WO2012038573A1 - Anticuerpo contra ephrin b2 y su uso - Google Patents

Anticuerpo contra ephrin b2 y su uso Download PDF

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cells
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Jorge Luís MARTÍNEZ TORRECUADRADA
María Angeles ABENGOZAR INFANTES
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Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas CNIO
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention belongs to the field of Biotechnology and Biomedicine, and refers to a new specific antibody against ephrin B2, capable of blocking the formation of blood vessels (angiogenesis) and lymphatics (lymphangiogenesis). Furthermore, the present invention relates to the use of said antibody, for example, for the preparation of a medicament.
  • Angiogenesis or formation of new blood vessels from pre-existing ones plays a fundamental role in numerous physiological processes during embryonic development and in postnatal life: reproduction, scarring and inflammation.
  • the molecular mechanisms responsible for the transition from an endothelial cell to an angiogenic phenotype are not completely known, it is a complex process that involves the proliferation, migration and assembly of endothelial cells, followed by the recruitment of other perivascular cells as pericytes or muscle cells and remodeling of the extracellular matrix (Risau, W. Nature 1997; 386: 671-674).
  • Uncontrolled growth of blood vessels is an underlying disorder in numerous pathologies such as rheumatoid arthritis or diabetic retinopathy and, especially in neoplastic processes.
  • Tumor growth will depend on the constant supply of oxygen and nutrients through the constitution of a network of new blood vessels, so that in the absence of adequate vascularization, the cells undergo a process of necrosis and / or apoptosis that inhibits or moderates the increase in tumor volume.
  • the vertebrate circulatory system is made up of lymphatic vessels that also play a critical role during the development of the organism and in pathological processes.
  • the lymphatic system drains the interstitial fluid from the tissues and returns it to the blood system; In addition, it absorbs lipids from the digestive system, is part of the individual's immune defense by transporting cells of the immune system, for example in inflammation, and in pathological conditions it induces different types of lymphedema, inflammatory diseases and participates in the invasion and metastasis of carcinomas (Tammela , T. and Alitalo, K. Cell 2010; 140: 460-76).
  • the study of lymphangiogenesis or formation of lymphatic vessels from pre-existing ones remained delayed for many decades and it is not until recent years that specific biomolecular mechanisms and markers have been described, which are currently being used to study the process of tumor dissemination and metastasis.
  • vasculogenesis a process in which lymphatic vessels originates from endothelial precursors derived from mesoderm in a process called vasculogenesis, while the formation of lymphatic vessels seems to start from a set of venous endothelial cells in the jugular and perimensional region. Since their embryonic origin is common, both vascular systems share similar molecular mechanisms that regulate their development and maturation.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGFR vascular endothelial growth factor
  • ephrins (acronym for "erythropoietin producing hepatoma receptor interactors"), together with their corresponding receptors (Eph), is also involved in the remodeling of the blood vascular system (Adams, RH and Klein, R. Trends Cardiovasc Med. 2000; 10: 183-188) and lymphatic (Mákinen, T et al. Genes Dev. 2005; 19: 397-410).
  • EphA receptors bind to the ephrin A subgroup ligands, characterized by being anchored to the membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) molecule, while Eph B receptors bind to ephrin B subgroup ligands, which are anchored to the membrane through a transmembrane region followed by a cytoplasmic domain.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • the arteries express the transmembrane ligand ephrin B2 and the veins express the Eph B4 receptor (Adams, RH and Alitalo K. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 464-478).
  • This group of molecules are responsible for the regulation of various cellular functions such as morphology, migration, repulsion, adhesion and cell invasion by modifying the organization of the cytoskeleton and influencing the activities of integrins and other intracellular adhesion molecules (Pasquale, EB. Cell 2008 ; 133: 38-52).
  • Eph receptors expressed in one cell depend on the interaction of the Eph receptors expressed in one cell with the corresponding ephrin expressed in another, generating bidirectional signals that affect each of the cells involved.
  • Signaling from the Eph receptor is called "direct”, and depends on the tyrosine kinase domain present in its cytoplasmic region, which has the ability to autophosphorylate and phosphorylate other proteins, and the association of the receptor with other effector molecules.
  • the ephrin B ligand For its part, the ephrin B ligand generates another signal called “reverse” (English “reverse") dependent on the side of the phosphorylation of several tyrosines present in its cytoplasmic region, carried out by kinases of the Src family and other receptors tyrosine kinase, and, on the other hand, of other associated proteins.
  • most Eph receptors and B ephrins have a PDZ domain binding site in their cytoplasmic regions that is important for performing physiological functions, particularly of B ephrins (Mákinen, T et al. Genes Dev. 2005; 19: 397-410).
  • mice deficient for these genes have an altered angiogenesis that is lethal in an embryonic state (Wang, HU et al. Cell 1998; 93: 741-753; Adams, RH et al. Genes Dev. 1999; 13: 295-306), while that the study of mice expressing ephrin B2 with mutations in active signaling sites showed that this protein controls angiogenic and lymphoangiogenic growth through the regulation of the VEGF signaling pathway (Wang, Y et al.
  • Antibodies against ephrin B2 are described in WO2007 / 127506 and WO2010 / 019565.
  • WO2007 / 127506 shows that the antibodies described block signaling between ephrin B2 and Eph B4 and have an angiogenesis inhibitory effect, capable of decreasing tumor volume in an animal model.
  • the present invention provides a new therapeutic agent capable of controlling angiogenesis and refers to a new antibody against ephrin B2, with a sequence different from that of the antibodies described to date and a high specificity, capable of inhibiting the formation of new vessels. blood and lymphatic and significantly prevent the growth of tumors.
  • the antibodies against ephrin B2 described in WO2007 / 127506 are capable of inhibiting angiogenesis, but an inhibitory effect of lymphangiogenesis is not described.
  • the present invention is based on antibodies that specifically recognize and bind to ephrin B2 and refers to said antibodies and compositions and methods based on them, which is a tool important therapeutic and diagnostic against those pathologies associated with ephrin B2.
  • the present invention relates to new specific antibodies against ephrin B2 that have antiangiogenic and antilinfoangiogenic activity, and are capable of inhibiting the growth of solid tumors.
  • This invention provides a new solution to the problem of controlling diseases that occur with angiogenesis disorders, such as, for example, cancer.
  • the B1 1 antibody described here specifically recognizes ephrin B2 so that it inhibits its binding to the Eph B4 receptor which, in vitro assays, inhibits the formation of tubules and the migratory capacity of endothelial cells ( HUVEC) and, in vivo tests with carcinoma cells of the pancreas, lung and colon, produces a considerable reduction in the number of blood and lymphatic vessels in tumors.
  • the antibody of the present invention is capable of significantly retarding tumor growth and causing the decrease in their size.
  • the inventors have demonstrated that the B1 1 antibody blocks the interaction of ephrin B2 with Eph B4 both in vitro and in cultured cells, where it is also shown how the antibody is capable of inhibiting the signaling of ephrin through its receptor ( see figure 5 of this report).
  • the 2B1 antibody is also able to inhibit the formation of tubules and the migratory capacity of endothelial cells (HUVEC) and reduce the number of blood and lymphatic vessels in tumors in in vivo assays.
  • the 2B1 antibody does not compete with the Eph B4 receptor in Biacore TM assays or Eph B4 cell block assays, as shown in Figure 5 herein. Therefore, a first aspect of the present invention relates to an isolated polypeptide characterized in that:
  • to. comprises an amino acid sequence of at least 76% sequence identity with SEQ ID NO: 1 and
  • the polypeptide comprises an amino acid sequence with at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99% identity with SEQ ID NO: 1. More preferably, the polypeptide comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • isolated refers to said polypeptide being identified and separated and / or extracted from a natural environment.
  • % sequence identity refers to the percentage of amino acids of the sequence in question that are identical to the amino acids of the sequence with which it is compared, after aligning said sequences and entering spaces , if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity, regardless of conservative substitutions.
  • the alignment can be carried out in different ways, known to the person skilled in the art, such as using public tools such as the BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) programs. A person skilled in the art can determine the appropriate parameters for measuring alignment, including the algorithms necessary to achieve maximum alignment of the sequences being compared.
  • ephrin B2 refers, unless specifically or contextually indicated otherwise, to any natural polypeptide or to any variant of the ephrin B2 protein.
  • the name of this protein is the acronym for "erythropoietin producing hepatoma receptor interactors ", although it can also be called ephrine or epine.
  • a natural polypeptide can be a naturally truncated or secreted form, such as the extracellular domain, or any natural variant such as the various alternative forms of splicing, or any allelic variant.
  • the polypeptide is an antibody. More preferably, the antibody is human. Preferably, the isotype of the human antibody is lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 or IgA.
  • antibody or “immunoglobulin” are used in their broadest sense, and include monoclonal, polyclonal, multispecific antibodies (provided they have the desired biological activity) and may include antibody fragments.
  • the antibody can be human, humanized and / or affinity matured.
  • a "human antibody” is one whose amino acid sequence corresponds to that of an antibody produced by a human.
  • the antibodies of the present invention can be single-chain variable fragments (scFv) from the English “single chain variable Fragmenf.”
  • scFv single-chain variable fragments
  • the term “variable” refers to the fact that certain parts of the variable domains of the antibodies differ greatly in their sequence, and are the sequences responsible for the specific binding of each antibody to its antigen, however, the variability is not distributed homogeneously throughout the entire variable domain of the antibodies. This variability is concentrated in three segments called CDR , "complementity-determining regions") or hypervariable regions, present in the variable domains of both the light chain and the heavy chain. The most conserved parts of the variable domains are called the framework (in English, "framework").
  • variable fragment or "Fv” is the m fragment nimo of an antibody that contains a complete site recognition and antigen binding.
  • a single chain variable fragment can have a heavy chain variable domain and another light chain variable domain covalently linked by a peptide that allows heavy and light chains to be associated to form the structure of the antigen binding site.
  • An Fv can also be of two chains. In any case, even a single variable domain, with only three CDRs, is sufficient to specifically recognize and bind an antigen, although with less affinity.
  • Light chains of vertebrate antibodies or immunoglobulins can be of two types, called kappa and lambda, depending on the amino acid sequences of their constant domains.
  • immunoglobulins are associated with different classes or types. There are five main classes or types: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. In addition, some of them are divided into subclasses or isotypes, such as lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 and lgGA2.
  • an antibody fragment can be any part of the antibody that maintains the function of the complete antibody.
  • Some examples of antibody fragments are Fv, Fab (antigen binding fragments), Fab2 (fragments with two antigen binding sites), all well known to one skilled in the art.
  • the single-chain variable fragments comprise the VH (heavy chain variable domain) and VL (light chain variable domain) domains of the antibody, these domains being in a single polypeptide chain.
  • scFv-Fc formats of the antibodies of the present invention may be those known as minibodies or "minibodies", which comprise a scFv and a constant region of type CH3, or so-called scFv-Fc, which comprise a scFv and the constant regions CH2 and CH3 .
  • minibodies which comprise a scFv and a constant region of type CH3, or so-called scFv-Fc, which comprise a scFv and the constant regions CH2 and CH3 .
  • the term "antigen" refers to a predetermined antigen to which the antibody is capable of selectively binding.
  • the antigen can be a polypeptide, a carbohydrate, a nucleic acid, a lipid, a hapten or other natural or synthetic molecule.
  • the antigen is a polypeptide.
  • the inventors of the present invention have studied the affinity of the B1 1 and 2B1 antibodies for the ephrin B2, finding that B1 1 has a high affinity for the antigen, the affinity constant (KD) being of 1 10 nM, while 2B1 has a lower affinity, the KD being 630 nM.
  • the affinity of the binding between the recognition and binding site of an antibody and its antigen has to do with the strength of the sum of the total non-covalent interactions between the two.
  • the affinity of one molecule for another can generally be represented by the affinity constant, also called the dissociation constant (K D ). Affinity can be measured by commonly known methods, such as, but not limited to, with the methods described herein.
  • the polypeptide further comprises a signal peptide.
  • the signal peptide is SEQ ID NO: 6, the signal peptide of the known bacterial Nase from Erwinia carotovora as pelB. This signal peptide allows the scFv to be located in the periplasm, where it folds correctly thanks to the oxidizing environment.
  • a signal peptide is a small sequence of between 3 and 60 amino acids that directs the transport of a polypeptide or protein to a specific subcellular location, such as the endoplasmic reticulum, the mitochondria or the nucleus.
  • the signal peptide can also direct the transport of the protein out of the cell, which could be equivalent to its secretion or its transport to the cell periplasm, in the case of cells such as Escherichia coli.
  • Some examples of signal peptide to direct the secretion of a polypeptide are pelB, stll, ecotin, lamB, herpes GD, 1 pp, alkaline phosphatase, invertase, alpha factor and the leader sequence of protein A.
  • the polypeptide further comprises at least one label.
  • the label is selected from the list comprising: c-myc, FLAG, HA, histidine chain, GST, biotin, VSV-G, HSVtk, V5, biotin, avidin, streptavidin, maltose binding protein and a protein fluorescent.
  • the marker is a histidine chain, c-myc or both.
  • the histidine chain comprises between 4 and 12 histidines. More preferably, the histidine chain comprises 6 histidines.
  • the polypeptide comprises the c-myc markers and a histidine chain.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is SEQ ID NO: 7.
  • the term "marker”, as used herein, refers to a marker peptide or a marker protein, which allows the identification of the protein of interest when produced together with said protein as a fusion protein.
  • the marker peptide or the marker protein is used for the identification and / or location of the protein of interest because said markers correspond to binding sites to certain molecules or atoms, such as the histidine chain, GST, avidin or streptavidin, or because they are easily detectable by immunochemical techniques, such as hemagglutinin, VSV-G, HSVtk, FLAG, V5 or myc, or because they are easily observable, such as fluorescent proteins.
  • the VSV-G marker peptide belongs to the vesicular stomatitis vesicle glycoprotein.
  • the HSVtk marker peptide belongs to the thymidine kinase of the herpes simplex virus 1.
  • the FLAG peptide is an 8 amino acid epitope designed specifically as a recombinant protein marker.
  • V5 is a small epitope present in the P and V proteins of simian virus 5 paramyxovirus (SV5).
  • the myc epitope has 10 amino acids and is part of the human c-myc transcription factor sequence.
  • Another embodiment of the invention is an antibody whose amino acid sequence comprises the polypeptide of the first aspect of the invention.
  • a second aspect of the present invention relates to a nucleic acid encoding the polypeptide of the first aspect of the invention.
  • the nucleic acid is a vector. More preferably, the vector is an expression vector.
  • a nucleic acid or polynucleotide is a polymer of nucleotides of any length, including DNA and RNA.
  • the nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or any substrate that can be incorporated into a DNA or RNA polymer by a polymerase or by a synthetic reaction.
  • encodes refers to the genetic code that determines how a nucleotide sequence is translated into a polypeptide or a protein.
  • the order of nucleotides in a sequence determines the order of amino acids along a polypeptide or protein.
  • a vector is a nucleic acid molecule used to transfer genetic material to a cell. Apart from said genetic material, a vector may also contain different functional elements that include transcription control elements, such as promoters or operators, regions or enhancers of binding to transcription factors, and control elements to initiate and terminate translation. Vectors include, but are not limited to: plasmids, cosmids, viruses, phages, recombinant expression cassettes and transposons.
  • An expression vector is one capable of directing the expression of genes to which it has been operatively linked.
  • An expression vector is used for the translation and transcription of a gene of interest, normally controlled by a promoter.
  • a promoter is a nucleotide sequence that controls the translation of the gene of interest. The promoter is operatively linked to the gene of interest.
  • Operationally linked refers to the functional relationship and location of the promoter sequence with respect to the gene of interest, for example, a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence.
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence.
  • an operably linked promoter is contiguous with the sequence of interest, however, an enhancer does not have to be contiguous with the sequence of interest to control its expression.
  • a third aspect of the invention refers to a cell comprising the vector of the second aspect of the invention.
  • the cell can be prokaryotic, for example, but not limited, the cell can be a bacterium like E. coli that used to produce the antibody of the invention.
  • the cell can be eukaryotic, such as, but not limited to, a yeast or an insect cell, which is used to produce the antibody of the invention.
  • the cell can be eukaryotic and used for cell therapy, or it can be a cell that has incorporated the vector of the second aspect of the invention by gene therapy.
  • the cell is a mammalian cell.
  • a mammalian cell is any cell whose species belongs to the Animalia Kingdom, Filo Chordata, Subfilo Vertebrata and Mammalia Class.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method of obtaining the polypeptide of the first aspect of the invention, which comprises the steps:
  • the cell is prokaryotic. In another preferred embodiment of the fourth aspect of the invention, the cell is eukaryotic.
  • a fifth aspect of the invention relates to a method of detecting and / or quantifying ephrin B2 which comprises the steps:
  • a preferred embodiment of the fifth aspect of the invention is a method of diagnosing a disease associated with the expression of ephrin B2 comprising the steps:
  • a disease associated with the expression of ephrin B2 can be, among others, any disease that occurs with a deregulation of angiogenesis, such as both neoplastic and non-neoplastic diseases.
  • Non-neoplastic diseases that occur with an dysregulation of angiogenesis include, but are not limited to: aberrant hypertrophy, arthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, sarcoidosis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, proliferative retinopathy, neovascular glaucoma, macular degeneration associated with aging, macular edema diabetic, corneal neovascularization, meningioma, hemangioma, angiofibroma, thyroid hyperplasia, chronic inflammation, lung inflammation, sepsis, cerebral edema, synovial inflammation, hypertrophic bone formation, osteoarthritis, polycystic ovary, endometriosis, Crohn's disease, ulcerative
  • An isolated biological sample is an isolated sample of an organism such as the human or animal body and can come from a physiological fluid and / or any cell or tissue of an organism.
  • the biological sample may be a tissue, for example, but not limited to, a biopsy or a fine needle aspirate.
  • the biological sample isolated in step (a) is a biological fluid.
  • the biological fluid may include excreted or secreted fluids from the body, as well as fluids that are not normally.
  • Biological fluid may include, but is not limited to, amniotic fluid surrounding the fetus, aqueous humor, interstitial fluid, lymph, breast milk, mucus (including nasal drainage and phlegm), saliva, sebum (skin fat), serum , sweat, tears, urine, pericardial fluid, blood and blood plasma.
  • the biological fluid is blood, blood plasma or blood serum.
  • the biological sample isolated in step (a) of the method of the invention can be, for example, but not limited, fresh, frozen, fixed or embedded in paraffin.
  • detect and / or quantify refers to the detection of the presence and / or to the extent of the amount or concentration, preferably semi-quantitatively or quantitatively.
  • the measure can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the amount or concentration of the complex formed by ephrin B2 and the polypeptide of the first aspect of the invention, based on a signal that is obtained directly from said complex and that is directly correlated with the number of complex molecules present in the sample.
  • Said signal which we can also refer to as an intensity signal, can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of the complex.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component (for example, a component other than the complex) or a biological measurement system (for example, the measurement of cellular responses, ligands, "tags” or enzymatic reaction products).
  • Quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative amount of complex formed by ephrin B2 and the polypeptide of the first aspect of the invention as well as any other value or parameter related to the complex, or which I can derive from it.
  • Said values or parameters comprise values of signal intensity obtained from any of the physical or chemical properties of the complex, obtained by direct measurement, for example, intensity values of mass spectroscopy or nuclear magnetic resonance. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement.
  • the detection as understood by one skilled in the art, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly.
  • the amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools, for example, but not limited, by determining confidence intervals, determining the p-value, Student's test or discriminant functions of Fisher
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention allows the disease to be correctly detected in at least 60%, in at least 70%, in at least 80%, or in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • compare refers to, but is not limited to, the comparison of the amount of complex formed by ephrin B2 and the polypeptide of the first aspect of the invention of the biological sample. to be analyzed, also called a biological sample problem, with a complex amount of a reference sample, which is called a control.
  • the reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively together with the problem biological sample. The comparison can be done manually or assisted by computer.
  • a sixth aspect of the present invention relates to the use of the polypeptide of the first aspect of the invention to prepare a medicament.
  • the medicament is used to inhibit angiogenesis.
  • it is used for the prophylactic or therapeutic treatment of a pathological condition associated with angiogenesis.
  • a pathological condition associated with angiogenesis can be any neoplasia, as well as other non-neoplastic diseases, such as, but not limited to, those described in WO2007 / 127506.
  • the tumor or cancer is solid.
  • the cancer is from the pancreas, colon or lung.
  • a tumor or cancer is said to be solid when it is a mass of tissue that does not contain cavities or fluid. Depending on the cell type, solid tumors receive different names, such as sarcoma, carcinoma or lymphoma.
  • a seventh aspect of the invention relates to a composition
  • a composition comprising the polypeptide of the first aspect of the invention, the nucleic acid or the vector of the second aspect of the invention, or the cell of the third aspect of the invention.
  • the composition is a pharmaceutical composition.
  • it is characterized in that it further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the excipient must be pharmacologically acceptable.
  • excipient is a component of a pharmaceutical composition that is not an active compound but a diluent, a vehicle or a filler, among others, which is considered “pharmaceutically acceptable” when it is safe, non-toxic and has no adverse effects.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the compound, stabilizes it or helps the preparation of the drug in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered. Furthermore, the excipient must be pharmaceutically suitable, that is, it must allow the activity of the compounds of the pharmaceutical composition, that is, it must be compatible with said components.
  • the "vehicle” or carrier is preferably an inert substance.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition. Therefore, the carrier is a substance that is used in the medicament to dilute any of the components of the pharmaceutical composition of the present invention to a certain volume or weight; or that even without diluting said components it is capable of allowing a better dosage and administration or giving consistency and form to the medicine.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
  • the pharmaceutical composition further comprises another active substance.
  • another active substance is any matter, whatever its human, animal, plant, chemical or other origin to which an appropriate activity is attributed to constitute a medicine.
  • the pharmaceutical composition further comprises an antiangiogenic agent.
  • a Antiangiogenic agent is a molecule capable of inhibiting angiogenesis, vasculogenesis or undesirable vascular permeability, directly or indirectly.
  • antiangiogenic agents are those molecules capable of blocking an angiogenic agent, such as antibodies against VEGF, against the VEGF receptor or small molecules that block the VEGF pathway, all of them well described and known.
  • the pharmaceutical composition further comprises a chemotherapeutic agent.
  • a chemotherapeutic agent is a compound useful in the treatment of cancer.
  • chemotherapeutic drugs are cytotoxic compounds such as anthracyclines, daunorubicin, adriamycin, derivatives of docetaxel, vinca alkaloids, vincristine, carmustine, cisplatin, fluorouracils, cytostatic compounds such as polyamine, tamoxifen, prodasone or sandostatin inhibitors, or compounds that induce sandostatin, or compounds that induce apoptosis such as sodium butyrate or mitomycin C, antibiotics such as penicillins, betalactamines, cephalosporins, cyclines, aminoglycosides, macrolides or sulfonamides, or anitivirals such as AZT, protease inhibitors or acyclovir, retrovir or foscarnet
  • cytotoxic compounds such as anth
  • An eighth aspect of the invention relates to the use of the composition of the seventh aspect of the invention to prepare a medicament.
  • the medicament is used to inhibit angiogenesis.
  • the prophylactic or therapeutic treatment of a pathological condition associated with angiogenesis More preferably, for the prophylactic or therapeutic treatment of a tumor or cancer.
  • the tumor or cancer is solid.
  • the cancer is from the pancreas, colon or lung.
  • a therapeutically effective amount is administered.
  • the term "therapeutically effective amount" refers to an amount that, administered in doses and during the necessary period of time, it is effective in achieving the desired prophylactic or therapeutic result.
  • a “therapeutically effective amount” of the polypeptide or pharmaceutical composition of the invention may vary with the stage of the disease, age, sex and weight of the individual, and refers to an amount that has no adverse effects or toxicity and is capable to achieve the desired prophylactic or therapeutic effect.
  • An "individual” is a vertebrate.
  • the vertebrate is a mammal. More preferably, the mammal is a human. Mammals include, but are not limited to, farm animals (such as cows), animals that participate in sports, pets (such as cats, dogs and horses), primates, mice and rats.
  • the composition of the present invention can be presented in the form of solutions or any other form of clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as tablet, capsule, powder, granule, ointment, solution, suppository, injection, inhalant, gel, microsphere or aerosol.
  • the pharmaceutical composition is presented in a form adapted to oral or parenteral administration.
  • the form adapted to oral administration refers to a physical state that can allow oral administration. Said form adapted to oral administration is selected from the list comprising, but not limited to, drops, syrup, herbal tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, seal, pill, tablet, tablet, tablet or lyophilized.
  • the form adapted to parenteral administration refers to a physical state that can allow its injectable administration, that is, preferably in a liquid state. Parenteral administration can be carried out via intramuscular, intraarterial, intravenous, intradermal, subcutaneous or intraosseous administration but not limited to these types of parenteral administration routes. Another possibility is that the pharmaceutical composition is presented in a form adapted to sublingual, nasal, intrathecal, bronchial, lymphatic administration, rectal, transdermal or inhaled.
  • Fig. 1 Expression of the clones selected in E. coli. Analysis by electrophoresis in acrylamide gels (SDS-PAGE) and Coomassie blue staining of the expression of scFvs selected against ephrin B2 (clones 2B1, A1, B11 and E4) in E. coli (Total extract) and of the corresponding periplasmic fraction isolated by mild osmotic shock (Periplasma). Molecular weights are indicated to the left of the figure in kDa.
  • Clones B11 and 2B1 are purified in larger quantities. Analysis of the purifications of scphvs A1, B1 1, E4 and 2B1 specific to ephrin B2 by electrophoresis in acrylamide gels (SDS-PAGE) and staining with Coomassie blue. The scFvs present in the respective periplasmic extracts were purified by immobilized Ni 2+ affinity chromatography. The different elution fractions of the chromatographs of each scFv are shown in the figure. Molecular weights are indicated in kDa. Fig. 3. Clones B11 and 2B1 are more specific.
  • the sensograms represent the response against time (s) in those corresponding to the binding curves of clone B1 1 (A) to immobilized ephrin B2 using four different concentrations (0.4; 0.2; 0.1; 0.05 ⁇ ) and of clone 2B1 (B) at concentrations of 30, 20, 10 and 7.5 ⁇ , from which the respective affinity constants (K D ) were calculated, where K D is 110 nM for clone B1 1 and 630 nM for clone 2B1.
  • Fig. 5 Study of the blockade of the binding of ephrin B2 to Eph B4.
  • A. Graph showing the percentage of binding of ephrin B2 to Eph B4.
  • Serial dilutions of scFv B11 ( ⁇ ) or 2B1 (o) were mixed with ephrin B2 and injected onto Eph B4 immobilized on a chip.
  • the relative amount of Ephrin B2 bound to EphB4 was measured immediately after the injection of each sample and plotted as a function of scFv concentration.
  • B. The scFv B1 1 is able to block the interaction between ephrinB2 and its EphB4 receptor in a cellular assay. Analysis of phosphorylation of Eph B4 receptor tyrosines in HUVEC cells in response to stimulation with ephrin B2 overexpressed on the surface of HEK293 cells. HUVEC cells and HEK293 cells that overexpress ephrinB2 were cocultured for 20 minutes in the presence or absence of the scFv anti-ephrinB2.
  • VEGF was used as a positive control.
  • the graph shows the quantification of tubule formation.
  • Each treatment was repeated at least three times and the corresponding values (mean +/- standard deviation) are represented as the percentage of tubules formed in the presence of the antibodies tested with respect to the control without any treatment.
  • * p ⁇ 0.0001.
  • Fig. 7 Analysis of the inhibition of lateral cell migration by wound healing tests in vitro.
  • HUVEC cells were grown to confluence and a wound was made in the cell monolayer. The cells were then incubated in serum-free medium in the absence (control) or in the presence of VEGF as a migration stimulus. Lateral migration of the cells was monitored for 24 hours in the presence of the anti-ephrin B2, B1 1 or 2B1 scFv, or an irrelevant scFv as a negative control.
  • the figure shows representative micrographs (4x magnification) after 24 hours of the wound area where the initial area without cells at time 0 has been marked with dashed lines. The graph quantifies cell migration at 24 hours.
  • A. Microg representative raffias (40x magnification) of histological sections of the corresponding implants removed after 6 days and stained with the CD34 endothelial cell marker.
  • B The graphs show the percentage of positive area for the CD34 marker (left panel) and the relative variation of the hemoglobin content in the implants with respect to the control implant without VEGF (right panel).
  • Fig. 9 Tumor growth inhibition in xenotransplanted mice with pancreatic carcinoma cells (BxPC3) and treated with B11 or 2B1.
  • Fig. 10 Histopathological analysis of xenotransplanted tumors of pancreatic carcinoma cells (BxPC3) and treated with B11 or 2B1. The analysis was performed 38 days after implantation and 1 day after the last dose of antibody. The tumors were fixed with formalin and embedded in paraffin to subsequently perform the corresponding immunohistochemical staining.
  • B11 is able to inhibit tumor growth in xenotransplanted mice with colon carcinoma cells (SW620) (A) and lung carcinoma cells (H460) (B).
  • the graphs show the means of the tumor volumes (upper panels) and the means of the fluorescence intensities (lower panels) together with the deviations standard at each point of the groups treated with 20 mg / kg of B1 1 and of the untreated control groups.
  • Fig. 12 Analysis of the biodistribution of B11 and 2B1 and location of the tumor masses.
  • Nu / nu nude mice were xenotransplanted with H460 lung carcinoma cells that stably express the fluorescent protein mCherry. When the tumor reached a size detectable both macroscopically and by fluorescence intensity at 610 nm, the corresponding scFv conjugated to the fluorochrome AlexaFluor®750 were administered intravenously.
  • A Images of the dorsal regions at 0.5; 2; 6; 24 and 48 hours after administration of scFv. The location of the tumors is indicated by an arrow.
  • B Fluorescence intensity at 750 nm of tumors removed 6 and 48 hours after administration of scFv B1 1 and 2B1 labeled with AlexaFluor®750 and the negative control (C-) treated with PBS.
  • the invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which demonstrates the specificity of the antibody against the ephrin B2 of the invention, as well as its effectiveness in inhibiting the formation of new blood and lymphatic vessels.
  • EXAMPLE 1 Identification and characterization of new human antibodies against ephrin B2.
  • telomeres were subcloned into pET28b vectors under the T7 RNA polymerase promoter in order to provide the fragments with a histidine tail to facilitate purification by affinity chromatography.
  • Recombinant vectors were generated and transformed into the E. coli BL21 line (DE3) to subsequently induce their expression with IPTG.
  • the periplasmic fraction was prepared by mild osmotic shock and the presence of scFv was analyzed by SDS-PAGE (Fig. 1).
  • the scFv present in the periplasmic fractions were purified by nickel affinity chromatography, followed by a change of buffer to PBS by gel filtration (Fig. 2).
  • the phage surface protein display technology was used (in English, Phage display) with a human antibody library from non-immunized individuals of 1.5 x 10 scFv.
  • the first round of immunoselection (in English, panning) was performed with the extracellular region of ephrin B2 fused to the Fe domain of human IgG, expressed and purified in mammalian cells, as an immobilized antigen on ELISA plates (linked immunoadsorption assay to enzymes, from English, "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay", Maxisorp, Nunc) at a rate of 1 ⁇ g / well for 16 hours at 4 o C in PBS (Phosphate Buffer Saline).
  • a blocking step was carried out with 2% milk in PBS for 2 hours at 37 ° C, followed by incubation of the library for 2 hours at 37 ° C.
  • the phages not specifically bound they were removed by successive washes with PBS-0.1% Tween, while antigen specific phages were eluted with 100 ⁇ trypsin.
  • Escherichia coli cells of strain TG1 (MRC Geneservices) in exponential growth (Optical density at a wavelength of 600 nm (DOeoo) of 0.4) were infected for 30 minutes at 37 ° C with eluted phages.
  • Infected bacteria were seeded on TYE plates (of tryptone and yeast extract, from English, "Tryptone, Yeast Extracf) supplemented with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 1% (v / v) glucose and allowed to grow for 16 hours at 37 ° C.
  • the bacteria were collected from the plates with 2xTY medium (16 g / l of tryptone, 10 g / l of yeast extract and 5 g / l of NaCI) supplemented with 15% glycerol and 50 ⁇ of the bacteria collected were diluted in 50 ml of 2xTY culture medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 1% glucose; the cultures were incubated until they reached the exponential phase and the cells were infected with 2.5 x 10 1 1 phage helper KM13 (MRC Geneservices) After 30 minutes of incubation at 37 ° C, the cultures were centrifuged, the precipitates were resuspended in the same volume of medium 2xTY supplemented with 100 ⁇ 9 / ⁇ of ampicillin, 50 ⁇ 9 / ⁇ of kanamycin and 0.1% glucose and were grown overnight at 30 ° C.
  • 2xTY medium 16 g / l of tryptone, 10 g / l of yeast extract and 5 g
  • the phages of each round of selection were precipitated from the culture medium. For this, the cultures were centrifuged at 3,300 x g for 15 minutes and 10 ml of PEG (polyethylene glycol) / NaCl were added to 40 ml of supernatant and left 1 hour on ice. They were centrifuged at 3,300 x g for 30 minutes and the supernatants were discarded. The precipitates were resuspended in 2 ml of PBS and centrifuged at 11,600 x g for 10 minutes. Supernatants were recovered and phages were used for the next round of selection, similar to the one described above, with the particularity that decreasing amounts of antigen were used to improve antibody affinity. The phages united in this second round were amplified and returned to undergo a third round of selection to achieve an enrichment of those carrying a scFv reactive against the ephrin B2.
  • Phage ELISAs were performed to assess the degree of enrichment in specific phages of ephrin B2, resulting from each round of selection.
  • Flexible ELISA plates (Falcon, BD Biosciences) were upholstered with 0.3 ⁇ g of ephrin B2-Fc and an irrelevant protein as a negative control, in PBS at 4 o C for 16 hours. After several washes with PBS, the plates were blocked with 2% milk in PBS for 2 hours at room temperature, followed by incubation with the different dilutions of the phages of each round of selection in PBS-2% milk for 1 hour. at room temperature.
  • the affinity constants of the antibodies to ephrin B2 were determined by means of the surface plasmon resonance technique in a Biacore X, with the extracellular region of immobilized ephrin B2 and different dilutions of the purified scFv.
  • Clone B1 1 had the highest affinity constant, this being 1 10 nM, while the affinity of clone 2B1 was lower, 630 mM (Fig. 4).
  • the ability of the antibodies to compete in the binding of ephrin B2 to its natural receptor Eph B4 was analyzed with the same technique.
  • Eph B4-Fe was immobilized on a chip and the binding of ephrin B2 was measured in the presence of different concentrations of B11 or 2B1.
  • the presence of B1 1 blocks the binding of ephrin B2 to Eph B4 in a manner dependent on its concentration, with an IC50 of 0.3 ⁇ (Fig. 5), indicating that B11 competes for the same binding site as the Eph receptor B4
  • the 2B1 antibody does not have a blocking effect (Fig. 5).
  • the coding sequences of the positive scFv were amplified by PCR using pelBForward oligonucleotides or primers (SEQ ID NO: 2) 5'-CATAATGAAATACCTATTGCCTA-3 ' and cmycReverse (SEQ ID NO: 3) 5 ' - CTTATTAGCGTTTGCCATT-3 '.
  • PCR products were treated with Exol (USB) enzymes, to remove unused oligonucleotides, and SAP (USB), to remove leftover dNTPs, at 37 ° C for 30 minutes and 80 ° C for 15 minutes, and said products were sequenced with both oligonucleotides. Once the sequences were obtained, they were compared to each other to determine the number of single sequence clones using the ClustalW program and the ExPAS and Proteomics server translation tool.
  • scFv selected with a histidine tail that facilitates its purification they were cloned into the vector pET28b (Novagen).
  • ScFvs were amplified by PCR using primers pET28-scFvMehta 5 '(SEQ ID NO: 4) 5OAGTCATCATGAAATACCTATTGCCTAC3' and pET28-scFvMehta3 '(SEQ ID NO: 5) 5OACCGGACTCGAGTGCGGCCCCATTCAG3' including two sites Real restriction and XhoI, respectively, for its subsequent cloning in the vector pET28b, previously digested with Ncol, site compatible with Real and Xhol.
  • the digested insert and vector ligation was carried out by incubation overnight at 16 ° C with the enzyme T4 Ligasa (Roche) putting a molar ratio insert: vector 3: 1.
  • Competent E. coli cells of the strain DH5a library (Invitrogen) were transformed by heat shock and selected on LB-Agar plates ("Lysogeny Broth") with 50 ⁇ g / ml kanamycin. A positive colony of each construction was inoculated in LB supplemented with kanamycin and grown at 37 ° C overnight.
  • Recombinant vectors were purified with the Wizard kit (Promega) and the sequence was verified by DNA sequencing. Expression and purification of scFv
  • Competent E. coli cells of strain BL21 (DE3) were transformed with recombinant plasmids pET28 by thermal shock. Bacteria transformed into LB plates with 50 ⁇ 9 / ⁇ kanamycin were selected.
  • the expression of scFv was carried out by induction with IPTG (isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) at a final concentration of 1 mM when the ⁇ of the cultures was 0.6.
  • Expression levels of scFv were analyzed by polyacrylamide-SDS gels (sodium dodecyl sulfate) followed by Coomassie bright blue staining.
  • a lysis of the outer wall of the bacterium was performed by gentle osmotic shock, resuspending the cells in 1/50 volumes of TES buffer (200 mM Tris-HCI pH 8 , 0.5 mM EDTA, 0.5 M Sucrose) supplemented with 20 ⁇ g / ml of benzamidine (Sigma) and 10 ⁇ g / ml of soy trypsin inhibitor (Sigma) and subsequently diluted 1.5 times in 0.2 x TES buffer.
  • TES buffer 200 mM Tris-HCI pH 8 , 0.5 mM EDTA, 0.5 M Sucrose
  • the lysates were left 30 minutes on ice, centrifuged at 16,250 xg for 10 minutes and the supernatants containing the periplasmic fraction were collected. Purification of scFv was carried out by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) using Ni 2+ HisTrap columns (GE Healthcare) followed by desalting on a HiPrep 26/10 gel desalting gel filtration column (GE Healthcare ) coupled in tandem on an ⁇ KTAxpress device.
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • GE Healthcare Ni 2+ HisTrap columns
  • HiPrep 26/10 gel desalting gel filtration column GE Healthcare
  • As equilibration buffer of the affinity column 20 mM sodium phosphate pH 7.4, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole was used, and as elution buffer, the same as equilibration buffer with a concentration of 0.3 imidazole M. This buffer was exchanged for PBS in gel filtration.
  • mice ephrin B1-Fc, mouse ephrin B2-Fc and human ephrin B3-Fc (R&D) proteins were electrophoretically separated into gels of 10% polyacrylamide-SDS and transferred to nitrocellulose membranes (GE Healthcare). After blocking the membranes with PBS-3% semi-skimmed milk powder for 1 hour, they were incubated with the periplasmic fractions diluted 1: 5 in PBS-3% milk powder for 16 hours at 4 o C.
  • Ephrin B2-Fc covalently bound to the surface of the CM5 chip (GE Healthcare) after activation of the carboxyl groups of the dextran matrix of the chip with 0.4 M EDC (1-ethyl-3 - (- dimethylaminopropyl) -carbodiimide ) and 0.1 M NHS (N-hydroxysuccinimide) in a 1: 1 ratio for 7 minutes at a flow rate of 10 ⁇ / minute.
  • the ephrin B2-Fc protein was diluted to 10 ⁇ g / ml in 10 mM sodium acetate at pH 4 and 30 ⁇ of this solution was passed over the chip surface at a flow of 10 ⁇ / minute in HBS-EP buffer (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20) (GE Healthcare). Excess activated ester groups were blocked by injecting 1 M ethanolamine at pH 8.5 at a flow of 10 ⁇ / minute for 7 minutes. Through this protocol, approximately 2,000 response units (RU) of ephrin B2 were immobilized.
  • HBS-EP buffer 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20
  • Excess activated ester groups were blocked by injecting 1 M ethanolamine at pH 8.5 at a flow of 10 ⁇ / minute for 7 minutes. Through this protocol, approximately 2,000
  • Eph B4 soluble was conjugated to a CM5 chip (GE Healthcare) using the same protocol described above. Serial dilutions of each scFv were mixed with a constant concentration (0.2 ⁇ ) of ephrin B2-Fc in HBS-EP buffer and 30 ⁇ of each mixture was injected at a flow of 20 ⁇ / minute on the Eph B4 coated chip . The relative amount of Ephrin B2 bound to Eph B4 was plotted as a function of the corresponding antibody concentration.
  • HEK-293 cells grown with RPM1 medium (Sigma) supplemented with 5% fetal bovine serum were transfected with the plasmid pcDNA3-ephrin B2.
  • a mixture was prepared with 20 ⁇ g of pcDNA3-ephrinB2 and 60 ⁇ of FUGENE transfection reagent (Roche) in 1 ml of OPTIMEM medium (Invitrogen) and incubated 30 minutes at room temperature.
  • the cell monolayer was washed several times with serum-free OPTIMEM (Invitrogen) medium and the DNA-FUGENE mixture was added.
  • the cells were lysed with lysis buffer (100 mM Tris HCI pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.5% Triton X100) supplemented with protease inhibitor cocktails (Roche) and phosphatases (Sigma).
  • the lysate was centrifuged 25 minutes at 16,000xg, 4 o C and then, the supernatant was incubated for 2 hours at 4 o C with a preformed complex for 16 hours at 4 o C by a specific antibody against Eph B4 (R&D) and Protein G coupled to Sepharose (GE Healthcare).
  • the immunocomplex was washed twice with lysis buffer and electrophoresis in 7.5% polyacrylamide SDS-PAGE gels was performed.
  • Eph B4 The detection of phosphorylated Eph B4 was performed by immunoblot. For this, proteins immunoprecipitated by the anti-Eph B4 antibody and separated by electrophoresis were transferred to a Hybond-C nitrocellulose membrane (GE Healthcare) and blocked with PBS supplemented with 0.05% Tween-20 (Sigma) and Phosphoblocker® blocking agent (Cell BioLabs, Inc) at 3% for 1 hour at room temperature. Next, the membrane was incubated with the 4G10 monoclonal antibody to peroxidase-conjugated anti-phosphotyrosine (Millipore) diluted 1: 2,000 for 16 hours at 4 o C.
  • 4G10 monoclonal antibody to peroxidase-conjugated anti-phosphotyrosine (Millipore) diluted 1: 2,000 for 16 hours at 4 o C.
  • the visualization was performed by chemiluminescence detection with SuperSignal® West Femto Substrate (Thermo Scientific).
  • SuperSignal® West Femto Substrate Thermo Scientific.
  • the same membrane was regenerated with the ReBlot Plus Strong (Chemicon) agent for 15 minutes at room temperature and incubated with the anti-Eph B4 (R&D) antibody diluted 1: 1 .000 in PBS, with 0.05% Tween-20 and 5% semi-skimmed milk for 16 hours at 4 o C.
  • the membrane was incubated with a conjugated anti-goat antibody (1: 5,000) with peroxidase (Dako) for 2 hours at room temperature and the bands were visualized with ECL Plus reagent (GE Healthcare).
  • EXAMPLE 2 Antiangiogenic activity of antibodies B11 and 2B1 in HUVEC cells in vitro.
  • HUVEC cells human umbilical vein endothelial cells, from English "Human Umbilical Vein Endothelial Cells"
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • antibodies B1 1 and 2B1 and especially the first one, specific against ephrin B2, have antiangiogenic capacity and are capable of inhibiting the migration of endothelial cells in vitro.
  • EXAMPLE 3 Effect of antibodies B11 and 2B1 on the vascularization of Matrigel implants in vivo.
  • Implants without VEGF were used as negative controls in which no vascularization developed (Fig. 8A).
  • implants with VEGF and implants with VEGF and treated with an irrelevant scFv presented a prominent vascularization, considering the positive controls of the experiment.
  • Animals treated with the B1 1 antibody showed minimal vascularization, 95% lower than in the positive controls, comparable to that presented by animals implanted with Matrigel without growth factor, which is reflected in an absence of Endothelial cells positive for CD34 and hemoglobin in implants (Fig. 8B).
  • the group of mice treated with the 2B1 antibody showed a 50% inhibition in vessel formation with respect to the positive controls.
  • mice Nuymic nude mice 4 to 6 weeks old (Charles River) were used.
  • mice anesthetized with 2% isofluorane were injected with 200 ⁇ of Matrigel (BD Biosciences).
  • Another group of animals was injected with 200 ⁇ of Matrigel supplemented with 50 ng / ml of VEGF and 375 ⁇ g / ml of heparin (Sigma) in the upper abdominal area.
  • treatment with scFv is initiated intravenously on alternate days, until a total dose of 300 ⁇ g / mouse is reached.
  • the implants were removed and the formation of new vessels was determined based on the concentration of hemoglobin present and in histological sections stained with anti-CD34, blood vessel marker.
  • a portion of each Matrigel implant was taken, weighed and homogenized in 300 ⁇ of distilled water. After centrifugation at 16,000 x g for 5 minutes, 100 ⁇ of the supernatant was taken and diluted 1: 1 with TMB substrate (3, 3 ', 5-5'-tetramethylbenzidine) (Sigma). After 15 minutes, the colorimetric reaction was assessed by measuring the optical density at 650 nm. Finally, the values were normalized against the weight of the implant.
  • EXAMPLE 4 B11 and 2B1 antibodies inhibit the growth of human tumors in nude mice.
  • BxPC3 cells were implanted subcutaneously to 2 groups of 8 mice and once the presence of tumor masses was detected macroscopically, intravenous treatment with B1 1 and 2B1 was initiated every other day until the 20 mg / kg dose or with PBS was completed.
  • a negative control 60 days after the implantation of the tumor cells, it was observed that the group of mice treated with the B1 1 antibody exhibited a very significant reduction in tumor size, specifically 70% growth inhibition compared to the average tumor size of the tumors.
  • control group Fig. 9
  • Mice treated with 2B1 showed a moderate reduction in tumor growth, around 35%.
  • Ki67 proliferation marker With respect to the Ki67 proliferation marker, no representative differences were observed between the tumors of treated animals and the controls, presenting about 30% of Ki67 positive cells in the three groups.
  • lymphatic vessels were analyzed using the Lyvel marker; in those tumors treated with B11 the almost complete absence of lymphatic vessels was observed. In tumors treated with 2B1, a significant decrease in the number of lymphatic vessels was also observed, although not as drastically as in the case of B11.
  • the anti-angiogenic, antilinfoangiogenic and tumor growth inhibitory capacity of the B11 antibody in other xenograft models was studied following the same procedure described above.
  • a 90% reduction in tumor size was observed after 23 days after implantation (Fig. 1 1A), while the reduction in the case of lung cells it was 65% (Fig. 11 B).
  • This reduction in the respective sizes was corroborated with a similar decrease in the fluorescence emissions of the mCherry protein, present in the tumor cells.
  • Immunohistochemical analyzes confirmed the decrease in the number of vessels blood and the absence of lymphatic vessels in tumors treated with B1 1, as had been observed in the pancreatic carcinoma cell model.
  • the B1 1 antibody specific for ephrin B2 has a potent antiangiogenic and antilinfoangiogenic capacity, which would result in a decrease or retardation in the growth of those tumors treated with the antibody.
  • the 2B1 antibody also has a good antiangiogenic and antilinfangiogenic capacity.
  • xenotransplants were performed: with carcinoma cells of the pancreas (BxPC3), colon (SW620, stably expressing the fluorescent protein mCherry (Clontech)) and lung (H460, stably expressing the fluorescent protein mCherry).
  • BxPC3 pancreas
  • SW620 stably expressing the fluorescent protein mCherry
  • H460 stably expressing the fluorescent protein mCherry
  • 1 to 5 million human tumor cells were injected subcutaneously in a volume of 0.2 ml of PBS on the flank of immunodeficient mice (nude or SCID) from the English "Severe Combined Immunodeficiency") until macroscopically observing the presence of a neoplastic mass (about 30 mm 3 ).
  • the treatment was initiated by intravenous administration, through the tail veins, of the corresponding antibodies in 100-200 ⁇ of PBS on alternate days for 2 weeks or until reaching the final dose of 20 mg / kg.
  • Control animals received PBS following the same guidelines. Tumor sizes were measured 2-3 times per week and, in the case of xenotransplanted mice with cells labeled with fluorescent protein mCherry, the fluorescence emission intensity was also measured (number of photons per second and centimeter square) at 610 nm in an IVIS Spectrum 200 imaging system (Caliper LifeSciences) to visualize tumor growth based on the emission intensity of the mCherry protein.
  • the final processing of the images includes a subtraction of the signal residual (elimination of autofluorescence) and a color scale following a signal intensity profile.
  • the animals were sacrificed by asphyxiation with CO2 when the neoplasm reached a predetermined size of 1,500-2,000 mm 3 , in accordance with current legislation regarding the use of experimental animals.
  • Statistical analysis of tumor growth measures was performed by parametric analysis using the t-Student test. The level of statistical significance was p ⁇ 0.05.
  • Tumor samples from xenotransplanted mice were extracted from animals slaughtered one day after the end of the antibody treatment. Said samples were fixed with formalin and embedded in paraffin. Histological sections from each tumor were stained with hematoxylin and eosin or prepared for immunohistochemical characterization.
  • the proliferative activity of the tumor cells was analyzed by staining with a rabbit anti-K ⁇ 67 monoclonal antibody (DAKO), the presence of apoptotic cells was detected with an active rabbit anti-caspase 3 polyclonal antibody (R&D), the new Vascularization was measured by staining against CD34 in endothelial cells with a specific rat monoclonal antibody (Abcam) and the lymphatic vessels were labeled by staining with a rabbit polyclonal antibody anti-LYVE1 (Abcam).
  • the visualization of all the cuts was carried out with 3,3-diaminobenzidine plus tetrahydrochloride (DAKO) and they were counterstained with hematoxylin. Positive cells were counted by the AxioVision (Zeiss) system.
  • EXAMPLE 5 Biodistribution and localization of tumor masses in vivo.
  • mice xenostransplanted with a tumor line in this case H460 lung carcinoma
  • mice xenostransplanted with a tumor line in this case H460 lung carcinoma
  • an AlexaFluor®750 fluorochrome Molecular Probes
  • cells expressing the fluorescent protein mCherry were used.
  • nude nude mice nu / nu H460 cells were implanted subcutaneously in the dorsal region. When the tumors reached an approximate volume of 0.3 cm 3 , 15 ⁇ g of the antibody conjugated to AlexaFluor®750 was administered intravenously.
  • the animals showed a fluorescence signal during the first hours in the upper ventral region, attributable to a certain degree of elimination of antibodies by hepatobiliary route, this fact was demonstrated when the organs were analyzed separately and it was verified that the liver at 6 hours it showed a fluorescence of about 1 x 10 8 p / s / cm 2 / sr (photons / second / square centimeter / esterdian).
  • mice xenotransplanted with the H460 lung carcinoma line were used stably expressing the fluorescent protein mCherry.
  • the use of cells with fluorescent markers was performed to unequivocally locate the tumor.
  • 5 x 10 6 cells were injected subcutaneously and allowed to grow until the Neoplastic mass reached a size around 500 mm 3 .
  • the scFvs were conjugated to the AlexaFluor®750 fluorochrome by means of the SAIVI TM Rapid Antibody Labeling Kit (Invitrogen) following the manufacturer's instructions. Once the tumors reached the expected size, 15 ⁇ g of labeled antibody was injected intravenously into each mouse.
  • Fluorescence images in vivo were taken at 0.5, 2, 6, 24 and 48 hours after administration of scFv labeled with an IVIS Spectrum 200 (Caliper LifeSciences) in vivo imaging system by exciting the fluorochrome at 749 nm. After eliminating the autofluorescence, we proceeded to color scale following a signal intensity profile.

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Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo contra ephrin B2 y a su uso para detectar dicha proteína y como medicamento para inhibir la angiogénesis y la linfoangiogénesis, en el tratamiento de enfermedades en las que estos procesos están implicados como, por ejemplo, el cáncer.

Description

ANTICUERPO CONTRA EPHRIN B2 Y SU USO
La presente invención pertenece al campo de la Biotecnología y la Biomedicina, y se refiere a un nuevo anticuerpo específico contra ephrin B2, capaz de bloquear la formación de vasos sanguíneos (angiogénesis) y linfáticos (linfoangiogénesis). Además, la presente invención se refiere al uso de dicho anticuerpo, por ejemplo, para la preparación de un medicamento.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La angiogénesis o formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de preexistentes desempeña un papel fundamental en numerosos procesos fisiológicos durante el desarrollo embrionario y en la vida postnatal: reproducción, cicatrización e inflamación. Aunque los mecanismos moleculares responsables de la transición de una célula endotelial hacia un fenotipo angiogénico no son completamente conocidos, se trata de un proceso complejo que implica la proliferación, migración y ensamblaje de células endoteliales, seguido por el reclutamiento de otras células perivasculares como pericitos o células musculares y de la remodelación de la matriz extracelular (Risau, W. Nature 1997; 386:671 -674). El crecimiento incontrolado de los vasos sanguíneos es un trastorno subyacente en numerosas patologías como artritis reumatoide o retinopatía diabética y, sobre todo en procesos neoplásicos. El crecimiento tumoral va a depender del constante aporte de oxígeno y nutrientes a través de la constitución de una red de nuevos vasos sanguíneos, de tal manera que en ausencia de la vascularización adecuada, las células sufren un proceso de necrosis y/o apoptosis que inhibe o modera el incremento del volumen tumoral.
Además de vasos sanguíneos, el sistema circulatorio de los vertebrados está constituido por vasos linfáticos que también juegan un papel crítico durante el desarrollo del organismo y en procesos patológicos. El sistema linfático drena el líquido intersticial de los tejidos y lo reincorpora al sistema sanguíneo; además, absorbe lípidos del sistema digestivo, forma parte de la defensa inmune del individuo transportando células del sistema inmune, por ejemplo en inflamación, y en condiciones patológicas induce diferentes tipos de linfedema, enfermedades inflamatorias y participa en la invasión y metástasis de carcinomas (Tammela, T. y Alitalo, K. Cell 2010; 140:460-76). El estudio de la linfangiogénesis o formación de vasos linfáticos a partir de preexistentes permaneció postergado durante muchas décadas y no es hasta los últimos años cuando se han descrito mecanismos biomoleculares y marcadores específicos, los cuales se están utilizando actualmente para estudiar el proceso de diseminación tumoral y metástasis.
Durante el desarrollo embrionario, los vasos sanguíneos se originan a partir de precursores endoteliales derivados del mesodermo en un proceso llamado vasculogénesis, mientras que la formación de los vasos linfáticos parece iniciarse a partir de un conjunto de células endoteliales venosas en la región yugular y perimesonéfrica. Dado que su origen embrionario es común, ambos sistemas vasculares comparten mecanismos moleculares similares que regulan su desarrollo y maduración. Se han identificado varias vías de señalización en las que receptores tirosin quinasas juegan un papel muy importante en estos mecanismos de formación del sistema cardiovascular, en concreto, la vía de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a través de sus correspondientes receptores (VEGFR) en cooperación con la actividad de receptores de Tie-1 y Tie-2 regulados por angiopoyetinas (Thurston, G. Cell Tissue Res. 2003; 314:61 -68). Además, se ha demostrado que otro grupo de moléculas, las ephrins (acrónimo del inglés "erythropoietin producing hepatoma receptor interactors"), junto con sus correspondientes receptores (Eph), también está implicado en el remodelado del sistema vascular sanguíneo (Adams, RH y Klein, R. Trends Cardiovasc Med. 2000; 10: 183-188) y linfático (Mákinen, T et al. Genes Dev. 2005; 19:397-410). Esta familia comprende el mayor grupo de tirosin quinasas conocido, con 14 receptores y 8 ligandos, y se subdivide en dos categorías de receptores, Eph A y Eph B, en base a la homología de su secuencia y a las propiedades de unión a los correspondientes ligandos. Los receptores EphA se unen a los ligandos del subgrupo ephrin A, caracterizados por estar anclados a la membrana a través de una molécula de glicosilfosfatidilinositol (GPI), mientras que los receptores Eph B se unen a ligandos del subgrupo ephrin B, que se encuentran anclados a la membrana a través de una región transmembrana seguida por un dominio citoplásmico. Se ha descrito que las arterias expresan el ligando transmembrana ephrin B2 y las venas expresan el receptor Eph B4 (Adams, RH y Alitalo K. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 464-478). Este grupo de moléculas son las responsables de la regulación de diversas funciones celulares como la morfología, migración, repulsión, adhesión e invasión celular modificando la organización del citoesqueleto e influenciando las actividades de integrinas y otras moléculas de adhesión intracelulares (Pasquale, EB. Cell 2008; 133:38-52). Estas actividades dependen de la interacción de los receptores Eph expresados en una célula con la correspondiente ephrin expresada en otra, generando señales bidireccionales que afectan a cada una de las células implicadas. La señalización procedente del receptor Eph se denomina "directa", (del inglés "forward") y depende del dominio tirosin quinasa presente en su región citoplásmica, el cual tiene capacidad de autofosforilarse y fosforilar a otras proteínas, y de la asociación del receptor con otras moléculas efectoras. Por su parte, el ligando ephrin B genera otra señalización denominada "inversa" (del inglés "reverse") dependiente por un lado de la fosforilación de varias tirosinas presentes en su región citoplásmica, llevada a cabo por quinasas de la familia Src y otros receptores tirosin quinasa, y, por otro lado, de otras proteínas asociadas. Además, la mayoría de los receptores Eph y las ephrins B presentan un sitio de unión a dominios PDZ en sus regiones citoplásmicas que es importante para realizar las funciones fisiológicas, particularmente de las ephrins B (Mákinen, T et al. Genes Dev. 2005; 19:397-410).
Estudios de inactivación de los genes que codifican para el Eph B4 y para la ephrin B2 en ratones transgénicos sugieren un papel fundamental de ambas proteínas en el desarrollo del sistema vascular. Ratones deficientes para estos genes presentan una angiogénesis alterada que es letal en estado embrionario (Wang, HU et al. Cell 1998; 93:741 -753; Adams, RH et al. Genes Dev. 1999; 13:295-306), mientras que el estudio de ratones que expresan ephrin B2 con mutaciones en sitios activos de señalización demostró que esta proteína controla el crecimiento angiogénico y linfoangiogénico a través de la regulación de la vía de señalización del VEGF (Wang, Y et al. Nature 2010; 465:483-6; Sawamiphak S et al. Nature 2010; 465:487-91 ). En WO2007/127506 y en WO2010/019565 se describen anticuerpos contra ephrin B2. En WO2007/127506 se demuestra que los anticuerpos descritos bloquean la señalización entre ephrin B2 y Eph B4 y presentan un efecto inhibidor de la angiogénesis, capaz de disminuir el volumen tumoral en un modelo animal.
Sin embargo, la necesidad de nuevos agentes terapéuticos capaces de controlar la angiogénesis continúa existiendo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención aporta un nuevo agente terapéutico capaz de controlar la angiogénesis y se refiere a un nuevo anticuerpo contra ephrin B2, con una secuencia distinta a la de los anticuerpos descritos hasta la fecha y una alta especificidad, capaz de inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos y linfáticos y de impedir considerablemente el crecimiento de tumores. Los anticuerpos contra ephrin B2 descritos en WO2007/127506 son capaces de inhibir la angiogénesis, pero no se describe un efecto inhibidor de la linfoangiogénesis. La presente invención se basa en anticuerpos que reconocen y se unen específicamente a la ephrin B2 y se refiere a dichos anticuerpos y a composiciones y métodos basados en ellos, que supone una herramienta terapéutica y diagnóstica importante contra aquellas patologías asociadas a la ephrin B2.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a nuevos anticuerpos específicos contra ephrin B2 que tienen actividad antiangiogénica y antilinfoangiogénica, y son capaces de inhibir el crecimiento de tumores sólidos.
Esta invención aporta una nueva solución al problema de controlar enfermedades que cursan con trastornos de la angiogénesis, como es, por ejemplo, el cáncer.
Como han demostrado los inventores, el anticuerpo B1 1 que aquí se describe reconoce específicamente la ephrin B2 de manera que inhibe su unión al receptor Eph B4 lo que, en ensayos in vitro, inhibe la formación de túbulos y la capacidad migratoria de células endoteliales (HUVEC) y, en ensayos in vivo con células de carcinoma de páncreas, pulmón y colon, produce una reducción considerable en el número de vasos sanguíneos y linfáticos en los tumores. Además, los inventores han observado que el anticuerpo de la presente invención es capaz de retrasar considerablemente el crecimiento tumoral y de provocar la disminución del tamaño de los mismos. Los inventores han demostrado que el anticuerpo B1 1 bloquea la interacción de la ephrin B2 a Eph B4 tanto in vitro como en células en cultivo, donde se muestra además cómo el anticuerpo es capaz de inhibir la señalización de la ephrina a través de su receptor (ver figura 5 de la presente memoria).
El anticuerpo 2B1 es también capaz de inhibir la formación de túbulos y la capacidad migratoria de células endoteliales (HUVEC) y de reducir el número de vasos sanguíneos y linfáticos en los tumores en ensayos in vivo El anticuerpo 2B1 no compite con el receptor Eph B4 en los ensayos de Biacore™ ni en los ensayos celulares de bloqueo de Eph B4, como muestra la figura 5 de la presente memoria. Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido aislado caracterizado porque:
a. comprende una secuencia aminoacídica de al menos un 76% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y
b. reconoce y se une específicamente a la ephrin B2.
Preferentemente, el polipéptido comprende una secuencia aminoacídica con al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 . Más preferentemente, el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 .
El término "aislado", tal y como se emplea en la presente descripción, referido a un polipéptido, se refiere a que dicho polipéptido ha sido identificado y separado y/o extraído de un entorno natural.
El término "% de identidad de secuencia" con respecto a un polipéptido, se refiere al porcentaje de aminoácidos de la secuencia en cuestión que son idénticos a los aminoácidos de la secuencia con la que se compara, después de alinear dichas secuencias y de introducir espacios, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, sin tener en cuenta las sustituciones conservadoras. El alineamiento puede llevarse a cabo de distintas formas, conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo usando las herramientas públicas como son los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Un experto en la materia puede determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para alcanzar el máximo alineamiento de las secuencias que se comparan.
El término "ephrin B2", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere, a no ser que se indique específicamente o contextualmente de otra forma, a cualquier polipéptido natural o a cualquier variante de la proteína ephrin B2. El nombre de esta proteína es el acrónimo de "erythropoietin producing hepatoma receptor interactors" , aunque también puede ser llamada ephrina o efrina. Un polipéptido natural puede ser una forma naturalmente truncada o secretada, como por ejemplo el dominio extracelular, o cualquier variante natural como por ejemplo las distintas formas alternativas de "splicing", o cualquier variante alélica.
Preferentemente, el polipéptido es un anticuerpo. Más preferentemente, el anticuerpo es humano. Preferentemente, el isotipo del anticuerpo humano es lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4 o IgA.
Los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se emplean en su sentido más amplio, e incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales, multiespecíficos (siempre que presenten la actividad biológica deseada) y pueden incluir fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad. Un "anticuerpo humano" es aquel cuya secuencia aminoacídica corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser fragmentos variables monocadena (scFv, del inglés "single chain variable Fragmenf). El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables de los anticuerpos difieren bastante en su secuencia, y son las secuencias responsables de la unión específica de cada anticuerpo a su antígeno. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de manera homogénea a lo largo de todo el dominio variable de los anticuerpos. Esta variabilidad se concentra en tres segmentos llamados CDR (del inglés, "complementarity- determining regions") o regiones hipervariables, presentes en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más conservadas de los dominios variables reciben el nombre de marco (del inglés, "framework"). Los CDR de ambas cadenas (pesada y ligera) contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. El fragmento variable o "Fv" es el fragmento mínimo de un anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno. Un fragmento variable monocadena puede presentar un dominio variable de cadena pesada y otro dominio variable de cadena ligera unidos covalentemente por un péptido que permite que las cadenas pesada y ligera puedan asociarse para formar la estructura del sitio de unión a antígeno. Un Fv puede ser también de dos cadenas. En cualquier caso, incluso un solo dominio variable, con tres CDR únicamente, es suficiente para reconocer y unir específicamente un antígeno, aunque con menor afinidad.
Las cadenas ligeras de los anticuerpos o inmunoglobulinas de vertebrados pueden ser de dos tipos, llamados kappa y lambda, según sean las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes. Según cuáles sean las secuencias aminoacídicas de los dominios constantes de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se asocian a distinta clases o tipos. Hay cinco clases o tipos principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Además, algunos de ellos se dividen en subclases o isotipos, como por ejemplo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgGA2. Además, los dominios constantes de las cadenas pesadas de las distintas clases e inmunoglobulinas reciben el nombre de alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Un fragmento de anticuerpo puede ser cualquier parte del anticuerpo que mantenga la función del anticuerpo completo. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos son Fv, Fab (fragmentos de unión a antígeno), Fab2 (fragmentos con dos sitios de unión a antígeno), todos ellos sobradamente conocidos por un experto en la materia. Los fragmentos variables monocadena (scFv) comprenden los dominios VH (dominio variable de la cadena pesada) y VL (dominio variable de la cadena ligera) del anticuerpo, estando estos dominios en una única cadena polipeptídica. Otros formatos de los anticuerpos de la presente invención pueden ser los conocidos como minianticuerpos o "minibodies", que comprenden un scFv y una región constante de tipo CH3, o los llamados scFv-Fc, que comprenden un scFv y las regiones constantes CH2 y CH3. Estos formatos aumentan el peso molecular de los scFv, evitan su rápida eliminación por el riñon y pueden ser muy útiles para el uso de un scFv en técnicas de imagen.
El término "antígeno" se refiere a un antígeno predeterminado al que el anticuerpo es capaz de unirse de manera selectiva. El antígeno puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un hapteno u otra molécula natural o sintética. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido.
Los inventores de la presente invención han estudiado la afinidad de los anticuerpos B1 1 y 2B1 por la ephrin B2, encontrando que B1 1 tiene una alta afinidad por el antígeno, siendo la constante de afinidad (KD) de1 10 nM, mientras que 2B1 presenta una menor afinidad, siendo la KD de 630 nM. La afinidad de la unión entre el sitio de reconocimiento y unión de un anticuerpo y su antígeno tiene que ver con la fuerza de la suma del total de las interacciones no covalentes entre ambos. La afinidad de una molécula por otra puede representarse generalmente por la constante de afinidad, también llamada constante de disociación (KD). La afinidad puede medirse por métodos habitualmente conocidos, como por ejemplo, pero sin limitarse, con los métodos descritos en esta memoria.
Cuando un anticuerpo presenta baja afinidad por su antígeno, suele unirse a él más despacio y se disocia con facilidad. De cara a mejorar la afinidad de un anticuerpo por su antígeno, pueden emplearse técnicas bien descritas en la bibliografía para "madurar la afinidad" (Marks et al. BioTechnology 1992. 10:779:783; Barbas, CF et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 1994 26; 91 :3809- 13). Estas técnicas pueden ser, entre otras, el "barajado" (del inglés "shuffling") de los dominios VH y VL, o la mutagénesis aleatoria (del inglés "random mutagenesis").
En una realización preferida de la invención, el polipéptido además comprende un péptido señal. Preferentemente, el péptido señal es SEQ ID NO: 6, el péptido señal de la pectato Nasa bacteriana de Erwinia carotovora conocido como pelB. Este péptido señal permite que el scFv se localice en el periplasma, donde se pliega correctamente gracias al entorno oxidante.
Un péptido señal es una pequeña secuencia de entre 3 y 60 aminoácidos que dirige el transporte de un polipéptido o proteína hacia una localización subcelular determinada, como puede ser el retículo endoplásmico, la mitocondria o el núcleo. El péptido señal puede dirigir también el transporte de la proteína fuera de la célula, lo que podría equivaler a su secreción o a su transporte al periplasma celular, en el caso de células como Escherichia coli. Algunos ejemplos de péptido señal para dirigir la secreción de un polipéptido son pelB, stll, ecotina, lamB, herpes GD, 1 pp, fosfatasa alcalina, invertasa, factor alfa y la secuencia líder de la proteína A.
En una realización preferida de la invención, el polipéptido además comprende al menos un marcador. Preferentemente, el marcador se selecciona de la lista que comprende: c-myc, FLAG, HA, cadena de histidinas, GST, biotina, VSV-G, HSVtk, V5, biotina, avidina, estreptavidina, proteína de unión a maltosa y una proteína fluorescente. Más preferentemente, el marcador es una cadena de histidinas, c-myc o ambos. Preferentemente, la cadena de histidinas comprende entre 4 y 12 histidinas. Más preferentemente, la cadena de histidinas comprende 6 histidinas. En una realización preferida de la invención, el polipéptido comprende los marcadores c-myc y una cadena de histidinas. En una realización preferida de la invención, la secuencia aminoacídica del polipéptido es SEQ ID NO: 7.
El término "marcador", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a un péptido marcador o a una proteína marcadora, que permiten la identificación de la proteína de interés cuando son producidos junto con dicha proteína como proteína de fusión. El péptido marcador o la proteína marcadora sirven para la identificación y/o la localización de la proteína de interés porque dichos marcadores corresponden a sitios de unión a determinadas moléculas o átomos, como la cadena de histidinas, la GST, la avidina o la estreptavidina, o porque son fácilmente detectables por técnicas inmunoquímicas, como hemaglutinina, VSV-G, HSVtk, FLAG, V5 o myc, o porque son fácilmente observables, como las proteínas fluorescentes. El péptido marcador VSV-G pertenece a la glicoproteína del virus vesicular de la estomatitis. El péptido marcador HSVtk pertenece a la timidina quinasa del virus del herpes simple 1. El péptido FLAG es un epítopo de 8 aminoácidos diseñado específicamente como marcador de proteínas recombinantes. V5 es un pequeño epítopo presente en las proteínas P y V del paramixovirus del virus de simio 5 (SV5). El epítopo myc tiene 10 aminoácidos y es parte de la secuencia del factor de transcripción c-myc humano.
Otra realización de la invención es un anticuerpo cuya secuencia aminoacídica comprende el polipéptido del primer aspecto de la invención.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para el polipéptido del primer aspecto de la invención. Preferentemente, el ácido nucleico es un vector. Más preferentemente, el vector es un vector de expresión.
Un ácido nucleico o polinucleótido es un polímero de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o cualquier sustrato que pueda ser incorporado en un polímero de ADN o ARN por una polimerasa o por una reacción sintética.
El término "codifica" se refiere al código genético que determina cómo una secuencia de nucleótidos se traduce en un polipéptido o una proteína. El orden de los nucleótidos de una secuencia determina el orden de los aminoácidos a lo largo de un polipéptido o una proteína. Un vector es una molécula de ácido nucleico usada para transferir material genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Algunos vectores son capaces de replicarse o dividirse autónomamente una vez son introducidos en la célula huésped, como los vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano o los vectores episomales de mamíferos. Otros vectores pueden integrarse en el genoma de la célula huésped y replicarse así junto con el genoma celular. Un vector de expresión es aquel capaz de dirigir la expresión de genes a los que se ha ligado de manera operativa. Un vector de expresión se usa para la traducción y la transcripción de un gen de interés, normalmente controlado por un promotor. Un promotor es una secuencia de nucleótidos que controla la traducción del gen de interés. El promotor está operativamente unido al gen de interés. Operativamente unido" se refiere a la relación funcional y a la localización de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés, por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a un secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. En general, un promotor operativamente unido está contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.
El término "origen de replicación", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una secuencia de nucleótidos donde se forma una horquilla de replicación y donde se inicia la replicación del ADN. Un tercer aspecto de la invención ser refiere a una célula que comprende el vector del segundo aspecto de la invención. La célula puede ser procariota, por ejemplo, pero sin limitarse, la célula puede ser una bacteria como E. coli que se usa para producir el anticuerpo de la invención. La célula puede ser eucariota, como por ejemplo, pero sin limitarse, una levadura o una célula de insecto, que se usa para producir el anticuerpo de la invención. La célula puede ser eucariota y usarse para terapia celular, o puede ser una célula que ha incorporado el vector del segundo aspecto de la invención mediante terapia génica.. En una realización preferida de la invención, la célula es una célula de mamífero. Una célula de mamífero es cualquier célula cuya especie pertenece al Reino Animalia, Filo Chordata, Subfilo Vertebrata y Clase Mammalia. Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención del polipéptido del primer aspecto de la invención, que comprende las etapas:
(a) expresar el vector del segundo aspecto de la invención en una célula y (b) purificar el polipéptido expresado en la etapa (a). En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la célula es procariota. En otra realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la célula es eucariota.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un método de detección y/o cuantificación de la ephrin B2 que comprende las etapas:
(a) poner en contacto una muestra biológica aislada con el polipéptido del primer aspecto de la invención y (b) detectar y/o cuantificar el complejo formado por la ephrin B2 y dicho polipéptido en la muestra empleada en (a). Una realización preferida del quinto aspecto de la invención es un método de diagnóstico de una enfermedad asociada a la expresión de la ephrin B2 que comprende las etapas:
(a) poner en contacto una muestra biológica aislada con el polipéptido del aspecto primero de la invención, (b) detectar y/o cuantificar el complejo formado por la ephrin B2 y dicho polipéptido en la muestra empleada en (a), (c) comparar los niveles de ephrin B2 detectados con los niveles control y (d) asociar el resultado de dicha comparación a la presencia o ausencia de la enfermedad.
Una enfermedad asociada a la expresión de la ephrin B2 puede ser entre otras, cualquier enfermedad que curse con una desregulación de la angiogénesis, como pueden ser enfermedades tanto neoplásicas como no neoplásicas. Las enfermedades no neoplásicas que cursan con una desregulación de la angiogénesis incluyen, pero no se limitan: hipertrofia aberrante, artritis, artritis reumatoide, soriasis, sarcoidosis, ateroesclerosis, retinopatía diabética, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, degeneración macular asociada al envejecimiento, edema macular diabético, neovascularización corneal, meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasia tiroidea, inflamación crónica, inflamación de pulmón, sepsis, edema cerebral, inflamación sinovial, formación hipertrófica del hueso, osteoartritis, ovario poliquístico, endometriosis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, esclerodermia, tracoma, sinovitis, dermatitis, preclampsia (WO2007/127506).
Una muestra biológica aislada es una muestra aislada de un organismo como el cuerpo humano o animal y puede provenir de un fluido fisiológico y/o cualquier célula o tejido de un organismo. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia o un aspirado por aguja fina. En una realización preferida, la muestra biológica aislada en la etapa (a) es un fluido biológico. El fluido biológico puede incluir fluidos excretados o secretados del cuerpo, así como fluidos que normalmente no lo son. El fluido biológico puede incluir, aunque sin limitarse, líquido amniótico que rodea el feto, humor acuoso, fluido intersticial, linfa, leche materna, moco (incluyendo el drenaje nasal y la flema), saliva, sebo (grasa de la piel), suero, sudor, lágrimas, orina, líquido pericárdico, sangre y plasma sanguíneo. En una realización más preferida, el fluido biológico es sangre, plasma sanguíneo o suero sanguíneo. La muestra biológica aislada en la etapa (a) del método de la invención puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca, congelada, fijada o embebida en parafina.
La expresión "detectar y/o cuantificar" el complejo formado por la ephrin B2 y el polipéptido del primer aspecto de la invención en una muestra biológica aislada, tal y como se emplea en la presente descripción, hace referencia a la detección de la presencia y/o a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa. La medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del complejo formado por la ephrin B2 y el polipéptido del primer aspecto de la invención, basada en una señal que se obtiene directamente de dicho complejo y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de complejo presentes en la muestra. Dicha señal, a la que también podemos referirnos como señal de intensidad, puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del complejo. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del complejo) o un sistema de medida biológica (por ejemplo, la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad" se refiere, pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de complejo formado por la ephrin B2 y el polipéptido del primer aspecto de la invención así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con el complejo, o que pueda derivarse de él. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas del complejo, obtenidos mediante medida directa, por ejemplo, valores de intensidad de espectroscopia de masas o resonancia magnética nuclear. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta. La detección, tal y como es entendida por un experto en la materia, no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001 . Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
El término "comparar", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere, pero no se limita, a la comparación de la cantidad de complejo formado por la ephrin B2 y el polipéptido del primer aspecto de la invención de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de complejo de una muestra de referencia, que recibe el nombre de control. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente junto con la muestra biológica problema. La comparación puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso del polipéptido del primer aspecto de la invención para preparar un medicamento. En una realización preferida de la invención, el medicamento se usa para inhibir la angiogénesis. Preferiblemente, se usa para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una condición patológica asociada a la angiogénesis. Más preferiblemente, para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un tumor o del cáncer. Una condición patológica asociada a la angiogénesis puede ser cualquier neoplasia, así como otras enfermedades no neoplásicas, como por ejemplo, pero sin limitarse, las descritas en WO2007/127506. En una realización preferida del sexto aspecto de la invención, el tumor o el cáncer es sólido. Preferiblemente, el cáncer es de páncreas, colon o pulmón. Un tumor o un cáncer se dice que es sólido cuando es una masa de tejido que no contiene cavidades ni líquido. Según el tipo celular, los tumores sólidos reciben distintos nombres, como sarcoma, carcinoma o linfoma.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el polipéptido del primer aspecto de la invención, el ácido nucleico o el vector del segundo aspecto de la invención, o la célula del tercer aspecto de la invención. En una realización preferida del séptimo aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica. Preferiblemente, se caracteriza porque además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. Además el excipiente debe ser farmacológicamente aceptable.
Un "excipiente "es un componente de una composición farmacéutica que no es un compuesto activo sino un diluyente, un vehículo o un relleno, entre otros, que se considera "farmacéuticamente aceptable" cuando es seguro, no es tóxico y no presenta efectos adversos. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del compuesto, lo estabiliza o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término excipiente "farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, debe ser compatible con dichos componentes
El "vehículo" o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.
En otra realización aún más preferida, la composición farmacéutica además comprende otra sustancia activa. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de otros agentes terapéuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico. El término "principio activo" es toda materia, cualquiera que sea su origen humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.
En una realización preferida del séptimo aspecto de la invención, la composición farmacéutica además comprende un agente antiangiogénico. Un agente antiangiogénico es una molécula capaz de inhibir la angiogénesis, la vasculogénesis o la permeabilidad vascular indeseable, directa o indirectamente. Ejemplos de agentes antiangiogénicos son aquellas moléculas capaces de bloquear un agente angiogénico, como son por ejemplo anticuerpos contra VEGF, contra el receptor de VEGF o pequeñas moléculas que bloqueen la vía de VEGF, todos ellos bien descritos y conocidos.
En una realización preferida del séptimo aspecto de la invención, la composición farmacéutica además comprende un agente quimioterapéutico. Un agente quimioterapéutico es un compuesto útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de fármacos quimioterapéuticos son compuestos citotóxicos como las antracilinas, daunorubicina, adriamicina, derivados de docetaxel, alcaloides de la vinca, vincristina, carmustina, cisplatino, fluorouracilos, compuestos citostáticos como los inhibidores de poliamina, tamoxifeno, prodasona o sandostatina, o compuestos que inducen la apoptosis como el butirato sódico o la mitomicina C, antibióticos como las penicilinas, betalactaminas, cefalosporinas, ciclinas, aminoglucósidos, macrólidos o sulfamidas, o anitivirales como el AZT, inhibidores de proteasas o aciclovir, retrovir o foscarnet.
Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición del séptimo aspecto de la invención para preparar un medicamento. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medicamento se usa para inhibir la angiogénesis. Preferiblemente, para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una condición patológica asociada a la angiogénesis. Más preferiblemente, para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un tumor o del cáncer. En una realización preferida, el tumor o el cáncer es sólido. Preferiblemente, el cáncer es de páncreas, colon o pulmón. En una realización preferida del octavo aspecto de la invención, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que, administrada en dosis y durante el período de tiempo necesario, es efectiva a la hora de conseguir el resultado profiláctico o terapéutico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" del polipéptido o composición farmacéutica de la invención puede variar con el estadio de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y se refiere a una cantidad que no presenta efectos adversos ni toxicidad y es capaz de alcanzar el efecto profiláctico o terapéutico deseado. Un "individuo" es un vertebrado. Preferiblemente, el vertebrado es un mamífero. Más preferiblemente, el mamífero es un humano. Entre los mamíferos se incluyen, pero sin limitarse, los animales de granja (como las vacas), animales que participan en deportes, mascotas (como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.
En cada caso la forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La composición farmacéutica de la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel, microesfera o aerosol. Según una realización aún más preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se presenta en una forma adaptada a la administración oral o parenteral.
La forma adaptada a la administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. Dicha forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. La forma adaptada a la administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral Otra posibilidad es que la composición farmacéutica se presente en una forma adaptada a la administración sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Expresión de los clones seleccionados en E. coli. Análisis mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie de la expresión de los scFvs seleccionados frente a ephrin B2 (clones 2B1 , A1 , B11 y E4) en E. coli (Extracto total) y de la correspondiente fracción periplásmica aislada mediante choque osmótico suave (Periplasma). Los pesos moleculares se señalan a la izquierda de la figura en kDa.
Fig. 2. Los clones B11 y 2B1 se purifican en mayores cantidades. Análisis de las purificaciones de los scFvs A1 , B1 1 , E4 y 2B1 específicos de ephrin B2 mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie. Los scFvs presentes en los respectivos extractos periplásmicos se purificaron mediante cromatografía de afinidad a Ni2+ inmovilizado. En la figura se muestran las distintas fracciones de elución de las cromatografías de cada scFv. Los pesos moleculares se indican en kDa. Fig. 3. Los clones B11 y 2B1 son más específicos. Determinación de la especificidad de los scFv anti-ephrin B2 seleccionados frente a las distintas ephrin B por inmunoblot. Las proteínas recombinantes comerciales ephrin B1 - Fc (EB1 ) de ratón, ephrin B2-Fc (EB2) de ratón y ephrin B3-Fc (EB3) humana se separaron electroforéticamente y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Posteriormente, se analizó la reactividad de los clones B1 1 y 2B1 junto con un anticuerpo comercial anti-ephrin B2 como control (C). Los pesos moleculares se indican a la izquierda de la figura en kDa. Fig. 4. Análisis de afinidad de los scFv anti-ephrin B2 mediante Biacore™.
Los sensogramas representan la respuesta frente al tiempo (s) en las correspondientes a las curvas de unión del clon B1 1 (A) a ephrin B2 inmovilizada utilizando cuatro concentraciones diferentes (0,4; 0,2; 0,1 ; 0,05 μΜ) y del clon 2B1 (B) a concentraciones de 30, 20, 10 y 7,5 μΜ, a partir de los cuales se calcularon las respectivas constantes de afinidad (KD), siendo KD de 110 nM para el clon B1 1 y de 630 nM para el clon 2B1 .
Fig. 5. Estudio del bloqueo de la unión de ephrin B2 a Eph B4. A. Gráfica que muestra el porcentaje de unión de ephrin B2 a Eph B4. Ensayos de inhibición de la unión de ephrin B2 a Eph B4 en presencia de los scFv anti- ephrin B2 mediante resonancia de plasmón superficial. Diluciones seriadas de los scFv B11 (·) ó 2B1 (o) se mezclaron con ephrin B2 y se inyectaron sobre Eph B4 inmovilizado en un chip. La cantidad relativa de ephrin B2 unida a EphB4 se midió inmediatamente después de la inyección de cada muestra y se representó en función de la concentración de scFv. La figura muestra los valores promedios de cada concentración de scFv con barras de error indicando la desviación estándar (n=3). B. El scFv B1 1 es capaz de bloquear la interacción entre ephrinB2 y su receptor EphB4 en un ensayo celular. Análisis de la fosforilación de las tirosinas del receptor Eph B4 en células HUVEC en respuesta a la estimulación con ephrin B2 sobreexpresada en la superficie de células HEK293. Células HUVEC y células HEK293 que sobreexpresan ephrinB2 se cocultivaron durante 20 minutoss en presencia o ausencia de los scFv anti-ephrinB2. Tras inmunoprecipitar el receptor Eph B4, se analizó la cantidad total de esta proteína (panel inferior) y su nivel de fosforilación (panel superior), mediante inmunoblot. Fig. 6. Efecto inhibitorio de B11 y 2B1 en la formación de estructuras tubulares in vitro por células endoteliales HUVEC en Matrigel.
Microfotografías (aumento 4x) representativas de la formación de túbulos a las 6 horas de cultivar células HUVEC sobre Matrigel en presencia de B1 1 , 2B1 o un scFv irrelevante como control negativo (C-). Como control positivo se empleó VEGF. La gráfica muestra la cuantificación de la formación de túbulos. Cada tratamiento fue repetido al menos tres veces y los valores correspondientes (media +/- desviación estándar) se representan como el porcentaje de túbulos formados en presencia de los anticuerpos ensayados con respecto al control sin ningún tratamiento. *=p<0,0001 .
Fig. 7. Análisis de la inhibición de la migración celular lateral mediante ensayos de cicatrización de heridas in vitro. Se crecieron células HUVEC hasta confluencia y se hizo una herida en la monocapa celular. A continuación, las células se incubaron en medio sin suero en ausencia (control) o en presencia de VEGF como estímulo de migración. La migración lateral de las células se monitorizó durante 24 horas en presencia de los scFv anti-ephrin B2, B1 1 ó 2B1 , o de un scFv irrelevante como control negativo. La figura muestra micrografías representativas (aumento 4x) después de 24 horas del área de la herida en la que se han marcado con líneas discontinuas el área inicial sin células a tiempo 0. La gráfica cuantifica la migración celular a las 24 horas. Cada scFv se ensayó al menos tres veces, y los valores correspondientes (medias +/- desviación estándar) se representaron en función del porcentaje de área migrada con respecto al tiempo 0. *=p<0,001. Fig. 8. Análisis del efecto inhibitorio en la formación de estructuras tubulares in vivo. Se realizaron implantes de Matrigel en ratones atímicos nu/nu y se valoró la formación de vasos después de 6 días de la implantación mediante cuantificación de células endoteliales y hemoglobina. A. Microg rafias representativas (aumento 40x) de cortes histológicos de los correspondientes implantes extirpados después de 6 días y teñidos con el marcador de células endoteliales CD34. B. Las gráficas muestran el porcentaje de área positiva para el marcador CD34 (panel izquierdo) y la variación relativa del contenido de hemoglobina en los implantes con respecto al implante control sin VEGF (panel derecho).
Fig. 9. Inhibición del crecimiento tumoral en ratones xenotransplantados con células de carcinoma pancreático (BxPC3) y tratados con B11 ó 2B1.
La gráfica muestra la media de los volúmenes tumorales y la desviación estándar en cada punto para cada uno de los grupos (n=8), tratados con 20 mg/kg de B11 ( A ), 2B1 (■) o sin tratar (C-) (♦). Fig. 10. Análisis histopatológico de los tumores xenotransplantados de células de carcinoma pancreático (BxPC3) y tratados con B11 ó 2B1. El análisis se realizó 38 días después de la implantación y 1 día después de la última dosis de anticuerpo. Los tumores se fijaron con formalina y se embebieron en parafina para posteriormente realizar la tinción inmunohistoquímica correspondiente. Las células apoptóticas se detectaron mediante tinción de caspasa 3 activa, la actividad proliferativa se analizó mediante tinción de Ki67, la vascularización se marcó mediante tinción de CD34 y los vasos linfáticos se detectaron mediante tinción de LYVE1 . Posteriormente se contaron las células o las áreas positivas y se representaron los valores medios de todos los campos contados junto con sus respectivas desviaciones estándar. *=p<0,0001 ; **=<0,001 .
Fig. 11. B11 es capaz de inhibir el crecimiento tumoral en ratones xenotransplantados con células de carcinoma de colon (SW620) (A) y células de carcinoma de pulmón (H460) (B). Las gráficas muestran las medias de los volúmenes tumorales (paneles superiores) y las medias de las intensidades de fluorescencia (paneles inferiores) junto con las desviaciones estándar en cada punto de los grupos tratados con 20 mg/kg de B1 1 y de los grupos control no tratados.
Fig. 12. Análisis de la biodistribución de B11 y 2B1 y localización de las masas tumorales. Ratones atímicos nu/nu fueron xenotransplantados con células H460 de carcinoma de pulmón que expresan de manera estable la proteína fluorescente mCherry. Cuando el tumor alcanzó un tamaño detectable tanto macroscópicamente como por intensidad de fluorescencia a 610 nm, se administraron por vía intravenosa los correspondientes scFv conjugados al fluorocromo AlexaFluor®750. A. Imágenes de las regiones dorsales a las 0,5; 2; 6; 24 y 48 horas después de la administración de los scFv. La localización de los tumores se indica con una flecha. B. Intensidad de fluorescencia a 750 nm de los tumores extirpados a 6 y 48 horas después de la administración de los scFv B1 1 y 2B1 marcados con AlexaFluor®750 y el control negativo (C-) tratado con PBS.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad del anticuerpo contra la ephrin B2 de la invención, así como su efectividad para inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos y linfáticos.
EJEMPLO 1 : Identificación y caracterización de nuevos anticuerpos humanos frente a la ephrin B2.
A partir una genoteca de anticuerpos humanos expresados en la superficie de fagos M13 y mediante sucesivas rondas de selección frente a la región extracelular de la ephrin B2, expresada en células de mamífero y purificada mediante cromatografía de afinidad, se obtuvo una colección de clones de fagos que reaccionaron positivamente con el antígeno ephrin B2 por ELISA. Estos clones se secuenciaron con cebadores específicos y se identificaron 4 fragmentos variables monocadena (scFv) de secuencias diferentes entre sí, tanto en VH (cadena variable pesada) como en VL (cadena variable ligera), denominados A1 , B11 , E4 y 2B1 . Posteriormente, se llevó a cabo el análisis de la expresión y purificación de cada uno de los scFv seleccionados. Para ello se subclonaron en vectores pET28b bajo el promotor de la T7 ARN polimerasa con el objetivo de dotar a los fragmentos de una cola de histidinas para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad. Se generaron los vectores recombinantes y se transformaron en la estirpe de E. coli BL21 (DE3) para posteriormente inducir su expresión con IPTG. Se preparó la fracción periplásmica mediante choque osmótico suave y se analizó la presencia de los scFv por SDS-PAGE (Fig. 1 ). A continuación, se procedió a la purificación de los scFv presentes en las fracciones periplásmicas mediante cromatografía de afinidad con níquel, seguida de un cambio de tampón a PBS por filtración en gel (Fig. 2). El mayor rendimiento se obtuvo en el caso del clon 2B1 (cuya secuencia es SEQ ID NO: 8), seguido del clon B1 1 (cuya secuencia es SEQ ID NO: 7). Sin embargo, las expresiones de los scFv A1 y E4 fueron tan bajas, que las cantidades que se llegaron a obtener no fueron suficientes para una caracterización posterior de estos anticuerpos (Fig. 2). Por tanto, los clones B1 1 y 2B1 fueron finalmente los seleccionados para analizar su reactividad. Los ensayos funcionales, mediante técnicas de ELISA, demostraron que los anticuerpos se expresaron en forma funcionalmente activa y reconocían específicamente a su antígeno diana, la ephrin B2.
La especificidad de los dos anticuerpos se comprobó mediante inmunoblot (Western blot) y ELISA analizando la reactividad de B11 y 2B1 con otros componentes de la familia de las ephrins B: la ephrin B1 y la ephrin B3, en formas recombinantes comerciales, en comparación con la reactividad con la ephrin B2 (Fig. 3). Como control, se utilizó un anticuerpo anti-ephrin B2 comercial (R&D). Ambos anticuerpos, B1 1 y 2B1 , reconocieron únicamente a la ephrin B2, demostrando su elevada especificidad por esta proteína, incluso mayor que el anticuerpo comercial que reconoce también a las ephrins B1 y B3 Estos resultados se confirmaron por ELISA. Selección de fragmentos variables monocadena (scFv) de anticuerpos específicos de ephrin B2 a partir de genotecas de fagos
Se utilizó la tecnología de despliegue de proteínas en la superficie de fagos (en inglés, Phage display) con una genoteca de anticuerpos humanos procedente de individuos no inmunizados de 1 ,5 x 1010 scFv. La primera ronda de inmunoselección (en inglés, panning) se realizó con la región extracelular de la ephrin B2 fusionada al dominio Fe de la IgG humana, expresada y purificada en células de mamífero, como antígeno inmovilizado en placas de ELISA (Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas, del inglés, "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay", Maxisorp, Nunc) a razón de 1 μg/pocillo durante 16 horas a 4o C en PBS (Solución salina de fosfato, del inglés "Phosphate Buffer Saline"). Tras 3 lavados del pocilio con PBS se llevó a cabo una etapa de bloqueo con 2% de leche en PBS durante 2 horas a 37° C, seguida de una incubación de la genoteca durante 2 horas a 37° C. Los fagos unidos no específicamente se eliminaron por lavados sucesivos con PBS-0,1 % Tween, mientras que los fagos específicos de antígeno se eluyeron con 100 μΙ de tripsina. Se infectaron células de Escherichia coli de la cepa TG1 (MRC Geneservices) en crecimiento exponencial (Densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm (DOeoo) de 0,4) durante 30 minutos a 37° C con los fagos eluídos. Se sembraron las bacterias infectadas en placas de TYE (de triptona y extracto de levadura, del inglés, "Tryptone, Yeast Extracf) suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina y glucosa al 1 % (v/v) y se dejaron crecer durante 16 horas a 37° C. A continuación, se recogieron las bacterias de las placas con medio 2xTY (16 g/l de triptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCI) suplementado con glicerol al 15% y se diluyeron 50 μΙ de las bacterias recogidas en 50 mi de medio de cultivo 2xTY suplementado con 100 μg/ml de ampicilina y glucosa al 1 %; se incubaron los cultivos hasta alcanzar la fase exponencial y se infectaron las células con 2,5 x 101 1 fagos helper KM13 (MRC Geneservices). Tras 30 minutos de incubación a 37° C, se centrifugaron los cultivos, se resuspendieron los precipitados en el mismo volumen de medio 2xTY suplementado con 100 μ9/ηιΙ de ampicilina, 50 μ9/ηιΙ de kanamicina y glucosa al 0,1 % y se crecieron durante toda la noche a 30° C.
Los fagos de cada ronda de selección se precipitaron a partir del medio de cultivo. Para ello se centrifugaron los cultivos a 3.300 x g durante 15 minutos y se añadieron 10 mi de PEG (polietilenglicol)/NaCI a 40 mi de sobrenadante y se dejaron 1 hora en hielo. Se centrifugaron a 3.300 x g durante 30 minutos y se descartaron los sobrenadantes. Los precipitados se resuspendieron en 2 mi de PBS y se centrifugaron a 11 .600 x g durante 10 minutos. Se recuperaron los sobrenadantes y los fagos se utilizaron para la siguiente ronda de selección, similar a la anteriormente descrita, con la particularidad de que se utilizaron cantidades decrecientes de antígeno para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Los fagos unidos en esta segunda ronda se amplificaron y se volvieron a someter a una tercera ronda de selección para conseguir un enriquecimiento de aquéllos que portan un scFv reactivo contra la ephrin B2.
ELISA de fagos
Se realizaron ELISAs de fagos para valorar el grado de enriquecimiento en fagos específicos de ephrin B2, resultantes de cada ronda de selección. Placas de ELISA flexibles (Falcon, BD Biosciences) se tapizaron con 0,3 μg de ephrin B2-Fc y una proteína irrelevante como control negativo, en PBS a 4o C durante 16 horas. Después de varios lavados con PBS, las placas se bloquearon con 2% de leche en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de la incubación con las diferentes diluciones de los fagos de cada ronda de selección en PBS-2% leche durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron de nuevo los pocilios con PBS-Tween 20 al 0,1 % y se incubaron con una dilución 1 :5.000 de un anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado a peroxidasa (HRP) (GE Healthcare) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras cuatro lavados con PBS-0,1 % Tween, se revelaron con TMB (3, 3', 5,5'- tetrametilbenzidina) (Sigma). La reacción colorimétrica se detuvo con ácido sulfúrico 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm. Los dos scFv seleccionados, B11 y 2B1 , se caracterizaron mediante distintas técnicas. En primer lugar se determinaron las constantes de afinidad de los anticuerpos a la ephrin B2 por medio de la técnica de resonancia de plasmón superficial en un Biacore X, con la región extracelular de la ephrin B2 inmovilizada y distintas diluciones de los scFv purificados. El clon B1 1 presentó la mayor constante de afinidad, siendo ésta de 1 10 nM, mientras que la afinidad del clon 2B1 fue más baja, 630 mM (Fig. 4). A continuación, se analizó con la misma técnica la capacidad de los anticuerpos para competir en la unión de la ephrin B2 a su receptor natural Eph B4. Para ello, se inmovilizó Eph B4- Fe en un chip y se midió la unión de la ephrin B2 en presencia de distintas concentraciones de B11 o 2B1 . La presencia de B1 1 bloquea la unión de la ephrin B2 a Eph B4 de manera dependiente de su concentración, con una IC50 de 0,3 μΜ (Fig. 5), indicando que B11 compite por el mismo sitio de unión que el receptor Eph B4. Sin embargo, el anticuerpo 2B1 no tiene un efecto bloqueante (Fig. 5).
ELISA de fagos monoclonales
Se picaron colonias individuales de la tercera ronda de selección y se crecieron durante toda la noche a 37° C en agitación en 100 μΙ de medio 2xTY suplementado con 100 μg/ml de ampicilina y glucosa al 1 % en placas de 96 pocilios (Sarstedt). Al día siguiente se diluyeron los cultivos 100 veces en el mismo medio y se incubaron durante 2 horas a 37° C en agitación. A continuación, se añadieron 25 μΙ de medio con 109 fagos helper KM13 y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Se centrifugaron las bacterias y el precipitado celular se resuspendió en 2xTY suplementado con 50 μg/ml de kanamicina y se cultivaron durante toda la noche a 30° C. Finalmente, los cultivos se centrifugaron y se utilizaron 50 μΙ del sobrenadante para hacer el ELISA en las mismas condiciones descritas arriba. Análisis de secuencia
Se amplificaron las secuencias codificadoras de los scFv positivos mediante PCR utilizando los oligonucleótidos o cebadores pelBForward (SEQ ID NO: 2) 5'-CATAATGAAATACCTATTGCCTA-3' y cmycReverse (SEQ ID NO: 3) 5'- CTTATTAGCGTTTGCCATT-3' . Se trataron los productos de PCR con las enzimas Exol (USB), para eliminar los oligonucleótidos no utilizados, y SAP (USB), para eliminar los dNTP sobrantes, a 37° C durante 30 minutos y a 80° C durante 15 minutos, y dichos productos se secuenciaron con ambos oligonucleótidos. Una vez obtenidas las secuencias, se compararon entre sí para determinar el número de clones de secuencia única mediante el programa ClustalW y la herramienta de traducción del servidor ExPASy Proteomics.
Subclonaje de los scFv en pET28b
Para dotar a los scFv seleccionados de una cola de histidinas que facilite su purificación, se clonaron en el vector pET28b (Novagen). Se amplificaron los scFv por PCR mediante los cebadores pET28-scFvMehta 5' (SEQ ID NO: 4) 5OAGTCATCATGAAATACCTATTGCCTAC3' y pET28-scFvMehta3' (SEQ ID NO: 5) 5OACCGGACTCGAGTGCGGCCCCATTCAG3' que incluyen dos sitios de restricción Real y Xhol, respectivamente, para su posterior clonaje en el vector pET28b, previamente digerido con Ncol, sitio compatible con Real y Xhol. La ligación de inserto y vector digeridos se realizó mediante incubación durante toda la noche a 16° C con la enzima T4 Ligasa (Roche) poniendo una relación molar inserto:vector 3:1. Se transformaron células competentes de E. coli de la cepa DH5a library (Invitrogen) mediante choque térmico y se seleccionaron en placas de LB-Agar (del inglés "Lysogeny Broth") con 50 μg/ml de kanamicina. Se inoculó una colonia positiva de cada construcción en LB suplementado con kanamicina y se cultivó a 37° C durante toda la noche. Los vectores recombinantes se purificaron con el kit Wizard (Promega) y se verificó la secuencia mediante secuenciación de ADN. Expresión y purificación de los scFv
Se transformaron células competentes de E. coli de la cepa BL21 (DE3) con los plásmidos recombinantes pET28 mediante choque térmico. Se seleccionaron las bacterias transformadas en placas de LB con 50 μ9/ιτιΙ de kanamicina. Se llevó a cabo la expresión de los scFv mediante inducción con IPTG (isopropil-β- D-1 -tiogalactopiranósido) a una concentración final de 1 mM cuando la ϋθβοο de los cultivos fue de 0,6. Se analizaron los niveles de expresión de los scFv mediante geles de poliacrilamida-SDS (dodecil sulfato sódico) seguidos de tinción con azul brillante de Coomassie. Dado que el scFv funcional se concentra en la región periplásmica de las células, se efectuó una lisis de la pared externa de la bacteria mediante choque osmótico suave, resuspendiendo las células en 1/50 volúmenes de tampón TES (200 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M Sacarosa) suplementado con 20 μg/ml de benzamidina (Sigma) y 10 μg/ml de inhibidor de tripsina de soja (Sigma) y, posteriormente, diluyendo 1 ,5 veces en tampón 0,2 x TES. Los lisados se dejaron 30 minutos en hielo, se centrifugaron a 16.250 x g durante 10 minutos y se recogieron los sobrenadantes conteniendo la fracción periplásmica. La purificación de los scFv se llevó a cabo mediante una cromatografía de afinidad a metal inmovilizado (IMAC) utilizando columnas de Ni2+ HisTrap (GE Healthcare) seguida de un desalado en una columna de filtración en gel HiPrep 26/10 desalting (GE Healthcare) acopladas en tándem en un equipo ÁKTAxpress. Como tampón de equilibrado de la columna de afinidad se utilizó 20 mM fosfato sódico pH 7,4, NaCI 0,5 M, imidazol 20 mM, y como tampón de elución, el mismo que el de equilibrado con una concentración de imidazol 0,3 M. Este tampón se intercambió por PBS en la filtración en gel.
Inmunoblot (Western blot)
Las proteínas recombinantes ephrin B1 -Fc de ratón, ephrin B2-Fc de ratón y ephrin B3-Fc humana (R&D) se separaron electroforéticamente en geles de poliacrilamida-SDS al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (GE Healthcare). Tras bloquear las membranas con PBS-3% leche en polvo semidesnatada durante 1 hora, se incubaron con las fracciones periplásmicas diluidas 1 :5 en PBS-3% leche en polvo durante 16 horas a 4o C. Como anticuerpos secundarios, se utilizaron anti c-Myc (Sigma) a una dilución 1 :1 .000 durante 2 horas a temperatura ambiente y anti-ratón conjugado a peroxidasa (Sigma) diluido 1 :5.000 durante 1 hora a temperatura ambiente. La visualización se realizó mediante incubación con el reactivo ECL (del inglés, "Enhanced Chemiluminescence") GE Healthcare).
Análisis de las constantes cinéticas de los scFv
Para el estudio de las constantes de afinidad de los scFv se utilizó la técnica de resonancia de plasmón superficial con el equipo BIAcore X (BIAcore). La ephrin B2-Fc se unió covalentemente a la superficie del chip CM5 (GE Healthcare) previa activación de los grupos carboxilo de la matriz de dextrano del chip con 0,4 M EDC (1 -ethyl-3-(-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) y 0,1 M NHS (N- hydroxysuccinimide) en un ratio 1 :1 durante 7 minutos a un flujo de 10 μΙ/minuto. La proteína ephrin B2-Fc se diluyó hasta 10 μg/ml en acetato sódico 10 mM a pH 4 y 30 μΙ de esta solución se pasó sobre la superficie del chip a un flujo de 10 μΙ/minuto en tampón HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% surfactante P20) (GE Healthcare). El exceso de grupos ésteres activados se bloquearon mediante la inyección de etanolamina 1 M a pH 8,5 a un flujo de 10 μΙ/minuto durante 7 minutos. Mediante este protocolo se inmovilizaron aproximadamente 2.000 unidades de respuesta (RU) de ephrin B2.
Para determinar las constantes de afinidad de los scFv, se inyectaron secuencialmente diferentes diluciones de los anticuerpos en orden creciente, a un flujo de 30 μΙ/minuto. Una vez obtenidos los sensogramas, las constantes de afinidad se calcularon utilizando el programa de evaluación BIAsoftware mediante el modelo de Langmuir 1 :1 . Análisis de competición por la unión a Eph B4
La capacidad de los scFv para inhibir la unión de la ephrin B2 a su receptor Eph B4 se analizó mediante un ensayo de unión competitiva por resonancia de plasmón superficial. Eph B4 soluble (R&D) se conjugó a un chip CM5 (GE Healthcare) mediante el mismo protocolo descrito anteriormente. Diluciones seriadas de cada scFv se mezclaron con una concentración constante (0,2 μΜ) de ephrin B2-Fc en tampón HBS-EP y se inyectaron 30 μΙ de cada mezcla a un flujo de 20 μΙ/minuto sobre el chip recubierto de Eph B4. La cantidad relativa de ephrin B2 unida a Eph B4 se representó en función de la concentración correspondiente de anticuerpo
Bloqueo de la señalización de EphB4 con el scFv B11 anti-ephrin B2 Para analizar la capacidad de los scFv anti-ephrin B2 para bloquear la activación del Eph B4 mediante fosforilación inducida por ephrin B2, se realizó un ensayo celular en el cual se utilizaron células HEK293 que sobreexpresan transitoriamente ephrin B2 para estimular células HUVEC, caracterizadas por expresar altos niveles de Eph B4 pero bajos niveles de ephrin B2. El resultado se muestra en la Figura 5 B. La ephrin B2 expresada en la superficie de las células HEK293 provocó una eficiente fosforilación del Eph B4 en las células HUVEC, tras una incubación de los dos tipos celulares durante 20 minutos. Sin embargo, la presencia del scFv B11 en este proceso causó la inhibición casi completa de la fosforilación del Eph B4, indicando que el tratamiento con el scFv B1 1 bloquea la interacción entre la ephrin B2 y su receptor Eph B4 en el contexto del contacto directo entre células. Este efecto no se observó al realizar el tratamiento con el scFv 2B1 . En el caso del scFv 2B1 , los niveles de fosforilación del Eph B4 fueron semejantes a los observados en ausencia de anticuerpos. Ensayo celular de fosforilación de Eph B4
Células HEK-293 crecidas con medio RPM1 (Sigma) suplementado con 5% de suero fetal bovino se transfectaron con el plásmido pcDNA3-ephrin B2. Se sembraron 4,5x106 células HEK-293 en un frasco de plástico T-75 (Nunc). Al día siguiente, se preparó una mezcla con 20 μg de pcDNA3-ephrinB2 y 60 μΙ de reactivo de transfección FUGENE (Roche) en 1 mi de medio OPTIMEM (Invitrogen) y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente. La monocapa celular se lavó varias veces con medio OPTIMEM (Invitrogen) sin suero y se añadió la mezcla ADN-FUGENE. Tras una incubación de 5 horas a 37° C y 5% CO2, se retiró el medio y se añadió RPM1 con 5% de suero fetal bovino. A las 48 horas, se levantaron las células transfectadas con PBS-5 mM EDTA y 5x106 células se añadieron a una placa P100 (Falcon) con células HUVEC crecidas hasta confluencia en medio EGM bullet kit (Lonza), suplementado con 10% suero fetal bovino en presencia de 20 μg/ml de los scFv anti-ephrin B2 o en ausencia de ellos. Tras una incubación de 20 minutos a 37° C y 5% CO2, las células se lisaron con tampón de lisis (100 mM Tris HCI pH 8,0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,5% Tritón X100) suplementado con cócteles de inhibidores de proteasas (Roche) y fosfatasas (Sigma). El lisado se centrifugó 25 minutos a 16.000xg, 4o C y a continuación, el sobrenadante se incubó durante 2 horas a 4o C con un complejo preformado durante 16 horas a 4o C por un anticuerpo específico frente a Eph B4 (R&D) y Proteína G acoplada a Sepharosa (GE Healthcare). Finalmente, el inmunocomplejo se lavó dos veces con tampón de lisis y se realizó una electroforesis en geles de 7,5% poliacrilamida SDS-PAGE.
La detección de Eph B4 fosforilado se realizó mediante inmunoblot. Para ello, las proteínas inmunoprecipitadas por el anticuerpo anti-Eph B4 y separadas por electroforesis se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond-C (GE Healthcare) y se bloquearon con PBS suplementado con Tween-20 (Sigma) al 0,05% y agente bloqueante Phosphoblocker® (Cell BioLabs, Inc) al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se incubó con el anticuerpo monoclonal 4G10 anti-fosfotirosina conjugado a peroxidasa (Millipore) diluido 1 :2.000 durante 16 horas a 4o C. La visualización se realizó mediante detección por quimioluminiscencia con SuperSignal® West Femto Substrate (Thermo Scientific). Para la detección del Eph B4 total, la misma membrana se regeneró con el agente ReBlot Plus Strong (Chemicon) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se incubó con el anticuerpo anti-Eph B4 (R&D) diluido 1 :1 .000 en PBS, con 0,05% Tween-20 y 5% leche semidesnatada durante 16 horas a 4o C. Tras varios lavados con PBScon 0,05% Tween-20, la membrana se incubó con un anticuerpo anti-cabra (1 :5.000) conjugado con peroxidasa (Dako) durante 2 horas a temperatura ambiente y las bandas se visualizaron con reactivo ECL Plus (GE Healthcare).
EJEMPLO 2: Actividad antiangiogénica de los anticuerpos B11 y 2B1 en células HUVEC in vitro.
Se analizó el efecto de los anticuerpos B1 1 y 2B1 sobre la capacidad angiogénica y sobre la migración de células endoteliales. Para ello, se realizaron experimentos de formación de tubos en Matrigel y ensayos de cicatrización in vitro con células HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana, del inglés "Human Umbilical Vein Endothelial Cells"), respectivamente.
En el experimento de formación de tubos en Matrigel, se observó que células HUVEC en presencia de 100 μg/ml del anticuerpo B1 1 formaban un número de túbulos 2 veces menor que en los controles sin anticuerpo o con un scFv irrelevante (Fig. 6) y, además de verse una disminución en el número de túbulos a las 6 horas de tratamiento, también se observó una mayor disposición de las células en monocapa, es decir se evidenció que se previene la formación de tubos en presencia del anticuerpo. Similares resultados se obtuvieron con el clon 2B1 , aunque con una menor capacidad de inhibición comparada con el B1 1 , un 40% con respecto a los controles. Para determinar el efecto sobre la migración lateral de células HUVEC, se realizó un experimento de cicatrización de monocapa en presencia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como agente estimulante de la migración. A las 24 horas de haber realizado la herida, el 60% de las células de la monocapa migraron a los espacios libres en el caso de estar presente VEGF o VEGF y un anticuerpo irrelevante en el proceso. Por el contrario, aquellas heridas tratadas con VEGF y B1 1 o 2B1 , únicamente fueron colonizadas por el 25% o el 30% de las células, respectivamente, datos comparables con el número de células migradas en el control negativo (20%), sin estímulo de migración presente (Fig. 7).
Por tanto, se puede concluir de ambos experimentos que los anticuerpos B1 1 y 2B1 , y especialmente el primero, específicos frente a la ephrin B2, presentan capacidad antiangiogénica y son capaces de inhibir la migración de células endoteliales in vitro.
Ensayo de formación de estructuras capilariformes en Matrigel
Placas de 24 pocilios se tapizaron con Matrigel (BD Biosciences) y se incubaron a 37° C durante 20 minutos para su gelificación. Seguidamente, se sembraron 5 x 104 células HUVEC sobre la capa de Matrigel en 1 mi de medio completo EGM-2 bullet kit (Lonza) suplementado con 10% de suero fetal bovino, y se incubaron durante 6 horas a 37° C en presencia de los diferentes anticuerpos a 100 μg/ml. A las 6 horas se estudió el grado de formación de estructuras tubulares mediante el análisis de imágines digitales obtenidas en un microscopio Axiovert 100 (Zeiss) equipado con cámara fotográfica.
Ensayo de cicatrización de heridas in vitro Los ensayos de migración celular se realizaron mediante cicatrización de heridas in vitro. Células HUVEC se crecieron hasta confluencia en placas de 24 pocilios, después de 1 hora de incubación con medio EGM-2 (Lonza) suplementado con 0,5% de suero fetal de ternera, se procedió a hacer un raspado lineal con una punta de pipeta y a tomar una fotografía de la zona. Las células se incubaron en ausencia (condiciones control) o presencia de 100 ng/ml de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular, del inglés "Vascular Endothelial Growth Factor", Peprotech) como estímulo de migración y 100 μg/ml del correspondiente anticuerpo. Al cabo de 24 horas se volvió a tomar una fotografía de la zona, se contaron las células migradas lateralmente hacia la zona de la herida y se determinó el porcentaje de área migrada desde el momento en que se hizo el raspado.
EJEMPLO 3: Efecto de los anticuerpos B11 y 2B1 sobre la vascularización de implantes de Matrigel in vivo.
Con el objeto de demostrar que los anticuerpos B1 1 y 2B1 son capaces de inhibir directamente la angiogénesis in vivo, se realizó un experimento de implantes de Matrigel suplementados con VEGF (Peprotech) en ratones desnudos atímicos nu/nu, con 6 animales por grupo. La valoración de la formación de redes capilares se llevó a cabo transcurridos 6 días desde la implantación del correspondiente Matrigel, mediante la cuantificación de hemoglobina presente en el implante extirpado y mediante tinción inmunohistológica de CD34, seguido del cálculo de las áreas positivas para este marcador de vasos sanguíneos. El tratamiento con los respectivos anticuerpos se inició por vía intravenosa inmediatamente después de la implantación del Matrigel, en días alternos, hasta alcanzar una dosis final de 300 μg/ratón. Se utilizaron implantes sin VEGF como controles negativos en los cuales no se desarrolló ningún tipo de vascularización (Fig. 8A). Por el contrario, implantes con VEGF e implantes con VEGF y tratados con un scFv irrelevante presentaron una prominente vascularización, considerándose los controles positivos del experimento. Los animales tratados con el anticuerpo B1 1 mostraron una mínima vascularización, un 95% menor que en los controles positivos, comparable a la que presentaron los animales implantados con Matrigel sin factor de crecimiento, lo que se refleja en una ausencia de células endoteliales positivas para CD34 y de hemoglobina en los implantes (Fig. 8B). El grupo de ratones tratados con el anticuerpo 2B1 mostró una inhibición del 50% en la formación de vasos con respecto a los controles positivos.
Ensayo de formación de tubos in vivo
Se emplearon ratones atímicos nu/nu de 4 a 6 semanas de edad (Charles River). Para el grupo control, los ratones anestesiados con isofluorano al 2% se inyectaron con 200 μΙ de Matrigel (BD Biosciences). Otro grupo de animales se inyectó con 200 μΙ de Matrigel suplementado con 50 ng/ml de VEGF y 375 μg/ml de heparina (Sigma) en la zona abdominal superior. Inmediatamente después de la implantación de los matrigeles se inicia el tratamiento con los scFv vía intravenosa en días alternos, hasta alcanzar una dosis total de 300 μg/ratón. A los 6 días, los implantes se extirparon y la formación de nuevos vasos se determinó en función de la concentración de hemoglobina presente y en cortes histológicos teñidos con anti-CD34, marcador de vasos sanguíneos. Para medir la hemoglobina, se tomó una porción de cada implante de Matrigel, se pesó y se homogeneizó en 300 μΙ de agua destilada. Tras una centrifugación a 16.000 x g durante 5 minutos, se tomaron 100 μΙ del sobrenadante y se diluyeron 1 :1 con sustrato TMB (3, 3', 5-5'- tetrametilbenzidina) (Sigma). Transcurridos 15 minutos, la reacción colorimétrica se valoró midiendo la densidad óptica a 650 nm. Finalmente, los valores se normalizaron frente al peso del implante.
Para el análisis inmunohistoquímico, porciones de los implantes se fijaron en formalina tamponada al 10%, se incluyeron en parafina y se realizaron cortes en micrótomo de 2,5 μηι de grosor. La recuperación antigénica se llevó a cabo con Tris-EDTA pH 9,0 y las células endoteliales se marcaron con un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD34 (Abcam) diluido 1 :75, seguido de un anticuerpo secundario anti-rata marcado con peroxidasa (Biocare Medical). La visualización se realizó mediante tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobenzidina plus (DAKO) y se contratiño con hematoxilina. Las células positivas se contaron mediante el sistema AxioVision (Zeiss).
EJEMPLO 4: los anticuerpos B11 y 2B1 inhiben del crecimiento de tumores humanos en ratones atímicos.
Dada la capacidad demostrada de los anticuerpos B1 1 y 2B1 para afectar la angiogénesis in vivo e in vitro, se estudió si también eran capaces de inhibir un proceso altamente dependiente de la angiogénesis como es el crecimiento tumoral. Para ello, se utilizaron tres modelos de xenotransplantes en ratón con células de carcinoma de páncreas (BxPC3), de colon (SW620) y de pulmón (H460). Las células de colon y pulmón expresan constitutivamente la proteína fluorescente mCherry para hacer un seguimiento de la evolución tumoral mediante el análisis de la fluorescencia que emiten. Previamente, se comprobó que ambos anticuerpos, B1 1 y 2B1 , no producían ningún efecto sobre la viabilidad celular in vitro en las tres líneas celulares empleadas.
Se implantaron subcutáneamente células BxPC3 a 2 grupos de 8 ratones y una vez que se detectó macroscópicamente la presencia de masas tumorales, se inició el tratamiento vía intravenosa con B1 1 y 2B1 en días alternos hasta completar la dosis de 20 mg/kg o con PBS como control negativo. Transcurridos 60 días desde la implantación de las células tumorales, se observó que el grupo de ratones tratados con el anticuerpo B1 1 exhibía una reducción muy significativa del tamaño tumoral, concretamente un 70% de inhibición del crecimiento comparado con el tamaño medio de los tumores del grupo control (Fig. 9). Los ratones tratados con 2B1 mostraron una reducción moderada del crecimiento tumoral, en torno al 35%.
Para estudiar los mecanismos responsables de esta inhibición en el crecimiento neoplásico, se extirparon varios tumores un día después de la finalización del tratamiento con el anticuerpo y se realizó un análisis inmunohistoquímico para valorar el estatus apoptótico, proliferativo, angiogénico y linfoangiogénico con anticuerpos frente a caspasa 3 activa, Ki67, CD34 y Lyvel , respectivamente (Fig. 10). El número de células apoptóticas en los tumores tratados con B1 1 aumentó 5 veces con respecto al de los controles. Por el contrario, la diferencia entre el número de células en apoptosis entre los tumores tratados con 2B1 y los controles no fue significativa.
Con respecto al marcador de proliferación Ki67, no se observaron diferencias representativas entre los tumores de animales tratados y los controles, presentando alrededor del 30% de células positivas para Ki67 en los tres grupos.
Cuando se analizó la presencia de vasos sanguíneos mediante medición del área positiva para CD34 en los tumores, se observó una reducción del 80% en los tumores tratados con B1 1 con respecto a los controles, y del 55% en los tumores tratados con 2B1 con respecto a los controles.
Por último, se analizó la presencia de vasos linfáticos mediante el marcador Lyvel ; en aquellos tumores tratados con B11 se observó la ausencia casi completa de vasos linfáticos. En los tumores tratados con 2B1 se observó también una disminución significativa del número de vasos linfáticos, aunque no de forma tan drástica como en el caso de B11 .
A continuación se estudió la capacidad antiangiogénica, antilinfoangiogénica e inhibitoria del crecimiento tumoral del anticuerpo B11 en otros modelos de xenoinjertos siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. En el caso de la línea celular SW620 de carcinoma de colon, se observó una reducción del 90% en el tamaño del tumor transcurridos 23 días después del implante (Fig. 1 1A), mientras que la reducción en el caso de las células de pulmón fue del 65% (Fig. 11 B). Esta reducción en los tamaños respectivos se corroboró con una disminución semejante en las emisiones de fluorescencia de la proteína mCherry, presente en las células tumorales. Los análisis inmunohistoquímicos confirmaron el descenso en el número de vasos sanguíneos y la ausencia de vasos linfáticos en los tumores tratados con B1 1 , al igual que se había observado en el modelo de células de carcinoma pancreático. Por tanto, se puede concluir que el anticuerpo B1 1 , específico para la ephrin B2, tiene una potente capacidad antiangiogénica y antilinfoangiogénica, que se traduciría en una disminución o retardo en el crecimiento de aquellos tumores tratados con el anticuerpo. El anticuerpo 2B1 también presenta una buena capacidad antiangiogénica y antilinfangiogénica.
Xenotransplantes
Se realizaron tres tipos de xenotransplantes: con células de carcinoma de páncreas (BxPC3), de colon (SW620, expresando de manera estable la proteína fluorescente mCherry (Clontech)) y de pulmón (H460, expresando de manera estable la proteína fluorescente mCherry). En los tres casos, se siguió básicamente el mismo protocolo. Se inyectaron subcutáneamente de 1 a 5 millones de células tumorales humanas en un volumen de 0,2 mi de PBS en el flanco de ratones inmunodeficientes (nude o SCID, del inglés "Severe Combined Immunodeficiency") hasta observar macroscópicamente la presencia de una masa neoplásica (de unos 30 mm3). En este momento se inició el tratamiento mediante la administración intravenosa, a través de las venas de la cola, de los correspondientes anticuerpos en 100-200 μΙ de PBS en días alternos durante 2 semanas o hasta alcanzar la dosis final de 20 mg/kg. Los animales control recibieron PBS siguiendo las mismas pautas. Se midieron los tamaños de los tumores con un calibre 2-3 veces por semana y, en el caso de los ratones xenotransplantados con células marcadas con proteína fluorescente mCherry, además se midió la intensidad de emisión de fluorescencia (número de fotones por segundo y centímetro cuadrado) a 610 nm en un sistema de imagen IVIS Spectrum 200 (Caliper LifeSciences) para visualizar el crecimiento tumoral en función de la intensidad de emisión de la proteína mCherry. El procesamiento final de las imágenes incluye una sustracción de la señal residual (eliminación de la autofluorescencia) y una coloración a escala siguiendo un perfil de intensidad de señal. Los animales se sacrificaron por asfixia con CO2 cuando la neoplasia alcanzó un tamaño predeterminado de 1.500-2.000 mm3, de acuerdo con la Legislación vigente relativa al uso de animales de experimentación. El análisis estadístico de las medidas de crecimiento tumoral se realizó mediante análisis paramétrico utilizando la prueba t-Student. El nivel de significación estadística se situó en p<0,05.
Análisis histológicos
Las muestras tumorales procedentes de los ratones xenotransplantados se extrajeron a partir de animales sacrificados un día después de la finalización del tratamiento con los anticuerpos. Dichas muestras se fijaron con formalina y se embebieron en parafina. Los cortes histológicos procedentes de cada tumor se tiñeron con hematoxilina y eosina o se prepararon para una caracterización inmunohistoquímica. La actividad proliferativa de las células tumorales se analizó mediante tinción con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-K¡67 (DAKO), la presencia de células apoptóticas se detectó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-caspasa 3 activa (R&D), la nueva vascularización se midió mediante tinción contra CD34 en células endoteliales con un anticuerpo monoclonal de rata específico (Abcam) y los vasos linfáticos se marcaron mediante tinción con un anticuerpo policlonal de conejo anti-LYVE1 (Abcam). La visualización de todos los cortes se llevó a cabo con tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobenzidina plus (DAKO) y se contratiñeron con hematoxilina. Las células positivas se contaron mediante el sistema AxioVision (Zeiss).
EJEMPLO 5: Biodistribución y localización de masas tumorales in vivo.
Con el objeto de analizar la distribución del anticuerpo dentro de los animales y comprobar que se localizaba en las zonas de desarrollo tumoral, se diseñó un experimento en el cual ratones xenostransplantados con una línea tumoral, en este caso H460 de carcinoma de pulmón, fueron tratados con el anticuerpo marcado con un fluorocromo AlexaFluor®750 (Molecular Probes) cuya emisión está cercana al infrarrojo. Para confirmar la posición de la masa tumoral se utilizaron células que expresan la proteína fluorescente mCherry. En ratones atímicos desnudos nu/nu se implantaron por vía subcutánea en la región dorsal células H460. Cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 0,3 cm3, se administraron por vía intravenosa 15 μg del anticuerpo conjugado con AlexaFluor®750. A las 0,5, 2, 6, 24 y 48 horas después de la administración, se tomaron imágenes de las regiones ventral y dorsal. El estudio de las imágenes dorsales de los ratones sirvió para localizar los anticuerpos en la masa tumoral desde la media hora de su administración (Figura 12A) con un nivel máximo a las 6 horas (Figura 12B). La intensidad de fluorescencia en el tumor emitida por el anticuerpo B1 1 a las 6 horas fue claramente superior a la mostrada por el anticuerpo 2B1 , indicando que B1 1 localiza más eficientemente en la zona tumoral que 2B1. A la media hora la señal en la zona vesical y en los ríñones fue muy intensa, indicando una rápida y activa eliminación de los anticuerpos por vía renal. A las 48 horas, la señal en estas zonas era muy débil, con valores cercanos a la autofluorescencia, sugiriendo que la práctica totalidad de los anticuerpos habían sido completamente eliminados. Además, los animales mostraron una señal de fluorescencia durante las primeras horas en la región ventral superior, atribuible a un cierto grado de eliminación de los anticuerpos por vía hepatobiliar, este hecho se demostró cuando se analizaron los órganos por separado y se comprobó que el hígado a las 6 horas presentaba una fluorescencia de alrededor de 1 x 108 p/s/cm2/sr (fotones/segundo/centímetro cuadrado/esterdian).
Biodistribución
Para el experimento de la distribución de los scFv se utilizaron ratones nude xenotransplantados con la línea de carcinoma de pulmón H460 expresando de manera estable la proteína fluorescente mCherry. La utilización de células con marcadores fluorescentes se realizó para situar inequívocamente el tumor. Se inyectaron 5 x 106 células por vía subcutánea y se dejaron crecer hasta que la masa neoplásica alcanzó un tamaño en torno a 500 mm3. Paralelamente, los scFv se conjugaron al fluorocromo AlexaFluor®750 mediante el SAIVI™ Rapid Antibody Labeling Kit (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. Una vez que los tumores alcanzaron el tamaño esperado, a cada ratón se inyectaron vía intravenosa 15 μg de anticuerpo marcado. Las imágenes de fluorescencia in vivo se tomaron a las 0,5, 2, 6, 24 y 48 horas después de la administración del scFv marcado con un sistema de imagen in vivo IVIS Spectrum 200 (Caliper LifeSciences) excitando el fluorocromo a 749 nm. Tras eliminar la autofluorescencia, se procedió a dar una coloración a escala siguiendo un perfil de intensidad de señal.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un polipéptido aislado caracterizado porque:
(a) comprende una secuencia aminoacídica de al menos un 76% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y
(b) reconoce y se une específicamente a la ephrin B2.
2. El polipéptido según la reivindicación anterior donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1 .
3. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde dicho polipéptido es un anticuerpo.
4. El polipéptido según la reivindicación anterior donde dicho anticuerpo es humano.
5. El polipéptido según la reivindicación anterior donde el isotipo del anticuerpo humano es lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4 o IgA.
6. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende un péptido señal.
7. El polipéptido según la reivindicación anterior donde el péptido señal es SEQ ID NO: 6.
8. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende al menos un marcador.
9. El polipéptido según la reivindicación anterior donde el marcador se selecciona de la lista que comprende: c-myc, FLAG, HA, cadena de histidinas, GST, biotina, VSV-G, HSVtk, V5, biotina, avidina, estreptavidina, proteína de unión a maltosa y una proteína fluorescente.
10. El polipéptido según la reivindicación anterior donde el marcador es una cadena de histidinas, c-myc o ambos.
1 1 . El polipéptido según la reivindicación anterior donde la secuencia aminoacídica de dicho polipéptido es SEQ ID NO: 7.
12. Un anticuerpo contra ephrin B2 cuya secuencia aminoacídica comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Un ácido nucleico que codifica para el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o para el anticuerpo según al reivindicación 12.
14. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación anterior.
15. El vector según la reivindicación anterior donde el vector es un vector de expresión.
16. Una célula que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15.
17. La célula según la reivindicación anterior donde dicha célula es procariota.
18. La célula según la reivindicación 16 donde dicha célula es eucariota.
19. La célula según la reivindicación anterior donde dicha célula es una célula de mamífero.
20. Un método de obtención del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o del anticuerpo según la reivindicación 12, que comprende las etapas (a) expresar el vector descrito según la reivindicación 15 en una célula y (b) purificar el polipéptido expresado en la etapa (a).
21 . El método según la reivindicación anterior donde la célula es procariota.
22. El método según la reivindicación 20 donde la célula es eucariota.
23. Un método de detección y/o cuantificación de la ephrin B2 que comprende las etapas (a) poner en contacto una muestra biológica aislada con el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o con el anticuerpo según al reivindicación 12 y (b) detectar y/o cuantificar el complejo formado por la ephrin B2 y dicho polipéptido o dicho anticuerpo, en la muestra empleada en (a).
24. Un método de diagnóstico de una enfermedad asociada a la expresión de la ephrin B2 que comprende las etapas (a) poner en contacto una muestra biológica aislada con el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o con el anticuerpo según la reivindicación 12, (b) detectar y/o cuantificar el complejo formado por la ephrin B2 y dicho polipéptido o dicho anticuerpo en la muestra empleada en (a), (c) comparar los niveles de ephrin B2 detectados con los niveles control y (d) asociar el resultado de dicha comparación a la presencia o ausencia de la enfermedad.
25. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 o del anticuerpo según la reivindicación 12, para preparar un medicamento.
26. Uso según la reivindicación anterior para inhibir la angiogénesis.
27. Uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una condición patológica asociada a la angiogénesis.
28. Uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un tumor o del cáncer.
29. Uso según la reivindicación anterior donde el tumor o el cáncer es sólido.
30. Uso según la reivindicación anterior donde el cáncer es de páncreas, colon o pulmón.
31 . Una composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , el anticuerpo según la reivindicaciín 12, el ácido nucleico según la reivindicación 13, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 o la célula según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.
32. La composición según la reivindicación anterior, donde dicha composición es una composición farmacéutica.
33. La composición según la reivindicación anterior caracterizada porque además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
34. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32 caracterizada porque además comprende un agente antiangiogénico.
35. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32 caracterizada porque además comprende un agente quimioterapéutico.
36. Uso de la composición según cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores para preparar un medicamento.
37. Uso según la reivindicación anterior para inhibir la angiogénesis.
38. Uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una condición patológica asociada a la angiogénesis.
39. Uso según la reivindicación anterior para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un tumor o del cáncer.
40. Uso según la reivindicación anterior donde el tumor o el cáncer es sólido.
41 . Uso según la reivindicación anterior donde el cáncer es de páncreas, colon o pulmón.
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