from the SPE column to an analytical column 69 by means of a HPLC gradient pump 67 and the analyte analyzed there.
  • Reference numbers 43 and 45 again designate an overflow line 43 and a waste container 45, which ensure that the overflow can flow off in a targeted manner.
  • FIG. 3 additionally shows a fully automatic analysis station for this direct analysis of dried blood spot samples according to the invention.
  • Reference numeral 71 denotes a robot arm having a mobility in the XYZ direction, which has a gripper 73.
  • the sample carrier 3 having the "dried blood spot" sample is taken out of a rack 75 or else returned to it.
  • the sample carrier 3 is then guided to an electronic read head 77 and positioned between the input adapter 7 and the output adapter 9 of the HPLC pressure chamber. Subsequently, the clamping of the sample carrier 3 between the input adapter 7 and the output adapter 9, so that this can be washed out via the flexible supply line 5 and the flexible output line 1 1 and fed to the analysis in the manner described above.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und Verwendungen zur direkten Analyse von Proben mittels HPLC, bei dem die Probe, die zumindest einen Analyten aufweist, in flüssiger Form auf einen Probenträger (3) aufgetragen und getrocknet wird, so daß sich die Probe als „dried spot" auf dem Probenträger (3) befindet, zwischen zwei Adaptern (7, 9) eines Adaptersystems (1) druckdicht eingespannt wird, wobei die Adapter (7, 9) jeweils in Richtung auf die eingespannte Probe einen zentrischen Hohlraum (19, 21) aufweisen, in den bei dem einen Adapter über eine Zuleitung (5) ein Extraktionsmittel zugeführt und bei dem anderen Adapter über eine Ausgangsleitung (11) abgeführt und dabei der eingespannte Probenträger (3) durchflössen und die Probe aus dem Probenträger (3) herausgewaschen wird. Ergänzend wird in den einen Adapter über eine Zuleitung (5) ein Waschmittel zugeführt und bei dem anderen Adapter als Ausgangsadapter (9) über eine Ausgangsleitung (11) abgeführt.

Description

Werner Döbelin
Grellingerstrasse 4
4153 Reinach BL
Verfahren und Vorrichtung zum automatischen und direkten Analysieren von„dried spot"-Proben mittels LC-MS-System
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren von medizinischen, phar- mazeutischen, biologischen, biochemischen und chemischen Proben mittels HPLC oder LC-MS-System, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens sowie bevorzugte Verwendungen von Verfahren und Vorrichtung.
Es ist bereits seit längerem bekannt, eine Mikrobestimmung von Blutbestandteilen über sogenannte„getrocknete Blutflecken", den„dried blood spots", durchzuführen. Ursprünglich wurde diese Methode der Blutanalyse von„dried blood spots" beschrieben durch I. Bang in„Ein Verfahren zur Mikrobestimmung von Blutbestandteilen", Biochem. Ztschr. 49, 19-39 (1913). Sie wurde dort eingesetzt zur Bestimmung von Glucosekonzentrationen im Blut.
Anfang der 60-iger Jahre entwickelte Dr. Guthrie ein Assay für die Bestimmung von Phenylketonuria, Guthrie R., Susi A.,„A simple Phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants", in Pediatrics 32, 338-343 (1963). Dabei wurden Bluttropfen auf Filterpapier gesammelt, um so Reihenuntersuchungen von Neugeborenen zur Bestimmung von angeborenen Stoffwechselerkrankungen zu ermöglichen.
In heutiger Zeit hat sich die Blutanalyse von„dried blood spots" unter anderem etabliert zur Untersuchung von Patienten in bezug auf verschiedene klinische Zwecke oder zur Durchführung epidemiologischer Untersuchungen. So wurde von Schütz et al. ein Verfahren zur Bestimmung von illegalen Drogen an Blutflecken veröffentlicht, die in der„Szene" gesammelt worden sind, Schütz, H., Gotta, J.C., Erdmann, F., Risse, M., Weiler, G.,„Simultaneous Screening and detection of drugs in small blood samples and bloodstains", Forensic Sei. Int. 126, 191-196 (2002). Dieses Verfahren ist nur dann geeignet, wenn qualitative Informationen ausreichen.
Für die Durchführung solcher Untersuchungen wird eine Filterpapierkarte, üblicherweise als„blood spot card" bezeichnet, in einem oder mehreren vorgegebenen Feldern vollständig und gleichmäßig mit Blut durchtränkt, der zuvor einer zu testenden Person entnommen worden ist. Die für die Untersuchung benötigte Blutmenge ist in der Regel gering. Ein Bluttropfen, der etwa ΙΟΟμΙ Blut entspricht, reicht üblicherweise für die Untersuchung aus. Die so präparierte Karte wird anschließend mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur getrocknet. Sie darf dabei nicht erhitzt werden.
Normalerweise muß diese Karte noch am selben Tag analysiert werden. Dazu sind konventionelle Testmethoden, wie die Bestimmung der Enzymaktivität, colorime- trisch und immunologisch, oder neuerdings auch die Tandem- Massenspektroskopie bekannt. Dabei wird die Massenspektroskopie mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in einem LC/MS/MS-System gekoppelt
Für die Analyse der Filterpapierkarten mittels Hochleistungsflüssigkeitschroma- tographie muß die Probe bei den herkömmlichen, bisher bekannten Analysesy- stemen aus der Filterpapierkarte ausgestanzt werden. Bei den bekannten Verarbeitungsmethoden sind in der Regel mehrere aufwendige manuelle Arbeitsschritte erforderlich, welche eine Vielzahl von Fehlerquellen beinhalten. Dadurch kann das analytische Resultat verfälscht oder sogar unbrauchbar gemacht werden. Übliche Fehlerquellen sind dabei Verschleppungen der Probe mit der Gefahr der Cross- oder Querkontamination, Verwechslungen, Fehler beim Pipettieren und/oder Dosieren. Außerdem decken die herkömmlichen, bisher bekannten Systeme zum Abarbeiten der mit den„dried blood spots" versehenen Filterpapierkarten mittels der Hochlei- stungsflüssigkeitschromatographie nur Teilbereiche der jeweils notwendigen Arbeitsschritte ab, sind zu komplex und/oder nicht robust.
Nach dem Ausstanzen der„dried blood spots" aus der Filterpapierkarte werden die„dried blood spots" in einer Lösung ausgewaschen, so daß der Analyt in die Lösung übergeht. Diese Probenlösung wird dann gefiltert oder zentrifugiert, damit möglicherweise in der Lösung enthaltene Partikel, z.B. von dem Filterpapier, die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)- Apparatur nicht beeinträchtigen und z.B. die HPLC-Säule nicht verstopfen. Je nach Verarbeitungsmethode der Proben erfolgen nun weitere manuelle Schritte der Probenaufarbeitung, bevor die Probelösung in die HPLC- Apparatur injiziert werden kann. Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, womit nicht nur solche„dried blood spot"-Proben automatisch, sicher und schnell aufgearbeitet werden und in ein HPLC-System, vorzugsweise in ein LC-MS-System, injiziert und dort analysiert werden können, sondern womit diese Analysemethode zusätzlich ganz neuen Verwendungen zugeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur direkten Analyse von medizinischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und/oder chemischen Proben mittels HPLC, bei dem die Probe, die zumindest einen Analyten aufweist, in flüssiger Form auf einen Probenträger aufgetragen und getrocknet wird, so daß sich die Probe als„dried spot" auf dem Probenträger befindet, zwischen zwei Adapter eines Adaptersystems druckdicht eingespannt wird, wobei die Adapter jeweils in Richtung auf die eingespannte Blutprobe einen zentrischen Hohlraum aufweisen, in den bei dem einen Adapter als Eingangsadap- ter über eine Zuleitung ein Extraktionsmittel zugeführt und bei dem anderen Adapter als Ausgangsadapter über eine Ableitung abgeführt und dabei der einge- spannte Probenträger durchflössen und somit die Probe aus dem Probenträger herausgewaschen wird.
Auf diese Weise kann die Methode der Analyse von„dried blood spots" erweitert werden auf die Analyse von„dried spots" unterschiedlichster Art, die weiter unter noch Erwähnung finden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die herausgewaschene Probe in dem Ausgangsadapter gefiltert wird.
Dadurch wird ein Verstopfen der HPLC- Vorrichtung, insbesondere der nachfolgenden Säulen wirksam vermieden. Da der Probenträger, welcher aus Filterpapier besteht, nicht ausgestanzt wird, werden auch weniger Partikel freigesetzt, was die Verstopfungsgefahr reduziert und das Filtrieren auch überflüssig machen kann. Die herausgewaschene Probe kann vor dem Passieren einer Analysesäule über eine SPE-Säule geführt und dort aufkonzentriert werden. Alternativ dazu kann es auch vorgesehen sein, die Probe direkt einem Massenspektrometer zuzuführen. Der Eingangs- und der Ausgangsadapter können zusammengepreßt und über den Probenträger als Dichtscheibe druckdicht verschlossen werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren vollautomatisch durchgeführt werden, indem der oder die Probenträger dem Adaptersystem über einen Roboter zugeführt und gewechselt werden.
Außerdem kann es vorgesehen sein, die Probe(n) mit dem Probenträger optisch zu erfassen und einer Bildanalyse zuzuführen. Eine Möglichkeit, solche Proben optisch zu erfassen, besteht in dem Einsatz von Digitalkameras. Einerseits dient dies der logistischen Erfassung, und andererseits können die Proben durch eine vorherige Bildanalyse punktgenau dem Ausgangsadapter zugeführt werden, der auch als Extraktionsadapter bezeichnet werden kann.
Auf diese Weise eröffnet sich sogar die Möglichkeit, daß eine Probe sogar mehrfach analysiert werden kann. Von Vorteil ist dies deshalb, weil durch den entsprechenden Adapter regelmäßig nur ein kleiner Teil der zu analysierenden Probe ex- trahiert wird. Mit der Wahl z.B. einer exzentrischen Position kann der gleiche Punkt mehrfach analysiert werden.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur direkten Analyse von medi- zinischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und chemischen Proben in Form eines„dried spot" auf einem Probenträger mittels HPLC, bei dem zwei Adapter eines Adaptersystems als Probenaufnahme über eine gedachte gemeinsame Achse jeweils an einer Dichtfläche druckdicht verschlossen werden, und wobei die Adapter jeweils einen zentrischen Hohlraum aufweisen, in den bei dem einen Adapter als Eingangsadapter über eine Zuleitung ein Waschmittel zugeführt und bei dem anderen Adapter als Ausgangsadapter über eine Ableitung abgeführt und dabei die Hohlräume durchflössen werden, wobei zusätzlich vor oder nach dem Passieren des Adaptersystems ein Interner Standard (ISTD) zugeführt wird.
Entsprechend dieser Variante kann die HPLC-Durchflußkammer über die Adapter bzw. das Adaptersystem auch ohne den Probenträger mit den„dried blood spot"- Blutproben druckdicht verschlossen werden. Die genannte Variante dient zur Durchspülung zu Reinigungszwecken und/oder zur Vorbereitung auf die nächste Analyse.
Der Interne Standard ist in üblicher Weise auf die zu untersuchende Probe abgestimmt. Die hierfür wesentlichen Kriterien sind dem Fachmann an sich bekannt und müssen daher hier nicht näher erläutert werden. Vorzugsweise wird der Interne Standard über eine zusätzliche Probenschleife zugeführt.
Normalerweise wird der ISTD einer flüssigen Probe vor der Probenvorbereitung, das wäre im Rahmen der vorliegenden Erfindung aber die Probenextraktion, zugegeben. Dies ist jedoch bei der Analyse von„dried spots" nicht ohne weiteres möglich. Da der ISTD trotzdem bevorzugt verwendet werden soll, weil er grundsätzlich eine Verbesserung der Meßgenauigkeit des HPLC- bzw. LC-MS-Systems ermöglicht, wird er nun gemäß einer bevorzugten Ausführungsform nach der Pro- benextraktion über die zusätzliche Probenschleife zugeführt. Diese ist einer Ventilschaltung zugeordnet, welche im wesentlichen für das Spülen, Reinigen mit einer Waschflüssigkeit und Vorbereiten auf die nächste Analyse vorgesehen ist. Alternativ dazu ist es aber auch möglich, den ISTD über ein separates Ventil zu- zugeben.
Die Analyse der Blutproben gemäß der zuerst genannten Variante in einer ihrer Ausgestaltungen und das Waschen und Vorbereiten des HPLC-Systems gemäß der zweiten Variante zu Reinigungszwecken können nacheinander, zeitlich ab- wechselnd oder zeitlich überlappend erfolgen.
Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur direkten Analyse von medizinischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und chemischen Proben in Form eines„dried spot" auf einem Probenträger mittels HPLC, mit einem Adap- tersystem zur Aufnahme der Probe, das einen Eingangsadapter und einen Ausgangsadapter aufweist, die über eine gemeinsame, gedachte Achse druckdicht miteinander verschließbar sind und jeweils zentral einen Hohlraum aufweisen, der bei dem Eingangsadapter in eine Zuleitung und bei dem Ausgangsadapter in eine Ausgangsleitung mündet.
In dem zentralen Hohlraum des Ausgangsadapters ist vorzugsweise ein Filter angeordnet.
Der Probenträger der Probe ist vorzugsweise zwischen dem Eingangsadapter und dem Ausgangsadapter eingespannt und bildet eine Dichtscheibe für das druckdichte Verschließen des Adaptersystems.
Alternativ ist ein Dichtring für das druckdichte Verschließen des Adaptersystems zwischen dem Eingangsadapter und dem Ausgangsadapter eingespannt. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung ist das Adaptersystem mit einer ersten Ventilschaltung verbunden, über die eine Verbindung zu einer Zuführung eines internen Standards (ISTD), einer Verdünnungs- und einer Waschlösung gebildet ist. Es kann eine zusätzliche Probenschleife für das Zuführen des Internen Standards (ISTD) vorgesehen sein, die in Serie zu dem Adaptersystem geschaltet ist.
Vorzugsweise befindet sich diese zusätzliche Probenschleife direkt an der ersten Ventilschaltung.
Es kann eine zweite Ventilschaltung vorgesehen sein, über die eine Verbindung zu einer SPE-Säule zum Aufkonzentrieren des Analyten in der Probe gebildet ist. Die zweite Ventilschaltung kann nach dem Aufkonzentrieren des Analyten die Weiterleitung der Probe zu einer Analysesäule bilden.
Dabei wird der Extrakt aus der Probe, wie sie sich ursprünglich als„dried spot" auf dem Probenträger befand, zu der Analysesäule weitergeleitet.
Das erfindungsgemäße HPLC-System kann mit einem Massenspektrometer als LC-MS-System gekoppelt sein.
Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung der zuvor erläuterten Vorrichtung und des Verfahrens gemäß einer der genannten Ausgestaltungen für die direkte quantitative oder qualitative Analyse von„dried spof'-Proben in Form von „dried blood spof'-Proben mittels HPLC oder LC-MS zur Untersuchung von Arzneimittelkonzentrationen in einer Blutprobe von Mensch oder Tier, Untersuchung oder Screening von Neugeborenen, Kindern, Jugendlichen und/oder Erwachsenen auf Stoffwechsel- und/oder Hormonerkrankungen oder sonstigen Erkrankungen, wie Aids.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht nur die bisherige Methode der Analyse von„dried blood spots" verbessert und einer direkten wie auch wahlweise zusätzlich automatisierten Anwendung zugeführt und durch moderne Verfahren der Bildanalyse verfeinert worden, sondern zusätzlich wesentlich erweitert auf die Verwendung für die direkte quantitative oder qualitative Analyse von im wesentlichen beliebigen Flüssigkeiten, die einer Analyse zugeführt werden sollen. Darunter fallen insbesondere medizinische, pharmazeutische, biologische, biochemi- sehe und chemische„dried spot"-Proben und ihre Untersuchung mittels HPLC oder LC-MS. Diese Proben können ausgewählt sein aus Körperflüssigkeiten von Mensch und/oder Tier, Extrakten von Leber-, Gehirn-, Gewebe- und/oder Pflanzenteilen, Proben aus chemischen Prozessen und/oder Proben aus der chemischen Prozeßanalytik, wobei die Aufzählung exemplarischen Charakter hat.
Zusammenfassend läßt sich die vorliegende Erfindung somit dadurch beschreiben, daß ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitgestellt werden, mit dem nicht nur „dried blood spot"-Blutproben direkt, gemäß einer besonderen Ausgestaltung auch vollautomatisch, dazu sicher und schnell aufgearbeitet werden und direkt in das HPLC- bzw. LC-MS-System injiziert und dort analysiert werden können, sondern nun erstmals auch beliebige andere Proben, weshalb die„spots" nun in Abwandlung nicht mehr als„dried blood spot"-Proben bezeichnet werden, sondern unter Bildung eines neuen Begriffs als„dried spots".
Der die„dried spot" -Proben , gegebenenfalls in Form von„dried blood spot"- Blutproben aufweisende Probenträger wird vorzugsweise automatisch in eine Hochdruck-Durchflusskammer eingespannt, der Analyt wird ausgewaschen, der ISTD und eine Verdünnungslösung können zugegeben werden und die Probenlö- sung kann direkt auf eine SPE-Säule gepumpt Dadurch kann der Analyt mittels HPLC-Säulenschaltung aufkonzentriert, gereinigt und getrennt werden. Er kann auch an ein Massenspektrometer (MS-System) weitergeleitet werden.
Die Messung kann mittels LC-MS erfolgen. Wesentlich ist, daß die Durchflusskammer auch ohne den Probenträger druckdicht verschlossen und zur Reinigung druckdicht durchspült werden kann. Die einzelnen Funktionen können einander besonders vorteilhaft zeitlich überlagert werden. Die probenträger können des weiteren automatisch gewechselt und elektronisch erfaßt werden.
Im folgenden soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Zeichnung näher erläutert werden.
Es zeigen: Fig. 1 Eine schematische Ansicht der Analysenstation für das direkte Analysieren von„dried spot"-Proben mittels HPLC,
Fig.3 eine geschnittene Ansicht des erfindungsgemäßen Adapter-Systems für die Zuführung der„dried spot"-Probe, und
Fig. 3 eine schematische Ansicht einer vollautomatischen Analysenstation für„dried spot"-Proben mittels HPLC.
Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur direkten Analyse von„dried spot"-Proben oder„dried blood spot"-Proben mittels eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Systems, auch kurz als LC bezeichnet, dient zunächst das in Fig. 1 dargestellte HPLC-System, daß sowohl im Normalmodus wie im reversed phase-Modus arbeiten kann. Die direkte Analyse von„dried blood spot"-Proben ist davon unabhängig durchführbar und soll nachfolgend näher erläutert werden.
Außerdem gelten die nachfolgenden Ausführungen nicht nur für die Anwendung im Bereich der üblichen HPLC-Trennverfahren. Die erfindungsgemäße Ausgestaltung des HPLC-Systems kann genauso im Bereich der Ultrahochleistungsflüs- sigkeitschromatographie (UPLC oder UHPLC) eingesetzt werden. Die UPLC un- terscheidet sich dabei von dem herkömmlichen HPLC-Trennverfahren durch einen höheren Probendurchsatz, der im wesentlichen bedingt ist durch eine im UPLC- Verfahren erreichte höhere Trennleistung. Grundsätzlich bezeichnet die UPLC ein HPLC-Trennverfahren mit stark gesteigerter Leistung. Das in Fig. 1 dargestellte HPLC-System weist erfindungsgemäß ein spezielles Adaptersystem 1 auf, mit dem„dried spot"-Proben, die zumindest einen zu untersuchenden Analyten aufweisen und die auf einem Probenträger 3 aus Filterpapier angeordnet sind, zur direkten Analyse, ohne vorheriges Ausstanzen, in das HPLC- System überführt werden, indem der bzw. jeder der Probenträger nacheinander über das spezielle Adaptersystem 1 in eine Hochdruck-Durchflusskammer eingespannt werden. Das spezielle Adaptersystem 1 ist zusätzlich in Fig. 2 noch einmal näher veranschaulicht. Es weist eine flexible Zuleitung 5 auf, die in einen Ein- gangsadapter 7 führt, der mit einem weiteren Adapter, der als Ausgangsadapter 9 bezeichnet ist, zusammenwirkt. Dieser Ausgangsadapter 9 ist über eine flexible Ausgangsleitung 11 mit dem HPLC-System verbunden.
Wenn die vorliegenden Erläuterungen dieses Ausführungsbeispiels exemplarisch von„dried blood spots", also getrockneten Blutflecken ausgehen, ist dies nicht beschränkend zu verstehen. Die dargestellte Methodik kann ebenso für beliebige andere Körperflüssigkeiten und allgemein Flüssigkeiten verwendet werden, die einer Analyse mittels HPLC oder LC-MS zugeführt werden sollen.
Mit 13 ist des weiteren eine gedachte gemeinsame Achse des Eingangsadapters 7 und des Ausgangsadapters 9 bezeichnet, auf welcher diese beiden zusammengepreßt werden können. Der Probenträger 3 für die jeweilige„dried blood spot"- Probe wird für die Analyse zwischen dem Eingangsadapter 7 und dem Ausgangsadapter 9 angeordnet und dient gleichzeitig als Dichtscheibe zwischen der Dicht- fläche 15 des Eingangsadapters 7 und der Dichtfläche 17 des Ausgangsadapters 9.
Die Zuleitung 5 mündet in einen zentralen bzw. zentrischen Hohlraum 19 des Eingangsadapters 7, der zu einem weiteren zentralen bzw. zentrischen Hohlraum 21 des Ausgangsadapters 9 korrespondiert. In dem zentralen bzw. zentrischen Hohlraum 21 des Ausgangsadapters 9 befindet sich ein Filter 23.
Es ist nun erfindungsgemäß vorgesehen, daß der zumindest eine Analyt, welcher sich in der„dried blood spot"-Probe auf dem Probenträger 3 befindet, in dem Bereich des zentrischen Hohlraums 19 des Eingangsadapters 7 aus dem Probenträger 3 ausgewaschen und durch den Filter 23 in dem Ausgangsadapter 9 in die Ausgangsleitung 1 1 und damit in das HPLC-Analysensystem gespült wird. Dies wird weiter unten noch näher erläutert.
Außerdem ist es möglich, daß der Eingangsadapter 7 und der Ausgangsadapter 9 auf ihrer gemeinsamen, gedachten Achse 13 zusammengepreßt werden, ohne daß sich der Probenträger 3 dazwischen befindet. In diesem Fall dient ein O-Ring 25, welcher auf der Dichtfläche 15 des Eingangsadapters 7 angeordnet ist, als Dichtung zwischen dem Eingangsadapter 7 und dem Ausgangsadapter 9.
In dieser Betriebsweise, d.h. ohne Probenträger 3, werden der Hohlraum 19, die Zuleitung 5 und die Ausgangsleitung 1 1 ausgewaschen und so z.B. auf einen neuen Analysedurchlauf vorbereitet. Dies wird im folgenden zunächst beschrieben.
Die Ausgangsleitung 1 1 führt im dargestellten Ausführungsbeispiel zu einem 10- Port- Ventil 27, bei dem in einer Stellung A die in Fig. 1 mit 29 bezeichneten Ver- bindungen aktiv sind, während in einer Stellung B die in Fig. 1 mit 31 bezeichneten Verbindungen aktiv sind.
Wenn der Eingangsadapter 7 und der Ausgangsadapter 9 über ihre entsprechenden Dichtflächen 15 und 17 zusammengepreßt werden, entsteht eine (druck-) dichte Verbindung zwischen dem Eingangsadapter 7 und dem Ausgangsadapter 9, ganz unabhängig davon, ob sich die„dried blood spof'-Probe auf dem Probenträger 3 dazwischen befindet oder nicht.
Sind bei dem genannten 10-Port- Ventil 27 die Verbindungen 31 aktiv, was der Stellung B entspricht, und zusätzlich der Eingangsadapter 7 und der Ausgangsadapter 9 zusammengepreßt, wird eine Waschlösung 33 mittels einer dafür vorge- sehenen Waschpumpe 35 in die Ausgangsleitung 1 1, die Zuleitung 5 und die Innenbereiche des Eingangsadapters 7 und des Ausgangsadapters 9, insbesondere die zentralen, zentrischen Hohlräume 19 und 21 gespült.
An das 10-Port- Ventil 27 ist ebenso eine Schlaufe 37 für einen internen Standard (ISTD) angeschlossen, die nun mit einer in Fig. 1 ebenso dargestellten Ladesprit- ze 39 und über eine ISTD-Zuleitung 41 mit dem ISTD gefüllt wird. Eine Über- laufleitung 43 sorgt dafür, daß ein Überlauf in einen dafür vorgesehenen Abfallbehälter 45 fließen kann.
Befindet sich die zu untersuchende„dried blood spof'-Probe auf dem Probenträ- ger 3 zwischen dem Eingangsadapter 7 und der Ausgangsadapter 9, wird die Stellung A gewählt, in der die Verbindungen 29 aktiv sind. Es wird dann mittels eines Lade-Laufmittels 47 und einer dafür vorgesehenen Ladepumpe 49 der ISTD aus der Schlaufe 37 durch die flexible Zuleitung 5, den Eingangsadapter 7, den Probenträger 3 mit der zu untersuchenden„dried blood spot"-Probe, den Ausgangsadapter 9, die Ausgangsleitung 1 1 durch eine weitere Verbindungsleitung 51 auf eine SPE-Säule 53 gespült.„SPE" wird dabei als übliche Kurzform für„solid phase extraction" verwendet. Dazu wird ein 6-Port-Ventil 55 passiert, in welchem die Verbindung 57 offen oder aktiv ist.
Des weiteren ist in dem System noch eine Verdünnungspumpe 59 vorgesehen, welche der Verbindungsleitung 51 zur SPE-Säule über ein T-Stück 61 zugeschaltet ist. Diese Verdünnungspumpe 59 kann aus einem Reservoir 63 ein Verdün- nungs-Laufmittel in die Verbindungsleitung 51 führen und dadurch das Lade- Laufmittel 47 verdünnen.
Wenn durch den geschilderten Vorgang ein Analyt aus der„dried blood spot"- Probe auf dem Probenträger 3 zwischen dem Eingangsadapter 7 und der Aus- gangsadapter 9 gewaschen und mit zumindest einem für diesen geeignet ausgewählten Laufmittel transportiert wird, so wird dieser Analyt mit dem ISTD auf der SPE-Säule 53 aufkonzentriert.
Dann wird das genannte 6-Port- Ventil 55 so geschaltet, daß eine mit der Bezugs- ziffer 65 bezeichnete Verbindung offen oder aktiv ist. Dies bewirkt, daß der Analyt und der ISTD mittels einer HPLC-Gradientenpumpe 67 von der SPE-Säule zu einer analytischen Säule 69 gespült werden und der Analyt dort analysiert wird. Mit den Bezugsziffern 43 und 45 sind wieder eine Überlaufleitung 43 und ein Abfallbehälter 45 bezeichnet, welche dafür sorgen, daß der Überlauf gezielt ab- fließen kann.
In Fig. 3 ist zusätzlich noch eine vollautomatische Analysenstation für diese erfindungsgemäße, direkte Analyse von„dried blood spot"-Proben dargestellt.
Dabei bezeichnet die Bezugsziffer 71 einen Roboterarm mit einer Beweglichkeit in XYZ-Richtung, der einen Greifer 73 aufweist. Mittels dieses Roboterarms 71 wird der die„dried blood spot"-Probe aufweisende Probenträger 3 aus einem Rack 75 genommen oder auch dahin zurückgestellt. Der Probenträger 3 wird dann zu einem elektronischen Lesekopf 77 geführt und zwischen dem Eingangsadapter 7 und dem Ausgangsadapter 9 der HPLC- Druckkammer positioniert. Anschließend erfolgt das Einspannen des Probenträgers 3 zwischen dem Eingangsadapter 7 und dem Ausgangsadapter 9, so daß die- ser über die flexible Zuleitung 5 und die flexible Ausgangsleitung 1 1 ausgewaschen und in der zuvor beschriebenen Weise der Analyse zugeführt werden kann.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur direkten Analyse von medizinischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und chemischen Proben mittels HPLC, bei dem die Probe, die zumindest einen Analyten aufweist, in flüssiger Form auf einen Probenträger (3) aufgetragen und getrocknet wird, so daß sich die Probe als„dried spot" auf dem Probenträger (3) befindet, zwischen zwei Adaptern (7, 9) eines Adaptersystems (1) druckdicht eingespannt wird, wobei die Adapter (7, 9) jeweils in Richtung auf die eingespannte Probe einen zentrischen Hohlraum (19, 21) aufweisen, in den bei dem einen Adapter als Eingangsadapter (7) über eine Zuleitung (5) ein Extraktionsmittel zugeführt und bei dem anderen Adapter als Ausgangsadapter (9) über eine Ausgangsleitung (11) abgeführt und dabei der eingespannte Probenträger (3) durchflössen und somit die Probe aus dem Probenträger (3) herausgewaschen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die herausgewaschene Probe in dem Ausgangsadapter (9) gefiltert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die herausgewaschene Probe vor dem Passieren einer Analysesäule (69) über eine SPE-Säule (53) geführt und dort aufkonzentriert oder direkt in ein Mas- senspektrometer geführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Eingangsadapter (7) und der Ausgangsadapter (7, 9) zusammengepreßt und über den Probenträger (3) als Dichtscheibe druckdicht verschlossen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es vollautomatisch durchgeführt wird, indem der oder die Probenträger (3) dem Adaptersystem (1) über einen Roboter zugeführt und gewechselt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe(n) mit dem Probenträger (3) optisch erfaßt und einer Bildanalyse zugeführt werden.
Verfahren zur direkten Analyse von medizinischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und chemischen Proben in Form eines„dried spot" auf einem Probenträger (3) mittels HPLC, bei dem zwei Adapter (7, 9) eines Adaptersystems (1) als Probenaufnahme über eine gedachte gemeinsame Achse (13) jeweils an einer Dichtfläche druckdicht verschlossen werden, und wobei die Adapter (7, 9) jeweils einen zentrischen Hohlraum (19, 21) aufweisen, in den bei dem einen Adapter als Eingangsadapter (7) über eine Zuleitung (5) ein Waschmittel zugeführt und bei dem anderen Adapter als Ausgangsadapter (9) über eine Ausgangsleitung (1 1) abgeführt und dabei die Hohlräume (19, 21) durchflössen werden, wobei zusätzlich vor oder nach dem Passieren des Adaptersystems (1) ein Interner Standard (ISTD) zugeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Interne Standard über eine zusätzliche Probenschleife (37) zugeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse der Proben gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 und das Waschen und Vorbereiten des HPLC-Systems gemäß den Ansprüchen 7 oder 8 nacheinander, zeitlich abwechselnd oder zeitlich überlappend erfolgt.
Vorrichtung zur direkten Analyse von medizinischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und chemischen Proben in Form eines„dried spot" auf einem Probenträger (3) mittels HPLC, mit einem Adaptersystem (1) zur Aufnahme der Probe, das einen Eingangsadapter (7) und einen Ausgangsadapter (9) aufweist, die über eine gemeinsame, gedachte Achse (13) druckdicht miteinander verschließbar sind und jeweils zentral einen Hohlraum (19, 21) aufweisen, der bei dem Eingangsadapter (7) in eine Zuleitung (5) und bei dem Ausgangsadapter (9) in eine Ausgangsleitung (1 1) mündet.
Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in dem zentralen Hohlraum (17) des Ausgangsadapters (9) ein Filter (23) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Probenträger (3) der Probe zwischen dem Eingangsadapter (7) und dem Ausgangsadapter (9)eingespannt ist und eine Dichtscheibe für das druckdichte Verschließen des Adaptersystems (1) bildet.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 1 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Dichtring (25) für das druckdichte Verschließen des Adaptersystems (1) zwischen dem Eingangsadapter (7) und dem Ausgangsadapter (9) eingespannt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Adaptersystem (1) mit einer ersten Ventilschaltung (27) verbunden ist, über die eine Verbindung zu einer Zuführung (41) eines Internen Standards (ISTD), einer Verdünnungs- und einer Waschlösung (33) gebildet ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch eine zusätzliche Probenschleife (37) für das Zuführen des Internen Standards (ISTD), die in Serie zu dem Adaptersystem (1) geschaltet ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, gekennzeichnet durch eine zweite Ventilschaltung (55), über die eine Verbindung zu einer SPE- Säule (53) zum Aufkonzentrieren des Analyten in der Probe gebildet ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Ventilschaltung (55) nach dem Aufkonzentrieren des Analyten die Weiterleitung (65) der Probe zu einer Analysesäule (69) bildet.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 17, gekennzeichnet durch eine Kopplung der HPLC mit einem Massenspektrometer als LC-MS- System.
19. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 18 oder des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die direkte quantitative oder qualitative Analyse von„dried spot"-Proben in Form von„dried blood spot"-Proben mittels HPLC oder LC-MS zur Untersuchung von Arzneimittelkonzentrationen in der Probe von Mensch oder Tier, Untersuchung oder Screening von Neugeborenen, Kindern, Jugendlichen und/oder Erwachsenen auf Stoffwechsel- und/oder Hormonerkrankungen oder sonstigen Erkran- kungen, wie Aids.
20. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 18 oder des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die direkte quantitative oder qualitative Analyse von medizinischen, pharmazeutischen, biologi- sehen, biochemischen und chemischen„dried spot"-Proben mittels HPLC oder LC-MS, wobei die Proben ausgewählt sind aus Körperflüssigkeiten von Mensch und/oder Tier, Extrakten von Leber-, Gehirn-, Gewebe- und/oder Pflanzenteilen, Proben aus chemischen Prozessen und/oder Proben aus der chemischen Prozeßanalytik.
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