WO2012015200A2 - 간 질환의 진단, 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

간 질환의 진단, 치료 및 예방용 조성물 Download PDF

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박기훈
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    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • composition for diagnosis, treatment and prevention of liver disease ⁇ Technical field ⁇
  • the present invention relates to a composition for diagnosing, treating and preventing liver disease, and more particularly, to measure a protein level of TM4SF5 (Transmembrane 4 L six fami ly member 5 or Four-Transmembrane b 6 Super fami ly member 5) protein level.
  • a composition for diagnosing liver disease comprising a kit for diagnosing liver disease comprising the composition, TM4SF5 protein level and TM4SF5 expression-related signaling proteins and the level of phosphorylation, by measuring the expression and phosphorylation level, and comparing the information with a normal control sample for diagnosing liver disease.
  • the present invention relates to a composition for treating or preventing liver disease, and a composition for treating or preventing liver disease, comprising a substance that inhibits expression and phosphorylation of TM4SF5 protein and signaling proteins related to TM4SF5 expression.
  • the liver has many functions in the body such as metabolism of lipids, detoxification, bile excretion, storage of various nutrients, control of hematopoiesis, blood diarrhea, and circulating blood volume. In this case, it is very important to maintain life.
  • the function of the liver is to manage energy metabolism.
  • the liver has the function of synthesizing, storing, and distributing about 2,000 kinds of enzymes, albumin, and serum proteins of unggo factors, bile acids, phospholipids, and cholesterol.
  • there is a function to excrete various metabolites into the duodenum and immune function plays an important role in maintaining life.
  • Liver diseases are classified into viral liver disease, alcoholic liver disease, drug toxic liver disease, fatty liver, autoimmune liver disease, metabolic liver disease and other liver diseases according to the cause of the disease. Liver disease is not detected in the early stages of the disease, so it is only found in a very advanced stage. As a cause of death not only in Korea but also in the world, it is necessary to study effective diagnosis and treatment.
  • TGFP transforming growth factor ⁇
  • TGFP The secreted TGFP promotes collagen synthesis to cause hepatic fibrosis and affects not only hepatic stellate cells but also surrounding hepatocytes, causing EMT (epi the i a 1 to mesenchymal transition). Since hepatic fibrosis eventually develops through the process of hepatic fibrosis, understanding and studying the process of hepatic fibrosis is the most basic step in solving all diseases that can cause cirrhosis.
  • alcoholic liver damage is caused by compounds that occur in alcohol or by metabolism itself, leading to lipid accumulation, hepatocellular damage and fibrosis.
  • hepatocytes are damaged by various causes such as alcoholic, chronic viral B, C, chronic autoimmune disease, chronic cholangiopathic disease, chronic heart disease, parasitic layer, drug addiction, etc., hepatocytes, Cooper cells .
  • Various cytokines and oxygen free radicals are generated by the interaction of various cells such as sinusoidal endothelial cells and hepatic stellate eel 1 (HSC), and the extracellular matrix , ECM) is damaged, and abnormal proliferation of ECM such as collagen I and III is induced, leading to hepatic fibrosis.
  • hepatic fibrosis unlike cirrhosis, is reversible, consists of thin fibril, is known to have nodule formation, and normal recovery may be possible if the cause of liver damage is lost.
  • hepatic fibrosis process continues repeatedly, cross inking between ECMs increases, forming thick fibrils and progressing to irreversible cirrhosis with nodules.
  • Increases in ECM, such as collagen (co 11 agen) are an important cause of hepatic fibrosis and are mainly produced by HSC cells activated by a variety of causes.
  • Hepatic fibrosis is progressing more and more, and cirrhosis occurs.
  • the pathogenesis is hepatocyte regeneration and fibrous proliferation when hepatocellular necrosis is caused by some cause. Liver cirrhosis occurs when this process continues for a long time.
  • Liver cirrhosis formed by hepatic nodules or nodules regenerated by persistent or repeated diffuse parenchymal injury, fibrosis proliferation, and hepatocellular regeneration is pathologically associated with necrosis, inflammation (fif initiation) and fibrosis. This is a chronic disease that involves cirrhosis and ultimately leads to liver cancer and death.
  • TM4SF5 Flexible-Transmembrane L6 Superfami ly member 5 protein
  • tetraspnins tetraspnins or tetraspan
  • TM4SF5 Proteins form complexes with cell adhesion molecules, such as integrins, on the cell membrane to form large tetraspnin-web or tetraspanin-enriched microdomains (TERMs), contributing to a variety of biological functions such as cell adhesion, proliferation, and migration.
  • TM4SF5 is overexpressed in human liver cancer cells and functions as a carcinogen by causing EMT and contact growth inhibition through a process leading to accumulation of P 27 kipl protein in the cytoplasm and inhibition of RhoA protein activity. Has been reported.
  • An object of the present invention is a liver comprising a substance for measuring the expression and / or phosphorylation level of TM4SF5 (Transmembrane 4 L six family member 5 or Four-Transmembrane L6 Super fami ly member 5) protein levels and signaling proteins associated with TM4SF5 expression It is to provide a disease diagnosis composition and a liver disease diagnosis kit containing the composition for diagnosing liver disease.
  • TM4SF5 Transmembrane 4 L six family member 5 or Four-Transmembrane L6 Super fami ly member 5
  • step 2) to provide a method for providing information for diagnosing liver disease comprising comparing the protein level of step 1) with the TM4SF5 protein level of a normal control sample.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • liver disease treatment candidate substance to liver disease cells expressing TM4SF5 protein
  • -l, beta-catenin, desmolackin To provide a method for screening a liver disease treatment substance, comprising selecting a candidate substance when the level of expression of one or more proteins selected from the group consisting of claudine and collagen is selected as a liver disease treatment substance.
  • Another object of the present invention to provide a composition for treating or preventing liver disease comprising a substance that inhibits the expression or activity of TM4SF5 protein.
  • Another object of the present invention is to provide a substance for measuring TM4SF5 protein level for use as a composition for diagnosing liver disease.
  • Another object of the present invention is to provide a substance that inhibits the expression or activity of the TM4SF5 protein for preparing a medicament for treating or preventing liver disease.
  • It is another object of the present invention to provide a method for treating liver disease comprising administering to a subject suffering from liver disease, a substance that inhibits the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of TM4SF5 protein.
  • It is another object of the present invention to provide a method for preventing liver disease comprising administering to a subject a substance that inhibits the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of TM4SF5 protein.
  • the present invention measures the expression and phosphorylation levels of TM4SF5 (transmembrane 4 L six fami ly member 5 or Four-Tr ansmembr ane L6 Super f ami ly member 5) protein levels and / or TM4SF5 expression related signaling proteins It provides a composition for diagnosing liver disease comprising a substance.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing liver disease comprising the composition.
  • step 2) provides a method of providing information for diagnosing liver disease, comprising comparing the protein level of step 1) with the TM4SF5 protein level of a normal control sample.
  • liver disease treatment candidate substance to liver disease cells expressing TM4SF5 protein
  • a method for screening a liver disease therapeutic substance comprising the step ⁇ of selecting a candidate substance when the expression of 0 TM4SF5 protein is inhibited as a liver disease treatment substance, compared to a control group not treated with the candidate substance of step 1) do.
  • liver disease treatment comprising the step of selecting a candidate for treating liver disease when one or more protein expression levels selected from the group consisting of beta-catenin, desmoflokin, claudine, and collagen are changed Provided are methods of screening materials.
  • the present invention provides a composition for treating or preventing liver disease comprising a substance that inhibits the expression or activity of TM4SF5 protein.
  • the present invention also provides a substance for measuring the level of TM4SF5 protein for use as a composition for diagnosing liver disease.
  • the present invention also provides a substance that inhibits the expression or activity of the TM4SF5 protein for preparing a medicament for treating or preventing liver disease.
  • the present invention provides a method for treating liver disease comprising administering to a subject suffering from liver disease a substance that inhibits the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of TM4SF5 protein.
  • the present invention provides a method for preventing liver disease comprising administering to a subject a substance that inhibits the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of TM4SF5 protein.
  • TM4SF5 protein refers to Transmembrane 4 L six family member (also called Four Transmembrane L6 Super fami ly member 5 or 'L6H'), tetraspanin which is a membrane receptor group that crosses the cell membrane four times.
  • TM4SF Transmembrane 4 Super Family
  • prevention means that the administration of the composition to decrease the liver function It means any action that restrains or delays.
  • treatment refers to any action in which liver function and growth is restored or beneficially altered by administration of a therapeutic agent.
  • the term "administration" means providing a subject with a composition of the present invention in any suitable manner.
  • the present invention is described in detail.
  • the present invention relates to TM4SF5 (Transmembrane 4 L six fami ly). member 5 or Four-Transmembrane L6 Super f ami ly member 5)
  • TM4SF5 Transmembrane 4 L six fami ly
  • member 5 or Four-Transmembrane L6 Super f ami ly member 5
  • a composition for diagnosing liver disease comprising a substance for measuring protein levels.
  • the present invention also provides a substance for measuring the level of TM4SF5 protein for use as a composition for diagnosing liver disease.
  • the TM4SF5 protein is preferably obtained through the expression of the polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 from the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the TM4SF5 is a water-insoluble protein and has four regions that pass through the cell membrane, two ring structures that exist outside the cell, and two terminal structures that exist in the cytoplasm, and in various cancer cells such as pancreatic cancer, lung cancer, gastric cancer, rectal cancer and liver cancer. It is known to be highly expressed (Muller-Pi llasch, F., et al., Gene 208: 25, 1998; Pascual-Le Tal lec, L. et al., J Clin Endocrinol Me tab 87: 501, 2002).
  • liver disease refers to any disease that causes liver failure, and includes, for example, viruses (eg, A, B, C, D, or E viruses), alcohols, aplatoxins, drugs (tuberculosis drugs). , Aspirin, antibiotics, anesthetics, antihypertensives, oral contraceptives), and congenital metabolic disorders.
  • viruses eg, A, B, C, D, or E viruses
  • drugs tuberculosis drugs
  • Aspirin antibiotics
  • anesthetics antihypertensives
  • oral contraceptives congenital metabolic disorders.
  • Specific examples of liver disease include chronic liver injury, liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, liver cancer, cirrhosis, alcoholic liver disease, or fatty liver.
  • a substance capable of measuring the protein expression level of a gene includes all antibodies such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies that specifically recognize and bind to TM4SF5 protein.
  • antibody 1 means a specific protein molecule directed against the antigenic site.
  • a liver disease diagnostic marker protein has been identified, and thus it is known to those skilled in the art to generate an antibody using the same.
  • the polyclonal antibody is a liver disease marker protein described above, which is well known in the art for injecting TM4SF5 antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum comprising the antibody.
  • These polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host such as goat, rabbit, sheep, animal, horse, pig, rat, rat, cow, dog, and the like.
  • Monoclonal antibodies are hybridomas that are well known in the art. Hybrid method (see Kohler and Milstein (1976) European Jounr a 1 of Immunology 6: 511-519), or phage antibody library (CI ackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al , J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991). Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • 3 induces the expression of TM4SF5 (Transmembrane 4 L six family member 5 or Four 'Transmembrane L6 Super f ami ly member 5) in the stage of epilepsy progressing to liver fibrosis, cirrhosis, liver cancer, etc.
  • TM4SF5 Transmembrane 4 L six family member 5 or Four 'Transmembrane L6 Super f ami ly member 5
  • the present inventors treated with TGF
  • TM4SF5 conditioned-media of LX2 cell line known as activated Stellate Cells (HSC) was treated to normal hepatic epithelial cells
  • HSC activated Stellate Cells
  • TM4SF5 TM4SF5 is induced with activation of the EGFR signaling system and treated with EGFR inhibitors. It was confirmed that the expression of TM4SF5 is inhibited by.
  • the present inventors also found that the expression of TM4SF5 is induced by liver damage and inflammation in a rat animal model in which hepatic diseases such as chronic liver damage and liver fibrosis are caused by periodic injection or oral administration of CC1 4 black alcohol.
  • TM4SF5 coincides with the expression of TGFP and the collagen staining to confirm that TM4SF5 is involved in the liver disease stage of liver fibrosis and cirrhosis of liver damage and inflammation.
  • TSAHC reported to counteract the carcinogenic effects of TM4SF5 in TM4SF5-expressing hepatocellular carcinoma cells may offset the expression of ⁇ -SMA, which is a marker of EMT due to the expression of TM4SF5 by TGFP in normal hepatocytes.
  • scan the black CC1 4 is periodically such as liver fibrosis and liver injury in the rat animal model, caused by oral administration It was reduced to annual check all suppressed.
  • TM4SF5 which is known to be overexpressed in liver cancer cells, is induced by TGFP, depending on the activity of EGFR through the interaction between membrane receptors at the cellular level.
  • TM4SF5 is also important for the development of liver diseases such as liver fibrosis and cirrhosis due to chronic liver damage and hepatitis. It is confirmed that it can play a role.
  • the present invention provides a composition for diagnosing liver disease, comprising a substance for measuring the expression and phosphorylation level of TM4SF5 expression-related signaling proteins using various proteins involved in the TGF- ⁇ signaling system.
  • EMT epitope ial mesenchymal transition
  • EMT epitope ial mesenchymal transition
  • a -Smooth muscle act in eg, increasing proteins, a -Smooth muscle act in (viment in), cytoskeleton-intermediate (i ntmed e at filament), snail, slug, decreasing proteins, E-cadherin (E-cadher in
  • Smad2 mother s against decapentaplegic homo 1 og 2
  • Smad3 mother s against decapentaplegi c homo 1 og 3
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Erkl / 2 extracel lular signal-regulated kinase 1/2
  • the substance for measuring the protein level or phosphorylation level of the proteins is an antibody that specifically recognizes these proteins.
  • antibodies herein can also be readily prepared by those skilled in the art using known techniques.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing liver disease, which contains the composition for diagnosing liver of the present invention.
  • the liver disease is preferably liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, alcoholic liver disease or fatty liver, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit according to the present invention may be a diagnostic kit comprising an agent for measuring the TM4SF5 protein level, wherein the agent for measuring the protein level is preferably an antibody specific for the protein.
  • a diagnostic kit including an agent for measuring the protein level may be, for example, a kit for detecting a diagnostic marker including an essential element necessary for performing an ELISA, and the kit may form an "antigen-antibody complex".
  • Reagents capable of detecting antibodies such as labeled secondary antibodies, chromophores (chr nophores), enzymes (eg conjugated with antibodies), and substrates thereof may be included. It may also comprise antibodies specific for quantitative control proteins.
  • the amount of formation of the antigen-antibody complex can be quantitatively measured through the magnitude of a signal of a detection label.
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto.
  • Assays for measuring protein levels include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni Immunodiffusion methods include, but are not limited to, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunoimmunoprecipitation assays, complement fixation assays, FACS, protein ⁇ -E.
  • Measuring TM4SF5 protein level from the sample is
  • the biological sample of step 1) is preferably tissue, whole blood, serum, or plasma, but is not limited thereto.
  • TM4SF5 protein expression level in the normal control group and the protein expression level in suspected liver disease patients it is possible to diagnose the actual patient with liver disease, and furthermore, to determine the progression or prognosis of liver disease. You can predict it.
  • Measuring the TM4SF5 protein level can measure the level of TM4SF5 protein life using the antibody that specifically recognizes TM4SF5, and specifically, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oak It can be performed using the aforementioned various protein level measurement methods such as the Teroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis method, tissue immunostaining staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip method.
  • liver disease treatment candidates to liver disease cells expressing TM4SF5 (Transmembrane 4L six fami ly member 5 or Four—Transmembrane L6 Super fami ly member 5) protein;
  • a method for screening a liver disease treatment substance comprising selecting a candidate substance when the expression of TM4SF5 protein is inhibited as a liver disease treatment substance, compared to a control group not treated with the candidate substance of step 1) to provide .
  • the liver (disease) cell may be any liver disease cell expressing the TM4SF5 protein.
  • the liver disease cell expressing the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 from the nucleotide represented by SEQ ID NO: 1 Means, liver disease cells expressing the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, for example, SNU449 liver cancer expressing TM4SF5 Cell line (KCLB No. 00449), Huh7, HepG2 cell line, in addition to CC1 4 or alcohol, refers to cells of liver disease associated with chronic liver damage, hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, fatty liver, or artificially produced liver disease cells do.
  • the artificially produced liver disease cells include cells expressing TM4SF5 protein by a cloning technique including genetic engineering.
  • the candidate substance is estimated to have the potential as a liver disease treatment agent according to a conventional selection method or randomly selected individual nucleic acids, peptides, proteins, antibodies, Other extracts, natural products, compounds, and the like.
  • the compound may be a compound that inhibits the expression of TM4SF5 protein.
  • the candidate material for the treatment or prevention of liver disease is treated to liver disease cells or tissues or other biological samples to express the expression and phosphorylation levels of TM4SF5 protein and TM4SF5 expression related signaling proteins.
  • TM4SF5 protein and TM4SF5 expression related signaling proteins By measuring, it is possible to select a substance for treating or preventing liver disease, and to inhibit the expression and phosphorylation of signaling proteins associated with TM4SF5 expression and TM4SF5 expression, compared with the case where the candidate substance is not treated, Or as a prophylactic substance.
  • confirmation of the reaction between the substances is a protein-protein, a protein-compound, or a candidate substance mentioned above, which is used to confirm whether a reaction between a protein-nucleic acid, a peptide, an antibody, another extract or a natural product is performed.
  • Conventional methods can be used.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing liver disease, comprising a substance that inhibits the expression or activity of TM4SF5 protein.
  • the present invention also provides a substance that inhibits the expression or activity of the TM4SF5 protein for preparing a medicament for treating or preventing liver disease.
  • the present invention also provides a method for treating liver disease comprising administering to a subject suffering from liver disease a substance that inhibits the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of TM4SF5 protein.
  • the present invention provides a method for preventing liver disease comprising administering to a subject a substance which inhibits the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of TM4SF5 protein.
  • the TM4SF5 protein is preferably a polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the liver disease is preferably liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, alcoholic liver disease or fatty liver, but is not limited thereto.
  • the substance that inhibits the expression or activity of the TM4SF5 protein is preferably a sulfonyl-chalcone compound represented by the following [Formula 1] to [Formula 4], and [Table 1], but is not limited thereto.
  • the expressed TM4SF5 protein functions to express ⁇ -SMA, that is, to induce epithel ia ⁇ mesenchymal transition (EMT), to induce p27 expression, and to enhance phosphorylation of Ser27 in p27.
  • SMA expression i.e., reduced induction of EMT (ep i the 1 al-mesenchymal transition), decreased expression of p27, and reduced phosphorylation of SerlO of p27.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing liver disease comprising a substance that inhibits the expression or activity of TM4SF5 protein and inhibits the expression and phosphorylation level of TM4SF5 protein expression-related signaling proteins.
  • R 2 and R 3 are each independently hydrogen or a hydroxyl group
  • R 4 is C 6 ⁇ C 10 aryl having at least one substituent selected from the group consisting of alkyl of CrC 5 or hydrogen, halogen, nitro and crc 5 , preferably methyl benzyl, P-frame Luyl, P-nitrophenyl or P-fluorophenyl.
  • R 2 and R 3 are each independently hydrogen or a hydroxyl group
  • R 4 is alkyl of Ci-C 5 ; Or C 6 -Cl 0 aryl having at least one substituent selected from the group consisting of hydrogen, halogen, nitro and d-C 5 alkyl.
  • Ri is R 4 S0 2- ;
  • R 2 and R 3 are each independently hydrogen or a hydroxyl group
  • R 4 is C 6 ⁇ C 10 aryl having one or more substituents selected from the group consisting of alkyl of CrC 5 or hydrogen, halogen, nitro and crc 5 / ⁇ , preferably methyl, benzyl, P-tolyl, p nitrophenyl or P-fluorophenyl.
  • R 2 and R 3 are each independently hydrogen or a hydroxyl group.
  • R 4 is d-C 5 alkyl; Or hydrogen, halogen, nitro and d 6.
  • C 6i having one or more substituents selected from the group consisting of C 1 5 alkyl ! p e l! o ! Aryl of C 10 .
  • the substance which inhibits is an anti liver disease substance, More preferably,
  • TSAHC [4 '-(p-toluenesul fonylamino) -4-hydroxy chalcone] described as 1 is a representative compound.
  • Korean Patent Publication No. 10-2003-0036993 discloses a matrix metalloproteinase, in which a chalcone-based compound decomposes the base membrane components. Although it has been described that it has a property of inhibiting the activity of P), it does not mention at all the treatment or prophylactic function of the liver disease of the chalcone-based compound as well as the chalcone-based compound represented by the formula (1) to 4 of the present invention Its structure is characterized by containing a sulfone group (S0 3- ) or sulfonamide group (S0 2 NH-). That is, the anti- liver activity (function) of the chalcone-based compound against TM4SF5 is the sulfone group (S0 3). — Comes from).
  • the liver damage of mice caused by CC1 4 using TSAHC [4 '-(p-toluenesulfony 1 amino) -4-hydroxy chalcone] (Compound No. 1 in Table 1), which is a representative compound among them.
  • the chalcone-based compounds function as antagonists that specifically inhibit the phenomena caused by TM4SF5.
  • the chalcone-based compound according to the present invention may be used in the form of a chalcone derivative in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salts acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid are useful. That is, the chalcone derivative is pharmaceutically acceptable according to a conventional method in the art.
  • Free acids include inorganic and organic acids
  • the inorganic acid can be hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.
  • Organic acids include citric acid, acetic acid, lactic acid, maleic acid and fumaric acid.
  • Gluconic acid methanesulfonic acid, acetic acid, glyconic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-luluenesulfonic acid, kalutuuronic acid, elbonic acid, glutamic acid or aspartic acid
  • hydrochloric acid as the organic acid
  • Methanesulfonic acid can be used.
  • chalcone derivative according to the present invention is pharmaceutically acceptable
  • It may include both hydrates and solvates.
  • the chalcone-based compound according to the invention for clinical use, the chalcone-based compound according to the invention or
  • Disintegrant coating material, emulsifier, suspending agent, solvent, stabilizer, absorption
  • the mixture may be oral, injectable, rectal or external
  • liver disease treatment or prophylactic composition containing a salt thereof Or a liver disease treatment or prophylactic composition containing a salt thereof
  • tablet coating station 1 for example, tablet coating station 1,
  • Dragees hard or soft gelatin capsules, liquids, emulsifiers or
  • Dosing can also be administered rectally, for example
  • it can be administered as an ointment cream, gel or liquid;
  • parenteral administration e.g., using a solution for injection.
  • the chalcone-based compound of the present invention For the preparation of the capsule, the chalcone-based compound of the present invention
  • excipients suitable for capsules include lactose, maize
  • Suitable excipients used in soft gelatin capsules include, for example, vegetable
  • Excipients that can be used for the production of syrups include, for example, water,
  • excipients which can be used are for example
  • Examples include water alcohols, polyols, glycerin and vegetable oils.
  • composition for treating or preventing liver disease may also include preservatives, solubilizers, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, sweeteners, pigments, fragrances, osmotic pressure-controlling salts, laxatives, coatings or antioxidants, It may also contain valuable medication.
  • pharmaceutical formulations for oral administration may be granules, tablets, sugar coated tablets, capsules, pills, suspensions or emulsifiers, for parenteral formulations, for example intravenous, intramuscular or subcutaneous.
  • parenteral formulations for example intravenous, intramuscular or subcutaneous.
  • a formulation of sterile aqueous solution may be used, which may include other substances, for example salts or glucose, to make an isotonic solution. It may also be administered in the form of suppositories or pessaries, or may be applied externally in the form of lotions, solutions, creams, ointments or dusting powders.
  • the daily dose level of the chalcone-based compound of the present invention is 5 to 2000 mg when administered orally or parenterally.
  • the level of TM4SF5 expression and the expression and phosphorylation level of signaling proteins related to TM4SF5 expression can be diagnosed and screened for the treatment of liver disease, and the expression of TM4SF5 can be suppressed.
  • the use of antagonists against TM4SF5 is also possible for the prevention and / or treatment of the disease.
  • FIG. 1 shows that TM4SF5 is expressed by TGF
  • FIG. 1 shows Western blots of Smad phosphorylation and TM4SF5 expression in normal liver and liver cancer tissues of humans. Edie-.
  • the transcriptional activity of the TM4SF5 promoter was confirmed using a luciferase reporter gene assay.
  • Figure 3 shows the degree of phosphorylation of Smad3 and Smad2 and the expression level of non-mentin, E-cadherin, TM4SF5 by Western blotting and fluorescent immunostaining using non-mentin antibody in AML12 cells according to TGFP treatment. It is a result of confirming that the expression of the non-mentin was increased by changing the cell dispersion pattern by the 3 treatment.
  • TM4SF5 expression in Chang cells is phosphorylation of Smad2 / 3, phosphorylation of Tyrll73 of EGFR,
  • FIG. 6 shows that the expression of TM4SF5 in AML12 cells is increased by treatment with TGFp concentration in AML12 cells and conditioned-media treatment of LX2 cells known as activated hepatic stellate cells (12 and 24 hours). The result is.
  • TM4SF5 The expression of TM4SF5 and the increase of phospho-Y 1173 EGFR and phospho-Erkl / 2 were confirmed by Western blot.
  • TM4SF5 is a result of confirming the increase in expression of TM4SF5 according to TGFP, EGF, HGF, PDGF treatment in AML12 cells using Western blot.
  • FIG. 12 shows conditioned-media treatment (CM, 24 hours) of LX2 cells known as activated hepatic stellate cells in AML12 cells simultaneously with DMS0 or EGFR kinase inhibitor AG1478 100 nM), followed by conditioned-media treatment in ML12 cells.
  • Western blot confirmed that the increase in expression of TM4SF5 was not increased by AG1478 treatment.
  • FIG. 13 is a result of confirming overexpression of Smad2, Smad3, or Smad4 with Chang adenovirus for 24 hours by inducing overexpression, and expressing the expression level of TM4SF5 following TGFP treatment using Western blot.
  • 14 is a result of confirming overexpression of Smad2, Smad3, or Smad4 in Chang cells with adenovirus for 24 hours to induce overexpression and expressing the expression level of TM4SF5 by TGFP treatment when AG1478 was treated and untreated using Western blot.
  • FIG. 16 is a result of confirming the expression level of TM4SF5 using Western blot after inducing overexpression by infecting Smad4 with adenovirus for 24 hours when cycloheximide was treated with or without Chang cells.
  • 17 shows AML12 cells and Chang cells in suspension In the case of reseeding the fibronectin-coated container, the expression level of TM4SF5 according to TGF ⁇ treatment was confirmed using Western blot.
  • FIG. 18 is a result of confirming expression of TM4SF5 by TGF ⁇ treatment using Western blot after inducing expression of Chang cells with control virus (LacZ) or Smad7-adenovirus for 24 hours.
  • Figure 19 is a result of confirming expression of TM4SF5 by TGF ⁇ treatment using Western blot after inducing expression of Chang cells with control virus (LacZ) or Smad7-adenovirus for 24 hours.
  • FIG. 21 shows the results of TM4SF5 or TGFP expression in normal tissues and liver tissues according to CC1 4 treatment periods using immunohistochemical staining.
  • FIG. 22 shows the results of a -SMA expression and Erkl / 2 phosphorylation in normal tissues and liver tissues during CC1 4 treatment using immunohistochemical staining.
  • FIG. 23 shows that collagen staining experiments resulted in the accumulation of collagen 0 t I and fibrosis in normal tissues and liver tissues during CC1 4 treatment.
  • FIG. 25 shows Western blot expression levels of ⁇ -SMA by TGF
  • TSAHC TSAHC administration group
  • Hepatic injuries H & E staining
  • collagen type I expression by collecting liver tissue from CC1 4 administration group
  • CC1 4 -TSAHC group treated with TSAHC.
  • the degree Masson's Tr ichrome duator staining
  • the a -SMA expression level immunohistochemical staining
  • TSAHC TSAHC administration group
  • the liver tissue obtained by this method is stored frozen in liquid nitrogen, and the tissue is pulverized using a homogizer and extracted for 0.1% SDS (Sigma). Extraction was performed using a lysis buffer.
  • hepatic cancer cell lines Huh7, HepG2 and gastric cancer cell lines Huh7, HepG2 and gastric cancer cell lines
  • TM4SF5 promoter pBabe—galactosidase (Choi et al., 2009), in which the gen of the upstream promoter of TM4SF5 inserts a nic fragment of about 3 kb ahead of the TM4SF5 gene in the pGL3 luciferase vector (Pr omega) in SNU16mAd cells. , Blood 113: 1845-1855), and harvested 24 hours later to measure reporter gene luciferase activity. Infection efficiency was confirmed by measuring beta-galactosidase activity and quantified after normalization. As a result,
  • TM4SF5 is a const ruct having a promoter region of TM4SF5, so that transcription of TM4SF5 can be confirmed, whereas pGL3-basic is a construct without the promoter and thus corresponds to a control without transcription (FIG. 2).
  • pGL3-basic is a construct without the promoter and thus corresponds to a control without transcription (FIG. 2).
  • AML12 cells (US ATCC) and Chang cells (US human hepatocytes) ATCC was washed with serum-free DMEM and maintained serum-free for 4 hours. After serum star vat ion, TGF 3 (2.5ng / ml) was treated, incubated for 24 hours, and cell extracts were prepared.
  • TM4SF5 The protein expression of TM4SF5 in these extracts was increased by pSmad3 pSmad2 (Cel 1 Signaling Technology, Danver s, MA), vimentin (viment in, Sigma-Aldr i ch), E ⁇
  • the nucleotide sequence of the TM4SF5 antibody was constructed by constructing a pGEX-5X2 vector (Amersham) having the c-terminal region of the TM4SF5 (cut with EcoRl from amino acids 229 to 594).
  • a pGEX-5X2 vector Amersham
  • PBS containing 0.3% SDS and protease inhibitors were used, and after protein extraction, antigens were extracted from electrophoretic SDS gels and immunized with mice. After inducing immune response Obtained from the serum was tested for anti-immune male for recombinant protein and animal cell extracts.
  • vimantin antibody By using a vimantin antibody, the fluorescent glass stained cover glass was confirmed by fluorescence microscopy, and the expression of vimantin was higher than that of the control group treated with PBS (phosphate saline buffer) without TGF ⁇ treatment. , It was confirmed that EMT occurred by changing cells into a dispersed pattern (FIG. 3).
  • 3 was expressed as 0, 2.5, in Chang cells, normal human liver cells.
  • liver is known to activate hepatic stellate cells by external stimulation such as TGFP, and activated hepatic stellate cells secrete several cytokines to affect surrounding epithelial cells.
  • AML12 cells normal hepatocytes
  • LX2 cells Dr. Scott Friedman, Mount Sinai School of Medicine, NY.
  • Conditioned media of LX2 cells were cultured with LX2 cells containing 0.2% FBS for 12 hours or 24 hours, and treated with conditioned media on AML12 cells. Confirmation via Western blot.
  • Lysate protein extracted from the cells was quantified and used in the same amount, separated using 8-12% SDS gel, and then phospho-Y 1173 EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), phospho-Y 992 EGFR (Ce 11 Signaling Technology, Danver s, MA), EGFRCSant a Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), phospho-Erk, phospho Smad2, phospho ⁇ Smad3 (Cel 1 Signaling Technology, Danver s, MA), TM4SF5, and a -tubul in (Sigma-Aldrich) antibodies were used.
  • TM4SF5 expression was increased in AML12 cells by conditon ion-media of LX2 cells, and also accompanied by EGFR / Erk activation, it was confirmed that the EGFR signaling system was simultaneously activated (FIG. 6).
  • the AML12 cell line was grown in DMEM containing 10% FBS, washed with DMEM without serum and maintained without ser ⁇ for 4 hours, after serum starvation, and treated with TGF
  • phospho-Y 1173 EGFR (Sant a Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), phospho-Y EGFR (Ce 11 Signaling Technology, Danver s, MA), phospho-Erk (Cel 1 Signaling Technology, Danver s, MA), phospho ⁇ Smad2 (Cel 1 Signaling Technology, Danver s, MA), phosph Smad3 ( Using the Cel 1 Signaling Technology, Danver s, MA), TM4SF5, and a -tubul in (Sigma-Aldr i ch) antibodies, expression of TM4SF5 and EGFR signal transduction-related factors was confirmed using Western blot.
  • the AML12 cell line was grown in DMEM containing 10% FBS, washed with DMEM without serum, remained serum-free for 4 hours, and after serum starvation, TGFP (2.5ng / ml).
  • various inhibitors PD98059 MEK inhibitor, LC Laboratories, Woburn, MA
  • LY294002 PI3K inhibitor
  • PP2, PP3 sr c inhibitor, Tocris Cookson, Avonmouth, UK
  • Rapamyc inOn TOR inhibitor GF109203 (PKC inhibitor, Ca 1 biochem, San Diego, CA), AG1478 (EGFR inhibitor, LC Laboratories, Woburn, MA), U0126 (ERKl / 2 inhibitor, LC Laboratories, Woburn, MA), SP600125 (Jnk inhibitor), Y-27632 (R0CK inhibitor, Calbiochem, San Diego, Calif.), and confirmed the expression of TM4SF5, showed AG1478 within the range of the cell death (phospho-Y 397 FAK
  • the chang cell line was grown in DMEM containing 10% FBS, washed with DMEM without serum, maintained serum free for 4 hours, serum starvation, TGF
  • TGF 2.5ng / ml
  • EGF 50ng / ml
  • TM4SF5 expression was confirmed whether the expression of TM4SF5 is increased when the EGFR signaling system is directly activated by treatment with growth factors such as EGF.
  • the AML12 cell line was grown in DMEM containing 10% FBS, washed with DMEM without serum, maintained serum free for 4 hours, and then treated with TGF ⁇ (2.5ng / ml) after serum starvation 30 Minutes ago, EGF, HGF, PDGF (PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA) were treated to activate EGFR signaling. Then, after treatment with TGFP, it was incubated for 24 hours.
  • AML12 cell line is a normal hepatic cell line and therefore sensitive to serum, so experiments were performed even under serum-free treatment with ITS (Insul in, transferrin, selenium, Si gma-Aldrich) in order to prevent cells from dying. It can be regarded as the same condition.
  • TM4SF5 When treated with PDGF, it was confirmed that the expression of TM4SF5 was increased by EGFR signaling activation (FIG. 11). Therefore, it was found that the EGFR signaling system plays a major role in inducing the expression of TM4SF5 by TGF
  • AG1478 was used to investigate whether EGFR signaling system activity is involved in inducing TM4SF5 expression in ML12 cells by conditioned media of hepatic stellate cell line LX2 cells.
  • TM4SF5 is induced by activation of the EGFR signaling system following activation of receptor-regulated Smad (R-Smad) by TGFP.
  • R-Smad receptor-regulated Smad
  • experiments were performed to activate the TGFP signaling system using Smad2, Smad3 known as R_Smad, and Smad4 adenovirus known as common-mediator Smad (co-Smad), and the effects on the expression of EGFR signaling system and TM4SF5 were investigated.
  • Proteins in these cell extracts were quantified and Western blotting was performed using antibodies against phospho-Y 1173 EGFR, EGFR, FLAG (Ce 11 Signaling Technology, Danver s, MA), ⁇ ⁇ tubulin, and TM4SF5.
  • TM4SF5 was increased in the TGFp-dependent group in the group injected with Smad2 adenovirus, and the group injected with Smad3 adenovirus was not different from the group injected with the control virus. Therefore, it was confirmed that Smad2 is the main R-Smad related to TM4SF5 by TGF ⁇ .
  • Smad2, 3, 4, adenoviruses were infected with Chang cell lines, followed by serum starvation after 24 hours, and then treated with AG1478 1 hour before TGF
  • Western blotting was performed by quantifying the protein of the cell extract, and it was confirmed that the expression of TM4SF5 by TGF ⁇ was decreased in the group treated with Smad2 and Smad4 adenovirus by AG1478. could. Therefore, it was confirmed that EGFR signaling activation plays a role in the expression of TM4SF5 by TGFP (FIG. 14).
  • AML12 cells and Chang cells were detached from the cell culture vessel using 0.05% trypsin-EDTA, and then rolled (60 rpm) for 1 hour in a medium containing 1% BSA.
  • 3 (5 ng / ml) was treated 15 minutes before reseeding the cells in a cell culture vessel pre-coated with or with fibronectin. Cells in suspension to prevent them from sticking are in suspension, and cells reseeding in fibronectin-coated containers are reattached. After suspension or reseeding in a container, harvested in 12 hours and Western blot was performed to confirm the expression of TM4SF5.
  • TM4SF5 was expressed only in the case of fibronectin-coated, and when TM4SF5 was expressed by TGFP, it was dependent on the cell adhesion signal (FIG. 17).
  • Control viruses include LacZ adenovirus (Lee MS et al., Mol Cell Biol. 2005 Aug; 25 (16): 6921-36) were infected with Chang and AML12 cell lines, followed by serum starvation after 24 hours, TGFP treatment, and cell extracts obtained after 24 hours.
  • Control viruses include LacZ adenovirus (Lee MS et al., Mol Cel l).
  • Proteins from these cell extracts were quantified, phospho-EGFR o45 , phospho-EGFR Y992 , phospho-EGFR Y1173 , EGFR, phospho-Erk, Erk, phospho-Smad2, phospho-Smad3, phospho-Smad2 / 3, ⁇ ⁇ SMA, Western blotting was carried out using antibodies to aza tubul in, and TM4SF5.
  • TM4SF5 expression was decreased, and phosphorylation and EGFR phosphorylation of Smad2 increased with TGFP treatment,
  • TMGSF5 expression is induced by TGFP treatment, wherein EGFR phosphorylation, Erk phosphorylation,
  • TM4SF5 expression of TM4SF5 during liver disease such as liver fibrosis and cirrhosis
  • the purpose of this study was to evaluate the expression of TM4SF5 due to chronic liver injury through animal experiments in mice.
  • the rats were balb / c, 4 weeks old, and only 20g female rats were used. Sterile water and feed were provided, and the interior lamps were illuminated for 12 hours and flashed for 12 hours for the day and night biological cycle of rats.
  • the rats were divided into CC1 4 and ethanol administration groups, and 16 rats of each group were used.
  • the CC1 4 group received intraperitoneal administration of lmg / kg of 40% CC1 4 diluted in rib oil three times a week.
  • Ethane was orally administered with ethanol at 20% at 1 week, 30% at 3 weeks, 40% at 3 weeks, and 50% at 4 weeks, and regenerated by ether method for 4 weeks (1 control group, 3 experimental groups) every week. .
  • Liver tissues removed from these regenerative mice were incised for immunohistochemistry, and some were fixed with formaldehyde and then paraffinized.
  • the prepared 4-5 ⁇ -thick paraffin sections were fixed on slides and subjected to hematoxylin and eosin (H & E) staining and immunohistochemistry.
  • H & E hematoxylin and eosin staining and immunohistochemistry.
  • Masson's Trichrome staining was performed to confirm collagen synthesis. Masson's Trichrome staining was performed using a kit purchased from Sigma Aldrich, and the nuclei were stained by first reacting paraffin fragments fixed on the slide with Bouin's solution in a 1-kPa, Weiger t's Iron hematoxylin solution. Next, Biebrich Scarlet- After cytoplasmic staining with acid Fucshin, collagen Iol staining with line blue solution. Finally, by "permanent aqueous medium", the microscope observed at 100 and 400 X magnification.
  • Injected rat liver tissue contains nucleated masses and broken cytoplasm.
  • TM4SF5 In addition to the expression of TM4SF5, it was found that pERK, pEGFR Y1173 were activated using the antibodies of Example 3, and that a -SMA (antibody purchased from Sigma-Aldrich) was expressed. It was confirmed that it is expressed in the damaged area.
  • a -SMA antibody purchased from Sigma-Aldrich
  • TM4SF5 Of antagonists that inhibit the inducing phenomena in liver disease
  • TSAHC [4 '-(-toluenesulfonylamino) -4-hydroxychalcone] functions as an antagonist that specifically inhibits phenomena such as EMT in TM4SF5, and TSAHC TM4SF5 in the disease stage of liver fibrosis and cirrhosis. To see if it can be suppressed.
  • TGFp treatment was performed on normal hepatocytes, and TSAHC treatment was performed when TM4SF5 expression and EMT were induced.
  • normal hepatocytes were washed with DMEM without serum, maintained serum free for 4 hours, serum starvation, and then treated with TGFP to induce expression of TM4SF5.
  • TSAHC 5 or 10 ⁇ M After 18 hours of incubation with TSAHC 5 or 10 ⁇ M, the expression of ⁇ -SMA protein was confirmed.
  • the expression of a—SMA induced by TGFP was also significantly reduced by TSAHC treatment.
  • control drug (4'— am i ⁇ -4-hydroxycha 1 cone), which is similar in structure to TSAHC but substituted with different R groups, (4 ⁇ M, 10 ⁇ M) TM4SF5 and a ⁇ It did not appear to affect the expression of SMA (FIG. 25).
  • TM4SF5 by TGFP was induced to increase a -SMA expression, which indicates that epithelial cells were metastasized to mesenchymal cells, and it was confirmed that ⁇ -SMA expression was inhibited by TSAHC treatment.
  • EGFR / Erk phosphorylation was also reduced, leading to the expression of TM4SF5 by TGFP, which induces EMT and confirms that a-SMA expression by TGF ⁇ is inhibited by TSAHC treatment.
  • TSAHC an antagonist for TM4SF5
  • TSAHC Phosphorylation Inhibitor
  • the CC1 4 administration group was intraperitoneally administered 40% CC1 4 diluted in reeve oil at 1 mg / kg three times a week, with the CCU-ContComp group treated with 4'— Amino I 4_hydroxychalcone as a control compound (ContComp).
  • TSAHC as TM4SF5 protein inhibitor
  • ContComp black has TSAHC (each 50 mg / kG, 40% DMS0 ) 3 times per week oral treatment with the (Oral) or IP (intraper i toneal injection).
  • Paraffin specimens were prepared in the same manner as in Example 5, and 4-511 1 mm thick paraffin sections were fixed on the slides. Subsequently, using nuclear and cytoplasmic staining (H & E staining), Masson's Tr i chrome duator staining for collagen type I staining, and antibodies to ⁇ -SMA (smooth muscle act in, Sigma) to determine the degree of liver damage ( 1: 1500) immunihi st ochemi stry3 ⁇ 4-.
  • H & E staining nuclear and cytoplasmic staining
  • Masson's Tr i chrome duator staining for collagen type I staining
  • ⁇ -SMA smooth muscle act in, Sigma
  • ethane was administered.
  • the group (Vehicle) or TSAHC-only group showed normal liver and nuclear and cytoplasm staining through nuclear and cytoplasmic staining (H & E staining) .However, the group injected with CC1 4 was able to identify liver damage.
  • TM4SF5 protein In the CC1 4 -TSAHC group treated with TSAHC as an inhibitor, it was confirmed that the degree of liver damage was reduced during oral (oral) and IPC intraperi toneal injection. However, this change was not seen in the CCl 4 -ContComp group with CC1 4 treatment as a control compound (4'-Amino-4-hydroxychalcone).
  • Masson 1 s Tri chrome staining as in the expression of collagen type I caused by the treatment of 4 CC1 CC1 4
  • For oral -TSAHC group (Oral) and IP intraperitoneal injection were the expression of collagen I reduced both during processing In the CCU-ContComp group, this change was not observed, and ⁇ -SMA immunofluorescence staining also reduced the expression of a-SMA due to TSAHC treatment.
  • Decreased expression of a -SMA suggests a decrease in epithelial mesenchymal transition (EMT) of hepatocytes required for hepatic fibrosis.
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • mice from each group were randomly selected to quantify the protein of liver tissue extract, and then phospho-Y 1173 EGFR (Sant a Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), phospho-Y 1068 EGFR (Santa). Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), phosphate Ierk (Ce 11 Signaling Technology, Danver s, MA), Erk (Ce 11 Signaling Technology ; Danver s, MA, USA ), phosphate Smad3 (Ce 11 Signaling Technology, Danvers, MA), TM4SF5 (using the antibody of Example 1), a -SMA (smooth muscle act in, Sigma), phosphine S 10 ⁇ p27 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p27 (BD Transduct.
  • ⁇ -SMA which is one of the functions of TM4SF5 expressed, that is, the induction of epithel ia ⁇ mesenchymal transition (EMT), the induction of p27 expression and enhanced SerlC ⁇ phosphorylation in the liver tissues of TSAHC treated groups It was confirmed that the decrease significantly.
  • EMT epithel ia ⁇ mesenchymal transition
  • SerlC ⁇ phosphorylation in the liver tissues of TSAHC treated groups It was confirmed that the decrease significantly.
  • the control compound 4'-Amino-4-hydroxychalcone did not confirm the reduction of several phenomena due to CC1 4 -dependent TM4SF5 expression. That is, it was confirmed that the activity of TM4SF5 was inhibited by TSAHC.
  • TM4SF5 protein substances that inhibit the expression or activity of TM4SF5 protein, that is, substances that inhibit the expression and phosphorylation levels of TM4SF5 protein or signaling proteins related to TM4SF5 expression, inhibit liver damage and hepatic fibrosis. It suggests that it can be usefully used for treatment and prevention.

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Abstract

본 발명은 간 질환의 진단, 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, TM4SF5(Transmembrane 4 L six family member 5 또는 Four-Transmembrane L6 Superfamily member 5) 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 간 질환 진단용 키트, TM4SF5 단백질 수준 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 측정하여, 정상 대조군 시료와 비교하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법, 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법, 및 TM4SF5 단백질의 발현 또는 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화를 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 간 질환에 있어서, TM4SF5 발현 수준 측정 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 측정을 통해, 간질환의 진단 및 치료 물질의 스크리닝 등이 가능하며, 상기 TM4SF5에 대한 길항제를 이용하여 간 질환의 예방 및/또는 치료 또한 가능하다.

Description

【명세서 】
【발명의 명칭 】
간 질환의 진단， 치료 및 예방용 조성물 【기술분야 】
본 발명은 간 질환의 진단， 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로， 더욱 상세하게는， TM4SF5(Transmembrane 4 L six fami ly member 5 또는 Four -Transmembrane ᄂ 6 Super fami ly member 5) 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물 , 상기 조성물을 포함하는 간 질환 진단용 키트， TM4SF5 단백질 수준 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 측정하여 , 정상 대조군 시료와 비교하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법， 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법， 및 TM4SF5 단백질의 발현 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화를 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술 】
간은 우리 몸에서 지질 등의 대사 작용， 해독， 담즙의 배설， 각종 영양소의 저장， 조혈이나 혈액 웅고 및 순환 혈액량의 조절 등 많은 기능을 갖기 때문에 간에 장해가 발생하면 여러 가지 기능이 저하되며 최악의 경우에는 생명 유지가 곤란해질 정도로 매우 중요한 장기이다.
간의 기능을 보다 구체적으로 살펴보면 , 첫째 , 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물에서 흡수된 모든 영양소들이 간에서 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급되거나 저장된다. 둘째， 간은 약 2, 000여종의 효소， 알부민， 웅고 인자들의 혈청단백질 , 담즙산, 인지질， 콜레스테를 등의 지방 등을 합성하고 저장하며 분배하는 기능이 있다. 셋째， 해독 및 분해 기능으로서 약물 , 술， 독성물질 등을 해독시키므로 간세포가 손상되기 쉽고 따라서 약물성， 독성， 알코올성 간 질환 등이 흔히 발생하게 된다. 또한 각종 대사산물을 십이지장으로 배설하는 기능 및 면역기능이 있어 생명유지에 중요한 역할을 하고 있다.
간질환은 병이 생기는 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환， 약물 독성간질환, 지방간， 자가 면역성 간질환， 대사성 간질환 및 기타 간질환 등으로 구분된다. 간 질환은 초기에 자각증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에， 우리 나라뿐만 아니라 세계적으로도 사망원인의 수위를 차지하고 있어， 효과적인 진단 및 치료에 관한 연구가 필요하다.
간이 알코올， 바이러스， 여러 유해환경인자에 의해 자극을 받으면 간성상세포가 활성화되어 TGFP를 포함한 여러 사이토카인을 분비하는데， 특히， TGFP (transforming growth factor β )는 발생 , 발암 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다기능적 사이토카인이다ᅳ TGFp 신호전달계는 TGF|3에 의해 활성화된 TGFp 수용체가 세포 내 Smad2/3 단백질 등을 인산화 및 활성화시켜 Smad4와 결합한 후 핵 내로 이동함으로써 여러 관련 유전자의 전사를 일으키는 것으로 알려져 있다.
이렇게 분비된 TGFP는 콜라겐 합성을 촉진시켜 간 섬유화를 일으키고， 간성상세포 자신 뿐 아니라 주변의 간세포에도 영향을 주어 EMT( epi the 1 i a 1 to mesenchymal transition)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 계속되는 간섬유화증 (hepatic fibrosis)의 과정을 거쳐 결국은 간경변증이 유발되므로 간섬유화증의 과정을 이해하고 연구하는 것은 간경변을 유발할 수 있는 모든 질환을 해결하는데 가장 기본적인 단계라고 할 수 있다.
또한， 알코을성 간 손상은 알코을 자체 또는 대사과정에서 생기는 화합물에 의해 초래되며， 지질축적， 간세포 손상 및 섬유화증을 유발한다 . 알코올성， 만성 바이러스성 B, C, 만성 자가면역질환， 만성 담관성 질환， 만성심장질환， 기생층， 약물중독 등의 여러가지 원인에 의해 간세포 (hepatocytes)가 손상을 받으면 간세포， 쿠퍼세포 (Kupffer cell), 동모양 혈관 내피세포 (sinusoidal endothelial cell) 및 간성상세포 (hepat ic stellate eel 1 , HSC) 등 여러 세포들의 상호작용에 의해 각종 cytokines 및 oxygen free radical 등이 생성되고， 정상 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)이 손상을 받게되며， collagen I 및 III와 같은 ECM의 이상 증식이 유발되어 간섬유화증으로 진행된다. 일반적으로 간섬유화증은 간경변과는 달리 가역적 (reversible) 이고, 씬 피브릴 (thin fibril)로 구성되며， 결절 (nodule) 형성이 없는 것으로 알려져 있고 , 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있으나， 이러한 간섬유화증 과정이 반복적으로 지속되면 ECM 간의 크로스링킹 (crossl inking)이 증가하여 씨크 피브릴 (thick fibril)을 형성하고 결절 (nodule)이 있는 비가역적인 (irreversible) 간경변으로 진행된다. 콜라겐 ( co 11 agen)과 같은 ECM의 증가는 간섬유화증의 중요한 원인이 되고 여러가지 원인에 의해 활성화된 HSC 세포에 의해 주로 생성이 된다.
간섬유화가 더욱더 진행되어 간경변증 (Cirrhosis)가 일어나는 데 , 그 발병기전은 어떤 원인에 의해 간세포 괴사가 일어나면 간세포 재생과 섬유조직 증식이 있다. 이런 과정이 오랫동안 반복하여 지속될 때 간경변증이 생긴다 . 지속적 또는 반복적인 미만성 간실질 손상， 섬유조직 증식과 간세포재생에 의해 재생된 간 결절이나 결절로 형성된 간경변은 병리학적으로 괴사 (necrosis) , 염증 ( inf 1 a瞧 at i on) 및 섬유화 (fibrosis)에 이은 간경변이 수반되는 만성질환이며 궁극적으로 간암으로의 진행 및 사망에 이르게 된다.
한편， 테트라스패닌 (tetraspnins 또는 tetraspan)의 한 종류로도 알려져 있는 TM4SF5(Four-Transmembrane L6 Superfami ly member 5) 단백질은 비수용성의 단백질로서 세포막을 통과하는 4개의 영역과 세포밖에 존재하는 2개의 고리구조와 세포질 내에 존재하는 하나의 고리구조 및 2개의 말단구조를 가지고 있다. TM4SF5 단백질들은 인테그린 같은 세포부착 분자들과 복합체를 세포막에 형성하여 거대한 tetraspnin-web 혹은 tetraspanin-enriched microdomain(TERM)을 이루고 있어， 세포의 부착， 증식 그리고 이동 같은 다양한 생물학적 기능에 기여하고 있다. 이러한 TM4SF5는 사람의 간암세포에서 과발현되어 있는 것으로 알려져 있으며 , 세포질 내의 P27kipl 단백질의 축적과 그로 인한 RhoA 단백질의 활성 저해로 이어지는 과정을 통한 EMT 현상， 접촉생장저지 현상을 일으킴으로써 발암유전자로서의 기능을 나타낸다고 보고한 바 있다.
하지만， 아직까지 이러한 TM4SF5가 어떠한 신호전달과정을 통해 발현이 유도되는지 아직 보고된 바 없으며 , 간 섬유화， 간경화 등으로 진행되는 간 질병과 TM4SF5의 관련성에 관해서는 알려져 있지 않았다. 이에 본 발명자들은 간 질병 단계에서 TGFp가 TM4SF5의 발현올 유도하는 것을 확인하고, 이러한 TM4SF5가 간 질병의 진단 마커로 활용될 수 있고， TM4SF5에 대한 길항제가 간 질병의 치료 및 /또는 예방할 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명 】
【기술적 과제 】
본 발명의 목적은 TM4SF5( Transmembrane 4 L six family member 5 또는 Four -Transmembrane L6 Super f ami ly member 5) 단백질 수준 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 /또는 인산화 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물 및 상기 간 질환 진단용 조성물을 함유하는 간 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은
1) 간 질환 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터
TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 TM4SF5 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
1) TM4SF5 단백질올 발현하는 간 질환 세포에 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하지 않은 대조군과 비교하여 , TM4SF5 단백질의 발현이 저해되는 경우의 후보물질을 간 질질환환 치치료료 물물질질로로 선선택택하하는는 단계를 포함하는， 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
. 발명의 다른 목적은
1) CC14 등의 약물을 주사 혹은 섭취시키어 간질환 및 간 손상을 유도하 동물모델 구축하여 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하지 않은 대조군과 비교하여， TM4SF5의 발현에 의한 현상인 α SMA， w 멘틴， 세포골격- 중간섬， 스네일， 슬러그， Ε-카데린， Z()-l, 베타-카테닌， 데스모플락킨 클라우딘 , 및 콜라젠 (collagen)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 발현 수준이 변화하는 경우의 후보물질을 간 질환 치료 물질로 선택하는 단계를 포함하는， 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간 질환 진단용 조성물로 사용하기 위한 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간 질환 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 제공하는 것이다.
발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질올 간 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 치료방법을 제공하는 것이다
발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 예방방법을 제공하는 것이다 【기술적 해결방법 】
상기 목적을 달성하기 위하여，
본 발명은， TM4SF5( Transmembrane 4 L six fami ly member 5 또는 Four-Tr ansmembr ane L6 Super f ami ly member 5) 단백질 수준을 측정하는 물질 및 /또는 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물을 제공한다 .
본 발명은 또한， 상기 조성물을 포함하는 간 질환 진단용 키트를 제공한다 .
또한， 본 발명은
1) 간 질환 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터
TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 TM4SF5 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은
1) TM4SF5 단백질을 발현하는 간 질환 세포에 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하 않은 대조군과 비교하여， TM4SF5 단백질의 발현 0 저해되는 경우의 후보물질을 간 질환 치료 물질로 선택하는 단계 ί 포함하는 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) CC14 등의 약물을 주사 흑은 섭취시키어 간질환 및 간 손상을 유도하는 동물모델 구축하여 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하지 않은 대조군과 비교하여， TM4SF5의 발현에 의한 현상인 α -SMA, 비멘틴 , 세포골격- 중간섬， 스네일， 슬러그， E-카데린， Z0-1 , 베타-카테닌， 데스모플락킨，클라우딘， 및 콜라젠 (collagen)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 발현 수준이 변화하는 경우의 후보물질을 간 질환 치료 물질로 선택하는 단계를 포함하는， 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 간 질환 진단용 조성물로 사용하기 위한 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질을 제공한다.
또한， 본 발명은 간 질환 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 간 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 치료방법을 제공한다 .
아울러， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 예방방법을 제공한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한， 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로， 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다. 본 발명에 있어서 용어 "TM4SF5 단백질 "이란 Transmembrane 4 L six family member로 (Four Transmembrane L6 Super f ami ly member 5 또는 'L6H'라고도 함)， 세포막을 네 번 통과하는 막수용체 그룹인 테트라스패닌 (tetraspanin) , 테트라스판 ( t et r aspan) 혹은 Transmembrane 4 Super Fami ly(TM4SF) 에 속하는 한 종류이며， 상기 TM4SF transmembrane 4 super family) 단백질들은 세포막을 네 번 통과하는 서로 유사한 구조로 이루어져 있다 . 이는 생화학적으로 transmembrane ck)ma i n (막횡단영역 )으로 추정되는 네 개의 소수성 (hydrophobic) 부위를 포함하는 구조를 공유하고 있는데， 특히 이들 중 TM4SF5를 포함하는 Four-Transmembrane L6 Super fami ly(L6， TM4SF5, L6D, IL-TMP 포함)는 테트라스파닌 들 중 생화학적 기능은 잘 알려지지 않았다.
본 발명에서 용어， "예방 "이란 조성물의 투여로 간 기능 저하를 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어， "치료 "란 치료물질의 투여로 간 기능 및 성장이 회복되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어， "투여 ''는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 TM4SF5( Transmembrane 4 L six fami ly member 5 또는 Four -Transmembrane L6 Super f ami ly member 5) 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 간 질환 진단용 조성물로 사용하기 위한 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질을 제공한다.
상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드의 발현을 통해 수득하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 TM4SF5는 비수용성의 단백질로서 세포막을 통과하는 4개의 영역과 세포밖에 존재하는 2개의 고리구조와 세포질에 존재하는 2개의 말단구조를 가지고 있고 , 췌장암， 폐암， 위암, 직장암， 간암 등 여러 암세포에서 높게 발현된다고 알려져 있다 (Muller-Pi llasch, F. , et al . , Gene 208:25， 1998； Pascual-Le Tal lec, L. et al . , J Clin Endocrinol Me tab 87:501， 2002) .
상기 "간 질환"은 간의 기능 저하를 유발하는 모든 질환을 의미하고， 예컨대 , 바이러스 (예를 들어， A, B, C, D, 또는 E형 바이러스)， 알코올， 아플라톡신 (aplatoxin)， 약물 (결핵약， 아스피린， 항생제， 마취제， 고혈압 치료제， 경구피임제 등)， 선천적 대사이상 등에 의해 유발된다. 간 질환의 구체적인 예로는 만성적 간손상， 간섬유화증， 간경변증， 간염， 간암， 간경화, 알콜성 간질환 또는 지방간 등이 있다.
본 발명에서 유전자의 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 물질로는 TM4SF5 단백질에 대해 특이적으로 인식하여 결합하는 다클론 항체 , 단클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함한다. 여기서 , "항체 1 '란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기한 바와 같이 간 질환 진단 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 간 질환 마커 단백질로써 , TM4SF5 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소， 토끼， 양， 원승이， 말， 돼지， 쥐， 랫트 (rat), 소， 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (hybridoma method) (Kohler 및 Mi lstein(1976) European Jounr a 1 of Immunology 6:511-519 참조)， 또는 파지 항체 라이브러리 (CI ackson et al , Nature, 352:624-628, 1991； Marks et al , J. Mol . Biol . , 222:58, 1-597， 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다 . 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동， 투석， 염 침전 , 이온교환 크로마토그래피 , 친화성 크로마토그래피 등의 방법올 이용하여 분리 , 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 , Fab, F(ab'), F(ab' ) 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 , 간섬유화, 간경화， 간암 등으로 진행되는 간질병 단계에서 TGF|3가 TM4SF5(Transmembrane 4 L six family member 5 또는 Fourᅳ Transmembrane L6 Super f ami ly member 5)의 발현을 유도하는 것을 확인한 것으로， 구체적으로, 본 발명자들은 정상 간세포주에 TGF|3를 처리하면 Smad2/3의 인산화와 더불어 TM4SF5의 발현이 유도되며， 세포-세포간의 접촉이 소실되는 현상과， α -smooth muscle act in 발현이 증가되는 것으로 나타났고, 이때 EGFR 신호전달계가 활성화된다는 것을 확인하였다.
또한, 활성화된 간성상세포 (Hepatic Stellate Cells, HSC)로 알려진 LX2 세포주의 conditioned-media를 정상 간상피세포에 처리하였을 경우， EGFR 신호전달계의 활성화와 동반하여 TM4SF5의 발현이 유도되었으며， EGFR 저해제 처리에 의해서 TM4SF5의 발현이 저해되는 것이 확인되었다. 본 발명자들은 아울러 , CC14 흑은 알코을을 주기적으로 주사 혹은 경구투여하여 만성적 간손상 및 간 섬유화 등의 간 질환을 일으킨 쥐 동물모델에서 간 손상 및 염증에 따라 TM4SF5의 발현이 유도되는 것을 면역조직화학 검사를 통해 알 수 있었고， TM4SF5의 발현되는 곳이 TGFP가 발현되는 곳과 콜라겐이 염색된 부분에 일치하는 것으로써 간 손상 및 염증에 따른 간 섬유화 및 간경변의 간 질병 단계에서 TM4SF5가 관련됨을 확인하고， TM4SF5가 발현되는 간암세포에서 TM4SF5에 의한 발암효과를 상쇄시키는 것으로 보고된 화합물 TSAHC가 정상간세포에서 TGFP에 의한 TM4SF5의 발현에 따른 EMT 현상의 마커라 할 수 있는 α -SMA의 발현을 상쇄시킬 수 있음을 확인하하였고, CC14을 주기적으로 주사 흑은 경구투여하여 생긴 쥐동물모델에서의 간손상 및 간 섬유화 등이 확연하게 줄어들고 억제됨올 확인하였다.
이를 통해 , 본 발명에서는， 간암세포에서 과발현된 것으로 알려져 있는 TM4SF5가 TGFP에 의해 발현이 유도되는 것을 세포수준에서 막수용체간 상호작용을 통하여 EGFR의 활성에 의존적으로 이루어지는 것을 확인하고， 간손상에 따라 TM4SF5의 발현이 유도되는 것을 확인함으로써 ， TM4SF5의 발현이 만성적 간손상 및 간염증에 따른 간섬유화 및 간경변 등의 간질환 발병에도 중요한 역할을 할 수 있음을 확인한 것이다.
또한， 본 발명은 TGF- β 신호전달체계에 관여하고 있는 여러 단백질들을 추가적인 마커로써 이용하여， TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물을 제공한다.
예컨대， EMT(epithel ial一 mesenchymal transition, 상피一 중배엽세포 전이 )에 의해 발현이 증가하거나 감소하는 단백질들, 예를 들어， 증가하는 단백질들로써， a -SMA( a -smooth muscle act in) , 비맨틴 (viment in)， 세포골격-중간섬유 ( i nt ermed i at e filament), 스네일 (snail), 슬러그 (slug), 감소하는 단백질들로써， E-카데린 (E- cadher in) , Zo-l( t ight junction protein 1 Zo-1) , 버 1타一카테닌， 데스모플락킨 (desmoplakin), 클라우딘 (c 1 audin) 등과 같은 단백질들의 수준을 측정하는 물질을 더 포함할 수 있다.
또는， Smad2(mother s against decapentaplegic homo 1 og 2), Smad3(mother s against decapentaplegi c homo 1 og 3)， EGFR( epidermal growth factor receptor ) 및 Erkl/2(extracel lular signal-regulated kinase 1/2)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 인산화 수준을 측정하는 물질을 더 포함할 수 있다. 여기서， 상기 단백질들의 단백질 수준 또는 인산화 수준을 측정하는 물질이란， 이들 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것이다. 여기서의 항체도 앞서 언급한 바와 같이， 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한， 본 발명은 본 발명의 간 진단용 조성물올 함유하는 간 질환 진단용 키트를 제공한다 .
상기 간 질환은 간섬유화증， 간경변증， 간염， 알콜성 간질환 또는 지방간인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다 .
본 발명에 따른 진단용 키트는 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 제재를 포함하는 진단 키트일 수 있으며， 이때 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체이다. 따라서， 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 진단 키트는， 예컨대， ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트일 수 있으며， 이러한 키트는 "항원 -항체 복합체 "를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약， 예컨대， 표지된 2차 항체， 발색단 (chr이 nophores)， 효소 (예 : 항체와 접합) 및 그의 기질 등을 포함할 수도 있다. 또한， 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
아울러 , 상기 항원 -항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물， 리간드， 발광물， 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는 웨스턴 블롯， ELISA, 방사선면역분석 , 방사선 면역 확산법， 오우크테로니 면역확산법ᅳ 로케트 면역전기영동 , 조직면역 면역침전 분석법 보체 고정분석법， FACS, 단백질 ^ -E.이 있으나， 이들로 제한되 것은 아니다.
또한， 본 발명은
1) 간 질환 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 단계 ;
2) 상기 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 TM4SF5 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 간 질환 의심 환자로부터 분리된
시료로부터 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 단계는 상기
진단용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 통하여
것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 생물학적 시료는 조직 , 전혈， 혈청，또는 혈장인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 TM4SF5 단백질 수준과 비교하는 단계는 상기 시료 내 TM4SF5 단백질의 수준이 대조군에 비해 높은 것을 확인하는 단계를 이용함으로써 , 간 질환 진단의 정보를 제공하기 위한, TM4SF5의 검출 방법을 포함한 것이다. 이러한 방법들을 통해， 정상대조군에서의 TM4SF5 단백질 발현 수준과 간 질환 의심환자에서의 단백질 발현수준을 비교함으로써 , 간 질환의 실제 환자 여부를 진단할 수 있고， 나아가서는， 간 질환의 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있을 것이다.
상기 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 단계는 TM4SF5를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 상기 TM4SF5 단백질생이간수준을 물루 측정할 수 있으며 구체적으로， 웨스턴 블랏， ELISA, 방사선면역분석， 방사 면역확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동환느적」， 조직면역 염색， 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법， FACS 또는 단백질 칩 방법 등의 앞서 언급한 다양한 단백질 수준 측정방법을 이용하여 수행할 수 있다.
또한， 본 발명은
1) TM4SF5( Transmembrane 4 L six fami ly member 5 또는 Four— Transmembrane L6 Super f ami ly member 5) 단백질을 발현하는 간 질환 세포에 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하지 않은 대조군과 비교하여 , TM4SF5 단백질의 발현이 저해되는 경우의 후보물질을 간 질환 치료 물질로 선택하는 단계를 포함하는, 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다 .
상기 간 (질환 ) 세포는， TM4SF5 단백질을 발현하는 간 질환 세포라면 어떤 것이든 가능하며， 일 구체예로 , 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드로부터 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드를 발현하는 간 질환 세포를 의미하고， 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드를 발현하는 간 질환 세포는 예컨대， TM4SF5를 발현하는 SNU449 간암 세포주 (KCLB No. 00449) , Huh7, HepG2 세포주， 그 외에도 , CC14 또는 알코올 등에 의한 만성적 간 손상， 간염， 간섬유화， 간경변， 지방간 등과 관련된 간 질환의 세포 또는 인위적으로 제조한 간 질환 세포를 의미한다. 여기서 인위적으로 제조한 간 질환 세포는 유전자 조작을 포함하는 클론 기술에 의해 TM4SF5 단백질을 발현하는 세포를 들 수 있다.
상기 간 질환 세포에 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계에서， 후보 물질은 통상적인 선정방식에 따라 간 질환 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산， 펩타이드， 단백질， 항체， 기타 추출물 또는 천연물， 화합물 등이 될 수 있다. 바람직하게는， TM4SF5 단백질의 발현을 저해하는 화합물일 수 있다 .
본 발명에 있어서， 상기 스크리닝 방법에 따르면， 간 질환의 치료 또는 예방의 후보물질을 간 질환 세포 또는 조직 또는 기타 생물학적 시료에 처리하여 , TM4SF5 단백질 수준 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 측정함으로써， 간 질환 치료 또는 예방 물질을 선별할 수 있는데， 상기 후보물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여， TM4SF5 발현 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화를 저해하는 물질을 간 질환 치료 및 /또는 예방 물질로서 결정한다. 본 발명의 스크리닝 방법에서， 상기 물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질 , 단백질-화합물， 또는 상기 언급된 후보 물질로써 , 단백질-핵산， 펩타이드， 항체， 기타 추출물 또는 천연물 간의 반웅 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
또한， 본 발명은 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 간 질환 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 제공한다 .
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 간 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 치료방법을 제공한다.
아울러， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질올 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 예방방법을 제공한다 .
상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 간 질환은 간섬유화증， 간경변증， 간염， 알콜성 간질환 또는 지방간인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다 .
상기 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 4] ，및 [표 1]로 표시되는 설포닐-칼콘계 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 발현된 TM4SF5 단백질은 α-SMA의 발현， 즉 EMT(epi thel ia卜 mesenchymal transition)의 유도 및 p27의 발현 유도 및 p27의 SerlO의 인산화 향상과 같은 기능을 하며， 이에 TM4SF5 단백질의 활성 저하는 a -SMA의 발현 , 즉 EMT(ep i the 1 i al-mesenchymal transition)의 유도 감소, p27의 발현 유도 감소 및 p27의 SerlO의 인산화 수준 감소로 나타난다.
즉， 본 발명은 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하여 TM4SF5 단백질 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
【화학식 1】
Figure imgf000013_0001
상기 식에서，
！^은 R4S02- 이고;
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시기이고;
여기서 , 상기 R4는 CrC5의 알킬 또는 수소， 할로겐， 니트로 및 crc5의 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 갖는 C6~C10의 아릴이며， 바람직하게는 메틸 벤질， P-틀루일 , P- 니트로페닐 또는 P-플루오로페닐이다.
이 중에서 보다 바람직하게는,
【화학식 2】
Figure imgf000013_0002
상기 식에서， R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시기이고，
R4은 Ci - C5의 알킬 ; 또는 수소 , 할로겐， 니트로 및 d ~ C5의 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 갖는 C6 ~ Cl0의 아릴이다.
【화학식 3】 ，
상기 식에서，
Ri은 R4S02- 이고；
R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시기이고;
여기서， 상기 R4는 CrC5의 알킬 또는 수소， 할로겐 , 니트로 및 crc5의 알킬로 이루어지는 군/ᅳ 으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 갖는 C6~C10의 아릴이며， 바람직하게는 메틸 , 벤질， P-틀루일， p 니트로페닐 또는 P-플루오로페닐이다.
이 중에서 보다 바람직하게는,
【화학식 4】
Figure imgf000014_0001
상기 식에서， R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시기이¬며，¬표화활
R4은 d ~ C5의 알킬 ; 또는 수소， 할로겐， 니트로 및 d ~ 의 성합 C 15 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 갖는 C6i! pel! o! ~ C10의 아릴이다.
이와 같은 본 발명의 TM4SF5 단백질의 발현 또는
저해하는 물질은 항 간질환 물질로써， 더욱 바람직하게는 이하
기재하고 있는 칼콘계 화합물들이다. 표 1의 화합물들 중에서
1로 기재한 TSAHC[4' - (p-toluenesul fonylamino)-4-hydroxy chalcone]가 대표적인 화합물이다.
【표 1】
화합물 구조 화합물 구조
1 15
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
9ΐ
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
' -(P-틀루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘； ' -(P-를루엔설포닐아미노 )-3-하이드록시칼콘； 4' - (Ρ-를루엔설포닐아미노 )-2-하이드록시칼콘;
3' - (Ρ-를루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘；
2' - (Ρ-를루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘 ;
4' - (Ρ-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
4' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘
4' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘
3' - (Ρ-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
3' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3—하이드록시칼콘
3' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘
2' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
2' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘
2' - (Ρ-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘
4' - (m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
4' - (m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드톡시칼콘
4' - (m-하이드록시벤젠설포닐아미노)— 2-하이드록시칼콘
3' - (m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -4-하이드톡시칼콘
3' - (in-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘
3' - (m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘
2' - (m -하이드록시벤젠설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘
2' - (m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘
2' - (m -하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘
4' - (P-플루오로벤젠설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘 ;
4' - (m-플루오로벤젠설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘 ;
4' - 〔0-플루오로벤젠설포닐아미노 )-4-하이드특시칼콘 ;
4' - (P-니트로벤젠설포닐아미노 ) -4-하이드록시칼콘
4' - (m-니트로벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
4' - 〔0-니트로벤젠설포닐아미노) -4-하이드톡시칼콘
4' - (P-아미노벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
4' - (m-아미노벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
4' - 〔0-아미노벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘
4' - 〔벤젠설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘；
4' - 〔메탄설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘；
4' - -를루엔설포네이트) -4-하이드록시칼콘 ;
4' - -플루오로벤젠설포네이트) -4-하이드록시칼콘
4' - 플루오로벤젠설포네이트) -4-하이드록시칼콘
4' - ： P-니트로벤젠설포네이트 )-4-하이드톡시칼콘;
4' - ： P-아미노벤젠설포네이트) -4-하이드록시칼콘 ;
4' - 〔벤젠설포네이트 ) -4-하이드록시칼콘；
4' - 〔메탄설포네이트 ) -4—하이드록시칼콘；
4' - :p-를루엔설포닐아미노 )-3,4—디하이드록시칼콘
4' - ： P-틀루엔설포닐아미노 )-2，3-디하이드록시칼콘
4' - :p-를루엔설포닐아미노 )-2，4-디하이드록시칼콘
4' - 를루엔설포닐아미노 )-2 ,5-디하이드록시칼콘 ' (ρ-를루엔설포닐아미노) 디하 록시칼콘
' (Ρ-를루엔설포닐아미노) 디하 록시칼콘
' (p_ -하하이。 드록ᄉ 벤젠설포닐 노 4-디하이드
' (P- -하하이 o 드록入 벤젠설포닐 노 3-디하 0
' ᄋ 록入 벤젠설포닐 노
(P- -하 4-디하 o . Λ
' (P- -하 o 록入 벤젠설포닐 노 5-디하 o
' (P- -하 o 록入 벤젠설포닐 노 4-디하ᄋ
' (Ρ· -하 o 로로로로로록入 벤젠설포닐 노 3-디하 o
' ᄉᄉᄉᄉᄉ
(P- -하 o 록시벤젠설포닐 노 4一디하 o
' (P- -하 o 록시벤젠설포닐 노 5-디하 o
' (P. -하 o 록시벤젠설포닐 노 4-디하ᄋ
' (P. -하 o 벤젠설포닐 노 3-디하 o
' (P- -하 o 벤젠설포닐 노 4_디하ᄋ
' (P- -하ᄋ 벤젠설포닐 33ᄆ _ᄋᄋᄋ 0ᄋᄋᄋᄋᄋᄋᄋ 0ᄋᄋᄋ 0ᄋᄋᄋᄋᄋ 0ᄋᄆᄋᄋᄋ 0ᄋᄋ」」」
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1 , V Τ Ί Ί Τ Τ Τ 1111 Ί 11111 Ί 111 Ί 1 , 1 ,一 , , ,Γ 11 I IΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓ I I I I- )
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' (m- -하ᄋ 록入 벤젠설포닐 노 5-디하 o
' (m- -하ᄋ 록入' 벤젠설포닐 노 4"디하 o 록시칼콘 ' (m- -하ᄋ 록入 벤젠설포닐 노 3-디하 0 록시칼콘 ' (m- -하ᄋ 톡入 벤젠설포닐 노 4_디하ᄋ 록시칼콘 ' (m- -하 톡入 벤젠설포닐 노 5-디하 o 록시칼콘 로로로로로로로로로로로로
' (m- -하ᄋ 록入 벤젠설포닐 노 4ᅳ디하 o 로
록시칼콘 ᄉᄉᄉᄉ Λ Λ Λᄉ Λᄉᄉᄉ시 . ' (m- -하 ο 록入 벤젠설포닐 노 3-디하 o 록시 ¾칼 ¾ ¾ ¾칼칼 ¾ ¾칼칼칼 ¾ ¾ ¾칼칼콘 ' (m- -하ᄋ 록入 벤젠설포닐 노 4ᅳ디하 o 록시칼콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘콘 ' (m.하 ο 록入 벤젠설포닐 노 5-디하 o 록시칼콘 ' (Ρ-플루오로벤젠설포닐아 )-3 디하이드록시칼콘 ' (m-플루오로벤젠설포닐아 )-3 디하이드록시칼콘 ' (0-플루오로벤젠설포닐아 )-3 디하이드록시칼콘 ' (P-니트로벤젠설포닐아미 3,4 -디하이드록 A 칼콘 ' (m-니트로벤젠설포닐아미 3,4 -디하이드톡ᄉ 칼콘 ' (0-니트로벤젠설포닐아미 3,4 -디하이드톡 칼콘 ' (p-아미노벤젠설포닐아미 3,4 -디하이드록 칼콘 ' ᅵ (m-아미노벤젠설포닐아미 3,4 -디하이드록人칼콘 ' (0-아미노벤젠설포닐아미 3,4- -디하이드록 '칼콘 ' (벤젠설포닐아미노) -3,4- 록시칼콘 ;
' (메탄설포닐아미노) -3,4- 록시칼콘 ;
' (P-틀루엔벤젠설포닐아미 2-클로로 -4-하 o 드록시칼콘 ' (P-하이드록시벤젠설포네 )-4-하이드톡시칼
' (P-하이드록시벤젠설포네 )-3-하이드록시칼
' (P-하이드록시벤젠설포네 )-2 하이드록시칼
' (m-하이드록시벤젠설포네 )-4-하이드톡시칼
' (m-하이드록시벤젠설포네 )-3 하이드록시칼 4' -(m-하이 rr록시벤젠설포네이ᄐ ) -2- -하이드록시칸코 ,
4' -(P-하이 ττ록시벤젠설포네이 ) -3 4—디하이 록시칼콘
4' -(P- -하이 r:록시벤젠설포네이 ) -2 3—디하이 τ 록시칼콘
4' -(P-하이 xz록시벤젠설포네이트 ) r
-2 4-디하이 :록시칼콘
τη
4' -(P-하이 rr록시벤젠설포네이트 ) -2 5-디하이 록시칼콘
4' -(m-하이 r:록시벤젠설포네이ᄐ ) -3 4-디하이 tr톡시칼콘
4' -(m-하이 tr록시벤젠설포네이ᄐ ) -2 3-디하이 tr록시칼콘
4' _(m一하이 τ 록시벤젠설포네이트 ) -2 4-디하이 tr록시칼콘
4' -(m-하이 ττ록시벤젠설포네이ᄐ ) -2 5-디하이 록시칼콘 한국공개특허 10-2003-0036993호에는 칼콘계 화합물이 기저막 성분을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테아제 (Matrix metalloproteinase, 丽 P)의 활성을 저해하는 성질을 갖고 있음을 기재하고 있으나， 칼콘계 화합물의 간 질환 치료 또는 예방 기능에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않을 뿐만 아니라 본 발명의 상기 화학식 1 내지 4로 표시되는 칼콘계 화합물은 그 구조상 설폰기 (S03-) 또는 설폰아미드기 (S02NH-)를 함유하고 있는 것을 특징으로 하고 있다 즉， 칼콘계 화합물의 TM4SF5에 대한 항 간 활성 (기능)은 상기 설폰기 (S03— )로부터 비롯되는 것이다.
본 발명의 실시예에서는 이 중 대표적인 화합물인 TSAHC[4'-(p- toluenesul f ony 1 amino)-4-hydroxy chalcone] (표 1의 1번 화합물 )를 사용하여 CC14에 의한 생쥐의 간손상 및 간섬유화에 필요한 간세포들의 EMT 및 콜라젠의 합성 및 축적이 감소됨을 확인함으로써 ， 간 질환 억제， 치료 또는 예방 기능을 확인하였다.
상기 칼콘계 화합물들은 TM4SF5에 의한 현상들을 특이적으로 저해하는 길항제로 기능한다.
대한민국특허 10-0934706호에 나타난 바와 같이， TM4SF5가 발현되는 세포주에， 상기 TSAHC를 포함하는 칼콘계 화합물들 중에 하나 이상을 처리하면， 계속적인 생장곡선이 칼콘계 화합물의 농도， 처리 시간에 따라 의존적으로 감소하고， 세포주기 S기로의 진입 , 및 세포간의 접촉이 되살아나는 반면， 본 발명의 칼콘계 화합물 약물의 효과는 TM4SF5가 발현되지 않는 세포에서는 전혀 효과가 없는 것으로 나타났다 . 게다가 , TM4SF5에 의한 p27kipl, pS10p27kipl, pY577FAK의 발현 정도 및 mesenchymal 세포의 마커인 a -SMA 또는 비멘틴의 발현에 있어서도, 상기 칼콘계 화합물에 의해 효과적으로 감소하도록 함으로써 , EMT(epithel ial to mesenchymal transit ion)-ir 억게하고， TM4SF5가 발현된 SNU449세포주인 SNU449Tp 세포주에 본 발명의 칼콘계 화합물을 처리하면 세포질에 존재하는 p27kipl이 더 이상 안정화되지 못하고 감소한다 .
본 발명에 따른 상기 칼콘계 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태인 칼콘 유도체의 형태로 사용할 수 있다.
상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 즉, 상기 칼콘 유도체는 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는
초목투투활 r
산진부적여여택가염으로 형성될 수 있다. 유리산으로는 무기산과 유기산을
에용제제될
사용할 수 있으며 ， 무기산으로는 염산， 브롬산， 황산， 인산， 등을
사용할 수 있고， 유기산으로는 구연산， 초산， 젖산， 말레산， 푸마린산
글루콘산 , 메탄설폰산， 아세트산 , 글리콘산， 석신산， 타타르산， 4- 를루엔설폰산, 칼룩투론산， 엘본산， 글루탐산 또는 아스파르트산등을
사용할 수 있다. 바람직하게는, 무기산으로는 염산， 유기산으로는
메탄설폰산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 칼콘 유도체는 약학적으로 허용
가능한 염 뿐만 아니라， 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염，
수화물， 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
임상적 사용올 위해， 본 발명에 따른 상기 칼콘계 화합물 또는
그들의 염 형태 등은 단독으로 투여될 수 있으나， 부형제， 결합제，
붕해제 , 코팅 물질， 유화제 , 현탁제， 용매， 안정화제 , 흡수
및 /또는 연고 기재를 흔합함으로써 특정 사용 및 바람직한
왁위
적당하도톡 제형화된 약제학적 흔합물의 형태로 일반적으로
스해
수 있다. 상기 흔합물은 경구용, 주사용, 직장용 또는 외용
사용될 수 있다.
상세하게는， 앞서 언급한 바와 같 o 상기 칼콘계 화합물
또는 그들의 염을 함유하는 간 질환 치치료료 또는 예방용 조성물은
경구적으로 투여될 수 있으며 , 예를 들어， 정제 코팅 정거 1，
드라지 (dragees)， 경질 또는 연질젤라틴 캡슐제， 액제， 유화제 또는
현탁제 같은 제형일 수 있다. 투여는 또한 직장으로 투여， 예를 들어，
좌제를 사용하여 투여될 수 있으며 ; 국소적 또는 경피적담약연경으로 투여，
예를 들어， 연고 크림， 겔 또는 액제로 사용하여 투여될 수체제질질 있으며 ;
i학
또는 비경구적으로 투여 예를 들어， 주사용 용액을 사용하여 투여될¬¬분와젤적젤
수 있다. 라으또라함
정게， 코팅 정제， 드라지 (dragees)， 경질 또는 로틴께는틴
캡슬제의 제조를 위해， 본 발명의 칼콘계 화합물은
불활성인 무기 또는 유기 부형제 (약제학적으로 허용되는
흔합될 수 있다. 정제 , 코팅 정제， 드라지 (dragees)，
캡슐제에 적당한 부형제의 예에는 락토오즈, 메이즈 (maize)
그들의 유도체 , 탈크 또는 스테아르산 또는 그들의 염들이이 포함된다.
연질 젤라틴 캡슐제에 사용되는 적당한 부형제에는 예를 들어 식물성
오일， 왁스， 지방， 반 -고형 (semi-solid) 또는 액체 폴리을 등이
포함된다. 그러나 활성 성분의 성질에 따라 연질 젤라틴 캡슐제에
어떠한 부형제도 필요하지 않는 경우가 있을 수 있다. 액제 및
시럽제의 제조를 위해， 사용될 수 있는 부형제에는 예를 들어， 물，
폴리올， 사카로오즈， 전화당 (invert sugar) 및 글루코오즈가 포함된
다. 주사용 용액의 제조를 위해 , 사용될 수 있는 부형제는 예를
들어，물 알코을 , 폴리올， 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다. 좌제
및 국소 또는 경피 적용용의 제조를 사용될 수 있는 부형제에는
예를 들어， 천연 오일 또는 경화유， ᄌ 바 H 반 -고형 또는 액체
폴리을이 포함된다. 상기 간 질환 치료 또는 예방용 조성물은 또한 보존제， 용해제 , 안정화제 , 습윤제， 유화제， 감미제 , 색소, 방향제， 삼투압 조절용 염 , 완층제， 코팅제 또는 항산화제를 포함할 수 있고， 그들은 또한 다른 치료학적으로 가치있는 약제를 포함할 수도 있다.
결과적으로， 경구 투여용 약제학적 제형은 과립제， 정제， 당 코팅 정제， 캡슐제， 환제 (pill), 현탁제 또는 유화제일 수 있으며， 비경구용 제형으로 예를 들어， 정맥내 , 근육내 또는 피하 제형용으로는 멸균 수용액의 제형이 사용될 수 있으며 이는 등장성용액을 만들기 위하여 다른 물질 예를 들어， 염들 또는 글루코오즈를 포함할 수 있다. 또한 좌제 또는 페서리 (pessary)의 제형으로 투여될 수 있으며， 또는 로션 , 용액， 크림， 연고 또는 더스팅 파우더 (dusting powder)의 형태로 외용적으로 적용될 수 있다. 본 발명의 칼콘계 화합물 1일 용량 수준은 경구 또는 비경구용으로 투여될 때 5 내지 2000 mg이다. 1 회 투여 또는 적절한 2 회 이상의 분할투여가 가능하다. 그러나， 실제 투여량은 투여 경로， 환자의 연령， 성별 및 체중， 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며， 따라서， 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 조성물 투여에 의하여 간염， 간섬유화 , 간경화 및 지방간 등의 질환 뿐만 아니라 이에 의해 유발되는 증상 (symptom) 또는 합병증 (complication)을 예방 및 치료할 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명은 간 질환에 있어서 , TM4SF5 발현 수준 측정 및 / TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준 측 통해， 간 질환의 진단 및 치료 물질의 스크리닝 등이 가능하며 , 또상정 TM4SF5의 발현을 억제하거나 TM4SF5 대한 길항제를 이용하여 는을기간 질환의 예방 및 /또는 치료 또한 가능하다. 【도면의 간단한 설명 】
도 1 내지 도 4는 TGF|3에 의해 TM4SF5가 발현되고, EMT 현상이 일어남을 확인한 것으로， 도 1은 사람의 정상 간 조직 및 간암 조직에서의 Smad 인산화 및 TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이디-.
도 2는 Huh7, HepG2 및 SNU16mAd 세포에 TGF|3 처리에 따른，
TM4SF5 프로모터의 전사 활성을 루시퍼라제 리포터 유전자 어세이를 이용하여 확인한 결과이다.
도 3은 AML12 세포에 TGFP 처리에 따른， Smad3 및 Smad2의 인산화 정도 및 비멘틴 , E-카데린 , TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과 및 비멘틴 항체를 이용한 형광 면역 염색을 통해 TGF|3 처리에 의해 세포가 분산된 패턴으로 바뀌며 비멘틴의 발현이 높아진 것을 확인한 결과이다.
도 4는 Chang 세포에 처리에 따른， Smad3 및 Smad2의 인산화 정도 및 ci -SMA 및 TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 증가함을 확인하고， 광학현미경 관찰을 통해 세포가 분산된 패턴을 확인한 결과이다.
도 5는 Chang세포에 TGF|3 농도별로 처리하고， Chang 세포 내 TM4SF5의 발현이 Smad2/3의 인산화， EGFR의 Tyrll73의 인산화，
Erkl/2의 인산화가 함께 증가함을 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다ᅳ
도 6는 AML12세포에 TGFp 농도별로 처리하고， 활성화된 간성상세포로 알려진 LX2 세포의 conditioned-media 처리 (12 시간 및 24 시간)에 의한 AML12 세포 내 TM4SF5의 발현이 증가함을 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 7은 AML12 세포에서 TGFp 처리에 따른 TM4SF5의 발현 정도 및 세포 모양의 변화가 EGFR 억제제인 AG1478 를 처리함으로써 억제됨을 확인한 결과이다.
도 8은 AML12 세포에 여러 가지 저해제를 처리하여 TM4SF5의 발현 여부를 웨스턴 블럿을 이용하여 비교한 결과이다.
도 9는 Chang 세포에 TGFP , EGF의 서로 다른 시간동안 처리에 따른 TM4SF5의 발현과 phospho-Y1173 EGFR의 증가를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 10은 EGF의 서로 다른 농도로 4시간 동안 처리에 따른
TM4SF5의 발현과 phospho-Y1173 EGFR, phospho—Erkl/2의 증가를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 11은 AML12 세포에서 TGFP ， EGF, HGF , PDGF 처리에 따른 TM4SF5의 발현 증가를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 12는 AML12세포에 활성화된 간성상세포로 알려진 LX2 세포의 conditioned-media 처리 (CM, 24 시간)를 DMS0 혹은 EGFR kinase 억제제 AG1478 100 nM) 처리를 동시에 한 후， ML12 세포 내 conditioned-media 처리에 의한 TM4SF5의 발현 증가가 AG1478처리에 의해 증가하지 못함을 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 13은 Chang세포에 Smad2, Smad3, 혹은 Smad4를 아데노바이러스로 24시간 감염시켜 과발현을 유도한 후, TGFP 처리에 따른 TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다. 도 14는 Chang세포에 Smad2， Smad3, 혹은 Smad4를 아데노바이러스로 24시간 감염시켜 과발현을 유도한 후， AG1478이 처리 및 미처리시 TGFP 처리에 따른 TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 15는 Chang세포를 40C에서 TGFP 처리에 따른 TM4SF5의 발현 및 phospho-Y1173 EGFR 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 16은 Chang 세포에 cycloheximide를 처리하고 안하고하는 경우에 Smad4를 아데노바이러스로 24시간 감염시켜 과발현을 유도한 후， TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다. 도 17는 AML12 세포 및 Chang 세포를 suspension 상태로 둔 경우 및 피브로넥틴 코팅 용기에 reseeding한 경우의 TGF β처리에 따른 TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다. 도 18은 Chang세포에 대조군 바이러스 (LacZ) 혹은 Smad7- 아데노바이러스를 24시간 감염시켜 발현을 유도 한 후， TGF β처리에 따른 TM4SF5의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다. 도 19는 AML12세포에 대조군 바이러스 (LacZ) 혹은 Smad7- 아데노바이러스를 24시간 감염시켜 발현을 유도 한 후， TGFP처리에 따른 TM4SF5의 발현 phospho-Y1173EGFR, Smad2/3의 인산화， phopsho- Erkl/2, 및 α -SMA의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 결과이다.
도 20은 정상 쥐와 CC14로 처리한 쥐의 간 조직을 H&E 염색을 통해 간 손상이 일어난 것을 확인한 결과이다.
도 21은 면역조직화학 염색법을 이용하여 정상 조직과 CC14 처리기간에 따른 간 조직의 TM4SF5 또는 TGFP의 발현 결과를 확인한 결과이다.
도 22는 면역조직화학 염색법을 이용하여 정상 조직과 CC14 처리기간에 따른 간 조직의 a -SMA 발현 정도 및 Erkl/2의 인산화정도를 확인한 결과이다.
도 23은 콜라겐 염색 실험을 통하여 정상 조직과 CC14 처리기간에 따른 간 조직의 콜라겐 타0 t I의 축적 부위와 섬유화가 유발된 것을 확인한 결과이다.
도 24는 정상 조직과 만성적 알코을 섭취 또는 CC14 처리기간에 따른 간 조직의 TM4SF5의 발현 정도， phospho-Y1173 EGFR 및 Smad2의 인산화 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 25는 AML12 세포에서 TSAH (：， 4 '-아미노 -5-히드록시칼콘 화합물의 처리에 따른， TGF|3에 의한 α -SMA 의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 26은 Chang 세포에서， TSAHC, 4 ' -(p-아미노벤젠설폰아미드) - 4_히드록시칼콘, 4，4-디히드록시칼콘 화합물의 처리에 따른 TGFP - 매개 비멘틴의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 27는 AML12 세포에서 TSAHC, 4 ' -(p-아미노벤젠설폰아미드) -
4-히 L록시칼콘， 4'，4-디히드록시칼콘 화합물의 처리에 따른 TGFP - 매개 비멘틴의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 28은 에탄올 투여 그룹 (Vehicle), TSAHC 투여 그룹 (TSAHC),
CC14 투여 그룹， Control compound로서 4 ' _Amino_4_hydroxychal cone를 함께 처리한 CCl4-ContComp 그룹 및 TSAHC를 함께 처리한 CC14-TSAHC 그룹의 간 조직을 채취하여 간 손상 정도 (H&E 염색 )， collagen type I 발현 정도 (Masson's Tr ichrome duator 염색 ) 및 a -SMA 발현 정도 (면역조직화학 염색 )을 확인한 결과이다.
도 29은 에탄을 투여 그룹 (Vehicle), TSAHC 투여 그룹 (TSAHC),
CCI4 투여 그룹， Control compound로서 4 '—Amino—4—hydroxychal cone를 함께 처리한 CCl4-ContComp 그룹 및 TSAHC를 함께 처리한 CC14-TSAHC 그룹의 간 조직을 채취하여 Smad3의 인산화， EGFR/Erk의 인산화 및 활성화, TM4SF5 및 α -SMA 발현정도 등을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태 】
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> TGFP에 의한 TM4SF5의 발현 유도와 EMT 현상 확인
TGFP 신호전달계와 TM4SF5 단백질간의 연관성에 관해 알아보고자， 다음과 같은 방법으로 정상 간조직 및 간암조직으로부터 추출액을 얻었다.
정상 간조직과 간암조직은 경북대학병원의 환자로부터 2007년
3월에서 4월 사이에 얻었으며， 이러한 방법으로 얻은 간조직은 액체질소에 얼려져 보관되며， 파쇄기 (homogehizer)를 이용하여 조직을 작게 분쇄한 후， 0.1% SDS(Sigma)를 포함하는 추출용 완층용액 (lysis buffer)를 이용하여 추출하였다.
TGFp 신호전달계인 Smad2/3와 TM4SF5에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행함으로써， 이들 단백질의 발현 및 인산화를 확인한 결과， 간암 조직에서 TM4SF5가 과발현되고， 시그널링인 Smad2/3의 인산화가 향상됨을 확인할 수 있었다 (도 1). 따라서 , TM4SF5의 발현이 TGF|3와 상호관련이 있음을 알 수 있었다. 또한， 간성상세포 (Hepatic Stellate Cells, HSC) 및 간상피세포의 EMT에 관여하여， 간질환 초기에 주역할을 하는 것으로 알려진 TGFP가 간암조직에서 과발현되는 TM4SF5의 발현올 유도하는지를 알아보기 위하여， TM4SF5의 프로모터를 루시퍼라제 리포터 유전자 어세이를 통하여 수행하였다.
구체적으로ᅳ 간암세포주인 Huh7, HepG2 및 위암세포주인
SNU16mAd 세포에 pGL3 루시퍼레이즈 백터 (Pr omega)에 TM4SF5 유전자의 약 3kb 앞서는 (-3kb) TM4SF5의 upstream 프로모터의 gen이 nic fragment를 삽입한 pGL3-human TM4SF5 프로모터， pBabe— galactosidase(Choi et al . , 2009, Blood 113： 1845-1855)를 형질감염 시킨 후， 24시간 후에 harvest하여 리포터 유전자 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 감염 효율은 베타-갈락토시다제 활성 측정을 통해 확인하였고， 표준화 (normalization) 한 후 정량화하였다. 그 결과，
TGF|3에 의해 TM4SF5의 프로모터 부위에 transcriptional 활성이 높아지는 것을 확인하여， TM4SF5의 전사가 활성화되어 일어나는 것을 알 수 있었다. pGL-basic의 경우， pGL3-TM4SF5의 control로써 ， pGL3-
TM4SF5는 TM4SF5의 프로모터 부위를 지니는 const ruct이므로， TM4SF5의 전사를 확인할 수 있는 반면， pGL3-basic은 그 프로모터가 없는 construct이므로 전사가 일어나지 않는 대조군에 해당한다 (도 2). 또한， 10% FBS 함유된 DMEM에서 배양한 쥐의 정상간세포주인
AML12 세포 (미국 ATCC)와 사람의 정상간세포주인 Chang 세포 (미국 ATCC)를 혈청 (serum)이 없는 DMEM으로 씻어준 후， 4시간 동안 혈청 (serum)이 없는 상태를 유지하였다. serum star vat ion후， TGF 3 (2.5ng/ml )를 처리하고， 24시간동안 배양한 후 , 세포 추출액올 준비하였다.
이러한 추출액의 TM4SF5의 단백질 발현이 증가되는 것을 pSmad3 pSmad2(Cel 1 Signaling Technology, Danver s , MA) , 비맨틴 (viment in， Sigma-Aldr i ch) , E ^|"데린 (E_cadher i n， Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , 및 TM4SF5(Sin_Ae Lee et al. , J. Clin. Invest . 2008 Apr; 118(4) :1354-66)에 대한 항체를 이용하여 면역블롯팅 실험 및 면역형광염색법을 통해 확인하여 서로의 관련성을 확인하였다. TM4SF5 항체는 TM4SF5의 c-말단 부위 (아미노산 229에서 594번까지 EcoRl을 이용하여 절단)를 가진 pGEX-5X2 백터 (Amersham)를 제작하여 그 염기서열을 확인하였다. DH5a 박테리아로부터 IPTG로 유도된 재조합 단백질을 얻기 위해 0.3 % SDS와 단백질분해효소 저해제가 들어있는 PBS를 이용하였다. 단백질 추출 후， 전기 영동된 SDS 젤로부터 항원을 추출하여 생쥐에게 면역하였다. 총 세 차례의 면역반웅을 유도한 후 생쥐로부터 혈청을 얻어 재조합 단백질과 동물세포 추출물에 대한 면역 반웅성을 검사하였다.
그 결과， 도 3 내지 도 5에 나타난 바와 같이， AML12 세포에 TGF|3 처리시에， TM4SF5의 발현이 증가됨을 확인하였으며， 뿐만 아니라， E-카데린 (E-cadherin) 감소와 a -SMA와 비멘틴 (viment in)의 증가로 EMT(epithel ia卜 mesenchymal transition) 현상이 일어남을 알 수 있었다. 면역블롯팅에서는 세포 -세포 접촉에 중요한 E-카데린의 발현이 낮아지는 반면 , 중간엽 (mesenchymal ) 세포의 마커인 비멘틴의 발현이 높아지며， 형광염색법으로 확인시에， 세포 내 단백질의 형광 면역 염색을 위해， 세포들을 미리 피브로넥틴 (10 g/ml)으로 코팅된 커버글라스 위에 을리고， 앞선 방법과 같이 TGFP를 처리하였다. 비맨틴 항체를 이용하여， 형광 면역 염색이 이루어진 커버글라스를 형광현미경을 이용하여 확인한 결과， TGF β를 처리하지 않고， vehicle로 PBS(phosphate saline buffer)를 처리한 대조군에 비해 비맨틴의 발현이 높아지고， 세포가 분산된 패턴으로 바뀌어 EMT가 일어나는 것으로 확인되었다 (도 3) .
또한 사람의 정상 간세포주인 chang 세포에 TGFP처리한 후， 면역 블롯팅을 수행하여 TM4SF5의 발현이 유도됨을 확인하고 , 세포의 모양을 비교해 볼 때 , TGFp를 처리하지 않고 vehicle로 PBS(phosphate sal ine buffer)를 처리한 대조군에 비해 세포-세포간의 접착이 약해지고 모양이 길어지는 EMT 현상이 유도되고, mesenchyma 1 세포의 또 다른 마커인 α -SMA의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 4) .
아울러， 사람의 정상간세포주인 Chang 세포에 TGF|3를 0， 2.5,
5 ng/ml의 농도별로 처리한 후， 면역블롯팅을 수행한 결과에서도 , TM4SF5의 단백질의 발현이 TGF13 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라， phospho-Y1173EGFR(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA) , EGFR(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , phospho-Erk , phosph으 Smad2 , phospho一 Smad3(Cel 1 Signaling Technology, Danver s , MA) , 및 a -tubul in(Si ma-Aldrich) 항체를 이용하여， EGFR 신호전달계가 활성화되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).
<실시예 2> 간성상세포의 conditioned-media 에 의한 TM4SF5의 발현 확인
생체 내에서 간은 TGFP와 같은 외부 자극에 의해 간성상세포가 활성화되고， 활성화된 간성상세포가 여러 사이토카인을 분비함으로써 주변의 간상피세포에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 활성화상태 간성상세포주인 LX2 세포 (Dr. Scott Friedman, Mount Sinai School of Medicine, NY)를 키운 배지 (condi t ioned一 media)를 정상간세포주인 ALM12 세포에 처리함으로써， AML12 세포에 미치는 영향을 조사하였다.
간성상세포 세포주인 LX2 세포의 conditioned medi a는 LX2 세포를 0.2% FBS가 함유된 상태에서 12시간 또는 24시간 동안 배양한 배지로 이 conditioned media를 AML12 세포에 처리하고 24시간 후에， TM4SF5의 발현을 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 세포로부터 추출한 용해물의 단백질은 정량화하여 동일한 양을 사용하였으며， 8 - 12% SDS gel을 사용하여 분리한 후, phospho-Y1173EGFR(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA) , phospho-Y992EGFR(Ce 11 Signaling Technology, Danver s , MA) , EGFRCSant a Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA) , phospho-Erk , phosph으 Smad2， phosphoᅳ Smad3(Cel 1 Signaling Technology, Danver s , MA), TM4SF5 , 및 a -tubul in(Sigma- Aldrich) 항체들을 이용하였다.
그 결과， LX2 세포의 condi t ioned-media에 의해 AML12 세포 내에 TM4SF5의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었고， 또한 EGFR/Erk 활성화를 동반하므로， EGFR 신호전달계가 동시에 활성화되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 6) .
<실시예 3> TGFP에 의한 TM4SF5의 발현에서 EGFR 신호전달계의 활성화의 역할 확인
(1) TGF|3에 의한 TM4SF5의 발현 유도에 있어， EGFR 신호전달계의 역할을 알아보기 위해 EGFR의 저해제인 AG1478을 이용하여 조사하였다.
AML12 세포주를 10% FBS 함유 DMEM에서 키우고 , serum이 들어있지 않은 DMEM으로 씻어낸 후， 4시간 동안 ser蘭이 없는 상태를 유지하여， serum starvation 한 후， TGF|3 (2.5ng/ml )를 처리하기 30분전에， DMS0(control vehicle)과 AG1478(100nM)를 첨가하여 EGFR 시그널링을 억제시켰다. 그리고， TGFP (R&D systems, Minneapolis, MN USA)를 처리한 다음， 24시간 동안 배양하였다.
phospho-Y1173EGFR(Sant a Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA) , phospho-Y EGFR(Ce 11 Signaling Technology, Danver s , MA) , phospho- Erk(Cel 1 Signaling Technology, Danver s , MA) , phospho一 Smad2(Cel 1 Signaling Technology, Danver s , MA) , phosph으 Smad3(Cel 1 Signaling Technology, Danver s , MA), TM4SF5 , 및 a -tubul in(Sigma-Aldr i ch) 항체들을 이용하여， TM4SF5 및 EGFR 신호 전달계 관련 인자들의 발현 여부를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인하였다.
그 결과， 도 7에 나타난 바와 같이， AG1478 처리군의 경우 , TGFP에 의한 TM4SF5의 발현이 감소됨올 확인할 수 있었고， 광학 현미경 관찰을 통한 세포 사진을 통해서도 TGF|3 처리에 의해 세포- 세포간의 접촉이 사라지는 EMT 현상이 나타나는 반면， EGFR 저해제인 AG1478 X Laboratories, Woburn, MA, USA)를 처리할 경우， 세포- 세포간의 접촉이 유지되어 , TGFP에 의한 세포의 흩어짐이 AG1478에 의해 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 , TGF|3를 처리하여 TM4SF5가 발현 유도될 때 EGFR의 저해는 TM4SF5의 발현을 억제하는 것을 확인함으로써 , TGFP에 의한 TM4SF5의 발현유도에 EGFR의 활성화가 필요함을 확인하였다.
(2) 또한， AML12 세포주를 10% FBS 함유 DMEM에서 키우고 , serum이 들어있지 않은 DMEM으로 씻어낸 후， 4시간 동안 serum이 없는 상태를 유지하여， serum starvation 한 후， TGFP (2.5ng/ml )를 처리하기 30분전에， AML12 세포에 여러가지 저해제 PD98059(MEK inhibitor , LC Laboratories , Woburn, MA) , LY294002(PI3K inhibitor) , PP2 , PP3( sr c inhibitor, Tocris Cookson , Avonmouth , UK) , Rapamyc inOn TOR inhibitor) , GF109203(PKC inhibitor, Ca 1 b i ochem , San Diego, CA) , AG1478(EGFR inhibitor , LC Laboratories, Woburn, MA) , U0126(ERKl/2 inhibitor , LC Laboratories, Woburn, MA) , SP600125(Jnk inhibitor) , Y-27632(R0CK inhibitor , Calbiochem, San Diego, CA)를 처리하여 , TM4SF5 발현 여부를 확인한 결과 , 세포가 죽지않는 범위 내 (phospho-Y397 FAK가 높게 유지되어 있는 조건 )에서 AG1478에 의해 TM4SF5의 발현이 저해되는 것을 확인하였다 (도 8) .
(3) TGFp에 의한 TM4SF5의 발현유도에 있어 , TGFP와 EGF를 처리하여 TM4SF5의 발현에서의 역할을 확인하였다.
chang 세포주를 10% FBS 함유 DMEM에서 키우고， serum이 들어있지 않은 DMEM으로 씻어낸 후， 4시간 동안 serum이 없는 상태를 유지하여， serum starvation 한 후, TGF|3 (2.5ng/ml )와 EGF(50ng/ml)를 처리한 다음， 0, 0.5 1 2 24 시간 동안 배양하여 , TM4SF5의 발현여부와 EGFR 신호전달계를 확인한 결과， TGFP 처리군의 경우， 30분에서 24시간까지 지속적으로 EGFR 신호전달계의 활성화와 TM4SF5의 발현이 유도되는 것을 확인할 수 있었고， EGF 처리군에서는 일시적인 EGFR 신호전달계의 활성화와 TM4SF5의 발현을 확인할 수 있었다 (도 9) . EGF를 단독으로 4시간 동안 농도별로 처리한 실험에서도 EGF 만으로는 EGFR 신호전달계의 활성화와 TM4SF5의 발현 여부가 크게 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 10) . 그러므로, TGFP에 의한 EGFR 신호전달계의 지속적인 활성화가 TM4SF5의 발현유도에 주역할을 하는 것을 알 수 있었다.
(4) TGFp에 의한 TM4SF5의 발현 유도에 있어， EGF 등의 생장인자들의 처리에 의해 , EGFR 신호전달계를 직접 활성화시킨 경우， TM4SF5의 발현이 증가하는지 여부를 확인하였다.
AML12 세포주를 10% FBS 함유 DMEM에서 키우고， serum이 들어있지 않은 DMEM으로 씻어낸 후， 4시간 동안 serum이 없는 상태를 유지하여， serum starvation 한 후， TGF β (2.5ng/ml )를 처리하기 30분전에， EGF, HGF, PDGF(PeproTech , Inc. , Rocky Hi l l , NJ , USA)를 처리하여 EGFR 시그널링을 활성화시켰다. 그리고， TGFP를 처리한 다음 , 24시간 동안 배양하였다. AML12 세포주는 정상간세포주로 serum에 민감하므로 세포가 죽지 않는 상황을 만들기 위해 serum이 없는 상태에서 ITS( Insul in, transferrin, selenium, Si gma- Aldrich)를 처리한 조건에서도 실험을 수행하였으며， 이는 serum free 조건과 동일하다고 볼 수 있다.
TM4SF5의 발현 여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과， EGF, HGF,
PDGF를 처리한 경우， EGFR 시그널링 활성화에 의해， TM4SF5의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 11) . 그러므로， EGFR 신호 전달계가 TGF|3에 의한 TM4SF5의 발현유도에 주역할을 하는 것을 알 수 있었다.
(5) 또한， 간성상세포 세포주인 LX2 세포의 conditioned media에 의한 ML12 세포 내에 TM4SF5의 발현 유도에 있어， EGFR 신호전달계의 활성이 관여하는지 알아보기 위해 AG1478을 이용하여 조사하였다.
수집한 LX2 세포의 conditioned media를 AML12 세포에 처리하기 1시간 전에， AG1478 100 nM)를 첨가하여 EGFR의 kinase 활성을 억제하여 EGFR 시그널링을 억제시켰다. 그리고 AML12 세포에 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였다.
그 결과, AG1478에 의해 EGFR 시그널링이 억제됨으로써 TM4SF5의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었고， EGFR 신호전달계가 TM4SF5의 발현유도에 주역할을 하는 것을 알 수 있었다 (도 12) .
(6) 그러나， AG1478을 통한 EGFR의 활성화 저해가 TM4SF5의 발현을 억제하지만， TGF]3 시그널링인 Smad2의 활성화에는 영향을 주지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로， TGFP에 의한 receptor-regulated Smad(R-Smad)의 활성화에 따른 EGFR 신호전달계의 활성화에 의해 TM4SF5의 발현이 유도되는 것을 예측할 수 있다. 다음으로 R_Smad로 알려진 Smad2, Smad3와 common-mediator Smad(co- Smad)로 알려진 Smad4 아데노 바이러스를 이용해 TGFP 신호전달계를 활성화시키는 실험을 수행하여， EGFR 신호전달계와 TM4SF5의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
TGFP 신호전달계를 활성화시키기 위해， Smad2, 3， 4， 아데노바이러스 (Lee MS et al . , Mol Cel l Biol . 2005 Aug;25( 16) :6921-36)를 Chang 세포주에 감염시킨 후， 24 시간 후에 serum starvation 과정을 거친 후， TGFP를 24 시간 처리한 후에 세포추출액을 얻었다. Control virus로는 LacZ 아데노바이러스 (Lee MS et al. , Mol Cel l Biol . 2005 Aug;25(16) :6921-36)를 사용하였다.
이러한 세포 추출액의 단백질을 정량화하여， phospho-Y1173EGFR, EGFR , FLAG(Ce 11 Signaling Technology, Danver s , MA) , α一 tubulin, 및 TM4SF5에 대한 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 그 결과 , Smad2 아데노바이러스를 주입한 군에서 TGFp 의존적으로 TM4SF5의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, Smad3 아데노바이러스를 주입한 군은 control 바이러스를 주입한 군과 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 그러므로 Smad2가 TGF β에 의한 TM4SF5에 관련된 주 R-Smad 임을 확인하였다. Smad4 아데노바이러스 주입한 군에서는 Smad4의 과발현에 의해 TM4SF5의 발현이 높아지는 것을 확인하였고， TGFp에 의해 TM4SF5의 발현이 더욱 증가하며， EGFR 신호전달계의 활성화가 관여함을 확인하였다 (도 13) .
뿐만 아니라， Smad2, 3， 4， 아데노바이러스를 Chang 세포주에 감염시킨 후, 24시간 후에 serum starvation 과정을 거친 후, TGF|3를 처리하기 1시간전 AG1478을 처리하여 EGFR 시그널링을 억제시켰다. 그리고， TGFP를 처리한 다음, 24시간 후에 세포추출액의 단백질을 정량화 하여 웨스턴 블럿팅올 수행한 결과， AG1478에 의해 Smad2와 Smad4 아데노바이러스를 처리한 군에서 TGF β에 의한 TM4SF5의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로， TGFP에 의한 TM4SF5의 발현에 EGFR 신호전달 활성화가 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다 (도 14) .
(7) 또한, TGFP에 의한 TM4SF5의 발현에 관여하는 EGFR 활성화가 internal i zed EGFR의 recycling 혹은 traff icking과 관련있는 지 알아보기 위해， 다음 실험을 수행하였다.
Smad4 아데노바이러스를 Chang 세포주에 감염시킨 후， 24 시간 후에 serum starvation 과정을 거친 후， TGF|3를 처리하고， 4°C에서 24 시간동안 배양함으로써 internalized EGFR의 recycling 혹은 trafficking을 저해하였다.
그 결과， Sniad4 아데노 바이러스를 주입한 군에서 TGF β를 처리하고 4°C에서 배양했을 경우에도 EGFR의 발현증가 없이 EGFR 시그널링의 활성화와 TM4SF5의 발현이 조금은 유도되는 것을 확인하였다 (도 15) . 그러므로 , TGF|3에 의한 TM4SF5의 발현에 관여하는 EGFR 활성화에 internal ized EGFR의 recycl ing은 관여하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
(8) 또한 , Smad4 아데노 바이러스에 의한 TM4SF5의 발현증가가
Smad4에 의한 EGFR의 단백질 합성에 의한 것인지 알아보기 위해 , 단백질합성 저해제인 cycloheximide(Sigma)를 이용하여 조사하였다.
Smad4 아데노바이러스를 Chang 세포주에 감염시킨 후， 24시간 후에 serum starvation 과정을 거친 후, cycloheximideClOO g/ml)를 처리하여 새로운 단백질의 합성을 저해하였다. 그리고, 24시간 후에 세포추출액의 단백질을 정량화 하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
그 결과， Smad4 아데노 바이러스를 주입한군과 control virus를 주입한 대조군에서 EGFR의 발현은 비슷하지만, Smad4 의 발현에 의해 EGFR 시그널링의 활성화가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로， Smad4 과발현에 의한 EGFR 신호전달계의 활성화에 EGFR의 합성은 관여하지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 16).
(9) 또한， AML12 세포와 Chang 세포를 0.05% trypsin-EDTA를 사용하여 세포배양용기에서 떼어내어 1% BSA가 포함된 배지에서 1시간동안 rolling(60 rpm) 시킨 후， 세포가 붙지 않는 suspension 상태에 두거나 피브로넥틴을 미리 코팅한 세포배양용기에 세포를 reseeding하기 15분전에 TGF|3 (5 ng/ml )를 처리하였다. 세포가 붙지 못하도록 suspension 상태에 둔 세포는 suspension 상태이고 , 피브로넥틴 (Sigma)이 코팅된 용기에 reseeding한 세포는 재부착하게 된다 . suspension 상태로 두거나 용기에 reseeding 한 후， 12시간만에 harvest하여 웨스턴블랏을 수행하여 TM4SF5의 발현을 확인하였다.
그 결과, 피브로넥틴 코팅된 경우에서만 TM4SF5가 발현됨을 확인함으로써， TGFP에 의해 TM4SF5가 발현될 때 , 세포부착신호에 의존적임을 확인하였다 (도 17) .
<실시예 4> Inhibi tory-Smad에 의한 TGFP 신호전달계 억제에 따른 TM4SF5의 발현 변화 확인
상기 실시예들에서는， TGF β에 의한 EGFR 신호전달계의 활성화에 따른 TM4SF5의 발현을 확인하였다. 다음으로， Inhibitory-
Smad로 알려진 Smad7 아데노바이러스를 이용한 TGFP 신호전달계를 억제시키는 실험을 수행하였다.
TGF|3 신호전달계를 저해하기 위해， Smad7 아데노바이러스 (Lee
MS et al. , Mol Cell Biol . 2005 Aug ; 25( 16) : 6921-36)를 Chang 세포주와 AML12 세포주에 감염시킨 후, 24시간 후에 serum starvation 과정을 거친 후 , TGFP를 처리하고， 24시간 후에 세포추출액을 얻었다 . control virus로는 LacZ 아데노바이러스 (Lee MS et al . , Mol Cel l
Biol . 2005 Aug;25(16) :6921— 36)를 사용하였다 .
이러한 세포 추출액의 단백질을 정량화하여， phospho-EGFR o45, phospho-EGFRY992, phospho-EGFRY1173 , EGFR, phospho-Erk, Erk, phospho-Smad2 , phospho-Smad3 , phospho-Smad2/3 , αᅳ SMA, aᅳ tubul in, 및 TM4SF5에 대한 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
그 결과， 도 18에 나타난 바와 같이， Chang 세포주의 경우，
Smad7 아데노바이러스 주입 발현에 의해 TM4SF5의 발현이 감소되고， Smad2의 인산화 및 EGFR 인산화도 TGFP 처리에 따라 증가한 후，
Smad7에 의해 감소되는 것으로 나타났다.
AML12 세포주의 경우， 도 19에 나타난 바와 같이， TGFP처리에 의해 TM4SF5가 발현 유도되며 , 이때 EGFR의 인산화 , Erk의 인산화，
Smad2/3의 인산화가 동반되며， 중간엽 (mesenchymal ) 세포의 마커인 α -SMA 발현이 증가하여， EMT가 일어났음을 알 수 있었다. 그러나,
Smad7 에 의해 smad2/3, EGFR, Erk 들의 인산화가 감소되고， TM4SF5의 발현이 감소되는 것 뿐만 아니라， 다시 α -SMA 발현이 감소되는 것올 확인할 수 있었다. 그 결과， TGF β에 의한 TM4SF5의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었고， EGFR 신호전달계 또한 비활성화되는 것을 알 수 있었다 (도 18 및 도 19). 이러한 결과로부터， TGF|3에 의한 Smad 단백질의 활성화와 EGFR 신호전달계의 활성화를 통해 TM4SF5의 발현이 유도되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5> 간섬유화 및 간경변 등의 간질병 과정에서의 TM4SF5의 발현 확인
쥐를 이용한 동물 실험을 통해 만성적 간손상에 따른 TM4SF5의 발현 여부를 알아보고자 하였다.
쥐는 balb/c로， 생후 4주， 체증 약 20g의 암컷 쥐만을 사용하였다. 멸균된 물과 사료를 공급하였고 , 쥐의 주야간 생물학적 주기를 위하여 실내등을 12시간은 조영하고， 12시간은 점멸하였다. 쥐는 CC14와 에탄올 투여 그룹으로 나누고， 각 그룹당 16 마리의 쥐를 사용하였다. CC14 그룹은 일주일에 세 번씩 을리브 오일에 희석시킨 40% CC14를 lmg/kg으로 복강 투여하였고， 1주일 단위로
4마리씩 (대조군 1마리， 실험군 3마리 ) 4주동안 에테르 방법으로 회생하였다.
에탄을 그룹은 1주째 20% 2주째 30% 3주째 40%, 4주째 50%의 에탄올을 구강 투여 하였고， 일주일 단위로 4마리씩 (대조군 1마리， 실험군 3마리 ) 4주동안 에테르 방법으로 회생하였다.
이렇게 회생시킨 쥐에서 떼어낸 간 조직은 면역조직화학 검사를 위해 절개한 후, 일부는 포름알데히드로 고정한 후 파라핀 표본으로 만들었다. 준비된 4-5 μ ιη 두께의 파라핀 절편은 슬라이드에 고정시킨 후 H&E( hematoxylin and eosin) 염색과 면역조직화학검사를 시행하였다. 자일렌 (xylene)을 이용한 탈파라핀 과정과 탈수과정 (100%> 90 > 80%> 70% 에탄을)을 거친 후 , 10mM 시트레이트 버퍼 (pH 6.0)에 넣고 10분간 끓여 항원 복구 (antigen retrieval)을 시켜주었다. 상온에서 식힌 슬라이드는 과산화수소 ？ Λ 함유 메탄을 (hydrogen peroxide in methanol)에 10분간 담가두어 내부 퍼옥시다제 (endogenous peroxidase)를 퀀칭 (quenching) 入 1키고， 6% 말 혈청 (normal horse serum)으로 30분간 블로킹하였다. TM4SF5에 대한 항체 (Sin-Ae Lee et al. , J. Clin. Invest. , 2008 Apr .； 118(4)： 1354- 66)는 4°C에 하룻밤 동안 반웅시키고， 바이오티닐화된 2차 항체 (토끼 항체에 대한 이차 항체， Calbiochem, San Diego, CA)와 ABC 용액 (Vector Lab, USA)에 각각 상온에서 1시간 반웅시킨 후 3,3- 디아미노벤지딘 크로모젠 & 기질 버퍼 (DAB)로 반웅올 확인하였다. 헤마토자일린을 이용한 대조염색 후， 마운팅 (permanet aqueous medium)하여 현미경으로 100X 및 400X의 배율로 관찰하였다.
또한 , 콜라겐 합성여부를 확인하기 위하여 Masson's Trichrome 염색을 시행하였다. Masson's Trichrome 염색은 Sigma Aldrich에서 구입한 kit를 사용하였으며，먼저 슬라이드에 고정시킨 파라핀 절편을 Bouin's solution에 반웅入 1킨 早， Weiger t ' s Iron hematoxylin solution에 반응시켜 핵을 염색하였다. 그 다음, Biebrich Scarlet- acid Fucshin을 이용하여 세포질을 염색한 후 , line blue solution을 이용하여 콜라겐 I올 염색하였다. 마지막으로 미"운팅 (permanent aqueous medium)하여 현미경으로 100 및 400 X의 배율로 관찰하였다.
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이， 핵과 세포질
염색 )을 통해 균일하게 핵과 세포질이 염색된 정상간과 달리
주입한 쥐의 간 조직은 핵들이 뭉쳐있고 세포질이 망가져 있는
간 손상이 일어난 것을 확인할 수 있었다 (도 20).
또한， 도 21 및 도 22에 나타난 바와 같이， 면역조직화학염색법을 수행하여 , 간손상에 따라 TGFP의 분비，
TM4SF5의 발현 뿐만 아니라, 실시예 3의 항체들을 이용하여 pERK, pEGFRY1173이 활성화되고， a -SMA(Sigma-Aldrich에서 항체 구매 )가 발현되는 것을 알 수 있었으며， 상기 발현이 서로 유사하게 관련하여 간 손상된 지역에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
도 23에서는， 콜라겐 염색 실험을 통해 간 손상된 부분은， 콜라겐이 많이 합성된 것으로 섬유화가 유발된 것을 알 수 있었다. 콜라겐 I의 발현 양상이 TGFp ， TM4SF5, a -SMA가 발현되는 곳과 일치하는 것을 확인함으로써 , 간 질병과정에서 TM4SF5가 관여함을 예측할 수 있었다.
또한， 간 손상에 따른 쥐 간 조직 추출시 일부는 액체질소에 바로 얼려 보관하며 , 파쇄기 (homogehi zer)를 이용하여 조직을 작게 분쇄한 후， 라이시스버퍼 (lysis buffer)를 이용하여 추출하였다. 추출한 용해물은 정량화하여 같은 양의 단백질을 사용하였고， 8~12¾ SDS gel을 이용하여 분리한 후, pSmad2, TM4SF5, a -tubul in 항체를 이용하여 면역블롯팅 실험을 수행한 결과, 도 24에 나타난 바와 같이， 색것 8 CC14의 처리 경우에서 대조군에 대비하여 TM4SF5의 발현 증가으 ^^와 더불어 TGFP 신호전달계인 Stnad의 활성화와 EGFR 신호전달계가를로 활성화되는 것을 확인하였다 <실시예 6> TM4SF5가 유도하는 현상을 저해하는 길항제의 간 질환에서의 작용 확인
본 발명자들은 TSAHC [4'-( -toluenesulfonylamino)-4- hydroxychalcone]가 TM4SF5에 EMT 등의 현상들을 특이적으로 저해하는 길항제로 기능한다는 점에 착안하여 , TSAHC가 간섬유화 및 간경변의 질병단계에서 TM4SF5를 조절하여 그 기능을 억제시킬 수 있는지 알아보았다.
먼저， 정상간세포주에 TGFp를 처리하여 , TM4SF5의 발현과 EMT를 유도할 때， TSAHC를 처리하는 실험을 수행하였다. 앞선 실험과 같이 , 정상간세포주를 serum이 들어있지 않은 DMEM으로 씻어낸 후， 4시간 동안 serum이 없는 상태를 유지하여 , serum starvation 한 후， TGFP를 처리하여 TM4SF5의 발현을 유도하였고， 6 시간 후에 TSAHC 5 혹은 10 μ Μ를 처리하여 18 시간 배양 후， α-SMA 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과， 도 25에 나타난 바와 같이 , TSAHC 처리에 따라， TGFP에 의해 유도되는 a— SMA의 발현 또한 현저하게 감소되는 것으로 나타났다. 비교 실험으로， TSAHC와 구조가 거의 유사하나 서로 다른 R기로 치환된 control 약물 (4 '— am i ηο-4-hydroxycha 1 cone )에서는 같은 농도조건 하에서 (5μ Μ, 10 μ M) TM4SF5와 a -SMA의 발현에 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다 (도 25).
뿐만 아니라， 수용성 유도체인 4'-( - aminobenzenesu 1 f onam i de ) -4-hydroxycha 1 cone(ASAHC)을 동일한 방법으로 5， 10 μ Μ를 AML12 및 Chang 세포주에 처리하였을 경우， TSAHC의 경우처럼 mesenchymal 세포의 marker인 vimentin이 단순히 TGFP 1을 처리한 경우보다 낮은 정도를 보여줌으로써， ASAHC 또한 TGFP 1의 처리에 따른 TM4SF5의 발현으로 인한 EMT의 현상으로 vimentin이 증가되는 것을 억제함을 알 수 있었다 (도 26 및 27). 하지만， 또 다른 control 화합물로서 , 4' ,4—dihydroxychalcone의 처리에 의해서는 TGFP I에 의한 vimentin의 발현에 크게 영향을 주지 않음으로써 , TSAHC와 ASAHC와는 달리 TM4SF5와는 무관할 것으로 추정되었다 (도 26 및 27).
이를 통해， TGFP에 의한 TM4SF5의 발현이 유도되어 a -SMA 발현이 증가하고 이는 상피세포가 중간엽 (mesenchymal ) 세포로 전이된 것을 알 수 있었으며， TSAHC 처리하여 α -SMA 발현이 저해됨을 확인하였다. 동시에 EGFR/Erk의 인산화도 동반되어 감소함으로써， TGFP에 의해 TM4SF5가 발현유도되며 , 이는 EMT를 유도하고 TSAHC 처리에 의해 TGF β에 의한 a -SMA 발현이 저해됨올 확인하였다.
이러한 결과들로 미루어 보아 TM4SF5에 대해 길항제로 작용하는 TSAHC가 간암을 포함하여， 전반적인 간의 손상， 간섬유화， 간경변에 중요한 역할을 할 것으로 보이는 TM4SF5에 의한 신호전달 단백질들의 혹상험 발현 및 인산화 기능올 막는 것으로서， 간질환을 억제할 수 있은을을는 약물의 후보물질이 될 수 있음을 확인하였다. <실시예 7> TM4SF5 단백질 발현 및 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 저해 물질 (TSAHC)의 간손상 및 간섬유화 억제 효과 확인
쥐를 이용한 동물 실험을 통해 TM4SF5 단백질의 발현
TM4SF5 발현에 따른 신호전달을 저해하는 물질이 간 질환의 손 감소 또는 예방할 수 있는지 확인하기 위하여， 다음의 실 수행하였다.
생후 5주 된 쥐는 Balb/c 쥐 (n=5)를 사용하였으며， 멸균된 물과 사료를 공급하였고， 쥐의 주야간 생물학적 주기를 위하여 실내등을 12시간은 조영하고， 12시간은 점멸하였으며 , 2주 동안 에탄올 혹은 CCI4를 투여하였다. CC14 투여 그룹은 일주일에 세 번씩 을리브 오일에 희석시킨 40% CC14를 1 mg/kg으로 복강투여하였는데， Control compound(ContComp)로서 4'— Amino一 4_hydroxychalcone를 함께 처리한 CCU-ContComp 그룹과 TM4SF5 단백질 저해 물질로서 TSAHC를 함께 처리한 CC14-TSAHC 그룹의 경우， 격일로 CC14를 처리한 다음날, ContComp 흑은 TSAHC (각각 50 mg/kG, 40% DMS0)를 처리하여 1주일에 3번씩 경구 (Oral) 혹은 IP( intraper i toneal injection) 처리되도록 하였다.
2주간의 처리 후， ether 방법으로 회생시킨 다음， 회생시킨 각 그룹의 쥐로부터 간을 채취한 다음， 실시예 5와 마찬가지로 파라핀 표본으로 만든 후, 4-511 1Ή 두께의 파라핀 절편은 슬라이드에 고정시킨 후， 간 손상 정도를 확인하기 위한 핵과 세포질 염색 (H&E 염색 )， collagen type I 염색을 위한 Masson ' s Tr i chrome duator 염색 및 α - SMA(smooth muscle act in, Sigma)에 대한 항체를 이용하여 (1:1500) immunihi st ochemi stry¾- 수행하였다.
그 결과， 도 28에 나타난 바와 같이 , H&E 염색 결과 대조군으로서 에탄을 투여 그룹 (Vehicle), TSAHC 만을 투여한 그룹 (TSAHC) 및 CC14만을 투여한 그룹 (CC14)를 관찰한 경우， 에탄을 투여 그룹 (Vehicle) 또는 TSAHC 만을 투여한 그룹은 핵과 세포질 염색 (H&E 염색 )을 통해 균일하게 핵과 세포질이 염색된 정상적인 간의 모습을 보였으나 CC14를 주입한 그룹의 경우 간 손상올 확인할 수 있었으며， TM4SF5 단백질 저해 물질로서 TSAHC를 함께 처리한 CC14- TSAHC 그룹의 경우 경구 (Oral) 및 IPC intraper i toneal injection) 처리 시 모두 간 손상의 정도가 감소함을 확인할 수 있었다. 그러나， CC14 처리一의존적인 현상이 control compound인 (4 '—Amino— 4— hydroxychalcone)을 함께 투여한 CCl4-ContComp 그룹에서는 이러한 변화가 보이지 않았다.
아울러， Masson1 s Tri chrome 염색 결과， 마찬가지로 CC14의 처리로 인한 collagen type I의 발현이 CC14-TSAHC 그룹의 경우 경구 (Oral) 및 IP intraperitoneal injection) 처리 시 모두 콜라겐 I의 발현정도가 감소하였으며 , CCU-ContComp 그룹에서는 이러한 변화가 보이지 않음을 관찰할 수 있었으며， α-SMA 면역형광염색 결과 역시 TSAHC의 처리로 인하여 a-SMA의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. a -SMA의 발현이 감소는 곧 간섬유화에 필요한 간세포들의 EMT(epi thel ia卜 mesenchymal transition)이 감소하였음을 시사한다. 추가적으로， 상기 각 그룹으로부터 두 마리의 쥐를 임의로 선택하여 채취한 간의 조직 추출액의 단백질을 정량화한 다음， phospho-Y1173EGFR( Sant a Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA) , phospho-Y1068EGFR(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , EGFR(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA) , phosphᄋ一 Erk(Ce 11 Signaling Technology, Danver s , MA) , Erk(Ce 11 Signaling Technology ; Danver s , MA , USA) , phosph으 Smad3(Ce 11 Signaling Technology, Danvers, MA) , TM4SF5(실시예 1의 항체 사용)， a -SMA(smooth muscle act in , Sigma) , phosph으 S10ᅳ p27(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p27(BD Transduct . Lab. San Jose CA, USA) 및 α- tubulin(Sigma-Aldrich)에 대한 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 그 결과， 도 29에 나타난 바와 같이， CC14 처리에 의해 TM4SF5 발현이 야기되는 신호전달 과정 (즉， TGF베타 1의 하위인자인 Smad3의 인산화， EGFR/Erk 인산화 및 활성화)에는 TSAHC 및 control compound에 의해 영향을 받지 않았으나, 일단 발현된 TM4SF5의 기능의 하나인 α -SMA 발현， 즉 EMT(epi thel ia卜 mesenchymal transition)의 유도 및 p27의 발현 유도 및 SerlC^ 인산화 향상은 TSAHC 처리군의 간조직에서 현저히 감소됨을 확인하였다. 하지만， control compound 인 4'-Amino-4-hydroxychalcone에 의해서는 CC14-의존적 TM4SF5 발현에 따른 여러 현상들의 감소가 확인되지 않았다. 즉, TSAHC에 의하여 TM4SF5의 활성이 억제됨을 확인하였다.
이러한 실험 결과는 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질， 즉， TM4SF5 단백질의 발현 또는 TM4SF5 발현 관련 신호전달 단백질들의 발현 및 인산화 수준을 저해하는 물질이 간손상 및 간섬유화 등을 억제하여 간 질환의 치료 및 예방을 위하여 유용하게 사용될 수 있음을 제시한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서， 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며， 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위 】
【청구항 1】
TM4SF5( Transmembrane 4 L six family member 5
Transmembrane ᄂ 6 Super f ami ly member 5) 단백질 수준
물질을 포함하는 간 질환 진단용 조성물 .
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질은 TM4SF5를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물.
【청구항 3】
제 1¾"에 있어서， a -SMA( α -smooth muscle act in) , 비멘틴 (viment in)， 세포골격-중간섬유 ( i nt ermed i at e filament), 스네일 (snail), 슬러그 (slug), E—카데린 (E-cadher in)， Z0-l(tight junction protein 1 Z0_1), 베타-카테닌， 데스모플락킨 (desmoplakin)， 클라우딘 (claudin) 및 콜라젠 (col lagen)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물.
【청구항 4]
제 3항에 있어서， 상기 a -SMA, 비멘틴， 세포골격 -중간섬유, 스네일， 슬러그， E-카데린， Z0-1, 베타-카테닌， 데스모플락킨 , 클라우딘 및 콜라젠으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물
【청구항 5】
제 3항에 있어서， 상기 콜라젠 단백질 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 염색법들 (Mai lory 또는 Masson's Trichrome Staining)인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물
【청구항 6】
제 1항에 있어서 , Smad2(mothers against decapentaplegi c homo 1 og 2)， Smad3(mother s against decapent a 1 egi c homolog 3)， EGFR( epidermal growth factor receptor ) 및 Erkl/2(extracel lular signal-regulated kinase 1/2)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 인산화 수준을 측정하는 물질을 더 포함하는 간 질환 진단용 조성물.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 Smad2 ,Smad3, EGFR 및 Erkl/2로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 인산화 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물 【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물. 【청구항 9】
제 1항에 있어서 , 상기 간 질환은 간섬유화증， 간경변증， 간염， 알콜성 간질환 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 조성물. 【청구항 10】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 간 질환 진단용 키트.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 간 질환은 간섬유화증 간경변증， 간염， 알콜성 간질환 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 간 질환 진단용 키트.
【청구항 12】
1) 간 질환 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터
TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 TM4SF5 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 TM4SF5 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 .
【청구항 13】
제 12항에 있어서 , TM4SF5를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 상기 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 .
【청구항 14】
제 12항에 있어서， 상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏， ELISA, 방사선면역분석 , 방사 면역확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동， 조직면역 염색 , 면역침전 분석법 , 보체 고정 분석법 , FACS, 간질환 및 간손상올 유도하는 동물모델 구축， 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 . 【청구항 15】
제 12항에 있어서， 상기 생물학적 시료가 조직， 세포 , 전혈， 혈청 또는 혈장인 것인 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 .
【청구항 16】
제 12항에 있어서， 상기 간 질환은 간섬유화증, 간경변증， 간염， 알콜성 간질환 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 간 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 .
【청구항 17】
1) TM4SF5( Transmembrane 4 L six f ami 1 y member 5 또는 Fourᅳ Transmembrane L6 Super fami ly member 5) 단백질을 발현하는 간 질환 세포에 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하지 않은 대조군과 비교하여 TM4SF5 단백질의 발현이 저해되는 경우의 후보물질을 간 질환 치료 물질로 선택하는 단계를 포함하는, 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법
【청구항 18】
1) CC14 등의 약물올 주사 혹은 섭취시키어 간질환 및 간손상을 유도하는 동물모델 구축하여 간 질환 치료 후보 물질을 처리하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 후보물질로 처리하지 않은 대조군과 비교하여， TM4SF5의 발현에 의한 현상인 α -SMA, 비멘틴， 세포골격- 중간섬 스네일， 슬러그， E-카데린 , Z0-1, 베타-카테닌， 데스모플락킨，클라우딘， 및 콜라젠 (col lagen)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 발현 수준이 변화하는 경우의 후보물질을 간 질환 치료 물질로 선택하는 단계를 포함하는， 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법
【청구항 19】
제 17항 및 제 18항에 있어서 , 상기 간 질환은 간섬유화증， 간경변증, 간염， 알콜성 간질환 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 물질의 스크리닝 방법 .
【청구항 20】
TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물. 【청구항 21】
제 20항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 . 【청구항 22】
제 20항에 있어서， 상 7 간 질환은 간섬유화증， 간경변증， 간염 알콜성 간질환 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
【청구항 23】 하있것
제 20항에 >！서， 상기 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 '] 화학식 2 또는 화학식 4로 표시되는 설포닐- 칼콘계 화합물인 을 특징으로 하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물:
[화학식 2]
Figure imgf000043_0001
(상기 식에서， R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시기이고，
R4은 ( - C5의 알킬 ; 또는 수소 , 할로겐 , 니트로 및 ~ C5의 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 갖는 c6 - C10의 아릴이다); 및
[화학식 4]
Figure imgf000043_0002
(상기 식에서 ， R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시기이며，
R4은 d - C5의 알킬 ; 또는 수소， 할로겐， 니트로 및 d - C5의 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 갖는 c6 - C10의 아릴이다) .
【청구항 24】
제 23항에 있어서， 상기 설포닐-칼콘계 화합물은 다음 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물: ' -(p-를루엔설포닐아미노 ) -4-하이드록시칼콘 ;
' -(P-를루엔설포닐아미노 )-3-하이드록시칼콘； ' -(P-를루엔설포닐아미노 )-2-하이드록시칼콘； ' -(P-틀루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘;
' -(P-틀루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘;
' _(p-하이드록시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ' -(p-하이드특시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ' -(p-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ' -(p-하이드록시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ' -(p-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ' _(p-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ' -(p-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ' —(p-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ' -(p-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ' -(m-하이드록시벤젠설포닐아미노)— 4-하이드록시칼콘 ' -Cm-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -3—하이드록시칼콘 ' -Cm—하이드록시벤젠설포닐아미노)— 2-하이드록시칼콘 ' -(m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -4—하이드록시칼콘 ' -(m-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ' -(m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ' -(m-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ' -(m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ' -(m-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ' -(P -플루오로벤젠설포닐아미노 )-4 -하이드록시칼콘; ' -(m—플루오로벤젠설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘 ; ' -Co-플루오로벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ; ' -(P-니트로벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ; ' —Cm-니트로벤젠설포닐아미노 ) -4-하이드록시칼콘 ; ' —Co-니트로벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ; ' -(p-아미노벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ; ' -(m-아미노벤젠설포닐아미노 ) -4-하이드록시칼콘 ; ' -(0-아미노벤젠설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ; ' - (벤젠설포닐아미노 )-4-하이드톡시칼콘 ;
' - (메탄설포닐아미노 )-4-하이드톡시칼콘;
' -(P-를루엔설포네이트) -4-하이드록시칼콘 ;
' -(P-플루오로벤젠설포네이트) -4-하이드톡시칼콘 ; ' - (m-플루오로벤젠설포네이트 )-4-하이드톡시칼콘； ' -(P-니트로벤젠설포네이트) -4-하이드록시칼콘 ; ' -(p-아미노벤젠설포네이트 )-4-하이드톡시칼콘 ;
' - (벤젠설포네이트) -4-하이드록시칼콘 ;
' - (메탄설포네이트) -4-하이드록시칼콘 ;
' -(P-를루엔설포닐아미노 )-3,4-디하이드록시칼콘 ; ' -(P-를루엔설포닐아미노 )-2, 3-디하이드록시칼콘 ; P-를루엔설포닐아미노) - 2,4-디하이드록시 ¾
P-를루엔설포닐아미노) - 2,5-디하이드록시 ¾
P-를루엔설포닐아미노) - 3,4-디하이드록시
P-틀루엔설포닐아미노) - 3,4-디하이드톡시
p- -하이드록시벤젠설포닐아이노 3, 4-디하 o
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -2 3-디하 o
-하이드록시벤젠설포닐아미노
p- -2 4_디하ᄋ
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -2 5-디하。
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -3 4一디하ᄋ'
p- -하이드록시벤젠설포닐아이노 -2 3-디하。.
p- -하이드록시밴젠설포닐아이노 -2 4一디하ᄋ'
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -2 5-디하ᄋ'
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -3 4ᅳ디하ᄋ'
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -2 3-디하。'
p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 -2 4ᅳ디하ᄋ'
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m- -하이드록시밴젠설포닐아미노 -3 디하ᄋ'
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【청구항 25】
간 질환 진단용 조성물로 사용하기 위한 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질 .
【청구항 26】
제 25항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질은 TM4SF5를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 TM4SF5 단백질 수준을 측정하는 물질 .
【청구항 27】
간 질환 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 칼칼칼칼위칼칼칼칼한
단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질 . 콘콘콘콘콘콘콘콘
【청구항 28】
제 27항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 상기 화학식 2 또는 화학식 4로 표시되는 설포닐- 칼콘계 화합물인 것을 특징으로 하는 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성올 저해하는 물질 .
【청구항 29】
제 28항에 있어서， 상기 설포닐-칼콘계 화합물은 다음 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질 :
4' -(P-를루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘;
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3' -(P-를루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘 ;
2' -(P-를루엔설포닐아미노 )-4-하이드록시칼콘；
4' -(P-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -4-하이드톡시칼콘 ;
4' -(p-하이드톡시벤젠설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ;
4' -(P-하이드록시벤젠설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ; 하이드록시벤젠설포닐아 4-하이드
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P-를루엔설포닐아미노) - 2,5- 드록시칼콘
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P-를루엔설포닐아미노) - 3,4- 드록시칼콘
P-하이드록시벤젠설포닐아미 4-디하이드록시칼콘 P-하이드록시벤젠설포닐아미 3-디하이드록시칼콘 P-하이드톡시벤젠설포닐아미 4-디하이드록시칼콘
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효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간
【청구항 31】
제 30항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 상기 화학식 2 또는 화학식 4로 표시되는 설포닐- 칼콘계 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료방법 . 【청구항 32】
제 31항에 있어서， 상기 설포닐-칼콘계 화합물은 다음 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 간 질환 치료방법：
4' -(P- -를루엔설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ;
4' -(p- -를루엔설포닐아미노) -3-하이드록시칼콘 ;
4' -(p- -를루엔설포닐아미노) -2-하이드록시칼콘 ;
3' -(p- -를루엔설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ;
2' -(p- -를루엔설포닐아미노) -4-하이드록시칼콘 ;
4' -(p- -하이드록시벤젠설포닐아미노) - -4-하이드록시 코
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3' -(p- -하이드록시벤젠설포닐아미노) - -4—하이드록시칼콘
3' -(p- -하이드록시벤젠설포닐아미노 ) - -3-하이드록시칼콘
3' -(p- -하이드록시벤젠설포닐아미노) - 하이드록시칼콘
2' -(p- -하이드록시벤젠설포닐아미노) - -4-하이드록시가코
2' -(p- -하이드톡시벤젠설포닐아미노) - -3-하이드록시카코
2' -(p- -하이드록시벤젠설포닐아미노) - -2ᅳ하이드록시칼콘
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4' -(ρ-하이드록시벤젠설포너 -3-하이드록시칼콘
4' -(Ρ-하이드록시벤젠설포너 -2-하이드록시칼콘
4' -(m-하이드록시벤젠설포너' -4-하이드톡시칼콘
4' -(m-하이드톡시벤젠설포너 -3-하이드록시칼콘
4' 하이드록시벤젠설포너' -2-하이드록시칼콘
4' -(p-하이드록시벤젠설포너' -3, 4一디하이드록人
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【청구항 33】
약학적으로 유효한 양의 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 예방방법 . 【청구항 34】
제 33항에 있어서， 상기 TM4SF5 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 상기 화학식 2 또는 화학식 4로 표시되는 포닐- 칼콘계 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방방법 . 【청구항 35】
제 34항에 있어서 , 상기 설포닐-칼콘계 화합물은 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 간 질환 예방방법： 루엔설포닐아미노) -4—하이드
루엔설포닐아미노) -3-하이드
루엔설포닐아미노) -2-하이드
루엔설포닐아미노) -4-하이드
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ffl ffl _---- - - - - - - -------------------- --- 루엔설포닐아미노) -4-하이드
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4' -(P-아미노벤젠설포닐아미노) -3， 4-디하이드록시칼콘 ;
4' -(m—아미노벤젠설포닐아미노) -3, 4-디하이드록시칼콘 ;
4' -Co-아미노벤젠설포닐아미노) -3， 4-디하이드록시칼콘 ;
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