WO2012029224A1 - 標的物質の検出方法、それに用いるアブタマーセット並びにセンサ及び装置 - Google Patents

標的物質の検出方法、それに用いるアブタマーセット並びにセンサ及び装置 Download PDF

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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target substance, an aptamer set, a sensor and an apparatus used therefor.
  • Aptamers refer to nucleic acids (DNA, RNA, PNA) and peptides that have the ability to bind to specific substances.
  • a sequence having a significant binding force is selected from a nucleic acid library using a method called “Systematic Evolution of Ligands by Experimental Enrichment (SELEX)” described in Non-Patent Document 1.
  • target substances Sensors that utilize the specific binding ability of aptamers and aptamer binding target substances (hereinafter referred to as target substances) have been studied and developed for various purposes such as disease diagnosis, environmental monitoring, and inspection of belongings. Yes. Many of such sensors detect a target substance by detecting physical and chemical changes that occur in the aptamer and the target substance due to the binding of the aptamer and the target substance.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 propose a sensor that uses hybridization of aptamers.
  • a complementary strand 21 (a nucleic acid 21 having a complementary sequence, but not an aptamer) of an aptamer 20 is immobilized on an electrode 23.
  • the complementary strand 21 is hybridized with the aptamer 20 modified with the electrode reactant 22.
  • the target substance 24 is added, the aptamer 20 and the target substance 24 are bound (FIG. 1B).
  • the aptamer 20 and the complementary strand 21 are cleaved, and the aptamer 20 is released from the surface of the electrode 23 (FIG.
  • Non-Patent Document 3 an aptamer switch probe is disclosed. In this method, an aptamer labeled with a fluorescent molecule and a complementary strand modified with a quencher are hybridized.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a target substance detection method, aptamer set, sensor and apparatus used therefor, which are highly sensitive even when the target substance has a low concentration. There is to do.
  • the base sequence of the first aptamer to which the target substance binds includes at least a part of the base sequence of the double-stranded formation site of the first aptamer,
  • the base sequence of the first aptamer to which the target substance binds includes at least a part of the base sequence of the double-stranded formation site of the first aptamer,
  • the base sequence of the second aptamer to which the non-target substance binds is a complex of the target substance consisting of a complex containing at least part of the base sequences of two or more of the double-strand formation sites of the second aptamer.
  • the first aptamer has one or more double-stranded sites;
  • the second aptamer has two or more duplex-forming sites;
  • the base sequence of the first aptamer to which the target substance binds includes at least a part of the base sequence of the double-stranded formation site of the first aptamer,
  • the base sequence of the second aptamer to which the non-target substance binds includes at least a part of the base sequence of the two or more double-stranded formation sites of the second aptamer;
  • the sensor Means for binding the target substance to the first aptamer; Means for binding a substance different from the target substance to a second aptamer; Means for detecting cleavage of the double-stranded forming site of the first aptamer.
  • a method for detecting a target substance, an aptamer set, a sensor and an apparatus used therefor which are highly sensitive even when the target substance has a low concentration.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the first embodiment.
  • the detection method of the target substance 5 according to the first embodiment includes a first aptamer 1 to which the target substance 5 in the test sample (test object) specifically binds, and a non-target substance other than the target substance 5 A second aptamer 2 to which (second ligand 6) specifically binds, wherein the first aptamer 1 has a double-strand formation site formed by one or more double strands, The aptamer 2 of 2 has two or more double strand forming sites, and the base sequence of the first aptamer 1 to which the target substance 5 binds is the base sequence of the double strand forming site of the first aptamer 1
  • the complex comprising at least a part and the base sequence of the second aptamer 2 to which the second ligand 6 binds includes at least part of the base sequence of two or more double-stranded formation
  • this target substance detection method includes a first aptamer 1 to which a target substance 5 in a test sample (test object) specifically binds, and a non-target substance other than the target substance 5 (second ligand).
  • the composite 4 is prepared.
  • This complex 4 has a nucleic acid fragment 3 having a sequence complementary to a part of the second aptamer 2.
  • the first aptamer 1 has at least one double-strand formation site with the second aptamer 2, and the second aptamer 2 is the same as the first aptamer 1.
  • the aptamer duplex forming site is a site where an aptamer and a complementary strand (another aptamer or nucleic acid fragment) having a complementary sequence form a nucleic acid duplex.
  • double-stranded nucleic acid site (Hereinafter simply referred to as a double-stranded nucleic acid site).
  • the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 is the same as the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 (shares a part of the same base sequence) or the first aptamer 1
  • the site has a base sequence complementary to the double-stranded nucleic acid site.
  • the target substance 5 is the first ligand
  • the substance different from the target substance 5 is the second ligand 6.
  • the second ligand 6 is added in advance to the test sample (test object).
  • the step of detecting the target substance 5 from the step of preparing the complex 4 will be described separately from the following first step to fourth step.
  • the target substance 5 binds to the first aptamer 1 (FIG. 2B).
  • one end of the first aptamer 1 forms a double-stranded nucleic acid site, but the other end is in a single-stranded state. That is, the structure of one end of the first aptamer 1 can be freely deformed. Therefore, the 1st aptamer 1 can take the three-dimensional structure as an aptamer, and can couple
  • the double strand at the double-stranded nucleic acid site formed between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 is cleaved. That is, when the first aptamer 1 and the target substance 5 are bound in the first step, the double-stranded nucleic acid site is eliminated by branch migration. This branch migration occurs when the binding between the target substance 5 and the first aptamer 1 is stronger than the binding between the nucleic acids forming the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1.
  • the first aptamer 1 moves away from the second aptamer 2 (FIG. 2 (c)).
  • the base sequence of the first aptamer 1 to which the target substance 5 binds is common to a part or all of the base sequence of the double-stranded forming site of the first aptamer 1. For this reason, when the target substance 5 binds to the first aptamer 1, the structure of the first aptamer 1 in the double-stranded nucleic acid site is deformed, and the first aptamer 1 and the second aptamer 2 are cleaved.
  • the second ligand 6 is bound to the second aptamer 2 (FIG. 2 (d)).
  • the second aptamer 2 Prior to the second step, the second aptamer 2 has two double-stranded nucleic acid sites. That is, the structure of both ends of the second aptamer 2 cannot be freely deformed. For this reason, the second aptamer 2 cannot take a three-dimensional structure as an aptamer and does not bind to the second ligand 6.
  • the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 becomes one place.
  • the structure of one end of the second aptamer 2 can be freely deformed. Therefore, the second aptamer 2 can form a three-dimensional structure as an aptamer. Therefore, the second aptamer 2 can bind to the second ligand 6 present in the test sample.
  • the base sequence of the second aptamer 2 to which the second ligand 6 binds is common to some or all of the base sequences of the two double-stranded formation sites of the second aptamer 2. For this reason, when the second ligand 6 binds to the second aptamer 2, the structure of the two double-stranded nucleic acid sites of the second aptamer 2 is deformed.
  • the first aptamer 1 becomes difficult to form a double-stranded nucleic acid site.
  • the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 are cleaved as described later. To do.
  • the double strand formed between the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 is cleaved.
  • the double-stranded nucleic acid site is eliminated by branch migration as in the second step.
  • the second aptamer 2 is cleaved, the second aptamer 2 is separated from the complementary nucleic acid fragment 3 (FIG. 2 (e)). Thereafter, cleavage of the double-strand formation site of the first aptamer 1 is detected.
  • the detection of the cleavage at the double-stranded formation site of the first aptamer 1 is not limited as long as the physical and chemical changes caused by the double-stranded cleavage at the double-stranded nucleic acid site can be detected. It means detecting a signal change such as an optical signal, an electrical signal, or a color signal.
  • the effect of the first embodiment will be described in comparison with the technique described in the patent literature.
  • the target substance and the complementary strand undergo a competitive reaction with the aptamer. Since this competitive reaction is an equilibrium reaction, when the concentration of the target substance is low, the cleaved aptamer may form a complementary strand and a double strand again. For this reason, the amount of aptamer cleavage is reduced, making it difficult to obtain a sufficient amount of signal change.
  • the structure of a part of the second aptamer 2 having the above is deformed. For this reason, it becomes difficult for the first aptamer 1 to form a double strand with the base sequence portion having such a deformed structure. Thereby, even if the target substance 5 is desorbed from the first aptamer 1, it is possible to suppress the first aptamer 1 from forming a double-stranded nucleic acid site again with the second aptamer 2.
  • the double-strand cleavage at the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 can be maintained. Therefore, even when the concentration of the target substance 5 is low, the signal change amount of the cleavage of the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 can be increased as compared with the technique described in the above patent document. it can. Therefore, according to the first embodiment, the standard substance can be detected with high sensitivity.
  • the test object does not contain a substance that binds to the first aptamer 1
  • the first aptamer does not bind to the substance in the test object, and the second aptamer 2
  • the double strand in the double stranded nucleic acid site between is not resolved. Therefore, the double strand at the double-stranded nucleic acid site between the second aptamer 2 and the complementary nucleic acid fragment 3 is not cleaved.
  • the cleavage at the double-stranded nucleic acid site formed between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 and the double-stranded nucleic acid site formed between the second aptamer 2 and the complementary nucleic acid fragment 3 It is possible to detect whether or not the target substance 5 is contained in the test object by detecting the cleavage at or both of the two.
  • the concentration of the second ligand 6 in the test object is not less than the dissociation constant (Kd2) between the second aptamer 2 and the second ligand 6, and the first The concentration is preferably equal to or higher than the concentration of the complex 4 including the aptamer 1, the second aptamer 2, and the nucleic acid fragment 3.
  • Kd2 dissociation constant
  • the first aptamer 1 separated from the second aptamer 2 in the second step releases the target substance 5 according to the equilibrium reaction and becomes a single-stranded state, it recombines with the second aptamer 2. Is inhibited. Therefore, even when the target substance 5 is at a low concentration, dissociation of the first aptamer 1 and the second aptamer 2 proceeds and a large signal can be obtained.
  • the double-stranded nucleic acid formed between the cleavage at the double-stranded nucleic acid site formed between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 complementary to the second aptamer 2 A double test can be done by detecting both cleavage at the site. This improves the reliability of the measurement.
  • fluorescent molecules are emitted so that fluorescence of different wavelengths is emitted when the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 is cleaved and when the double-stranded nucleic acid site of the nucleic acid fragment 3 is cleaved. It is only necessary to distinguish between signal changes caused by cleavage of each double-stranded nucleic acid site.
  • the concentration of the second ligand 6 is preferably 5 times or more, more preferably 50 times or more the dissociation constant (Kd2) of the second aptamer and the second ligand.
  • the second ligand 6 is added to the test object which is a measurement solution prior to the first step, but the timing of addition is not particularly limited, but the second ligand 6 May be present when the second aptamer 2 recovers its binding ability as an aptamer, and may be added simultaneously with or between the first to third steps.
  • the first aptamer 1 is a nucleic acid that can specifically bind to the target substance 5 and complements that can form a double-stranded nucleic acid site with the second aptamer 2. What is necessary is just to have a simple base sequence.
  • the first aptamer 1 may be DNA or RNA, or may be an artificial nucleic acid such as PNA.
  • the first aptamer 1 is not particularly limited, but preferably has an aptamer structure that specifically binds to an epitope of the target substance 5 and may partially have a structural part that does not bind to the target substance 5. .
  • the first aptamer 1 can be obtained using, for example, a known aptamer screening method such as the SELEX method. Further, if necessary, a nucleic acid sequence obtained by SELEX or the like plus a desired base sequence may be synthesized.
  • the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 and the second aptamer 2 may be in any part of the first aptamer 1, for example, in the end part of the aptamer or in the center part. May be. Further, the entire sequence of the single-stranded nucleic acid of the first aptamer 1 may form a double-stranded nucleic acid site.
  • the double-stranded nucleic acid site here includes a part of the base sequence that binds to the target substance 5 in order to facilitate branch migration when the target substance 5 and the first aptamer 1 are bound.
  • the length is 5 to 20 bases.
  • the first aptamer 1 may be modified with a fluorescent substance or a labeling substance such as a quencher for detection of a double-stranded nucleic acid site described later.
  • the second aptamer 2 is a nucleic acid that can specifically bind to the second ligand 6, and the first aptamer 1, the nucleic acid fragment 3, and the double-stranded nucleic acid What is necessary is just to have the complementary base sequence which can form a site
  • the second aptamer 2 as in the first aptamer 1, DNA, RNA, PNA or the like obtained by using a known aptamer screening method such as the SELEX method can be used.
  • a nucleic acid sequence obtained by the above method may be synthesized by adding a desired base sequence.
  • the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 and the first aptamer 1 may be in any part of the second aptamer 2, for example, in the end part of the second aptamer 2. However, it may be in the center.
  • the double-stranded nucleic acid site with the first aptamer 1 is a base that binds to the second ligand 6 so as to inhibit rebinding of the first aptamer 1 when the second ligand 6 binds. It is preferably formed so as to include a part of the sequence, and the length is preferably 5 to 20 bases.
  • the structure of the complementary strand (second aptamer 2) of the first aptamer corresponding to the double-stranded nucleic acid site can be deformed by binding to the second ligand 6 (substance).
  • the double-stranded nucleic acid site with the nucleic acid fragment 3 includes a part of the base sequence that binds to the second ligand 6 in order to facilitate branch migration when the second ligand 6 is bound.
  • the length is 5 to 20 bases.
  • the second aptamer 2 may be modified with a fluorescent substance or a labeling substance such as a quencher for detection of a double-stranded nucleic acid site described later.
  • the nucleic acid fragment 3 has a complementary base sequence that can form a double-stranded nucleic acid site with the second aptamer 2, for example, DNA, RNA, PNA, etc. Can be used. Further, the nucleic acid fragment 3 may have a non-complementary base sequence in addition to a base sequence complementary to the second aptamer 2 in a part thereof.
  • the double-stranded nucleic acid site with the second aptamer 2 may be in any part of the nucleic acid fragment 3, for example, at the end or at the center.
  • the nucleic acid fragment 3 may be modified with a fluorescent substance or a labeling substance such as a quencher for detection of a double-stranded nucleic acid site described later.
  • the complex 4 formed by binding the first aptamer 1 and the nucleic acid fragment 3 to the second aptamer 2 is obtained by mixing a solution in which each nucleic acid is mixed. It can be formed by annealing. Conditions such as temperature and time for annealing may be general conditions, and are appropriately set based on the length and type of complementary base pairs of the sequence to be used, salt concentration, and the like.
  • the concentration of the complex 4 is not particularly limited, but is preferably 1 nM or more and 1 mM or less so that cleavage at the double-stranded nucleic acid site can be easily detected.
  • the target substance detection method of the first embodiment is usually performed in a solution containing an inspection object.
  • the solution may be a general reaction solution.
  • conditions such as temperature at the time of performing each process, pH, a metal ion, are set appropriately.
  • Mg 2+ ions may be added to the solution.
  • a temperature condition, pH, or the like that cannot maintain the double-stranded bond of the nucleic acid is not desirable.
  • cleavage at a double-stranded nucleic acid site formed between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 and a nucleic acid fragment 3 complementary to the second aptamer 2 As a method for detecting cleavage at a double-stranded nucleic acid site formed between the two, a general method for detecting cleavage of a double-stranded nucleic acid can be used, and the method is not particularly limited.
  • Non-patent Document 3 a method using a fluorescent dye and a quencher
  • Patent Document 1 a method of modifying gold nanoparticles into a nucleic acid and detecting its aggregation and dispersion
  • Patent Document 1 A method using a double-stranded nucleic acid indicator such as SYBR Green I, which is used for quantifying the amount of double-stranded nucleic acid sites in real-time PCR, and the like.
  • FIG. 2A an example of detection of cleavage of a double-stranded nucleic acid site when a fluorescent dye (fluorescent substance 8) and a quencher 9 are used as modifiers will be described with reference to FIG. 2 again.
  • the fluorescent substance 8 is modified at one end of the second aptamer 2 and the quencher 9 is modified at one end of the nucleic acid fragment 3.
  • the base sequence at the end of the second aptamer 2 and the base sequence at the end of the nucleic acid fragment 3 are continuous and complementary so that the fluorescent substance 8 and the quencher 9 are close to each other.
  • a fluorescence measurement is performed with respect to the solution (FIG. 2 (a)) of a test object.
  • the fluorescence of the fluorescent substance 8 modified with the second aptamer 2 is weakened because the quencher 9 of the nucleic acid fragment 3 is close.
  • the solution is measured for fluorescence.
  • the target substance 5 binds to the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 (FIG. 2B), and the first aptamer 1 becomes the second aptamer. 2 (FIG. 2 (c)).
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6 (FIG. 2 (d)), the double-stranded nucleic acid portion of the second ligand disappears, and the second aptamer 2 moves away from the nucleic acid fragment 3 ( FIG. 2 (e)). Thereby, the quencher 9 leaves.
  • the fluorescence of the fluorescent substance 8 of the second aptamer 2 is recovered. Therefore, the fluorescence intensity of the solution becomes larger when the target substance 5 is brought into contact with the first aptamer 1.
  • the first aptamer 1 continues to bind to the nucleic acid fragment 3, and therefore the second aptamer 2 is not separated, so that the fluorescence intensity of the solution does not change.
  • the presence or absence of the target substance 5 can be examined by comparing the fluorescence intensities before and after contacting the test object.
  • an aptamer set including the complex 4 can be used for detection of the target substance 5. That is, in this aptamer set, the first aptamer 1 to which the target substance 5 in the test sample specifically binds and the non-target substance (second ligand 6) other than the target substance 5 specifically binds.
  • a second aptamer 2 wherein the first aptamer 1 has one or more double-stranded formation sites, and the second aptamer 2 has two or more double-stranded formation sites
  • the first base sequence of the first aptamer to which the target substance 5 binds includes at least a part of the base sequence of the double-strand formation site of the first aptamer 1, and the second aptamer 2 to which the second ligand 6 binds.
  • the base sequence consists of a complex containing at least part of the base sequence of two or more double-stranded formation sites of the second aptamer 2.
  • the double-strand formation site of the first aptamer 1 is cleaved by the binding between the target substance 5 and the first aptamer 1.
  • the structure of the first aptamer 1 corresponding to the double-stranded formation site is deformed by the binding between the second ligand 6 and the second aptamer 2, or the double-stranded nucleic acid site together with the first aptamer 1 The structure that forms is deformed. Thereby, the effect of this Embodiment is acquired.
  • the detection apparatus for the target substance 5 includes the test object including the target substance 5, the first aptamer 1, the second aptamer 2, and the nucleic acid fragment 3 in the double-stranded nucleic acid site.
  • Such a detection unit for detecting the cleavage of the double-stranded nucleic acid site is not limited as long as it can detect a physical or chemical change caused by the cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • an optical signal an electrical signal
  • Examples include detection of signal changes such as color signals.
  • this target substance detection apparatus even if the target substance has a low concentration, a large signal change occurs and high measurement sensitivity can be obtained by the target substance detection method described above.
  • the first aptamer 1 and / or the second aptamer forms a complex 4 by forming a double strand at the nucleic acid fragment 3 and a double-stranded nucleic acid site. .
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the second embodiment. Since the second embodiment is an application of the first embodiment, the description of the same points as the first embodiment will be omitted.
  • the first aptamer 1 and the second aptamer 2 form at least one double-stranded nucleic acid site, and the second aptamer 2 is the first aptamer.
  • the double-stranded nucleic acid site with 1 a nucleic acid fragment 3 and a double-stranded nucleic acid site are formed.
  • At least one of the first aptamer 1, the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 is fixed to the member. Thereby, the composite 4 is fixed to the member.
  • the first aptamer 1, the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 can be the same as those in the first embodiment, but at least one of them is fixed to the member. It is preferable to have a functional group. Such a functional group is not limited as long as it can form a covalent bond or specific adsorption with the surface of the member. For example, carboxyl group, amino group, thiol group, disulfide group, succinimidyl group, maleimide group And biotin. As these functional groups, those prepared by a general nucleic acid synthesis method can be used. In addition, the functional group may be modified at any site as long as it does not interfere with the specific binding between the aptamer and the ligand. For example, the functional group may be present at the end of the first aptamer 1, the second aptamer 2 or the nucleic acid fragment 3. It may be in the central part.
  • the material according to the second embodiment is not particularly limited as long as the member can fix the nucleic acid or can be processed so as to fix the nucleic acid.
  • Examples of a method for immobilizing a nucleic acid on a member include a method of forming a peptide bond using a functional group of a nucleic acid and a functional group on the surface of the member, and the presence of gold, platinum, silver, palladium, etc. on the member surface.
  • There are a method of chemically adsorbing a thiol group of a nucleic acid on the surface a method of forming a biotin-avidin bond by immobilizing avidin on a member surface, and the like.
  • the member may be treated with thiol or silane to form a desired functional group.
  • a substrate 11 particles such as beads, or a microarray chip may be used.
  • the timing for fixing the nucleic acid to the member is not particularly limited, and may be after the complex 4 of the first aptamer 1, the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 is formed, or a nucleic acid having a functional group is used as the member. After fixing to the nucleic acid, another nucleic acid may be hybridized to the fixed nucleic acid.
  • the member to which the composite 4 is fixed can also be used as a sensor element described in the third embodiment of the present invention.
  • the detection of the target substance 5 according to the second embodiment will be described.
  • the sensor the substrate 11 on which the complex 4 is immobilized
  • the second target molecule second ligand 6
  • the first to the first to third embodiments described in the first embodiment are used.
  • the double strand at the double stranded nucleic acid site is cleaved.
  • the same effect as in the first embodiment can be obtained.
  • the method for detecting the cleavage of the double-stranded nucleic acid site is not particularly limited.
  • the nucleic acid fragment 3 of the complex 4 is fixed to the substrate 11 (member), and the first aptamer Label one.
  • the first aptamer 1 is labeled in advance with a fluorescent dye (fluorescent substance 8), a radioisotope (RI), a fluorescent quencher, or the like.
  • the cleavage of the first aptamer 1 and the second aptamer 2 can be detected by measuring the signal intensity of the substrate surface by these labels.
  • the weight of the nucleic acid bound to the surface of the member may be quantified by a known method such as surface plasmon resonance or quartz vibration microbalance method.
  • a fluorescent dye is used as a labeling substance and a substrate 11 is used as a member will be described with reference to FIG.
  • fluorescence measurement is performed on the surface of the substrate 11 before contacting the object to be inspected (FIG. 3A).
  • the substrate 11 is irradiated with excitation light to excite the fluorescent substance 8 modified with the first aptamer 1. Fluorescence is emitted from the fluorescent substance 8, and the intensity corresponding to the amount of the fluorescent substance 8 (fluorescent molecule) on the surface of the substrate 11 can be measured.
  • the substrate 11 after contacting the inspection object is measured for fluorescence.
  • the test substance contains the target substance 5 (FIG. 3 (b))
  • the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 disappears, so the first aptamer 1 Is away from the second aptamer 2 and also away from the substrate 11 (FIG. 3C).
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6 (FIG. 3 (d)), the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 disappears, and the second aptamer 2 leaves the substrate 11. (FIG. 3 (e)).
  • the fluorescence intensity on the surface of the substrate 11 becomes smaller when the target substance 5 is brought into contact therewith.
  • the first aptamer 1 continues to be bonded to the substrate 11, so that the fluorescence intensity on the surface of the substrate 11 does not change.
  • the presence or absence of the target substance 5 can be examined by comparing the fluorescence intensity of the surface of the substrate 11 before and after contacting the inspection object.
  • the first aptamer 1 separated from the substrate 11 can be dissociated from the target substance 5 by an equilibrium reaction.
  • the second aptamer 2 contacts with the second aptamer 2 to form a double-stranded nucleic acid site, and the first aptamer 1 and second This requires a process in which the conjugate with the aptamer 2 contacts the complementary nucleic acid fragment 3 on the substrate 11.
  • the second ligand 2 Since the second ligand 2 is contained in the test sample solution at a high concentration, the existence ratio of the second aptamer bound to the first aptamer 1 is very small. Even when the second aptamer 2 is recombined, the first dissociated from the member once due to the synergistic effect that the conjugate dispersed in the solution is less frequently contacted with the complementary nucleic acid fragment 3 on the surface of the substrate 11. The aptamer 1 hardly recombines with the substrate 11. Therefore, compared with the first embodiment in which no member is used, even when the target substance 5 is at a low concentration, dissociation of the first aptamer and the second aptamer 2 proceeds and a larger signal change can be obtained. It becomes possible.
  • the aptamer separated from the member may be removed by exchanging the measurement solution before the fluorescence measurement. Thereby, the fluorescent substance in the solution is removed, the background signal is reduced, and the measurement sensitivity can be improved.
  • the complementary nucleic acid fragment 3 is fixed to the member.
  • the nucleic acid fragment is not limited to the member, and even if the first aptamer 1 or the second aptamer 2 is fixed. good.
  • the nucleic acid to be labeled is not limited to the first aptamer 1, and the second aptamer 2 or the complementary nucleic acid fragment 3 may be labeled. These may be used in appropriate combination as long as the cleavage of the double-stranded nucleic acid site described in the first to fourth steps of the first embodiment occurs as a signal change.
  • a sensor including the complex 4 can be used for detection of the target substance 5.
  • This sensor further includes a member to which the composite 4 is fixed.
  • this sensor has a first aptamer 1 to which the target substance 5 in the test sample specifically binds and a non-target substance (second ligand 6) other than the target substance 5 to specifically bind.
  • the base sequence of the first aptamer 1 to which the substance 5 binds includes at least a part of the base sequence of the double-stranded formation site of the first aptamer 1, and the second aptamer 2 to which the second ligand 6 binds.
  • the base sequence has a complex including at least a part of the base sequence of two or more double-stranded forming sites of the second aptamer 2 and a member to which the complex is fixed.
  • the double-strand formation site of the first aptamer 1 is cleaved by the binding between the target substance 5 and the first aptamer 1.
  • the structure of the first aptamer 1 corresponding to the double-stranded formation site is deformed or a double-stranded nucleic acid site is formed together with the first aptamer 1.
  • the structure to be formed is deformed. Thereby, the effect of this Embodiment is acquired. Further, by providing a member to which the complex 4 of these nucleic acids is fixed in advance, the user can detect the target substance immediately when necessary.
  • the target substance 5 detection apparatus includes a complex 4 in which the first aptamer 1, the second aptamer 2, and the nucleic acid fragment 3 each form a double strand at a double-stranded nucleic acid site.
  • a member substrate 11
  • the detection apparatus includes the sensor, a binding unit that binds the target substance 5 to the first aptamer 1, and a junction part that binds the second ligand 6 different from the target substance 5 to the second aptamer 2.
  • This apparatus can simplify the flow path and valve mechanism for mixing a plurality of liquids by fixing the composite 4 to the member.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the third embodiment.
  • the point that the complex 4 including the first aptamer 1, the second aptamer 2, and the nucleic acid fragment 3 is fixed to the member is the same as the second embodiment, but this The difference is that the member is a conductive member.
  • the electrode 12 is mentioned as an electroconductive member.
  • the electrode 12 may have fine materials such as gold fine particles, platinum fine particles, and carbon nanotubes attached to the surface for the purpose of increasing the surface area and increasing the sensitivity.
  • the method of detecting the target substance 5 of the third embodiment is the same as that of the second embodiment except that a conductive member is used as the electrode 12 and the cleavage of the double-stranded nucleic acid site is detected by electrochemical measurement. It is the same as the form.
  • the method for detecting the cleavage of a double-stranded nucleic acid site by electrochemical measurement is, for example, about a double-stranded nucleic acid binding substance bound to a double-stranded nucleic acid part by adding a double-stranded nucleic acid binding substance such as an intercalator.
  • the nucleic acid fragment 3 is immobilized on the electrode 12 and the nucleic acid fragment 3 is labeled with methylene blue 14 as an electrode reactant, but the nucleic acid immobilized on the electrode 12 and the nucleic acid that modifies the electrode reactant and
  • the electrode reactant is not limited to this, and a combination in which cleavage of a double-stranded nucleic acid site occurs as a signal change can be appropriately selected and used.
  • Electron transfer is performed, for example, by connecting the electrode 12 as a working electrode together with a reference electrode and a counter electrode (not shown) to a potentiostat, and in a potential range from +0.1 V to ⁇ 0.5 V with respect to a silver / silver chloride reference electrode.
  • SWV square wave voltammetry
  • the electron transfer between the electrode 12 after contacting the inspection object and the methylene blue 14 is measured by SWV.
  • the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 disappears when the test object is brought into contact (FIG. 4B).
  • the 1st aptamer 1 leaves
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6 (FIG. 4 (d)).
  • the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 disappears, and the second aptamer 2 is separated from the electrode 12 (FIG. 4 (e)). Then, the double-stranded nucleic acid site of the complementary nucleic acid fragment 3 disappears, so that the degree of freedom of the complementary nucleic acid fragment 3 is improved and the contact frequency between the methylene blue 14 and the electrode is increased. Therefore, the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 becomes larger when the target substance 5 is brought into contact, and a larger reduction current is observed.
  • the first aptamer 1 continues to be bonded to the electrode 12, so that the electron transfer of the methylene blue 14 does not change and the reduction current value does not change.
  • the presence or absence of the target substance 5 can be examined by comparing the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 before and after contacting the test object.
  • the first aptamer 1 once separated from the electrode 12 cannot be recombined with the electrode 12, the first aptamer 1 and the second aptamer even when the target substance 5 has a low concentration.
  • the dissociation of 2 proceeds and a large signal change can be obtained.
  • the third embodiment can obtain the same effects as those of the first embodiment.
  • the measurement of the electron transmission before contacting the inspection object can be omitted as necessary.
  • the electron transfer efficiency is changed by improving the degree of freedom of the nucleic acid due to the cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • the electrode reactant is modified to the nucleic acid released from the member. May be.
  • methylene blue 14 may be modified in the second aptamer 2, and in this case, the target substance 5 exists in the reduction current value of SWV when the second aptamer 2 is separated from the electrode 12 by the target substance 5. The case is smaller.
  • the electrode reactant according to the third embodiment may be any material that changes the electron transfer efficiency depending on the frequency of contact with the electrode 12, such as a metal, a complex thereof, a heterocyclic compound, a catalyst, an enzyme, and the like.
  • the metal include particles such as Os, Fe, Ru, Co, Cu, Ni, Ti, V, Mo, Cr, Mn, Ag, Pd, W, and Au, and salts of such metals.
  • oxides, complexes having metal ions as the central metal, etc., and heterocyclic compounds such as quinones and derivatives thereof such as hydroquinone and anthraquinone, methylene blue and derivatives thereof, pyrroles, pyridine, viologen, etc.
  • Examples of the catalyst include fine particles such as Pt and titanium oxide.
  • Examples of the enzyme include, but are not limited to, oxidase such as glucose oxidase and bilirubin oxidase, and dehydrogenase such as glucose dehydrogenase.
  • oxidase such as glucose oxidase and bilirubin oxidase
  • dehydrogenase such as glucose dehydrogenase.
  • Coenzyme oxidases such as diaphorase
  • peroxidation such as horseradish peroxidase and catalase Reductase
  • the means for measuring electron transfer is not particularly limited, and various electrochemical measurement methods can be used. For example, SWV, cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, AC voltammetry, AC impedance, amperometry, potentiometry, etc. Is mentioned.
  • the double-stranded nucleic acid binding substance when used for detection of a double-stranded nucleic acid site, the double-stranded nucleic acid binding substance has a property of binding specifically to the double-stranded nucleic acid site and has electrode reactivity.
  • the intercalator itself may be modified with electrode reactive molecules.
  • a modified intercalator such as a nitrogen-containing condensed ring compound such as acridine and ethidium bromide, methylene blue, benzopyrene, actinomycin, nogaramycin, distamycin A, methidium, and derivatives thereof with the above electrode reactant Can do.
  • a method for detecting these for example, the above-described means for measuring electron transfer may be used.
  • a complex 4 in which a first aptamer 1, a second aptamer 2, and a nucleic acid fragment 3 form a double strand at a double-stranded nucleic acid site is immobilized. It has a conductive member (electrode 12), a contact part that makes the detection object and the electrode 12 contact, and a detection part that detects the cleavage of the double-stranded nucleic acid site by electrochemical measurement. Since this apparatus does not use an optical mechanism, the apparatus configuration can be simplified, and the apparatus can be reduced in size and cost.
  • the complex 4 in which the first aptamer 1, the second aptamer 2, and the nucleic acid fragment 3 form a double-stranded nucleic acid site is immobilized.
  • This is a conductive member (electrode 12).
  • the first aptamer 1 forms a complex 4 by forming two double-stranded nucleic acid sites with the second aptamer 2.
  • the first aptamer 1 includes a base sequence that can bind to the target substance 5 described above, a base sequence that can form a double-stranded nucleic acid site with the second aptamer 2, and as necessary. And a functional group that can be fixed to the member (electrode 12) and a modifying substance.
  • the first aptamer 1 may further include a base sequence that does not bind to the target substance 5.
  • the base sequence not involved in the binding with the target substance is, for example, the base sequence of the nucleic acid fragment 3 capable of forming a double-stranded nucleic acid site with the second aptamer 2 described above.
  • the base sequence that binds to the target substance 5 is located between the base sequences that can form these two double-stranded nucleic acid sites so that the first aptamer 1 can form a three-dimensional structure that can bind to the target substance 5.
  • the first aptamer 1 may have a structural portion that does not bind to the target substance 5.
  • the second aptamer 2 can be the same as described in the first to third embodiments.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the fourth embodiment.
  • the first aptamer 1 forms a complex 4 by forming two double-stranded nucleic acid sites with the second aptamer 2.
  • one end of the first aptamer 1 is fixed to the electrode 12 (member).
  • the second aptamer 2 is modified with methylene blue 14 as an electrode reactant at one end near the electrode 12 (FIG. 5A).
  • SWV causes a reduction reaction of methylene blue 14 according to the contact frequency between methylene blue 14 and electrode 12, and a reduction current is observed.
  • the electron transfer between the electrode 12 after contacting the inspection object and the methylene blue 14 is measured by SWV.
  • the target substance 5 when the test object is brought into contact, one of the double-stranded nucleic acid sites of the first aptamer 1 disappears due to branch migration, and a part of the first aptamer 1 Is separated from the second aptamer 2 (FIG. 5B).
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6 (FIG. 5 (c)), and the double-stranded nucleic acid portion of the second aptamer 2 disappears. Thereby, the 2nd aptamer 2 leaves
  • the contact frequency between the methylene blue 14 and the electrode 12 decreases due to the separation of the methylene blue 14 from the electrode 12. Therefore, the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 is less when the target substance 5 is brought into contact with the methylene blue 14, and the measured reduction current is reduced.
  • the target substance 5 is not included in the test object, since the second aptamer continues to be bonded to the electrode, the electron transfer of the methylene blue 14 does not change and the reduction current value does not change.
  • the double-stranded nucleic acid between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 is compared by comparing the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 before and after contacting the test object. Site cleavage can be detected. Thereby, the presence or absence of the target substance 5 can be investigated. Since the second aptamer 2 away from the first aptamer 1 has a high concentration of the second ligand 6, the second aptamer 2 cannot take a single-stranded nucleic acid state that can recombine with the first aptamer 1. For this reason, even when the target substance 5 has a low concentration, dissociation between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 proceeds, and a large signal change can be obtained.
  • the target substance 5 is detected by SWV of methylene blue 14.
  • the present invention is not limited to this, and means that can detect physical and chemical changes caused by cleavage of double-stranded nucleic acid sites can be used. That's fine. Thereby, the target substance 5 can be detected. Therefore, the member is not limited to a conductive member, and the complex 4 of the first aptamer 1 and the second aptamer 2 may not be fixed to the member.
  • the first aptamer 1 has the base sequence of the nucleic acid fragment 3 that can form a double-stranded nucleic acid site with the second aptamer 2, whereby the nucleic acid fragment 3 is obtained. It can be omitted.
  • the target substance detection apparatus contacts the complex 4 in which the first aptamer 1 and the second aptamer 2 form a double-stranded nucleic acid site, and the detection target and the complex 4. And a detection unit for detecting the cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • a detection apparatus even if the target substance has a low concentration, a large signal change occurs and high measurement sensitivity is obtained by the target substance detection method described above.
  • the complex 4 in which the first aptamer 1 and the second aptamer 2 form two double-stranded nucleic acid sites is immobilized. It has a member. By providing a member in which these nucleic acids are fixed in advance, the user can immediately detect the target substance when necessary.
  • the first aptamer 1 and the second aptamer 2 form a double strand in at least one double-stranded nucleic acid site to constitute a complex 4.
  • the second aptamer 2 has a double-stranded nucleic acid site hybridized with base sequences complementary to its own sequence in addition to the double-stranded nucleic acid site with the first aptamer 1.
  • the first aptamer 1 can be the same as that described in the first to third embodiments.
  • the second aptamer 1 requires a base sequence that can bind to the second ligand 6, and a base sequence that can form a double-stranded nucleic acid site with the first aptamer 1. Accordingly, it has a functional group that can be immobilized on the member and a modifying substance, and further has a base sequence that can hybridize with complementary base sequences of its own sequence. Since this base sequence that can hybridize with complementary base sequences of its own sequence is likely to cause branch migration when the second ligand 6 is bound, it is one of the base sequences that bind to the second ligand 6. The length is preferably 5 to 20 bases.
  • the second aptamer 2 may have a structural portion that does not bind to the second ligand 6.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the fifth embodiment.
  • the complex 4 is fixed to a member in which one end of the first aptamer 1 is an electrode 12.
  • the second aptamer 2 has a double-stranded nucleic acid site hybridized with base sequences complementary to its own sequence, and methylene blue 14 is modified as an electrode reactant at one end close to the electrode 12. (FIG. 6A).
  • SWV causes a reduction reaction of methylene blue 14 according to the contact frequency between methylene blue 14 and electrode 12, and a reduction current is observed.
  • the electron transfer between the electrode 12 after contacting the inspection object and the methylene blue 14 is measured by SWV.
  • the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 disappears by branch migration, and the first aptamer 1 becomes the second aptamer. It leaves
  • the electrode 12 is separated from the methylene blue 14 modified to the second aptamer 2.
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6 (FIG. 6 (c)), and the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 disappears (FIG. 6 (d)).
  • the double-stranded nucleic acid between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 is compared by comparing the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 before and after contacting the test object. Site cleavage can be detected. Thereby, the presence or absence of the target substance 5 can be investigated.
  • the test object includes the target substance 5
  • the methylene blue 14 is separated from the electrode 12 by the cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • the contact frequency between the methylene blue 14 and the electrode 12 decreases. Therefore, the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 is less when the target substance 5 is brought into contact with the methylene blue 14, and the measured reduction current is reduced.
  • the second aptamer 2 When the target substance is not included in the test object, the second aptamer 2 is a double strand hybridized with a double-stranded nucleic acid site with the first aptamer 1 and a base sequence complementary to its own sequence. Nucleic acid sites remain formed. For this reason, the second aptamer 2 cannot form a three-dimensional structure as an aptamer and does not bind to the second ligand 6. Accordingly, since the second aptamer 2 continues to be bonded to the electrode 12, the electron transfer of the methylene blue 14 does not change, and the reduction current value does not change.
  • the second aptamer 2 away from the first aptamer 1 has a high concentration of the second ligand 6, the second aptamer 2 hardly takes a single-stranded nucleic acid state that can recombine with the first aptamer. For this reason, even when the target substance 5 has a low concentration, dissociation between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 proceeds, and a large signal change can be obtained. Also in the fifth embodiment, the same effect as in the first embodiment can be obtained.
  • the target substance 5 is detected by the SWV of methylene blue 14.
  • the present invention is not limited to this, and means that can detect a physical or chemical change caused by cleavage of a double-stranded nucleic acid site is used.
  • the target substance 5 may be detected. Therefore, the member is not limited to a conductive material, and the complex 4 of the first aptamer 1 and the second aptamer 2 may not be fixed to the member.
  • the nucleic acid fragment 3 can be omitted because the second aptamer 2 has a base sequence that can hybridize with complementary base sequences of its own sequence.
  • the target substance detection apparatus includes a second aptamer 2 in which a first aptamer 1 forms a double strand with complementary base sequences of its own sequence in a double-stranded nucleic acid site.
  • the complex 4 in which at least one double-stranded nucleic acid site is formed has a contact part for bringing the complex 4 into contact with the detection target and a detection unit for detecting cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • the sensor (device for detecting a target substance) of the fifth embodiment includes a second aptamer 2 in which the first aptamer 1 forms a double-stranded nucleic acid site with complementary base sequences of its own sequence. It has a member to which a complex 4 in which at least one double-stranded nucleic acid site is formed is fixed. By providing a member in which these nucleic acids are fixed in advance, the user can immediately detect the target substance when necessary.
  • the linked aptamer 16 having the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion of the second aptamer 2 has the nucleic acid fragment 3 and at least two double-stranded nucleic acid sites. ing.
  • the ligated aptamer 16 and the nucleic acid fragment 3 constitute a complex 4.
  • the base sequence portion of the first aptamer 1 is the base sequence of the first aptamer that can bind to the target substance described in the first to third embodiments, and a structural portion that does not bind to the target substance 5 You may have.
  • the base sequence portion of the second aptamer 2 is a base sequence that can bind to the second ligand 6 as described in the first to third embodiments, and binds to the second ligand 6. You may have a structure part which does not.
  • the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion of the second aptamer 2 may be in any part of the linked aptamer 16, for example, each may be at the end of the linked aptamer. , May be in the center.
  • the site capable of forming a double-stranded nucleic acid site with the nucleic acid fragment 3 may be in any part of the linked aptamer 16, for example, at the end of the linked aptamer 16 or in the center. Good. However, one of the sites capable of forming a double-stranded nucleic acid site is likely to cause branch migration when the target substance 5 and the linked aptamer 16 are combined.
  • the length is preferably 5 to 20 bases. More preferably, it is 5 to 10 bases because rebinding of the first aptamer 1 dissociated from the target substance 5 is difficult to occur.
  • the site capable of forming a double-stranded nucleic acid site is a part of the base sequence that binds to the second ligand so that rebinding to the nucleic acid fragment 3 is easily inhibited when the second ligand 6 is bound. It is preferable to contain. More preferably, since the double-stranded nucleic acid site is easily cleaved by branch migration when the target substance 5 is bound, the base sequence to which the second ligand is bound in the double-stranded nucleic acid site is 10 bases or less. In addition, another part of the site capable of forming a double-stranded nucleic acid site is likely to cause branch migration when the second ligand 6 is bound. Therefore, a part of the base sequence that binds to the second ligand 6 The length is preferably 5 to 20 bases.
  • the base sequence of the first aptamer 1 to which the target substance 5 binds includes at least a part of the base sequence of the double-stranded formation site of the first aptamer 1. For this reason, when the target substance 5 binds to the first aptamer 1, the structure of the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 is deformed, and the first aptamer 1 and the nucleic acid fragment 3 are cleaved (FIG. 7 ( b)).
  • the base sequence of the second aptamer 2 to which the second ligand 6 binds is common to some or all of the base sequences of the two double-stranded formation sites of the second aptamer 2.
  • the second ligand 6 binds to the second aptamer 2, the structure of one double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 corresponding to a part of the double-stranded nucleic acid site of the first aptamer 1 The body is deformed. Since the structure of the first aptamer 1 remains deformed, it is suppressed that the first aptamer 1 forms a double-stranded nucleic acid site with the nucleic acid fragment 3 again.
  • the double-stranded nucleic acid site of the second aptamer 2 having a complementary base sequence with the double-stranded nucleic acid site of another nucleic acid fragment 3 The structure of is deformed. As a result, the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 are cleaved. For this reason, since the second aptamer 2 is separated from the nucleic acid fragment 3, the first aptamer 1 that constitutes the linked aptamer 16 together with the second aptamer 2 is also separated from the nucleic acid fragment 3. Thereby, it is further suppressed that the first aptamer 1 forms a double-stranded nucleic acid site again with the nucleic acid fragment 3 (FIG. 7D).
  • the linked aptamer 16 may have a functional group that can be fixed to a member and a modifying substance that can detect cleavage of a double-stranded nucleic acid site, if necessary.
  • the nucleic acid fragment 3 has a base sequence capable of forming a double-stranded nucleic acid site with the linking aptamer 16.
  • the nucleic acid fragment two types of nucleic acid fragments capable of binding to two double-stranded nucleic acid sites of the linked aptamer may be used, or 1 having a base sequence capable of forming two double-stranded nucleic acid sites with the linked aptamer.
  • the nucleic acid fragment 3 of the book may be used.
  • the nucleic acid fragment 3 may have a functional group that can be immobilized on a member and a modifying substance that can detect cleavage of a double-stranded nucleic acid site, if necessary.
  • the same effects as in the first embodiment can be obtained.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the sixth embodiment.
  • the linked aptamer 16 having the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion 2 of the second aptamer 2 forms two double-stranded nucleic acid sites with the nucleic acid fragment 3. ing.
  • One of the double-stranded nucleic acid sites includes a base sequence that binds to the target substance 5 of the first aptamer and a base sequence that binds to the second ligand 6, and the other site includes the second ligand 6 and Contains the base sequence to be bound.
  • One end of the nucleic acid fragment 3 is fixed to the electrode 12, and the other end is modified with methylene blue 14 as an electrode reactant (FIG. 7 (a)).
  • SWV causes a reduction reaction of methylene blue 14 according to the contact frequency between methylene blue 14 and electrode 12, and a reduction current is observed.
  • the electron transfer between the electrode 12 and the methylene blue 14 after contacting the inspection object is measured by SWV.
  • the double-stranded nucleic acid site including the base sequence portion of the first aptamer 1 disappears due to branch migration and leaves the nucleic acid fragment 3. (FIG. 7B).
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6.
  • the base sequence portion of the second aptamer 2 that has formed a double-stranded nucleic acid site together with the base sequence portion of the first aptamer 1 becomes free.
  • the base sequence portion of the second aptamer 2 can take a structure as an aptamer, and the binding ability to the second ligand 6 is restored. Thereby, the base sequence part of the 2nd aptamer 2 couple
  • the base sequence portion of the second aptamer 2 binds to the second ligand 6, the double-stranded nucleic acid portion of the second aptamer 2 disappears, and the linked aptamer 16 is separated from the nucleic acid fragment 3 (FIG. 7 (d)). .
  • the degree of freedom of the nucleic acid fragment 3 is improved, and the contact frequency between the methylene blue 14 and the electrode 12 is improved.
  • the cleavage of the double-stranded nucleic acid site between the ligated aptamer 16 and the nucleic acid fragment 3 is performed. Can be detected. Thereby, the presence or absence of the target substance 5 can be investigated.
  • the degree of freedom of the nucleic acid fragment 3 is improved by cleavage of the double-stranded nucleic acid site, so that the contact frequency between the methylene blue 14 and the electrode 12 is improved. Therefore, the electron transfer between the methylene blue 14 and the electrode 12 becomes larger when the target substance 5 is brought into contact.
  • the linked aptamer 16 continues to bind to the nucleic acid fragment 3. For this reason, the electron transfer of the methylene blue 14 does not change.
  • the linked aptamer 16 separated from the nucleic acid fragment 3 has a high concentration of the second ligand 6, the base sequence portion of the second aptamer 2 continues to bind to the second ligand 6. Therefore, the first aptamer 1 hardly takes a single-stranded nucleic acid state that can recombine with the nucleic acid fragment 3. For this reason, even when the target substance 5 has a low concentration, dissociation between the first aptamer 1 and the second aptamer 2 proceeds, and a large signal change can be obtained.
  • the target substance 5 is detected by SWV of methylene blue 14.
  • the present invention is not limited to this, and means capable of detecting physical and chemical changes caused by cleavage of double-stranded nucleic acid sites is used. That's fine. Therefore, the member is not limited to a conductive member, and the complex 4 of the nucleic acid fragment 3 and the linked aptamer 16 may not be fixed to the member.
  • the cleavage of the double-stranded nucleic acid site is detected by the weight of the nucleic acid itself, such as QCM or SPR, or a change in dielectric constant, a modifier for the nucleic acid may be omitted.
  • the first aptamer 1 and the second aptamer 2 do not have to be composed of independent single-stranded nucleic acids.
  • the ligated aptamer 16 and one nucleic acid fragment 3 having a base sequence capable of forming two double-stranded nucleic acid sites are used.
  • the present invention is not limited to this, and various modifications can be adopted. it can. These modifications are shown in FIGS.
  • the base sequence of the first aptamer 1 of the linked aptamer 16 forms one double-stranded nucleic acid site
  • the base sequence of the second aptamer 2 has two or more double-stranded nucleic acid sites.
  • the target substance 5 serves as a trigger to cleave these double-stranded nucleic acid sites. For example, as shown in FIG.
  • two different nucleic acid fragments 3 may hybridize to the linked aptamer 16 to form a double-stranded nucleic acid site. Further, as shown in FIG. 10, even if the base sequence of the second aptamer 2 is hybridized with a part of the linked aptamer 16 having the same base sequence as the nucleic acid fragment 3, a double-stranded nucleic acid site is formed. Good. In addition, as shown in FIG.
  • the base sequence of the first aptamer 1 hybridizes with a part of the linked aptamer 16 having the same base sequence as the nucleic acid fragment 3 to form a double-stranded nucleic acid site,
  • the base sequence portion of two aptamers 2 may form a nucleic acid fragment 3 and a double-stranded nucleic acid site. In either case, the same effect as in the sixth embodiment can be obtained.
  • the linked aptamer 16 has a base sequence capable of forming a double-stranded nucleic acid site with the base sequence of the first aptamer 1 and the base sequence of the second aptamer 2, It may be hybridized to form a double-stranded nucleic acid site.
  • This is similar to the sixth embodiment in that the first aptamer 1 is prevented from forming a double-stranded nucleic acid site again with the second aptamer 2 due to the deformation of the structure of the first aptamer 1. The effect that it is done is acquired.
  • the linked aptamer 16 having the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion of the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 are at least two places.
  • the complex 4 in which the double-stranded nucleic acid site is formed has a contact part that makes the complex 4 contact the detection target and a detection unit that detects the cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • a large signal change occurs and high measurement sensitivity is obtained by the target substance detection method described above, even when the target substance has a low concentration.
  • the sensor (device for detecting a target substance) of the sixth embodiment includes a linked aptamer 16 having a base sequence portion of the first aptamer 1 and a base sequence portion of the second aptamer 2, and a nucleic acid fragment 3. And a member to which the complex 4 in which at least two double-stranded nucleic acid sites are formed is fixed. By providing a member in which these nucleic acids are fixed in advance, the user can immediately detect the target substance when necessary.
  • the target substance 5 bound to the base sequence portion of the first aptamer 1 of the linked aptamer 16 is coupled to the first aptamer 1 by binding the base sequence portion of the second aptamer 2 to the first aptamer 1. From one aptamer 1 and binds to another first aptamer 1. Then, the cleavage of the double-stranded nucleic acid site is amplified by cleaving the double-stranded nucleic acid site of the other first aptamer 1. Since the seventh embodiment is an application of the sixth embodiment, the description of the same points as the sixth embodiment will be omitted.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a procedure of a target substance detection method according to the seventh embodiment.
  • the linked aptamer 16 forms two double-stranded nucleic acid sites with the nucleic acid fragment 3 to form the complex 4.
  • the nucleic acid fragment 3 is modified with methylene blue 14 and fixed to the electrode 12.
  • the electron transfer between the electrode 12 (FIG. 8A) before contacting the inspection object and the methylene blue 14 is measured by SWV.
  • the inspection object is brought into contact with the composite 4.
  • the target substance 5 is included in the test object
  • the target substance 5 is bound to the first aptamer 1 when the test object is brought into contact (FIG. 8B).
  • the double-stranded nucleic acid site containing the base sequence portion of the first aptamer 1 disappears due to branch migration, and the first aptamer 1 is separated from the nucleic acid fragment 3 (FIG. 8C).
  • the second aptamer 2 binds to the second ligand 6.
  • the base sequence portion of the second aptamer 2 that has formed a double-stranded nucleic acid site together with the base sequence portion of the first aptamer 1 becomes free.
  • the base sequence part of the 2nd aptamer 2 couple
  • the target substance 5 moves away from the base sequence of the first aptamer 1.
  • the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion of the second aptamer 2 are close to each other.
  • the target substance 5 and the second ligand 6 are competitively bound to the linked aptamer 16 due to steric hindrance between the target substance 5 and the second ligand 6. Therefore, when the second ligand 6 is present in the solution, the equilibrium reaction in which the base sequence of the first aptamer 1 and the target substance 5 bind to each other and the binding between the base sequence of the second aptamer 2 and the second ligand 6 are bound.
  • the target substance 5 bound to the first aptamer 1 moiety is driven out. And the target substance 5 leaves
  • the target substance 5 is separated, the double-stranded nucleic acid portion of the second aptamer 2 disappears, and the linked aptamer 16 is separated from the nucleic acid fragment 3 (FIG. 8 (f)).
  • the double-stranded nucleic acid site with the linked aptamer 16 disappears, the degree of freedom of the nucleic acid fragment 3 is improved, and the contact frequency between the methylene blue 14 and the electrode 12 is improved.
  • the cleavage of the double-stranded nucleic acid site between the ligated aptamer 16 and the nucleic acid fragment 3 is performed. Can be detected. Thereby, the presence or absence of the target substance 5 can be investigated.
  • the linked aptamer 16 bound to the second ligand 6 has an apparent binding constant with the target substance 5 because the second ligand 6 becomes steric hindrance. Therefore, the target substance 5 separated from the base sequence of the first aptamer 1 is linked to the nucleic acid fragment 3 that is not bound to the second ligand 6 and a linked aptamer that forms a double strand at the double-stranded nucleic acid site (FIG. 8 (a)) is preferentially combined. Then, the double-stranded nucleic acid site is cleaved, the linked aptamer 16 is separated from the nucleic acid fragment 3, and again separated from the base sequence of the first aptamer 1.
  • the base sequence of the first aptamer 1, the base sequence of the second aptamer 2, and the linked aptamer 16 can be the same as those in the sixth embodiment.
  • the ratio (Kd2) of the dissociation constant (Kd1) between the base sequence of the first aptamer 1 and the target substance 5 and the dissociation constant (Kd2) between the base sequence of the second aptamer 2 and the second ligand 6 / Kd1) is preferably 1 or less, and more preferably 0.2 or less.
  • the concentration of the second ligand 6 is preferably at least 5 times the dissociation constant (Kd2) of the second aptamer 2 and the second ligand 6, and more preferably at least 50 times.
  • Kd2 dissociation constant
  • the target substance 5 is detected by SWV of methylene blue 14.
  • the present invention is not limited to this, and means that can detect physical and chemical changes caused by cleavage of double-stranded nucleic acid sites can be used. That's fine. Therefore, the member is not limited to a conductive member, and the complex 4 of the nucleic acid fragment 3 and the linked aptamer 16 may not be fixed to the member.
  • the cleavage of the double-stranded nucleic acid site is detected by the weight of the nucleic acid itself, such as QCM or SPR, or a change in dielectric constant, a modifier for the nucleic acid may be omitted.
  • the linked aptamer 16 having the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion of the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 are at least two places.
  • the complex 4 in which the double-stranded nucleic acid site is formed has a contact part that makes the complex 4 contact the detection target and a detection unit that detects the cleavage of the double-stranded nucleic acid site.
  • the target substance detection method described above amplifies the cleavage of the double-stranded nucleic acid site, resulting in high measurement sensitivity. available.
  • the linked aptamer 16 having the base sequence portion of the first aptamer 1 and the base sequence portion of the second aptamer 2 and the nucleic acid fragment 3 are And a member to which the complex 4 in which at least two double-stranded nucleic acid sites are formed is fixed.
  • the present embodiment also includes the following aspects.
  • a complex comprising the above-mentioned double-stranded nucleic acid sites, the second aptamer having two or more double-stranded nucleic acid sites, and comprising the first aptamer and the second aptamer;
  • a double-stranded nucleic acid site of the first aptamer and the second aptamer is cleaved by binding the target substance in the test sample and the first aptamer, and the double-stranded
  • a method for detecting a target substance comprising detecting the target substance by detecting cleavage of a nucleic acid site.
  • the first aptamer and / or the second aptamer form a complex by forming a double strand at a nucleic acid fragment and a double-stranded nucleic acid site, [1] 2.
  • the above-mentioned second aptamer forms a double-stranded nucleic acid site hybridized with base sequences complementary to its own sequence, [1] or [2]
  • a method for detecting a target substance [4] The method for detecting a target substance according to any one of [1] to [3], wherein the first aptamer and the second aptamer are linked.
  • the target substance bound to the first aptamer is separated from the first aptamer by the binding of the second ligand and the second aptamer, and again binds to another first aptamer.
  • the ratio of the dissociation constant of the second aptamer and the second ligand to the dissociation constant of the first aptamer and the target substance is 1 or less, [1] to [1] [5]
  • the ratio of the dissociation constant of the second aptamer and the second ligand to the dissociation constant of the first aptamer and the target substance is 0.2 or less [6] 2.
  • a method for detecting a target substance according to 1. [8] The method for detecting a target substance according to any one of [1] to [7], wherein the complex is fixed to a member. [9] The target substance according to any one of [1] to [8], wherein the member is an electrode and the cleavage of a double-stranded nucleic acid site is detected as an electrical reaction. Detection method.
  • the complex is modified with an electrode reactant, and cleavage of a double-stranded nucleic acid site is detected by a detection value of electron transfer between the electrode reactant and the electrode.
  • the method for detecting a target substance according to [9]. Any one of [1] to [10], wherein the concentration of the second ligand is at least 5 times the dissociation constant between the second aptamer and the second ligand. The method for detecting a target substance according to Item. [12] The method for detecting a target substance according to [11], wherein the concentration of the second ligand is 50 times or more the dissociation constant between the second aptamer and the second ligand. .
  • a sensor device for detecting a target substance), wherein the complex formed by binding is fixed to the member and used in a target substance detection method.
  • [15] The complex formed by the first aptamer and / or the second aptamer forming a nucleic acid fragment and a double-stranded nucleic acid site is fixed to the member, [16] The sensor (target substance detection apparatus) according to [16]. [16] The method according to [14] or [15], wherein the second aptamer forms a double-stranded nucleic acid site hybridized with complementary base sequences of its own sequence. Sensor (device for target substance detection). [17] The sensor (target substance detection apparatus) according to any one of [14] to [16], wherein the first aptamer and the second aptamer are linked.
  • the complex is modified with an electrode reactant, and the cleavage of a double-stranded nucleic acid site can be detected by a detection value of electron transfer between the electrode reactant and the electrode.
  • the sensor according to [20] apparatus for target substance detection).
  • a complex comprising the above-mentioned double-stranded nucleic acid sites, the second aptamer having two or more double-stranded nucleic acid sites, and comprising the first aptamer and the second aptamer;
  • the target substance detection apparatus characterized by the above-mentioned.

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Abstract

標的物質の検出方法は、被検用試料中の標的物質（５）が特異的に結合する第１のアブタマー（１）と標的物質（５）以外の第２のリガンド６が特異的に結合する第２のアブタマー（２）とを備え、第１のアブタマー（１）は１以上の二本鎖が形成する二本鎖形成部位を有しており、第２のアブタマー（２）は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質（５）が結合する第１のアブタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド（６）が結合する第２のアブタマー２の塩基配列は、第２のアブタマー（２）の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体（４）を用意する工程と、標的物質（５）と第１のアブタマー（１）とを結合させる工程と、第２のリガンド（６）と第２のアブタマー２とを結合させる工程と、第１のアブタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。

Description

標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置
　本発明は、標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置に関する。
　アプタマーとは、特定の物質と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）およびペプチドを指す。このようなアプタマーは、非特許文献１に記載されたＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法を用いて、核酸ライブラリから有意な結合力を有する配列が選別される。
　アプタマーとアプタマーの結合対象物質（以下、標的物質と呼ぶ）の特異的な結合能力を利用したセンサが、疾病診断、環境モニタリングおよび所持品検査等の種々の目的のために研究され、開発されている。このようなセンサの多くは、アプタマーと標的物質の結合によってアプタマーおよび標的物質に生じる物理的および化学的変化を検知することによって標的物質を検出している。
　このようなセンサとして、非特許文献２および３では、アプタマーのハイブリダイズを利用したセンサが提案されている。具体的には、非特許文献２では、図１（ａ）に示すように、電極２３上にアプタマー２０の相補鎖２１（相補な配列を有する核酸２１。ただし、アプタマーではない）を固定する。この相補鎖２１に、電極反応物質２２が修飾されたアプタマー２０をハイブリダイズさせる。続いて、標的物質２４が添加されると、アプタマー２０と標的物質２４が結合する（図１（ｂ））。これにより、アプタマー２０と相補鎖２１とが開裂して、アプタマー２０が電極２３の表面から遊離する（図１（ｃ））。図１（ｃ）の状態と比較して、図１（ａ）の状態の方では、アプタマー２０に修飾された電極反応物質２２の反応電流が大きい。従って、電流値の大小を指標として標的物質の有無を検出することができることが記載されている。
　また、非特許文献３では、アプタマースイッチプローブが開示されている。この方法では、蛍光分子で標識されたアプタマーとクエンチャーで修飾された相補鎖がハイブリダイズしている。
特表２００９－５０５６４１号公報
Ｃ．Ｔｕｅｒｋ　ａｎｄ　Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｖｏｌ．２４９　（１９９０），　ｐ５０５－ｐ５１０ Ａｎａｌｙｓｔ，　２００８，　１３３　ｐ３２３－３２５ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　ｖｏｌ．１３０　（２００８），　ｐ　１１２６８－１１２６９
　しかし、本発明者が検討したところ、このようなハイブリダイズの開裂を利用する方法では、以下の課題があることが判明した。すなわち、ハイブリダイズの開裂においては、アプタマーに対して標的物質と相補鎖とが競争反応を起こしている。そして、この競争反応は平衡反応である。このため、開裂しているアプタマーから標的物質が分離して、再度、相補鎖とアプタマーがハイブリダイズすることがある。これにより、標的物質が低濃度の場合には、開裂量が少なくなり充分なシグナル変化が得られないことがあった。従って、標的物質が低濃度な場合で、高感度な検出方法が求められていた。
　本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、標的物質が低濃度な場合でも高感度な、標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置を提供することにある。
　本発明によれば、
　被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
　前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
　前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖が形成される二本鎖形成部位を有しており、
　前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
　前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
　前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体を用意する工程と、
　前記標的物質と前記第１のアプタマーとを結合させる工程と、
　前記標的外物質と前記第２のアプタマーとを結合させる工程と、
　前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む、標的物質の検出方法が提供される。
　本発明によれば、
　被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
　前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
　前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
　前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
　前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
　前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる、標的物質の検出に用いるアプタマーセットが提供される。
　本発明によれば、
　被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
　前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
　前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
　前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
　前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
　前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、
　前記複合体が固定されている部材と、を有する、標的物質の検出に用いるセンサが提供される。
　本発明によれば、
　上記センサと、
　標的物質を第１のアプタマーに結合させる手段と、
　前記標的物質と異なる物質を第２のアプタマーに結合させる手段と、
　前記第１のアプタマーの二本鎖形成部位の開裂を検出する手段と、を含む、装置が提供される。
　なお、以上の構成要素の任意の組合せ、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた、本発明の態様として有効である。
　本発明によれば、標的物質が低濃度な場合でも高感度な、標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置が提供される。
　上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
従来の標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第１の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第２の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第３の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第４の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第５の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第６の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第７の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。 第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。 第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。 第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。 第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
［第１の実施の形態］
　第１の実施の形態について、図２を用いて説明する。図２は、第１の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
　第１の実施の形態の標的物質５の検出方法は、被検用試料中（検査対象物）の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖が形成する二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体４を用意する工程と、標的物質５と前記第１のアプタマー１とを結合させる工程と、第２のリガンド６と第２のアプタマー２とを結合させる工程と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。すなわち、この標的物質の検出方法は、被検用試料（検査対象物）中の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖形成部位を有しており、前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有している、複合体４を用意する工程と、標的物質５と第１のアプタマー１との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位を開裂させる工程と、物質（第２のリガンド６）と第２のアプタマー２との結合により、第１のアプタマー１と共に二本鎖核酸部位を形成する第２のアプタマー２の構造体（第２のアプタマー２の一部の構造体）を変形させる、または二本鎖形成部位に相当する第１のアプタマー１の構造体を変形させる工程と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。
　まず、複合体４を用意する。この複合体４は、第２のアプタマー２の一部と相補的な配列を有する核酸断片３を有する。ここで、複合体４においては、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と少なくとも１カ所が二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は第１のアプタマー１との二本鎖形成部位に加えて、核酸断片３と二本鎖形成部位を有している（図２（ａ））。第１の実施の形態において、アプタマーの二本鎖形成部位とは、アプタマーとその相補的な配列を有する相補鎖（他のアプタマーや核酸断片）とが核酸の二本鎖を形成している部位を意味する（以下、単に二本鎖核酸部位と称する）。また、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位は、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と共通（同じ塩基配列の部分を共有する）であるか、または、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と相補的な塩基配列を有する部位となる。
　第１の実施の形態では、標的物質５は第１のリガンドであり、標的物質５と別の物質は第２のリガンド６である。また、被検用試料（検査対象物）中には、あらかじめ第２のリガンド６が添加されている。
　続いて、複合体４を用意する工程から標的物質５を検出する工程を、下記の第１の工程から第４の工程に分けて説明する。第１の実施の形態の第１の工程では、標的物質５が第１のアプタマー１に結合する（図２（ｂ））。複合体４において、第１のアプタマー１は一端が二本鎖核酸部位を形成しているが、別の一端は一本鎖状態である。すなわち、第１のアプタマー１の一端の構造が自在に変形できる。従って、第１のアプタマー１はアプタマーとしての立体構造をとることができ、検査対象物中の標的物質５と結合することができる。
　続いて、第１の実施の形態の第２の工程では、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における二本鎖が開裂する。すなわち、第１の工程で第１のアプタマー１と標的物質５とが結合すると、ブランチマイグレーションによって二本鎖核酸部位が解消する。このブランチマイグレーションは、標的物質５と第１のアプタマー１との結合が、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位を形成していた核酸同士の結合よりも強い場合に起こる。このようにして第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消えると、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２から離れる（図２（ｃ））。ここで、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、標的物質５が第１のアプタマー１に結合すると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位における構造が変形し、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２とが開裂する。
　続いて、第１の実施の形態の第３の工程では、第２のアプタマー２に第２のリガンド６が結合する（図２（ｄ））。第２の工程以前では、第２のアプタマー２は、２カ所が二本鎖核酸部位を形成している。すなわち、第２のアプタマー２の両端の構造が自在に変形できない。このため、第２のアプタマー２は、アプタマーとしての立体構造をとることができず、第２のリガンド６と結合することはない。一方、第２の工程で第１のアプタマー１の第２のアプタマー２が開裂すると、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が１カ所になる。すなわち、第２のアプタマー２の一端の構造が自在に変形できる。このため、第２のアプタマー２がアプタマーとしての立体構造を形成できるようになる。従って、第２のアプタマー２は、被検用試料中に存在する第２のリガンド６と結合することができる。そして、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２つの二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、第２のリガンド６が第２のアプタマー２に結合すると、第２のアプタマー２の２つの二本鎖核酸部位の構造体が変形する。第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と対応する第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位の構造体が変形すると、第１のアプタマー１が二本鎖核酸部位を形成しにくくなる。一方、核酸断片３との二本鎖核酸部位に対応する第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位の構造体が変形すると、後述のように、第２のアプタマー２と核酸断片３とが開裂する。
　続いて、第１の実施の形態の第４の工程では、第２のアプタマー２と核酸断片３との間で形成された二本鎖が開裂する。第３の工程において第２のアプタマー２と第２のリガンド６とが結合すると、第２の工程と同様に、ブランチマイグレーションによって二本鎖核酸部位が解消する。この第２のアプタマー２が開裂すると、第２のアプタマー２は、相補な核酸断片３から離れる（図２（ｅ））。この後、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する。ここで、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位における開裂を検出するとは、二本鎖核酸部位における二本鎖の開裂によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化を検出することを意味する。
　ここで、第１の実施の形態の作用効果について、特許文献に記載の技術と比較しつつ説明する。
　上記の特許文献に記載のハイブリダイズの開裂においては、アプタマーに対して標的物質と相補鎖とが競争反応を起こしている。そして、この競争反応は平衡反応であるため、標的物質の濃度が低いと、開裂したアプタマーは、再度相補鎖と二本鎖を形成することがあった。このため、アプタマーの開裂量が低下して、充分なシグナル変化量を得ることが困難であった。
　これに対して、第１の実施の形態においては、物質（第２のリガンド６）と第２のアプタマー２との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と相補的な塩基配列を有する第２のアプタマー２の一部の構造を変形させている。このため、第１のアプタマー１は、このような変形構造の塩基配列部分と、二本鎖を形成しにくくなる。これにより、第１のアプタマー１から標的物質５が脱離したとしても、第１のアプタマー１が、第２のアプタマー２と、再度二本鎖核酸部位を形成することを抑制できる。これにより、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位における二本鎖の開裂を維持することができる。従って、標的物質５の濃度が低濃度である場合においても、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位の開裂のシグナル変化量を、上記特許文献に記載の技術と比較して大きくすることができる。よって、第１の実施の形態によれば、高感度に標準物質を検出することができる。
　また、第１の実施の形態において、検査対象物が第１のアプタマー１と結合する物質を含まない場合、第１のアプタマーは、検査対象物中の物質と結合せず、第２のアプタマー２との間の二本鎖核酸部位における二本鎖は解消されない。そのため、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間の二本鎖核酸部位における二本鎖も開裂しない。したがって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における開裂および第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂、またはその両方を検出することによって、検査対象物に標的物質５が含まれるかどうかを検知することができる。
　第１の実施の形態において、検査対象物中の第２のリガンド６の濃度は、第２のアプタマー２と第２のリガンド６の間の解離定数（Ｋｄ２）以上であり、かつ、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２及び核酸断片３を含む複合体４の濃度以上であることが好ましい。これにより、第４の工程で核酸断片３から解離した第２のアプタマー２は、その約半数以上が第２のリガンド６と結合した状態となる。すると、第２の工程で第２のアプタマー２から離れた第１のアプタマー１が、平衡反応に従って標的物質５を放出して一本鎖状態となっても、第２のアプタマー２との再結合が阻害される。したがって、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナルを得ることが可能となる。
　また、第１のアプタマー１の解離が進行することから、第２のリガンド６が充分量添加されているため、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３の解離も進行する。このため、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂を検出することによっても、大きなシグナルを得ることが可能となる。
　また、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における開裂と、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂との両方を検出することにより、二重検査をおこなうことができる。これにより、測定の信頼性が向上する。そのためには、例えば、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が開裂した場合と核酸断片３の二本鎖核酸部位が開裂した場合とで、異なる波長の蛍光が発せられるように、蛍光分子を使い分けるなどして、それぞれの二本鎖核酸部位の開裂により生じるシグナル変化を区別可能にすればよい。
　なお、第２のリガンド６の濃度が高いほど第２のアプタマー２と第２のリガンド６の結合体の存在比率が高まる。このため、第２のリガンド６の濃度は、好ましくは第２のアプタマーと第２のリガンドの解離定数（Ｋｄ２）の５倍以上、さらに好ましくは５０倍以上である。
　なお、図２（ａ）において、第２のリガンド６は、第１の工程に先立ち測定溶液である検査対象物に添加されているが、その添加タイミングは特に限定されないが、第２のリガンド６は第２のアプタマー２がアプタマーとしての結合能力を回復したときに存在していれば良く、第１～第３の工程と同時または各工程の間で添加しても良い。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１のアプタマー１は、標的物質５と特異的に結合できる核酸であり、第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な相補な塩基配列を持っていればよい。この第１のアプタマー１としては、例えば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、ＰＮＡのような人工核酸であってもよい。第１のアプタマー１は、特に制限されないが、標的物質５のエピトープと特異的に結合するアプタマーの構造を有するものが好ましく、一部に標的物質５と結合しない構造部分を有していてもよい。第１のアプタマー１は、例えば、ＳＥＬＥＸ法等の公知のアプタマースクリーニング方法を用いて取得できる。また、必要に応じて、ＳＥＬＥＸ等で取得された核酸配列に所望する塩基配列を足したものを合成しても良い。第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との二本鎖核酸部位は、第１のアプタマー１の任意の部分にあってもよく、例えば、アプタマーの端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、第１のアプタマー１の一本鎖核酸の全配列が二本鎖核酸部位を形成していてもよい。ただし、ここでの二本鎖核酸部位は、標的物質５と第１のアプタマー１が結合した際に、ブランチマイグレーションを生じ易くするために、標的物質５と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５～２０塩基であることが好ましい。また、第１のアプタマー１は、後述する二本鎖核酸部位の検出の為に、蛍光物質や、クエンチャーなどの標識物質が修飾されていても良い。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第２のアプタマー２は、第２のリガンド６と特異的に結合できる核酸であり、第１のアプタマー１および核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成可能な相補な塩基配列を持っていればよい。この第２のアプタマー２としては、第１のアプタマー１と同様に、ＳＥＬＥＸ法等の公知のアプタマースクリーニング方法を用いて取得したＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を用いることができ、必要に応じて、ＳＥＬＥＸ等で取得された核酸配列に所望する塩基配列を足したものを合成しても良い。第２のアプタマー２と第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位は、第２のアプタマー２の任意の部分にあってもよく、例えば、第２のアプタマー２の端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。ただし、第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位は、第２のリガンド６が結合した際に、第１のアプタマー１の再結合を阻害するように、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５～２０塩基であることが好ましい。すなわち、第２のリガンド６（物質）との結合により、二本鎖核酸部位に相当する第１のアプタマーの相補鎖（第２のアプタマー２）の構造を変形させることができる。くわえて、核酸断片３との二本鎖核酸部位は、第２のリガンド６が結合した際に、ブランチマイグレーションを生じ易くするために、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５～２０塩基であることが好ましい。また、第２のアプタマー２は、後述する二本鎖核酸部位の検出の為に、蛍光物質や、クエンチャーなどの標識物質を修飾しても良い。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、核酸断片３は、第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成できる相補な塩基配列を有しており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を用いることができる。また、核酸断片３は、その一部に、第２のアプタマー２と相補的な塩基配列に加えて、相補的でない塩基配列を有していてもよい。第２のアプタマー２との二本鎖核酸部位は、核酸断片３の任意の部分にあってもよく、例えば、端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、核酸断片３は、後述する二本鎖核酸部位の検出の為に、蛍光物質や、クエンチャーなどの標識物質を修飾しても良い。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１のアプタマー１および核酸断片３が第２のアプタマー２に結合することによって構成される複合体４は、それぞれの核酸を混合した溶液をアニールすることによって形成することができる。アニールをおこなう温度や時間等の条件は一般的な条件で良く、使用する配列の相補的な塩基対の長さや種類、塩濃度などに基づいて適切に設定する。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、複合体４の濃度は、特に限定されないが、二本鎖核酸部位における開裂が検出しやすいように１ｎＭ以上１ｍＭ以下が好ましい。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法は、通常は検査対象物を含む溶液中でおこなう。ここで溶液は一般的な反応溶液でよい。また、各工程を行う際の温度、ｐＨ、金属イオン等の条件は適切に設定する。標的物質５と第１のアプタマー１の結合を促進させるために、Ｍｇ２＋イオンを溶液に加えると良い。ただし、実施の形態の標的物質の検出方法は、核酸の二本鎖部分を利用するため、核酸の二重鎖結合が維持できないような温度条件やｐＨ等は望ましくない。
　第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における開裂および第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂を検出する方法は、一般的な二本鎖核酸の開裂を検出する方法を用いることができ、その方法は特に限定されない。この二本鎖核酸の開裂の検出方法としては、例えば、蛍光色素とクエンチャーを用いる方法（非特許文献３）、核酸に金ナノ粒子を修飾しその凝集および分散を検出する方法（特許文献１）や、リアルタイムＰＣＲなどで二本鎖核酸部位の量を定量する為に用いられるＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉなどの二本鎖核酸指示薬を使用する方法、などを用いることができる。
　ここでは、蛍光色素（蛍光物質８）とクエンチャー９を修飾物質として用いる場合の二本鎖核酸部位の開裂の検出例について、再度図２を用いて説明する。図２（ａ）では、第２のアプタマー２の一端に蛍光物質８が、核酸断片３の一端にクエンチャー９が修飾されている。蛍光物質８とクエンチャー９が互いに近接するように、第２のアプタマー２の端部の塩基配列と、核酸断片３の端部の塩基配列は連続する相補な配列となっている。
　はじめに、複合体４に接触させる前に、検査対象物の溶液（図２（ａ））に対して蛍光測定を行う。溶液に励起光を照射すると、第２のアプタマー２に修飾された蛍光物質８は、核酸断片３のクエンチャー９が近接しているため蛍光が弱められる。
　次に、検査対象物を複合体４に接触させた後、溶液を蛍光測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位に標的物質５が結合し（図２（ｂ））、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れる（図２（ｃ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合し（図２（ｄ））、第２のリガンドの二本鎖核酸部分が消え、第２のアプタマー２が核酸断片３から離れる（図２（ｅ））。これにより、クエンチャー９が離れる。その結果、第２のアプタマー２の蛍光物質８の蛍光が回復する。したがって、溶液の蛍光強度は、標的物質５を第１のアプタマー１に接触させた方が大きくなる。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第１のアプタマー１は核酸断片３に結合し続ける為、第２のアプタマー２は分離しないので、上記溶液の蛍光強度は変化しない。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後の蛍光強度を比較することによって、標的物質５の有無を調べることができる。
　また、第１の実施の形態においては、上記複合体４を含むアプタマーセットを、標的物質５の検出に用いることができる。すなわち、このアプタマーセットは、被検用試料中の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質５が結合する第１のアプタマーの１塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる。このアプタマーセットにおいては、標的物質５と第１のアプタマー１との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位が開裂する。一方、第２のリガンド６と第２のアプタマー２との結合により、二本鎖形成部位に相当する第１のアプタマー１の構造体が変形する、又は第１のアプタマー１と共に二本鎖核酸部位を形成する構造体が変形する。これにより、本実施の形態の効果が得られる。
　また、第１の実施の形態に係る標的物質５の検出装置は、標的物質５を含む検査対象物と第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３がそれぞれ二本鎖核酸部位において二本鎖を形成している複合体４とを接触させる接触部と、複合体４の二本鎖核酸部位における開裂を検出する検出部と、を備える。すなわち、この検出装置は、上記アプタマーセットと標的物質５とを接触させる接触部と、複合体４の二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部と、を備える。このような二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部は、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化の検出が挙げられる。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。
　また、第１の実施の形態においては、第１のアプタマー１及び／又は第２のアプタマーが、核酸断片３と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成して複合体４を構成している。
［第２の実施の形態］
　第２の実施の形態では、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３を含む複合体４において、少なくとも１カ所が部材に固定されている場合について説明する。図３は、第２の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
　なお、第２の実施の形態は、第１の実施の形態の応用であるので、第１の実施の形態と同様な点については説明を省略する。
　第２の実施の形態の複合体４においては、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と少なくとも１カ所が二本鎖核酸部位を形成しており、第２のアプタマー２は第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位に加えて核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成している。第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３の少なくとも１カ所が部材に固定されている。これにより、複合体４は部材に固定されている。
　第２の実施の形態において、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３は、第１の実施の形態と同様のものを用いることができるが、少なくともいずれかが部材に固定する為の官能基を有することが好ましい。そのような官能基としては、部材の表面と共有結合または特異的な吸着を形成可能なものであれば限定されず、例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ジスルフィド基、スクシンイミジル基、マレイミド基、ビオチンなどが挙げられる。これらの官能基は、一般的な核酸合成方法で作製したものを用いることができる。また、官能基は、アプタマーとリガンドの特異的結合を妨げない限り、任意の部位に修飾されても良く、例えば、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２または核酸断片３の端部にあっても良いし、中央部にあっても良い。
　第２の実施の形態に係る部材は、核酸を固定可能なもの、もしくは、固定させるように処理が可能なものであれば、その材料は特に限定されない。部材に核酸を固定する方法としては、例えば、核酸の官能基と部材表面の官能基を利用してペプチド結合を形成する方法や、部材表面に金、白金、銀、パラジウムなどを存在させた上で、その表面に核酸のチオール基を化学吸着させる方法や、部材表面にアビジンを固定して、ビオチン－アビジン結合を形成する方法などがある。部材がこれらの官能基を持たない場合は、部材をチオールやシランなどで処理して、所望の官能基を形成すればよい。部材としては、基板１１、ビーズ等の粒子、またはマイクロアレイチップ等を用いても良い。部材に核酸を部材に固定するタイミングは、特に限定されず、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３の複合体４が形成した後でも良いし、官能基を有する核酸を部材に固定した後に、固定された核酸に対して他の核酸をハイブリダイズさせても良い。なお、部材に導電性材料を用いた場合、複合体４が固定された部材は、本発明の第３の実施の形態で説明するセンサ素子としても使用することができる。
　第２の実施の形態に係る標的物質５の検出について説明する。第２のターゲット分子（第２のリガンド６）が存在する状態下で、センサ（複合体４が固定された基板１１）が標的物質５と接触すると、第１の実施形態で説明した第１～第４の工程と同様の仕組みで、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成される二本鎖核酸部位における二本鎖および第２のアプタマー２と核酸断片３の間で形成される二本鎖核酸部位における二本鎖が開裂する。従って、第１の実施の形態と同様に、これらの二本鎖核酸部位の開裂を検出することにより、検査対象物に標的物質５が含まれるか否かを検査することが可能となる。また、第２の実施の形態においても、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
　第２の実施の形態において、二本鎖核酸部位の開裂を検出する方法は特に限定されないが、例えば、複合体４のうち、核酸断片３を基板１１（部材）に固定し、第１のアプタマー１を標識する。蛍光色素（蛍光物質８）、放射性同位体（ＲＩ）、蛍光クエンチャー等で第１のアプタマー１をあらかじめ標識しておく。そして、これら標識による基板表面の信号強度を測定することによって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との開裂を検出できる。また、表面プラズモン共鳴や水晶振動マイクロバランス法などの公知の方法によって、部材表面に結合している核酸の重さを定量しても良い。以下に、標識物質に蛍光色素を用い、部材に基板１１を用いた例について、図３を用いて説明する。
　はじめに、検査対象物を接触させる前の基板１１表面を蛍光測定する（図３（ａ））。基板１１に励起光を照射して、第１のアプタマー１に修飾された蛍光物質８を励起する。蛍光物質８から蛍光が発せられ、基板１１の表面の蛍光物質８（蛍光分子）の量に応じた強度が測定できる。
　次に、検査対象物を接触させた後の基板１１を蛍光測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合（図３（ｂ））、検査対象物５を接触させると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消える為、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れ、基板１１からも離れる（図３（ｃ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合して（図３（ｄ））、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が消え、第２のアプタマー２が基板１１から離れる（図３（ｅ））。従って、基板１１の表面の蛍光強度は、標的物質５を接触させた方が小さくなる。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第１のアプタマー１は基板１１に結合し続ける為、基板１１の表面の蛍光強度は変化しない。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後の基板１１の表面の蛍光強度を比較することによって、標的物質５の有無を調べることができる。基板１１から離れた第１のアプタマー１は、平衡反応によって標的物質５から解離し得る。解離した第１のアプタマー１が部材（基板１１）に再結合する為には、第２のアプタマー２と接触して二本鎖核酸部位を再形成する過程と、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との結合体が基板１１上の相補な核酸断片３と接触する過程を必要とする。被検用試料の溶液中には第２のリガンド２が高濃度で含まれる為、第１のアプタマー１と結合した第２のアプタマーの存在比率は僅かである点、仮に第１のアプタマー１と第２のアプタマー２が再結合した場合でも、溶液中に分散した結合体が基板１１の表面の相補な核酸断片３と接触する頻度は低い点、の相乗効果により、一度部材から遊離した第１のアプタマー１は基板１１に再結合することがほとんどない。従って、部材を使用しない第１の実施の形態と比較して、標的物質５が低濃度の場合でも第１のアプタマーと第２のアプタマー２の解離が進行し、より大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
　なお、必要に応じて、蛍光測定をする前に測定液を交換するなどして部材から離れたアプタマーを除去してもよい。これにより、溶液中の蛍光物質が除去されて、バックグラウンドシグナルが減少し、測定感度を向上させることができる。
　また、第２の実施の形態では、相補な核酸断片３を部材に固定したが、部材に固定するのは核酸断片に限らず、第１のアプタマー１または第２のアプタマー２を固定しても良い。また、標識をする核酸も第１のアプタマー１に限らず、第２のアプタマー２または相補な核酸断片３に標識をしても良い。これらは、第１の実施の形態の第１～第４工程で説明した二本鎖核酸部位の開裂がシグナル変化として生じればよく、適切に組み合わせて使用することができる。
　また、第２の実施の形態においては、上記複合体４を含むセンサを、標的物質５の検出に用いることができる。このセンサは、複合体４が固定されて部材をさらに備える。すなわち、このセンサは、被検用試料中の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、この複合体が固定された部材とを有する。このセンサにおいては、標的物質５と第１のアプタマー１との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位が開裂する。一方、第２のリガンド６と第２のアプタマー２との結合により、二本鎖形成部位に相当する第１のアプタマー１の構造体が変形する又は第１のアプタマー１と共に二本鎖核酸部位を形成する構造体が変形する。これにより、本実施の形態の効果が得られる。また、あらかじめこれらの核酸の複合体４が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
　また、第２の実施の形態の標的物質５の検出装置は、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２、および核酸断片３がそれぞれ二本鎖核酸部位において二本鎖を形成した複合体４が固定された部材（基板１１）と、標的物質５を部材に固定された複合体４に接触させる接触部と、複合体４の二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。すなわち、この検出装置は、上記センサと、標的物質５を第１のアプタマー１に結合させる結合部と、標的物質５とは異なる第２のリガンド６を第２のアプタマー２に結合させる接合部と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する検出部と、を含む。この装置は、複合体４が部材に固定されることにより、複数の液を混合するための流路やバルブ機構を簡略化させることができる。
［第３の実施の形態］
　第３の実施の形態は、第２の実施の形態の応用であり、同様な点については説明を省略する。
　図４は、第３の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。第３の実施の形態において、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２及び核酸断片３を含む複合体４が部材に固定される点は、第２の実施の形態と同じであるが、この部材が導電性部材である点が異なる。導電性の部材としては、電極１２が挙げられる。電極１２としては、電気伝導性が高く、かつ表面を修飾するのが容易であることから、金、白金、炭素等の材料が好適に用いられる。また、電極１２としては、表面に表面積を大きくして感度を高める目的で、その表面に、金微粒子や白金微粒子、カーボンナノチューブなどの微細材料が付着していても良い。
　第３の実施の形態の標的物質５の検出方法は、導電性の部材を電極１２として使用して、二本鎖核酸部位の開裂を電気化学測定により検出する点を除き、第２の実施の形態と同様である。電気化学測定により二本鎖核酸部位の開裂を検出する方法は、例えば、インターカレータなどの二本鎖核酸結合物質を添加して、二本鎖核酸部位に結合した二本鎖核酸結合物質について、電極１２で酸化および還元した際に流れる電流値により二本鎖核酸部位の量を定量する方法や、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２または核酸断片３に電極反応物質を修飾し、二本鎖核酸部位の開裂にともなう電子伝達の変化を電極１２により測定する方法などがある。
　以下で、導電性の部材に電極１２を用い、電極反応物質としてメチレンブルー１４を核酸断片３に修飾した場合の標的物質の検出メカニズムについて、図４を用いて具体例を挙げて説明する。
　なお、第３の実施の形態では、核酸断片３を電極１２に固定し、核酸断片３に電極反応物質としてメチレンブルー１４を標識したが、電極１２に固定する核酸と電極反応物質を修飾する核酸および電極反応物質はこれに限らず、二本鎖核酸部位の開裂がシグナル変化として生じる組み合わせを、適切に選択して使用することができる。
　はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（導電性の部材）（図４（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達を測定する。電子伝達は、例えば、作用極として電極１２を、図示しない参照電極および対極と共にポテンショスタットに接続し、銀／塩化銀参照電極に対して＋０．１Ｖの電位から－０．５Ｖまでの電位範囲でのスクウェアウェーブボルタンメトリー（ＳＷＶ）により測定することができる。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、電子が電極に伝達され、還元電流が観測される。
　次に、検査対象物を接触させた後の電極１２と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると（図４（ｂ））、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消える。このため、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れ、電極１２からも離れる（図４（ｃ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合する（図４（ｄ））。これにより、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が消え、第２のアプタマー２が電極１２から離れる（図４（ｅ））。すると、相補的な核酸断片３の二本鎖核酸部位が消滅することで、相補的な核酸断片３の自由度が向上し、メチレンブルー１４と電極間の接触頻度が増加する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が大きくなり、より大きな還元電流が観測される。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第１のアプタマー１は電極１２に結合し続ける為、メチレンブルー１４の電子伝達は変化せず、還元電流値も変化しない。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、標的物質５の有無を調べることができる。第２の実施の形態で述べたとおり、一度電極１２から離れた第１のアプタマー１が電極１２に再結合できない為、標的物質５が低濃度の場合でも第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。また、第３の実施の形態は、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
　なお、検査対象物を接触させる前の電子伝達があらかじめ分かっている場合や、無視できるほど小さい場合など、必要に応じて、検査対象物を接触させる前の電子伝達の測定は省略することができる。
　なお、第３の実施の形態では、二本鎖核酸部位の開裂による核酸の自由度の向上により電子伝達効率が変化したが、それに限らず、例えば、部材から遊離する核酸に電極反応物質が修飾されていても良い。例えば、第２のアプタマー２にメチレンブルー１４が修飾されていてもよく、その場合、標的物質５によって電極１２から第２のアプタマー２が離れることにより、ＳＷＶの還元電流値は標的物質５が存在する場合の方が小さくなる。
　なお、第３の実施の形態に係る電極反応物質は、電極１２との接触頻度により電子伝達効率が変化するものであればよく、例えば、金属やその錯体、複素環式化合物、触媒、酵素などが用いられる。具体的には、金属としては、例えば、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｔｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｗ、Ａｕ等の粒子、このような金属の塩および酸化物、金属のイオンを中心金属とする錯体等を挙げることができ、複素環式化合物として、ヒドロキノンやアントラキノン等のキノン類およびその誘導体、メチレンブルーおよびその誘導体、ピロール類やピリジン、ビオロゲン等を挙げることができ、触媒としては、Ｐｔや酸化チタン等の微粒子を挙げることができ、酵素としては、特に制限されないが、例えば、グルコースオキシダーゼやビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ等の脱水素酵素、ジアフォラーゼ等の補酵素酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼやカタラーゼ等の過酸化物還元酵素、を挙げることができる。
　電子伝達を測定する手段は特に限定されず、各種電気化学測定法を用いることができるが、例えば、ＳＷＶ、サイクリックボルタンメトリー、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー、交流ボルタンメトリー、交流インピーダンス、アンペロメトリー、ポテンシオメトリーなどが挙げられる。
　また、二本鎖核酸部位の検出に二本鎖核酸結合物質を用いる場合、二本鎖核酸結合物質は、二本鎖核酸部位に特異的に結合する性質を有し電極反応性を有するものであれば限定されず、例えば、メチレンブルー、キノン、アクリジン、およびそれらの誘導体等を挙げることができる。また、インターカレータ自身に、電極反応性の分子を修飾したものを用いてもよい。例えば、アクリジン、エチジウムブロマイドなどの含窒素縮合環化合物、メチレンブルー、ベンゾピレン、アクチノマイシン、ノガラマイシン、ディスタマイシンＡ、メチジウム、およびこれらの誘導体等のインターカレータに、上記電極反応物質を修飾したものを用いることができる。これらを検出する方法は、例えば、前述の電子伝達を測定する手段を用いればよい。
　第３の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２と核酸断片３とが二本鎖核酸部位において二本鎖を形成した複合体４が固定された導電性の部材（電極１２）と、検知対象物と電極１２とを接触させる接触部と、電気化学測定により二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有するものである。この装置は、光学的な機構を用いない為、装置構成を簡略化することができ、装置の小型化や低コスト化が可能となる。
　第３の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２と核酸断片３とが二本鎖核酸部位を形成した上記複合体４が固定された導電性の部材（電極１２）である。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が用いられることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
［第４の実施の形態］
　第４の実施の形態では、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と２箇所の二本鎖核酸部位を形成して複合体４を構成している。
　第４の実施の形態において、第１のアプタマー１は、前述の標的物質５と結合可能な塩基配列と、第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列と、必要に応じて部材（電極１２）に固定可能な官能基および修飾物質を有する。この第１のアプタマー１は、さらに、標的物質５と結合しない塩基配列を備えてもよい。標的物質との結合に関与しない塩基配列は、例えば、前述の第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な核酸断片３の塩基配列である。第１のアプタマー１が標的物質５と結合可能な立体構造を形成可能なように、標的物質５と結合する塩基配列は、これら２つの二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列の間に位置しないことが好ましい。なお、第１のアプタマー１は、標的物質５と結合しない構造部分を有していてもよい。
　第２のアプタマー２は、第１～３の実施の形態で説明したものと同様のものを用いることができる。
　続いて、第４の実施の形態の検出メカニズムについて図５を用いて具体的に説明する。なお、第１～３の実施の形態と同様な点は説明を省略する。図５は、第４の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
　第４の実施の形態において、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と２箇所の二本鎖核酸部位を形成して複合体４を構成している。この複合体４は、第１のアプタマー１の一端が電極１２（部材）に固定されている。第２のアプタマー２には、電極１２に近い側の一端に電極反応物質としてメチレンブルー１４が修飾されている（図５（ａ））。
　はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（図５（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、還元電流が観測される。
　次に、検査対象物を接触させた後の電極１２と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位の一つが消えて、第１のアプタマー１の一部が第２のアプタマー２から離れる（図５（ｂ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合して（図５（ｃ））、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部分が消える。これにより、第２のアプタマー２が電極１２から離れる（図５（ｄ））。すると、メチレンブルー１４が電極１２から離れることによって、メチレンブルー１４と電極１２間の接触頻度が減少する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が少なくなり、測定される還元電流が減少する。一方、検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第２のアプタマーは電極に結合し続ける為、メチレンブルー１４の電子伝達は変化せず、還元電流値も変化しない。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。第１のアプタマー１から離れた第２のアプタマー２は、第２のリガンド６の濃度が高いため、第１のアプタマー１と再結合可能な一本鎖核酸状態をとることができなくなる。このため、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
　なお、第４の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いればよい。これにより、標的物質５の検出を行うことができる。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の複合体４も部材に固定されていなくてもよい。
　第４の実施の形態の標的物質の検出方法では、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な核酸断片３の塩基配列を有することにより、核酸断片３を省くことが可能となる。
　第４の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２とが二本鎖核酸部位を形成した複合体４と、検知対象物と複合体４とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。
　第４の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２とが２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
［第５の実施の形態］
　第５の実施の形態は、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と少なくとも１箇所の二本鎖核酸部位における二本鎖を形成して複合体４を構成している。第２のアプタマー２は、第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位に加え、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を有している。
　第５の実施の形態において、第１のアプタマー１は、第１～３の実施の形態で説明したものと同様のものを用いることができる。また、第５の実施の形態において、第２のアプタマー１は、第２のリガンド６と結合可能な塩基配列と、第１のアプタマー１と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列と、必要に応じて部材に固定可能な官能基および修飾物質を有し、さらに、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズ可能な塩基配列を有する。自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズ可能なこの塩基配列は、第２のリガンド６が結合した際にブランチマイグレーションを生じ易いことから、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５～２０塩基であることが好ましい。なお、第２のアプタマー２は、第２のリガンド６と結合しない構造部分を有していてもよい。
　第５の実施の形態の検出メカニズムについて図６を用いて具体的に説明する。なお、第１～３の実施の形態と同様な点は説明を省略する。図６は、第５の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
　第５の実施の形態において、複合体４は、第１のアプタマー１の一端が電極１２である部材に固定されている。第２のアプタマー２は、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を有しており、電極１２に近い側の一端に電極反応物質としてメチレンブルー１４が修飾されている（図６（ａ））。
　はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（図６（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、還元電流が観測される。
　次に、検査対象物を接触させた後の電極１２と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消えて、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れる（図６（ｂ））。第２のアプタマー２が離れることにより、第２のアプタマー２に修飾されたメチレンブルー１４と電極１２が離れる。
　続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合して（図６（ｃ））、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が消える（図６（ｄ））。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。検査対象物が標的物質５を含む場合、二本鎖核酸部位の開裂によりメチレンブルー１４が電極１２から離れる。これにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度が減少する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が少なくなり、測定される還元電流が減少する。検査対象物に標的物質が含まれない場合は、第２のアプタマー２は第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位と、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位とが形成されたままとなる。このため、第２のアプタマー２はアプタマーとしての立体構造を形成することができず、第２のリガンド６と結合しない。したがって、第２のアプタマー２は電極１２に結合し続ける為、メチレンブルー１４の電子伝達は変化せず、還元電流値も変化しない。
　第１のアプタマー１から離れた第２のアプタマー２は、第２のリガンド６の濃度が高いため、第１のアプタマーと再結合可能な一本鎖核酸状態をとることがほとんどない。このため、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。また、第５の実施の形態においても、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
　なお、第５の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いて、標的物質５を検出しても良い。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との複合体４も部材に固定されていなくてもよい。
　第５の実施の形態では、第２のアプタマー２が自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズ可能な塩基配列を持つことにより、核酸断片３を省くことができる。
　第５の実施の形態の標的物質の検出装置は、二本鎖核酸部位において、第１のアプタマー１が自身の配列の相補的な塩基配列同士で二本鎖を形成した第２のアプタマー２と少なくとも１箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４において、この複合体４と検知対象物とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。
　第５の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１が自身の配列の相補的な塩基配列同士で二本鎖核酸部位を形成した第２のアプタマー２と少なくとも１箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
［第６の実施の形態］
　第６の実施の形態では、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６が、核酸断片３と少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を有している。この連結アプタマー１６および核酸断片３で複合体４が構成されている。
　第１のアプタマー１の塩基配列部分とは、第１～３の実施の形態で説明した標的物質と結合可能な第１のアプタマーの塩基配列のことであり、標的物質５と結合しない構造部分を有してもよい。また、第２のアプタマー２の塩基配列部分とは、第１～３の実施の形態で説明したような第２のリガンド６と結合可能な塩基配列のことであり、第２のリガンド６と結合しない構造部分を有してもよい。第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分は、連結アプタマー１６の任意の部分にあってもよく、例えば、それぞれが、連結アプタマーの端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。
　核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成可能な部位は、連結アプタマー１６の任意の部分にあってもよく、例えば、連結アプタマー１６の端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。ただし、二本鎖核酸部位を形成可能な部位のうち１箇所は、標的物質５と連結アプタマー１６が結合した際にブランチマイグレーションを生じ易いことから、標的物質５と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５～２０塩基であることが好ましい。さらに好ましくは、標的物質５から解離した第１のアプタマー１の再結合が生じづらいことから、５～１０塩基である。さらに、二本鎖核酸部位を形成可能な部位は、第２のリガンド６が結合した際に核酸断片３との再結合が阻害されやすいように、第２のリガンドと結合する塩基配列の一部を含むことが好ましい。さらに好ましくは、標的物質５が結合した際のブランチマイグレーションにより二本鎖核酸部位が開裂しやすいことから、二本鎖核酸部位における第２のリガンドの結合する塩基配列は、１０塩基以下である。また、二本鎖核酸部位を形成可能な部位の別の１箇所は、第２のリガンド６が結合した際にブランチマイグレーションを生じ易いことから、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５～２０塩基であることが好ましい。
　第６の実施の形態では、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む。このため、標的物質５が第１のアプタマー１に結合すると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位の構造が変形し、第１のアプタマー１と核酸断片３とが開裂する（図７（ｂ））。また、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２つの二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、第２のリガンド６が第２のアプタマー２に結合すると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位に一部に相当する第２のアプタマー２の１つの二本鎖核酸部位の構造体が変形する。第１のアプタマー１の構造体は変形したままであるので、第１のアプタマー１が、核酸断片３と再度二本鎖核酸部位を形成することが抑制される。一方、第２のリガンド６と第２のアプタマー２とが結合すると、別の核酸断片３との二本鎖核酸部位との相補的な塩基配列を有する第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位の構造体が変形する。これにより、第２のアプタマー２と核酸断片３とが開裂する。このため、第２のアプタマー２が核酸断片３から離れるため、第２のアプタマー２ととともに連結アプタマー１６を構成する第１のアプタマー１も、核酸断片３から離れる。これにより、第１のアプタマー１が核酸断片３と再度二本鎖核酸部位を形成することがさらに抑制される（図７（ｄ））。
　また、連結アプタマー１６は、必要に応じて部材に固定可能な官能基および二本鎖核酸部位の開裂を検出可能な修飾物質を有していてよい。
　第６の実施の形態において、核酸断片３は、連結アプタマー１６と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を持っている。核酸断片は、連結アプタマーの２箇所の二本鎖核酸部位に結合可能な２種類の核酸断片を用いてもよいし、連結アプタマーと２つの二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を持つ１本の核酸断片３を用いてもよい。核酸断片３は、必要に応じて部材に固定可能な官能基および二本鎖核酸部位の開裂を検出可能な修飾物質を有していてよい。第６の実施の形態では、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
　第６の実施の形態の検出メカニズムについて図７を用いて具体的に説明する。なお、第１～３の実施の形態と同様な点は説明を省略する。図７は、第６の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
　第６の実施の形態において、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分２を有する連結アプタマー１６が、核酸断片３と２箇所の二本鎖核酸部位を形成している。二本鎖核酸部位のうち、１箇所は第１のアプタマーの標的物質５と結合する塩基配列と第２のリガンド６と結合する塩基配列を含んでおり、もう一箇所は第２のリガンド６と結合する塩基配列を含んでいる。核酸断片３は、一端が電極１２に固定されており、別の一端に電極反応物質としてメチレンブルー１４が修飾されている（図７（ａ））。
　はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（図７（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、還元電流が観測される。
　次に、検査対象物を接触させた後の電極１２とメチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の塩基配列部分を含む二本鎖核酸部位が消えて、核酸断片３から離れる（図７（ｂ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合する。先の工程で、第１のアプタマー１の塩基配列部分と一緒に二本鎖核酸部位を形成していた第２のアプタマー２の塩基配列部分が自由になる。このため、第２のアプタマー２の塩基配列部分がアプタマーとしての構造をとれるようになり、第２のリガンド６との結合能力が回復する。これにより、第２のアプタマー２の塩基配列部分が溶液中に添加されている第２のリガンド６と結合する（図７（ｃ））。第２のアプタマー２の塩基配列部分が第２のリガンド６と結合すると、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部分が消えて、連結アプタマー１６が核酸断片３から離れる（図７（ｄ））。連結アプタマー１６との二本鎖核酸部位が消えることにより、核酸断片３の自由度が向上し、メチレンブルー１４と電極１２との接触頻度が向上する。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、連結アプタマー１６と核酸断片３の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。検査対象物が標的物質５を含む場合、二本鎖核酸部位の開裂により核酸断片３の自由度が向上することにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度が向上する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が大きくなる。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、連結アプタマー１６は核酸断片３に結合し続ける。このため、メチレンブルー１４の電子伝達は変化しない。
　核酸断片３から離れた連結アプタマー１６は、第２のリガンド６の濃度が高いため、第２のアプタマー２の塩基配列部分が第２のリガンド６と結合し続ける。したがって、第１のアプタマー１は核酸断片３と再結合可能な一本鎖核酸状態をとることがほとんどない。このため、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
　なお、第６の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いればよい。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、核酸断片３と連結アプタマー１６の複合体４も部材に固定されていなくてもよい。二本鎖核酸部位の開裂をＱＣＭやＳＰＲのような核酸自体の重さや誘電率変化によって検出する場合、核酸への修飾物質を省略しても良い。
　第６の実施の形態の標的物質の検出方法では、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２は独立の一本鎖核酸で構成されていなくても良い。
　なお、図７では、連結アプタマー１６と２つの二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を持つ１本の核酸断片３を用いたが、それに限定されず、各種の変形例を採用することができる。これらの変形例は、図９～１２に示す。これらの変形列においては、連結アプタマー１６の第１のアプタマー１の塩基配列が１カ所の二本鎖核酸部位を形成し、第２のアプタマー２の塩基配列が２カ所以上の二本鎖核酸部位を形成し、標的物質５がトリガーとなって、これらの二本鎖核酸部位が開裂する構成であればよい。例えば、図９に示すように、連結アプタマー１６に異なる２つの核酸断片３がハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成してもよい。また、図１０に示すように、第２のアプタマー２の塩基配列が、核酸断片３と同様の塩基配列を持つ連結アプタマー１６の一部とハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成してもよい。また、図１１に示すように、第１のアプタマー１の塩基配列が、核酸断片３と同様の塩基配列を持つ連結アプタマー１６の一部とハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成し、第２のアプタマー２の塩基配列部分が核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成しても良い。いずれも第６の実施の形態と同様の効果が得られる。
　さらには、図１２に示すように、連結アプタマー１６が、第１のアプタマー１の塩基配列および第２のアプタマー２の塩基配列と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を有し、これらがハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成しても良い。これは、第６の実施の形態と同様に、第１のアプタマー１の構造体の変形により、第１のアプタマー１が、第２のアプタマー２と再度二本鎖核酸部位を形成することが抑制されるという効果が得られる。
　第６の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４において、この複合体４と検知対象物とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度がえられる。
　第６の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
［第７の実施の形態］
　第７の実施の形態は、連結アプタマー１６の第１のアプタマー１の塩基配列部分に結合した標的物質５は、第２のリガンド６と第２のアプタマー２の塩基配列部分の結合によって、第１のアプタマー１から離れ、別の第１のアプタマー１に結合する。そして、この別の第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が開裂することにより、二本鎖核酸部位の開裂を増幅する。第７の実施の形態は第６の実施の形態の応用であるので、第６の実施の形態と同様の点は説明を省略する。
　第７の実施の形態の検出メカニズムについて図８を用いて具体的に説明する。図８は、第７の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。第７の実施の形態において、第６の実施の形態と同様に、連結アプタマー１６が核酸断片３と２カ所の二本鎖核酸部位を形成して、複合体４が構成されている。（図８（ａ））。この核酸断片３は、メチレンブルー１４で修飾され電極１２に固定されている。
　はじめに、第６の実施の形態と同様に、検査対象物を接触させる前の電極１２（図８（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。
　次に、検査対象物を複合体４に接触させる。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、標的物質５が第１のアプタマー１に結合する（図８（ｂ））。これにより、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の塩基配列部分を含む二本鎖核酸部位が消えて、第１のアプタマー１が核酸断片３から離れる（図８（ｃ））。
　次に、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合する。先の工程で、第１のアプタマー１の塩基配列部分と一緒に二本鎖核酸部位を形成していた第２のアプタマー２の塩基配列部分が自由になる。これにより、第６の実施の形態と同様に、第２のアプタマー２の塩基配列部分が溶液中に添加されている第２のリガンド６と結合する（図８（ｄ））。
　続いて、標的物質５が第１のアプタマー１の塩基配列から離れる。第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分が近接している。このため、標的物質５と第２のリガンド６の立体障害により、連結アプタマー１６に対して標的物質５と第２のリガンド６は競争的に結合する。したがって、溶液中に第２のリガンド６が存在すると、第１のアプタマー１の塩基配列と標的物質５が結合する平衡反応と第２のアプタマー２の塩基配列と第２のリガンド６の結合が結合する平衡反応の競争反応によって、第１のアプタマー１部分に結合した標的物質５の追い出し反応が起こる。そして、標的物質５が第１のアプタマー１の塩基配列から離れる（図８（ｅ））。標的物質５が離れると、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部分が消えて、連結アプタマー１６が核酸断片３から離れる（図８（ｆ））。連結アプタマー１６との二本鎖核酸部位が消えることにより、核酸断片３の自由度が向上し、メチレンブルー１４と電極１２との接触頻度が向上する。
　以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、連結アプタマー１６と核酸断片３の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。
　第２のリガンド６と結合した連結アプタマー１６は、第２のリガンド６が立体障害となるため、見かけ上の標的物質５との結合定数が下がる。そのため、第１のアプタマー１の塩基配列から離れた標的物質５は、第２のリガンド６と結合していない核酸断片３と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成している連結アプタマー（図８（ａ））に優先的に結合する。そして、二本鎖核酸部位を開裂し、連結アプタマー１６を核酸断片３から離し、再び、第１のアプタマー１の塩基配列から離れる。このように、標的物質５により連結アプタマー１６が核酸断片３から離れる反応が繰り返される。これにより、二本鎖核酸部位の開裂が増幅され、標的物質５を高感度に検出することが可能となる。
　第７の実施の形態において、第１のアプタマー１の塩基配列、第２のアプタマー２の塩基配列、および連結アプタマー１６は、第６の実施の形態と同様のものを用いることができる。ここでは、第１のアプタマー１の塩基配列と標的物質５のあいだの解離定数（Ｋｄ１）と第２のアプタマー２の塩基配列と第２のリガンド６のあいだの解離定数（Ｋｄ２）の比（Ｋｄ２／Ｋｄ１）は好ましくは１以下であり、さらに好ましくは、０．２以下である。これにより、第２のリガンド６と第２のアプタマー２の塩基配列の結合による標的物質５の追い出し反応が生じやすくなる。
　溶液中に添加される第２のリガンド６の濃度は、高いほど第２のアプタマー２と第２のリガンド６の結合体の存在比率が高まる。このため、第２のリガンド６の濃度は、好ましくは第２のアプタマー２と第２のリガンド６の解離定数（Ｋｄ２）の５倍以上であり、さらに好ましくは５０倍以上である。これにより、第２のリガンド６と第２のアプタマー２の塩基配列の結合による標的物質５の追い出し反応が生じやすくなる。
　なお、第７の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いればよい。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、核酸断片３と連結アプタマー１６の複合体４も部材に固定されていなくてもよい。二本鎖核酸部位の開裂をＱＣＭやＳＰＲのような核酸自体の重さや誘電率変化によって検出する場合、核酸への修飾物質を省略しても良い。
　第７の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４において、この複合体４と検知対象物とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、二本鎖核酸部位の開裂が増幅して引き起こされ、高い測定感度がえられる。
　第７の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は本実施の形態の標的物質の検出方法によって必要なときに直ちに標的物質を検出することができる。
　また、本実施の形態は以下の態様も含む。
［１］標的物質をリガンドとする第１のアプタマーと、上記標的物質とは別の物質である第２のリガンドと結合する第２のアプタマーと、を備え、上記第１のアプタマーは少なくとも１カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第２のアプタマーは二カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーとを含む、複合体を用意し、被検用試料中の上記標的物質と上記第１のアプタマーとの結合により、上記第１のアプタマーおよび上記第２のアプタマーの二本鎖核酸部位を開裂させ、上記二本鎖核酸部位の開裂を検出することにより、上記標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
［２］上記第１のアプタマーおよび／または第２のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成して上記複合体を形成していることを特徴とする、［１］に記載の標的物質の検出方法。
［３］上記第２のアプタマーが、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を形成していることを特徴とする、［１］または［２］に記載の標的物質の検出方法。
［４］上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーが、連結されていることを特徴とする［１］～［３］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［５］上記第１のアプタマーと結合した上記標的物質が、上記第２のリガンドと上記第２のアプタマーの結合によって上記第１のアプタマーと離れ、再び別の第１のアプタマーと結合することにより二本鎖核酸部位の開裂を増幅することを特徴とする、［４］に記載の標的物質の検出方法。
［６］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が１以下であることを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［７］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が、０．２以下であることを特徴とする［６］に記載の標的物質の検出方法。
［８］上記複合体が、部材に固定されていることを特徴とする、［１］～［７］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［９］上記部材が、電極であり、二本鎖核酸部位の開裂を、電気的反応として検出することを特徴とする、［１］～［８］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［１０］上記複合体が、電極反応物質により修飾されており、二本鎖核酸部位の開裂を、上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出することを特徴とする、［９］に記載の標的物質の検出方法。
［１１］上記第２のリガンドの濃度が、上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の５倍以上であることを特徴とする、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［１２］上記第２のリガンドの濃度が、上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の５０倍以上であることを特徴とする、［１１］に記載の標的物質の検出方法。
［１３］上記第１のアプタマーおよび／または上記第２のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位を形成して上記複合体を形成していることを特徴とする、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［１４］標的物質をリガンドとする第１のアプタマーと、標的物質とは別の物質である第２のリガンドと結合する第２のアプタマーと、部材と、を備え、上記第１のアプタマーは少なくとも１カ所以上の二本鎖核酸部位を有し、上記第２のアプタマーが二カ所以上の二本鎖核酸部位を有し、上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーとが二本鎖核酸部位により結合して形成した複合体が、上記部材に固定され、標的物質の検出方法に使用することを特徴とする、センサ（標的物質検出用の装置）。
［１５］上記第１のアプタマーおよび／または上記第２のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位を形成して形成した上記複合体が、上記部材に固定されていることを特徴とする、［１６］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１６］上記第２のアプタマーが、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を形成していることを特徴とする、［１４］または［１５］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１７］上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーが、連結されていることを特徴とする［１４］～［１６］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１８］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が、１以下である、［１４］～［１７］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１９］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が、０．２以下であることを特徴とする［１８］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［２０］上記部材が電極であり、二本鎖核酸部位の開裂を、電気的反応として検出可能なことを特徴とする［１４］～［１９］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［２１］上記複合体が、電極反応物質により修飾されており、二本鎖核酸部位の開裂を、上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出可能なことを特徴とする［２０］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［２２］標的物質をリガンドとする第１のアプタマーと、上記標的物質とは別の物質である第２のリガンドと結合する第２のアプタマーと、を備え、上記第１のアプタマーは少なくとも１カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第２のアプタマーは二カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーとを含む、複合体と被検用試料とを接触させる手段と、上記被検用試料中の上記標的物質との結合による二本鎖核酸部位の開裂を検出する手段とを含み、標的物質の検出方法に使用することを特徴とする、標的物質検出装置。
［２３］［１４］～［２１］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）と、被検用試料中の標的物質と第１のアプタマーとの結合による上記複合体からの二本鎖核酸部位の開裂を検出する手段と、を備える、［２２］に記載の標的物質検出装置。
［２４］上記被検用試料中の上記標的物質と第１のアプタマーの結合による上記複合体からの二本鎖核酸部位の開裂を電気的反応として検出する電気反応検出手段を備える、［２３］に記載の標的物質検出装置。
［２５］上記二本鎖核酸部位の開裂を上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出する電子伝達検出手段を備える、［２４］に記載の標的物質検出装置。
　なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。
　この出願は、２０１０年９月１日に出願された日本出願特願２０１０－１９６０５３号を基礎とする優先権を主張しその開示の全てをここに取り込む。

Claims (10)

  1. 　被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
    　前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
    　前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖が形成される二本鎖形成部位を有しており、
    　前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
    　前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
    　前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体を用意する工程と、
    　前記標的物質と前記第１のアプタマーとを結合させる工程と、
    　前記標的外物質と前記第２のアプタマーとを結合させる工程と、
    　前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む、標的物質の検出方法。
  2. 　前記第１のアプタマーまたは前記第２のアプタマーが、前記二本鎖形成部位において核酸断片と二本鎖を形成して前記複合体を構成している、請求項１に記載の標的物質の検出方法。
  3. 　前記第２のアプタマーが、前記二本鎖形成部位において、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズしている、請求項１または２に記載の標的物質の検出方法。
  4. 　前記第１のアプタマーと前記第２のアプタマーとが連結している、請求項１から３のいずれか１項に記載の標的物質の検出方法。
  5. 　前記第１のアプタマーと結合した前記標的物質が、前記標的外物質と前記第２のアプタマーとの結合により、前記第１のアプタマーから離れ、別の前記第１のアプタマーと結合する、請求項４に記載の標的物質の検出方法。
  6. 　前記複合体が部材に固定されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の標的物質の検出方法。
  7. 　被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
    　前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
    　前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
    　前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
    　前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
    　前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる、標的物質の検出に用いるアプタマーセット。
  8. 　被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
    　前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
    　前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
    　前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
    　前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
    　前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、
    　前記複合体が固定されている部材と、を有する、標的物質の検出に用いるセンサ。
  9. 　前記部材が導電性を有する、請求項８に記載のセンサ。
  10. 　請求項８または９に記載のセンサと、
    　標的物質を第１のアプタマーに結合させる手段と、
    　前記標的物質と異なる物質を第２のアプタマーに結合させる手段と、
    　前記第１のアプタマーの二本鎖形成部位の開裂を検出する手段と、を含む、装置。
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