WO2012029954A1 - 新規Ｇｃグロブリンガラクトース脱糖体の製造方法 - Google Patents

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WO2012029954A1
WO2012029954A1 PCT/JP2011/070048 JP2011070048W WO2012029954A1 WO 2012029954 A1 WO2012029954 A1 WO 2012029954A1 JP 2011070048 W JP2011070048 W JP 2011070048W WO 2012029954 A1 WO2012029954 A1 WO 2012029954A1
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globulin
galactose
amino acid
acid sequence
seq
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均 堀
義浩 宇都
亮太 竹内
美典 中川
弘 寺田
慶司 廣田
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MORITA PHARMACEUTICAL IND Ltd
Tokyo University of Science
University of Tokushima NUC
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MORITA PHARMACEUTICAL IND Ltd
Tokyo University of Science
University of Tokushima NUC
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a galactose deglycoside of Gc globulin derived from plasma or serum and a pharmaceutical composition comprising the deglycoside as an active ingredient.
  • Gc globulin which is a glycoprotein in serum, is deglycosylated by an inflammatory reaction and finally converted into GcMAF having N-acetylgalactosamine in the sugar chain structure in vivo.
  • This GcMAF activates macrophages. That is, Gc globulin functions as a precursor of GcMAF (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 -11, Patent Document 1.
  • GcMAF As the anti-tumor effect of GcMAF is clarified, its clinical application is expected, but it has not yet been developed as a therapeutic drug.
  • Human Gc globulin has sugar chains of galactose, sialic acid, mannose and N-acetylgalactosamine, but there are at least three subtypes (1f, 1s and 2). One type has three sugars and the second type has two sugars. Furthermore, since human serum contains one Gc globulin species from each parent, the types present in human individuals are (1f, 1f), (1f, 1s), (1f, 2), (1s, 1s), (1s, 2), (2, 2), more specifically, (1f, 1f), (1s, 1s), (2, 2) homotype and (1f, 1s) , (1f, 2), (1s, 2) heterotype subspecies exist.
  • threonine is located at positions 418 and 420, and N-acetylgalactosamine is bound to either 418 or 420th threonine, and saccharides of galactose and sialic acid are further added to this N-acetylgalactosamine.
  • threonine is located at the 418th and 420th positions, and N-acetylgalactosamine is bound to either the 418th or 420th threonine, and galactose and ⁇ -mannose are further added to this N-acetylgalactosamine.
  • threonine is observed at position 418, N-acetylgalactosamine is bound to this position, and galactose is further bound (Non-patent Documents 12 and 13).
  • the deglycosylation reaction of 1f1f type human serum Gc globulin has been clarified, that is, when inflammation occurs in vivo, ⁇ -galactosidase of B lymphocytes is activated, which causes degalactose
  • the Gc globulin thus obtained is further desialated by sialidase of T cells to become GcMAF having only an N-acetylgalactosamine terminus.
  • human serum contains at least three types of Gc globulin subsets, and the process of deglycosylation reaction has not been clarified for all subsets.
  • the GcMAF described above is only manufactured using only the 1f and 1f homotypes. For this reason, a technique for producing GcMAF using collected serum, plasma protein, or Gc globulin in a large amount and easily, that is, by a standardized method has not been established, and GcMAF is produced in this field. There was a need for new techniques to do this.
  • Yamamoto N. Et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8539-8543 (1991).
  • Yamamoto N. Et al. Int. J. Cancer. 122 (2), 461-7 (2008).
  • Yamamoto N. Et al. Transl. Oncol. , 1 (2), 65-72 (2008).
  • Yamamoto N. Et al. Cancer. Immunol. Immunother. , 57 (7), 1007-16 (2008).
  • Yamamoto N. Et al., Cancer Res. 57, 2187-92 (1997) Koga et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. , 220, 20-6 (1999) Korbelik et al., Br. J. Cancer.
  • the present invention provides a Gc globulin derivative that can be easily produced from collected serum, plasma protein, or Gc globulin and can be used as GcMAF.
  • the present inventors can use a galactose deglycoside obtained by allowing ⁇ -galactosidase to act on Gc globulin regardless of a subset of Gc globulin as GcMAF. In other words, it was found that it can be easily converted into GcMAF by in vivo or in vitro activation, and the present invention has been completed.
  • the present invention has the following features.
  • a method for producing a galactose deglycoside of Gc globulin by reacting Gc globulin derived from plasma or serum with ⁇ -galactosidase.
  • N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 A galactose deglycoside of Gc globulin having a sugar chain structure in which N-acetylgalactosamine is bound to 418 threonine in the amino acid sequence represented by A pharmaceutical composition for activating macrophages, comprising one or more galactose
  • N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 A galactose deglycoside of Gc globulin having a sugar chain structure in which N-acetylgalactosamine is bound to 418 threonine in the amino acid sequence represented by A pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, comprising one or more galactose de
  • N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 A galactose deglycoside of Gc globulin having a sugar chain structure in which N-acetylgalactosamine is bound to 418 threonine in the amino acid sequence represented by A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising one or more galactose deglyco
  • a method for treating cancer comprising the following (i) to (iv): (I) The galactose deglycoside of [4] Gc globulin; (Ii) N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 A galactose deglycoside of Gc globulin having a sugar chain structure in which N-acetylgalactosamine is bound to 418 threonine in the amino acid sequence represented by One or more galactose deglycosides of Gc globulin
  • N-acetylgalactosamine is bound to either the threonine at position 418 or 420 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A galactose deglycoside of Gc globulin having a sugar chain structure in which ⁇ -mannose is further bonded to acetylgalactosamine; or comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and represented by SEQ ID NO: 3 A galactose deglycoside of Gc globulin having a sugar chain structure in which N-acetylgalactosamine is bound to threonine at position 418 in the amino acid sequence.
  • Gc globulin galactose deglycoside that can be easily produced and can be used as GcMAF regardless of the subtype of Gc globulin.
  • FIG. 1 shows an SDS-PAGE electrophoresis image of a purified product (1f1fGcX) stained with CBB.
  • P Positive control (Gc protein: Sigma)
  • GcX Pre-GcMAF purified product (1f1fGcX)
  • M Marker
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting of a pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) using a human anti-Gc globulin antibody.
  • Primary antibody anti-human Gc globulin (diluted 10,000 times, reacted at room temperature for 1 hour).
  • Secondary antibody anti-rabbit HRP-IgG (10,000-fold dilution, reacted for 1 hour at room temperature). Exposure 30 seconds.
  • FIG. 3-1 shows the results of Western blotting of a pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) using PNA lectin.
  • Primary antibody PNA lectin (diluted 10,000 times, reacted at room temperature for 1 hour).
  • Secondary antibody Streptavidin (diluted 10,000 times, reacted at room temperature for 1 hour). 1 minute exposure.
  • Gc Gc globulin;
  • GcX Pre-GcMAF purified product (1f1fGcX).
  • FIG. 3-2 shows the results of Western blotting of a pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) using HPA lectin.
  • Primary antibody HPA lectin (diluted 10,000 times, reacted for 1 hour at room temperature).
  • Secondary antibody Streptavidin (diluted 10,000 times, reacted at room temperature for 1 hour). 1 minute exposure.
  • MAF Purified GcMAF
  • GcX Pre-GcMAF purified product (1f1fGcX).
  • FIG. 4-1 is a characteristic diagram showing macrophage phagocytic activation ability of pre-GcMAF purified product (1f1fGcX).
  • FIG. 4-2 is a characteristic diagram showing the macrophage phagocytic activation ability of a pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) preliminarily cultured with non-peritoneal cells.
  • FIG. 4-3 is a characteristic diagram showing macrophage phagocytic activation ability of 1f1f type Gc globulin (1f1fGc) as a raw material. In the figure, * indicates the result of Experiment 2.
  • FIG. 5-1 is a characteristic diagram showing the ability of pre-GcMAF purified product (1s1sGcX) to activate macrophage phagocytosis. In the figure, * indicates the result of Experiment 2.
  • FIG. 1s1sGcX 1s1sGcX
  • FIG. 5-2 is a characteristic diagram showing macrophage phagocytic activation ability of 1s1s type Gc globulin (1s1sGc) as a raw material. In the figure, * indicates the result of Experiment 2.
  • FIG. 6-1 is a characteristic diagram showing the ability of pre-GcMAF purified product (22GcX) to activate macrophage phagocytosis. In the figure, * indicates the result of Experiment 2.
  • FIG. 6-2 is a characteristic diagram showing the macrophage phagocytic activation ability of 22 types of Gc globulin (22Gc) as a raw material. In the figure, * indicates the result of Experiment 2.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequence of the 1f subtype Gc globulin (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 10 shows the amino acid sequence of the 1s subtype Gc globulin (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 11 shows the amino acid sequence of 2 subtypes of Gc globulin (SEQ ID NO: 3).
  • the present invention relates to a method for producing a galactose deglycoside (pre-GcMAF) of Gc globulin that can be easily produced and used as GcMAF or has a function of easily converting to GcMAF regardless of Gc type.
  • pre-GcMAF galactose deglycoside
  • the method of the present invention includes a step of reacting Gc globulin derived from plasma or serum with ⁇ -galactosidase.
  • Gc globulin that can be used in the present invention is derived from plasma, preferably serum.
  • Gc globulin is contained in the serum at about 300 to 500 mg / l, and is the 20th largest protein in serum proteins. Therefore, Gc globulin can be obtained efficiently and in large quantities by using plasma or serum.
  • Gc globulin may be in a form contained in plasma or serum, or may be in the form of a crude product or an isolated form.
  • the “form of the crude product” is not a substantially pure Gc globulin but a state containing impurities.
  • substantially pure means a purity of 95% or more, preferably 99% or more.
  • isolated form means a purity of 95% or more, preferably 99% or more. Preferably, it is in an isolated form.
  • Methods for isolating and purifying Gc globulin from plasma or serum include known methods commonly used for protein purification, such as ammonium sulfate salting out, precipitation separation with organic solvents (ethanol, methanol, acetone, etc.), ion exchange chromatography, Isoelectric focusing chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography using substrates or antibodies, chromatography such as reverse phase column chromatography, microfiltration, ultrafiltration, reverse It can refine
  • filtration processing such as osmosis filtration, combining one or more suitably.
  • plasma or serum is applied to an affinity column such as an actin binding column, 25-hydroxy-vitamin D 3 binding column, anti-Gc globulin antibody binding column and the like to specifically bind Gc globulin, and another protein is appropriately used.
  • an affinity column such as an actin binding column, 25-hydroxy-vitamin D 3 binding column, anti-Gc globulin antibody binding column and the like to specifically bind Gc globulin, and another protein is appropriately used.
  • Gc globulin is adsorbed on the resin, washed and then eluted with an acetate buffer or guanidine solution.
  • the eluate can be concentrated by substituting the buffer solution using a centricon or the like.
  • 25-hydroxy - vitamin D 3 is a vitamin D 3 which position 25 is hydroxide, specific avidity for Gc-globulin is very high, the Gc globulin in plasma or serum by using this It can be separated and purified with high purity.
  • a method of dialysis of Gc globulin from plasma is known (for example, Japanese Translation of PCT International Publication No. 2005-508892), and this method can also be used in the present invention.
  • the Gc globulin that can be used in the present invention is an appropriate Gc globulin that is artificially produced using a gene recombination technique (for example, JP-A-11-511962), that is, a nucleic acid that encodes Gc globulin. Those obtained by recombinant expression in host cells are also included.
  • the amino acid sequence of Gc globulin is known and is registered in a database such as GenBank, and such sequence information can be used.
  • the ⁇ -galactosidase that can be used in the present invention may be derived from any organism, or may be a recombinant enzyme obtained by recombinant expression in a suitable host cell using a nucleic acid encoding ⁇ -galactosidase.
  • Good. ⁇ -galactosidase can take any form such as a crudely purified form, a purified form, and an immobilized form.
  • the crudely purified form includes, for example, a processed product from cell culture (eg, extract, lyophilized product, etc.).
  • Commercially available ⁇ -galactosidase for example, Grade III from Bovine Liver (SIGMA) can also be used.
  • the immobilized form means a state in which it is immobilized on an appropriate solid phase.
  • a solid phase material include, but are not limited to, cellulose derivatives such as cellulose and nitrocellulose, sepharose, agarose, metal, glass, ceramic, resin, and the like.
  • the shape and material of the solid phase are not particularly limited.
  • the desugaring reaction is carried out at 20 to 60 ° C., preferably 35 to 42 ° C., more preferably 37.5 ° C., for 0.5 to 5 hours, preferably 0.5 to 2 hours, and ⁇ -galactosidase to Gc globulin. This is done by acting.
  • the reaction pH is from pH 5 to pH 11, preferably in the neutral range.
  • the step of desugaring reaction may be performed by a batch method or a continuous method.
  • Gc globulin All subtypes of Gc globulin have a common structure in which galactose is O-glycosidically bonded to N-acetylgalactosamine, which is the center of the sugar chain. Therefore, regardless of which Gc globulin subtype is used, galactose deglycosides can be induced by the action of ⁇ -galactosidase.
  • pre-GcMAF the galactose deglycoside is referred to as “pre-GcMAF”.
  • pre-GcMAF has a-(SA) -GalNAc sugar chain structure derived from the 1f subtype, a-( ⁇ -MAN) -GalNAc sugar chain structure derived from the 1s subtype, and Those having -GalNAc sugar chain structure derived from 2 subtypes may be included in any combination depending on the subtype included in plasma or serum used as a material.
  • pre-GcMAF has the following structure according to the type of Gc globulin subtype.
  • Pre-GcMAF derived from the 1f subtype of Gc globulin includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and N-acetyl at either 418 or 420th threonine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Galactosamine is bound, and has a sugar chain structure in which sialic acid is further bound to this N-acetylgalactosamine.
  • Pre-GcMAF derived from the 1s subtype Gc globulin includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and N-acetyl is added to either 418 or 420th threonine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Galactosamine is bound, and it has a sugar chain structure in which ⁇ -mannose is further bound to N-acetylgalactosamine.
  • Pre-GcMAF derived from two subtypes of Gc globulin includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and N-acetylgalactosamine binds to threonine at position 418 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It has a sugar chain structure.
  • each of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 has a deletion, substitution, addition or insertion of 1 to several amino acids in each amino acid sequence
  • Gc globulin protein An amino acid sequence encoding a protein having the following activity / function is also included. However, the threonine at position 418 or 420 having the above sugar chain structure in each amino acid sequence is conserved. “Activities and functions of Gc globulin protein” include known ones.
  • the detection and measurement method of each function can be performed by a known method.
  • the range of “1 to several” is not particularly limited. For example, 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, or 1 or Two.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 are respectively represented by the respective amino acid sequences and BLAST (Basic Local Alignment Search at the National Center for Biological Information) (National Biological Information Center). Including amino acid sequences having 90%, 95%, 99% or more identity when calculated using the default local alignment search tool)) etc. (eg default or default parameters), preferably Includes an amino acid sequence that is composed of the amino acid sequence and encodes a protein having the activity and function of a Gc globulin protein. However, the threonine at position 418 or 420 having the above sugar chain structure in each amino acid sequence is conserved.
  • identity refers to identical amino acids and similarities to all overlapping amino acid residues in an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned with or without introducing a gap. It means the percentage of amino acid residues.
  • identity can be determined using methods well known to those skilled in the art, sequence analysis software, and the like (for example, known algorithms such as BLAST and FASTA).
  • Pre-GcMAF can be produced using only one type of enzyme ( ⁇ -galactosidase) even if the material contains multiple Gc globulin subtypes, and the type of enzyme depends on the subtype.
  • the pre-GcMAF can be manufactured quickly and in large quantities and on the other hand for the patient individually.
  • the manufactured pre-GcMAF may be subjected to further purification steps.
  • purification process since pre-GcMAF has the same property as Gc globulin, it can carry out using the method used for the said Gc globulin refinement
  • the pre-GcMAF of the present invention has a different effect of activating macrophages depending on the type of Gc globulin subtype used as a material.
  • an action that activates macrophages means an action that enhances the phagocytic ability of macrophages (particularly, the phagocytic ability through Fc receptors), the ability to produce active oxygen, and the antigen presenting action.
  • macrophage phagocytic ability is sometimes referred to as “macrophage phagocytic activity”, but these terms can be used interchangeably.
  • pre-GcMAF itself derived from the 1f subtype of Gc globulin does not have an effect of activating macrophages.
  • Pre-GcMAF derived from the 1f subtype of Gc globulin can be converted to GcMAF by contacting with lymphocytes, particularly T lymphocytes, to obtain an action of activating macrophages.
  • lymphocytes particularly T lymphocytes
  • the effect of activating macrophages in the supernatant can be obtained by contacting pre-GcMAF derived from Gc globulin of the 1f subtype with lymphocytes.
  • pre-GcMAF derived from the 1f subtype of Gc globulin can be administered into the patient's living body to contact with lymphocytes in the patient's living body and be converted to GcMAF to activate macrophages. it can.
  • pre-GcMAF derived from 1s subtype Gc globulin and pre-GcMAF derived from 2 subtype Gc globulin have the action of activating macrophages by themselves, and the action can be brought into contact with lymphocytes. Retained.
  • the pre-GcMAF produced in this way can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating and preventing various diseases and disorders.
  • the pre-GcMAF contained in the pharmaceutical composition is produced using plasma or serum as a material.
  • plasma or serum containing the same Gc globulin subset as the subject to which the pharmaceutical composition is administered can be produced as a material.
  • the pre-GcMAF contained in the pharmaceutical composition is produced from the subject's own plasma or serum as the material to which the pharmaceutical composition is administered.
  • the pre-GcMAF produced and the protein and / or derivative thereof contained in the plasma or serum can be transferred to viral infections, production of irregular antibodies, fever / anaphylaxis Can be administered to a subject without causing any problems.
  • the “subject” includes human and non-human mammals, but preferably is a human.
  • the pre-GcMAF contained in the pharmaceutical composition may not be in contact with the lymphocytes or the cell culture medium, or may be activated by contact with the lymphocytes or the cell culture medium. It may be a state that has been converted (that is, a state converted into GcMAF).
  • Diseases / disorders that can be treated using the pharmaceutical composition include, for example, diseases / disorders that are known or can be treated by macrophage activation or angiogenesis inhibition. And wound healing, allergic diseases, autoimmune diseases, side effects due to therapeutic agents, cancer, angiogenic diseases other than cancer, and the like, but are not limited thereto.
  • “Cancer” includes melanoma, metastasis, adenocarcinoma, sarcoma, thymoma, lymphoma, lung tumor, liver tumor, colon tumor, kidney tumor, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, leukemia, uterine tumor, breast tumor, prostate tumor , Renal tumors, ovarian tumors, spleen tumors, brain tumors, testicular tumors, bone tumors, muscle tumors, placental tumors, gastric tumors, and the like.
  • Angiogenic diseases other than cancer include diabetic retinopathy, post-lens fibroproliferation, trachoma, neovascular glaucoma, psoriasis, immune inflammation (eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, thyroiditis, Goodpasture syndrome, systemic vasculitis, scleroderma, Sjogren's syndrome, sarcoidosis, primary biliary cirrhosis, autoimmune disease, etc.), nonimmune inflammation, atherosclerosis and excessive wound repair It is not limited to these.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered orally or parenterally (for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection, administration to the abdominal cavity or thoracic cavity, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, transdermal For example, by absorption or rectal administration).
  • parenterally for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection, administration to the abdominal cavity or thoracic cavity, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, transdermal
  • parenterally for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection, administration to the abdominal cavity or thoracic cavity, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, transdermal
  • parenterally for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection, administration to the abdominal cavity or thoracic cavity, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, transdermal
  • intravenous administration for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be made into a suitable dosage form according to the administration route. Specifically, injections, suspensions, emulsifiers, ointments, creams, tablets, capsules, granules, powders, pills, fine granules, troches, rectal administration, oily suppositories, water-soluble It can be prepared in various pharmaceutical forms such as suppositories.
  • Excipients include, for example, lactose, fructose, glucose, corn starch, sorbit and crystalline cellulose, sterilized water, ethanol, glycerol, saline, buffer, etc.
  • disintegrants include, for example, starch, sodium alginate, gelatin
  • binders include calcium carbonate, calcium citrate, dextrin, magnesium carbonate, and synthetic magnesium silicate.
  • methyl cellulose or a salt thereof, ethyl cellulose, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl cellulose, and polyvinylpyrrolidone are lubricants.
  • Talc, magnesium stearate, polyethylene glycol and hydrogenated vegetable oil, and stabilizers include amino acids such as arginine, histidine, lysine and methionine, human serum albumin , Gelatin, dextran 40, methylcellulose, sodium sulfite, sodium metasulfite, etc.
  • Other additives include syrup, petrolatum, glycerin, ethanol, propylene glycol, citric acid, sodium chloride, sodium nitrite and sodium phosphate Respectively.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced aseptically by a commonly used technique such as passing through a sterilizing filter.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as patient age, weight, severity of disease, etc., but pre-GcMAF is preferably 0.4 to 4000 ng / kg body weight per administration. Can be administered in an amount appropriately selected from the range of 20 to 2000 ng.
  • the effect of the pharmaceutical composition of the present invention can be achieved by evaluating remission, exacerbation, healing, etc. of a diseased site before and after administration of the pharmaceutical composition in an in vivo system.
  • the wound healing effect can be performed by evaluating wound size and / or keloid formation before and after administration of the pharmaceutical composition. It can be confirmed that administration of the pharmaceutical composition of the present invention reduces wound size and / or keloid formation.
  • the antitumor effect of the pharmaceutical composition can be determined by measuring skin mass before and after administration of the pharmaceutical composition, and evaluating general tumor size and / or keloid formation using X-rays or the like.
  • diabetic retinopathy can be performed by diagnosing and evaluating retinal lesions before and after administration of the pharmaceutical composition.
  • improvement of retinal lesion, lack of progression, etc. can be confirmed.
  • confirmation of the effect of the pharmaceutical composition of this invention can be performed by the method normally used in the effect confirmation by GcMAF administration.
  • the effect of pre-GcMAF can be evaluated by macrophage activation.
  • the activation of macrophages by GcMAF is obtained by removing mouse peritoneal cells, pre-culturing them in serum-free medium, dividing them into adherent cells and non-adherent cells, adding GcMAF to the adherent cells, and culturing for 3 hours. Can be confirmed by examining phagocytic activity (Nagazawa H. et al. (2004) supra).
  • pre-GcMAF derived from Gs globulin of 1s subtype or 2 subtype since pre-GcMAF itself has macrophage activation action, the effect of pre-GcMAF is evaluated using the above method. be able to.
  • pre-GcMAF derived from 1f subtype Gc globulin since pre-GcMAF itself does not have a macrophage activation effect, it cannot be evaluated using the above method. Then, after adding pre-GcMAF to non-adherent cells and culturing for 2 hours, it can be confirmed by examining the phagocytic activity in cells cultured for 3 hours after adding the culture solution to the adherent cells.
  • the present invention further includes a method for treating and preventing the above-mentioned diseases and disorders using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pre-GcMAF in the present invention is a Gc globulin obtained by removing only galactose from serum Gc globulin.
  • it When it is derived from the 1s subtype or the 2 subtype, it can be used in the same manner as GcMAF. Even if it is derived from the 1f subtype, it can be efficiently and easily converted into GcMAF in the in vivo environment. It can be used similarly. For this reason, like GcMAF, administration of pre-GcMAF to a patient can be expected to enhance macrophage activation and angiogenesis, and further enhance patient resistance and repair power.
  • Example 1 Synthesis and fractionation of pre-GcMAF using purified Gc globulin as a raw material (I) Recovery of Gc globulin from serum 20 ml of blood collected from a human having 1f1f subtype Gc globulin was allowed to stand at room temperature for 30 minutes Thereafter, the mixture was centrifuged (3,000 rpm) at 4 ° C. for 10 minutes to obtain 10.3 ml of serum.
  • the recovered solution is injected into a dialysis membrane clipped on one side, the other side is also clipped, floated and floated in 4 L of 5 mM phosphate buffer (sodium phosphate buffer (SPB)) for dialysis. went. The dialysate was changed 90 minutes, 180 minutes and 270 minutes after the start of dialysis. The third was dialysis overnight.
  • 5 mM phosphate buffer sodium phosphate buffer (SPB)
  • the liquid was collected and passed through a prepared hydroxyapatite column (BioRad Bio-Scale TM Mini CHT Type III, 40 ⁇ M Cartridge, Catalog # 732-4332, LOT NO. B012409B) at 0.2 ml / min. Thereafter, 5 mM phosphate buffer (SPB) was washed at a flow rate of 2.0 ml / min, and when the baseline was settled, a gradient was made by connecting to 200 mM phosphate buffer (SPB, pH 7.0). Approximately 9 ml was recovered as a contained solution.
  • SPB mM phosphate buffer
  • purified Gc globulin could be obtained from a human having 1s1s or 22 subtype Gc globulin using the same method as described above.
  • the reaction solution was transferred to a 2.0 ml Eppendorf tube containing 1.0 g of 25 (OH) VD 3 binding beads (synthesized at the Hori Laboratory of the University of Tokushima graduate School of Sociotechnoscience) and shaken at 4 ° C. for 1 hour. After that, it was centrifuged (13,000 rpm) at 4 ° C. for 2 minutes, and the supernatant was removed. To the precipitate, 0.5 ml of STE buffer was added, shaken for 60 seconds, centrifuged at 4 ° C. for 2 minutes (13,000 rpm), and the supernatant was removed. This operation was repeated three times.
  • the obtained pre-GcMAF-containing extract is put into a prepared microcon (MILLIPORE, Lot NO. R9DN95311, 10000 MVCO), and a recovery cup is attached, followed by centrifugation (13,500 rpm) at 4 ° C. for 10 minutes.
  • the buffer solution was replaced with 10 mM SPB to obtain 20 ⁇ l of a pre-GcMAF purified product (1f1fGcX), which was used in the following examples.
  • Example 2 Examination of physical properties of purified pre-GcMAF (1f1fGcX) (I) Visualization of protein by SDS-PAGE (CBB staining) of purified pre-GcMAF (1f1fGcX), Western blot and HPLC analysis using human anti-Gc globulin
  • the protein concentration of the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) was measured with an acid (BCA) protein measurement kit (PIERCE, Reagent A [Lot NO. HH106101, PROD # 23223], Reagent B [Lot NO. CE49183, PROD # 23224]). However, it was 17.1 ⁇ g / 20 ⁇ l.
  • This band was confirmed to be a Gc globulin derivative since it showed a positive reaction in a Western blot using a human anti-Gc globulin antibody (FIG. 2).
  • Gc globulin has a Gal- (SA) -GalNAc sugar chain structure
  • GcMAF has a GalNAc sugar chain structure, but the sugar chain structure of the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) does not belong to any of them. It became clear.
  • Example 3-1 Effect of pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) on macrophage phagocytic activity (in vitro) Gc globulin does not affect macrophage phagocytic activity, but GcMAF is known to increase macrophage phagocytic activity in in vitro phagocytosis of sheep erythrocytes (SRBC) via Fc receptors on mouse peritoneal macrophages (N. Yamamoto, NPWillett and DDLindsay. Inflammation 1994; 18 (3): 311-322 .; N. Yamamoto, S. Homma and I. Millman. J. Immunol. 1991; 147: 273-280.). Based on this finding, the effect of pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) derived from 1f1f subtype Gc globulin on phagocytic activity of macrophages was examined.
  • SRBC sheep erythrocytes
  • the purified pre-GcMAF (1f1fGcX) did not directly affect the phagocytic activity of macrophages, but increased the phagocytic activity of macrophages when precultured with non-peritoneal cells.
  • the raw material 1f1f type Gc globulin did not increase macrophage phagocytic activity in either Experiment 1 or 2 (FIG. 4-3).
  • the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) exhibits GcMAF-like macrophage phagocytic activation ability when it coexists with non-peritoneal non-adherent cells, that is, in the in vivo environment.
  • Example 3-2 Effect of pre-GcMAF purified product (1s1sGcX) on macrophage phagocytic activity (in vitro)
  • a pre-GcMAF purified product derived from 1s1s subtype Gc globulin was prepared in the same manner as in Example 1 (hereinafter referred to as “pre-GcMAF purified product (1s1sGcX)”), and Experiment 1 of Example 3-1
  • the effect of the pre-GcMAF purified product (1s1sGcX) on macrophage phagocytic activity was examined in the same procedure as in Experiment 2.
  • p 0.0238 (p ⁇ 0.05) for the GcMAF administration group
  • p 0.0463 (p ⁇ 0.05) for the pre-GcMAF purified product (1s1sGcX) administration group.
  • Example 3-3 Effect of pre-GcMAF purified product (22GcX) on macrophage phagocytic activity (in vitro)
  • a purified pre-GcMAF derived from 22 subtypes of Gc globulin was prepared in the same manner as in Example 1 (hereinafter referred to as “pre-GcMAF purified product (22GcX)”).
  • pre-GcMAF purified product (22GcX) was prepared in the same manner as in Example 1 (hereinafter referred to as “pre-GcMAF purified product (22GcX)”.
  • Experiment 1 of Example 3-1 In the same procedure as in Experiment 2, the effect of the pre-GcMAF purified product (22GcX) on the phagocytic activity of macrophages was examined.
  • the purified pre-GcMAF product (22GcX) exhibits GcMAF-like macrophage phagocytic activation ability.
  • the GcMAF-like macrophage phagocytic activation ability of the pre-GcMAF purified product (22GcX) coexists with non-peritoneal non-adherent cells, that is, does not decrease even in the in vivo environment.
  • Example 4 Anti-angiogenic activity (in vivo) of pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) Whether the pre-GcMAF purified product exhibits angiogenesis inhibitory activity similarly to GcMAF was examined for in vivo angiogenesis inhibitory activity by the chicken embryo chorioallantoic membrane method (CAM method).
  • CAM method chicken embryo chorioallantoic membrane method
  • CAM chorioallantoic membrane
  • GcMAF glycosynthesized in the Hori laboratory of the University of Tokushima graduate School of Sociotechnoscience
  • Pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) was administered and cultured at 39 ° C. for 1 day and then at 39.5 ° C. for 1 day.
  • the eggshell is removed and about 1 ml of Intralipos is injected into the CAM.
  • the number and size of capillaries grown on the CAM are visually determined, and the total number of eggs in which the inhibition is observed is used in the experiment.
  • the angiogenesis inhibition rate was calculated by dividing by.
  • GcMAF has an in vivo angiogenesis inhibition rate of 20%, which is slightly weaker than the positive control TX-1934 (synthesized by the Hori Laboratory of the Sociotechnoscience Department of the University of Tokushima graduate School) (inhibition rate 30%). showed that.
  • the inhibition rate of the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) at the same dose (100 ng) was 23%, and that of the 10 ng pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) was 31% (significantly different from the control group (p ⁇ 0.05)), a slightly stronger inhibitory activity than TX-1934 (inhibition rate of 25%).
  • Example 5-1 Simple synthesis of pre-GcMAF from serum and examination of its physical properties
  • 50 ⁇ l of prepared serum derived from a human having the 1f1f subtype
  • 175 ⁇ l of 100 mM SPB and 10 mU / ⁇ l of ⁇ -galactosidase were added and incubated at 37.5 ° C. for 1 hour.
  • the obtained reaction product was prepared and transferred to a 2.0 ml Eppendorf tube containing 1.0 g of 25 (OH) VD 3 binding beads (synthesized at the Hori Laboratory of the Sociotechnoscience Department of the University of Tokushima graduate School). Shake for an hour. After centrifugation (13,000 rpm) at 4 ° C. for 2 minutes to remove the supernatant, the precipitate was washed by shaking with 0.5 ml of STE buffer for 60 seconds, and further at 4 ° C. for 2 minutes. The supernatant was removed by centrifugation (13,000 rpm).
  • the crude product (2) obtained from serum by a simple method contains pre-GcMAF, but also contains serum-derived proteins as contaminants.
  • Example 5-2 Western blotting using PNA lectin and HPA lectin of pre-GcMAF crude purified product (2) As a result of Western blotting using PNA lectin and HPA lectin in a band showing a positive reaction, the above example Similar to 2, no staining bands corresponding to Gc globulin and GcMAF were observed.
  • 1s1s subtype corresponds to Gc globulin and GcMAF. No staining band was seen.
  • Western blotting using PNA lectin no staining band corresponding to Gc globulin was observed in 22 subtypes.
  • pre-GcMAF is also contained in a crude product obtained by a simple method from human serum having 1s1s subtype or 22 subtype.
  • Example 6 Preparation of pre-GcMAF and examination of its physical properties
  • I Synthesis of pre-GcMAF from serum and purification of pre-GcMAF 1.0 ml of STE buffer in 1.0 ml of prepared serum (derived from human having 1f1f subtype) 150 ⁇ l of 10-mU / ⁇ l ⁇ -galactosidase (Grade III from Bovine Liver, SIGMA, Lot NO. 54H7025, G1875) was added and incubated at 37.5 ° C. for 1 hour.
  • the collected liquid was transferred to a dialysis membrane clipped on one side, the other side was also clipped, floated, floated in 4 L of 5 mm phosphate buffer (SPB), and dialyzed.
  • the dialysate is changed 90 minutes, 180 minutes and 270 minutes after the start of dialysis, and the third time is overnight dialysis.
  • the sample was placed in the prepared centricon (MILLIPORE, Lot NO. R0DA20931, 30000 MVCO), a collection chapp was attached, and the mixture was centrifuged (3990 G) for 10 minutes in a centrifuge equipped with an angle rotor, and 200 ⁇ l A final purified product was obtained.
  • the protein concentration was 200.6 ⁇ g / 200 ⁇ l by BCA method.
  • the final purified product was confirmed to be a single band by visualization of the protein by SDS-PAGE (CBB staining), and the band showed a positive reaction by Western blotting with human antiglobulin.
  • Example 7 Control of tumor growth of pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) in LLC (Lewis lung carcinoma cells) lung metastasis mice After acclimatization of 5 week old C57BL / 6 mice for a minimum of 7 days, 2 ⁇ 10 5 LLC were Injected from the tail vein. Seven days later, the mice were treated with a non-treated group (control group), a positive control group (4 ng / kg / day of GcMAF) and a treated group (pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) 0.04 ⁇ g / kg / day and 0.4 ⁇ g / day). Randomly divided into 4 groups (2 groups). The drug is i. p.
  • mice were sacrificed on the 11th day, and the number of tumor nodules formed in the lung (total number and number of sizes less than 2 mm and more than 2 mm) were counted, and the effect of suppressing tumor growth by the pre-GcMAF purified product I investigated.
  • the number of tumor nodules formed in the lung was the treatment group (pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) produced in Example 1 above) relative to the control group. 2 group) was significantly reduced.
  • the treatment group showed a significant difference from the control group (* p ⁇ 0.05). Therefore, it was revealed that the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) was administered at 0.04 ⁇ g / kg or 0.4 ⁇ g / kg and exhibited significant anticancer activity.
  • the number of tumor nodules that grew to a size of 2 mm or more decreased depending on the dose of the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX), and the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) It was observed that the administration suppressed the growth of tumor nodules.
  • a tumor grows to a size of 3 mm 3 (tumor diameter of about 2 mm) or more, angiogenesis is induced because the oxygen concentration in the center of the tumor decreases.
  • the suppression of tumor nodule growth observed in the treatment group suggests that the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) suppresses angiogenesis in tumor tissue and inhibits tumor growth.
  • a decrease in the number of tumor nodules of less than 2 mm was observed. This is because the primary implantation of cancer cells from the blood vessels into the lung tissue was suppressed from secondary metastasis from the implanted tumor. I suggest that
  • Example 8 Control of tumor growth by type-specific pre-GcMAF purified product in LLC (Lewis lung carcinoma cells) lung metastasis mice After acclimatization of 5 week old C57BL / 6 mice for a minimum of 7 days, 2 x 10 5 LLCs Injected from the tail vein. Seven days later, the mice were treated with the untreated group (control group) and the treatment group (1f1fGcX, 1s1sGcX or 22GcX administration group, each at 0.4 ⁇ g / kg for 10 days (each pre-GcMAF purified product was obtained in Example 1 above). 3-2 and 3-3) were randomly divided into 4 groups. The drug is i. p.
  • mice were sacrificed on the 11th day, and the number of tumor nodules formed in the lung (total number and the number of less than 2 mm and a size of 2 mm or more) were counted, and tumor growth by administration of each pre-GcMAF purified product The inhibitory effect of was investigated.
  • the average number of tumor nodules in the treatment group tended to decrease significantly compared to the untreated group.
  • the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX), pre-GcMAF purified product ( 1s1sGcX) and pre-GcMAF purified product (22GcX) showed a significant reduction in the number of tumor nodules (*** p ⁇ 0.001). This shows the same tendency as the result of the macrophage activation ability of each pre-GcMAF purified product shown in Examples 1 to 3-3.
  • the pre-GcMAF purified product is less than the lung cancer untreated group, the pre-GcMAF purified product (1f1fGcX) and the pre-GcMAF purified product (1s1sGcX) are 0 in number, and the pre-GcMAF purified product In (22GcX), the number was 1.
  • Gc globulin galactose deglycoside that can be easily produced and can be used as GcMAF regardless of the subtype of Gc globulin. Therefore, like GcMAF, Gc globulin galactose deglycosides are administered to patients to treat various diseases and disorders such as macrophage activation and angiogenesis inhibition, as well as enhancement of patient resistance and repair ability. Can be used to prevent.

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Abstract

　Ｇｃグロブリンより、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリン誘導体の提供。　Ｇｃグロブリンをβ－ガラクトシダーゼによって処理することによって得られるＧｃグロブリンガラクトース脱糖体の提供。

Description

新規Ｇｃグロブリンガラクトース脱糖体の製造方法
　本発明は、血漿または血清に由来するＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体を製造する方法および当該脱糖体を有効成分として含む医薬組成物に関する。
　怪我をしたとき、動物は自然に治癒する能力を持っている。このとき、血清中の糖タンパク質であるＧｃグロブリンは、炎症反応によって脱糖され、生体内で最終的にＮ－アセチルガラクトサミンを糖鎖構造に持つＧｃＭＡＦへと変換される。このＧｃＭＡＦがマクロファージを活性化させる。すなわち、Ｇｃグロブリンは、ＧｃＭＡＦの前駆体として機能する（非特許文献１）。
　ＧｃＭＡＦは、マクロファージ活性化作用および／または抗血管新生機構を介して様々な腫瘍形成を抑制または遅延させ、また形成腫瘍に対しては増殖抑制作用を示すことが報告されている（非特許文献２－１１、特許文献１）。
　ＧｃＭＡＦが有する抗腫瘍効果が明らかになるに伴いその臨床応用が期待されるが、未だに治療薬として開発がなされていないのが現状である。
　その理由のひとつには、原料となる規格化されたＧｃグロブリンを集めることの難しさがあげられる。
　ヒトＧｃグロブリンには、ガラクトース、シアル酸、マンノース、Ｎ－アセチルガラクトサミンの糖鎖が付いているとされるが、少なくとも（１ｆ，１ｓおよび２）の３種類のサブタイプが存在している。そして、１のタイプには糖が３つ、２のタイプには糖が２つあるとされる。さらに、ヒト血清中には両親から１種類ずつのＧｃグロブリン種が含まれるので、これだけでも、ヒト個人に存在するタイプは、（１ｆ，１ｆ）、（１ｆ，１ｓ）、（１ｆ，２）、（１ｓ，１ｓ）、（１ｓ，２）、（２，２）の６通り、さらに詳しく云えば（１ｆ，１ｆ）、（１ｓ，１ｓ）、（２，２）のホモタイプと（１ｆ，１ｓ）、（１ｆ，２）、（１ｓ，２）のヘテロタイプの亜種が存在する。
　各サブセットについて、マクロファージ活性化に関連する糖鎖の構造が明らかにされている。１ｆの１タイプでは４１８と４２０番目にスレオニンが位置し、４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンにＮ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにガラクトースおよびシアル酸の糖が結合している。１ｓの１タイプでは４１８と４２０番目にスレオニンが位置し、４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンにＮ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにガラクトースおよびα－マンノースが結合している。２タイプでは４１８番目にスレオニンがみられ、この位置にＮ－アセチルガラクトサミンが結合し、さらにガラクトースが結合している（非特許文献１２，１３）。
　このうち、１ｆ１ｆタイプのヒト血清Ｇｃグロブリンの脱糖の反応については明らかにされており、すなわち、生体内で炎症が起こると、Ｂリンパ球のβ－ガラクトシダーゼの活性化が起こり、これによって脱ガラクトースされたＧｃグロブリンが、さらにＴ細胞のシアリダーゼによって脱シアル酸され、Ｎ－アセチルガラクトサミン末端のみを持つＧｃＭＡＦとなる。
　上記のとおりヒト血清中には、少なくても３種類のＧｃグロブリンサブセットが含まれており、また全てのサブセットについてその脱糖反応の過程が明らかにされているわけではない。先に述べたＧｃＭＡＦは１ｆ，１ｆのホモタイプのみを使って製造されるのみである。このため、集められた血清、血漿タンパク質、またはＧｃグロブリンを用いて、大量かつ容易に、すなわち規格化された方法によって、ＧｃＭＡＦを製造する技術は確立されておらず、当該分野においてはＧｃＭＡＦを製造するための新たな手法が求められていた。
特表２００３－５３２６８２号公報
Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８，８５３９－８５４３（１９９１）． Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ．ら、Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ．，　１２２（２），　４６１－７（２００８）． Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ．ら、Ｔｒａｎｓｌ．　Ｏｎｃｏｌ．，　１（２），　６５－７２（２００８）． Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，　５７（７），　１００７－１６（２００８）． Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５７，２１８７－９２（１９９７） Ｋｏｇａら、Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｌ．　Ｍｅｄ．，２２０，　２０－６（１９９９） Ｋｏｒｂｅｌｉｋら、Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ．　７５，　２０２－７（１９９７） Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５６，　２８２７－３１（１９９６） 橋谷進ら、日本口腔科学会雑誌、４６（５）：５３２（１９９７） Ｋｉｓｅｒ，Ｏ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，　５：３２－４０（２００３） Ｏｎｉｚｕｋａ　Ｓら、Ｐａｎｃｒｅａｓ　２８（３）：３１７－３１９（２００３） Ｍｏｈａｍａｄ　Ｓ．Ｂ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　２３（６Ａ），　４４５１－７，　２００３． Ｎａｇａｓａｗａ　Ｈ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　２４（５Ｃ），　３３６１－６，　２００４．
　本発明は、集められた血清、血漿タンパク質、またはＧｃグロブリンより、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリン誘導体を提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、Ｇｃグロブリンのサブセットに関係なく、Ｇｃグロブリンにβ－ガラクトシダーゼを作用させて得られるガラクトース脱糖体が、ＧｃＭＡＦとして利用可能であること、あるいはｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで活性化させることによって簡単にＧｃＭＡＦへと変換できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］　血漿または血清に由来するＧｃグロブリンとβ－ガラクトシダーゼを反応させて、該Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体を製造する方法。
［２］　Ｇｃグロブリンが血漿または血清より単離または粗精製されたものである、［１］の方法。
［３］　さらに、製造されたガラクトース脱糖体をリンパ球またはリンパ球の培養上清と接触させるステップを含む、［１］または［２］の方法。
［４］　［１］～［３］のいずれかの方法によって製造された、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
［５］　以下の（i）～（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、マクロファージを活性化するための医薬組成物。
［６］　以下の（i）～（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、血管新生を阻害するための医薬組成物。
［７］　以下の（i）～（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、癌を治療するための医薬組成物。
［８］　［５］～［７］のいずれかの医薬組成物であって、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体が該医薬組成物を投与される被験体の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、上記医薬組成物。
［９］　癌を治療する方法であって、以下の（i）～（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を癌患者に投与することを含む、上記方法。
［１０］　Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体が、該ガラクトース脱糖体を投与される癌患者の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、［９］の方法。
［１１］　癌患者における癌の治療に使用するための、以下の（i）～（iv）：
（i）［４］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
（iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
［１２］　［１１］のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体であって、該ガラクトース脱糖体が該ガラクトース脱糖体を投与される癌患者の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、上記Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
［１３］　配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；または
　配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-197485号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、Ｇｃグロブリンのサブタイプに関係なく、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリンガラクトース脱糖体を提供することができる。
図１は、ＣＢＢ染色した精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。Ｐ：ポジティブコントロール（Ｇｃタンパク質：シグマ社）、ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）、Ｍ：マーカー 図２は、ヒト抗Ｇｃグロブリン抗体を用いたプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のウェスタンブロットの結果を示す。一次抗体：抗ヒトＧｃグロブリン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。二次抗体：抗ウサギＨＲＰ－ＩｇＧ（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。感光３０秒。Ｐ：ポジティブコントロール（Ｇｃタンパク質：シグマ社）、ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）、Ｍ：マーカー 図３－１は、ＰＮＡレクチンを用いたプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のウェスタンブロットの結果を示す。一次抗体：ＰＮＡレクチン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。二次抗体：ストレプトアビジン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。感光１分間。Ｇｃ：Ｇｃグロブリン；ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）。 図３－２は、ＨＰＡレクチンを用いたプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のウェスタンブロットの結果を示す。一次抗体：ＨＰＡレクチン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。二次抗体：ストレプトアビジン（１０，０００倍希釈，１時間室温にて反応させた）。感光１分間。ＭＡＦ：精製ＧｃＭＡＦ；ＧｃＸ：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）。 図４－１は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。 図４－２は、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。 図４－３は、原料である１ｆ１ｆタイプのＧｃグロブリン（１ｆ１ｆＧｃ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。 図５－１は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。 図５－２は、原料である１ｓ１ｓタイプのＧｃグロブリン（１ｓ１ｓＧｃ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。 図６－１は、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。 図６－２は、原料である２２タイプのＧｃグロブリン（２２Ｇｃ）のマクロファージ貪食活性化能を示す特性図である。図中、＊印は実験２の結果を示す。 図７は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）による抗癌効果を示す特性図である。数値およびエラーバーはn=3-4で行った実験のmean±SEMを示す。図中、黒は2mm以上の大きさまで成長した腫瘍の数を示し、白は2mm未満の大きさの腫瘍の数を示す。また、図中のアスタリスク（＊）および（＊＊）はBonferroniの多重比較検定により、無処置群に対する有意な減少（p<0.05）および（p<0.01）をそれぞれ示す。 図８は、各プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ、１ｓ１ｓＧｃＸ、１ｆ１ｆＧｃＸ）による抗癌効果を示す特性図である。数値およびエラーバーはn=3-4で行った実験のmean±SEMを示す。図中、黒は2mm以上の大きさまで成長した腫瘍の数を示し、白は2mm未満の大きさの腫瘍の数を示す。また、図中のアスタリスク（＊＊＊）はBonferroniの多重比較検定により、無処置群に対する有意な減少（p<0.001）を示す。 図９は、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。 図１０は、１ｓサブタイプのＧｃグロブリンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図１１は、２サブタイプのＧｃグロブリンのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
　本発明は、Ｇｃタイプに関係なく、簡単につくれ、かつ、ＧｃＭＡＦとして利用可能な、あるいは簡単にＧｃＭＡＦに変換する機能を持つＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体（プレＧｃＭＡＦ）の製造方法に関する。
　本発明方法は、血漿または血清に由来するＧｃグロブリンとβ－ガラクトシダーゼを反応させる工程を含む。
　本発明において利用できるＧｃグロブリンは、血漿、好ましくは血清に由来する。Ｇｃグロブリンは血清中に３００～５００ｍｇ／ｌ程度含有され、血清タンパク中で２０番目に多いタンパク質とされる。したがって、血漿または血清を利用することによって、効率的かつ大量にＧｃグロブリンを得ることができる。
　Ｇｃグロブリンは、血漿または血清中に含まれる形態であっても良いし、あるいは粗精製物の形態であっても、単離された形態であっても良い。「粗精製物の形態」とは、実質的に純粋なＧｃグロブリンとされたものではなく、不純物を含んだ状態をいう。ここで「実質的に純粋」とは、９５％以上、好ましくは９９％以上の純度を意味する。また、「単離された形態」とは、９５％以上、好ましくは９９％以上の純度を意味する。好ましくは、単離された形態である。
　血漿または血清よりＧｃグロブリンを単離・精製する方法は、タンパク質精製に通常用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を１つまたは複数を適宜組み合わせて用いて精製することができる。好ましくは、アクチン結合カラム、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ３結合カラム、抗Ｇｃグロブリン抗体結合カラムなどのアフィニティカラムに血漿または血清をアプライし特異的にＧｃグロブリンを結合させて、別のタンパク質を適当な洗浄液で遊離させ、その後、適当な溶出液でＧｃグロブリンを溶出する。また、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ３結合樹脂によるバッチ式で行うこともできる。樹脂にＧｃグロブリンを吸着させ、洗浄後、酢酸緩衝液あるいはグアニジン液などで溶出させる。溶出液は、セントリコンなどを使用して緩衝液を置換、濃縮することができる。なお、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ３は、２５位が水酸化されているビタミンＤ３であって、Ｇｃグロブリンに対する特異的結合力が極めて高く、これを用いることによって血漿または血清中のＧｃグロブリンを高い純度で分離、精製することができる。また、血漿よりＧｃグロブリンを透析する方法が公知であり（例えば、特表２００５－５０８８９２）、本発明においては当該方法を利用することもできる。
　また、本発明において利用できるＧｃグロブリンには、遺伝子組換え技術（例えば、特表平１１－５１１９６２）を用いて人工的に製造されたＧｃグロブリン、すなわちＧｃグロブリンをコードする核酸を用いて適切な宿主細胞で組み換え的に発現させて得られるものも含まれる。Ｇｃグロブリンのアミノ酸配列は公知であり、GenBank等のデータベースに登録されており、これらの配列情報を利用することができる。
　本発明において利用できるβ－ガラクトシダーゼは、いずれの生物由来のものであってもよく、あるいはβ－ガラクトシダーゼをコードする核酸を用いて適切な宿主細胞で組み換え的に発現させて得られる組換え酵素でもよい。β－ガラクトシダーゼは、粗精製形態、精製形態、固定化形態などの任意の形態を採ることが可能である。粗精製形態には、例えば細胞培養からの処理物（例えば、抽出物、凍結乾燥物など）が含まれる。また、市販のβ－ガラクトシダーゼ（例えばＧｒａｄｅ　ＩＩＩ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｉｖｅｒ（ＳＩＧＭＡ））を利用することもできる。固定化形態とは、適当な固相に固定された状態を意味する。このような固相の材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）が挙げられる。固相の形状および材質は特に限定されるものではない。
　脱糖反応は、２０～６０℃、好ましくは３５～４２℃、より好ましくは３７．５℃にて、０．５～５時間、好ましくは、０．５～２時間、Ｇｃグロブリンにβ－ガラクトシダーゼを作用させることにより行う。反応ｐＨは、ｐＨ５～ｐＨ１１、好ましくは中性域とする。脱糖反応のステップは、バッチ方式で行っても良いし、連続方式で行っても良い。
　Ｇｃグロブリンにおけるいずれのサブタイプにおいても、糖鎖の中心であるＮ－アセチルガラクトサミンにガラクトースがＯ－グリコシド結合している共通の構造を有する。したがって、いずれのＧｃグロブリンサブタイプを用いたとしても、β－ガラクトシダーゼを作用させることによって、ガラクトース脱糖体を誘導することができる。以下、本発明において、当該ガラクトース脱糖体を「プレＧｃＭＡＦ」と記載する。したがって、「プレＧｃＭＡＦ」には、１ｆサブタイプに由来する－（ＳＡ）－ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を有するもの、１ｓサブタイプに由来する－（α－ＭＡＮ）－ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を有するもの、および／または２サブタイプに由来する－ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を有するものが、材料として用いた血漿または血清中に含まれるサブタイプに応じて任意の組み合わせで含まれ得る。
　本発明において、プレＧｃＭＡＦは、Ｇｃグロブリンサブタイプの種類に応じて、以下の構造を有する。
　１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する。
　１ｓサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する。
　２サブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する。
　本明細書において、配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列にはそれぞれ、各アミノ酸配列に、１～数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有し、かつＧｃグロブリンタンパク質の活性・機能を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列も含まれる。ただし、ここで各アミノ酸配列において上記糖鎖構造を有する４１８または４２０番目のスレオニンは保存されている。「Ｇｃグロブリンタンパク質の活性・機能」としては公知のものが挙げられ、ビタミンD３と結合して、ビタミンD３を目的の組織に運ぶキャリアータンパク質としての機能や、細胞の分裂、形態変化および運動などの調節に関するアクチンの重合を調節する機能（F-アクチンの脱重合促進とG-アクチンの再重合の阻止作用など）や、上記のとおりＧｃＭＡＦへと変換されマクロファージを活性化する機能などが挙げられる。各機能の検出および測定方法は、公知の手法により行うことができる。「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個または２個である。
　また、本明細書において、配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列にはそれぞれ、各アミノ酸配列とＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸列からなり、かつＧｃグロブリンタンパク質の活性・機能を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列も含まれる。ただし、ここで各アミノ酸配列において上記糖鎖構造を有する４１８または４２０番目のスレオニンは保存されている。
　ここで、「同一性」とは、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（パーセンテージ）を意味する。同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム）を使用して求めることができる。
　プレＧｃＭＡＦは、材料中に複数のＧｃグロブリンサブタイプが含まれていたとしても、一律に一種類の酵素（β－ガラクトシダーゼ）のみを用いて製造することができ、サブタイプに応じて酵素の種類を変える必要がないために、迅速かつ大量に、また一方で患者に対して個別的に、プレＧｃＭＡＦを製造することができる。
　製造されたプレＧｃＭＡＦは、さらなる精製工程に供しても良い。当該精製工程においては、プレＧｃＭＡＦがＧｃグロブリンと同じ性質を持つことから、上記Ｇｃグロブリンの精製に用いられる方法を適宜用いて行うことができる。
　下記実施例にて詳述するように、本発明のプレＧｃＭＡＦは材料として用いるＧｃグロブリンサブタイプの種類に応じて、マクロファージを活性化する作用が相違する。ここで「マクロファージを活性化する作用」とは、マクロファージの貪食能（特にＦｃレセプターを介する貪食能）や活性酸素産生能および抗原提示作用を高める作用を意味する。なお、本明細書において、「マクロファージの貪食能」を「マクロファージの貪食活性」と記載する場合があるが、これらの用語は相互互換的に用いることができる。１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦそれ自体では、ＧｃＭＡＦと異なりマクロファージを活性化する作用を有していない。１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは、リンパ球、特にＴリンパ球と接触させることによって、ＧｃＭＡＦへと変換されマクロファージを活性化する作用を得ることができる。実際、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦをリンパ球と接触させることによって、上清中にマクロファージを活性化する作用が得られる。あるいは、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦは患者生体内へ投与されることによって、患者生体内のリンパ球と接触して、ＧｃＭＡＦへと変換されマクロファージを活性化する作用を得ることができる。一方、１ｓサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦおよび２サブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦでは、それ自体単独でマクロファージを活性する作用を有し、その作用はリンパ球と接触させても保持される。
　このようにして作製されたプレＧｃＭＡＦは様々な疾患・障害を治療および予防するための医薬組成物の有効成分として利用することができる。
　当該医薬組成物に含まれるプレＧｃＭＡＦは、血漿または血清を材料として製造される。また、当該医薬組成物を投与される被験体と同一のＧｃグロブリンサブセットを含む血漿または血清を材料として製造することができる。さらに好ましくは、当該医薬組成物に含まれるプレＧｃＭＡＦは、当該医薬組成物を投与される被験体自身の血漿または血清を材料として製造されたものである。被験体自身の血漿または血清を材料として利用することによって、製造されたプレＧｃＭＡＦや当該血漿または血清に含まれるタンパク質および／またはその誘導体を、ウイルス感染症伝搬、不規則抗体の産生、発熱・アナフィラキシーなどの問題を生じることなく、被験体に投与することができる。本発明において、「被験体」はヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれるが、好ましくはヒトである。
　また、当該医薬組成物に含まれるプレＧｃＭＡＦは、上記リンパ球等または当該細胞の培養液と接触させていなくても良いし、上記リンパ球等または当該細胞の培養液と接触させることによって活性化された状態（すなわち、ＧｃＭＡＦへと変換された状態）であっても良い。
　当該医薬組成物を用いて治療し得る疾患・障害としては、例えば、マクロファージの活性化や血管新生の阻害によって治療し得ることが公知である、または治療し得る可能性がある疾患や障害が挙げられ、創傷治癒、アレルギー疾患、自己免疫疾患、治療薬による副作用、癌、癌以外の血管新生疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。「癌」としては、黒色腫、転移、腺癌、肉腫、胸腺腫、リンパ腫、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮腫瘍、胸部腫瘍、前立腺腫瘍、腎性腫瘍、卵巣腫瘍、脾臓腫瘍、脳腫瘍、精巣腫瘍、骨腫瘍、筋腫瘍、胎盤の腫瘍、胃性腫瘍など（これらに限定されない）が挙げられる。「癌以外の血管新生疾患」としては、糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、トラコーマ、新血管形成緑内障、乾癬、免疫性炎症（例えば、慢性関節リュウマチ、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、全身性脈管炎、硬皮症、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、原発性胆管性肝硬変、自己免疫疾患など）、非免疫性炎症、アテローム性動脈硬化症および過剰創傷修復などが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の医薬組成物は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）によって投与することができる。
　また、本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。
　これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビットおよび結晶セルロース、滅菌水、エタノール、グリセロール、生理食塩水、緩衝液などが、崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウムおよび合成ケイ酸マグネシウムなどが、結合剤としては、例えばメチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが、安定化剤としては、例えばアルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン４０、メチルセルロース、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが、その他の添加剤としては、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリウムなどがそれぞれ挙げられる。
　また本発明の医薬組成物は、通常用いられている手法、例えば除菌フィルターを通す等によって、無菌的に作製することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、プレＧｃＭＡＦを、１回の投与につき体重１ｋｇあたり０．４～４０００ｎｇ、好ましくは２０～２０００ｎｇの範囲から適宜選択される量を投与することができる。
　本発明の医薬組成物の効果は、ｉｎ　ｖｉｖｏの系であれば、当該医薬組成物の投与前後における疾患部位の寛解、増悪、治癒などを評価することによって行うことができる。たとえば、創傷治癒効果については、医薬組成物の投与前後における創傷サイズおよび／またはケロイド形成を評価することによって行うことができる。本発明の医薬組成物の投与によって、創傷サイズおよび／またはケロイド形成が縮小していることが確認できる。また当該医薬組成物の抗腫瘍効果については、医薬組成物の投与前後における皮膚塊の測定、Ｘ線などを用いた一般的な腫瘍サイズおよび／またはケロイド形成を評価することによって行うことができる。本発明の医薬組成物の投与によって、皮膚塊や腫瘍サイズおよび／またはケロイド形成が縮小していることが確認できる。さらに、糖尿病性網膜症においては、医薬組成物の投与前後における網膜病巣を診断・評価することによって行うことができる。本発明の医薬組成物の投与によって、網膜病巣の改善、進行の欠如などが確認できる。なお、本発明の医薬組成物の効果の確認は、ＧｃＭＡＦ投与による効果確認において、通常用いられている方法によって行うことができる。
　一方、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系では、プレＧｃＭＡＦの効果は、マクロファージの活性化作用によって評価することができる。一般的に、ＧｃＭＡＦによるマクロファージの活性化作用は、マウス腹腔細胞を取り出し、無血清培地で予備培養を行い、付着細胞と非付着細胞に分け、その付着細胞にＧｃＭＡＦを加えて３時間培養した細胞で貪食活性を調べることによって確認することができる（Ｎａｇａｓａｗａ　Ｈ．ら、（２００４）上掲）。上記のとおり、１ｓサブタイプまたは２サブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦの場合は、プレＧｃＭＡＦ自体がマクロファージの活性化作用を有するために、上記の手法を用いてプレＧｃＭＡＦの効果を評価することができる。一方、１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦの場合は、プレＧｃＭＡＦ自体がマクロファージの活性化作用を有さないために、上記の手法を用いて評価することはできない。そこで、非付着細胞にプレＧｃＭＡＦを加え２時間培養した後、当該培養液を付着細胞に加えて３時間培養した細胞で貪食活性を調べることによって確認することができる。
　本発明は、さらに本発明の医薬組成物を用いた上記疾患・障害の治療および予防方法を包含する。
　本発明におけるプレＧｃＭＡＦは、血清のＧｃグロブリンからガラクトースのみを外したＧｃグロブリンである。１ｓサブタイプまたは２サブタイプに由来する場合には、ＧｃＭＡＦと同様に利用することができ、１ｆサブタイプに由来するものであっても生体内環境では効率よく簡単にＧｃＭＡＦへと変換しＧｃＭＡＦと同様に利用することができる。このため、ＧｃＭＡＦ同様、プレＧｃＭＡＦを患者に投与することによって、マクロファージの活性化作用や血管新生阻害作用、さらに患者の抵抗性や修復力の増強が期待できる。
　以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
実施例１：精製Ｇｃグロブリンを原料としたプレＧｃＭＡＦの合成と分取
（Ｉ）血清からのＧｃグロブリンの回収
　１ｆ１ｆサブタイプのＧｃグロブリンを有するヒトより採血した血液２０ｍｌを、室温で３０分静置後、４℃、１０分間遠心分離（３０００ｒｐｍ）し、血清１０．３ｍｌを得た。
　血清３．５ｍｌにＳＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４，　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　６．０５ｇ，　ＥＤＴＡ・２ＮＡ　０．５６ｇ，　ＮＡＣＬ　８．７７ｇ，　ＳＤＷ　１０００ｍｌ，　ＴＲＩＴＯＮ－１００　１ｍｌ）を３．５ｍｌ加えて全量を７．０ｍｌとし、これを準備した２５（ＯＨ）ＶＤ３（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）を結合したアフィニティカラム（１０ｍｍ×８０ｍｍ）に０．４ｍｌ／ｍｉｎで流した。さらに、ＳＴＥ緩衝液を９０分間流した後、６Ｍのグアニジン塩酸塩を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して、溶出したタンパク質含有溶液約２０ｍｌを回収した。回収液は、片側をクリップで留めた透析膜に注入して、反対側もクリップで留め、浮きをつけて５ｍＭリン酸緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液（ＳＰＢ））４Ｌ中に浮かべて透析を行った。透析開始から９０分後、１８０分後、さらに２７０分後に透析液を交換した。３回目は一夜透析とした。
　透析後、液を集めて、準備したヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ　Ｂｉｏ－ＳｃａｌｅＴＭ　Ｍｉｎｉ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ，　４０μＭ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　Ｃａｔａｌｏｇ＃７３２－４３３２，　ＬＯＴ　ＮＯ．Ｂ０１２４０９Ｂ）に０．２ｍｌ／ｍｉｎで流した。その後、５ｍＭリン酸緩衝液（ＳＰＢ）を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して洗浄し、ベースラインが落ち着いたところで、２００ｍＭリン酸緩衝液（ＳＰＢ，ｐＨ７．０）につないでグラジエントを行い、Ｇｃグロブリン含有溶液としてほぼ９ｍｌを回収した。これを、準備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．Ｒ０ＤＡ２０９３１，　３００００　ＭＶＣＯ）に入れ、回収用チャップを付けて、アングルローターを取り付けた遠心器で１０分間、遠心分離（３９００Ｇ）して、精製Ｇｃグロブリン７４２．６７μｇ／３００μｌを得た。
　なお、１ｓ１ｓまたは２２のサブタイプのＧｃグロブリンを有するヒトからも、上記と同様の方法を用いて、精製Ｇｃグロブリンを得ることができた。
（ＩＩ）ＧｃグロブリンからのプレＧｃＭＡＦの合成と濃縮
　精製Ｇｃグロブリンの２５μｇに、１０ｍＵ／μｌのβ－ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｄｅ　ＩＩＩ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｉｖｅｒ，　ＳＩＧＭＡ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．５４Ｈ７０２５，　Ｇ１８７５）２５μｌを加え、さらに１００ｍＭ　ＳＰＢ（ｐＨ７．０）１６５μｌを加えて全量２００μｌとし、３７．５℃で１時間インキュベーションした。反応液を２５（ＯＨ）ＶＤ３結合ビーズ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）１．０ｇを加えた２．０ｍｌのエッペンチューブに移し、４℃にて１時間振とうした後、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。沈殿物にＳＴＥ緩衝液０．５ｍｌを加えて６０秒間振とうして、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた。この操作を３回繰り返した。次に、溶出液として０．４ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸塩を加え６０秒間振とうし、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）した。これを３回繰り返し、液をあわせてプレＧｃＭＡＦ含有抽出液とした。
　得られたプレＧｃＭＡＦ含有抽出液を、準備したｍｉｃｒｏｃｏｎ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．Ｒ９ＤＮ９５３１１，　１００００　ＭＶＣＯ）に入れ、回収用チャップを付けて、４℃にて１０分間、遠心分離（１３，５００ｒｐｍ）して、１０ｍＭ　ＳＰＢで緩衝液置換を行い、２０μｌのプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を得て、以下の実施例に用いた。
実施例２：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の物性検査
（Ｉ）プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）によるタンパク質の可視化、ヒト抗Ｇｃグロブリンを用いたウェスタンブロットおよびＨＰＬＣ解析
　ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質測定キット（ＰＩＥＲＣＥ，　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ　［Ｌｏｔ　ＮＯ．ＨＨ１０６１０１，　ＰＲＯＤ　＃　２３２２３］，　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂ　［Ｌｏｔ　ＮＯ．ＣＥ４９１８３，　ＰＲＯＤ　＃　２３２２４］）でプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のタンパク質濃度を測定したところ、１７．１μｇ／２０μｌとなった。
　また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色像でタンパク質の可視化を行ったところ、分子量５６ｋＤａ付近に１本の濃いバンドがみられた（図１）。
　このバンドは、ヒト抗Ｇｃグロブリン抗体を用いたウェスタンブロットにおいて陽性反応を示したことから、Ｇｃグロブリン誘導体であることが確認された（図２）。
　また、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のタンパク質バンドが単一バンドであったことから、ＨＰＬＣによるタンパク質分析（２８０ｎｍ）を行ったところ、保持時間１２．５５４ｍｉｎのシグマ社製のＧｃグロブリンピークに一致した。
（ＩＩ）プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）のＰＮＡレクチン、ＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロッティング
　プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の糖鎖構造を調べるため、目的バンド（分子量５６ｋＤａ付近の濃いバンド）のＰＮＡレクチンを用いたウェスタンブロッティングを行った結果、精製ＧｃグロブリンはＰＮＡレクチンで染まったが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）はＰＮＡレクチンでは染まらなかった（図３－１）。また、目的バンドのＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロッティングを行った結果、精製ＧｃＭＡＦ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）はＨＰＡレクチンで染まったが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の分子量５６ｋＤａ付近のバンドはＨＰＡレクチンでは染まらなかった（図３－２）。
　以上の結果より、ＧｃグロブリンはＧａｌ－（ＳＡ）－ＧａｌＮＡｃ糖鎖構造、また、ＧｃＭＡＦはＧａｌＮＡｃ糖鎖構造であるが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の糖鎖構造はいずれにも属さないことが明らかとなった。
実施例３－１：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）によるマクロファージ貪食活性への影響（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるマウス腹腔マクロファージのＦｃレセプターを介するヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の貪食試験において、Ｇｃグロブリンはマクロファージの貪食活性に影響を与えないが、ＧｃＭＡＦはマクロファージの貪食活性を上昇させることが知られている（N.Yamamoto, N.P.Willett and D.D.Lindsay. Inflammation 1994;18(3):311-322.；N.Yamamoto, S.Homma and I.Millman. J.Immunol.1991;147:273-280.）。この知見に基づいて、１ｆ１ｆサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の、マクロファージの貪食活性に及ぼす影響を調べた。
　プレＧｃＭＡＦ精製物のマクロファージの貪食活性に及ぼす影響は以下の手順で評価した。
＜実験１＞
　８週齢のＩＣＲマウス（雌）の腹腔にＰＢＳ　１０ｍｌを注入して腹腔内混合細胞を取り出し、４℃、１，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。集めた細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０６細胞／ｍｌに調節し、カバーグラスを沈めたプレートに５．０×１０５細胞／ｗｅｌｌになるように５００μｌずつ播種した。当該細胞にＲＰＭＩ培地を５００μｌ加えて、３７．５℃で１時間予備培養して、マクロファージをカバーグラスに定着させた。その後、上清を除き、付着したマクロファージ層を洗浄して、新しいＲＰＭＩ培地を加えて３７℃で１５時間培養した。
　この準備したマクロファージ層に、それぞれ１０ｎｇのプレＧｃＭＡＦ精製物、１０ｎｇの精製ＧｃＭＡＦ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）、または１μｇのＬＰＳ（シグマ社）を加えて、３７℃、３時間培養した。続いて、マクロファージに、ＩgＧをコートした０．５％ＳＲＢＣを加えて９０分間貪食させた後、マクロファージを固定、ギムザ染色した。その後、顕鏡して貪食されたＳＲＢＣをカウントして貪食指数（ingestion index）を算出し、マクロファージの貪食活性を評価した。
＜実験２＞
　実験１の予備培養時の上清を回収し、回収した上清液約１ｍｌに１０ｎｇのプレＧｃＭＡＦ精製物を加えて、３７℃、１時間培養した。その後、培養物を遠心分離して培地に含まれる非付着細胞を除き、この処理液を実験１と同様に準備したマクロファージ層に培養液として加えて、３７℃、３時間培養した。続いて、マクロファージに、ＩｇＧをコートした０．５％ＳＲＢＣを加えて９０分間貪食させた後、細胞を固定、ギムザ染色した。その後、顕鏡した後、貪食されたＳＲＢＣをカウントして貪食指数（ingestion index）を算出し、マクロファージの貪食活性を評価した。
　なお、「コントロール」としてはマウス腹腔から抽出した腹腔液の上清（上記実験１の予備培養時の上清に該当）を用いた。
　プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を用いた、実験１の結果を図４－１に、実験２の結果を図４－２に示す。
　実験１において、貪食指数の平均(n=3)は、コントロール群に対してＧｃＭＡＦ投与群では上昇したが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）投与群においては変化がなかった（図４－１）。コントロール群に対する有意差検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を行った結果、ＧｃＭＡＦ投与群はp=0.0040（p<0.01）、LPS投与群はp=0.0017（p<0.01）と、それぞれ有意差が見られたが、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）投与群はp=0.1595で有意差は見られなかった。
　実験２において、マクロファージの平均貪食指数(n=3)はコントロール群に対して、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の投与群は上昇した（図４－２）。コントロール群に対する有意差検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を行った結果、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の投与群はp=0.0009（p<0.01）と有意差がみられた。プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）はマクロファージの貪食活性に直接的な影響を及ぼさないが、腹腔非付着細胞との予備培養を行ったときにはマクロファージの貪食活性を上昇させた。
　なお、原料である1f1fタイプのGcグロブリンは、実験１および２のいずれにおいても、マクロファージ貪食活性を上昇させなかった（図４－３）。
　以上の結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（1f1fGcX）は腹腔非付着細胞と共存させることによって、すなわち、生体内環境において、GcMAF様のマクロファージ貪食活性化能を示すことが明らかとなった。
実施例３－２：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）によるマクロファージの貪食活性への影響（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
　1s1sのサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦ精製物を、実施例１と同様の方法で作製し（以下、「プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）」と記載）、実施例３－１の実験１、実験２と同様の手順で、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）がマクロファージの貪食活性に及ぼす影響を調べた。
　結果を図５－１、ならびに図５－２に示す。
　図５－１に示すとおり、実験１の結果、マクロファージの平均貪食指数(n=4)は、コントロール群に対してＧｃＭＡＦ投与群およびプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群において上昇した。コントロール群に対する各群の有意差検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を行った結果、ＧｃＭＡＦ投与群はp=0.0238（p<0.05）、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群はp=0.0463（p<0.05）と、それぞれ有意差が見られた。また、実験２において、マクロファージの平均貪食数(n=4)はコントロール＊群に対してプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群（1s1sGcX＊）において上昇した。コントロール＊群に対する有意差検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を行った結果、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）投与群（1s1sGcX＊)はp=0.0396（p<0.05）と有意差がみられた。
　一方、図５－２に示すとおり、原料である1s1sタイプのGcグロブリンは、実験１および２のいずれにおいても、貪食活性の上昇を示さなかった。
　以上の結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（1s1sGcX）はGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能を示すことが明らかとなった。また、プレＧｃＭＡＦ精製物（1s1sGcX）のGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能は、腹腔非付着細胞と共存させることによって、すなわち、生体内環境においても低下しないことが明らかとなった。
実施例３－３：プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）によるマクロファージの貪食活性への影響（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
　２２のサブタイプのＧｃグロブリンに由来するプレＧｃＭＡＦ精製物を、実施例１と同様の方法で作製し（以下、「プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）」と記載）、実施例３－１の実験１、実験２と同様の手順で、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）がマクロファージの貪食活性に及ぼす影響を調べた。
　結果を図６－１、ならび図６－２に示す。
　図６－１に示すとおり、実験１の結果、マクロファージの平均貪食指数(n=4)は、コントロール群に対してＧｃＭＡＦ投与群およびプレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群において上昇した。コントロール群に対する各群の有意差検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を行った結果、ＧｃＭＡＦ投与群は p=0.0214（p<0.05）、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群はp=0.0319（p<0.05）と、それぞれ有意差が見られた。また、実験２において、マクロファージの平均貪食数(n=4)はコントロール＊群に対してプレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群（22GcX＊）において上昇した。コントロール＊群に対する有意差検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を行った結果、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）投与群（22GcX＊）はp=0.0254（p<0.05）と有意差がみられた。
　一方、図６－２に示すとおり、原料である22タイプのGcグロブリンは、実験１および２のいずれにおいても、貪食活性能の上昇を示さなかった。
　以上の結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）はGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能を示すことが明らかとなった。また、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）のGcMAF様のマクロファージ貪食活性化能は、腹腔非付着細胞と共存させることによって、すなわち、生体内環境においても低下しないことが明らかとなった。
実施例４：プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の血管新生阻害活性（ｉｎ　ｖｉｖｏ）
　プレＧｃＭＡＦ精製物がＧｃＭＡＦと同様に血管新生阻害活性を示すかについて、鶏胚漿尿膜法（ＣＡＭ法）によるｉｎ　ｖｉｖｏ血管新生阻害活性を調べた。
＜実験＞
　孵卵０日目の鶏受精卵を孵卵器で３７．６℃、４日間培養し、気室上方部と鶏卵側部の卵殻の２ヶ所に錐で穴をあけ、鶏卵側部の穴から約４ｍｌの卵白を吸引除去した。次いで、気室上方部の穴にシリコンスポイトをあてて吸引し、卵殻膜から卵黄のうや胚を剥離した後、鶏卵側部の穴をオプサイトでシールした。次に、気室上方部の穴の卵殻を一部除去して卵殻膜を露出させ、気室上方部にステンレス製のキャップをかぶせて３９℃で２４時間培養した。培養後、絨毛尿膜（ＣＡＭ）が２～３ｍｍになっていることを確認してシリコンリングをＣＡＭの中心に置き、精製ＧｃＭＡＦ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）およびプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を投与して３９℃で１日、次いで３９．５℃で１日間培養した。培養後、卵殻を取り除いてイントラリポス約１ｍｌをＣＡＭに注入し、ＣＡＭ上に成長した毛細血管の数や大きさを目視にて判定し、阻害が見られた鶏卵数を実験に使用した全体数で割り、血管新生阻害率を算出した。
＜結果＞
　１００ｎｇ　ＧｃＭＡＦのｉｎ　ｖｉｖｏ血管新生阻害率は２０％であり、ポジティブコントロールのＴＸ－１９３４（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）（阻害率３０％）と比較してやや弱い阻害活性を示した。
　一方、同じ用量（１００ｎｇ）のプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の阻害率は２３％、１０ｎｇのプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）では３１％であり（コントロール群との間に有意差を示す（ｐ＜０．０５））、ＴＸ－１９３４（阻害率２５％）よりもやや強い阻害活性を示した。
　この結果より、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）はＧｃＭＡＦに比べてやや強い血管新生阻害活性を有することが示された。
実施例５－１：血清からのプレＧｃＭＡＦの簡易合成とその物性検査
　血清から直接、プレＧｃＭＡＦ精製物の合成が可能か否かを調べるため、準備した血清５０μｌ（１ｆ１ｆサブタイプを有するヒトに由来する）に１７５μｌの１００ｍＭ　ＳＰＢおよび１０ｍＵ／μｌのβ－ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｄｅ　ＩＩＩ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｉｖｅｒ，　ＳＩＧＭＡ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．５４Ｈ７０２５，　Ｇ１８７５）２５μｌを加えて３７．５℃にて１時間インキュベートした。得られた反応物を準備した２５（ＯＨ）ＶＤ３結合ビーズ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）１．０ｇを入れた２．０ｍｌのエッペンチューブに移し、４℃にて１時間振とうした。４℃にて２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた後、沈殿物をＳＴＥ緩衝液０．５ｍｌを用いて６０秒間振とうして洗浄し、さらに４℃にて２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた。この操作を３回繰り返した後、０．５ｍｌの５．０Ｍ　酢酸緩衝液を加え６０秒間振盪し、Ｇｃグロブリン誘導体を溶出し、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、溶出液を取り出す。この操作を３回繰り返し、溶出液をあわせて、ｍｉｃｒｏｃｏｎ　（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．Ｒ９ＤＮ９５３１１，　１００００　ＭＶＣＯ）を用いて１０ｍＭ　ＳＰＢ緩衝液で置換し、プレＧｃＭＡＦの粗精製物（２）２１．６４μｇ／２９μｌを得た。
　プレＧｃＭＡＦの粗精製物（２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）によるタンパク質の可視化では、計３つのバンドが見られた。ヒト抗Ｇｃグロブリンを用いたウェスタンブロットを行った結果、Ｇｃグロブリンに相当する、最も濃いバンド（分子量５６ｋＤａ付近）のみに陽性反応が認められた。その他の２つバンドは陽性反応を示さなかった。
　ＣＢＢ染色の結果よりＷｉｎｄｏｗｓ用汎用画像処理パッケージＷｉｎＲｏｏｆを用いて目的バンドの染色濃度を１．０としたとき、それぞれのバンドの染色濃度・バンド面積を測定し、目的バンド値／全バンド値×１００％を目的バンドの純度として求めた結果を表１に示す。目的バンドの純度は６６．１１％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　血清から簡易法により得られた粗精製物（２）にはプレＧｃＭＡＦが含まれるが、夾雑物として血清由来のタンパク質も含まれる。
実施例５－２：プレＧｃＭＡＦ粗精製物（２）のＰＮＡレクチン、ＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロッティング
　陽性反応を示すバンドでのＰＮＡレクチン、ＨＰＡレクチンを用いたウェスタンブロットを行なった結果、上記実施例２と同様に、ＧｃグロブリンおよびＧｃＭＡＦに該当する染色バンドが見られなかった。
　また、１ｓ１ｓサブタイプまたは２２サブタイプを有するヒトの血清から簡易法により得られた粗精製物を用いて、上記と同様にウェスタンブロッティングを行った結果、１ｓ１ｓサブタイプについてはＧｃグロブリンおよびＧｃＭＡＦに該当する染色バンドが見られなかった。２２のサブタイプではＰＮＡレクチンを用いたウェスタンブロットを行なった結果、Ｇｃグロブリンに該当する染色バンドが見られなかった。
　この結果は、１ｓ１ｓサブタイプまたは２２サブタイプを有するヒトの血清から簡易法により得られた粗精製物にもプレＧｃＭＡＦが含まれることを示唆する。
実施例６：プレＧｃＭＡＦ製造例とその物性検査
（Ｉ）血清からのプレＧｃＭＡＦ合成とプレＧｃＭＡＦの精製
　準備した血清１．０ｍｌ（１ｆ１ｆサブタイプを有するヒトに由来する）にＳＴＥ緩衝液１．０ｍｌおよび１０ｍＵ／μｌのβ－ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｄｅ　ＩＩＩ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｉｖｅｒ，　ＳＩＧＭＡ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．５４Ｈ７０２５，　Ｇ１８７５）１５０μｌ加えて３７．５℃にて１時間インキュベートした。
　反応液に１０ｍｌのＳＴＥ緩衝液を加えて、準備した２５（ＯＨ）ＶＤ３結合ビーズ（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部の堀研究室で合成）のアフィニティカラム（１０ｍｍ×８０ｍｍ）に０．４ｍｌ／ｍｉｎで流した。さらに、ＳＴＥ緩衝液を５分間流した後、６Ｍのグアニジンを加えたＳＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して、溶出してくるＧｃグロブリン誘導体　約２５ｍｌを回収した。回収液は、片側をクリップで留めた透析膜に移して、反対側もクリップで留め、浮きをつけて５ｍｍリン酸緩衝液（ＳＰＢ）４Ｌの中に浮かべて透析を行った。透析開始から９０分後、１８０分後および２７０分後に透析液を変えて、３回目は一夜透析とする。
（ＩＩ）ヒドロキシアパタイトカラム処理での二次精製とその物性検査
　試薬などの混入物を除くため、透析後の液を集め、準備したヒドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ　Ｂｉｏ－ＳｃａｌｅＴＭ　Ｍｉｎｉ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ，　４０μＭ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　Ｃａｔａｌｏｇ　＃７３２－４３３２，　Ｌｏｔ　ＮＯ．　Ｂ０１２４０９Ｂ）に０．２ｍｌ／ｍｌでサンプルを流した。その後、５ｍＭ　ＳＰＢ緩衝液を２．０ｍｌ／ｍｉｎで流して洗浄し、ベースラインが落ち着いたところで、２００ｍＭ　ＳＰＢ緩衝液（ｐＨ７．４）につないでグラジエントを行った。Ｇｃグロブリンのほぼ９ｍｌを回収した。これを、準備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，　Ｌｏｔ　ＮＯ．Ｒ０ＤＡ２０９３１，　３００００　ＭＶＣＯ）にサンプルを入れ、回収用チャップを付けて、アングルローターを取り付けた遠心器で１０分間、遠心分離（３９９０Ｇ）して、２００μｌの最終精製物を得た。このタンパク質濃度はＢＣＡ法で２００．６μｇ／２００μｌであった。
　最終精製物はＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）によるタンパク質の可視化で単一のバンドであることが確認でき、ヒト抗グロブリンによるウェスタンブロットでそのバンドは陽性反応を示した。
実施例７：　ＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ)肺転移マウスにおけるプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の腫瘍生育の制御
　５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを最低７日間馴化させたのち、２ｘ１０５個のＬＬＣを尾部静脈から注入した。７日後のマウスを無処置群（対照群）と陽性対照群（ＧｃＭＡＦの４ｎｇ／ｋｇ／日投与）および治療群（プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の０．０４μｇ／ｋｇ／日および０．４μｇ／ｋｇ／日投与の２群）の４群に無作為に分けた。薬剤は１０日間ｉ．ｐ．投与した後、１１日目にマウスを屠殺し、肺に形成された腫瘍結節の数（全数および２ｍｍ未満と２ｍｍ以上の大きさの数）を集計し、プレＧｃＭＡＦ精製物による腫瘍生育の抑制効果を調べた。
　結果を図７に示す。
　各群（ｎ＝３または４）での肺に形成された腫瘍結節の数（平均値±ＳＥＭ）は、対照群に対して治療群（上記実施例１で製造したプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を投与された２群）において大きく減少した。当該腫瘍結節数の減少について、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った結果、治療群は対照群に対して有意差を示した（＊　ｐ＜０．０５）。したがって、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）を０．０４μｇ／ｋｇまたは０．４μｇ／ｋｇで投与することによって、有意な抗がん活性を示すことが明らかとなった。
　さらに、図７に示すとおり、治療群においては２ｍｍ以上の大きさまで成長した腫瘍結節の数が、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）の用量に依存して減少しており、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）投与により、腫瘍結節の成長が抑制されることが観察された。通常、腫瘍は３ｍｍ３（腫瘍径約２ｍｍ）以上の大きさまで成長すると、腫瘍中心部の酸素濃度が低下するため血管新生が誘導される。治療群で観察される腫瘍結節の成長抑制は、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）が腫瘍組織での血管新生を抑制し、腫瘍の生育を阻害することを示唆する。また、治療群においては、２ｍｍ未満の腫瘍結節数の減少が観察されたが、これは血管から肺組織に一次着床した癌細胞が、着床した腫瘍からさらにニ次転移することが抑制されていることを示唆する。
実施例８：　ＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ）肺転移マウスにおけるタイプ別のプレＧｃＭＡＦ精製物による腫瘍生育の制御
　５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを最低７日間馴化させたのち、２ｘ１０５個のＬＬＣを尾部静脈から注入した。７日後にマウスを、無処置群（対照群）および治療群（１ｆ１ｆＧｃＸ、１ｓ１ｓＧｃＸまたは２２ＧｃＸ投与群、各々０．４μｇ／ｋｇの１０日間ｉ．ｐ．投与（各プレＧｃＭＡＦ精製物は上記実施例１、３－２、３－３で製造したもの））の４群に無作為に分けた。薬剤は１０日間ｉ．ｐ．投与した後、１１日目にマウスを屠殺し、肺に形成された腫瘍結節の数（全数および２ｍｍ未満と２ｍｍ以上の大きさの数）を集計し、各プレＧｃＭＡＦ精製物の投与による腫瘍育成の抑制効果を調べた。
　結果を図８に示す。各群（ｎ＝３－４）の肺に形成された平均腫瘍結節数の±ＳＥＭとして示す。
　治療群の平均腫瘍結節数は無処置群に対して大きく減少する傾向を示し、治療群の対照群に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った結果、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）およびプレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）は有意な腫瘍結節数の減少を示した（＊＊＊　ｐ＜０．００１）。これは上記実施例１～３－３に示した、各プレＧｃＭＡＦ精製物のマクロファージ活性化能の結果と同様の傾向を示す。
　また、２ｍｍ以上の腫瘍結節に目を向けると、プレＧｃＭＡＦ精製物では肺がん無処置群より少なく、プレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ）およびプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｓ１ｓＧｃＸ）では個数０であり、プレＧｃＭＡＦ精製物（２２ＧｃＸ）では個数１となった。これらの結果は、これらのプレＧｃＭＡＦ精製物（１ｆ１ｆＧｃＸ、１ｓ１ｓＧｃＸ、２２ＧｃＸ）が腫瘍組織での血管新生を抑制し、腫瘍の生育を阻害することを示唆する。
　本発明により、Ｇｃグロブリンのサブタイプに関係なく、容易に製造することができ、かつＧｃＭＡＦとして利用可能なＧｃグロブリンガラクトース脱糖体を提供することができる。このため、ＧｃＭＡＦ同様、Ｇｃグロブリンガラクトース脱糖体を患者に投与することによって、マクロファージの活性化作用や血管新生阻害作用、さらに患者の抵抗性や修復力の増強など様々な疾患や障害を治療又は予防するために利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (13)

  1. 　血漿または血清に由来するＧｃグロブリンとβ－ガラクトシダーゼを反応させて、該Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体を製造する方法。
  2. 　Ｇｃグロブリンが血漿または血清より単離または粗精製されたものである、請求項１記載の方法。
  3. 　さらに、製造されたガラクトース脱糖体をリンパ球またはリンパ球の培養上清と接触させるステップを含む、請求項１または２記載の方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項記載の方法によって製造された、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
  5. 　以下の（i）～（iv）：
    （i）請求項４記載のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
    （ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
    （iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
    （iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
    からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、マクロファージを活性化するための医薬組成物。
  6. 　以下の（i）～（iv）：
    （i）請求項４記載のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
    （ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
    （iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
    （iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
    からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、血管新生を阻害するための医薬組成物。
  7. 　以下の（i）～（iv）：
    （i）請求項４記載のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
    （ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
    （iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
    （iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
    からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を含む、癌を治療するための医薬組成物。
  8. 　請求項５～７のいずれか１項記載の医薬組成物であって、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体が該医薬組成物を投与される被験体の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、上記医薬組成物。
  9. 　癌を治療する方法であって、以下の（i）～（iv）：
    （i）請求項４記載のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
    （ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
    （iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
    （iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
    からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体、を癌患者に投与することを含む、上記方法。
  10. 　Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体が、該ガラクトース脱糖体を投与される癌患者の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、請求項９記載の方法。
  11. 　癌患者における癌の治療に使用するための、以下の（i）～（iv）：
    （i）請求項４記載のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体;
    （ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号１で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにシアル酸が結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；
    （iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；および
    （iv）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体、
    からなる群より選択される、一または複数のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
  12. 　請求項１１記載のＧｃグロブリンのガラクトース脱糖体であって、該ガラクトース脱糖体が該ガラクトース脱糖体を投与される癌患者の血漿または血清に由来するＧｃグロブリンを材料として製造されたものである、上記Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
  13. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号２で表されるアミノ酸配列における４１８または４２０番目のいずれかのスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合しており、このＮ－アセチルガラクトサミンに対してさらにα－マンノースが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体；または
    　配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ該配列番号３で表されるアミノ酸配列における４１８番目のスレオニンに、Ｎ－アセチルガラクトサミンが結合している糖鎖構造を有する、Ｇｃグロブリンのガラクトース脱糖体。
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