WO2012010128A2 - Verfahren zur herstellung von autologen proteinen - Google Patents

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    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
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    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1

Definitions

  • the invention relates to a method for producing at least one therapeutically active protein or a protein mixture in a container, wherein the container is filled with a body fluid, incubated and the therapeutically active protein is formed in the body fluid.
  • the invention also relates to a container for carrying out the method and to medicaments which contain the proteins thus produced as active ingredient.
  • Degenerative joint diseases are of great importance in both humans and animals.
  • arthrosis occurs idiopathically (with known risk factors) in the elderly patient, or may be caused by post-traumatic conditions in younger patients as a complication.
  • both forms have the same clinical symptoms, including joint pain and impaired function, and often result in a severely compromised quality of life for the affected patient.
  • Various causes such as overloading, incorrect loading, joint instability or even infections lead to a mechanical and enzymatic damage to the articular cartilage with apoptosis of the chondrocytes, as well as loss of collagen type II and proteoglycans.
  • cartilage degeneration is central to the pathogenesis, the disease affects not only the cartilage, but also the joint capsule and the subchondral bone.
  • the breakdown products enter the synovium and lead to synovitis.
  • damage to the joint capsule can directly lead to a release of inflammatory mediators and a severely traumatized joint capsule also results in a joint instability.
  • the subchondral bone plate adapts to increased bone density.
  • this sclerosis makes the bone stiffer and more brittle. On the one hand, this leads to a decrease in the ability to absorb shock, which puts more stress on the overlying cartilage and, on the other hand, shearing forces at the subchondral bone plate junction and mineralized cartilage.
  • proinflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha
  • IL-1 interleukin 1
  • IL-6 interleukin 6
  • PGE2 prostaglandin E2
  • the proinflammatory (inflammatory) cytokines TNFa, IL-1 and IL-6 are secreted by synovial membrane synoviocytes (synovial membrane), inflammatory cells in synovial membrane and chondrocytes, and stimulate the release of matrix metalloproteinases (MMPs) and aggrecanases as well as other inflammatory mediators such as prostaglandins (PGE2) or nitrite oxide (NO).
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • PGE2 prostaglandins
  • NO nitrite oxide
  • Metalloproteases are enzymes that degrade the matrix of cartilage (type II collagen, proteoglycans, etc.). 11-1 and TNFa also directly inhibit the production of type II collagen.
  • symptomatic therapies based on non-steroidal and steroidal anti-inflammatory drugs
  • treatments with cytokine inhibitors or chondroprotective drugs called “disease-modifying drugs” (Qvist et al., 2008)
  • the body's own (autologous) proteins are obtained from the patient's blood and re-administered to this patient as an individual medication.
  • the internal structures of the syringe including particles arranged in the syringe, in particular glass beads impregnated with chromium sulfate, are coated with immobilized inducers intended to stimulate the biosynthesis of the desired proteins.
  • inducers intended to stimulate the biosynthesis of the desired proteins.
  • immunoglobulins in particular immunoglobulin G, are provided as such inducers in order to stimulate the monocytes contained in the blood to form anti-inflammatory proteins.
  • the syringe is filled with a body fluid of a patient and incubated.
  • the therapeutically active protein is formed in the body fluid.
  • the thus enriched body fluid can be stored sterile in the syringe and, if necessary, the patient directly without further treatment or, for example, after centrifugation and / or sterile filtration can be recycled.
  • a solution to this problem is to provide a method of the type mentioned, in which the container contains gold particles.
  • the term 'container' is hereafter a closable container or a closable container for storing liquids for a certain time, wherein the container or container is close to the liquid to be absorbed.
  • Gelsolin is an ubiquitous in all animal (including human) cells and also extracellular (eg in blood plasma) actin-binding protein that fragmented Ca 2+ -dependent actin filaments and prevents repolymerization, and a key role in the regulation of actin filament structure and dismantling processes.
  • Gelsolin has been discovered and identified in cytoplasmic extracts, and its ubiquitous presence and phylogenetic conservation in motile cells speaks for its essential role as an intracellular regulatory protein. Only later was it discovered that gelsolin also occurs in mammalian blood plasma and depolymerizes actin there.
  • Plasma gelsolin is an isoform of cytoplasmic gelsolin (cGelsolin, cGS) and differs structurally in that it has an additional 23 amino acids at the N-terminal end.
  • the physiological function of plasma-gelolin is still the subject of much research (DiNubriu, 2007 and literature cited therein).
  • Gelsolin regulates important cellular functions such as cell motility, phagocytosis, apoptosis and activation of platelets (Silacci et al., 2004, Trickey et al., 2004). In people with rheumatoid arthritis, the plasma concentration of gelsolin is reduced (Osborn et al., 2008).
  • the proteins produced by the method according to the invention may (but need not) be administered directly to the patient, ie without further manipulation - such as, for example, together with the other constituents of the liquid in the container. Centrifugation, sterile filtration or transfer to other containers - to be re-applied. This avoids contamination of the protein solution and minimizes the risk of patient infection when administering the proteins.
  • the gold particles are removed from the body fluid, for example the serum, and discarded.
  • the body fluid for example the serum
  • both the gold particles and body cells (for example blood cells) and other insoluble aggregates are removed from the body fluid (for example the serum) after in vitro incubation and discarded.
  • body fluid for example the serum
  • the gold particles used in the process preferably have a defined structure and / or a defined size. Micro- and / or nanoparticles with a particle size between 10 nanometers to 500 micrometers are particularly suitable.
  • gold particles with a size of about 1 ⁇ m are preferably used in the method, more preferably in one Amount of 10 3 - 10 4 gold particles per 10 ml.
  • containers for example a syringe
  • a capacity of about 10 ml have proven useful for this application.
  • the gold particles are present in the container in an amount of 0.3 mg per 1 ml of body fluid. Concentrations of 0.1 to 10 mg per 1 ml are basically suitable and intended.
  • the internal structure of the container is preferably free of anticoagulants such as heparin, citrate, EDTA or CPDA, because it has surprisingly been found in the context of the work on which this invention is based that fewer proteins are biosynthesized in the presence of such substances than in the absence.
  • anticoagulants such as heparin, citrate, EDTA or CPDA
  • a container in particular a syringe into consideration because it can not only serve as Incubationsgefäß, but at the same time as a sampling instrument for obtaining the body fluid and / or as an application instrument for the administration of the proteins to a patient is suitable.
  • a container is also a closable bag into consideration, because it can be handled and stored more flexible especially for larger volumes than a syringe with a comparable volume, and because it can be coupled technically simple and safe with a syringe, so that the filling and emptying can be done over this.
  • the process according to the invention is particularly suitable for the production (biosynthesis) and accumulation of proteins from blood cells. Therefore, blood, in particular blood, is preferably provided as body fluid.
  • the therapeutically active protein gelsolin is particularly well, i. produce and accumulate in significant amounts with the method according to the invention. Therefore, the method according to the invention is intended in particular for obtaining gelsolin,
  • a solution of the stated object is also to provide a container for in vitro biosynthesis and enrichment (in vitro induction) of therapeutically active proteins in a body fluid, which is characterized in that the container contains gold particles and for receiving, storage and Re-delivery of a body fluid sample is suitable, and that it can be coupled with a hollow needle (cannula, injection needle) such that its contents can be injected by means of this hollow needle (cannula, injection needle).
  • a hollow needle cannula, injection needle
  • the proteins produced can be brought directly to the desired application site by means of the dockable hollow needle, in particular be introduced into a human or animal body.
  • the gold particles preferably have a defined structure and or a defined size. Micro and / or nanoparticles (particle size between 10 nanometers and 500 micrometers) are particularly suitable.
  • An appropriate amount of gold particles in the container is 0.1 mg to 10 mg per 1 ml of body fluid, preferably 0.3 mg per 1 ml of body fluid.
  • the container is preferably a syringe or a bag.
  • the syringe has the advantage that it can serve not only as an incubation vessel, but at the same time as a sampling device for obtaining the body fluid and / or as an application tool for the administration of the proteins to a patient.
  • the bag has the advantage that it can be handled and stored more flexibly with larger volumes than a syringe of comparable volume and can be coupled with a syringe for filling and emptying.
  • the gold particles e.g., Gold Microcarriers from BioRad Laboratories, Cat 165-2264.
  • the syringe in particular the inner wall of the syringe barrel and the syringe barrel located in the cylinder, is preferably made of a plastic, for example polystyrene, polyethylene, polyvinyl chloride, polypropylene (neutral S-Monovetten, Sarstedt) or a similar substance or mixtures thereof.
  • a plastic for example polystyrene, polyethylene, polyvinyl chloride, polypropylene (neutral S-Monovetten, Sarstedt) or a similar substance or mixtures thereof.
  • the container is particularly well suited for the production (biosynthesis) and enrichment of proteins, in particular of gelsolin, from blood cells. Therefore, blood, in particular blood, is preferably provided as body fluid.
  • the proteins produced by the method according to the invention in a body fluid can be used together with the body fluid and the gold particles or without the gold particles as a medicament for the treatment of diseases.
  • the protein-enriched and, in particular, cytokinin-enriched and gelsolin-enriched bodily fluids, in particular blood serums, produced by the methods according to the invention are a safe, cost-effective and rapidly produced and particularly low-side-effect alternative to comparable conventional medicament preparations.
  • the present invention therefore also relates to "a protein-enriched body fluid, in particular a cytokine- and gelsolin-enriched blood serum, for use as a medicament or for the production of a medicament, obtainable in that the bodily fluid, in particular blood serum, is taken up in a container containing gold particles, preferably gold particles with the size of about 1 ⁇ and preferably in an amount of 10 3 - 10 4 gold particles per 10 ml container (or 0.3 mg of gold particles with a diameter 1 ⁇ per 1 ml blood / container) that this mixture of body fluid, in particular Blood serum, and gold particles is incubated (for example over 12-72 hours, preferably over 24 hours and at 20 ° C to 41 ° C, preferably at 37 ° C), and then the gold particles and preferably (ie optional) also blood cells and others insoluble constituents from the body fluid, in particular the serum, removed and discarded (preferably by centrifugation and / or sterile filtration).
  • a protein-enriched body fluid in particular a cytokin
  • the invention also relates to the use of autologous or homologous blood and gold particles in combination as medicaments or for the preparation of a medicament.
  • subject of the present invention is also a mixture of autologous or homologous blood and gold particles for use as drugs, or a drug comprising the mixture autologous or homologous blood and gold particles including the proteins enriched therein as a combination of active ingredients.
  • the medicaments according to the invention enable a particularly simple, inexpensive, low-risk, and effective treatment.
  • the medicaments described are particularly suitable for the treatment of degenerative tissue diseases, especially of arthroses and tendinoses.
  • the drug-incubated and subsequently particle-depleted drug is well-suited and contemplated for the treatment of osteoarthritis and other diseases associated with tissue degeneration and / or associated with gelsolin deficiency.
  • a particular embodiment of the medicaments according to the invention is characterized in that the body fluid (in particular blood) incubated with gold particles after incubation has a content of gelsolin which is at least twice the corresponding standard blood level for gelsolin.
  • the term "corresponding blood standard for gelsolin” in the present context stands for the human medical or veterinary standard value for gelsolin in the blood of the group of patients to be treated with the drug.
  • the patient group is characterized by its zoological species and race, sex and age.
  • This Gelsolin-rich medicine is intended primarily for the treatment of diseases associated with a lack of gelsolin in the blood of the patient, for example sepsis or stroke.
  • the incubated blood-gold mixture can be administered in whole or in part. If necessary, it may be subjected to centrifugation and / or sterile filtration prior to administration to the (animal or human) patient, e.g. To remove cells and cell fragments from the blood and at the same time to reduce the injection volume.
  • FIG. 1 shows an MID-FTIR spectroscopic analysis of the protein profile in blood sera of different patients before (TO) and after (T24) carrying out the method according to the invention in comparison to controls.
  • BLUE represents the protein profile for the time TO
  • GREEN shows the protein profile of the samples treated by the method according to the invention at time T24
  • ROT shows the protein profile of the control sera at time T24.
  • Figure 2 shows; the results of a multiplex analysis of the proteins:
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • G-CSF granulocyte-colony stimulating factor
  • SCGF-ß hematopoietic stellate cell growth factor
  • IL-18 interleukin-18
  • MCP-3 macrophage chemotactic protein
  • GROa growth-regulated oncogene alpha
  • FIG. 3 shows: the graphic documentation of the degree of swelling of all examined horses before and after the treatment according to the invention at the respective follow-up points.
  • FIG. 4 shows the graphic documentation of the lameness of all examined horses before and after the treatment according to the invention at the respective follow-up times
  • FIG. 5 shows: KOOS score before and after treatment in patients with gonarthrosis
  • FIG. 6 shows: formation of effusion and concentration of gelsolin in the synovial fluid in a patient with gonarthrosis in the course of time: after the 1st (T1), 2nd (T2) and 3rd injection (T3)
  • FIG. 7 shows the proteoglycan release of explants / normal bones Preparations after shock treatment.
  • Example 1 Verification of Protein Production in a Blood Pepp by the Invention According to the Invention and in a Invention
  • the measuring principle of Fourier transform infrared spectroscopy is based on the irradiation of a substance with electromagnetic waves, whereby certain frequency ranges are absorbed. Since infrared radiation is energetically in the range of vibrational levels of molecular bonds, absorption leads to vibrational excitation of the bonds. This is visible in the form of deflections in the measured spectrum (diagram). Since the energies or frequencies necessary for this are characteristic of the respective bonds, materials can also be identified and structures can be elucidated.
  • the FTIR spectroscopy is particularly suitable for the analysis of structural, reaction-induced changes in a biological macromolecule. It can be used to study biological systems, in particular protein-containing aqueous liquids. The sample is neither altered nor destroyed and it can be used under native conditions of the biomolecule,. i.e. It is possible to measure the "actual state" because neither a fixation nor a different preparation of the samples is necessary.
  • the MID-FTIR spectroscopy method allows automated and reproducible detection and quantification of changes in protein conformation and determination of protein concentration. Already very low protein concentrations (below 0.1 mg / ml) and lowest conformational changes can be detected.
  • the blood samples were analyzed with and without gold particles in the "as is" state in a highly accurate biocompatible and suitable for aqueous samples spectroscopic measuring cell (transmission cell).
  • concentration of the dissolved protein and its secondary structure (alpha-helix, beta-sheet) were automatically determined from each measured sample.
  • the results of this measurement are shown graphically in FIG. They show that the samples incubated according to the invention in the presence of gold particles behave biologically differently than the control samples.
  • the measured values of all samples at the time TO are marked blue and are predominantly in the upper left quadrant.
  • the measured values after carrying out the method according to the invention with an incubation period of 24 hours are marked in green color and are predominantly in or near the left lower quadrant.
  • GS Gelsolin
  • IL-4 interleukin-4
  • IL-10 interleukin-10
  • IL-13 interleukin-13
  • IL-1 receptor antagonist interleukin-1 receptor antagonist
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • TNF-a Tumor Necrosis Factor alpha
  • G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor
  • GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
  • IFN-g Interferon Gamma
  • SCGF-ß Macrophage inflammatory proteinase
  • MIP-la macrophage inflammatory protein-lss
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IL-18 interleukin-18
  • MCP-3 macrophage chemotactic protein
  • SDF-a stromal derived factor
  • FGF growth-regulated oncogenic alpha
  • a container according to the invention in the form of a syringe containing gold particles was filled with blood of the relevant animal and incubated for 24 hours at a temperature in the region of 37.degree. After the incubation period, the drug in the form of the blood in the syringe with the synthesized and enriched in the meantime proteins, especially cytokines and gelsolin, and the gold particles was completed and could be used directly and immediately.
  • the drug was manufactured in a syringe, it could be given by injection to the animal in question without being overfilled and thus without the risks of contamination and material loss.
  • the drug injections were given to the respective horse one week apart.
  • the first administration was at time T24, the second, third and fourth after week 1, after week 2 and after week 3.
  • the drug-containing syringes for the second, third and fourth applications were stored at minus 20 ° C until use ,
  • the gold particles were resuspended in sterile PBS and adjusted to the desired concentration, eg, 60 mg / ml.
  • the gold particle solution was removed with a pipette ⁇ and transferred to an S-Monovette neutral / 9 ml (92 ⁇ 16 mm) from Sarstedt (REF 02.1726.001).
  • the monovette was first opened in a sterile workbench (screw cap), the ⁇ gold particle solution applied to the inner syringe wall and then again locked.
  • the filled Monovettes superimposed their use at room temperature until "to. 9 ml of body fluid are designed for use in carrying out the method of the invention (eg, blood) were grown and mixed with the gold particle solution / PBS in the thus prepared Monovettes.
  • the intra-articular gelsolin concentration could be significantly increased (see Fig.6), At the same time there was a reduction in the amount of effusion (see. 6) and subsequently to a marked improvement in the clinical symptoms,
  • cartilage-bone samples were taken from the respective femoral heads under aseptic conditions of the animals in question and cut to 8 ⁇ 8 ⁇ 10 mm (length / width height) blocks.
  • the cartilage was macroscopically intact in all explants.
  • HS human serum
  • 100 U / ml pencillin 100 ⁇ g / liter gentamycin
  • 1.25 U / ml amphotericin B stored.
  • the impact load test (impaction test) was carried out on the day of the sampling.
  • the butt piston had the shape of a cylinder measuring 5 cm high and 3.94 cm in diameter and weighing 493 g.
  • the butt piston was threadedly connected to the actual impact disk ("impactor piece"), which had a weight of 7 g, a height / thickness of 1 cm and a diameter of 0.6 cm.
  • the shock loading / impacting took place once per cartilage-bone sample block in the "drop tower" by the free fall of the impact piston with impact disk from 1 cm height below the sample.
  • the impact load was 0.736 J on a cartilage surface of 28.3 mm 2 .
  • the cartilage-bone sample blocks / explants were divided into 3 groups:
  • the treated bone-cartilage preparations and also the O controls were washed 3 times with PBS and in 12-well culture plates überschreibt.
  • Each explant was prepared with 3 ml of the respective treatment medium and incubated under standardized conditions (37 ° C, 5% CO2,) in the incubator. The culture medium was changed every 72 hours.
  • the protein-rich blood serum prepared according to the invention was added to the explant of the relevant explant group on day 0 and day 7.
  • the proteoglycan content in the culture medium was measured in all assays.
  • the Blyscan glycosaminoglycan assay from Biocolor Ltd. (Carrickfergus, UK) was used for this purpose. The results are shown in the graph of FIG. 7.
  • the proteoglycan content is given as mean glycosaminoglycan (GAG) concentration in g / ml medium.
  • proteoglycan release shows that in all three groups, namely the O-controls and the two shock-treated / impacted explant / cartilage-bone preparations, the amount of proteogycan increases with time.

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Abstract

Bei dem Verfahren zur Herstellung mindestens eines therapeutisch wirksamen Proteins oder eines Proteingemisches in einem Behältnis wird das Behältnis mit einer Körperflüssigkeit und Goldpartikeln gefüllt und inkubiert und dabei das therapeutisch wirksame Protein in der Körperflüssigkeit gebildet.

Description

Verfahren zur Herstellung von autologen Proteinen
Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines therapeutisch wirksamen Proteins oder eines Proteingemisches in einem Behältnis, wobei das Behältnis mit einer Körperflüssigkeit gefüllt, inkubiert und das therapeutisch wirksame Protein in der Körperflüssigkeit gebildet wird. Die Erfindung betrifft außerdem ein Behältnis für die Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel, die die derart hergestellten Proteine als Wirkstoff enthalten.
Degenerative Gelenkerkrankungen haben sowohl beim Menschen als auch bei Tieren eine große Bedeutung. Beim Menschen tritt die Arthrose idiopathisch (mit bekannten Risikofaktoren) beim älteren Patienten auf, oder kann bei jüngeren Patienten als Komplikation posttraumatisch bedingt entstehen. Beide Formen haben aber die gleichen klinischen Symptome, u.a. Gelenkschmerzen und eingeschränkte Funktion, und führen häufig zu einer stark eingeschränkten Lebensqualität des betroffenen Patienten. Verschiedene Ursachen wie Überbelastung, Fehlbelastung, Gelenkinstabilität oder auch Infektionen führen zu einer mechanischen und enzymatischen Schädigung des Gelenkknorpels mit Apoptose der Chondrozyten, sowie Verlust an Kollagen Typ II und Proteoglykanen. Dabei besteht eine Imbalance zwischen Degeneration und Reparation. Obwohl im Mittelpunkt der Pathogenese die Knorpeldegeneration steht, betrifft die Krankheit nicht nur den Knorpel, sondern auch die Gelenkskapsel und den subchondralen Knochen. Bei Knorpelschäden gelangen die Abbauprodukte in die Synovia und führen zu einer Synovitis. Zudem können auch Schäden an der Gelenkskapsel direkt zu einer Freisetzung von Entzündungsmediatoren führen und eine stark traumatisierte Gelenkskapsel resultiert zudem in einer Gelenksinstabilität. Bei hoher und zyklischer Belastung adaptiert sich die subchondrale Knochenplatte mit einer erhöhten Knochendichte. Durch diese Sklerosierung wird aber der Knochen steifer und spröder. Dies führt einerseits zu einer Abnahme der Fähigkeit zur Schockabsorption, was den darüber liegenden Knorpel mehr belastet, und andererseits zu Scherkräften am Übergang subchondrale Knochenplatte und mineralisiertem Knorpel. Bei Pferden mit Arthrose und/oder Osteoarthritis und/oder anderen Gelenkserkrankungen wurden erhöhte Konzentrationen der proinflammatorischen (entzündungsfördernden) Zytokine Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFa), Interleukin 1 (IL-1) und Interleukin 6 (IL-6) sowie an Prostaglandin E2 (PGE2) und Metalloproteasen in der Synovia gemessen. Auch bei Menschen mit Arthrose ist die Konzentration der proinflammatorischen Zytokine im Blut und in der Synovia erhöht.
Die proinflammatorischen (entzündungsfördernden) Zytokine TNFa, IL-1 und IL-6 werden von den B-Synoviozyten (Synoviocyti secretorii) der Synovialmembran, von Entzündungszellen in der Synovialmembra und von Chondrozyten sezerniert und stimulieren die Freisetzung von Matrixmetalloproteasen (MMP's) und Aggrecanasen sowie von weiteren Entzündungsmediatoren wie Prostaglandinen (PGE2) oder Nitritoxid (NO). Metalloproteasen sind Enzyme, welche die Matrix des Knorpel (Kollagen Typ II, Proteoglykane u.a.) degradieren. 11-1 und TNFa hemmen auch direkt die Produktion von Typ II Kollagen.
Die herkömmliche Therapie der degenerativen Gelenkerkrankungen besteht in den meisten Fällen in einer symptomatischen Behandlung der Entzündung, d.h. in einer entweder systemischen oder intraartikulären Hemmung der Entzündung mittels entsprechender Medikamente. Hierzu gehören die am häufigsten eingesetzten intraartikulär applizierten Kortikosteroiden, teilweise in Kombination mit Hyaluronsäure. Zusätzlich werden gelegentlich außerdem Chondroprotektiva verabreicht.
Diese medikamentösen Therapien haben jedoch zahlreiche Nebenwirkungen.
Eine Alternative zu den symptomatischen Therapien (auf der Basis nicht steroidaler und steroidaler Entzündungshemmer) bilden die Behandlungen mit Zytokin-Inhibitoren oder Chondroprotektiva, die als„disease modifying drugs" bezeichnet werden (Qvist et al. 2008). Hierzu zählen auch Therapien, bei denen körpereigene (autologe) Proteine aus dem Blut des Patienten gewonnen und als individuelles Medikament diesem Patienten wieder verabreicht werden.
Aus der WO 9909051 ist ein Verfahren bekannt zur Herstellung von therapeutisch wirksamen, autologen (= körpereigenen) Proteinen in einer zuvor vom (tierischen oder menschlichen) Patienten gewonnenen Körperflüssigkeitsprobe und eine Spritze zur Durchfuhrung dieses Verfahrens. Als derart herstellbare Proteine sind Erythropoietin, Insulin, Interferone, Interleukin 4, Interleukin 10, löslicher Tumor-Nekrose-Faktor- ezeptor und der Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist genannt. Die Proteine werden in einer Spritze hergestellt und bereitgestellt.
Die inneren Strukturen der Spritze, wozu auch in der Spritze angeordnete Partikel, insbesondere mit Chromsulfat imprägnierten Glaskügelchen, zählen, sind mit immobilisierten Induktoren beschichtet, die die Biosynthese der gewünschten Proteine anregen sollen. Im Fall von Blut als Körperflüssigkeitsprobe sind als solche Induktoren Immunglobuline, insbesondere Immunglobulin G vorgesehen, um die im Blut enthaltenen Monocyten zur Bildung anti-inflammatorischer Proteine anzuregen.
Für die Durchführung des Verfahrens wird die Spritze mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten gefüllt und inkubiert. Dabei wird das therapeutisch wirksame Protein in der Körperflüssigkeit gebildet.
Die so angereicherte Körperflüssigkeit kann in der Spritze steril gelagert und bei Bedarf dem Patienten direkt ohne weitere Behandlung oder beispielsweise nach Zentrifugation und/oder Sterilfiltration wieder zugeführt werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein solches Verfahren derart weiterzuentwickeln bzw. abzuwandeln, dass die erzeugten Proteine in signifikant höheren Mengen vorliegen, und dass unerwünschte Begleiterscheinungen vermieden sind.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens der eingangs genannten Art, bei dem das Behältnis Goldpartikel enthält. Der Begriff 'Behältnis' steht im Folgenden für ein verschließbares Gefäß oder einen verschließbaren Behälter zur Aufbewahrung von Flüssigkeiten für eine bestimmte Zeit, wobei Gefäß bzw. Behälter dicht gegenüber der aufzunehmenden Flüssigkeit ist.
Der Einsatz von Gold als Arzneimittel ist in der Medizin schon lange bekannt. Ende des 19. Jahrhunderts wurde Gold vor allem als Arzneimittel zur Behandlung von Tuberkulose eingesetzt. Aufgrund der falschen Annahme, dass die rheumatoide Arthritis ebenfalls eine Infektionserkrankung sei, wendete man Gold als Arzneimittel auch bei diesem Leiden an. Die Therapie war erfolgreich und wurde dann über viele Jahre bis in die heutige Zeit angewendet (Kean and Kean 2008). Eine in vitro Studie an humanen Chondrozyten hat gezeigt, dass Goldverbindungen (Aurothiomalat) die Produktion von Nitrit Oxid (NO) der Chondrozyten hemmt. Nitrit Oxid vermittelt (mediiert) die destruktiven Effekte der proinflammatorischen Zytokine IL-1 und TNFa (Green et al. 2006). Dies führt zu einer verminderten Kollagen- und Proteoglykanproduktion, zur Chondrozytenapoptose und zu einer Stimulation der Metalloproteasen (Vuolteenaho et al. 2005).
In den im Stand der Technik bekannten therapeutischen Ansätzen wird das Gold entweder intramuskulär oder per os appliziert. Mit diesen Applikationsmethoden und der entsprechenden Galenik von Gold werden die aus den in vitro-Studien bekannten gewünschten Effekte jedoch nur ansatzweise erreicht.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals eingesetzte Kombination von Goldpartikeln mit einer menschlichen oder tierischen auto logen oder homologen Körperfiüssigkeit, insbesondere einer Eigenblutprobe, in einem abgeschlossenen System liefert überraschenderweise nicht nur (i) eine im Vergleich zu dem vorbekannten Verfahren deutlich höhere Konzentration der gewünschten Proteine, im Fall von Blut insbesondere der Zytokine (vor allem IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, G-CSF, MCP-1, MIP-1, RANTES, TNF-alpha, GRO-alpha, MCP-3, MIF und IL-1 RA), sondern (ii) auch eine bessere Qualität der betreffenden Proteine aufgrund einer Hemmung der physiologische Proteinalterung während der Inkubationszeit und (iü) außerdem eine signifikante Anreicherung des Proteins Gelsolin. Gelsolin ist ein ubiquitär in allen tierischen (inklusive menschlichen) Zellen und auch extrazellulär (z.B. im Blutplasma) vorhandenes Aktin- bindendes Protein, das Ca2+-abhängig Aktinfilamente fragmentiert und eine Repolymerisation verhindert, und das eine Schlüsselfunktion bei der Regulation der Aktinfilament-Aufbau und -Abbauprozesse hat/erfüllt. Gelsolin wurde in zytoplasmatischen Extrakten entdeckt und identifiziert, und seine ubiquitäre Präsenz und phylogenetische Konservierung in freibeweglichen Zellen spricht für seine essentielle Rolle als ein intrazelluläres regulatorisches Protein. Erst später wurde entdeckt, dass Gelsolin auch im Blutplasma von Säugern vorkommt und dort Aktin depolymerisiert. Dieses sogenannte Plasmagelsolin (pGelsolin, pGS) ist eine Isoform des zytoplasmatischen Gelsolins (cGelsolin, cGS) und unterscheidet sich von diesem strukturell dadurch, dass es am N-terminalen Ende zusätzliche 23 Aminosäuren aufweist. Die physiologische Funktion von Plasmagelsolin ist nach wie vor Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten (DiNubriu, 2007 und darin zitierte Literatur). Gelsolin reguliert so wichtige Zellfunktionen wie Zellmotilität, Phagozytose, Apoptose und Aktivierung von Thrombozyten (Silacci et al. 2004, Trickey et al. 2004). Bei Menschen mit rheumatoider Arthritis ist die Plasmakonzentration von Gelsolin vermindert (Osborn et al. 2008). Auch bei anderen Erkrankungen mit Gewebedegenerationen und insbesondere bei Sepsis ist die Plasmakonzentration von Gelsolin vermindert (Suhler et al. 1997, Osborn et al. 2008, Lee et al. 2007). Im Stand der Technik vorhandene Erkenntnisse weisen darauf hin, dass Plasmagelsolin als Puffer dient, um überschießende Entzündungsreaktionen des Körpers abzufangen (DiNubile 2008).
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteine, insbesondere Gelsolin und Zytokine, können (müssen jedoch nicht) zusammen mit den anderen Bestandteilen der in dem Behältnis befindlichen Flüssigkeit dem Patienten direkt, das heißt ohne weitere Manipulation - wie z.B. Zentrifugation, Sterilfiltration oder Umfüllen in andere Behälter - wieder appliziert werden. Dadurch wird eine Kontamination der Protein-Lösung vermieden und das Risiko einer Infektion des Patienten bei der Verabreichung der Proteine wird minimiert.
Bei einer erfindungsgemäßen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Goldpartikel nach der in vitro Inkubation aus der Körperflüssigkeit, beispielsweise dem Serum entfernt und verworfen. Das hat den Vorteil, dass goldinduzierte Nebenwirkungen bei oder nach der Verabreichung dieser Körperflüssigkeit, beispielsweise dieses Serums, komplett vermieden werden.
Bei einer ebenfalls bevorzugten erfindungsgemäßen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden sowohl die Goldpartikel als auch Körperzellen (beispielsweise Blutzellen) und andere unlöslichen Aggregate nach der in-vitro Inkubation aus der Körperflüssigkeit (beispielsweise dem Serum) entfernt und verworfen. Derartig aufbereitete autologe humane Körperflüssigkeiten und insbesondere Seren sind hervorragend verträglich, und Nebenwirkungen sind nicht zu erwarten. Die in dem Verfahren eingesetzten Goldpartikel weisen vorzugsweise eine definierte Struktur und/oder eine definierte Größe auf. Mikro- und/oder Nanopartikel mit einer Partikelgröße zwischen 10 Nanometern bis 500 Mikrometern sind besonders geeignet.
Bei den Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei denen die Goldpartikel nach der in vitro Inkubation aus der Körperflüssigkeit, beispielsweise dem Serum, zu entfernen und zu verwerfen sind, werden in dem Verfahren vorzugsweise Goldpartikel mit der Größe von etwa 1 μπι eingesetzt, weiter vorzugsweise in einer Menge von 103— 104 Goldpartikel pro 10 ml. Für diese Anwendung habe sich in der Praxis Behältnisse (z.B. eine Spritze) bewährt, deren Fassungsvolumen etwa 10 ml beträgt.
In einer Ausfuhrungsform, die sich in der praktischen Anwendung gut bewährt hat, liegen die Goldpartikel in dem Behältnis in einer Menge von 0,3 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit vor. Konzentrationen von 0,1 bis 10 mg pro 1 ml sind grundsätzlich geeignet und vorgesehen.
Die innere Struktur des Behältnisses ist vorzugsweise frei von Antikoagulantien wie Heparin, Citrat, EDTA oder CPDA, denn im Rahmen der dieser Erfindung zugrunde liegenden Arbeiten wurde überraschenderweise gefunden, dass bei Anwesenheit solcher Substanzen weniger Proteine biosynthetisiert werden als bei Abwesenheit. Insbesondere im Fall von Blut als Körperflüssigkeit und Heparin als Antikoagulanz wurde bei Anwesenheit von Heparin, z.B. als Beschichtung der Behältnisinnenwand, eine erheblich geringere Zytokinproduktion erhalten als bei Abwesenheit von Heparin und anderen Antikoagulantien.
Als Behältnis kommt insbesondere eine Spritze in Betracht, weil diese nicht nur als Inkubationsgefäß dienen kann, sondern gleichzeitig auch als Entnahmeinstrument für die Gewinnung der Körperflüssigkeit und/oder als Applikationsinstrument für die Verabreichung der Proteine an einen Patienten geeignet ist. Als Behältnis kommt aber auch ein verschließbarer Beutel in Betracht, weil dieser insbesondere bei größeren Volumina flexibler gehandhabt und gelagert werden kann als eine Spritze mit vergleichbarem Volumen, und weil er technisch einfach und sicher mit einer Spritze gekoppelt werden kann, so dass das Befüllen und Entleeren über diese erfolgen kann.
Das erfindungsgemäß Verfahren eignet sich ganz besonders für die Herstellung (Biosynthese) und Anreicherung von Proteinen aus Blutzellen. Deshalb ist als Körperflüssigkeit insbesondere Blut, vorzugsweise Blutserum, vorgesehen.
Überraschenderweise lässt sich das therapeutisch wirksame Protein Gelsolin besonders gut, d.h. in signifikanten Mengen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellen und anreichern. Deshalb ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Gewinnung von Gelsolin vorgesehen,
Hinsichtlich der Inkubationsbedingungen für das mit Körperflüssigkeit befüllte Behältnis hat sich in der Praxis gezeigt, dass ein Inkubationszeit von 12 bis 72 Stunden, bevorzugt 24 Stunden, bei einer Temperatur von 20°C bis 41 °C, vorzugsweise 37°, zu guten Ergebnissen fuhrt.
Eine Lösung der genannten Aufgabe besteht auch in der Bereitstellung eines Behältnisses für die in-vitro Biosynthese und Anreicherung (In-vitro Induktion) von therapeutisch wirksamen Proteinen in einer Körperflüssigkeit, das sich dadurch auszeichnet, dass das Behältnis Goldpartikel enthält und zur Aufnahme, Lagerung und Wiederabgabe einer Körperflüssigkeitsprobe geeignet ist, und dass es mit einer Hohlnadel (Kanüle, Injektionsnadel) derart koppelbar ist, dass sein Inhalt vermittels dieser Hohlnadel (Kanüle, Injektionsnadel) injiziert werden kann.
Mit diesem Behältnis lassen sich insbesondere das zuvor beschriebene Protein- Herstellungsverfahren durchführen und die mit diesem einhergehenden Vorteile nutzen. Die hergestellten Proteine können mittels der ankoppelbaren Hohlnadel direkt an den gewünschten Applikationsort gebracht werden, insbesondere in einen menschlichen oder tierischen Körper eingebracht werden. Die Goldpartikel weisen vorzugsweise eine definierte Struktur und oder eine definierte Größe auf. Mikro- und/oder Nanopartikel (Partikelgröße zwischen 10 Nanometern und 500 Mikrometern) sind besonders geeignet. Eine geeignete Menge Goldpartikel in dem Behältnis beträgt 0,1 mg bis 10 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit, vorzugsweise 0,3 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit.
Bei dem Behältnis handelt es sich vorzugsweise um eine Spritze oder um einen Beutel. Die Spritze hat den Vorteil, dass sie nicht nur als Inkubationsgefäß dienen kann, sondern gleichzeitig auch als Entnahmeinstrument für die Gewinnung der Körperflüssigkeit und/oder als Applikationsinstrument für die Verabreichung der Proteine an einen Patienten. Der Beutel hat den Vorteil, dass er bei größeren Volumina flexibler gehandhabt und gelagert werden kann als eine Spritze mit vergleichbarem Volumen und für das Befüllen und Entleeren mit einer Spritze gekoppelt werden kann.
Als Behältnis eignet sich besonders gut eine handelsübliche Spritze (beispielsweise 5 bis 100 ml Spritzen) ohne besondere Ausgestaltung in ihrem inneren Hohlraum. In den Spritzenzylinder werden die Goldpartikel (z.B. Gold Microcarriers von BioRad Laboratories, Cat. 165-2264) eingebracht,
Die Spritze, insbesondere die Innenwand des Spritzenzylinders und der in dem Zylinder liegenden Teil des Spritzenkolbens besteht vorzugsweise aus einem Kunststoff, beispielsweise aus Polystyrol, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polypropylen (neutrale S-Monovetten, Sarstedt) oder einem ähnlichen Stoff oder Gemischen davon.
Das Behältnis eignet sich besonders gut für die Herstellung (Biosynthese) und Anreicherung von Proteinen, insbesondere von Gelsolin, aus Blutzellen. Deshalb ist als Körperflüssigkeit insbesondere Blut, vorzugsweise Blutserum, vorgesehen. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Körper flüssigkeit hergestellten Proteine können zusammen mit der Körperflüssigkeit und den Goldpartikeln oder ohne die Goldpartikel als Arzneimittel zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden. Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten proteinangereicherten und insbesondere zytokinin- und gelsolinangereicherten Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutseren, stellen eine sichere, kostengünstig und schnell herzustellende und besonders nebenwirkungsarme Alternative zu vergleichbaren konventionellen Arzneimittelpräparaten dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb auch " eine proteinangereicherte Körperflüssigkeit, insbesondere ein zytokinin- und gelsolinangereichertes Blutserum, zur Verwendung als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, erhältlich dadurch, dass die Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, in ein Behältnis aufgenommen wird, welches Goldpartikel enthält, vorzugsweise Goldpartikel mit der Größe von etwa 1 μιη und vorzugsweise in einer Menge von 103 - 104 Goldpartikel pro 10 ml Behältnis (oder 0.3 mg Goldpartikel mit einem Durchmesser 1 μηι pro 1 ml Blut/Behältnis), dass diese Mischung aus Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, und Goldpartikeln inkubiert wird (beispielsweise über 12-72 Stunden, vorzugsweise über 24 Stunden und bei 20°C bis 41°C, vorzugsweise bei 37°C), und dass anschließend die Goldpartikel und vorzugsweise (d.h. optional) zudem Blutzellen und andere unlösliche Bestandteile aus der Körperflüssigkeit, insbesondere dem Serum, entfernt und verworfen werden (vorzugsweise durch Zentrifiigation und/oder Sterilfiltration).
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von autologem oder homologem Blut und Goldpartikeln in Kombination als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels. Mit anderen Worten: Gegenstand vorliegender Erfindung ist auch eine Stoffmischung aus autologem oder homologem Blut und Goldpartikeln zur Verwendung als Arzneimittel, bzw. ein Arzneimittel umfassend die Stoffmischung autologes oder homologes Blut und Goldpartikeln inklusive der darin angereicherten Proteine als Wirkstoffkombination. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel ermöglichen eine besonders einfache, kostengünstige, risikoarme, und effektive Behandlung. Die beschriebenen Arzneimittel eignen sich insbesondere für die Behandlung von degenerativen Gewebeerkrankungen, vor allem von Arthrosen und Tendinosen. Vor allem das mit Goldpartikeln inkubierte und anschließend von Partikeln befreite Arzneimittel ist für die Behandlung von Arthrose und anderen Krankheiten, die mit Gewebedegenerationen assoziiert sind, und/oder die mit einem Gelsolinmangel assoziiert sind, gut geeignet und dafür vorgesehen.
Eine besondere Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Arzneimittel zeichnet sich dadurch aus, dass die mit Goldpartikeln inkubierte Körperflüssigkeit (insbesondere Blut) nach der Inkubation einen Gehalt an Gelsolin aufweist, der wenigstens das Doppelte des entsprechenden Blutnormwerts für Gelsolin beträgt. Der Begriff "entsprechender Blutnormwert für Gelsolin" steht im vorliegenden Kontext für den humanmedizinischen oder tiermedizinischen Norm wert für Gelsolin im Blut derjenigen Patientengruppe, die mit dem Arzneimittel behandelt werden soll. Die Patientengruppe ist dabei charakterisiert durch ihre zoologische Art- und Rassenzugehörigkeit, Geschlecht und Alter.
Dieses Gelsolin-reiche Arzneimittel ist vor allem für die Behandlung von Krankheiten vorgesehen, die mit einem Gelsolinmangel im Blut des Patienten einhergehen, beispielsweise Sepsis oder Schlaganfall. Das inkubierte Blut-Gold-Gemisch kann als Ganzes oder in Teilen appliziert werden. Bei Bedarf kann es vor der Verabreichung an den (tierischen oder menschlichen) Patienten noch einer Zentrifugation und/oder Sterilfiltration unterworfen werden, um z.B. Zellen und Zellfragmente aus dem Blut zu entfernen und damit gleichzeitig auch das Injektionsvolumen zu verringern.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und dazugehörigen Figuren näher erläutert: Figur 1 zeigt: eine MID-FTIR- Spektroskopie- Analyse des Proteinprofils in Blutseren verschiedener Patienten vor (TO) und nach (T24) Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu Kontrollen. BLAU repräsentiert das Proteinprofil für den Zeitpunkt TO, GRÜN zeigt das Proteinprofil der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Proben zum Zeitpunkt T24, ROT zeigt das Proteinprofil der Kontrollseren zum Zeitpunkt T24.
Figur 2 zeigt; die Ergebnisse einer Multiplex- Analyse der Proteine:
GS = Gelsolin
IL-4 - Interleukin-4
IL- 10 - Interleukin-10
IL- 13 - Interleukin-13
IL-lRa - Interleukin-1 Rezeptorantagonist
IL- lß = Interleukin-lß
TNF-a Tumornekrosefaktor alpha
G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating factor
GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating factor
IFN-g Interferon Gamma
SCGF-ß = Hematopoietic Stern cell growth factor
MIP-la Macrophage inflammatory protein- la
MIP-lß Macrophage inflammatory protein- lß
VEGF Vascular endothelial growth factor
IL- 18 = Interleukin-18
MCP-3 = Macrophage chemotactic protein
SDF-a Stromal derived factor
basic FGF = Fibroblast growth factor
GROa = Growth-regulated oncogene alpha
in Blutproben zum Zeitpunkt TO ("TO") und nach 24 Stunden Inkubation einerseits ohne weitere Behandlung ("Kontrolle"), und anderseits mit Behandlung entweder gemäß WO 990905 l("StdT") oder gemäß dem erfindungs gemäßen Verfahren ("Erfindung"). Figur 3 zeigt: die graphische Dokumentation des Schwellungsgrades aller untersuchten Pferde vor bzw. nach der erfindungsgemäßen Behandlung zu den jeweiligen Nachuntersuchungszeitpunkten Figur 4 zeigt: die graphische Dokumentation der Lahmheit aller untersuchten Pferde vor bzw. nach der erfindungsgemäßen Behandlung zu den jeweiligen Nachuntersuchungszeitpunkten
Figur 5 zeigt: KOOS-Score vor und nach der Behandlung bei Patienten mit Gonarthrose
Figur 6 zeigt: Ergussbildung und Gelsolinkonzentration in der Synovialflüssigkeit bei einer Patientin mit Gonarthrose im Verlauf: nach der 1. (Tl), 2. (T2) bzw 3. Injektion (T3) Figur 7 zeigt: die Proteoglykanfreisetzung von Explantaten/ norpel-Knochen-Präparaten nach Stoßbehandlung.
Beispiel 1: Überprüfung der Proteinherstellung in einer Blutpobe nach dem erfind ungs gemäßen Verfahren und in einem erfindungsgemäßen
Behältnis mittels MID-FTIR-Spektroskopie-Verfahren und Multiplex- Analyse
Jeweils zwei Blutproben der Menge 9 ml von 1 1 verschiedenen Patienten (Nr. 1-11) wurden in ein erfindungsgemäßes Behältnis, nämlich eine zuvor mit 2,7 mg Goldpartikeln (mit einem Durchmesser von 1 μηι) befüllte 9ml Spritze aufgenommen. Eine gleiche Menge Blutprobe desselben Ursprungs (Patienten) wurde in eine gleichartige 9ml Spritze ohne Gehalt an Goldpartikeln aufgenommen. Die Proben wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert, nämlich zum Zeitpunkt TO sofort nach der Blutentnahme und zum Zeitpunkt T24 nach Inkubation für 24 Stunden bei 37°C.
Mittels Fourier-Transformations-Infrarot- Spektroskopie im mittleren Infrarot-Bereich (Spektralspektrum von 4000 cm"1 bis 400 cm"1), kurz MID-FTIR- Spektroskopie (z.B. dem AquaSpec- Verfahren der Firma Micro-Biolytics GmbH/Esslingen) wurden die Proben analysiert.
Das Messprinzip der Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie) beruht auf der Bestrahlung eines Stoffes mit elektromagnetischen Wellen, wobei bestimmte Frequenzbereiche absorbiert werden. Da Infrarotstrahlung energetisch im Bereich der Schwingungsniveaus von Molekülbindungen liegt, führt die Absorption zu einer Schwingungsanregung der Bindungen. Diese wird in Form von Ausschlägen im gemessenen Spektrum (Diagramm) sichtbar. Da die dazu notwendigen Energien bzw. Frequenzen charakteristisch für die jeweiligen Bindungen sind, können so auch Materialien identifiziert und Strukturen aufgeklärt werden.
Die FTIR-Spektroskopie ist insbesondere für die Analyse struktureller, reaktionsinduzierter Veränderungen in einem biologischen Makromolekül geeignet ist. Mit ihr lassen sich biologische Systeme, insbesondere proteinhaltige wässrige Flüssigkeiten untersuchen. Die Probe wird dabei weder verändert noch zerstört und es kann unter nativen Bedingungen des Biomoleküls gearbeitet werden, . d.h. es kann der "Ist-Zustand" gemessen werden, weil weder eine Fixierung noch ein andersartige Aufbereitung der Proben notwendig ist.
Da alle molekularen Bestandteile des Proteins Absorptionsbanden im infraroten Spektralbereich besitzen, können nahezu alle Bereiche eines Proteins beobachtet und detaillierte Informationen über die Struktur des Proteins erhalten werden.
Das MID-FTIR-Spektroskopie- Verfahren ermöglicht die automatisiert und reproduzierbar Erkennung und Quantifizierung von Änderungen der Protein-Konformation und die Bestimmung der Proteinkonzentration. Es können bereits sehr geringe Proteinkonzentrationen (bis unter 0,1 mg/ml) und geringste Konformations-Änderungen delektiert werden.
Bei der Durchführung des Verfahrens im Zuge der vorliegenden Erfindung wurden die Blutproben mit und ohne Goldpartikel im "Ist"-Zustand in einer hoch präzisen biokompatiblen und für wässrige Proben geeigneten spektroskopischen Messzelle (Transmissionszelle) analysiert. Unter Verwendung interner Kalibrationen wurde von jeder vermessenen Probe automatisch die Konzentration des gelösten Proteins und dessen Sekundärstruktur (alpha-Helix, beta-Faltblatt) bestimmt. Die Ergebnisse dieser Messung sind in Fig. 1 graphisch dargestellt. Sie zeigen, dass die erfindungsgemäß in Gegenwart von Goldpartikeln inkubierten Proben sich biologisch anders verhalten als die Kontrollproben. Die Messwerte aller Proben zum Zeitpunkt TO sind mit blauer Farbe gekennzeichnet und liegen überwiegend im linken oberen Quadranten. Die Messwerte nach Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Inkubationsdauer von 24 Stunden sind mit grüner Farbe gekennzeichnet und liegen überwiegend im oder nahe dem linken unteren Quadranten. Das zeigt an, dass die physiologische Proteinalterung im Rahmen der Blutinkubation durch den Zusatz von Gold gehemmt wird. Die Messwerte der Kontrollproben nach einer Inkubationsdauer von 24 Stunden sind mit roter Farbe gekennzeichnet und liegen überwiegend im rechten oberen Quadranten. Dieser Shift nach rechts zeigt eine Alterung der Proteinstruktur an.
Mit einem Multiparameter-Analyseverfahren (Synonym: Multiplex-Analyse) auf der Basis von unterscheidbar codierten Mikropartikeln (z.B. dem BioPlex™2200-System der Firma BioRad Laboratories, München) wurden folgende Proteine in den Proben mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ("Erfindung"), dem Verfahren gemäß WO 9909051 ("StdT") und entsprechenden Kontrollen ohne Behandlung zu den Zeitpunkten TO und T24 quantitativ bestimmt:
Gelsolin (GS), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-1 Rezeptorantagomst (IL-lRa), Interleukin-lß (IL- lß), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a), Granulocyte-Colony Stimulating factor (G-CSF), Granulocyte- Macrophage Colony Stimulating factor (GM-CSF), Interferon Gamma (IFN-g), Hematopoietic Stern cell growth factor (SCGF-ß), Macrophage inflammatory protein- la (MIP-la), Macrophage inflammatory protein-lß (MIP-lß), Vascular endothelial growth factor (VEGF), Interleukin-18 (IL- 18), Macrophage chemotactic protein (MCP-3), Stromal derived factor (SDF-a), Fibroblast growth factor basic (FGF), Growth-regulated oncogene alpha (GROa).
Diese Proteine spielen bei der Gewebedegeneration und der Gewebereparation wichtige Rollen.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 1 und graphisch in Fig. 2 dargestellt. Sie zeigen, dass bei den erfindungsgemäß behandelten Proben (Erfindung") nach 24 Stunden eine erhebliche Zunahme der Gelsolinkonzentration (Faktor 10) stattgefunden hat, während bei den Vergleichsproben ("Kontrolle-T24" und "StdT-T24") keine Gelsolinanreicherung sondern eher ein Gelsonlinschwund festgestellt wurde. Auch die Konzentrationen von Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a), Macrophage chemotactic protein (MCP-3) und Growth-regulated oncogene alpha ("GROa") waren in den erfindungsgemäß behandelten Proben ("Erfindung") wesentlich (TNF-a: Faktor 30-40, MCP-3: Faktor 20- 30) oder zumindest deutlich (GROa: Faktor 2) höher als in den Vergleichsproben ("Kontrolle-T24" und "StdT-T24").
Beispiel 2: Arzneimittel-Wirksamkeitsstudien am Tier
A) Weichteilschwellungen
Im Rahmen einer prospektiven klinischen Studie wurden 8 Pferde mit einer ausgeprägten Weichteilschwellung aufgrund von Tendinosen (degenerative Veränderungen an Sehnen im Bereich der Knochenansätze) mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel behandelt.
Für die Herstellung des Arzneimittels wurde ein erfindungsgemäßes Behältnis in Form einer Goldpartikel enthaltenden Spritze mit Blut des betreffenden Tieres gefüllt und 24 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 37°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit war das Arzneimittel in Gestalt des sich in der Spritze befindenden Blutes mit den zwischenzeitlich synthetisierten und angereicherten Proteinen, insbesondere Zytokinen und Gelsolin, sowie den Goldpartikeln fertig gestellt und konnte direkt und unmittelbar eingesetzt werden.
Da das Arzneimittel in einer Spritze hergestellt wurde, konnte es ohne Umfullung und damit ohne die Risiken von Kontamination und Materialverlust dem betreffenden Tier per Injektion verabreicht werden.
Für die vorliegende Studie wurden zum Zeitpukt TO für jedes Pferd vier derartige Arzneimittel-Dosen hergestellt, d.h. es wurden vier Goldpartikel enthaltende Spritzen mit Blut des betreffenden Tieres gefüllt und 24 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 37°C inkubiert. Diese Arzneimittel-Injektionen wurden dem jeweiligen Pferd im Abstand von jeweils einer Woche verabreicht. Die erste Verabreichung erfolgte zum Zeitpunkt T24, die zweite, dritte und vierte nach Woche 1, nach Woche 2 und nach Woche 3. Die Arzneimittel-haltigen Spritzen für die zweite, dritte und vierte Applikation wurden bis zu ihrer Verwendung bei minus 20°C gelagert.
Der Schwellungszustand wurde nach 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 3 Monaten, 6 Monaten und 1 Jahr überprüft und anhand einer Skala von 0-5 (0 = keinerlei Schwellung, 5 = massive Schwellung) bewertet.
In allen 8 Fällen wurde bereits nach 3 Wochen eine signifikante Reduktion der Schwellung festgestellt. Nach 6 Monaten und auch nach einem Jahr waren alle Pferde komplett schwellungsfrei. Es wurden im Rahmen der Behandlungen keinerlei Nebenwirkungen festgestellt.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 3 graphisch dargestellt.
B) Lahmheiten
In einer weiteren Pferdestudie wurden 11 Pferde mit dem klinischen Krankheitssymptom der Lahmheit (12 betroffene Extremitäten) mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel behandelt. Die medizinischen Ursachen für die Lahmheiten waren in sechs Fällen degenerative Knorpelveränderungen (n=6) in/an Gelenken und in sechs Fällen Weichteilerkrankungen (n=6). Für die Herstellung des Arzneimittels wurden wiederum pro Pferd vier erfindungsgemäße Behältnisse in Form Goldpartikel enthaltender Spritzen mit Blut des betreffenden Tieres gefüllt und 24 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 37°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit war das Arzneimittel in Gestalt des sich in der Spritze befindenden Blutes mit den zwischenzeitlich synthetisierten und angereicherten Proteinen, insbesondere Zytokinen und Gelsolin, sowie den Goldpartikeln im Prinzip fertig gestellt. Um das Injektionsvolumen zu minimieren wurden in einem anschließenden Zentrifugationsver fahren korpuskuläre Anteile durch Zentrifugati on über 10 Minuten bei 5000 U/min entfernt. Nur die jeweiligen Überstandes wurden für die Injektionen eingesetzt.
Diese Arzneimittel-Injektionen wurden dem jeweiligen Pferd im Abstand von jeweils einer Woche verabreicht. Die erste Verabreichung erfolgte zum Zeitpunkt T24, die zweite, dritte und vierte nach Woche 1, nach Woche 2 und nach Woche 3. Die Arzneimittel-haltigen Spritzen für die zweite, dritte und vierte Applikation wurden bis zu ihrer Verwendung bei minus 20°C gelagert.
Die Lahmheit wurde nach 1 , 2 und 3 Wochen, 3 und 6 Monaten und 1 Jahr überprüft und der Lahmheitsgrad wurde anhand einer Skala von 0-4 (0 = keinerlei Lahmheit, 5 = massive Lahmheit) gemäß AAEP = "American Association of Equine Practitioners" bewertet.
In allen 12 Fällen wurde bereits nach 3 Wochen eine signifikante Reduktion der Lahmheit festgestellt. Nach 6 Monaten und auch nach einem Jahr waren alle Pferde komplett symptomfrei, insbesondere lahmfrei. Es wurden im Rahmen der Behandlungen keinerlei Nebenwirkungen festgestellt.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 4 graphisch dargestellt.
Beispiel 3: Herstellung eines erfindungsgemäßen Behältnisses mit Goldpartikeln Als Goldpartikel wurde Goldpuder (Partikelgröße 1 μηι, Firma Bio-Rad Laboratories, München) verwendet. Die Goldpartikel wurden zunächst sterilisiert, wie vom Hersteller empfohlen: Die benötigte Menge Goldpartikel/Goldpuder, beispielsweise 30 mg, wurde mit 1 ml 70 %igen Ethanol versetzt, 10 Minuten unter leichtem Rühren (Mischer, Vortexer) inkubiert, nach 1 Minute absetzen kurz zentrif giert und anschließend der Überstand entfernt. Danach wurden die Goldpartikel dreimal mit je 1 ml sterilem Aqua bidest. gewaschen. Nach dem letzten Waschgang mit abschließender Zentrifugation und Abschütten des Überstands wurden die Goldpartikel in sterilem PBS resuspendiert und auf die gewünschte Konzentration, z.B. 60 mg/ml), eingestellt. Unter ständigem Schütteln wurden mit einer Pipette ΙΟμΙ der Goldpartikellösung entnommen und in eine S-Monovette - neutral/9ml (92 x 16 mm) von Sarstedt (REF 02.1726.001) überführt. Die Monovette wurde zunächst in einer sterilen Werkbank geöffnet (Schraubverschluss), die ΙΟμΙ Goldpartikellösung auf die innere Spritzenwand appliziert und anschließend wieder verschlossen. Die befüllten Monovetten lagerten bis" zur ihrer Verwendung bei Raumtemperatur. Für den Einsatz bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden in die derart vorbereiteten Monovetten 9 ml Körperflüssigkeit (z.B. Blut) aufgezogen und mit der Goldpartikel/PBS Lösung gemischt.
Beispiel 4: Arzneimittel-Wirksamkeitsstudien am Menschen
Im Rahmen einer prospektiven Längsschnittstudie wurden durch einen zugelassenen Arzt insgesamt 9 Patienten bzw. 13 Gelenke mit röntgenologisch nachgewiesener Gonarthrose behandelt. Der Arthrosegrad war nach Kellgren-Lawrence-Klassifkation (Kellgren J.H. and Lawrence J.S.: "Radiological Assessment of Osteo-Arthrosis", Ann. rheum. Dis. (1957), 16, 494-501) mit Grad 3-4 einzustufen. Alle Patienten erhielten jeweils vier intraartikuläre Injektion mit dem erfindungsgemäßen, zunächst goldbehandelten und anschließend von Partikeln befreiten autologen Serum im Anstand von einer Woche. Bei Vorliegen eines intraartikulären Ergusses wurde dieser jeweils vor der Injektion abpunktiert, die Punktionsmenge dokumentiert und zur weiteren Aufarbeitung in 1ml Aliquots bei minus 20° C eingefroren. Die Dokumentation des klinischen Behandlungsergebnisses erfolgte mit dem validierten Punktebewertungssystem (Synonym: Score) "KOOS" (Roos E.M., Roos H.P., Lohmander L.S., Ekdahl C, Beynnon B.D.: "Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS - development of a self- administered outcome measure", J. Orthop. Sports Phys. Ther. 1998, 28:88-96) vor der Behandlung, sowie 1, 3, 6 und 12 Monate nach der Behandlung. Die maximal erreichbare Punktzahl betrug 100. Je höher die Punktzahl, desto besser war das erreichte Ergebnis, Die Ergebnisse sind in Fig. 5 graphisch dargestellt.
Die Auswertung des KOOS-Score hinsichtlich der Parameter 'Symptome' und 'Sportaktivität' zeigte nach 3 und. 6 Monaten eine deutliche Verbesserung der klinischen Symptomatik (vgl. Fig.5).
Bei einer Patientin zeigte sich initial eine erhebliche Ergussbildung. Der Erguss wurde vor der Inj ektions-Behandlung jeweils abpunktiert, hinsichtlich der Ergussmenge dokumentiert und die Synoviapunktate hinsichtlich der Gelsolinkonzentration untersucht. Da die Gelsolinkonzentration vom Verdünnungsgrad der Ergussbildung abhängig ist, wurde die Gelsolinkonzentration auf die Urea-Konzentration bezogen (Kraus et al.: Urea as a Passive Transport Marker for Arthritis Biomarker Studies, ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 46, No. 2, February 2002, pp 420-^427). Die Ergebnisse sind in Fig. 6 graphisch dargestellt. Durch die intraartikuläre Applikation des erfindungsgemäß hergestellten Serums, d.h. des Serums nach Inkubation mit Goldpartikeln und anschließender Entfernung der (aller) Partikel konnte die intraartikuläre Gelsolinkonzentration deutlich gesteigert werden (vgl. Fig.6), Gleichzeitig kam es zu einer Reduktion der Ergußmenge (vgl. Fig.6) und im weiteren Verlauf zu einer deutlichen Verbesserung der klinischen Symptomatik,
Diese Studie belegt somit die Verwendung des Arzneimittels zur Behandlung von Arthrose und generell von Krankheiten, die mit einem Gelsolinmangel assoziiert sind.
Beispiel 5: Nachweis der chondroprotektiven Wirkung des erfind ungs gemäßen
Arzneimittels am in-vitro Knorpelimpaktierungsmodell
Der Einfluss mechanischer Überlastung auf den Gelenkknorpel im Rahmen der Arthroseentstehung ist hinlänglich bekannt. Es existieren auch gut etablierte und validierte in-vitro Modelle, die den Einfluss mechanischer Belastung bei Knorpel- Knochenexplantaten untersuchen, z.B. das Modell von Huser und Davies (Huser CA. und Davies M.E.: "Validation of an in vitro single-impact load model of the initiation of osteoarthritis-like changes in articular cartilage", J Orthop Res., Apr 2006;24(4):725-732.). Ein guter Indikator für die beginnende Knorpeldegeneration in solchen Modellen ist die Messung des Proteoglykangehalt im Kulturmedium der untersuchten Knorpel- Knochenproben.
Im Verlauf der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurde in einer tierexperimentellen Studie am Minischwein "Göttinger Minipig" bei 6 Tieren mit 9 ml Spritzen, die jeweils 103 Goldpartikel enthielten, pro Tier jeweils 4 Proben (ä 9 ml) Blut entnommen und gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren 24 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubationszeit wurden die Blutproben in den Spritzenzylindern zentrifugiert und je Spritze (bzw. Spritzenzylinder) der Überstand durch einen Sterilfilter in einen frischen/neuen goldpartikelfreien Spritzenzylinder überführt.
Parallel zur Entnahme der Blutproben wurden den der betreffenden Tieren unter aseptischen Bedingungen Knorpel-Knochen-Proben aus den jeweiligen Hüftköpfen entnommen und zu 8x8x10 mm (Länge/Breite Höhe) Blöcken zugeschnitten. Der Knorpel war bei allen Explantaten makroskopisch intakt.
Bis zum Einsatz in dem Stoßbelastungstest (Impaktierungstest) wurden Knorpel -Knochen- Probenblöcke in DMEM-Medium mit dem Zusatz von 10 % Humanem Serum (HS), 100 U/ml Pencillin, 100 £/ ι1 Gentamycin und 1,25 U/ml Amphotericin B aufbewahrt.
Noch am Tage der Probenentnahme wurde der Stoßbelastungstest (Impaktierungstest) durchgeführt. Dazu wurde jeweils ein Κηοφβ1-Κ_ηοϋ1ΐ€η-Ρκ βηΜοο1ί Εχρΐ3ηΐ3ΐ in einem zylinderförmigen Freifallturm ("drop tower") aus Polymethylmethacrylate mit den Maßen 33 cm Höhe und 4 cm axial mit Abstand unterhalb eines Stoßkolbens unter sterilen Bedingungen angeordnet. Der Stoßkolben hatte die Form eines Zylinders mit den Maßen 5 cm Höhe und 3,94 cm Durchmesser, und sein Gewicht betrug 493 g. Der Stoßkolben war über ein Gewinde mit der eigentlichen Stoßscheibe ("Impaktorstück") verbunden, die ein Gewicht von 7 g, eine Höhe/Dicke von 1 cm und einen Durchmesser von 0,6 cm aufwies. Die Stoßbelastung/Impaktierung erfolgte einmalig pro Knorpel -Knochen-Probenblock im "drop tower" durch den freien Fall des Stoßkolbens mit Stoßscheibe (Impaktors) aus 1 cm Höhe unter auf die Probe. Die Stoßbelastung betrug dabei 0.736 J auf eine Knorpeloberfläche von 28.3 mm2.
Die Knorpel-Knochen-Probenblöcke/Explantate wurden in 3 Gruppen unterteilt:
· Explantate ohne Stoßbehandlung = "nicht-impaktierte Kontrollen" = "0- Kontrollen")
• Explantate mit Stoßbehandlung = "impaktierte Kontrollen" = "Stoß-Kontrollen"
• Explantate mit Stoßbehandlung und anschließender Inkubation mit dem erfindungsgemäß hergestellten, proteinangereichtem Blutserum
Im Anschluß an die Stoßbehandlung wurden die behandelten Knochen-Knorpel-Präparate und ebenso die O-Kontrollen 3 mal mit PBS gewaschen und in 12-well Kulturplatten überfuhrt. Jedes Explantat wurde mit 3 ml des jeweiligen Behandlungsmediums angesetzt und unter standardisierten Bedingungen (37°C, 5 % CO2,) im Brutschrank inkubiert. Das Kulturmedium wurde alle 72 Stunden gewechselt.
Das erfindungsgemäß hergestellte proteinanger eichte Blutserum wurde bei den Explantat der betreffenden Explantat-Gruppe am Tag 0 und Tag 7 dem zugesetzt.
Am Tag 2, 7 und 14 wurde bei allen Testansätzen der Proteoglykangehalt im Kulturmedium gemessen. Hierzu wurde der Blyscan Gylcosaminoglycan Assay der Firma Biocolor Ltd., (Carrickfergus, UK) verwendet. Die Ergebnisse sind in der Graphik von Fig. 7 dargestellt. Der Proteoglykangehalt ist als mittlere Gylcosaminoglycan (GAG)- Konzentration in g/ml Medium angegeben.
Die Analyse der Proteoglykanfreisetziing zeigt, dass in allen drei Gruppen, nämlich den O-Kontrollen und den beiden stoßbehandelten/impaktierten Explantaten/ Knorpel- Knochen-Präparaten die Proteogykanmenge mit der Zeit ansteigt.
Bei den mit dem erfindungsgemäß hergestellten proteinangereichten Blutserum behandelten Explantaten/Kno el-K ochen-Prä araten ist dieser Anstieg jedoch nur wenig stärker als bei den nicht-impaktierten Kontrollen (O-Kontrollen), während die stoßbehandelten/impaktierten Explantate (Knorpel-Knochen-Präparate) ohne entsprechende Serumbehandlung einen sehr viel höheren Anstieg zeigen. Dieser Test belegt somit den chondroprotektiven Effekt des erfindungsgemäßen Arzneimittels.
Multiparameter-Analyseverfahren
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Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung mindestens eines therapeutisch wirksamen Proteins oder eines Proteingemisches in einem Behältnis, wobei das Behältnis mit einer
Körperflüssigkeit gefüllt, inkubiert und das therapeutisch wirksame Protein in der Kö erflüssigkeit gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis
Goldpartikel enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldpartikel nach der in vitro Inkubation aus der Körperflüssigkeit entfernt und verworfen werden.
3. Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Goldpartikel und Körperzellen und andere unlöslichen Aggregate nach der in-vitro Inkubation aus der Körperflüssigkeit entfernt und verworfen werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
Goldpartikel eine definierte Größe aufweisen, insbesondere Mikro- und/oder
Nanopartikel sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die
Goldpartikel in einer Menge von 0,1 mg bis 10 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit, vorzugsweise 0,3 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit, in dem Behältnis vorliegen.
6. Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldpartikel eine Größe von etwa 1 μπι aufweisen und in einer Menge von 103 - 104 Goldpartikel pro 10 ml vorliegen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das
Behältnis eine Spitze ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das
Behältnis ein verschließbarer Beutel ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mit der Körperflüssigkeit befüllte Behältnis 12 bis 72 Stunden, bevorzugt 24 Stunden, bei einer Temperatur von 20°C bis 41 °C, vorzugsweise 37°, inkubiert wird.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutisch wirksame Protein Gelsolin ist.
12. Behältnis für die in-vitro Biosynthese und Anreicherung (In-vitro Induktion) von therapeutisch wirksamen Proteinen in einer Körperflüssigkeit, dadurch
gekennzeichnet, dass das Behältnis Goldpartikel enthält, zur Aufnahme, Lagerung und Wiederabgabe einer Körperflüssigkeitsprobe geeignet ist, und mit einer Hohlnadel derart koppelbar ist, dass sein Inhalt vermittels dieser Hohlnadel injizierbar ist.
13. Behältnis nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldpartikel eine definierte Größe aufweisen, insbesondere Mikro- und/oder Nanopartikel sind.
14. Behältnis nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldpartikel in einer Menge von 0,1 mg bis 10 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit, vorzugsweise 0,3 mg pro 1 ml Körperflüssigkeit, in dem Behältnis vorliegen.
15. Behältnis nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis eine Spitze ist.
16. Behältnis nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis ein verschließbarer Beutel ist.
17. Behältnis nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die Körperflüssigkeit autologes oder homologes Blut ist.
18. Behältnis nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutisch wirksame Protein Gelsolin ist.
1 . Stoffmischung aus autologem oder homologem Blut und Goldpartikeln zur
Verwendung als Arzneimittel.
20. Stoffmischung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an Gelsolin aufweist, der wenigstens das Doppelte des entsprechenden Blutnormwerts für Gelsolin beträgt.
21. Stoffmischung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das
Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, die mit einem Gelsolinmangel assoziiert sind, geeignet und vorgesehen ist.
22. Stoffmischung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das
Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, die mit Gewebedegenerationen assoziiert sind, geeignet und vorgesehen ist.
23. Stoffmischung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit
Arthrose ist und das Arzneimittel für die Behandlung von Arthrose geeignet und vorgesehen ist.
24. Zytokinin- und gelsolinangereichertes Blutserum zur Verwendung als Arzneimittel, erhältlich dadurch, dass Blutserum in ein Goldpartikel enthaltendes Behältnis aufgenommen wird, dass diese Mischung aus Blutserum und Goldpartikeln inkubiert wird, und dass anschließend die Goldpartikel aus dem Serum entfernt und verworfen werden
25. Blutserum nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an
Gelsolin aufweist, der wenigstens das Doppelte des entsprechenden Blutnormwerts für Gelsolin beträgt.
26. Blutserum nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass Goldpartikel und Blutzellen und/oder andere unlöslichen Bestandteile aus dem Serum entfernt und verworfen werden.
27. Blutserum nach einem der Ansprüche 24 bis 26 dadurch gekennzeichnet, dass die Goldpartikel eine Größe von etwa 1 μιη aufweisen.
28. Blutserum nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldpartikel in einer Menge von 103— 104 Goldpartikel pro 10 ml Behältnis oder von 0.3 mg Goldpartikel mit einem Durchmesser Ιμιη pro 1 ml Blut/Behältnis vorliegen.
29. Blutserum nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, die mit Gewebedegenerationen assoziiert sind, geeignet und vorgesehen ist.
30. Blutserum nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit Arthrose ist und das Arzneimittel für die Behandlung von Arthrose geeignet und vorgesehen ist.
31. Blutserum nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, die mit einem Gelsolinmangel assoziiert sind, geeignet und vorgesehen ist.
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