WO2012018226A2 - 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법 - Google Patents

카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법 Download PDF

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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01051—Prephenate dehydratase (4.2.1.51)
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    • C12Y403/03—Amine-lyases (4.3.3)
    • C12Y403/03007—4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (4.3.3.7)

Definitions

  • the present invention relates to a mutant microorganism having a high ability to produce cadaverine and a method for producing cadaverine using the same, and more specifically, to a cadaverine troubled gene in which a gene involved in the degradation or use of cadaverine is weakened or deleted. It relates to a mutant microorganism having a performance and a method for producing cadaverine in high yield by culturing it under aerobic conditions.
  • Cadaverine known as 1,5-diaminopentane
  • Cadaverine may be used as a component of a polymer such as polyamide or polyurethane, as a chelating agent or other additive.
  • polyamide-5,4 is produced by polycondensation of cadaverine or succinic acid.
  • Polyamide-5,4 with a global market of 3.5 million tonnes per year, is expected to be produced from bio-based substitutes in traditional petroleum-based polyamides (Mimitsuka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 71: 2130-2135 , Kind et al., Met. Eng., 12: 341-351, 2010).
  • This cadaverine production process requires a renewable biomass-based carbon source.
  • Cadaverine is a polyamine found in several microorganisms (Tabor and Tabor, Microbiol Rev. , 49: 81-99,1985).
  • E. coli a Gram-negative bacterium
  • cadaverine is directly biosynthesized from L-lysine using L-lysine decarboxylase (FIG. 1).
  • L-lysine decarboxylase There are two types of L-lysine decarboxylase which are encoded by the gene ldcC and continuously expressed by the gene cadA and expressed only at low pH.
  • Cardaberine concentrations in E. coli are regulated by biosynthesis, degradation, absorption and release of cardaberine (Soksawatmaekhin et al., Mol Microbiol., 51: 1401-1412,2004).
  • cadaverine was not detected in wild-type Escherichia coli, and it was reported that cadaverine exists only in mutant strains that are defective in the biosynthesis of polyamines (Hafner et al., J. Biol. Chem., 254: 12419). -12426,1979). Although very small amounts of cadaverine are found in the microorganisms, the microorganisms are more resistant to cadaverine.
  • the wild-type Corynebacterium glutamicum (Corynebacteriumglutamicum), although the synthesis does not cadaverine can be grown in which the cadaverine from about 0.3M environment (Mimitsuka etal, Biosci.Biotechnol.Biochem, 71. .: 2130-2135,2007).
  • the high resistance of these microbes to cadaverine shows the potential for overproduction of cadaverine to a level that is metabolic and industrially available.
  • yeast Candida boidinii acetylates putrescine to N- acetylputrescine by N- acetyltransferase The spermidine acetyltransferase, a speG gene product in Escherichia coli, has a high homology with N- acetyltransferase in yeast and is believed to possess cadaverine acetyltransferase (Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148: 277-283, 1985).
  • putrescine degradation pathway "Puu catabolic pathway” based on the fact that the putrescine degradation pathway was closely related to the ⁇ -glutamylated metabolites in E. coli.
  • This pathway is also expected to be involved in cadaverine degradation.
  • glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase encoded by the gene puuA , the first enzyme involved in this pathway, can convert cadaverine to ⁇ -glutamyl-L- ⁇ -glutamyl-L-cadaverine.
  • putrescine importer a product of the gene puuP
  • putrescine inlets The putrescine influx may be thought of as introducing cadaverine because the cadaverine is structurally similar to putrescine.
  • the present inventors are directed to a gene coding for putrescine / cadaverine aminopropyl transferase ( speE ), spermidine, which is involved in the decomposition or utilization pathway of cadaverine in a microorganism producing cadaverine.
  • An object of the present invention is to provide a mutant microorganism having a weak or deleted gene involved in a cadaverine degradation or use pathway, and a method for producing the mutant microorganism having high productivity of cadaverine.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a high yield cadaverine by culturing the mutant microorganism.
  • the present invention is a gene ( speE ), spermidine encoding putrescine / cadaverine aminopropyl transferase involved in the pathway of degradation or use of cadaverine (cadaverine) Gene coding for N-acetyltransferase ( speG ), gene coding putrescine / cadaverine aminotransferase ( ygjG ), putrescine importer gene encoding the (puuP), and glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase (glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase) to weaken the at least one selected from the group consisting of a gene (puuA) encoding or deletion It provides a mutant microorganism having the ability to produce cadaverine characterized in that.
  • speG N-acetyltransferase
  • ygjG gene coding putrescine / cadaverine aminotransferase
  • the present invention also relates to a gene ( speE ), spermidine N-acetyltransferase, which encodes putrescine / cadaverine aminopropyl transferase involved in the pathway of degradation or use of cadaverine.
  • speE spermidine N-acetyltransferase
  • speG coding gene (spermidine N-acetyltransferase), gene coding putrescine / cadaverine aminotransferase ( ygjG ), gene coding putrescine importer (putrescine importer) puuP ), and one or more selected from the group consisting of glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase ( puuA ), attenuated or deleted, Gene encoding dihydrodipicolinate synthase ( dapA ), diaminopimelate decarboxyl native promoter of one or more genes selected from the group consisting of a gene encoding lysA and a gene encoding dihydrodipicolinate reductase ( dapB ) is substituted with a strong promoter. It provides a mutant microorganism having the ability to produce cadaverine.
  • the present invention also relates to a gene ( speE ), spermidine N-acetyltransferase, which encodes putrescine / cadaverine aminopropyl transferase involved in the pathway of degradation or use of cadaverine.
  • speE spermidine N-acetyltransferase
  • speG coding gene (spermidine N-acetyltransferase), gene coding putrescine / cadaverine aminotransferase ( ygjG ), gene coding putrescine importer (putrescine importer) puuP ), and the gene encoding glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase ( puuA ) is attenuated or deleted, and the gene encoding lac operon inhibitor ( lacI).
  • lysine decarboxylase a car, characterized in that the gene (cadA) coding for lysine decarboxylase) is introduced or amplified It provides a mutant microorganism having the Schwerin producing ability.
  • the present invention also encodes a putrescine / cadaverine aminopropyl transferase that is involved in the degradation or utilization pathway of cadaverine in microorganisms having a cadaverine production metabolic pathway.
  • Gene ( speE ) gene encoding spermidine N-acetyltransferase ( speG ), gene encoding putrescine / cadaverine aminotransferase ( ygjG ),
  • puuP putrescine importer
  • puuA glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase
  • the present invention also encodes a putrescine / cadaverine aminopropyl transferase that is involved in the degradation or utilization pathway of cadaverine in microorganisms having a cadaverine production metabolic pathway.
  • Gene ( speE ) gene encoding spermidine N-acetyltransferase ( speG ), gene encoding putrescine / cadaverine aminotransferase ( ygjG ),
  • puuP putrescine importer
  • puuA glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase
  • Dihydrodipicoli present in microorganisms having attenuated or deleted one or more selected, followed by the cadaverine producing metabolic pathway Sites gene encoding the synthetase (dihydrodipicolinate synthase) (dapA), diamino pimel rate decarboxylase (diaminopimelate decarboxylase) to the gene (lysA) and dihydro Diffie coli carbonate encoding the reductase (dihydrodipicolinate reductase) encoding It provides a method for producing a mutant microorganism having a cadaverine-producing ability, characterized in that by replacing the native promoter of one or more genes selected from the group consisting of a gene ( dapB ) with a strong promoter.
  • the present invention also encodes a putrescine / cadaverine aminopropyl transferase that is involved in the degradation or utilization pathway of cadaverine in microorganisms having a cadaverine production metabolic pathway.
  • Gene ( speE ) gene encoding spermidine N-acetyltransferase ( speG ), gene encoding putrescine / cadaverine aminotransferase ( ygjG ), Attenuates or deletes the gene encoding the putrescine importer ( puuP ) and the gene encoding the glutamate-putrescine / glutamate-cadaverine ligase ( puuA ) and the gene deletion in which a gene (lacI) encoding a lac operon, and then inhibitory factor, coding for lysine decarboxylase (lysine decarboxylase) (cadA) Mutant having a cadaverine producing ability, characterized in that for introducing or amplifying
  • the present invention also provides a method for producing cadaverine, wherein the mutant microorganism is cultured to produce cadaverine, and then cadaverine is recovered from the culture.
  • 1 is a schematic diagram showing a synthetic route of cadaverine from glucose.
  • Figure 2 is a fed-batch fermentation with glucose from WL3110 / p15CadA (filled rectangle), XQ27 / p15CadA (empty rectangle), XQ56 / p15CadA (filled triangle), XQ59 / p15CadA (empty triangle) and XQ60 / p15CadA (filled circle) strains.
  • Figure 3 is a graph showing the production of cell mass (filled rectangles) and cadaverine (empty rectangles) in fed-batch fermentation with glucose from the XQ56 / p15CadA strain.
  • FIG. 4 is a graph showing the production of cadaverine in flask fermentation with glucose from XQ56 ⁇ aceF / p15cadA (filled rectangle), XQ56 / p15cadA (filled rhombus) strains.
  • the term "attenuation” refers to a concept encompassing a mutation, substitution or deletion of some bases of a gene or introduction of some bases to reduce the activity of an enzyme expressed by the gene of interest. It includes everything that blocks some or much of the biosynthetic pathway.
  • the term 'deletion' is a concept encompassing a part or whole base of the gene, mutating, substituting or deleting, or introducing some base so that the gene is not expressed or does not exhibit enzymatic activity even when expressed. It includes everything that blocks the biosynthetic pathways involved in the enzymes of the gene.
  • amplification means that some bases of the gene are mutated, substituted or deleted, introduced into some bases, or introduced into a gene from another microorganism encoding the same enzyme to increase the activity of the corresponding enzyme. It is a concept that encompasses letting.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a synthetic route of cadaverine from glucose.
  • a microorganism having a cadaverine- producing ability attenuates or deletes genes ( speE, spG, ygjG, puuP, and puuA ) that are involved in the degradation or use pathway of cadaverine, It was intended to confirm that berin can be produced in high yield. Reduced activity of genes ( speE, speG, ygjG, puuP, puuA ) involved in the degradation or utilization pathway of cadaverine could be confirmed by reduced transcriptional and translational efficiency compared to each wild type level. .
  • puuA encoding a dehydratase (
  • the present invention provides a gene ( speE ), spermidine N, which encodes putrescine / cadaverine aminopropyl transferase, which is involved in the pathway of degradation or use of cadaverine.
  • speG spermidine N-acetyltransferase
  • ygjG a gene encoding putrescine / cadaverine aminotransferase
  • puuP putrescine importer coding gene
  • the present invention relates to a mutant microorganism having a cadaverine-producing ability and a method for producing the same.
  • the mutant microorganism may further be deleted a gene ( lacI ) encoding a lac operon inhibitor so that the expression of the gene encoding the enzyme involved in the cadaverine biosynthesis is increased.
  • Genes encoding the enzymes involved in the cadaverine biosynthesis may include dapA, dapB, dapD, dapC, dapE, dapF, lysA and the like.
  • the mutant microorganism may also be characterized in that the gene ( cadA ) encoding lysine decarboxylase is further introduced or amplified.
  • the lysine decarboxylase-encoding gene ( cadA ) is characterized in that it is introduced in the form of an expression vector containing a strong promoter, the strong promoter is trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter and It can be selected from the group consisting of trp promoters.
  • the microorganism may be used without limitation as long as it is a microorganism that produces cadaverine from glucose, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. , Pichia sp., Pseudomonas sp., Saccharomyces sp.
  • a gene encoding a dihydrodipicolinate synthase ( dapA ), a diaminopimelate dicarboxyl in a mutant microorganism in which a gene involved in the decomposition or use pathway of cadaverine is deleted is also provided. If a native promoter of one or more genes selected from the group consisting of a gene encoding lyase ( lysA ) and a gene encoding dihydrodipicolinate reductase ( dapB ) is substituted with a strong promoter It was intended to confirm that cadaverine can be produced in higher yield.
  • the cadaverine which the gene gene (lacI) encoding a (speE, speG, ygjG, puuP, puuA) and lac operon repressor involved in decomposition or the Flow deletion mutant microorganism of papaverine (cadaverine) of the present invention A mutant microorganism (XQ56) was prepared by substituting the promoter of the gene ( dapA ), which encodes a dihydrodipicolinate synthase, with a strong promoter trc, and the diaminopimelate decarboxylase of XQ56.
  • mutant microorganism (XQ59) in which the promoter of the gene ( lysA ) encoding decarboxylase was substituted with trc, a strong promoter
  • the gene ( dapB ) encoding the dihydrodipicolinate reductase of XQ59 was prepared.
  • a mutant microorganism (XQ60) was prepared by substituting the promoter for trc, a strong promoter, and the p15CadA vector was introduced into these mutant microorganisms to obtain XQ56 / p15CadA, XQ59 /. After preparing p15CadA and XQ60 / p15CadA, it was confirmed that the cadaverine production ability of the mutant microorganism was rapidly increased by culturing.
  • the present invention provides a gene ( speE ), spermidine N, which encodes putrescine / cadaverine aminopropyl transferase, which is involved in the pathway of degradation or use of cadaverine.
  • speG spermidine N-acetyltransferase
  • ygjG a gene encoding putrescine / cadaverine aminotransferase
  • puuP putrescine importer coding gene
  • the promoter of the gene ( dapA ) encoding the dihydrodipicolinate synthase is inhibited by intracellular DAP or the precursor L, L-diaminopimelate
  • lysine Can increase the metabolic flux to.
  • the promoter of the gene ( lysA ) encoding the diaminopimelate decarboxylase is inhibited by lysine, replacing the promoter of the lysA gene with a strong promoter enhances flow to cadaverine.
  • dapB which encodes the dihydrodipicolinate reductase
  • the mutant microorganism may be further deleted a gene encoding lac operon inhibitor ( lacI ) such that the expression of the gene encoding the enzyme involved in the cadaverine biosynthesis is increased, and the lysine decarboxylase ( The gene encoding lysine decarboxylase ( cadA ) can be further introduced or amplified.
  • lacI lac operon inhibitor
  • cadA lysine decarboxylase
  • the lysine decarboxylase-encoding gene ( cadA ) is characterized in that it is introduced in the form of an expression vector containing a strong promoter, the strong promoter is trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter and It can be selected from the group consisting of trp promoters.
  • the present invention relates to a method for producing putrescine, wherein the mutant microorganism is cultured to generate cadaverine, and then the cadaverine is recovered from the culture.
  • the culturing of the mutant microorganism and the obtaining of cadaverine can be carried out using a culture method commonly known in the conventional fermentation process (batch culture, fed-batch culture) and the separation and purification of cadaverine.
  • the biotechnological production of cadaverine can be performed in cells within or outside cells (invivo or invitro).
  • the PCR products were transformed into electrocompetent cells containing ⁇ recombinase.
  • Colonies were Luria-Bertani (LB) agar (Sambrook, J., Fritsch EF, & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring) containing chloroamphenicol (Cm; 34 ⁇ g / ml) Harbor Laboratory Press, 2000) plate.
  • LB Luria-Bertani
  • Cm chloroamphenicol
  • helper plasmid pJW168 (Lucigen Corporation, Middleton, WI, USA), including temperature-sensitive replication origin and IPTG-inducible cre recombinase (Palmeros et al., Gene, 247: 255-264,2000). It became.
  • pECmulox was subjected to PCR using the plasmid pACYC184 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) as a template, a primer of SEQ ID NOs: 1 and 2, and the PCR product was treated with Hin dIII and Sma I restriction enzymes. After ligating with plasmid pUG6 (Guldener, U et al. Nucleic Acids Res., 24: 2519-2524,1996) digested with Hin dIII and Eco RV.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 3 and 4, pECmulox, a plasmid as a template, to prepare a PCR product from which the lacI gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified, and then electroporated to E. coli (W3110) containing ⁇ recombinase to prepare WL3110 (W3110 ⁇ lacI ).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6, pECmulox, a plasmid as a template, to prepare a PCR product from which the speE gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified, and then electroporated to the WL3110 strain prepared in 1-1 to prepare an XQ08 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 7 and 8, pECmulox, a plasmid as a template, to prepare a PCR product from which the speE gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified and then electroporated to the XQ08 strain prepared in the above 1-2 to prepare an XQ11 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, pECmulox, a plasmid as a template, to prepare a PCR product from which the ygjG gene was deleted.
  • the purified PCR product was purified and then electroporated to the XQ11 strain prepared in the above 1-3 to prepare an XQ21 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ).
  • PCR was performed using the plasmid pECmulox as a template, the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12, to prepare a PCR product from which the puuA gene was deleted, and PCR was performed using the plasmid pECmulox as the primer, the templates of SEQ ID NOs: 12 and 13 PCR products with puuP gene deletion were prepared.
  • the purified PCR products were each purified, and then sequentially electroporated to the XQ21 strains prepared in 1-4 to prepare XQ27 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA ).
  • the promoter of the mutant strain (XQ27) prepared in the above 1-5 was replaced with a strong promoter trc promoter.
  • the exchange of the gene ( dapA ) operon encoding the dihydrodipicolinate synthase to the trc promoter for the wild type promoter was performed according to the following.
  • the fused lox71-chloroamphenicol antibiotic marker-lox66 DNA fragment was obtained by first PCR using pECmulox as a template and SEQ ID NOs: 14 and 15 as primers.
  • the first PCR product was used as a template and a second PCR reaction was performed using the primers of SEQ ID NOs: 16 and 17.
  • the final PCR product was electroporated to the XQ27 strain ( W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA ), and then the cells were screened for double homologous recombination while culturing the prepared strains in agar solid medium containing chloroamphenicol.
  • XQ56 strain W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA PdapA :: Ptrc
  • Promoter exchange to the trc promoter was confirmed by DNA sequence analysis.
  • the exchange of the gene ( lysA ) operon encoding the diaminopimelate decarboxylase to the trc promoter for the native promoter was performed according to the following manner.
  • the first PCR reaction was carried out using plasmid pECmulox as a template and SEQ ID NO: 15 above and SEQ ID NO: 18 below.
  • the second PCR reaction was carried out using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 20, with the first PCR product as a template.
  • the final PCR product was electroporated to the XQ56 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA PdapA :: Ptrc) prepared in 2-1, and then the prepared strain was cultured in agar solid medium containing chloroamphenicol. Only cells undergoing double homologous recombination were screened to obtain XQ59 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA PdapA :: PtrcPlysA :: Ptrc). Promoter exchange to the trc promoter was confirmed by DNA sequence analysis.
  • the exchange of the gene ( dapB ) operon encoding the dihydrodipicolinate reductase to the trc promoter for the wild type promoter was performed according to the following method.
  • the first PCR reaction was carried out using plasmid pECmulox as a template and SEQ ID NO: 15 above and SEQ ID NO: 21 below.
  • the second PCR reaction was carried out using the primers of SEQ ID NOs: 22 and 23, with the first PCR product as a template.
  • the third PCR reaction was carried out using the primers of SEQ ID NOS: 24 and 25, with the second PCR product as a template.
  • the final PCR product was electroporated to the XQ59 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA PdapA :: PtrcPlysA :: Ptrc) prepared in 2-2, and then the prepared strain was incubated in agar solid medium containing chloroamphenicol. Only cells undergoing double homologous recombination were screened to obtain XQ60 strain (W3110 ⁇ lacI ⁇ speE ⁇ speG ⁇ ygjG ⁇ puuP ⁇ puuA PdapA :: PtrcPlysA :: PtrcPdapB :: Ptrc). Promoter exchange to the trc promoter was confirmed by DNA sequence analysis.
  • Lysine decarboxylase (lysine decarboxylase) to amplify the gene (cadA) encoding E. coli W3110 (E.coli derived from K-12, ⁇ -, F -, prototrophic) , and the genomic DNA of the mold, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 26 and 27.
  • pTac15K was cut with EcoRI and treated with Mung Bean Nuclease, and then cut again with SacI to obtain a 4.0 kb DNA fragment. This fragment was combined with the above PCR product (2,168bp) cut with SacI, then introduced into E. coli TOP 10 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) and cloned to prepare a p15CadA plasmid.
  • pTac15K is a plasmid containing p15A origin, tac promoter, and kanamycin resistance gene, and can be produced by the following procedure.
  • the plasmid pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) was digested with Sph I, followed by treatment with the Klenow enzyme (New England Biolabs, Ipswich, Mass., USA), followed by digestion of the enzymatic product with Eco RI. 0.4 kb DNA fragments were obtained.
  • the Klenow enzyme and Eco RI were sequentially processed to obtain a 3.5 kb DNA fragment.
  • pHNC15K is a DNA fragment of pACYC177 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), pHCE IIB (TaKaRa Korea Biomedical, Seoul, Korea), pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) through a method similar to the preparation method of pTac15K. It is made from them.
  • p15CadA can constitutively express the cadA gene by using a strong tac promoter in E. coli , which lacks lacI.
  • the WL3110 / p15CadA strain was prepared by electroporation of the p15CadA plasmid prepared in 3-1 to the WL3110 strain prepared in 1-1. Next, the prepared strains were cultured in agar (agar) solid medium containing kanamycin to check whether transformation was performed.
  • the XQ27 / p15CadA strain was prepared by electroporation of the p15CadA plasmid prepared in 3-1 to the XQ27 strain prepared in 1-5. Next, the prepared strains were cultured in agar (agar) solid medium containing kanamycin to check whether transformation was performed.
  • the XQ56 / p15CadA strain was prepared by electroporation of the p15CadA plasmid prepared in 3-1 to the XQ56 strain prepared in 2-1. Next, the prepared strains were cultured in agar (agar) solid medium containing kanamycin to check whether transformation was performed.
  • the XQ59 / p15CadA strain was prepared by electroporation of the p15CadA plasmid prepared in 3-1 to the XQ59 strain prepared in 2-2. Next, the prepared strains were cultured in agar (agar) solid medium containing kanamycin to check whether transformation was performed.
  • the XQ60 / p15CadA strain was prepared by electroporation of the p15CadA plasmid prepared in 3-1 to the XQ60 strain prepared in 2-3. Next, the prepared strains were cultured in agar (agar) solid medium containing kanamycin to check whether transformation was performed.
  • the XQ56 ⁇ aceF / p15CadA strain was prepared by electroporation of p15CadA plasmid prepared in 3-1 to a strain of aceF (dihydrolipoamide acetyltransferase), which is one of the pyruvate dehydrogenase complexes, prepared in 2-1.
  • aceF dihydrolipoamide acetyltransferase
  • the prepared strains were cultured in agar (agar) solid medium containing kanamycin to check whether transformation was performed.
  • the activity of cadaverine degradation and utilization was measured using batch culture with decarboxylase activity.
  • R / 2 medium contains (NH 4 ) 2 HPO 4 2g / L, KH 2 PO 4 6.75g / L, citric acid 0.85g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.7g / L, and 0.5% (v / v) trace metal solution (Qian et al., Biotechnol. and Bioeng, 101 (3): 587-601, 2008).
  • Trace metal solution contains 5M HCl per liter: 10g FeSO 4 7H 2 O, 2.25g ZnSO 4 7H 2 O, 1g CuSO 4 5H 2 O, 0.5g MnSO 4 5H 2 O, 0.23g Na 2 B 4 O 7 10H 2 O , 2g CaCl 2 2H 2 O, and 0.1g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .
  • 100 ⁇ L mutant strains (WL3110 / pL15CadA strain, XQ27 / p15CadA strain, XQ56 / p15CadA strain) activated in LB medium were inoculated with a preliminary minimal medium and then incubated at 37 ° C. and 220 rpm for 24 hours. Thereafter, 1 ml of these were added to a 350-mL baffled flask containing 50 mL of the same medium, and then cultured at 37 ° C. and 220 rpm for 14 hours.
  • 200ml of the whole culture was used as an inoculum of fermentation, and dissolved fermentation oxygen was maintained at 20% saturated air by automatically adjusting the stirring speed, and the pH was maintained at 6.80 using 6M KOH.
  • 100 ⁇ L of the mutant strain (XQ56 ⁇ aceF / p15cadA strain) was inoculated in LB medium and incubated at 37 ° C, 220rpm for 15 hours. Thereafter, 1 mL of the mutant strain activated in LB medium was inoculated into a minimal medium, and then cultured at 37 ° C. and 220 rpm for 18 hours.
  • the culture was carried out in a 350-mL baffled flask, the experiment was carried out in a dose of a total of 100mL of a minimum medium 90mL, glucose 10mL of 100g / L concentration.
  • the cells were separated using a centrifuge, and the dissociated supernatants were analyzed by HPLC.
  • the cadaverine contained in the supernatant was detected as an ophthaldialdehyde (OPA) derivative on a Hewlett-Packard 1100 series instrument (230 nm region) equipped with a C18-reverse phase column.
  • OPA ophthaldialdehyde
  • solvent A 55% methanol of 0.1 M sodium acetate
  • solvent B methanol
  • the analysis was performed with the following conditions (1-6 minutes: 100% buffer A equilibration, 6-10 minutes: 0-30% linear gradient of buffer B, 10-15 minutes: 30-50% gradient of buffer B, 15-19 minutes 50-100% gradient of buffer B, 19-23 minutes gradient to 100% of buffer B, 23-25 minutes: 100-30% gradient of buffer B, 25-28 minutes 100% of buffer A at 30% of buffer B Flow rate gradient up to 0.8 ml / min).
  • a standard material was used for the calibration, and the measured concentration of cadaverine is shown in FIGS. 2 and 4.
  • the WL3110 / pL15CadA strain is 0.79 g / l
  • the XQ27 / p15CadA strain which deletes Cadaverine's degradation and metabolic pathways, is 1.19 g / l, and dihydrodipicolinate synthase.
  • the XQ56 / p15CadA strain overexpressing the coding gene ( dapA ) produced 1.31 g / l cadaverine.
  • the amount of cadaverine production was increased even when the gene encoding lysA and dihydrodipicolinate reductase ( dapB ) encoding the diaminopimelate decarboxylase was overexpressed. Showed a similar level.
  • the XQ56 ⁇ aceF / p15cadA strain which deleted aceF (dihydrolipoamide acetyltransferase), which is one of the pyruvate dehydrogenase complexes in the XQ56 strain had about 1.5-fold cardaberine production compared to the XQ56 / p15cadA strain in flask culture It was confirmed that the higher.
  • Example 5 Production of cadaverine through fed-batch culture of XQ56 / p15CadA strain
  • Fed batch culture of the XQ56 / p15CadA strain was performed in the 6.6 L fermentor of Example 4. Seed culture was performed in a 350 mL baffled flask containing 50 ml of R / 2 medium at 220 rpm, 37 ° C. for about 14 hours, as described in Example 4. 200ml of the whole culture was used as the inoculum of fermentation, and dissolved oxygen was maintained at 20% of saturated air by automatically adjusting the stirring speed during fermentation.
  • the feed solution was automatically added to increase the glucose concentration to 3 g / L or more when the pH of the culture increased to a fixed value of 6.8.
  • the feed solution also contains 577 g / L glucose, 8 g / L MgSO 4 , 115 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 .
  • the pH was maintained at 6.8 by the addition of 10M KOH, except for a short time of pH increase due to the exhaustion of glucose. Samples were taken, the cells were separated using centrifugation, and the dissociated supernatants were analyzed by HPLC in the same manner as in Example 4. As shown in FIG.
  • the XQ56 / p15CadA strain produced 9.61 g / l of cadaverine 30 hours after inoculation, wherein the productivity of the cadaverine is 0.32 g L ⁇ 1 h ⁇ 1 .
  • the present invention is useful for producing a high yield of cadaverine, which is widely used industrially by producing a mutant microorganism having a cadaverine-producing ability, and using it.

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Abstract

본 발명은 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 호기조건하에서 배양하여 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물은 산업적으로 널리 사용되는 카다베린을 고수율로 제조하는데 유용하다.

Description

카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법
본 발명은 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 호기조건하에서 배양하여 카다베린을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
1,5-diaminopentane으로 알려진 카다베린은 많은 산업적 응용에 있어서 중요한 기반 화학물질이다. 카다베린은 폴리아마이드나 폴리우레탄과 같은 고분자의 구성요소, 킬레이팅제 또는 다른 첨가제로 사용될 수 있다. 특히 폴리아마이드-5,4는 카다베린이나 숙신산의 중축합으로써 제조된다. 연간 350만 톤의 세계 시장을 가진 폴리아마이드-5,4는 전통적 석유기반의 폴리아마이드에서 바이오 기반 대체제로부터 생산될 것으로 기대된다 (Mimitsuka etal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,71:2130-2135,2007;Kindetal.,Met.Eng.,12:341-351,2010). 이러한 카다베린 생산공정에는 재생산 가능한 바이오매스 기반 탄소공급원이 요구된다.
카다베린은 몇몇 미생물로부터 발견되는 폴리아민이다(Tabor and Tabor, MicrobiolRev.,49:81-99,1985). 그람음성 박테리아인 대장균에서 카다베린은 L-라이신으로부터 L-라이신 탈탄산효소(decarboxylase)를 이용하여 직접 생합성된다(도 1). L-라이신 탈탄산효소는 유전자 ldcC로코딩되어계속적으로발현되는효소와유전자cadA로코딩되어낮은 pH에서만 발현이 유도되는 효소 2종류가 있다. 대장균 내의 카다베린 농도는 카다베린의 생합성과 분해, 흡수와 방출로써 조절된다(Soksawatmaekhin etal.,MolMicrobiol.,51:1401-1412,2004).
이러한 조절을 이유로 야생형 대장균 내에서 카다베린은 검출되지 않고, 단지 폴리아민의 생합성에 결함이 있는 돌연변이 균주 내에서 카다베린이 존재하는 것으로 보고되었다(Hafner etal.,J.Biol.Chem.,254:12419-12426,1979).비록 매우 적은 양의 카다베린이 미생물 내에 존재하는 것이 확인되었지만 미생물의 카다베린에 대한 내성은 더욱 높다. 예를 들어, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteriumglutamicum)은 비록 카다베린을 생합성 하지는 않지만 약 0.3M의 카다베린이 있는 환경에서 성장할 수 있다(Mimitsuka etal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,71:2130-2135,2007). 이러한 미생물의 카다베린에 대한 높은 내성은 대사공학적으로 산업적으로 이용 가능한 수준까지 카다베린을 과생산할 수 있는 가능성을 보여준다.
값싼 산업 폐기물 또는 단백질과 주요 구성요소를 포함한 원료를 사용한 발효를 통해 카다베린을 생산하는 방법에 관한 유럽 특허 No. 0726240 A1가 공개되었다. 그러나 공개된 원료가 매우 복잡하기 때문에 카다베린과 퓨트레신(putrescine)을 획득하기 위하여 여러 단계의 정제과정을 거쳐야 하는 문제가 있다. 또 재조합 미생물을 이용한 카다베린을 생화학적으로 생산하는 공정에 관한 특허 WO 2007/113127 A1가 공개되었다. 이 특허에 따르면, 라이신에서 카다베린으로 전환을 증가시키기 위해서 이러한 전환에 관여하는 유전자 ldcC로코딩된 라이신 탈탄산효소를 과발현시킴으로써 라이신 탈탄산 효소의 활성을 증가시켰다. 그러나 이러한 경우 증가된 라이신 탈탄산효소의 결과로써 카다베린 양이 증가되었지만 동시에 카다베린의 분해가 유도된다는 문제점이 있었다.
미생물내에서의 카다베린 분해 및 이용 활성도에 대한 연구는 다음과 같다. Bowman 등은 대장균 내의 카다베린으로부터 아미노프로필 카다베린을 생합성하는 것을 증진시키는 speE의 생산물인 putrescine/cadaverine aminopropy ltransferase를 보고하였다(Bowman etal.,J.Biol.Chem.,248:2480-2486,1973).
Haywood 등은 효모인 Candida boidinii가N-acetyltransferase에 의해 acetylates 퓨트레신을 N-acetylputrescine로 아세틸화시킨다고 보고하였다. 대장균에서 speG 유전자 산물인 spermidine acetyltransferase는 효모의 N-acetyltransferase와 상동성(homology)이 매우 높아서 카다베린 acetyltransferase를 소유하는 것으로 판단된다(Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148:277-283, 1985).
Samsonova 등은 대장균에서 γ-glutamylation 없이 YgjG putrescine/cadaverine aminotransferase와 YdcW 탈수소효소를 수반하는 다른 퓨트레신 생분해 경로를 보고했다(Samsonova etal.,BMCMicrobiol.,3:2,2003;Samsonovaetal.,FEBSLett.,579:4107-4112,2005).
Kurihara 등은 퓨트레신 분해경로가 대장균 내의 γ-glutamylated metabolites와 밀접한 관련이 있다는 것을 기반으로 퓨트레신 분해경로를 "Puu catabolic pathway"라고 명명하였다. 이러한 경로는 카다베린 분해에도 관여하는 것으로 예상된다. 예를 들어, 이러한 경로에 처음으로 관여하는 효소인 유전자 puuA 가 코딩하고 있는 glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase는 카다베린을 γ-glutamyl-L- γ-glutamyl-L-cadaverine으로 전환할 수 있다. 게다가 유전자 puuP의생산물인퓨트레신유입체(importer)는 이화경로(catabolic pathway)와 주요한 퓨트레신 유입체들과 관련있다(Kurihara etal.,J.Biol.Chem.,280:4602-4608,2005).이러한 퓨트레신 유입체는 카다베린이 퓨트레신과 구조적으로 유사하기 때문에 카다베린을 유입하는 것으로 생각할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 카다베린을 생산하는 미생물에서, 카다베린의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 변이균주를 제조하고, 이를 배양한 결과, 카다베린을 고수율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, 카다베린의 고생산능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 배양하여, 카다베린을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)가 약화 또는 결실되어 있고, lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 결실되어 있으며, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, 상기 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter를 strong promoter로 치환시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)를 약화 또는 결실시키고, lac오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)를 결실시킨 다음, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 카다베린을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 것을 특징으로 하는 카다베린의 제조방법을 제공한다.
도 1은 포도당으로부터 카다베린의 합성경로를 나타내는 모식도이다.
도2는 WL3110/p15CadA (채워진 직사각형), XQ27/ p15CadA(빈 직사각형), XQ56/ p15CadA (채워진 삼각형), XQ59/p15CadA(빈 삼각형) 및 XQ60/p15CadA (채워진 원) 균주로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 카다베린의 생산을 나타낸 그래프이다.
도 3은 XQ56/p15CadA 균주로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 세포질량 (채워진 직사각형) 및 카다베린 (빈 직사각형)의 생산을 나타낸 그래프이다.
도 4는 XQ56 ΔaceF/p15cadA (채워진 직사각형), XQ56/p15cadA (채워진 마름모) 균주로부터 포도당을 이용한 플라스크 발효에서 카다베린의 생산을 나타낸 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
도 1은 포도당으로부터 카다베린의 합성경로를 나타내는 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 카다베린 생성능을 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE,speG,ygjG,puuP,puuA)를 약화 또는 결실시키면 카다베린을 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고자 하였다. 상기 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE,speG,ygjG,puuP,puuA)의 감소된 활성도는 각각의 야생형 수준과 비교하여 감소된 전사적, 번역적 효율에 의하여 확인할 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에서는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 결실시킨 변이 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물의 카다베린 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실될 수 있다. 상기 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 dapA, dapB, dapD, dapC, dapE, dapF, lysA 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하며, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 미생물은 글루코즈로부터 카다베린을 생성하는 미생물이면 제한없이 사용할 수 있으며, 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.),사카로마이세스 속(Saccharomycessp.)등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 카다베린의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 변이 미생물에서, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환시키면 카다베린을 더욱 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, ygjG , puuP , puuA) 및 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 결실된 변이 미생물에서, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ56)을 제조하고, XQ56의 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ59)을 제조한 후, XQ59의 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ60)을 제조하였다, 그리고, 이들 변이 미생물에 p15CadA vector를 도입시켜 XQ56/p15CadA, XQ59/p15CadA, XQ60/p15CadA을 제조한 후, 배양함으로써 변이 미생물의 카다베린 생성능이 급격히 증가됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른관점에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
상기 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)의 프로모터는 세포내 DAP 혹은 전구체인 L,L-diaminopimelate에 의해서 억제되기 때문에, dapA유전자의 promoter를 strong promoter로 치환시키면 lysine에 대한 대사 플럭스를 증가시킬 수 있다. 그리고, 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)의 프로모터는 lysine에 의해서 억제되기 때문에, 이를 lysA 유전자의 promoter를 strong promoter로 치환시키면 카다베린으로의 흐름을 강화시킬 수 있으며, 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)의 프로모터는 lysine에 의해서 억제되기 때문에, dapB유전자의 promoter를 strong promoter로 치환시키면 카다베린으로의 흐름을 강화시킬 수 있다.
상기 변이 미생물은 앞서 설명한 바와 같이, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실될 수 있으며, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭될 수 있다.
상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하며, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에 있어서, 상기 변이 미생물을 배양하여 카다베린을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 것을 특징으로 하는 퓨트레신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 카다베린의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 카다베린의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 카다베린의 생물공학적 생산은 세포 내 혹은 세포 외(invivoorinvitro)에서 수행될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 제거하기 위하여 특정 벡터와 숙주세포로 카다베린 생성 미생물인 에스케리치아 속(Escherichiasp.) 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 벡터와 카다베린 생성 미생물들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1 : 카다베린 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 결실된 변이 균주의 제조 방법
본 발명에서 염색체 상의 일련의 유전자들(speE, speG, ygjG , puuA , puuP)의 결실은 이중 교차 상동 재조합 방법에 의해서 수행되었다 (Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. Proc.Natl.Acad.Sci.,97:6640-6645,2000). lox71-chloramphenicol marker (CmR)-lox66카세트는 타겟 유전자의 상단서열(upstream)과 하단서열(downstream)과 상동하는 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR을 통해 제조하였다. 이때 lox71-CmR-lox66카세트를 포함하는 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMSMicrobiol.Lett.,278:78-85,2008)를 PCR의 주형으로 사용하였다.
상기 PCR 산물들은 λ recombinase를 포함하는 전기충격용 대장균 세포(electrocompetent cells)에 트랜스포메이션시켰다. 콜로니들은 클로로암페니콜(Cm; 34μg/ml)을 포함하는 Luria-Bertani (LB) agar (Sambrook, J., Fritsch E. F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) 플레이트에서 선택되었다. CmR 의 성공적인 유전자 대체는 direct colony PCR에 의해서 확인되었다. 상기 항생제 마커는 차후에 temperature-sensitive replication origin과 IPTG-inducible cre recombinase (Palmeros etal.,Gene,247:255-264,2000)를 포함하는 helper plasmid pJW168(Lucigen Corporation, Middleton,WI, USA)에 의해 제거되었다.
참고로, pECmulox는 서열번호 1 및 2의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pACYC184 (New England Biolabs, Ipswich, MA,USA)를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 산물을 HindIII와 SmaI 제한효소로 처리한 후, HindIII와 EcoRV으로 절단한 pUG6 (Guldener, U etal.NucleicAcidsRes.,24:2519~2524,1996)플라스미드와 라이게이션하여 제조하였다.
[서열번호 1] : 5’-ATATAAGCTTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCCCTGAA CCGACGACCG-3’
[서열번호 2] : 5’-AATTCCCGGGTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCATCACCC GACGCACTTTGC-3’
1-1: WL3110 균주의 제조
서열번호 3 및 4의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, lacI 유전자가결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, λ recombinase를 함유하는 전기충격용 대장균(W3110)에 electroporation하여 WL3110(W3110 Δ lacI)를 제조하였다.
[서열번호 3] : 5’-GTGAAACCAGTAACGTTATACGATRTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTAGATT GGCAGCATTACACGTCTTG-3’
[서열번호 4] : 5’-TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGCACT TAACGGCTGACATGGG-3’
1-2: XQ08 균주의 제조
서열번호 5 및 6의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speE 유전자가결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-1에서 제조된 WL3110 균주에 electroporation하여 XQ08 균주(W3110 ΔlacIΔspeE)를 제조하였다.
[서열번호 5]: 5’-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTGTCGGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 6]: 5’-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCCATGCCG CATAGGCCACTAGTGGA-3’
1-3: XQ11 균주의 제조
서열번호 7 및 8의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speE 유전자가결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-2에서 제조된 XQ08 균주에 electroporation하여 XQ11 균주(W3110 ΔlacIΔspeEΔspeG)를 제조하였다.
[서열번호 7]: 5’-GAATGTAAGGACACGTTATGCCAAGCGCCCACAGTGTTAAGCTACGCCCGGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 8]: 5’-CTATTGTGCGGTCGGCTTCAGGAGAGTCTGACCCGGTGTTTTGTGCTCTGCCG CATAGGCCACTAGTGGA-3’
1-4: XQ21 균주의 제조
서열번호 9 및 10의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, ygjG 유전자가결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-3에서 제조된 XQ11 균주에 electroporation하여 XQ21 균주(W3110 ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjG)를 제조하였다.
[서열번호 9]: 5’-CTGCAATACTTAAATCGGTATCATGTGATACGCGAGCCTCCGGAGCATATGACA CTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 10]: 5’-CGTCGTATCGCCATCCGATTTGATATTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCCCG CATAGGCCACTAGTGGA-3’
1-5: XQ27 균주 생성
서열번호 11 및 12의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, puuA 유전자가결실된 PCR 산물을 제조하고, 서열번호 12 및 13의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, puuP 유전자가결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 각각 정제한 후, 상기 1-4에서 제조된 XQ21 균주에 순차적으로 electroporation하여 XQ27 균주(W3110 ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuA)를 제조하였다.
[서열번호 11]: 5’-GATGAAACAACCCCGCAAGGGGTATTACGCGTTTTTCAACATCCACTCAAGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 12]: 5’-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGTTGCC GCATAGGCCACTAGTGGA-3’
[서열번호 13]: 5’-TCACCATCATACAACGGCACTTTGCGATAGCGGCGGATCAGATACCATAAGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3’
실시예 2: 프로모터의 치환
카다베린의 생성능을 향상시기키 위하여, 상기 1-5에서 제조된 변이 균주(XQ27)의 프로모터를 strong promoter인 trc promoter로 치환시켰다.
2-1: XQ56 균주의 생성
디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc 프로모터로의 교환은 하기의 내용에 따라 수행하였다.
융합된 lox71-클로로암페니콜 항생제 마커-lox66 DNA 절편은 주형으로 pECmulox, 프라이머로 서열번호 14 및 15를 사용하여 첫 번째 PCR을 통해 획득하였다.
[서열번호 14]: 5’-GGTGAGTTGTTCTTAAGGAAAGCATAAAAAAAACATGCATACAACAATCAGA ACGGGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
[서열번호 15]: 5’-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAC AGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3’
trc 프로모터를 도입하기 위하여, 첫번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 16 및 17의 프라이머를 사용하여 두번째 PCR 반응을 수행하였다.
[서열번호 16]: 5’-TCACCAGATAATGTTGCGATGACAGTGTCAAACTGGTTATTCCTTTAAGGGG TGAGTTGTTCTTAAGGAAAG-3’
[서열번호 17]: 5’-GTAACAATCGCGACAATACTTCCCGTGAACATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAA TTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3’
최종 PCR 산물을 XQ27 균주 (W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuA)에 electroporation한 다음 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ56 균주 (W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuAPdapA::Ptrc)를 획득하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-2: XQ59 균주의 생성
디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다.
첫 번째 PCR 반응은 주형으로써 플라스미드인 pECmulox와 상기의 서열번호 15와 하기의 서열번호 18 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 18]: 5’-TAAGTTAACGGCGGCCATTAGCGCTCTCTCGCAATCCGGTAATCCATATCAT TGACACTATAGAACGCGGCCG-3’
두 번째 PCR 반응은 상기 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 하기 서열번호 19 및 20의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 19]: 5’-CTCAGTCAGGCTTCCGGCGGTCATTACCGCATGAAAAATTTCAATATGACGTA AGTTAACGGCGGCCATTA-3’
[서열번호 20]: 5’-GATCGGTATCGGTGCTGAACAGTGAATGTGGCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3’
최종 PCR 산물을 2-1에서 제조한 XQ56 균주(W3110 ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuAPdapA::Ptrc)에 electroporation한 다음 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ59 균주 (W3110 ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuAPdapA::PtrcPlysA::Ptrc)를 획득하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-3: XQ60 균주의 생성
디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다.
첫 번째 PCR 반응은 주형으로써 플라스미드인 pECmulox와 상기의 서열번호 15와 하기의 서열번호 21 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 21]: 5’-GTCATTCATCGACTCATGCCTTTCACTGATATCCCTCCCTGTTTGACACTAT AGAACGCGGCCG-3’
두 번째 PCR 반응은 상기 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 하기 서열번호 22 및 23의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 22]: 5’-TGGCTCTGGCGTCGTAACCTGTCACATGTTATTGGCATGCAGTCATTCATCG ACTCATGCC-3’
[서열번호 23]: 5’-GGCAACGCGGATGTTTGCATCATGCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT ATCCGCTCACAATTCCACA-3’
세 번째 PCR 반응은 상기 두 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 하기 서열번호 24 및 25의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 24]: 5’-GATGTGAAAGGCTTCCAGCAGTGGGTGGCTGAGGTGCTGGCTCTGGCGTCGT AACCT-3’
[서열번호 25]: 5’-TGAATCAACTGGCGGCCCATACGCCCCCCGGCTCCCGCGATGGCAACGCGGA TGTTTGCAT-3’
최종 PCR 산물을 2-2에서 제조한 XQ59 균주(W3110 ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuAPdapA::PtrcPlysA::Ptrc)에 electroporation한 다음 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ60 균주(W3110 ΔlacIΔspeEΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuAPdapA::PtrcPlysA::PtrcPdapB::Ptrc)를 획득하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 3: cadA 유전자가 도입된 균주의 제조
3-1: p15CadA plasmid 제조
라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 증폭하기 위해 E. coli W3110 (E.coliK-12에서 파생, λ-,F-,prototrophic)의 genomic DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 26 및 27의 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.
[서열번호 26]: 5’- CGTCGAATTCATGAACGTTATTGCAATATTG-3’
[서열번호 27]: 5’- GCTCGAGCTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3’
다음으로, pTac15K를 EcoRI으로 자르고 Mung Bean Nuclease를 처리한 후에, 이를 다시 SacI으로 잘라 4.0kb의 DNA 단편을 얻었다. 이 단편을 상기의 PCR 산물(2,168bp)을 SacI으로 자른 것과 결합시킨 후에 E. coli TOP 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 도입시키고 클로닝하여 p15CadA 플라스미드를 제조하였다.
참고로, pTac15K는 p15A origin과 tac 프로모터, 카나마이신 저항성 유전자를 갖고 있는 플라스미드로서, 다음의 과정을 통하여 제작할 수 있다. 먼저, 플라스미드 pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 SphI으로 절단한 후, Klenow 효소 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 처리하고, 다시 EcoRI으로 상기의 효소처리 산물을 절단하여 0.4kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 그다음, 플라스미드 pHNC15K를 NheI으로 절단한 이후, Klenow 효소와 다시 EcoRI을 순차적으로 처리하여 3.5kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 다음으로 이 두 DNA 절편을 라이게이션하여, 플라스미드 pTac15K를 제조하였다. pHNC15K는 pTac15K의 제조방법과 유사한 방법을 통하여, pACYC177 (New England Biolabs, Ipswich, MA,USA), pHCE IIB (TaKaRa Korea Biomedical, Seoul,Korea), pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)의 DNA 절편들로부터 만들어진 것이다.
p15CadA는 lacI가 결실된 E. coli에서 강한 tac promoter를 이용해 cadA gene을 constitutive하게 발현시킬 수 있다.
3-2: WL3110/p15CadA 균주 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 1-1에서 제조한 WL3110 균주에 electroporation하여 WL3110/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-3: XQ27/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 1-5에서 제조한 XQ27 균주에 electroporation하여 XQ27/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-4: XQ56/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 2-1에서 제조한 XQ56 균주에 electroporation하여 XQ56/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-5: XQ59/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 2-2에서 제조한 XQ59 균주에 electroporation하여 XQ59/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-6: XQ60/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 2-3에서 제조한 XQ60 균주에 electroporation하여 XQ60/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-7: XQ56 ΔaceF /p15CadA 균주의 제조
2-1에서 제조한 XQ56 균주에서 pyruvate dehydrogenase complex 중 하나인 aceF(dihydrolipoamide acetyltransferase)를 결실시킨 균주에 3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 electroporation하여 XQ56 ΔaceF/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
실시예 4: 변이 미생물을 이용한 카다베린 생산
cadaverine 분해와 이용의 활성은 decarboxylase의 활성과 함께 회분식(batch) 배양을 이용하여 측정하였다.
회분식 배양은 6.6L 발효기 (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)를 이용하였고, 최소배지인 R/2 배지 2L에 글루코오스 10g /L, (NH4)2SO4 3g/L를 첨가하였다. R/2 배지는 (NH4)2HPO4 2g/L, KH2PO4 6.75g/L, citric acid 0.85g/L, MgSO47H2O 0.7g/L, 및 0.5% (v/v) trace metal solution (Qian et al., Biotechnol. and Bioeng, 101(3): 587-601, 2008)을 포함한다. Trace metal solution은 1리터당 5M HCl: 10g FeSO47H2O, 2.25g ZnSO47H2O, 1g CuSO45H2O, 0.5g MnSO45H2O, 0.23g Na2B4O710H2O, 2g CaCl22H2O, 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을포함한다.
LB 배지에서 활성화된 100μL 변이 균주(WL3110/pL15CadA 균주, XQ27/p15CadA 균주, XQ56/p15CadA 균주)들을 예비 최소배지로 접종시킨 후, 37℃, 220rpm으로 24시간동안 배양하였다. 그 후, 이들 중 1ml을 동일한 배지 50mL을 포함하는 350-mL baffled flask에 첨가한 후, 37℃, 220rpm으로 14시간 동안 배양하였다. 전 배양액중 200ml은 발효의 접종원으로 사용하고, 발효시 용존산소는 교반속도를 자동적으로 조절함으로써 포화공기 20%로 유지하였고, 6M의 KOH를 이용하여 pH를 6.80로 유지시켰다. 또한, 변이 균주 (XQ56 ΔaceF/p15cadA 균주) 100μL는 LB 배지에 접종하여 37°C, 220rpm 으로 15시간 배양하였다. 그 후, LB 배지에서 활성화된 1mL의 변이균주를 최소배지에 접종시킨 후, 37℃, 220rpm으로 18시간 동안 배양하였다. 이때, 배양은 350-mL baffled flask에서 진행하였고, 최소배지 90mL, 100g/L 농도의 글루코오스 10mL 총 100mL의 용량에서 실험을 진행하였다. 배양액은 샘플링 한 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 분리한 후에, 해리된 상등액을 HPLC로 분석하였다. 상등액에 포함된 cadaverine은 C18-reverse phase column이 장착된 휴렛페커드 1100 시리즈 장비(230nm 영역)에서 ophthaldialdehyde(OPA) 유도체로 검출하였다. 이때, 이동상으로는 solvent A (0.1 M의 sodium acetate의 55% methanol)와 solvent B (methanol)를 이용하였다.
분석은 다음의 조건(1-6분: 100% buffer A equilibration, 6-10분: buffer B의 0-30% linear gradient, 10-15분: buffer B의 30-50% gradient, 15-19분 buffer B의 50-100% gradient, 19-23분 buffer B의 100%까지 gradient, 23-25분: buffer B의 100-30% gradient, 25-28분 buffer B의 30%에서 buffer A의 100%까지 0.8ml/min의 흐름 속도 gradient)에서 수행되었다. 이때, 보정을 위하여 표준물질을 사용하였으며, 측정된 카다베린의 농도는 도 2와 도 4에 나타내었다.
도 2에 도시된 바와 같이, WL3110/pL15CadA 균주는 0.79g/l, Cadaverine의 분해 및 이용 대사경로를 결실시킨 XQ27/p15CadA 균주는 1.19g/l, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)가 과발현된 XQ56/p15CadA 균주는 1.31g/l의 cadaverine을 생성하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)가 과발현된 경우에도 cadaverine의 생성량은 비슷한 수준을 보였다.
또한, 도 4에 도시된 바와 같이, XQ56 균주에서 pyruvate dehydrogenase complex 중 하나인 aceF(dihydrolipoamide acetyltransferase)를 결실시킨 XQ56 ΔaceF/p15cadA 균주는 플라스크 배양 상에서 XQ56/p15cadA 균주와 비교하여 카다베린 생산량이 약 1.5배 정도 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: XQ56/p15CadA 균주의 유가 배양을 통한 카다베린의 생산
실시예 4의 6.6L 발효기에서 XQ56/p15CadA 균주의 유가(fed batch) 배양을 수행하였다. 종균배양(Seed culture)은 실시예 4에 기재한 바와 같이, 약 14시간 동안 220rpm, 37℃에서 50 ml의 R/2 배지를 포함하는 350 mL baffled flask에서 수행하였다. 전 배양액중 200ml은 발효의 접종원으로 사용하고, 발효시 용존산소는 교반속도를 자동적으로 조절함으로써 포화공기 20%로 유지하였다.
글루코오스 소진에 따라 배양액의 pH가 6.8로 고정된 값보다 약 0.01 증가했을 때, 글루코오스 농도를 3g/L 이상으로 증가시키기 위해 공급 용액은 자동적으로 추가되었다. 또한 공급용액은 577g/L의 글루코오스, 8g/L의 MgSO4, 115g/L의 (NH4)2SO4를포함한다. 글루코오스의 소진에 따른 pH 증가의 짧은시간을 제외하면 대부분 10M KOH를 추가함으로써 pH를 6.8로 유지시켰다. 샘플을 채취하고, 원심분리를 사용하여 세포를 분리한 후에 해리된 상등액을 실시예 4와 동일한 방법으로 HPLC 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, XQ56/p15CadA 균주는 접종 30시간 후, 9.61g/l의 카다베린을 생산하였고, 이때 카다베린의 생산성은 0.32 g L-1h-1이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하고, 이를 이용함으로써, 산업적으로 널리 사용되는 카다베린을 고수율로 제조하는데 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (35)

  1. 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.)및 사카로마이세스 속( Saccharomycessp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  7. 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE ), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자 (dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  12. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.)및 사카로마이세스 속( Saccharomycessp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  13. 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE ), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)가 약화 또는 결실되어 있고, lac 오페론억제인자를코딩하는유전자(lacI)가 결실되어 있으며, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  15. 제13항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 추가로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.)및 사카로마이세스 속( Saccharomycessp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  18. 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론억제인자를코딩하는유전자(lacI)를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 추가로 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.)및 사카로마이세스 속( Saccharomycessp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  24. 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, 상기 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter를 strong promoter로 치환시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  26. 제24항에 있어서, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 추가로 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.)및 사카로마이세스 속(Saccharomycessp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  30. 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE),스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG),퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG),퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP),및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)를 약화 또는 결실시키고, lac 오페론억제인자를코딩하는유전자(lacI)를 결실시킨 다음, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA),디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter를 strong promoter로 추가로 치환시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillussp.),코리네박테리움 속(Corynebacteriumsp.),에스케리치아 속(Escherichiasp.),피치아 속(Pichiasp.),슈도모나스 속(Pseudomonassp.)및 사카로마이세스 속(Saccharomycessp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  35. 제1항 내지 제17항중 어느 한 항의 변이 미생물을 배양하여 카다베린을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 것을 특징으로 하는 카다베린의 제조방법.
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