WO2012033142A1 - Ｃ型肝炎ウイルスリポソームワクチン - Google Patents

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内田　哲也
麻衣子 種市
愛 三熊
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Saitama Medical University
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    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to peptide-bonded liposomes and peptides useful as hepatitis C virus vaccines, and uses thereof.
  • Hepatitis C is viral hepatitis that develops upon infection with the hepatitis C virus. After being infected with hepatitis C virus, it may heal spontaneously, but in many cases, if left untreated, it shifts to chronic hepatitis. If chronic hepatitis persists, it shifts to cirrhosis and further increases the risk of developing liver cancer. There are reports that about 80% of the causes of liver cancer are hepatitis C.
  • interferon therapy has shown a certain therapeutic result.
  • interferon therapy is not effective (for example, cases with a high viral load of type 1b), and therefore, development of an effective treatment method for a wider range of patients is required.
  • MHC major histocompatibility complex
  • hepatitis C virus is less immunogenic than other viruses. Therefore, a method for inducing CTLs using a relatively highly immunogenic epitope present in a hepatitis C virus antigen has been studied.
  • Patent Document 1 discloses a peptide that is derived from a protein of hepatitis C virus and induces an HLA-restricted CTL response in an immunized host.
  • Patent Document 2 discloses a method for inducing cytotoxic T lymphocytes using a hepatitis C virus immunogenic peptide capable of binding to HLA A2.1 and a composition containing the peptide.
  • a hepatitis C virus immunogenic peptide capable of binding to HLA A2.1
  • composition containing the peptide it is unclear whether these peptides are effective in the actual treatment or prevention of hepatitis C.
  • Patent Document 3 can efficiently and specifically enhance CTL for killing pathogen-infected cells or cancer cells using liposomes to which antigens are bound, and is useful for prevention and treatment of infectious diseases and cancers.
  • a method for preparing a T cell activator is disclosed.
  • Patent Document 4 discloses that an antigenic epitope particularly effective for the preparation of cytotoxic T lymphocytes was found from a highly conserved internal protein sequence of avian influenza virus, and a peptide containing the epitope was bound to the surface. It has been described that the prepared liposomes can induce antigen-specific cytotoxic T lymphocytes extremely potently.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a vaccine capable of efficiently inducing cytotoxic T lymphocytes and having a therapeutic or preventive effect on hepatitis C.
  • the present inventors have found that the strength of the antigen peptide inducing cytotoxic T lymphocytes in a state where it does not bind to liposomes, and the cytotoxicity of antigen peptides in the state where they bind to liposomes.
  • the strength to induce lymphocytes is not in a parallel relationship, and even if the activity to induce cytotoxic T lymphocytes is weak when not bound to liposomes, it is extremely strongly cytotoxic when bound to liposomes We found that T lymphocytes could be induced.
  • a liposome to which a peptide is bound is A partial amino acid sequence of 9 or more amino acids in the amino acid sequence of hepatitis C virus NS3 protein, Have a length of 9-11 amino acids and can induce cytotoxic T lymphocytes;
  • the liposome comprises a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and a liposome stabilizer.
  • the peptide is bound to the surface of the liposome; Peptide-bound liposomes.
  • the phospholipid is at least one selected from diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, succinimidyl-diacylphosphatidylethanolamine, and maleimide-diacylphosphatidylethanolamine.
  • [5] The peptide-bonded liposome according to [1], wherein the liposome stabilizer is cholesterol.
  • the peptide has an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond contained in the phospholipid membrane constituting the liposome.
  • the peptide-bonded liposome according to [1] which is bound to a phospholipid.
  • peptide-bonded liposome according to [1], wherein the liposome has the following composition: (A) a phospholipid having 1 to 99.8 mol% of an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (B) Liposome stabilizer 0.2 to 75 mol%.
  • a cytotoxic T lymphocyte activator comprising the peptide-bonded liposome according to [1].
  • a hepatitis C virus vaccine comprising the peptide-bonded liposome according to [1].
  • the hepatitis C virus vaccine of [12] further comprising CpG-DNA.
  • the hepatitis C virus vaccine of [12] which is used for treatment of hepatitis C.
  • a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and having a length of 9 to 11 amino acids.
  • a method for preventing or treating hepatitis C in a mammal comprising administering to the mammal a prophylactically or therapeutically effective amount of the peptide-bonded liposome according to [1].
  • cytotoxic T lymphocytes can be efficiently induced, which is useful for the treatment or prevention of hepatitis C.
  • the peptide-binding liposome or peptide of the present invention it is possible to provide a highly versatile hepatitis C virus vaccine that is effective against hepatitis C virus of any genotype of type 1a or 1b.
  • FIG. 1 shows the vaccine effect of peptide-bound liposomes.
  • Each graph shows the titer of the virus contained in the ovary.
  • 24 peptides except for one that was poorly water-soluble were divided into 4 pools (NS3-I to IV), and peptide-coupled liposomes were prepared using each pool, and the vaccine effect was measured. did.
  • the result using Adex1CA3269 is shown as a positive control, and the result without immunization (Nave) is shown as a negative control.
  • a broken line indicates a detection lower limit.
  • FIG. 2 shows the results of examining the immunogenicity of each peptide in each pool in FIG.
  • FIG. 3 shows the results of examining the immunogenicity of each peptide using peptide-bonded liposomes prepared from each peptide.
  • the number of IFN- ⁇ producing cells by stimulation of each peptide-bound liposome was quantified by the ELISPOT method, and the cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes was measured by the 51 Cr release method.
  • FIG. 4 shows the vaccine effect of peptide-bound liposomes prepared from each peptide. Each graph shows the titer of the virus contained in the ovary.
  • FIG. 5 shows the results obtained by examining the immunogenicity of peptide # 3 bound to liposomes by ELISPOT. Liposomes conjugated with mouse H-2b epitope peptide 1630-1637 showed high immunogenicity, whereas those conjugated with human HLA-A * 0201 epitope 1073-1081 or 1585-1593 are immunogenic. It was low. In contrast, peptide # 3 exhibited high immunogenicity comparable to that of mouse epitope 1630-1637 due to liposome binding.
  • FIG. 5 shows the results obtained by examining the immunogenicity of peptide # 3 bound to liposomes by ELISPOT. Liposomes conjugated with mouse H-2b epitope peptide 1630-1637 showed high immunogenicity, whereas those conjugated with human HLA-A * 0201 epitope 1073-1081 or 1585-1593 are immunogenic. It was low. In contrast, peptide # 3 exhibited high immunogenicity comparable to that of mouse epitope 1630-1637 due to liposome binding.
  • FIG. 6 shows that the immunogenicity of peptide # 3 is low in immunization experiments with two recombinant viruses Adex1CA3269 and VV-NS3. That is, peptide # 3 does not have immunogenicity when immunized with NS3 as a whole, but exhibits excellent immunogenicity by liposome binding.
  • FIG. 7 shows the boost effect of peptide-bound liposomes prepared from peptide # 3 (Lip- # 3). Similar to the results of FIG. 6, it is shown that the immunization with the recombinant virus VV-NS3 does not exhibit the immunogenicity of peptide # 3 and does not show the boost effect.
  • FIG. 8 shows the dose dependency of the immunogenicity of Lip- # 3.
  • FIG. 9 shows the cross-reactivity of Lip- # 3.
  • FIG. 10 shows the cross-reactivity of Lip- # 13 and Lip- # 13-1A.
  • FIG. 11 shows the cross-reactivity of Lip- # 19 and Lip- # 19-3A.
  • Peptide-bound liposome The present invention is a liposome to which a peptide is bound,
  • the peptide comprises a partial amino acid sequence of 9 or more amino acids in the amino acid sequence of hepatitis C virus NS3 protein (preferably an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1-3, 5, and 6), Have a length of 9-11 amino acids and can induce cytotoxic T lymphocytes;
  • the liposome comprises a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, and a liposome stabilizer.
  • the peptide is bound to the surface of the liposome; Peptide-coupled liposomes are provided.
  • the present invention relates to hepatitis C virus NS3 protein as an epitope having an activity of strongly inducing cytotoxic T cells when bound to the surface of the liposome described in detail below in hepatitis C virus antigen. It was completed based on finding an epitope sequence (epitope sequence of the present invention) having a length of 9 amino acids or more in the amino acid sequence.
  • the epitope sequence of the present invention is preferably an epitope sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1-3, 5, and 6 from the viewpoint of effectiveness as a vaccine when bound to liposomes.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 correspond to partial sequences present in the amino acid sequence of the NS3 protein of hepatitis C virus.
  • the peptide comprising the amino acid sequence includes, for example, peptides comprising the corresponding epitope sequences in the same antigen of different virus strains as follows.
  • YMNTPGLPV SEQ ID NO: 1
  • YLNTPGLPV SEQ ID NO: 4
  • AMFDSSVLC SEQ ID NO: 2
  • J1 strain ⁇ GMFDSVLC
  • IMTCMSADL SEQ ID NO: 3
  • strain 1a ⁇ IMMACMSADL (SEQ ID NO: 6) (J1 strain)
  • a peptide containing the epitope sequence of the present invention can induce cytotoxic T lymphocytes.
  • “Inducing cytotoxic T lymphocytes” means cells that specifically recognize the antigen in the mammal's body when the mammal (eg, human, transgenic mouse, etc.) is immunized with the antigen. It means that the number and / or activity of cytotoxic T lymphocytes (eg cytotoxic activity) is increased.
  • the length of the peptide contained in the peptide-bonded liposome of the present invention is not particularly limited, but is usually 9 to 11 amino acids, preferably 9 to 10 amino acids, more preferably 9 amino acids.
  • the peptide has an additional sequence on the N-terminal side and / or C-terminal side of the epitope sequence of the present invention.
  • the length of the additional sequence and the amino acid sequence are not particularly limited as long as the above properties of the peptide are not impaired.
  • the additional sequence may be an amino acid sequence actually present adjacent to a partial sequence corresponding to any of SEQ ID NOs: 1 to 6 in the amino acid sequence of the NS3 protein of hepatitis C virus.
  • the peptide is a residue that can overcome the selection of the presented antigen due to individual differences (polymorphism) of MHC when forming a major histocompatibility complex (MHC) in a cell.
  • the peptide contained in the peptide-bonded liposome of the present invention can be prepared by a known peptide synthesis technique such as liquid phase synthesis or solid phase peptide synthesis.
  • the peptide is produced by culturing a transformant (such as E. coli) into which an expression vector capable of expressing the peptide is introduced, and isolating the peptide from the culture by a well-known purification technique such as an affinity column. can do.
  • An expression vector capable of expressing the peptide can be constructed by linking a polynucleotide encoding the peptide downstream of a promoter in an appropriate expression vector using well-known genetic engineering techniques.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is such that the phospholipid that is an amphiphilic surfactant forms an interface with the polar group facing the aqueous phase, and the hydrophobic group is on the opposite side of the interface It has a structure suitable for.
  • the liposome refers to a phospholipid bilayer membrane having a closed space.
  • the peptide contained in the peptide-bonded liposome of the present invention can be bound to the surface of the liposome via a functional group that it has.
  • the functional group in the peptide used for binding to the liposome surface include an amino group, a thiol group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a disulfide group, or a hydrophobic group composed of a hydrocarbon group (alkyl group or the like) having a methylene chain. It is done.
  • amino group, thiol group, carboxyl group, hydroxyl group and disulfide group are covalently bonded, amino group and carboxyl group are bonded by ionic bond, hydrophobic group is hydrophobic group by hydrophobic bond, and the peptide is attached to the surface of liposome.
  • the peptide is preferably bound to the surface of the liposome via an amino group, carboxyl group or thiol group.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome has an amino group, a succinimide group, a maleimide group, a thiol group, It is desirable to have a functional group such as a hydrophobic group composed of a carboxyl group, a hydroxyl group, a disulfide group, or a hydrocarbon group having a methylene chain (such as an alkyl group).
  • the functional group possessed by the phospholipid membrane constituting the liposome is preferably an amino group, a succinimide group or a maleimide group.
  • the combination of the functional group of the peptide involved in the binding of the peptide to the liposome and the functional group of the phospholipid membrane constituting the liposome can be freely selected within a range that does not affect the effects of the present invention.
  • Preferred combinations include an amino group and an aldehyde group, an amino group and an amino group, an amino group and a succinimide group, a thiol group and a maleimide group, respectively.
  • the ionic bond and the hydrophobic bond are preferable from the viewpoint of easy preparation of the peptide bond to the liposome, and the covalent bond is preferably a peptide bond point or peptide bond on the liposome surface.
  • the peptide-bonded liposome of the present invention is that a peptide having an excellent cytotoxic T lymphocyte activation effect is bound to the surface of the liposome, which is a constituent component thereof. Therefore, it is preferable from the viewpoint of further enhancing the effect of the present invention that the peptide is stably bound to the surface of the liposome even after being administered into the living body, for example, by an injection action in a practical stage. From such a viewpoint, the bond between the peptide and the liposome is preferably a covalent bond.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention comprises an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. It contains a phospholipid having, and a liposome stabilizer.
  • the carbon number of the acyl group is preferably 16 to 22, more preferably 18 to 22, and most preferably 18 It is.
  • Specific examples of the acyl group include a palmitooleoyl group, an oleoyl group, and an elcoyl group, and an oleoyl group is most preferred.
  • the carbon number of the hydrocarbon group is preferably 16 to 22, more preferably 18 to 22, most preferably 18 is preferred.
  • Specific examples of the hydrocarbon group include a tetradecenyl group, a hexadecenyl group, an octadecenyl group, a C20 monoene group, a C22 monoene group, and a C24 monoene group.
  • the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group bonded to the 1-position and 2-position of the glycerin residue of the phospholipid may be the same or different. From the viewpoint of industrial productivity, the 1-position and 2-position groups are preferably the same.
  • a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond is preferably used.
  • the phospholipid preferably has an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond.
  • the acyl group has less than 13 carbon atoms, the liposome stability may be deteriorated, and the CTL activity enhancing effect may be insufficient.
  • the carbon number of the acyl group exceeds 24, the stability of the liposome may deteriorate.
  • Examples of phospholipids having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond include acidic phospholipids, neutral phospholipids and peptides. Examples include reactive phospholipids having a functional group capable of binding. These can be selected as appropriate according to various requirements.
  • phosphatidylserine phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylinositol and the like can be used.
  • Serine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, and diacylphosphatidylinositol are preferably used.
  • the acidic phospholipid imparts an anionic ionizing group to the surface of the liposome, and thus imparts a negative zeta potential to the surface of the liposome. For this reason, liposomes have a charge repulsive force and can exist as a stable preparation in an aqueous solvent. Thus, acidic phospholipids are important in ensuring the stability of the liposome when the peptide-bound liposome of the present invention is in an aqueous solvent.
  • the neutral phospholipid for example, phosphatidylcholine and the like can be used.
  • the neutral phospholipid that can be used in the present invention can be used by appropriately selecting the type and amount thereof within the scope of achieving the enhancement of CTL activity addressed by the present invention.
  • the neutral phospholipid has a higher function of stabilizing the liposome and can improve the stability of the membrane, compared to the phospholipid to which the acidic phospholipid and the peptide of the present invention are bound.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention preferably contains a neutral phospholipid.
  • the amount of neutral phospholipid used can be determined after securing the contents of acidic phospholipid used to achieve the CTL activity enhancing effect, reactive phospholipid for peptide binding, and liposome stabilizer.
  • the peptide of the present invention contains an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or 14 carbon atoms having one unsaturated bond contained in the phospholipid membrane constituting the liposome. It binds to the surface of liposomes by binding to phospholipids having ⁇ 24 hydrocarbon groups.
  • a reactive phospholipid having a functional group to which the peptide of the present invention can bind is used as the phospholipid for the peptide bond.
  • Reactive phospholipids having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond can be classified according to various requirements. The ratio is appropriately selected. Similar to the phospholipid, also in the reactive phospholipid, it is not preferable that the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group contained in the phospholipid has more than 24 or less than 14.
  • Examples of the reactive phospholipid include phosphatidylethanolamine or a terminally modified product thereof. Further, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, and terminally modified products thereof can also be used as reactive phospholipids. From the viewpoint of industrial availability, simplicity of the coupling step with the peptide of the present invention, yield, etc., phosphatidylethanolamine or a terminally modified product thereof is preferably used. Phosphatidylethanolamine has an amino group capable of binding the peptide of the present invention at its terminal.
  • the number of carbon atoms having one unsaturated bond is 14 to 14
  • diacylphosphatidylethanolamine having 24 acyl groups or a terminally modified product thereof.
  • Diacylphosphatidylethanolamine can be obtained, for example, by base exchange reaction between choline and ethanolamine using phospholipase D using diacylphosphatidylcholine as a raw material.
  • a crude reaction product can be obtained by mixing a chloroform solution in which diacylphosphatidylcholine is dissolved with water in which phospholipase D and ethanolamine are dissolved in an appropriate ratio.
  • the crude reaction product can be purified on a silica gel column using a chloroform / methanol / water solvent to obtain the desired diacylphosphatidylethanolamine.
  • a person skilled in the art can carry out by appropriately selecting column purification conditions such as a solvent composition ratio.
  • the terminally modified product examples include a diacylphosphatidylethanolamine terminally modified product in which one end of a divalent reactive compound is bonded to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine.
  • a divalent reactive compound a compound having at least one aldehyde group or succinimide group capable of reacting with the amino group of diacylphosphatidylethanolamine can be used.
  • the divalent reactive compound having an aldehyde group include glyoxal, glutaraldehyde, succindialdehyde, terephthalaldehyde and the like.
  • glutaraldehyde is used.
  • dithiobis succinimidyl propionate
  • ethylene glycol-bis succinimidyl succinate
  • disuccinimidyl succinate disuccinimidyl suberate
  • disuccinimidyl glutarate examples include disuccinimidyl glutarate.
  • N-succinimidyl 4- p-maleimidophenyl butyrate, sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) ) Butyrate, N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) acetate, N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) propionate, succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, sulfo Examples include succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide, N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide, and the
  • a diacylphosphatidylethanolamine terminal modified product having a maleimide group as a functional group can be obtained.
  • a functional group at one end of the divalent reactive compound as described above can be bonded to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine to obtain a diacylphosphatidylethanolamine terminal-modified product.
  • Examples of a method for binding a peptide to the surface of the liposome include a method of preparing a liposome containing the above-mentioned reactive phospholipid and then adding the peptide to bind the peptide to the reactive phospholipid of the liposome. it can. In addition, by previously binding the peptide to the reactive phospholipid, and then mixing the obtained reactive phospholipid bound to the peptide with a phospholipid other than the reactive phospholipid and a liposome stabilizer. In addition, it is possible to obtain a liposome having a peptide bound to its surface. Methods for conjugating peptides to reactive phospholipids are well known in the art.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention comprises an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. It contains at least one, for example two or more, preferably three or more phospholipids.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention includes diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, succinimidyl-diacylphosphatidylethanolamine, and maleimide-diacyl At least one selected from phosphatidylethanolamine, for example, 2 or more, preferably 3 or more, an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, or 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond A phospholipid having a hydrocarbon group.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention is An acidic phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; A neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; And at least one reactive phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond. preferable.
  • sterols and tocopherols can be used as the liposome stabilizer.
  • the sterols may be those generally known as sterols, and examples thereof include cholesterol, sitosterol, campesterol, stigmasterol, and brassicasterol, and particularly preferably from the viewpoint of availability, Cholesterol is used.
  • tocopherol what is generally known as tocopherol should just be mentioned, For example, commercially available alpha-tocopherol is mentioned preferably from points, such as availability.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention may contain a known component capable of constituting the liposome.
  • composition of the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention include the following: (A) a phospholipid having 1 to 99.8 mol% of an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (B) Liposome stabilizer 0.2-75 mol% The content of each component is expressed as mol% with respect to all components of the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome.
  • the content of the component (A) is preferably 10 to 90 mol%, more preferably 30 to 80 mol%, still more preferably 50 to 70 mol%, from the viewpoint of liposome stability.
  • the content of the component (B) is preferably 5 to 70 mol%, more preferably 10 to 60 mol%, still more preferably 20 to 50 mol%, from the viewpoint of liposome stability.
  • the content of the stabilizer exceeds 75 mol%, the stability of the liposome is impaired, which is not preferable.
  • the component (A) includes the following: (A) a phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, to which no peptide is bound, and (b) ) A phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond, to which a peptide is bound.
  • the content of the component (a) is usually 0.01 to 85 mol%, preferably 0.1 to 80 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, still more preferably 0.1 to 50 mol%.
  • the content of the component (b) is usually 0.2 to 80 mol%, preferably 0.3 to 60 mol%, more preferably 0.4 to 50 mol%, still more preferably 0.5 to 25 mol%.
  • the content is less than 0.2 mol%, the amount of the peptide of the present invention decreases, so it becomes difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level, and when it exceeds 80 mol%, Liposome stability is reduced.
  • the above component (a) phospholipid usually contains the above-mentioned acidic phospholipid and neutral phospholipid. Moreover, the above-mentioned reactive phospholipid is contained in the phospholipid of the said component (b).
  • the content of acidic phospholipid is usually 1 to 85 mol%, preferably 2 to 80 mol%, more preferably 4 to 60 mol%, and further preferably 5 to 40 mol%.
  • the content is less than 1 mol%, the zeta potential is reduced, the stability of the liposome is lowered, and it becomes difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level.
  • the content exceeds 85 mol%, as a result, the content of phospholipid bound to the peptide of the liposome decreases, and it is difficult to activate cytotoxic T lymphocytes to a practically sufficient level. Become.
  • the content of neutral phospholipid is usually 0.01 to 80 mol%, preferably 0.1 to 70 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, and still more preferably 0.1 to 50 mol%.
  • the content exceeds 80.0 mol% the content of acidic phospholipids, peptide-bound phospholipids and liposome stabilizers contained in liposomes decreases, and cytotoxic T lymphocytes are reduced to a practically sufficient level. It becomes difficult to activate.
  • the peptide-bound phospholipid is obtained by binding the peptide to the reactive phospholipid described above, and the ratio of the reactive phospholipid binding to the peptide is used for binding as long as the effect of the present invention is not hindered.
  • the type of functional group, coupling treatment conditions, and the like can be selected as appropriate.
  • a divalent reactive compound for example, when using a terminal modified form of diacylphosphatidylethanolamine obtained by binding one end of disuccinimidyl succinate, a divalent reactive compound, to the terminal amino group of diacylphosphatidylethanolamine as a reactive phospholipid, Depending on the choice of conditions for the binding process, 10-99% of the reactive phospholipid can be bound to the peptide. In this case, the reactive phospholipid not bound to the peptide becomes acidic phospholipid and is contained in the liposome.
  • Preferred embodiments of the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention can include the following compositions: (I) 1 to 85 mol% of acidic phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (II) 0.01 to 80 mol% of a neutral phospholipid having an acyl group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond; (III) 0.2 to 80 mol% of a phospholipid having a 14 to 24 carbon acyl group having one unsaturated bond or a 14 to 24 hydrocarbon group having one unsaturated bond to which a peptide is bound; (IV) Liposome stabilizer 0.2-75 mol%. (Total 100 mol%)
  • the following composition can be mentioned: Ingredient (I) 2-80 mol% Ingredient (II) 0.1-70 mol% Ingredient (III) 0.3-60 mol% Ingredient (IV) 10-70 mol% (Total 100 mol%)
  • the following composition can be mentioned: Ingredient (I) 4-60 mol% Ingredient (II) 0.1-60 mol% Ingredient (III) 0.4-50 mol% Ingredient (IV) 20-60 mol% (Total 100 mol%)
  • Particularly preferred embodiments of the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention can include the following compositions: Ingredient (I) 5-40 mol% Ingredient (II) 0.1-50 mol% Ingredient (III) 0.5-25 mol% Ingredient (IV) 25-55 mol% (Total 100 mol%)
  • the peptide-bonded liposome of the present invention is characterized in that the unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group contained in the phospholipid in the phospholipid membrane constituting the liposome part has 14 to 24 carbon atoms.
  • a phospholipid containing an unsaturated acyl group or unsaturated hydrocarbon group having less than 14 or more than 24 carbon atoms may be included as long as the effects of the invention are not hindered.
  • the carbon number is 14 to 24 with respect to the total number of all unsaturated acyl groups or unsaturated hydrocarbon groups contained in the phospholipid in the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention.
  • the ratio of the number of saturated acyl groups or unsaturated hydrocarbon groups is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 97% or more (for example, substantially 100%).
  • the phospholipid membrane constituting the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention is a non-phospholipid lipid having an acyl group or a hydrocarbon group having 14 to 24 carbon atoms as long as the effects of the present invention are not hindered. May be included.
  • the content of the lipid is usually 40 mol% or less, preferably 20 mol% or less, more preferably 10 mol% or less, still more preferably 5 mol% or less (for example, substantially 0 mol%).
  • the liposome portion of the peptide-bonded liposome of the present invention is appropriately formulated and processed using phospholipids, reactive phospholipids, liposome stabilizers, peptides, and the like, which are added to a suitable solvent, etc. It can be obtained by the method.
  • the form of the liposome is not particularly limited, and liposomes having various sizes and forms such as multilamellar liposomes, small unilamellar liposomes and large unilamellar liposomes are produced by appropriately selecting the above-described liposome production method. be able to.
  • the particle size of the liposome is not particularly limited, but from the viewpoint of storage stability, the particle size is 20 to 600 nm, preferably 30 to 500 nm, and then preferably 40 to 400 nm, and more preferably Is from 50 to 300 nm, most preferably from 70 to 230 nm.
  • a saccharide or a polyhydric alcohol is added to the inner aqueous phase and / or the outer aqueous phase of the liposome after the liposome preparation process or after the preparation. Also good.
  • a phospholipid composition freeze-dried product is prepared by adding or dissolving sugar or a polyhydric alcohol as a liposome protective agent and removing water by freeze-drying. It is preferable that
  • saccharide examples include monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose and xylose; disaccharides such as saccharose, lactose, cellobiose, trehalose and maltose; trisaccharides such as raffinose and melezitose; oligosaccharides such as cyclodextrin Sugar; polysaccharides such as dextrin; sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol and the like.
  • monosaccharides or disaccharides are preferable, and glucose or saccharose is more preferable in terms of availability.
  • polyhydric alcohols examples include glycerin-based compounds such as glycerin, diglycerin, triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, octaglycerin, nonaglycerin, decaglycerin, polyglycerin; sorbitol, mannitol Sugar alcohol compounds such as ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene glycol, pentaethylene glycol, hexaethylene glycol, heptaethylene glycol, octaethylene glycol, nonaethylene glycol and the like.
  • glycerin, diglycerin, triglycerin, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to 10,000 are preferable from the viewpoint of availability.
  • the concentration of saccharides or polyhydric alcohols contained in the inner aqueous phase and / or outer aqueous phase of the liposome is, for example, 1 to 20% by weight, preferably 2 to 10% by weight, based on the weight of the liposome liquid. Can be mentioned.
  • the peptide-bonded liposome of the present invention can be easily obtained by preparing a liposome before binding the peptide and then binding the peptide.
  • a suspension of liposomes containing phospholipids, liposome stabilizers, and reactive phospholipids for binding peptides to the membrane surface is prepared, and sucrose which is one of the above sugars in its outer aqueous phase Add about 2-10% by weight to dissolve.
  • sucrose which is one of the above sugars in its outer aqueous phase
  • This sugar-added preparation is transferred to a 10 ml glass vial, placed in a shelf-type freeze dryer, cooled to ⁇ 40 ° C. or the like to freeze the sample, and then a freeze-dried product is obtained by a conventional method.
  • the lyophilized product of the liposome obtained here can be stored for a long time since the water has been removed, and the final peptide of the present invention can be obtained by adding a specific peptide when necessary and carrying out the subsequent steps. Bound liposomes can be obtained simply and quickly. In the case where the interaction between the peptide and the liposome is strong and unstable, it is very convenient to store it at the lyophilized product of the liposome and bind the peptide when necessary.
  • the phospholipid membrane constituting the liposome part of the peptide-bonded liposome of the present invention can have a phospholipid to which a peptide is bound.
  • Examples of a method for obtaining liposomes containing phospholipids to which peptides are bound include the following methods (A) and (B).
  • a liposome containing a phospholipid, a reactive lipid, and a liposome stabilizer is prepared, a peptide and a divalent reactive compound are added thereto, and the functional group of the reactive phospholipid contained in the liposome , A method of linking the functional group of the peptide via a divalent reactive compound.
  • the divalent reactive compound that can be used here can be the same as that used in the preparation of the terminal modified form of the reactive phospholipid.
  • Specific examples of the divalent reactive compound having an aldehyde group include glyoxal, glutaraldehyde, succindialdehyde, and terephthalaldehyde.
  • glutaraldehyde is used.
  • N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate N-succinimidophenyl butyrate
  • sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimide) Phenyl) butyrate N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) acetate
  • N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) propionate succinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate
  • Use of sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidoethyl) -cyclohexane-1-carboxylate N- ( ⁇ -maleimidobutyryloxy) succinimide, N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide,
  • a terminal modified product of a reactive phospholipid having a maleimide group as a functional group for example, phosphatidylethanolamine
  • a functional group for example, phosphatidylethanolamine
  • a liposome containing a phospholipid, a reactive phospholipid, and a liposome stabilizer is prepared, a peptide is added thereto, and the functional group of the reactive phospholipid and the functional group of the peptide are contained in the liposome.
  • Examples of the type of bond in the above (A) and (B) include an ionic bond, a hydrophobic bond, and a covalent bond, and a covalent bond is preferable.
  • Specific examples of the covalent bond include a Schiff base bond, an amide bond, a thioether bond, and an ester bond.
  • the peptide can be bound to the reactive phospholipid contained in the phospholipid membrane constituting the liposome, and the phospholipid in which the peptide is bound to the liposome is formed.
  • a specific example of a method of binding a liposome as a raw material and a peptide via a divalent reactive compound is, for example, a method using a Schiff base bond.
  • a method of binding a liposome and a peptide via a Schiff base bond a liposome having an amino group on its surface is prepared, the peptide is added to the suspension of the liposome, and then a divalent reactive compound is formed as a divalent reactive compound.
  • An example is a method in which an aldehyde is added to bind the amino group on the liposome surface and the amino group in the peptide via a Schiff base.
  • a reactive phospholipid eg, phosphatidylethanolamine
  • a liposome raw material lipid phospholipid, liposome stabilizer, etc.
  • A-3 glutaraldehyde is added as a divalent reactive compound and allowed to react for a predetermined time to form a Schiff base bond between the liposome and the peptide.
  • A-4) Thereafter, in order to deactivate the reactivity of excess glutaraldehyde, glycine as an amino group-containing water-soluble compound is added to the liposome suspension and reacted.
  • A-5) Peptide of the present invention is obtained by removing unbound peptide, reaction product of glutaraldehyde and glycine, and excess glycine by a method such as gel filtration, dialysis, ultrafiltration, and centrifugation. A bound liposome suspension is obtained.
  • a reactive phospholipid having a functional group capable of forming an amide bond, a thioether bond, a Schiff base bond, an ester bond, etc. is applied to the phospholipid membrane constituting the liposome.
  • the method to introduce is mentioned.
  • Specific examples of such functional groups include succinimide group, maleimide group, amino group, imino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group and the like.
  • Examples of the reactive phospholipid introduced into the phospholipid membrane constituting the liposome include the above-mentioned 14 to 24 carbon acyl groups having one unsaturated bond or 14 to 24 carbon atoms having one unsaturated bond.
  • a terminal modified product of the amino group of a reactive phospholipid having a hydrocarbon group eg, phosphatidylethanolamine can be used.
  • (B-1) A diacylphosphatidylethanolamine having a C 14-24 acyl group having one unsaturated bond and disuccinimidyl succinate are reacted only at one end by a known method, and a succinimide group as a functional group To a disuccinimidyl succinate linked diacyl phosphatidylethanolamine.
  • B-2 The disuccinimidyl succinate-bound diacylphosphatidylethanolamine and other liposome constituents (phospholipid, liposome stabilizer, etc.) are mixed by a known method, and a succinimide group as a functional group on the surface To make liposomes.
  • B-3 A peptide is added to the liposome suspension, and an amino group in the peptide is reacted with a succinimide group on the surface of the liposome.
  • B-4) A suspension of liposomes containing the peptide-bound phospholipid of the present invention by removing unreacted peptides, reaction by-products and the like by a method such as gel filtration, dialysis, ultrafiltration, and centrifugation. Get.
  • a Schiff base bond can be formed by reacting with an succinimide group.
  • a thiol group is intended, a thioether bond can be formed by reacting with a maleimide group.
  • Peptide The present invention is also a peptide capable of inducing cytotoxic T lymphocytes, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and having a length of 9 to 11 amino acids (of the present invention) Peptide).
  • the peptide of the present invention is a peptide itself composed of an excellent epitope sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or is cleaved by the action of a proteasome or the like in a cell to produce the peptide. Therefore, the peptide of the present invention has excellent characteristics substantially the same as the peptide consisting of the epitope sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. That is, the peptide of the present invention can induce cytotoxic T lymphocytes.
  • the peptide of the present invention when used for the production of the cytotoxic T lymphocyte activator and hepatitis C virus vaccine of the present invention as described below, killing of cells infected with hepatitis C virus or hepatitis C Demonstrates excellent effects on virus protection.
  • the length of the peptide of the present invention is not particularly limited, but is usually 9 to 11 amino acids, preferably 9 to 10 amino acids, more preferably 9 amino acids.
  • the peptide of the present invention has an additional sequence on the N-terminal side and / or C-terminal side of the epitope sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the length of the additional sequence and the amino acid sequence are not particularly limited as long as the above properties of the peptide of the present invention are not impaired.
  • the additional sequence may be an amino acid sequence actually present adjacent to the partial sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 or 2 in the amino acid sequence of the NS3 protein of hepatitis C virus.
  • the peptide is a residue that can overcome the selection of the presented antigen due to individual differences (polymorphism) of MHC when forming a major histocompatibility complex (MHC) in a cell.
  • the peptide of the present invention can be prepared by the same method as the peptide contained in the peptide-bound liposome of the present invention.
  • the cytotoxic T lymphocyte (CTL) specifically recognizing the peptide of the present invention or the epitope peptide of the present invention is strongly potent. It is possible to guide. Cytotoxic T lymphocytes induced by the peptides of the present invention and peptide-bound liposomes, as a result of infection with hepatitis C virus, kill the cells presenting the peptides of the present invention or the epitope peptides of the present invention on HLA, Remove these cells. Therefore, the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are useful for the treatment and prevention of hepatitis C as cytotoxic T lymphocyte activators and hepatitis C virus vaccines.
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • the peptide of the present invention or peptide-bound liposome When used as a cytotoxic T lymphocyte activator or hepatitis C virus vaccine, it can be formulated according to conventional means.
  • the peptides and peptide-bonded liposomes of the present invention have low toxicity and can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form as a human or non-human mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.), birds (chicken, geese, ducks, ostriches, quail, etc.) and the like can be administered orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.).
  • a human or non-human mammal eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.
  • birds chicken, geese, ducks, ostriches, quail, etc.
  • parenterally
  • the animals to which the peptides of the present invention and peptide-bonded liposomes are administered are usually mammals (eg, humans) and birds that can be infected with the target hepatitis C virus.
  • the peptides and peptide-bound liposomes of the present invention are usually administered parenterally.
  • the cytotoxic T lymphocyte activator and hepatitis C virus vaccine of the present invention may be administered as an active ingredient peptide or peptide-bound liposome itself, or may be administered as an appropriate pharmaceutical composition. good.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the peptide or peptide-bound liposome and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving or suspending the peptide or peptide-bound liposome in a sterile aqueous solvent usually used for injection.
  • the aqueous solvent for injection include distilled water; physiological saline; phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, acetate buffer, and other buffer solutions.
  • the pH of such an aqueous solvent is 5 to 10, preferably 6 to 8.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • the peptide preparation of the present invention or the powder preparation of the peptide-binding liposome of the present invention can be obtained by subjecting the solution of the peptide of the present invention or the suspension of the peptide-binding liposome of the present invention to a treatment such as vacuum drying or freeze drying. It can also be prepared.
  • the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention is stored in a powder state, and can be used by dispersing the powder with an aqueous solvent for injection at the time of use.
  • the cytotoxic T lymphocyte activator and hepatitis C virus vaccine of the present invention may further contain an adjuvant in order to enhance the effect.
  • the adjuvant include aluminum hydroxide gel, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, Bordetella pertussis adjuvant, poly (I, C), CpG-DNA and the like, and CpG-DNA is particularly preferable.
  • CpG-DNA is a DNA containing a bacterial unmethylated CpG motif and is known to act as a ligand for a specific receptor (Toll-like receptor 9) (for details, see Biochim. Biophys. Acta 1489, 107- 116 (1999) and Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)).
  • CpG-DNA can enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes by the peptides or peptide-bound liposomes of the present invention by activating dendritic cells (DC).
  • DC dendritic cells
  • the content of the active ingredient (the peptide of the present invention or peptide-bound liposome) in the pharmaceutical composition is usually about 0.1 to 100% by weight, preferably about 1 to 99% by weight, more preferably about 10% by weight of the whole pharmaceutical composition. About 90% by weight.
  • the content of the adjuvant is within a range that can enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes. In general, it is about 0.01 to 10% by weight, preferably about 0.1 to 5% by weight of the whole pharmaceutical composition.
  • the dose of the peptide of the present invention or the peptide-bonded liposome of the present invention varies depending on the subject to be administered, the administration method, the dosage form, etc., and for example, activates cytotoxic T lymphocytes in vivo by subcutaneous administration or nasal administration.
  • cytotoxic T lymphocytes in vivo by subcutaneous administration or nasal administration.
  • the peptide of the present invention is in the range of 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably in the range of 20 ⁇ g to 100 ⁇ g, usually for 4 weeks to 18 months. Administer 2 to 3 times. Furthermore, when hepatitis C is treated by subcutaneous administration, the peptide of the present invention is in the range of 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably in the range of 20 ⁇ g to 100 ⁇ g, usually twice for 4 weeks to 18 months. 3 times.
  • the mouse is an HHD mouse in which H-2D and H-2K, which are mouse specific MHC class I genes, and ⁇ 2-microglobulin gene are knocked out and human HLA-A * 0201 and ⁇ 2-microglobulin genes are introduced and expressed (Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185 (12): 2043-2051) was used.
  • offspring (F1) born by crossing HHD (male) and C57BL / 6 mice (female, purchased from Tokyo Laboratory Animal Co., Ltd.) were used.
  • the immunity of peptide-bound liposomes is 100 ⁇ l / mouse for liposomes bound to six peptide pools, and 20 ⁇ l / mouse for single peptide-bound liposomes, each of which is consigned to CpG5002 (Hokkaido System Science Co., Ltd.). ) (5 ⁇ g / animal) and 7 days later (1) infection experiment with recombinant vaccinia virus expressing NS3 (VV-NS3), (2) 51 Cr release test, or (3) ELISPOT (IFN- ⁇ ).
  • VV-NS3 recombinant vaccinia virus expressing NS3
  • ELISPOT IFN- ⁇
  • recombinant adenovirus Adex1CA3269 recombinant adenovirus Adex1CA3269 (Makimura M, Miyake S, Akino N et al.
  • VV-NS3 Recombinant vaccinia virus expressing HCV-NS3 gene (VV-NS3) is a method already reported (Ohnishi Y, Shioda T, Nakayama K et al. The Journal of Virology 1994; 68 (6): 4075-4079) Similarly, it was created as follows.
  • Sense primer 5'-GCCGGATCCATGGTCTCCAAGGGGTGGAG-3 'using HCV cDNA clone pBRTM / HCV1-3011con Karlinsky AA, Agapov EV, Blight KJ, Mihalik K, Feinstone SM, Rice CM.
  • HCV-NS3 gene was amplified using (SEQ ID NO: 29) and the antisense primer 5′-TCACGTGACGACCTCCAGGTCGGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 30) and incorporated into the transfer vector pNZ68K2.
  • Vaccinia virus (VV-NS3) incorporating HCV-NS3 gene was prepared by homologous recombination between this transfer vector and wild-type vaccinia virus A (VV-wt) (WR strain), and 5-bromo-2-deoxyuridine C143 cells were infected in the presence and plaque purification was repeated three times, and then amplified in CV-1 cells.
  • VV-NS3 recombinant vaccinia virus
  • VV-NS3 recombinant vaccinia virus
  • PFU plaque forming unit
  • a mouse lymphoma-derived cell line in which human HLA-A * 0201 and ⁇ 2-microglobulin genes are introduced and expressed as in HHD mice, RMA-HHD (H-2b) (Pascolo S, Bervas N Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185 (12): 2043-2051) (RPMI1640, 10% FCS, G418 cultured at 500 ⁇ g / ml).
  • % specific lysis [(cpm sample -cpm spontaneous ) / (cpm maximum -cpm spontaneous )] X 100 cpm is the count per minute, spontaneous release is the count in the absence of effector cells, and maximum release is the count when the target cells are completely lysed by adding 2% Nonidet P-40.
  • ELISPOT IFN- ⁇ T cells that produce interferon gamma (IFN- ⁇ ) specifically in the spleen of immunized mice were measured using an ELISPOT kit (BD Bioscience). Place 0.5 ⁇ g of anti-IFN- ⁇ antibody (clone R4-6A2) in a 96-well plate, leave it overnight at 4 ° C., wash, add RPMI 1640 medium containing 10% FCS, and block at room temperature for 2 hours. went. Add 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 6 spleen cells of immunized mice to each well, and spleen cells of normal HHD mice pulsed with X-irradiation (40 Gy), 1/10 of the amount, and add 37 ° C. For 2 days.
  • the cells in each well were washed away, reacted with biotin-labeled anti-mouse IFN- ⁇ antibody for 2 hours at room temperature, then reacted with streptavidin-horseradish peroxidase for 1 hour at room temperature, and finally containing 3-amino-9-ethylcarbazole. Substrate solution was added to develop the spots. After drying, the number of spots in each well was counted by observing with a stereomicroscope.
  • the particle size of the liposome was adjusted using an extruder.
  • an 8 ⁇ m polycarbonate filter was passed, followed by a filter in the order of 5 ⁇ m, 3 ⁇ m, 1 ⁇ m, 0.65 ⁇ m, 0.4 ⁇ m and 0.2 ⁇ m.
  • An average particle size of 206 nm (measured by a dynamic light scattering method) of the liposome particles was obtained.
  • Example 1 Search for CTL epitopes From the amino acid sequence of NS3 region of hepatitis C virus HCV-1a strain polyprotein (GenBank accession #: AAB66324), 25 types of epitopes including 6 types reported as CTL epitopes were selected. For these epitopes, the predicted antigenicity score for cytotoxic T cells (CTL) was calculated using prediction programs (BIMAS and SYFPEITHI) available on the Internet (Table 1).
  • CTL cytotoxic T cells
  • Example 2 Screening of peptides having vaccine effect 1) Preparation of liposome preparation from peptide pool Of the 25 candidate peptides of Example 1, 24 peptides except for # 22, which was extremely poorly soluble, were divided into 4 groups (NS3- Pooled from I to IV). NS3-I was pooled with six known CTL epitope peptides. Using each pool, peptide-bound liposomes were prepared by the following method. 1.5 ml of the liposome of Reference Example 1 (preparation of liposome) was collected in a test tube, 3 ml of each peptide pool solution prepared separately was added, and the mixture was gently stirred at 5 ° C. for 48 hours for reaction.
  • This reaction solution was subjected to gel filtration according to a conventional method using Sepharose CL-4B equilibrated with a buffer solution. Since the liposome fraction is cloudy, the target fraction can be easily confirmed, but it may be confirmed with a UV detector or the like. Phosphorus concentration in the obtained liposome suspension was measured (Phospholipid Test Wako), and the concentration was diluted with a buffer so that the phospholipid-derived phosphorus concentration was 2 mM. Got. 2) Measurement of vaccine effect About the peptide bond liposome prepared in 1), the vaccine effect with respect to the recombinant vaccinia virus incorporating NS3 of HCV was measured (FIG. 1).
  • peptide-bound liposomes from each peptide was prepared by the following method. Collect 1.5 ml of the liposome of Reference Example 1 (Liposome preparation) in a test tube, add 3 ml of each peptide solution (1.25 mM, buffer solution) separately prepared, and then gently agitate at 5 ° C. for 48 hours. And reacted. This reaction solution was subjected to gel filtration according to a conventional method using Sepharose CL-4B equilibrated with a buffer solution.
  • Phosphorus concentration in the obtained liposome suspension was measured (Phospholipid Test Wako), and the concentration was diluted with a buffer so that the phospholipid-derived phosphorus concentration was 2 mM. Got. 4) Measurement of vaccine effect of peptide-bound liposomes
  • the immunogenicity of the peptide-bound liposomes prepared in 3) was examined (FIG. 3). As a result, IFN- ⁇ production was observed when any of the peptide-bonded liposomes was used, and particularly when peptide # 3 was used.
  • induction of cytotoxic T cells was also confirmed for peptides # 3, # 13, # 17 and # 23. The effect of using peptide # 3 was also remarkable for the induction of cytotoxic T cells.
  • Peptide # 3 is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (YMNTPGLPV)
  • Peptide # 13 is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (GMFDSSVLC)
  • peptide # 19 is a peptide consisting of the amino acid sequence (IMTCMSADL) represented by SEQ ID NO: 3.
  • CTL cytotoxic T cells
  • liposomes conjugated with epitope peptide 1630-1637 of mouse H-2b showed high immunogenicity, while those conjugated with epitope 1073-11081 or 1585-1593 of human HLA-A * 0201 were immune.
  • the originality was low.
  • Epitope 1073-1081 and epitope 1585-1593 are peptides that are known as excellent epitope peptides of hepatitis C virus, but the fact that they did not show significant immunogenicity is due to the use of excellent epitope peptides. Even if it does, the peptide bond liposome which has the outstanding immunogenicity has not necessarily been obtained.
  • peptide # 3 showed high immunogenicity comparable to that of mouse epitope 1630-1637 due to liposome binding. Furthermore, immunization experiments with Adex13269 and VV-NS3 revealed that peptide # 3 had low immunogenicity (FIG. 6). Note that 1031-1039 is an HLA-A24 (A * 2402) epitope of HCV NS3, and was used as a negative control here. These results indicate that peptide # 3 does not have immunogenicity when immunized with NS3 as a whole, but expresses excellent immunogenicity by liposome binding. That is, peptide # 3 is particularly suitable for use as a cytotoxic T lymphocyte activator or hepatitis C virus vaccine by binding to liposomes.
  • Boost effect of Lip- # 3 The boost effect of Lip- # 3 was confirmed by ELISPOT (FIG. 7). When the HHD mice were inoculated twice with Lip- # 3 according to the time schedule shown in the lower panel of FIG. 7, a marked increase in IFN- ⁇ production was observed. This indicates that Lip- # 3 can be used as a vaccine for the treatment of hepatitis C.
  • Example 5 Dip Dependence of Lip- # 3 Immunogenicity To examine the immunogenicity of Lip- # 3 in more detail, IFN- ⁇ production was measured by ELISPOT using serially diluted Lip- # 3 (FIG. 8). As a result, it was shown that IFN- ⁇ production can be caused by a dose of only 0.28 ⁇ g, and Lip- # 3 has excellent immunogenicity even at a very low dose.
  • Lip- # 3 cross-reactivity Peptide # 3 is a peptide derived from the HCV-1a strain. It was examined by a 51 Cr release test whether CTL induced by immunization with Lip- # 3 showed reactivity with peptides derived from other HCV strains (FIG. 9). As a result, immunization with Lip- # 3 resulted in a strong CTL response to # 3-2L (SEQ ID NO: 4) derived from HCV-1b strain, similar to the response to peptide # 3 derived from HCV-1a strain. I found it to happen. That is, it was shown that the vaccine effect against both HCV-1a strain and HCV-1b strain can be expected only by immunization with Lip- # 3.
  • the present invention it is possible to provide a highly effective vaccine against hepatitis C virus, which is originally low in immunogenicity. In addition, it is possible to provide an effective treatment even for patients whose effects are limited by conventional treatment methods.

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Abstract

　本発明は、ペプチドが結合したリポソームであって、該ペプチドが、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中の９アミノ酸以上の長さの部分アミノ酸配列を含み、９～１１アミノ酸の長さを有し、且つ細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり；該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、ペプチド結合リポソーム、該ペプチド結合リポソームを含む細胞傷害性Tリンパ球活性化剤、及びＣ型肝炎ウイルスワクチンを提供する。

Description

Ｃ型肝炎ウイルスリポソームワクチン
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスワクチンとして有用なペプチド結合リポソーム、ペプチド、及びそれらの用途に関する。
　Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染することで発症するウイルス性肝炎である。Ｃ型肝炎ウイルスに感染したのち、自然に治癒する場合もあるが、多くの場合放置すると慢性肝炎に移行する。慢性肝炎の状態が持続すると肝硬変に移行し、さらには肝癌を発症するリスクが高まる。肝癌の原因の約８割はＣ型肝炎であるとの報告もある。
　Ｃ型肝炎の治療においては、インターフェロン療法が一定の治療成績を挙げている。しかしながら、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型によっては、インターフェロン療法の効きにくい場合（例えば１ｂ型高ウイルス量症例）もあるため、更に広範な患者に有効な治療法の開発が求められている。
　ウイルスが感染した細胞はウイルス内部タンパク質の部分ペプチドを提示した主要組織適合抗原複合体（MHC）を細胞表面に露出する。このような特徴を示すウイルス感染細胞を特異的に殺傷できる細胞傷害性Tリンパ球（CD8+T細胞、サイトトキシックリンホサイト：CTL）を誘導できれば、ウイルスの複製、ひいては増殖及び拡散を効果的に防ぐことができる。
　Ｃ型肝炎ウイルスは、他のウイルスと比較して免疫原性が低いことが知られている。そこでＣ型肝炎ウイルス抗原の中に存在する比較的免疫原性の高いエピトープを利用して、ＣＴＬを誘導する方法が検討されている。
　特許文献１には、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質から誘導されるペプチドであって、免疫された宿主においてＨＬＡ拘束性ＣＴＬ応答を誘発するペプチドが開示されている。また特許文献２には、HLA A2.1に結合し得るＣ型肝炎ウイルスの免疫原性ペプチド、及び該ペプチドを含む組成物による細胞傷害性Tリンパ球の誘導方法が開示されている。しかしながら、これらのペプチドが実際のＣ型肝炎の治療又は予防において有効であるか否かは不明である。
　一方、生体の免疫応答を増強するための方法として、リポソーム製剤を用いる方法が知られている。
　特許文献３には、抗原が結合したリポソームを用いた、病原体感染細胞又は癌細胞を殺傷するためのＣＴＬを効率よく特異的に増強することができ、感染症や癌の予防・治療に有用なT細胞活性化剤の調製法が開示されている。
　また特許文献４には、鳥インフルエンザウイルスの、保存性の高い内部タンパク質配列中から、細胞傷害性Tリンパ球の調製に特に有効な抗原エピトープを見出したこと、該エピトープを含むペプチドを表面に結合したリポソームが、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得ることが記載されている。
国際公開第2005/118626号 米国特許出願公開第2009/0012004号明細書 特開2008-37831号公報 国際公開第2010/061924号
　本発明が解決しようとする課題は、細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、Ｃ型肝炎の治療効果又は予防効果を有するワクチンを提供することである。
　本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、リポソームに結合しない状態で抗原ペプチドが細胞傷害性Tリンパ球を誘導する強度と、リポソームに結合した状態で抗原ペプチドが細胞傷害性Tリンパ球を誘導する強度とは、パラレルの関係にはなく、リポソームに結合しない状態では細胞傷害性Tリンパ球を誘導する活性が弱くても、リポソームに結合した場合には極めて強力に細胞傷害性Tリンパ球を誘導できる場合があることを見出した。そこで、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質配列中に、リポソームを用いた細胞傷害性Tリンパ球の誘導に特に有効な抗原エピトープを探索した結果、幾つかの優れた抗原エピトープを見出した。更に、このエピトープを含むペプチドが結合したリポソームによりワクチン接種を行うと、極めて強力に抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球を誘導し、Ｃ型肝炎を治療又は予防し得ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］ペプチドが結合したリポソームであって、
該ペプチドが、
Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中の９アミノ酸以上の長さの部分アミノ酸配列を含み、
９～１１アミノ酸の長さを有し、且つ
細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり；
該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソーム。
［２］リン脂質が、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質である、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［３］アシル基がオレオイル基である、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［４］リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［５］リポソームの安定化剤がコレステロールである、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［６］ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［７］リポソームが以下の組成を有する、［１］記載のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　1～99.8モル%；
（Ｂ）リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
［８］リポソームが以下の組成を有する、［１］記載のペプチド結合リポソーム：
(I)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質　　1～85モル%；
(II)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質　　0.01～80モル%；
(III)ペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　0.2～80モル%；
(IV)リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
［９］部分アミノ酸配列が、配列番号１～３、５及び６のいずれかで表されるアミノ酸配列である、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［１０］［１］記載のペプチド結合リポソームを含む、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
［１１］更にＣｐＧ－ＤＮＡを含有することを特徴とする、［１０］記載の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
［１２］［１］記載のペプチド結合リポソームを含む、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
［１３］更にＣｐＧ－ＤＮＡを含有することを特徴とする、［１２］記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。
［１４］Ｃ型肝炎の治療用である、［１２］記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。
［１５］Ｃ型肝炎の予防用である、［１２］記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。
［１６］細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るペプチドであって、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含み、且つ9～11アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
［１７］Ｃ型肝炎の予防又は治療において使用するための、［１］記載のペプチド結合リポソーム。
［１８］哺乳動物に［１］記載のペプチド結合リポソームの予防的又は治療的有効量を投与することを含む、該哺乳動物におけるＣ型肝炎の予防又は治療方法。
［１９］Ｃ型肝炎ウイルスワクチンを製造するための、［１］記載のペプチド結合リポソームの使用。
　本発明のペプチド結合リポソーム又はペプチドを用いれば、細胞傷害性Ｔリンパ球を効率よく誘導することができ、Ｃ型肝炎の治療又は予防に有用である。また本発明のペプチド結合リポソーム又はペプチドを用いれば、１ａ型、１ｂ型のいずれの遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスに対しても有効な、汎用性の高いＣ型肝炎ウイルスワクチンを提供できる。
図１は、ペプチド結合リポソームのワクチン効果を示す。各グラフは卵巣に含まれるウイルスの力価を示す。２５の候補ペプチドのうち、水難溶性であった１つを除いた２４のペプチドを４つのプールに分け（ＮＳ３－ＩからＩＶ）、各プールを用いてペプチド結合リポソームを調製し、ワクチン効果を測定した。Adex1CA3269を用いた結果を陽性対照として、免疫しない場合の結果（Ｎａｉｖｅ）を陰性対照として示す。破線は検出下限を示す。 図２は、図１における各プール中の各ペプチドの免疫原性を調べた結果を示す。ＥＬＩＳＰＯＴ法により各ペプチドの刺激によるＩＦＮ－γ産生細胞数を測定し、５１Ｃｒ放出法により各ペプチドを抗原提示する標的細胞に対する細胞傷害性Tリンパ球の細胞傷害性を測定した。 図３は、各ペプチドから調製したペプチド結合リポソームを用いて、各ペプチドの免疫原性を調べた結果である。ＥＬＩＳＰＯＴ法により各ペプチド結合リポソームの刺激によるＩＦＮ－γ産生細胞数を定量し、５１Ｃｒ放出法により細胞傷害性Tリンパ球の細胞傷害性を測定した。 図４は、各ペプチドから調製したペプチド結合リポソームのワクチン効果を示す。各グラフは卵巣に含まれるウイルスの力価を示す。上パネル：棒グラフ；下パネル：個別データのプロット。破線は検出下限を示す。 図５は、リポソームに結合させたペプチド＃３の免疫原性をELISPOTで検討した結果を示す。マウスH-2bのエピトープペプチド１６３０－１６３７を結合したリポソームは高い免疫原性を示したのに対し、ヒトHLA-A*0201のエピトープ１０７３－１０８１又は１５８５－１５９３を結合したものは免疫原性が低かった。これに対してペプチド＃３はリポソーム結合により、マウスのエピトープ１６３０－１６３７と同程度の高い免疫原性を示した。 図６は、ペプチド＃３の免疫原性が２種の組換えウイルスAdex1CA3269とVV-NS3による免疫実験では低いことを示す。即ち、ペプチド＃３は、ＮＳ３全体で免疫した場合には免疫原性を有さないが、リポソーム結合によって優れた免疫原性を示す。 図７は、ペプチド＃３から調製したペプチド結合リポソーム（Ｌｉｐ－＃３）によるブースト効果を示す。図６の結果と同様に、組換えウイルスVV-NS3による免疫では、ペプチド＃３の免疫原性が発揮されず、ブースト効果も見られないことを示す。 図８は、Ｌｉｐ－＃３の免疫原性の用量依存性を示す。 図９は、Ｌｉｐ－＃３の交差反応性を示す。 図１０は、Ｌｉｐ－＃１３及びＬｉｐ－＃１３－１Ａの交差反応性を示す。 図１１は、Ｌｉｐ－＃１９及びＬｉｐ－＃１９－３Ａの交差反応性を示す。
１．ペプチド結合リポソーム
　本発明は、ペプチドが結合したリポソームであって、
該ペプチドが、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中の９アミノ酸以上の長さの部分アミノ酸配列（好ましくは配列番号１～３、５及び６のいずれかで表されるアミノ酸配列）を含み、９～１１アミノ酸の長さを有し、且つ細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり；
該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
ペプチド結合リポソームを提供する。
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス抗原中に、下記に詳述するリポソームの表面に結合させた場合に、細胞傷害性Ｔ細胞を強力に誘導する活性を有するエピトープとして、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中の９アミノ酸以上の長さのエピトープ配列（本発明のエピトープ配列）を見出したことに基づき完成されたものである。本発明のエピトープ配列は、リポソームに結合させた場合のワクチンとしての有効性の観点から、好ましくは配列番号１～３、５及び６のいずれかで表されるエピトープ配列である。
　配列番号１～６で表されるアミノ酸配列は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中に存在する部分配列に相当する。
　該アミノ酸配列からなるペプチドには、例えば以下のような、異なるウイルス株の同一抗原における対応するエピトープ配列からなるペプチドが含まれている。
ＹＭＮＴＰＧＬＰＶ（配列番号１）（１ａ株）
→ＹＬＮＴＰＧＬＰＶ（配列番号４）（１ｂ株）
ＡＭＦＤＳＳＶＬＣ（配列番号２）（Ｊ１株）
→ＧＭＦＤＳＳＶＬＣ（配列番号５）（１ａ株）
ＩＭＴＣＭＳＡＤＬ（配列番号３）（１ａ株）
→ＩＭＡＣＭＳＡＤＬ（配列番号６）（Ｊ１株）
　本発明のエピトープ配列を含むペプチド（本発明のエピトープペプチド）は、細胞傷害性Tリンパ球を誘導することができる。「細胞傷害性Tリンパ球を誘導する」とは、哺乳動物（例えばヒト、トランスジェニックマウス等）を抗原で免疫した場合に、該哺乳動物の生体内において、当該抗原を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球の数及び／又は活性（例えば細胞傷害活性）が上昇することを意味する。
　本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドの長さは、特に限定されないが通常9～11アミノ酸、好ましくは9～10アミノ酸、より好ましくは9アミノ酸である。該ペプチドの長さが10アミノ酸以上である場合には、該ペプチドは、本発明のエピトープ配列のN末端側及び／又はC末端側に付加配列を有する。付加配列の長さやアミノ酸配列は、該ペプチドの上記特性を損なわない限り特に限定されない。例えば、該付加配列は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中で、配列番号１～６のいずれかに相当する部分配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。また上記ペプチドが、細胞内で主要組織適合抗原複合体（MHC）を形成する際に、MHCの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基であればとりわけ好ましい。
　本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドは、例えば、液相合成又は固相ペプチド合成等の公知のペプチド合成技術によって調製できる。或いは、該ペプチドを発現し得る発現ベクターを導入した形質変換体（大腸菌等）を培養し、その培養物からアフィニティカラム等の周知の精製技術により該ペプチドを単離することにより、該ペプチドを製造することができる。該ペプチドを発現し得る発現ベクターは、周知の遺伝子工学的技術を用いて、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより構築することができる。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。ここで、リポソームとは閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことを指す。
　本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドは、それが有する官能基を介してリポソームの表面に結合することができる。リポソーム表面への結合に用いられる該ペプチド中の官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基又はメチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等が挙げられる。これらの内、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基及びジスルフィド基は共有結合により、アミノ基及びカルボキシル基はイオン結合により、疎水基は疎水基同士で疎水結合により、該ペプチドをリポソームの表面に結合することができる。該ペプチドは、好ましくはアミノ基、カルボキシル基又はチオール基を介してリポソームの表面に結合する。
　本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドが有する官能基を介して、該ペプチドが安定にリポソームに結合するため、リポソームを構成するリン脂質膜は、アミノ基、サクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基、メチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基等の官能基を有することが望ましい。リポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基は、好ましくは、アミノ基、サクシンイミド基又はマレイミド基である。該ペプチドのリポソームへの結合に関与する、該ペプチドの有する官能基とリポソームを構成するリン脂質膜が有する官能基の組み合わせは、本発明の効果に影響しない範囲において自由に選択することができるが、好ましい組み合わせとしては、それぞれ、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とアミノ基、アミノ基とサクシンイミド基、チオール基とマレイミド基等が挙げられる。イオン結合及び疎水結合は、リポソームへのペプチドの結合手順が簡便であり、ペプチド結合リポソームの調製容易性の点から好ましく、また、共有結合は、リポソーム表面のペプチドの結合安定性の点又はペプチド結合リポソームを実用する際の保存安定性の点から好ましい。本発明のペプチド結合リポソームは、その構成成分であるリポソームの表面に優れた細胞傷害性Tリンパ球活性化効果を有するペプチドが結合していることを1つの特徴としている。従って、実用段階で、例えば注射行為によって生体内に投与された後にも、該ペプチドがリポソームの表面に安定に結合していることが、本発明の効果をより高める点で好ましい。このような観点から、該ペプチドとリポソームとの結合としては、共有結合が好ましい。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有してなる。
　不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質における、該アシル基の炭素数は、好ましくは16～22であり、更に好ましくは18～22であり、最も好ましくは18である。該アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基等が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。
　不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質における、該炭化水素基の炭素数は、好ましくは16～22であリ、更に好ましくは18～22であり、最も好ましくは18である。該炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、C20モノエン基、C22モノエン基、C24モノエン基等が挙げられる。
　リン脂質が有するグリセリン残基の1-位、及び2-位に結合する不飽和のアシル基又は不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、1-位及び2-位の基が同一であることが好ましい。
　リン脂質としては、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質が好ましく用いられる。
　本発明の課題の一つは、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を殺傷するための細胞傷害性Tリンパ細胞（CD8+T細胞、CTL）を効率よく特異的に増強することである。実用上十分なレベルにCTL活性を増強させる点から、リン脂質は不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有することが好ましい。アシル基の炭素数が13未満であると、リポソームの安定性が悪くなったり、またCTL活性増強効果が不十分になる場合がある。また、アシル基の炭素数が24を超えると、リポソームの安定性が悪くなる場合がある。
　不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、ペプチドを結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質等の種類が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択することができる。
　酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を用いることができる。CTL活性を実用上十分なレベルに増強する点、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、及びジアシルホスファチジルイノシトールが好ましく用いられる。酸性リン脂質は、リポソームの表面にアニオン性電離基を与えるので、リポソーム表面にマイナスのゼータ電位を付与する。このためリポソームは、電荷的な反発力を得、水性溶媒中で安定な製剤として存在できる。このように、酸性リン脂質は、本発明のペプチド結合リポソームが水性溶媒中にある際のリポソームの安定性を確保する点で重要である。
　中性リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等を用いることができる。本発明で用いることができる中性リン脂質は、本発明が課題として取り組むCTL活性増強を達成する範囲において、その種類・量を適宜選択して用いることができる。中性リン脂質は、酸性リン脂質及び本発明のペプチドを結合したリン脂質に比べ、リポソームを安定化する機能が高く、膜の安定性を向上させ得る。かかる観点から、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、中性リン脂質を含有することが好ましい。CTL活性増強効果を達成するために用いる酸性リン脂質、ペプチド結合のための反応性リン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量を確保した上で、中性リン脂質の使用量を決定できる。
　本発明のペプチド結合リポソームにおいては、本発明のペプチドがリポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質に結合することにより、リポソームの表面に結合する。
　このペプチド結合のためのリン脂質として、本発明のペプチドが結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質が用いられる。不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質は、種々の要求に応じて、その種類、割合が適宜選択される。前記リン脂質と同様に、反応性リン脂質においても、リン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が24を超えるか、14未満である場合は好ましくない。
　反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いることができる。工業的な入手性、本発明のペプチドとの結合工程の簡便性、収率等の点から、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が好ましく用いられる。ホスファチジルエタノールアミンはその末端に本発明のペプチドを結合することのできるアミノ基を有する。更に、CTL活性を実用上十分なレベルに増強する点、リポソームでの安定性、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が最も好ましく用いられる。
　ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ジアシルホスファチジルコリンを原料に、ホスホリパーゼDを用いてコリンとエタノールアミンを塩基交換反応させることで得ることができる。具体的には、ジアシルホスファチジルコリンを溶解したクロロホルム溶液と、ホスホリパーゼD及びエタノールアミンを溶解した水を適宜比率において混合し粗反応物を得ることができる。粗反応物を、クロロホルム/メタノール/水系溶媒を用いてシリカゲルカラムで精製し目的のジアシルホスファチジルエタノールアミンを得ることができる。当業者であれば、溶媒組成比等のカラム精製条件を適宜選択して実施することが可能である。
　末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に2価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。2価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応することができるアルデヒド基又はコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する2価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する2価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール－ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。
　また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する2価反応性化合物として、N-サクシンイミジル4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）アセテート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホサクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-（γ-マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等が挙げられる。このような2価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。以上のような2価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得ることができる。
　リポソームの表面にペプチドを結合する方法としては、例えば、上記の反応性リン脂質を含有するリポソームを調製し、次にペプチドを加えてリポソームの反応性リン脂質にペプチドを結合する方法を挙げることができる。また、予めペプチドを反応性リン脂質に結合しておき、次に、得られたペプチドが結合した反応性リン脂質を、反応性リン脂質以外のリン脂質及びリポソームの安定化剤と混合することによっても、ペプチドを表面に結合したリポソームを得ることができる。反応性リン脂質へのペプチドの結合方法は、当該技術分野において周知である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質を少なくとも1種、例えば2種以上、好ましくは3種以上含有する。
　例えば、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも1種、例えば2種以上、好ましくは3種以上の、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質を含有する。
　また、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、
不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質、
不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質、
及び不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質
を、それぞれ、少なくとも1種含有することが好ましい。
　本発明において、リポソームの安定化剤としては、ステロール類やトコフェロール類を用いることができる。前記のステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、例えば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール等が挙げられ、入手性等の点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。前記のトコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、例えば、入手性等の点から、市販のα-トコフェロールが好ましく挙げられる。
　さらに、本発明の効果を損なわない限り、本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、リポソームを構成することのできる、公知の構成成分を含んでいてもよい。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の組成としては、例えば以下を挙げることができる：
（Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　1～99.8モル%；
（Ｂ）リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%
　尚、各成分の含有量は、ペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の全構成成分に対するモル%として表示する。
　上記成分（Ａ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは10～90モル%、より好ましくは30～80モル%、更に好ましくは50～70モル%である。
　上記成分（Ｂ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは5～70モル%、より好ましくは10～60モル%、更に好ましくは20～50モル%である。安定化剤の含有量が75モル%を超えるとリポソームの安定性が損なわれ好ましくない。
　上記成分（Ａ）には、以下が含まれる：
（ａ）ペプチドが結合していない、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及び
（ｂ）ペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質。
　上記成分（ａ）の含有量は、通常0.01～85モル%、好ましくは0.1～80モル%、より好ましくは0.1～60モル%、更に好ましくは0.1～50モル%である。
　上記成分（ｂ）の含有量は、通常0.2～80モル%、好ましくは0.3～60モル%、より好ましくは0.4～50モル%、更に好ましくは0.5～25モル%である。含有量が0.2モル%未満であると、本発明のペプチドの量が低下するため、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となり、80モル%を超えると、リポソームの安定性が低下する。
　上記成分（ａ）のリン脂質には、通常、上述の酸性リン脂質及び中性リン脂質が含まれる。また、上記成分（ｂ）のリン脂質には、上述の反応性リン脂質が含まれる。
　酸性リン脂質の含有量は、通常1～85モル%、好ましくは2～80モル%、より好ましくは4～60モル%、更に好ましくは5～40モル%である。含有量が1モル%未満であると、ゼータ電位が小さくなりリポソームの安定性が低くなり、また、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となる。一方、含有量が85モル%を超えると、結果として、リポソームのペプチドが結合したリン脂質の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となる。
　中性リン脂質の含有量は、通常0.01～80モル%、好ましくは0.1～70モル%、より好ましくは0.1～60モル%、更に好ましくは0.1～50モル%である。含有量が80.0モル%を超えると、リポソームに含まれる酸性リン脂質、ペプチドが結合したリン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量が低下し、実用上十分なレベルに細胞傷害性Tリンパ球を活性化することが困難となる。
　ペプチドが結合したリン脂質は、前記の反応性リン脂質にペプチドが結合して得られるもので、反応性リン脂質がペプチドと結合する割合は、本発明の効果を妨げない範囲において、結合に用いる官能基の種類、結合処理条件等を適宜実施して選択することができる。
　例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端アミノ基に2価反応性化合物であるジサクシンイミジルサクシネートの片末端を結合して得たジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端変性体を反応性リン脂質として用いる場合、結合処理諸条件の選択によって反応性リン脂質の10～99%をペプチドと結合することができる。この場合、ペプチドと結合していない反応性リン脂質は、酸性リン脂質となってリポソームに含有される。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
(I) 不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質1～85モル%；
(II) 不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質0.01～80モル%；
(III) ペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質0.2～80モル%；
(IV) リポソームの安定化剤0.2～75モル%。
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のより好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I)　　2～80モル%
上記成分(II)　 0.1～70モル%
上記成分(III)　0.3～60モル%
上記成分(IV)　 10～70モル%
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜の更に好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I)　　4～60モル%
上記成分(II)　 0.1～60モル%
上記成分(III)　0.4～50モル%
上記成分(IV)　 20～60モル%
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜のとりわけ好ましい態様としては、以下の組成を挙げることができる：
上記成分(I)　　5～40モル%
上記成分(II)　 0.1～50モル%
上記成分(III)　0.5～25モル%
上記成分(IV)　 25～55モル%
（合計100モル%）
　本発明のペプチド結合リポソームは、リポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が14～24であることを特徴とするが、本発明の効果を妨げない範囲で、炭素数が14未満又は24を超える不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基を含むリン脂質を含んでいても差支えない。本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜中のリン脂質に含まれる全ての不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の合計数に対して、炭素数が14～24である不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の数の割合は、例えば50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは75%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは97%以上（例えば実質的に100%）である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、本発明の効果を妨げない限り、炭素数が14～24の範囲のアシル基又は炭化水素基を有する、リン脂質以外の脂質を含んでもよい。該脂質の含有量は、通常は40モル%以下であり、好ましくは20モル%以下、より好ましくは10モル%以下、更に好ましくは5モル%以下（例えば実質的に0モル%）である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分は、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤、ペプチド等を用い、適宜配合や加工を行い、これを適当な溶媒に添加する等の方法で得ることができる。
　例えば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、W/O/Wエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等の製造方法が挙げられる。リポソームの形態は、特に限定されず、前記のリポソーム製造方法を適宜選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソーム等、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができる。
　リポソームの粒径は特に限定されるものではないが、保存安定性等の点から、粒径は20～600nmが挙げられ、好ましくは30～500nm、次に好ましくは40～400nmであり、更に好ましくは、50～300nmであり、最も好ましくは70～230nmである。
　なお、本発明においては、リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程又は調製後に、リポソームの内水相及び/又は外水相に、糖類又は多価アルコール類を添加しても良い。特に、長期保存或いは製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖或いは多価アルコールを添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
　糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコール等が挙げられる。これらの糖類の中では単糖類又は二糖類が好ましく、中でもグルコース又はサッカロースが入手性等の点からより好ましく挙げられる。
　前記多価アルコール類としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリン等のグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール等が挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量400～10,000のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。
　リポソームの内水相及び/又は外水相に含ませる、糖類或いは多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、例えば1～20重量%が挙げられ、好ましくは2～10重量%が挙げられる。
　本発明のペプチド結合リポソームを製造する場合、ペプチドを結合させる前のリポソームを作製した後、ペプチドを結合させることにより簡便に本発明のペプチド結合リポソームを得ることができる。
　例えば、リン脂質、リポソームの安定化剤及び膜表面にペプチドを結合するための反応性リン脂質を含有したリポソームの懸濁液を調製し、その外水相に前記の糖類の一つであるスクロースを2～10重量%程度加えて溶解する。この糖添加製剤を10mlガラス製バイヤルに移して棚段式凍結乾燥機内に置き、-40℃等に冷却して試料を凍結した後、常法により凍結乾燥物を得る。
　ここで得たリポソームの凍結乾燥物は、水分が取り除かれているため長期の保存が可能であり、必要時に特定のペプチドを加えて後の工程を実施することにより、本発明の最終的なペプチド結合リポソームを簡便に迅速に得ることができる。ペプチドとリポソームとの相互作用が強く不安定性が強い場合等は、このようにリポソームの凍結乾燥物の段階で保存し、必要な際にペプチドを結合して用いると非常に簡便である。
　本発明のペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、ペプチドが結合したリン脂質を有し得る。ペプチドが結合したリン脂質を含有するリポソームを得る方法としては、次の（Ａ）及び（Ｂ）による方法が挙げられる。
（Ａ）リン脂質、反応性脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチド及び2価反応性化合物を添加し、リポソーム中に含有される反応性リン脂質の官能基と、該ペプチドの官能基とを、2価反応性化合物を介して連結する方法。ここで用いることができる2価反応性化合物は、反応性リン脂質の末端変性体調製において用いたものを同様に用いることができる。具体的には、アルデヒド基を有する2価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。更に、コハク酸イミド基を有する2価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール－ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレート等が挙げられる。また、片末端にサクシンイミド基、もう一方の片末端にマレイミド基を有する2価反応性化合物として、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）アセテート、N-サクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スルホサクシンイミジル-4-（N-マレイミドエチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-（γ-マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等を使用することができる。かかる2価反応性化合物を使用すると、官能基としてマレイミド基を有する反応性リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）の末端変性体が得られる。
（Ｂ）リン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチドを添加し、リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、該ペプチドの官能基を連結して結合させる方法。
　前記（Ａ）及び（Ｂ）における結合の種類としては、例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合等が挙げられるが、好ましくは共有結合である。更に共有結合の具体例としては、シッフ塩基結合、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等が挙げられる。
　以上の2つの方法いずれとも、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる反応性リン脂質にペプチドを結合することができ、リポソームにペプチドを結合したリン脂質が形成される。
　前記の（Ａ）の方法において、原料となるリポソームとペプチドとを2価反応性化合物を介して結合させる方法の具体例としては、例えば、シッフ塩基結合を利用する方法が挙げられる。シッフ塩基結合を介してリポソームとペプチドとを結合する方法としては、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、ペプチドを該リポソームの懸濁液に添加し、次に、2価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基と該ペプチド中のアミノ基とをシッフ塩基を介して結合する方法を挙げることができる。
　この結合手順の具体例としては、例えば、次の方法が挙げられる。
（Ａ－１）アミノ基を表面に有するリポソームを得るために、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例 ホスファチジルエタノールアミン）をリポソーム原料脂質（リン脂質、リポソームの安定化剤等）中に混合して、アミノ基がリポソーム表面に所定量存在するリポソームを作成する。
（Ａ－２）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを添加する。
（Ａ－３）次に、2価反応性化合物としてグルタルアルデヒドを加えて、所定の時間反応させてリポソームとペプチドとの間にシッフ塩基結合を形成する。
（Ａ－４）その後、余剰のグルタルアルデヒドの反応性を失活させるため、アミノ基含有水溶性化合物としてグリシンをリポソーム懸濁液に加えて反応させる。
（Ａ－５）ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により、リポソームに未結合のペプチド、グルタルアルデヒドとグリシンとの反応産物、及び余剰のグリシンを除去して、本発明のペプチド結合リポソーム懸濁液を得る。
　前記の（Ｂ）の方法の具体例としては、アミド結合、チオエーテル結合、シッフ塩基結合、エステル結合等を形成することのできる官能基を有する反応性リン脂質を、リポソームを構成するリン脂質膜に導入する方法が挙げられる。このような官能基の具体例としては、サクシンイミド基、マレイミド基、アミノ基、イミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等が挙げられる。
　リポソームを構成するリン脂質膜に導入する反応性リン脂質の例としては、前記の不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例 ホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基末端の末端変性物を用いることができる。
　この結合手順の具体例として、ジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いた場合を例にとって、以下説明する。
（Ｂ－１）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンとジサクシンイミジルサクシネートを公知の方法で片末端のみ反応させて、官能基としてサクシンイミド基を末端に有するジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンを得る。
（Ｂ－２）前記ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンと他のリポソーム構成成分（リン脂質、リポソームの安定化剤等）とを公知の方法で混合し、表面に官能基としてサクシンイミド基を有するリポソームを作成する。
（Ｂ－３）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを加え、該ペプチド中のアミノ基と、リポソーム表面のサクシンイミド基とを反応させる。
（Ｂ－４）未反応のペプチド、反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により除去して、本発明のペプチド結合リン脂質を含有するリポソームの懸濁液を得る。
　リポソームとペプチドとを結合する場合、官能基として含有されることが多いアミノ基又はチオール基を対象とすることが実用上好ましい。アミノ基を対象とする場合には、サクシンイミド基と反応させることによりシッフ塩基結合を形成させることができる。チオール基を対象とする場合には、マレイミド基と反応させることによりチオエーテル結合を形成させることができる。
２．ペプチド
　本発明はまた、細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るペプチドであって、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含み、且つ9～11アミノ酸の長さを有するペプチド（本発明のペプチド）を提供する。
　本発明のペプチドは、配列番号1若しくは２で表される優れたエピトープ配列からなるペプチド自体であるか、又は細胞内でプロテアソーム等の作用により切断され、該ペプチドを生じる。従って、本発明のペプチドは、配列番号１又は２で表されるエピトープ配列からなるペプチドと実質的に同一の優れた特性を有する。即ち本発明のペプチドは、細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得る。そのため、本発明のペプチドを下記のような本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及びＣ型肝炎ウイルスワクチンの製造に供した場合、Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の殺傷やＣ型肝炎ウイルスの感染防御に優れた効果を発揮する。
　本発明のペプチドの長さは、特に限定されないが通常9～11アミノ酸、好ましくは9～10アミノ酸、より好ましくは9アミノ酸である。本発明のペプチドの長さが10アミノ酸以上である場合には、本発明のペプチドは、配列番号１又は２で表されるエピトープ配列のN末端側及び／又はC末端側に付加配列を有する。付加配列の長さやアミノ酸配列は、本発明のペプチドの上記特性を損なわない限り特に限定されない。例えば、該付加配列は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中で、配列番号１又は２に相当する部分配列に隣接して実際に存在するアミノ酸配列であり得る。また上記ペプチドが、細胞内で主要組織適合抗原複合体（MHC）を形成する際に、MHCの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基であればとりわけ好ましい。
　本発明のペプチドは、上記本発明のペプチド結合リポソームに含まれるペプチドと同様の方法により調製することができる。
３．本発明のペプチド及びペプチド結合リポソームの用途
　本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを用いれば、特異的に本発明のペプチド又は本発明のエピトープペプチドを認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を強力に誘導することが可能となる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームにより誘導される細胞傷害性Tリンパ球は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した結果、HLA上に本発明のペプチド又は本発明のエピトープペプチドを提示した細胞を殺傷し、これらの細胞を除去する。従って、本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤やＣ型肝炎ウイルスワクチンとしてＣ型肝炎の治療や予防に有用である。
　本発明のペプチドやペプチド結合リポソームを細胞傷害性Tリンパ球活性化剤やＣ型肝炎ウイルスワクチンとして使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、ヒト、非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ等）等に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームの投与対象である動物は、通常、標的とするＣ型肝炎ウイルスが感染し得る哺乳動物（例、ヒト）及び鳥類である。本発明のペプチドやペプチド結合リポソームは、通常、非経口的に投与される。
　本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及びＣ型肝炎ウイルスワクチンは、その有効成分であるペプチド又はペプチド結合リポソーム自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記ペプチド又はペプチド結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水系溶媒のpHは5～10が挙げられ、好ましくは6～8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
　また、本発明のペプチドの溶解液又は本発明のペプチド結合リポソームの懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの粉末製剤を調製することもできる。本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水系溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
　本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤及びＣ型肝炎ウイルスワクチンは、その効果を増強するため、アジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（I,C）、CpG-DNA等が挙げられるが、CpG-DNAがとりわけ好ましい。CpG-DNAは細菌の非メチル化CpGモチーフを含むDNAであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとしてはたらくことが知られている（詳細はBiochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) 及び Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)参照）。CpG-DNAは樹状細胞（DC）を活性化することにより、本発明のペプチド又はペプチド結合リポソームによる細胞傷害性Tリンパ球の誘導を増強することができる。
　医薬組成物中の有効成分（本発明のペプチド又はペプチド結合リポソーム）の含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1～100重量%、好ましくは約1～99重量%、さらに好ましくは約10～90重量%程度である。
　本発明の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤又はＣ型肝炎ウイルスワクチンがアジュバントを含む場合、該アジュバント（例えばCpG-DNA）の含有量は、細胞傷害性Tリンパ球の誘導を増強し得る範囲で適宜設定することができるが、通常、医薬組成物全体の約0.01～10重量%、好ましくは約0.1～5重量%程度である。
　本発明のペプチド又は本発明のペプチド結合リポソームの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、例えば、皮下投与或いは経鼻投与により生体内の細胞傷害性Tリンパ球を活性化する場合には、通常成人1人（体重60ｋｇ）あたり本発明のペプチドとして一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常4週間から18ヶ月に亘って、2回から3回投与する。また、皮下投与によりＣ型肝炎ウイルス感染に対して予防する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常4週間から18ヶ月に亘って、2回から3回投与する。更に、皮下投与によりＣ型肝炎を治療する場合には、本発明のペプチドとして一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常4週間から18ヶ月に亘って、2回から3回投与する。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
（マウスの免疫）
　マウスは、マウス固有のMHCクラスI遺伝子であるH-2DとH-2K、及びβ2-microglobulin遺伝子がノックアウトされ、ヒトのHLA-A*0201及びβ2-microglobulin遺伝子が導入され発現しているHHDマウス（Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185(12):2043-2051）を使用した。一部の実験にはHHD（雄）とC57BL/6マウス（雌、東京実験動物株式会社から購入）をかけ合わせて生まれた仔（F1）を用いた。ペプチド結合リポソームの免疫は、６種のペプチドプールを結合したリポソームの場合は100μl／匹で、単独のペプチド結合リポソームの場合は20μl／匹で、それぞれCpG5002（北海道システムサイエンス（株）に合成を委託）（5μg／匹）と共に皮下注射し、７日後に（１）ＮＳ３を発現する組換えワクシニアウイルス（VV-NS3）による感染実験、（２）５１Ｃｒ放出試験、又は（３）ＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＦＮ－γ）に供した。
　免疫の陽性対照として、ＨＣＶのＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ａ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスAdex1CA3269（Makimura M, Miyake S, Akino N et al. Vaccine 1996; 14:28-34、Urbani S, Uggeri J, Matsuura Y et al. Hepatology 2001; 33(6):1533-1543、Ohno S, Moriya O, Yoshimoto T, Hayashi H, Akatsuka T, Matsui M., Viral Immunol. 2006; 19:458-467）の５×１０７ＰＦＵを腹腔内接種したマウスを用いた。エピトープの免疫原性の比較実験で、上記のAdex1CA3269による免疫に加え、HCV-NS3遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス（VV-NS3）の１×１０７ＰＦＵを腹腔内接種する免疫も行った。
（ワクシニアウイルス感染実験）
　HCV-NS3遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス（VV-NS3）は、既に報告した方法（Ohnishi Y, Shioda T, Nakayama K et al. The Journal of Virology 1994; 68(6):4075-4079）と同様に次のように作成した。HCV cDNAクローンpBRTM/HCV1-3011con（Kolykhalov AA, Agapov EV, Blight KJ, Mihalik K, Feinstone SM, Rice CM. Science 1997; 277:570-574）を鋳型にして、センスプライマー5’-GCCGGATCCATGGTCTCCAAGGGGTGGAG-3’（配列番号２９）とアンチセンスプライマー5’-TCACGTGACGACCTCCAGGTCGGCC-3’（配列番号３０）を用いてHCV-NS3遺伝子を増幅し、トランスファーベクターpNZ68K2に組み込んだ。このトランスファーベクターと野生型ワクシニアウイルスA（VV-wt）（WR株）との間の相同組み換えによりHCV-NS3遺伝子を組み込んだワクシニアウイルス（VV-NS3）を作成し、5-bromo-2-deoxyuridine存在下にC143細胞に感染させてプラーク精製を３回繰り返した後、CV-1細胞で増幅した。
　免疫マウスに組換えワクシニアウイルス（VV-NS3）を２×１０６ＰＦＵ腹腔内接種し、５日後に両側の卵巣を摘出した。卵巣をホモジナイズした後、1% FCSと1 mM MgCl2を含むPBS 0.5 mlで希釈し、凍結融解を３回繰り返した後、ソニケーションを行なった。10倍の階段希釈を行ない、それぞれを6-ウェルプレート中のBS-C-1細胞に加え、48時間後に0.1% crystal violetで染色し、プラークをカウントした。結果はマウス当たりのplaque forming unit (PFU)で表した。
（５１Ｃｒ放出試験）
　正常HHDマウスの脾臓細胞をとり、これに10μMのペプチドを加えて２時間培養した。その後Ｘ線照射（40Gy）し、培養液で洗浄したものを刺激細胞とした。これに倍量の免疫マウス由来脾臓細胞を加え、６－７日間刺激培養した。これをエフェクター細胞とし、その細胞傷害活性を以下のように標準的な５１Ｃｒ放出試験（Shirai M, Akatsuka T, Pendleton CD et al. J Virol 1992; 66:4098-4106）で測定した。標的細胞として、HHDマウスと同様に、ヒトのHLA-A*0201及びβ2-microglobulin遺伝子が導入され発現しているマウスのリンパ腫由来細胞株、RMA-HHD (H-2b)（Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. The Journal of Experimental Medicine 1997; 185(12):2043-2051）（RPMI1640、10% FCS、G418 500μg/mlで培養）を用いた。この細胞１×１０６個に10μMのペプチドを加えて２時間培養した後に100μCiのNa2 51CrO4を加えて３０分間インキュベートして標識し、培養液で洗浄した後、９６穴培養プレートに５×１０３個／ウェルずつ入れ、それに上記のエフェクター細胞を種々のエフェクター/標的細胞比（E/T ratio）で加えて37℃で4時間インキュベートした。上清中の放射活性をガンマカウンターで測定し、以下の計算式で“% Specific Lysis”を算出した。
% specific lysis = [(cpmsample - cpmspontaneous)/(cpmmaximum- cpmspontaneous)] X
100
cpmは1分当たりのカウント、spontaneous releaseはエフェクター細胞非存在下でのカウント、maximum releaseは標的細胞を2% Nonidet P-40を加えることで完全溶解した時のカウントをそれぞれ意味する。
（ＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＦＮ－γ））
　免疫マウス脾臓中の抗原特異的にインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を産生するＴ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴキット（BD Bioscience）を用いて測定した。９６ウェルプレートに抗ＩＦＮ－γ抗体（clone R4-6A2）を0.5μg入れ、4℃で一晩静置した後洗浄し、10% FCSを含むRPMI 1640培地を加えて室温で２時間のブロッキングを行った。各ウェルに免疫マウス脾臓細胞を１×１０５又は１×１０６個、及び正常HHDマウスの脾臓細胞にペプチドをパルスしＸ線照射（40Gy）したものをその10分の1量加え、37℃で2日間培養した。各ウェルの細胞を洗浄除去し、ビオチン標識抗マウスＩＦＮ－γ抗体と室温で２時間反応させた後、streptavidin-horseradish peroxidaseと室温で１時間反応させ、最後に3-amino-9-ethylcarbazoleを含む基質液を加えてスポットを発色させた。乾燥後に各ウェルのスポットの数を実体顕微鏡で観察して数えた。
［参考例１］
リポソームの調製
１）脂質混合粉末の調製
　末端変性ホスファチジルエタノールアミンからなる反応性リン脂質（サクシンイミジル基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の合成
　ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン2g及びトリエチルアミン180μlをクロロホルム50mlに溶解及び添加し、300ml容の4つ口フラスコに入れた。このフラスコをマグネットスタラーで室温で攪拌しつつ、別に調製した2価反応性化合物であるジサクシンイミジルスベレート3gをクロロホルム80mlに溶解した溶液を、常法に従って4時間に亘って滴下し、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端を反応させた。この粗反応溶液をナス型フラスコに移し、エバポレータによって溶媒を留去した。次に、このフラスコに粗反応物を溶解できるだけのクロロホルムを少量加えて高濃度粗反応物溶液を得、クロロホルム/メタノール/水（65/25/1、体積比）で平衡化したシリカゲルを用いて常法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、目的のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端が結合した画分のみを回収し、溶媒を留去して目的の反応性リン脂質であるサクシンイミド基－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを得た。
２）脂質混合粉末の調製
　ジオレオイルホスファチジルコリン1.3354g（1.6987mmol）、前項で調製したサクシンイミド基-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン0.2886g（0.2831mmol）、コレステロール0.7663g（1.9818mmol）及びジオレオイルホスファチジルグリセロールNa塩0.4513g（0.5662mmol）をナス型フラスコに取り、クロロホルム/メタノール/水（65/25/4、容量比）混合溶剤50mlを入れ、40℃にて溶解した。次にロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶剤を留去し、脂質の薄膜を作った。更に注射用蒸留水を30ml添加し、攪拌して均一のスラリーを得た。このスラリーを凍結させ、凍結乾燥機にて24時間乾燥させ脂質混合粉末を得た。
３）リポソームの調製
　次に、別途作製した緩衝液（1.0mM Na2HPO4/KH2PO4、0.25Ｍサッカロース、pH7.4、以後緩衝液と略す）60mlを上記脂質混合粉末の入ったナス型フラスコ内に入れ、40℃にて攪拌しながら脂質を水和させ、リポソームを得た。次にエクストルーダーを用いてリポソームの粒径を調整した。まず8μmのポリカーボネートフィルターを通過させ、続いて5μm、3μm、1μm、0.65μm、0.4μm及び0.2μmの順にフィルターを通過させた。リポソーム粒子の平均粒径206nm（動的光散乱法による測定）が得られた。
［実施例１］
ＣＴＬエピトープの検索
　Ｃ型肝炎ウイルスHCV-1a株polyprotein（GenBank accession #: AAB66324）のＮＳ３領域のアミノ酸配列から、CTLエピトープとして報告されている６種を含む２５種類のエピトープを選択した。これらのエピトープについて、インターネット上で利用可能な予測プログラム（BIMAS及びSYFPEITHI）を用いて、細胞傷害性T細胞（CTL）に対する予想抗原性のスコアを計算した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
ワクチン効果を有するペプチドのスクリーニング
１）ペプチドプールからのリポソーム製剤の調製
　実施例１の２５の候補ペプチドのうち、極めて溶解性の低かった＃２２を除いた２４のペプチドを、４つのグループ（ＮＳ３－ＩからＩＶ）にプールした。なお、ＮＳ３－Ｉには、既知の６つのＣＴＬエピトープペプチドをプールした。各プールを用いて、ペプチド結合リポソームを以下の方法により調製した。
　参考例１（リポソームの調製）のリポソーム１．５ｍｌを試験管に採取し、別に調製した３ｍｌの各ペプチドプール溶液を加えた後、５℃で４８時間穏やかに攪拌し反応させた。この反応液を、緩衝液で平衡化したSepharoseCL-4Bを用いて常法に従ってゲル濾過した。尚、リポソーム画分は白濁しているので、目的画分は容易に確認できるが、ＵＶ検出器等で確認しても良い。
　得られたリポソーム懸濁液中のリン濃度を測定し（リン脂質テストＷａｋｏ）、リン脂質由来のリン濃度を２ｍＭになるように濃度を緩衝液で希釈調整し、各ペプチド結合リポソームの懸濁液を得た。
２）ワクチン効果の測定
　１）で調製したペプチド結合リポソームについて、ＨＣＶのＮＳ３を組み込んだ組換えワクシニアウイルスに対するワクチン効果を測定した（図１）。その結果、いずれのプールも一定のワクチン効果を示したが、特にＮＳ３－ＩＩ及びＮＳ３－ＩＩＩが高いワクチン効果を示した。
　また各プール中のペプチドの免疫原性を調べた（図２）。ＥＬＩＳＰＯＴ法により各ペプチドの刺激によるＩＦＮ－γ産生細胞数を測定したところ、ペプチド＃３、＃１３、＃１４、＃１７、＃１９、及び＃２３の刺激によるＩＦＮ－γ産生が確認された。また５１Ｃｒ放出試験によりＣＴＬの細胞傷害性を測定したところ、前記ペプチドを含む複数のペプチドについて細胞傷害性が確認された。特に、＃３、＃８、＃１３、＃１４、＃１７、＃１９、及び＃２３のペプチドは、強力に抗原特異的なＣＴＬを誘導した。
３）各ペプチドからのリポソーム製剤の調製
　上記試験においてＣＴＬ誘導性を有することが示唆されたペプチド＃３、＃１３、＃１４、＃１７、＃１９、及び＃２３について、各ペプチドからペプチド結合リポソームを以下の方法により調製した。
　参考例１（リポソームの調製）のリポソーム１．５ｍｌを試験管に採取し、別に調製した３ｍｌの各ペプチド溶液（１．２５ｍＭ、緩衝液溶液）を加えた後、５℃で４８時間穏やかに攪拌し反応させた。この反応液を、緩衝液で平衡化したSepharoseCL-4Bを用いて常法に従ってゲル濾過した。
　得られたリポソーム懸濁液中のリン濃度を測定し（リン脂質テストＷａｋｏ）、リン脂質由来のリン濃度を２ｍＭになるように濃度を緩衝液で希釈調整し、各ペプチド結合リポソームの懸濁液を得た。
４）ペプチド結合リポソームのワクチン効果の測定
　３）で調製したペプチド結合リポソームの免疫原性を調べた（図３）。その結果、いずれのペプチド結合リポソームを用いた場合にもＩＦＮ－γ産生が認められ、特にペプチド＃３を用いた場合に顕著であった。またペプチド＃３、＃１３、＃１７及び＃２３については細胞傷害性Ｔ細胞の誘導も確認された。細胞傷害性Ｔ細胞の誘導についても、ペプチド＃３を用いた場合の効果が顕著であった。
　さらにこれらのペプチド結合リポソームのワクチン効果を調べたところ、ペプチド＃３、＃１３、＃１９を用いた場合に顕著なワクチン効果が得られることが明らかとなった（図４）。
　なお、ペプチド＃３は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（YMNTPGLPV）からなるペプチドであり、ペプチド＃１３は、配列番号５で表されるアミノ酸配列（GMFDSSVLC）からなるペプチドであり、ペプチド＃１９は、配列番号３で表されるアミノ酸配列（IMTCMSADL）からなるペプチドである。
　これらの試験結果から、以下のことが示唆された。
　　・　予測プログラム（BIMAS、SYFPEITHI）における細胞傷害性T細胞（CTL）に対する予想抗原性スコアと、ペプチド結合リポソームのＣＴＬ誘導活性は必ずしも相関しないこと。
　　・　ペプチドのリポソームに結合しない場合におけるＣＴＬ誘導活性と、リポソームに結合した場合におけるＣＴＬ誘導活性とは、必ずしも相関しないこと。
［実施例３］
種々の実験系におけるペプチド＃３の免疫原性
　上記のリポソームを用いた試験において顕著なワクチン効果を示したペプチド＃３の免疫原性について、他の実験系を用いて更に検討した（図５及び図６）。
　上記のように、単独で細胞傷害性Tリンパ球を誘導するペプチドが、リポソーム結合により効率よく細胞傷害性Tリンパ球を誘導するとは限らない。このことをさらに確認するために、ヒトのHLA-A*0201遺伝子とマウス固有のH-2b遺伝子の両方を発現するマウス（HHD（雄）とC57BL/6マウス（雌）をかけ合わせて生まれた仔）に４種のペプチド結合リポソームを免疫して、それらの免疫原性を比較した（図５）。
　その結果、マウスH-2bのエピトープペプチド１６３０－１６３７を結合したリポソームは高い免疫原性を示したのに対し、ヒトHLA-A*0201のエピトープ１０７３－１０８１又は１５８５－１５９３を結合したものは免疫原性が低かった。エピトープ１０７３－１０８１及びエピトープ１５８５－１５９３は、Ｃ型肝炎ウイルスの優れたエピトープペプチドとして知られているペプチドであるが、これらが顕著な免疫原性を示さなかったことは、優れたエピトープペプチドを用いたとしても、優れた免疫原性を有するペプチド結合リポソームは必ずしも得ることができないことを示している。これに対してペプチド＃３は、リポソーム結合により、マウスのエピトープ１６３０－１６３７と同程度の高い免疫原性を示した。
　さらにAdex13269とVV-NS3による免疫実験では、ペプチド＃３の免疫原性が低いことが明らかとなった（図６）。なお、１０３１－１０３９は、HCV NS3のHLA-A24(A*2402)エピトープであり、ここでは陰性対照として用いた。
　これらの結果は、ペプチド＃３が、ＮＳ３全体で免疫した場合には免疫原性を有さないが、リポソーム結合によって優れた免疫原性を発現することを示す。即ち、ペプチド＃３は、特にリポソームに結合させて細胞傷害性Tリンパ球活性化剤やＣ型肝炎ウイルスワクチンとして使用されるのに適している。
［実施例４］
Ｌｉｐ－＃３のブースト効果
　Ｌｉｐ－＃３のブースト効果を、ＥＬＩＳＰＯＴにより確認した（図７）。図７下パネルに示すタイムスケジュールで、ＨＨＤマウスにＬｉｐ－＃３の接種を２回行なったところ、顕著なＩＦＮ－γ産生の増加が認められた。このことは、Ｌｉｐ－＃３をＣ型肝炎の治療用ワクチンとして使用し得ることを示す。
［実施例５］
Ｌｉｐ－＃３の免疫原性の用量依存性
　Ｌｉｐ－＃３の免疫原性をより詳細に検討するために、段階希釈したＬｉｐ－＃３を用いてＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ－γ産生を測定した（図８）。その結果、わずか０．２８μｇの用量でＩＦＮ－γ産生を引き起こすことができ、Ｌｉｐ－＃３が極めて低用量でも優れた免疫原性を有することが示された。
［実施例６］
Ｌｉｐ－＃３の交差反応性
　ペプチド＃３はＨＣＶ－１ａ株由来のペプチドである。Ｌｉｐ－＃３による免疫により誘導したＣＴＬが、別のＨＣＶ株由来のペプチドに対しても反応性を示すか、５１Ｃｒ放出試験により検討した（図９）。その結果、Ｌｉｐ－＃３による免疫で、ＨＣＶ－１ｂ株由来の＃３－２Ｌ（配列番号４）に対しても、ＨＣＶ－１ａ株由来のペプチド＃３に対する反応と同程度の強いＣＴＬ反応が生じることが分かった。即ち、Ｌｉｐ－＃３により免疫するだけで、ＨＣＶ－１ａ株とＨＣＶ－１ｂ株の両方に対するワクチン効果が期待できることが示された。
［実施例７］
Ｌｉｐ－＃１３及びＬｉｐ－＃１３－１Ａの交差反応性
　ペプチド＃１３及び＃１３－１Ａ（配列番号２）は、それぞれＨＣＶ－１ａ株及びＨＣＶ－１ｂ（Ｊ１）株由来のペプチドである。実施例６と同様に、Ｌｉｐ－＃１３及びＬｉｐ－＃１３－１Ａについて、５１Ｃｒ放出試験により交差反応性を調べた（図１０）。ただし、図１０下パネルに示すタイムスケジュールで、ペプチド結合リポソームの接種を２回行なった。Ｌｉｐ－＃１３による免疫では、＃１３に対するＣＴＬ反応には及ばないものの、＃１３－１Ａに対しても強いＣＴＬ反応が生じることが分かった。またＬｉｐ－＃１３－１Ａによる免疫では、＃１３に対しても、＃１３－１Ａに対する反応と同程度の強いＣＴＬ反応が生じることが分かった。即ち、Ｌｉｐ－＃１３又はＬｉｐ－＃１３－１Ａのいずれかにより免疫するだけで、ＨＣＶ－１ａ株とＨＣＶ－１ｂ（Ｊ１）株の両方に対するワクチン効果が期待できることが示された。
［実施例８］
Ｌｉｐ－＃１９及びＬｉｐ－＃１９－３Ａの交差反応性
　ペプチド＃１９及び＃１９－３Ａ（配列番号６）は、それぞれＨＣＶ－１ａ株及びＨＣＶ－１ｂ（Ｊ１）株由来のペプチドである。実施例６と同様に、Ｌｉｐ－＃１９及びＬｉｐ－＃１９－３Ａについて、５１Ｃｒ放出試験により交差反応性を調べた（図１１）。ただし、図１１下パネルに示すタイムスケジュールで、ペプチド結合リポソームの接種を２回行なった。Ｌｉｐ－＃１９による免疫では、＃１９－３Ａに対しても、＃１９に対する反応と同程度の強いＣＴＬ反応が生じることが分かった。またＬｉｐ－＃１９－３Ａによる免疫では、＃１９に対しても、＃１９－３Ａに対する反応と同程度の強いＣＴＬ反応が生じることが分かった。即ち、Ｌｉｐ－＃１９又はＬｉｐ－＃１９－３Ａのいずれかにより免疫するだけで、ＨＣＶ－１ａ株とＨＣＶ－１ｂ（Ｊ１）株の両方に対するワクチン効果が期待できることが示された。また＃１９と＃１９－３Ａとを比較すると、＃１９－３Ａを結合したリポソームの方がワクチン効果が高いことが示された。
　本発明によれば、本来免疫原性の低いＣ型肝炎ウイルスに対し、効果が高いワクチンを提供することができる。また従来の治療方法では効果が限定的であった患者に対しても有効な治療を提供することができる。
　本出願は日本で出願された特願２０１０－２０１１６０（出願日：２０１０年９月８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (19)

  1. 　ペプチドが結合したリポソームであって、
    該ペプチドが、
    Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列中の９アミノ酸以上の長さの部分アミノ酸配列を含み、
    ９～１１アミノ酸の長さを有し、且つ
    細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るものであり；
    該リポソームが、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質、及びリポソームの安定化剤を含有し；且つ
    該リポソームの表面に該ペプチドが結合している、
    ペプチド結合リポソーム。
  2. 　リン脂質が、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基を有するリン脂質である、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  3. 　アシル基がオレオイル基である、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  4. 　リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル－ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド－ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  5. 　リポソームの安定化剤がコレステロールである、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  6. 　ペプチドが、リポソームを構成するリン脂質膜に含まれる不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  7. 　リポソームが以下の組成を有する、請求項１記載のペプチド結合リポソーム：
    （Ａ）不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　1～99.8モル%；
    （Ｂ）リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
  8. 　リポソームが以下の組成を有する、請求項１記載のペプチド結合リポソーム：
    (I)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する酸性リン脂質　　1～85モル%；
    (II)不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有する中性リン脂質　　0.01～80モル%；
    (III)ペプチドが結合した、不飽和結合を1個有する炭素数14～24のアシル基又は不飽和結合を1個有する炭素数14～24の炭化水素基を有するリン脂質　　0.2～80モル%；
    (IV)リポソームの安定化剤　　0.2～75モル%。
  9. 　部分アミノ酸配列が、配列番号１～３、５及び６のいずれかで表されるアミノ酸配列である、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  10. 　請求項１記載のペプチド結合リポソームを含む、細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
  11. 　更にＣｐＧ－ＤＮＡを含有することを特徴とする、請求項１０記載の細胞傷害性Tリンパ球活性化剤。
  12. 　請求項１記載のペプチド結合リポソームを含む、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
  13. 　更にＣｐＧ－ＤＮＡを含有することを特徴とする、請求項１２記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。
  14. 　Ｃ型肝炎の治療用である、請求項１２記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。
  15. 　Ｃ型肝炎の予防用である、請求項１２記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。
  16. 　細胞傷害性Tリンパ球を誘導し得るペプチドであって、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含み、且つ9～11アミノ酸の長さを有する、ペプチド。
  17. 　Ｃ型肝炎の予防又は治療において使用するための、請求項１記載のペプチド結合リポソーム。
  18. 　哺乳動物に請求項１記載のペプチド結合リポソームの予防的又は治療的有効量を投与することを含む、該哺乳動物におけるＣ型肝炎の予防又は治療方法。
  19. 　Ｃ型肝炎ウイルスワクチンを製造するための、請求項１記載のペプチド結合リポソームの使用。
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