WO2012070977A1 - Способ получения белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, хозяйская клетка и штаммы-продуценты - Google Patents

Способ получения белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, хозяйская клетка и штаммы-продуценты Download PDF

Info

Publication number
WO2012070977A1
WO2012070977A1 PCT/RU2010/000752 RU2010000752W WO2012070977A1 WO 2012070977 A1 WO2012070977 A1 WO 2012070977A1 RU 2010000752 W RU2010000752 W RU 2010000752W WO 2012070977 A1 WO2012070977 A1 WO 2012070977A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
recombinant
web
spider
yeast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2010/000752
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Григорьевич БОГУШ
Михаил Юрьевич БЕБУРОВ
Владимир Георгиевич ДЕБАБОВ
Дмитрий Георгиевич КОЗЛОВ
Ирек Ильясович ГУБАЙДУЛЛИН
Любовь Ивановна ДАВЫДОВА
Игорь Арсеньевич ЗАЛУНИН
Константин Васильевич СИДОРУК
Сергей Эдуардович ЧЕПЕРЕГИН
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP10859885.5A priority Critical patent/EP2644616B1/en
Priority to US13/989,727 priority patent/US9475852B2/en
Publication of WO2012070977A1 publication Critical patent/WO2012070977A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • a method of producing a web protein, a fusion protein, a recombinant DNA, an expression vector, a host cell and producer strains is a method of producing a web protein, a fusion protein, a recombinant DNA, an expression vector, a host cell and producer strains.
  • the invention relates to the field of biotechnology and is directed to a method for producing recombinant spider web spider proteins, fusion proteins containing recombinant spider web web proteins and ubiquitin sequences of similar proteins, recombinant DNA encoding fusion proteins, host yeast cells and expression vectors used for the implementation of the method, as well as producer strains of recombinant proteins of the web of spider spiders.
  • the web is a unique biomaterial that combines amazing strength and elasticity. According to these indicators, it has no analogues both in nature and among materials created by man. So, for example, the skeleton thread of the web of the Nephila clavipes spider-spider surpasses steel in terms of tensile strength and is comparable to Kevlar, and surpasses Kevlar in the value of the gap energy; at the same time, it can stretch up to 35% of its length [Gosline J.M. et al. Endeavor, 1986, v. 10, 37-43].
  • the most studied skeleton thread of the Nephila clavipes orbiting spider consists of two proteins - spidroin 1 and spidroin 2 (MaSp l and MaSp2, respectively) synthesized by the large ampulla gland [Hinnman M. & Lewis R.
  • the repeating element of speedroin 1 can be represented as the following consensus sequence:
  • speedroin 1 is characterized by increased strength, and speedroin 2, capable of forming ⁇ -helices [Hayashi et al., 1999, Int. J. Biol. Macromol., V. 24, 271-275], - great elasticity.
  • speedroin 2 capable of forming ⁇ -helices [Hayashi et al., 1999, Int. J. Biol. Macromol., V. 24, 271-275], - great elasticity.
  • the MiSp l and MiSp2 proteins, synthesized by the small ampulla gland, and the Flag protein of the hunting strand of the spider-spider also have a repeating structure.
  • the repeating regions are enriched with alanine and glycine.
  • GGX and GA motifs are presented along the entire length of the amino acid sequence of both the MiSpl protein and MiSp2 protein [K. Vasanthavada et al. Cell. Mol. Life Sci, 2006, v. 63, 1986-1999].
  • dominant repeating motifs are represented by the pentapeptide GPGG1X and the tripeptide GGX.
  • the first step in the study of molecular mechanisms of cobweb assembly was to study the primary structure of the frame proteins ADF-3 and ADF-4 of the garden spider web (Araneus diadematus),
  • the aggregation properties of the obtained proteins revealed the role of various elements of the primary structure of the web proteins. It was found that repetitive regions occupying the main extent of the web proteins and containing a consensus sequence,
  • Non-repeating C-terminal regions play an important role in initiating protein assembly.
  • two modules were used as synthetic building blocks: a poly-A module and a second module consisting of four GPGQQ repeats. Modules of this type are also described by Hammerich et al. [Hummerich, D. et al., 2004, Biochemistry, v. 43, 13604-13612].
  • Synthetic 1F9 protein gene was expressed in yeast
  • the average yield of pure 1F9 protein was approximately 70 mg per kg of wet cell mass (approximately 23 mg / L fermentation culture).
  • the repeating region of the 1F9 protein contained 9 repetitions of the “monomer”, consisting of five variants of the primary repeats found in
  • nanofibrils and micelles both proteins in an aqueous solution spontaneously formed nanofibrils with a length of 100 nm - 1 ⁇ m and micelles with a diameter of about 1 ⁇ m. Moreover, nanofibrils had a spiral structure with a period of 40 nm.
  • yeast ubiquitin is used as an efficiently expressed component, hybrids undergo highly specific intracellular processing in yeast cells.
  • the yeast ubiquitin consisting of 76 amino acid residues, is a member of the ubiquitin-like eukaryotic protein family, to which include relatively small structurally conserved proteins with an extraordinary folding rate, high
  • ubiquitin-like protein family contains the conserved C-terminal motif Gly-Gly, which is a processing site [Miiller et al., 2001, Nature, v. 2, 202-210].
  • Gly-Gly is a processing site [Miiller et al., 2001, Nature, v. 2, 202-210].
  • the presence of this site in the composition of hybrid proteins with ubiquitin leads to the fact that in yeast cells hybrids undergo highly specific intracellular processing under the action of ubiquitin-specific DUB proteinases, as a result of which the ubiquitin component in the composition of the final expression products
  • ubiquitin family in particular, the yeast variant of SUMO protein.
  • SUMO-specific yeast proteinases provide high efficiency and specificity for processing SUMO-containing fusion proteins [Malakhov et al., 2004, J. Struct. Funct. Genom., V. 5, 75-86; Butt et al., 2005, Protein Expr. Purif., V. 43, 1-9].
  • the authors of the present invention for the first time proposed a method for producing recombinant web proteins of spider-web spiders (Araneidae) in yeast cells, providing for the production of recombinant proteins in amounts ten times greater than the amount of recombinant web proteins produced in accordance with methods known from
  • recombinant spider web spider proteins are expressed in yeast cells as a hybrid with a ubiquitin-like protein occupying the oomier-terminal position and containing a processing site recognized by natural yeast proteinases, preferably ubiquitin-specific O DUB or specific yeast proteinases, as a result of which, during expression, the hybrid proteins are processed by proteinases, which ensures the accumulation of mature cells in yeast cells logo of a web protein that does not contain a hybrid component, and the protein accumulates in the water-insoluble fraction of yeast cells.
  • natural yeast proteinases preferably ubiquitin-specific O DUB or specific yeast proteinases
  • the method according to the invention provides for the production of recombinant web protein, consensus
  • the method according to the invention provides for the production of recombinant web proteins whose consensus sequences are derived from the framework proteins of the large ampuloid gland Nephila clavipes and / or Nephila madagascariensis, and
  • the ubiquitin-like protein is selected from the group consisting of ubiquitin and SUMO yeast Saccharomyces cerevisiae protein.
  • the method according to the invention is directed to the production of a recombinant protein 2E12 of the Nephila madagascariensis skeleton spider yarns in Saccharomyces cerevisiae cells under the control of the yeast GAL1 gene promoter, the recombinant protein gene being fused to the sequence encoding ubiquitin or sacrumis cereus protein.
  • the method according to the invention is directed to the expression of the recombinant gene 1F9 protein of the skeleton of the Nephila clavipes spider-spider in Saccharomyces cerevisiae cells under the control of the yeast GAL1 gene promoter, the recombinant protein gene being fused to the sequence encoding the ubiquitin Sariceum cereum protein or Saromyce protein.
  • the invention is directed to a fusion protein
  • the sequence of the recombinant web protein includes consensus sequences that originate from the repeating sequences of the MaSpl and MaSp2 framework protein proteins the large ampuloid gland, the MiSpl and MiSp2 proteins of the small ampuloid gland, and the Flag protein of the hunting spider.
  • the invention is directed to a fusion protein in which the ubiquitin-like protein is ubiquitin or SUMO yeast Saccharomyces cerevisiae protein, and
  • the sequence of the recombinant web protein includes consensus sequences derived from the repeating protein sequences of the framework filament MaSpl and MaSp2 of the large ampuloid gland Nephila clavipes and Nephila madagascariensis and selected from the group: AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
  • the fusion protein comprises a recombinant protein 1F9 of a Nephila clavipes orb spider skeleton,
  • the fusion protein comprises a recombinant protein 2E12 of the Nephila madagascariensis skeleton spider yarn, the sequence of which is fused to
  • the invention is directed to a recombinant DNA encoding a fusion protein, comprising a recombinant spider-web spider-web protein and a ubiquitin-like protein occupying the ⁇ -terminal position in the composition of the fusion protein
  • recombinant web protein includes consensus sequences that originate from repeating protein sequences
  • the recombinant DNA encodes a fusion protein in which the ubiquitin-like protein is ubiquitin or SUMO yeast SUMcharomyces cerevisiae protein, and the sequence
  • a recombinant spider web spider protein includes consensus sequences derived from repeating sequences proteins MaSp 1 and MaSp2 of the large ampoule gland Nephila clavipes and Nephila madagascariensis and selected from the group:
  • the recombinant DNA of the invention encodes a fusion protein comprising the sequences of the recombinant protein 1 F9 of the skeleton spider Nephila clavipes and ubiquitin or SUMO yeast SUMcharomyces cerevisiae protein, and having
  • the recombinant DNA encodes a fusion protein comprising sequences
  • the invention relates to expression vectors, which include DNA sequences encoding recombinant spider-web spider proteins fused to the ubiquitin-like protein gene sequence occupying the ⁇ -terminal position with respect to the recombinant web protein in the fusion protein, and sequences of highly efficient regulated yeast promoters.
  • the invention provides expression vectors that comprise a recombinant DNA encoding a fusion protein in which the ubiquitin-like protein is ubiquitin or SUMO yeast SUMO protein Saccharomyces cerevisiae, and the recombinant web protein sequence includes consensus sequences, derived from repeating sequences of MaSpl proteins and
  • the invention provides an expression vector representing the pPDX3-HUB-2E12 bireplicon vector containing the replication initiation region of the endogenous 2- ⁇ m yeast plasmid, the promoter region of the yeast gene GAL1,
  • the invention provides an expression vector representing the pPDX3-SUMO-lF9 bireplicon vector, comprising the replication initiation region of the endogenous 2 ⁇ m yeast plasmid, the promoter region of the GAL1 yeast gene, a DNA sequence encoding a recombinant 1F9 protein fused to a sequence encoding a sequence encoding a coding sequence SUMO Saccharomyces cerevisiae protein.
  • the invention provides
  • host yeast cells producing recombinant web proteins orbiting spider.
  • the most preferred host cells according to the invention are Saccharomyces cerevisisae yeast cells.
  • the invention provides producer strains.
  • FIG. 1 Electrophoresis in 12% SDS page with DDS-Na fractions 1F9 after
  • FIG. 2 Electrophoresis in 12% SDS page with DDS-Na fractions 2E12 after
  • Lanes 1 — Stock solution before application to the column; 2 - slip; 3 - Molecular mass standards (from top to bottom, in kDa): 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17; 4- fraction containing 2E12; 5 - sample of standard 2E12.
  • FIG. 3 The vector map pPDX3-HUB-lF9.
  • SPIDROIN - synthetic gene of the recombinant protein 1F9 (spidroin - 1 spider N.clavipes); HUB - S.cerevisiae yeast ubiquitin gene; GAL 1 - promoter region of the GAL1 gene of S. cerevisiae yeast; URA3 and PGK1 are the structural genes URA3 and PGK1 of S. cerevisiae yeast, respectively; cyclT - yeast CYC1 gene transcription terminator sequence
  • S. cerevisiae 2 mkm is a fragment of the endogenous 2-micron plasmid of S. cerevisiae yeast containing the region of origin of replication;
  • pUC18 is a fragment of plasmid pUC 18 containing the beta-lactamase gene (ApR) and the region of origin of replication, which provides selective amplification of the vector in E. coli cells.
  • FIG. 4 The vector map pPDX3-SUMO-lF9.
  • SPIDROIN - synthetic gene of recombinant protein 1F9 recombinant spidroin-1 spider N.clavipes
  • GAL1 - promoter region of the GAL1 gene of S. cerevisiae yeast URA3 and PGK1 - structural genes of URA3 and PGK1 S. cerevisiae yeast, respectively
  • S.cerevisiae yeast CYC1 gene transcription terminator 2 mkm is a fragment of the endogenous 2-micron plasmid of S. cerevisiae yeast containing the region of the onset of replication of yeast;
  • pUC18 is a fragment of plasmid pUC18,
  • FIG. 5 Scheme of the vector pPDX3-HUB-2E12.
  • S.cerevisiae yeast CYC1 gene transcription terminator 2 mkm is a fragment of the endogenous 2-micron plasmid of S. cerevisiae yeast containing the region of origin of replication;
  • pUC18 is a fragment of the plasmid pUC18 containing the beta-lactamase gene (ApR) and the region of origin of replication, which provides selective amplification of the vector in E. coli cells.
  • FIG. 6 Photograph of an artificial yarn of 1F9 protein in a vessel with ethanol.
  • the present invention is based on the unexpected discovery that the expression of a recombinant spider-web spider protein in yeast cells as a fusion protein with a ubiquitin-like protein occupying the ⁇ -terminal position of the hybrid allows tenfold increase the production of the recombinant web protein, and the recombinant protein expressed as a fusion protein accumulates in yeast cells in a water-insoluble fraction as a processed protein, not
  • the present invention provides a method for producing a recombinant spider-web spider web protein in yeast cells, comprising constructing an expression vector, transformation of yeast cells with the obtained expression vector and expression in the transformed cells of the gene of the recombinant spider-web spider web protein, characterized in that an expression vector is used that includes a DNA sequence encoding a recombinant spider-web spider web protein fused to
  • yeast proteinases preferably ubiquitin-specific protein DUB or SUMO-specific yeast proteinases, as a result of which the expression of the hybrid proteins is processed by proteinases, which ensures the accumulation of yeast cells in the water-insoluble fraction
  • Recombinant proteins obtained by the method according to the invention have a pronounced peridic structure, which can be represented as a series of consensus sequences deduced by aligning the repeating units of the natural proteins of the web of spider-web spiders.
  • Recombinant proteins according to the invention have a pronounced peridic structure, which can be represented as a series of consensus sequences deduced by aligning the repeating units of the natural proteins of the web of spider-web spiders.
  • MaSpl and MaSpl are proteins of the frame filament of the large ampulliform gland Latrodectus hesperus [Lawrence B. A. et al., 2004, Biomacromolecules, v. 5, 689-695];
  • MiSpl and MiSpl are proteins of the small ampuloid gland Nephila clavipes [Colgin M. A. & Lewis R. V., 1998, Protein Sci., V. 7, 667-672];
  • consensus sequences are used that are derived from the repeating sequences of proteins of the large ampuloid gland Nephila clavipes and Nephila madagascariensis and selected from the group:
  • the construction of artificial genes encoding the recombinant proteins of the large and / or small ampulliform glands, or Flag proteins of the hunting thread of the spider-spider includes the reconstruction of the DNA sequence, encoding a consensus sequence or combinations of repeats of consensus sequences of various types, derived from the repeating sequences of the above proteins;
  • sequences of the corresponding cDNA can be derived based on the sequence of the natural protein, taking into account the degeneracy of the code and the frequency of occurrence of codons in yeast.
  • fragments encoding the most typical primary repeats were selected from the sequence of the natural protein and differed from each other in a set of deletions. The reconstructed DNA sequence included
  • the proposed method for producing a recombinant spider-web spider protein in yeast cells involves fusion of a recombinant web protein gene with a DNA sequence encoding a acubitin or SUMO yeast SUMcharomyces cerevisiae protein.
  • recombinant protein 1F9 of the Nephila clavipes spider-web spider web frame protein is obtained in Saccharomyces cerevisiae cells, wherein
  • the structural gene of the 1F9 protein is fused to the DNA sequence encoding ubiquitin Saccharomyces cerevisiae.
  • recombinant 2E 12 skeleton of the Nephila madagascariensis spider web spider web is obtained in Saccharomyces cerevisiae cells, wherein the 2E12 protein gene is fused to the DNA sequence encoding Saccharomyces cerevisiae ubiquitin.
  • a fusion protein containing the recombinant 1F9 protein sequence is expressed in Saccharomyces cerevisiae yeast cells, the 1F9 protein sequence being fused to the SACcharomyces cerevisiae yeast SUMO sequence.
  • Recombinant proteins obtained according to the proposed method were isolated from the water-insoluble fraction of the host cells of Saccharomyces cerevisiae using
  • recombinant proteins 1F9 and 2E12 accumulate in the fraction water-insoluble proteins of yeast cells (recombinant proteins are practically absent in the water-soluble fraction) and do not contain a component of a ubiquitin-like protein. Electrophoretic indicates this.
  • the recombinant protein synthesized in Saccharomyces cerevisiae cells accumulates in the fraction
  • water-insoluble proteins in the form of a processed protein that does not contain a hybrid component and cells expressing the recombinant web protein accumulate tens of times more recombinant protein than in accordance with methods known from the prior art.
  • the purified recombinant spider-web spider proteins according to the invention are capable of forming supramolecular structures of various types, in particular, the analyzed proteins form water-insoluble filaments (Example 12, Fig. 8).
  • the invention is directed to fusion proteins, comprising sequences of a recombinant spider-web spider protein and a ubiquitin-like protein occupying a ⁇ -terminal position in the composition of the fusion protein, wherein the sequence of the recombinant web protein includes consensus sequences, which come from
  • the invention is directed to a fusion protein in which the ubiquitin-like protein is ubiquitin or SUMO yeast Saccharomyces cerevisiae protein, and
  • sequence of the recombinant spiderweb spider web protein includes consensus sequences derived from
  • the fusion protein comprises a sequence of recombinant protein 1F9 of the Nephila clavipes orb spider skeleton fused to the sequence encoding ubiquitin or SUMO Saccharomyces cerevisiae protein as shown in the Sequence Listing (SEQ ID No. 1 and SEQ ID NO: 3, respectively) .
  • the fusion protein comprises a recombinant 2E12 protein sequence of the Nephila madagascariensis skeleton spider yarns fused to a sequence encoding a ubiquitin or SUMO Saccharomyces cerevisiae protein.
  • the invention encompasses recombinant DNAs encoding fusion proteins. Synthesized and Cloned
  • the DNA sequences used in accordance with the invention for the production of recombinant web proteins encode fusion proteins, including sequences of a recombinant spider-web spider web and ubiquitin-like protein, occupying the ⁇ -terminal position in the composition of the fusion protein, the recombinant sequence the web protein includes consensus sequences that originate from the repeating sequences of MaSpl and MaSp2 large ampoule-jelly proteins s, and proteins MiSp l MiSp2 minor ampullate gland protein trapping yarn Flag orb weaving spider.
  • the recombinant DNA encodes a fusion protein in which the ubiquitin-like protein is ubiquitin or SUMO yeast SUMcharomyces cerevisiae protein, and the sequence
  • the recombinant spider-web spider web protein includes consensus sequences derived from the repeating sequences of the proteins MaSp 1 and MaSp2 of the large ampuloid gland Nephila clavipes and Nephila madagascariensis and selected from the group:
  • the recombinant DNAs used in accordance with the invention for the production of recombinant web proteins encode the recombinant protein 1 f9 of a skeleton spider
  • Nephila clavipes or recombinant protein 2E12 of the Nephila madagascariensis orb spider skeleton the sequences of which are fused to the sequence encoding ubiquitin or SUMO yeast protein SUMcharomyces cerevisiae, as shown in the List of sequences (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and : 3).
  • the DNAs of the present invention also include coding sequences taking into account the degeneracy of the code and sequences used as primers in amplification reactions.
  • the proteins of the invention are obtained in yeast cells with
  • expression vectors which include the gene for a fusion protein containing the sequences of the recombinant protein of the spider web of the spider-web and ubiquitin-like protein, and highly effective regulated yeast promoters, in particular such promoters as GAL1, GPD1, CUP1.
  • Suitable vectors for constructing expression vectors in accordance with the invention can be used
  • episomal vectors containing the region of initiation of replication of the endogenous 2- ⁇ m plasmid of yeast, which ensures their ability to be maintained in the yeast cells in an episomic multi-copy state.
  • expression vectors carrying recombinant DNA encoding a fusion protein are constructed, wherein the ubiquitin-like protein is ubiquitin or Saccharomyces cerevisiae yeast SUMO protein, and the sequence of the recombinant spider-web spiderweb protein includes consensus sequences derived from repeating sequences from protein sequences MaSpl and MaSp2 of the large ampuloid gland Nephila clavipes and Nephila madagascariensis.
  • pPDX3-HUB-lF9 Fig. 3
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae, and in each case, the fusion of the structural gene of the 1F9 protein or 2E12 protein and the ubiquitin gene is performed in one reading frame.
  • a pPDX3-SUMO-lF9 expression bireplicon vector is constructed which is obtained by cloning the sequence of the 1F9 protein gene in the pPDX3-SUMO plasmid, which contains the Saccharomyces cerevisiae structural gene SMT3 encoding the protein encoding a protein under the control of the yeast GAL1 promoter region.
  • SUMO Saccharomyces cerevisiae moreover, as a result of cloning carry out the merger in one reading frame
  • the expression vectors pPDX3-FiUB-lF9, pPDX3-HUB-2E12 and P PDX3-SUM0-1F9 contain the region of initiation of replication of the endogenous 2- ⁇ m yeast plasmid, which
  • Saccharomyces. cerevisiae in an episomic multi-copy state Saccharomyces. cerevisiae in an episomic multi-copy state.
  • the invention provides
  • yeast cells producing recombinant spider-web spider-web proteins.
  • yeast cells are used which are selected from the group consisting of Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris and Schizosaccharomyces pombe.
  • Preferred host cells are Saccharomyces cerevisisae cells. Most preferably as host cells
  • Saccharomyces cerevisiae D702 which is diploid, which provides increased stability of its expression characteristics.
  • Saccharomyces cerevisiae D702 contains homozygous mutations in the chromosomal alleles of the PGK1 structural gene encoding phosphoglycerate kinase, which ensures stable
  • the cells of the recipient strain of Saccharomyces cerevisiae D702 are transfected with the expression vector pPDX3-HUB-lF9.
  • the cells of the recipient strain of Saccharomyces cerevisiae D702 are transfected with the expression vector pPDX3-HUB-2E12.
  • the resulting strain SCR-702-2E12 producing the recombinant protein 2E12 of the skeleton of the spider web of the spider Nephila madagascariensis was deposited
  • VKPM Industrial Microorganisms
  • the cells of the recipient strain of Saccharomyces cerevisiae D702 are transfected with the expression vector pPDX3-SUMO-lF9.
  • SCR-702-2E12 (a / a Ieu2lleu2 yigaz / yigaz trplltrpl gal80: LEU2lgal80: LEU2 lys7ILYS7 his3 / H! S3 his4 / HIS4 pgkl URA3 / pgkl URA3 GAL4: (STA2p-GAL4, GAL4, TR4: TRP1) STA2 / STA2 sue 0 / SUC 2) / pPDX3-2E12
  • YPD agar medium of the following composition (in wt.%): peptone-2, yeast extract - 1, glucose - 2, agar -2, water - the rest, the cells of the producer strains of Saccharomyces cerevisiae have an oval shape, 3 - 7 microns in diameter. Cells are budded. The budding is true, many-sided.
  • Colonies are as follows:
  • strains ferment glucose, fructose, maltose, sucrose, dextrins, and starch. Do not ferment lactose, galactose, inulin, xylose, arabinose.
  • the strains are stored at a temperature of -70 ° C in a 20% aqueous solution of glycerol. Storage on an agarized rich medium with glucose is possible for 3 months at + 4 ° C.
  • the stability of the claimed strains is maintained at 20 consecutive transfers in agarized YPD medium at a temperature of 28 ° C.
  • yeast ubiquitin The structural gene of yeast ubiquitin is amplified in the PNR reaction using the laboratory strain S. cerevisiae Y618 as a chromosomal DNA template [Kartasheva et al, 1996, Yeast, v.12, 1297-13] isolated using the Sidoruk method [Sidoruk et al., 2008 , Collection of abstracts and reports
  • the amplification primers are N513 (5'-ataccatggaacatcatcatcatcatcatcatcatggaggcatgcagatcttcgtcaagactttga) and N514 (5'-actggatccacctcttagccttagcacaac).
  • the amplified DNA fragment of 510 bp. elute from agarose gel with
  • Plasmid pi 01-25 contains the site recognition of Xhol restriction enzyme in the polylinker region following the BamHI cloning site.
  • the promoter region of the GAL1 gene and the nucleotide sequence encoding ubiquitin are cloned in the laboratory vector pPDX3, the DNA of which is split at the same sites. Cloning yields the pPDX3-HUB vector, which is used for gene cloning
  • the expression vector pPDX3-HUB-lF9 (Fig. 3) is obtained by cloning a Bglll / Xhol DNA fragment of the laboratory plasmid pUC21-lF9 3.6 kbp, including the 1F9 protein gene, in the vector pPDX3-HUB, the DNA of which is split into BamHI and Xhol sites. Cloning yields the expression vector pPDX3-HUB-lF9, in which the structural gene of the 1 F9 protein is fused in the same reading frame as the structural gene encoding ubiquitin. The vector is used to express 1F9 protein in S. cerevisiae yeast cells.
  • the expression vector pPDX3-HUB-2E12 is obtained by cloning a Bglll / Xhol DNA fragment of the laboratory plasmid pUC21-2E 12 with a size of 4.2 kb, including the 2E12 protein gene, in the pPDX3-HUB vector, the DNA of which is split at the BamHI and Xhol sites . Cloning yields the expression vector pPDX3-HUB-2E12, in which the structural gene of the 2E 12 protein is fused in the same reading frame as the structural gene encoding ubiquitin. The vector is used to express 2E12 protein in S. cerevisiae yeast cells.
  • the S.cerevisiae yeast structural gene SMT3 encoding the SUMO protein is amplified by PCR using a laboratory strain of S. cerevisiae as the chromosomal DNA template as in Example 1.
  • Amplification is carried out in two stages. First, two overlapping DNA fragments are amplified, for which the following pairs of primers are used:
  • N452 (5'-atatcaattggatccaccaatctgttctctctgtga).
  • Amplified DNA fragments are eluted from the agarose gel and used for PCR ligation.
  • a mixture of fragments 1 and 2 is used as a template for PCR, N450 and N452 serve as primers.
  • the resulting plasmid p 101-18 contains a DNA fragment, in which the yeast SMT3 gene is fused to the promoter region of the yeast GAL1 gene.
  • the polylinker part of plasmid p 101 - 18, following the BamHI cloning site, is the Xhol restriction enzyme recognition site.
  • the Hindlll / Xhol DNA fragment of plasmid p 101-18 including the promoter region of the GAL1 gene and the cloned SMT3 gene, is cloned in the laboratory pPDX3 vector, the DNA of which is cleaved at the same sites.
  • cloning receive the vector pPDX3-SUMO, which is used to clone genes of recombinant web proteins.
  • Example 5 Construction of the expression vector pPDX3-SUMO-lF9.
  • Cloning yields the expression vector pPDX3-HUB-lF9, in which the 1F9 protein structural gene is fused in the same reading frame as the structural gene encoding ubiquitin.
  • the vector is used to express 1F9 protein in S. cerevisiae yeast cells.
  • Example 6 Construction of strain SCR-702-1F9 - producer of protein 1F9 (VKPM Y-3583).
  • strain SCR-702-1F9 is obtained by transformation
  • cells of strain D702 are grown for 18-24 hours at a temperature of 28 ° C on YPGE agarized medium, the following composition in wt.%: Bactopeptone - 2, yeast extract - 1, bactoagar - 2, ethanol - 2, glycerin - 3 water is the rest.
  • the transformation of the grown cells of strain D702 is carried out according to the method of Ito et al. [Ito et al., 1983, J.
  • Transformants are selected according to their ability to grow on YPD medium of the following composition in wt.%: Bactopeptone - 2, yeast extract - 1, glucose - 2, bactoagar - 2, water - the rest.
  • Bactopeptone - 2 Bactopeptone - 2
  • yeast extract - 1 glucose - 2
  • bactoagar - 2 water - the rest.
  • SCR-702-1F9 One of the obtained transformants is called SCR-702-1F9.
  • Example 7 Construction of strain SCR-702-2E12 - producer of protein 2E12.
  • the strain SCR-702-2E12 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms as a strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3584.
  • Example 8 Construction of strain D702-SUMO-lF9-npoflyueHTa protein 1F9.
  • Example 9 Analysis of the expression of recombinant proteins 1F9 and 2E12 in cells of Saccharomyces cerevisiae strains.
  • water-insoluble proteins are suspended in 750 ⁇ l of "destruction buffer", transferred to new tubes and centrifuged for 15 min at 16000g.
  • the resulting precipitate (100 ⁇ l) containing the desired proteins was suspended in 400 ⁇ l of 6.5 G buffer (6.5 M solution of guanidine hydrochloride or guanidine thiocyanate in a buffer containing 0.1 M sodium phosphate, 0.01 M Tris-HCl, pH 6.5. ) and the target proteins are extracted overnight on a magnetic stirrer at a temperature of + 4 ° C. Then the suspension is centrifuged for 15 min at 16000 g, the supernatant with the target protein transferred into it is dialyzed against 300 ml of 5 mM sodium acetate for 1, 5 hours. Received sample
  • Electrophoretic analysis of the target protein is carried out with 12% PAG-DDS-Na according to the standard Laemmli procedure [Laemmli, 1970, Nature, v.227, 680-685].
  • the solution is diluted approximately 500-1000 times with “sample buffer” (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, May 2.% DDS-Na, 0.0025 May.%
  • Fig. 1 and 2 cerevisiae and do not contain a component of SUMO or ubiquitin. This is indicated by the electrophoretic mobility of the analyzed proteins and the absence in the gel of protein bands corresponding to the mobility of the 1F9 and 2E12 fusion proteins fused to the SUMO protein or ubiquitin.
  • the purity of the preparations was quantified using the Sorbfil 1.0 Video Densitometer program, for which the stained gels were scanned after electrophoresis, and the resulting image was introduced into
  • Example 10 Production of proteins 1F9 and 2E12 by strains of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3583 and VKPM Y-3584
  • VKPM Y-3583 and VKPM Y-3584 strains are grown in YPD medium on a rotary shaker at a speed of 250 rpm at a temperature of 28 ° C for 20-24 hours. 50 ml seed
  • the production of 1F9 protein under these conditions is at least 200 mg / l of culture fluid and the production of 2E12 protein under these conditions is at least 100 mg / l of culture fluid.
  • Example 1 Isolation and purification of recombinant proteins 1 F9 and 2E 12 from a water-insoluble fraction of Saccharomyces cerevisiae cells
  • cerevisiae yeast in a 3-liter fermenter on YPD medium without recharge in the presence of 2%> glucose in the starting medium with one fermentations receive an average of 400 - 500 g of wet cell biomass.
  • 1 kg of washed wet biomass is suspended in a “destruction buffer”, and the cells are destroyed using glass beads in a flow mill for 1, 5 hours, the resulting suspension is centrifuged and the precipitate is collected.
  • the target protein is extracted from the precipitate using a solution of 10% lithium chloride in 90% formic acid for 16 to 18 hours, followed by centrifugation. The precipitate is discarded and the supernatant is ultrafiltered, followed by diafiltration through
  • M50 membrane for translating into 10 mM sodium acetate, pH 4.0 and removing host cell proteins with a molecular weight below 50 k Yes.
  • a lyophilized preparation is a white substance similar to cotton wool.
  • recombinant protein is pre-dissolved in a sample of 90%> formic acid with 10% lithium chloride for at least 2 hours, dialyzed against deionized water (1-1, 5 hours) and analyzed with
  • Threads are obtained as a result of spinning.
  • the newly formed man-made filaments in the ethanol vessel are shown in FIG. 8.
  • the newly formed thread is kept in a vessel with 96% alcohol for 20 minutes, then stretched to the maximum in 75% ethanol, annealed,
  • the proposed method for producing recombinant web protein allows to obtain recombinant protein preparations with a very high degree of purification on an industrial scale, to develop microspinning methods for producing artificial fibers based on it, as well as methods for the formation of films, hydrogels, microgels and microcapsules based on recombinant web proteins for use in biotechnology, medicine, cosmetology, the automotive and aviation industries, and other technical fields.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов в клетках дрожжей. Для этого конструируют вектор экспрессии, который включает последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок паутины паука- кругопряда, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин-подобный белок, занимающий в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины. Экспрессия гибридного гена позволяет в десятки раз увеличить продукцию рекомбинантного белка паутины, причем рекомбинантный белок накапливается в клетках дрожжей в водонерастворимой фракции в виде процессированного белка, не содержащего гибридный компонент. Изобретение также относится к слитым белкам, содержащим последовательности рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов и последовательности убиквитин подобных белков, рекомбинантным ДНК, кодирующим слитые белки, хозяйским клеткам дрожжей и векторам экспрессии, используемым для осуществления способа, а также к штаммам- продуцентам рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов.

Description

Способ получения белка паутины, слитый белок, реко бинантная ДНК, вектор экспрессии, хозяйская клетка и штаммы-продуценты.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии и направлено на способ получения рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов, слитые белки, содержащие последовательности рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов и последовательности убиквитин подобных белков, рекомбинантные ДНК, кодирующие слитые белки, хозяйские клетки дрожжей и векторы экспрессии, используемые для осуществления способа, а также штаммы-продуценты рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов.
Уровень техники
Паутина является уникальным биоматериалом, сочетающим в себе удивительную прочность и эластичность. По этим показателям она не имеет аналогов как в природе, так и среди материалов, созданных человеком. Так, например, каркасная нить паутины паука-кругопряда Nephila clavipes по значениям прочности на разрыв превосходит сталь и сопоставима с кевларом, а по величине энергии разрыва превосходит и кевлар; в то же время она может растягиваться до 35% своей длины [Gosline J.M. et al. Endeavor, 1986, v.10, 37- 43].
Получение промышленных количеств таких материалов возможно лишь с помощью генно-инженерных и биотехнологических методов. К настоящему времени несколько генов, кодирующих белки паутины выделены и достаточно полно охарактеризованы [Xu М. & Lewis R. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1990, v.87, 7120-7124; Hinnman М. & Lewis R. J.Biol.Chem., 1992, v.267, 19320- 19324; Guerette P. et al. J. Science, 1996, v.272, 1 12-1 15; Hayashi C.Y.& Lewis R.V.
J.Mol.Biol., 1998, v.275, 773-784]. Эти гены относятся к наиболее протяженным из известных цистронов (размеры мРНК лежат в диапазоне от 7,5 до 15,5 т.н.) и состоят из большого числа тандемно повторяющихся протяженных
последовательностей, которые заметно различаются у разных генов. Наиболее изученная каркасная нить паука-кругопряда Nephila clavipes состоит из двух белков - спидроина 1 и спидроина 2 (MaSp l и MaSp2, соответственно) синтезируемых большой ампуловидной железой [Hinnman М. & Lewis R.
J.Biol.Chem., 1992, v.267, 19320- 19324; Guerette P. et al. Science, 1996, v.272, 1 12-1 15]. Повторяющийся элемент спидроина 1 можно представить в виде следующей консенсусной последовательности:
[GGAGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAG(A)4-7],
а повторяющуюся последовательность спидроина 2 - в виде
[GPGGYGPGQQGPGGYAPGQQPSGPGS(A)6- io]
Принципиальным различием между этими белками является то, что в случае спидроина 1 элементарным повтором является трипептид GGX (X = А, S или Y), а в случае спидроина 2 - пентапептиды GPGGX и GPGQQ. При этом для спидроина 1 характерна повышенная прочность, а для спидроина 2, способного образовывать β-спирали [Hayashi et al., 1999, Int.J.Biol.Macromol., v. 24, 271-275], - большая эластичность. Взаимодействие этих белков в составе каркасной нити паутины и обеспечивает уникальное сочетание ее свойств.
Белки MiSp l и MiSp2, синтезируемые малой ампуловидной железой, и белок Flag ловчей нити паука-кругопряда также имеют повторяющуюся структуру. Повторяющиеся области обогащены аланином и глицином. Мотивы GGX и GA представлены по всей длине аминокислотной последовательности как белка MiSpl , так и белка MiSp2 [К. Vasanthavada et al. Cell. Mol. Life Sci, 2006, v. 63, 1986-1999]. В последовательности белка Flag ловчей нити доминантные повторяющияся мотивы представлены пентапептидом GPGG1X и трипептидом GGX.
Результаты исследования белков каркасной нити паука-кругопряда Nephila clavipes, а также белка ловчей нити и белков, синтезируемых малой ампуловидной железой [Kohler Т.& Vollrath F. J.Exp.Zool., 1995, v.271 , 1-17; Colgin M.A. & Lewis R., Protein Sci., 1998, v.7, 667-672] позволили выдвинуть модульную гипотезу строения белков паутины [Hinman at al., 2000, TIBTECH, v. l , 374-379]. Структурный анализ белков паутины свидетельствует о наличии в них кристаллических областей, образованных β-складчатыми структурами (считается, что они формируются блоками (А)п и (GA)n), которые
обеспечивают прочность нитей паутины, и которые погружены в менее структурированный Gly-обогащенный матрикс, ответственный за
эластичность. На концах молекул содержатся неповторяющиеся (NR) уникальные консервативные последовательности, которые необходимы, как полагают, для повышения растворимости белков в концентрированном растворе внутри железы, а также для правильной подгонки молекул при формировании нити при прядении.
Были предприняты попытки клонирования и оптимизации экспрессии кДНК- копий природных генов, кодирующих белки каркасной нити паутины, в клетках Е. coli [Arcidiacono S. et al. Appl.Microbiol.Biotechnol., 1998, v.49, 1-38]. Однако, достигнутый уровень экспрессии был достаточно низким, что объясняется, в первую очередь, несоответствием частоты встречаемости определенных аминокислотных кодонов в генах паука и генах
использованного микроорганизма-реципиента.
Более успешным оказался путь химико-ферментативного синтеза генов белков паутины с последующим клонированием в клетках бактерий, дрожжей, табака, картофеля, используя синтетические модули ДНК с частотой
использования кодонов, адаптированной к соответствующей хозяйской клетке [Prince J.T. et al. Biochemistry, 1995, v.34, 10879-10884; Winkler S. et al.
Int.J.Biol.Macromol, 1999, v.24, 265-270; Fahnestock S.R. & Bedzyk L.A.
Appl.Microbiol.Biotechnol, 1997, v.47, 33-39; Fahnestock S.R. & Irwin S.L., Appl.Microbiol.Biotechnol., 1997, v.47, 23-32; Lewis, R. V. et al., 1996, Protein Expr. Purif., v. 7, 400-406; Scheller, J. et al., 2001 , Nat. Biotechnol., v. 19, 573- 577]. Указанные работы в основном касались экспрессии генов, кодирующих рекомбинантные белки каркасной нити паутины пауков-кругопрядов, содержащих консенсусную последовательность или ее небольшие фрагменты. В результате экспрессии синтетических генов были получены искусственные белки, содержащие варианты первичных повторов спидроинов 1 и 2, сходные с повторяющимися областями природных белков. Эти белки хотя и обладали особенностями вторичной структуры, характерными для белков паутины, но созданные на их основе нити по механическим свойствам были далеки от нитей природной паутины. Ни один из этих искусственных белков не
содержал С-концевых NR-областей, которые найдены во всех белках
каркасной нити. Свойствами, наиболее близкими к свойствам природных белков, обладали искусственные аналоги, содержавшие 800 и 1600
амиинокислотных остатков, полученные в результате экспрессии
синтетических генов в клетках E.coli [Fahnestock & Irwin, 1997,
Appl.Microbiol.Biotechnol., v.47, 23-32] или дрожжей Pichia pastoris [Fahnestock & Bedzyk, 1997, Appl.Microbiol.Biotechnol, v.47, 33-39].
Первым шагом в направлении исследований молекулярных механизмов сборки нитей паутины было изучение первичной структуры каркасных белков ADF-3 and ADF-4 паутины садового паука (Araneus diadematus),
соответствующих белкам MaSp2 и MaSp 1 (спидроины 2 и 1 большой
ампуловидной железы). Рекомбинантные белки паутины, состоящие из синтетических повторяющихся последовательностей и уникальных
аутентичных NR-областей на концах молекул, были экспрессированы в клетках Е. coli, выход очищеного белка составлял около 1 г на литр
бактериальной культуры [WO/2006/008163].
Сравнительный анализ вторичной структуры, растворимости и
агрегационных свойств полученных белков позволил выявить роль различных элементов первичной структуры белков паутины. Было обнаружено, что повторяющиеся области, занимающие основную по протяженности часть белков паутины и содержащие консенсусную последовательность,
включающую поли-А блок, детерминируют растворимость синтетических белков: Важным для обеспечения растворимости является чередование гидрофобных и гидрофильных сегментов в первичных повторах.
Неповторяющиеся области С-конца играют важную роль в инициации сборки белков. В этой системе экспрессии были использованы в качестве синтетических строительных блоков два модуля: модуль поли-А и второй модуль, состоящий из четырх повторов GPGQQ. Модули такого типа также описаны Хаммерих с соавторами [Hummerich, D. et al., 2004, Biochemistry, v. 43, 13604- 13612].
Процесс сборки паутины был изучен на модели двух рекомбинантных аналогов спидроина 1 (белок 1F9) и спидроина 2 (белок 2Е12), входящих в состав каркасных нитей паутины пауков Nephila clavipes и Nephila
madagascariensis, соответственно [Bogush V. G. & Debabov V.G., 2009, J.
Neuroimmune Pharmacol., v.4, 17-27].
Синтетический ген белка 1F9 был экспрессирован в дрожжах
Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора GAL1 с использованием бирепликонного экспрессионного вектора [Богуш В.Г. с соавт., 2001 ,
Биотехнология, т.2, стр.1 1-22], и в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris под контролем метанолиндуцибельного промотора ОХ 1 с
использованием интегративного вектора pHIL-D2 [Богуш В.Г. с соавт., 2006, Биотехнология, т.4, 3- 12].
В первом случае более 80% целевого белка обнаруживалось в
водонерастворимой фракции, и средний выход составлял 6 - 8 мг белка на 1 литр ферментационной культуры дрожжей. В дрожжах Pichia pastoris средний выход чистого белка 1F9 составил приблизительно 70 мг на 1 кг влажной клеточной массы (приблизительно 23 мг/л ферментационной культуры).
Последовательности рекомбинантных белков были максимально
приближены к последовательностям природных белков, в частности, повторяющаяся область белка 1F9 содержала 9 повторов «мономера», состоящего из пяти вариантов первичных повторов, обнаруженных в
природном спидроине 1.С целью увеличения уровня синтеза рекомбинантного белка в клетках дрожжей структура генов l f9 и 2Е12 была модифицирована путем замены "редких" триплетов на кодоны, характерные для эффективно экспрессирующихся генов дрожжей, а количество внутренних повторов нуклеотидных последовательностей сведено к минимуму. Фрагменты ДНК, кодирующие соответствующие мономеры обоих белков, были получены в результате химико-ферментативного синтеза и затем амплифицированы.
Конечный ген белка 1F9 кодировал девять повторов соответствующего
«мономера», составляющих белок с молекулярной массой 94 кДа; белок 2Е12 (молекулярная масса 1 13 кДа) содержал 12 «мономерных» повторов.
В растворах белков 1F9 и 2Е 12, очищенных с использованием
катионобменной хроматографии, были исследованы структурные переходы, возникающие при определенных воздействиях [Bogush V. G. & Debabov V.G., 2009, J. Neuroimmune Pharmacol., v.4, 17-27]. Несмотря на отсутствие
гидрофильных N- and С-концевых уникальных последовательностей (NR), которые, как предполагалось ранее, необходимы для формирования
нанофибрилл и мицелл, оба белка в водном растворе спонтанно формировали нанофибриллы длиной 100 нм - 1 мкм и мицеллы диаметром около 1 мкм. Причем нанофибриллы имели спиралевидную структуру с периодом в 40 нм.
Однако уровень синтеза рекомбинантных белков паутины с
использованием известных способов не позволял нарабатывать белки паутины в количествах, достаточных не только для изучения их структуры и свойств, но и для разработки и испытания нового класса медицинских материалов и изделий из них. Одним из способов увеличения экспрессии слабо
экспрессируемого белка методами генной инженерии, является его биосинтез в виде гибридного белка, в котором целевой белок слит с эффективно
экспрессируемым белком [Shatzman and Rosenberg, 1987, Methods Enzynol., v. 152, 661 -673]. Однако обычно преимущества такого подхода в значительной степени нивелируются необходимостью на завершающих стадиях очистки осуществлять процессинг гибридного продукта для высвобождения из его состава целевого белка, что нетехнологично в случае рекомбинантных белков паутины. Было показано, что при использовании дрожжевого убиквитина в качестве эффективно экспрессируемого компонента гибриды подвергаются высокоспецифичному внутриклеточному процессингу в клетках дрожжей. Убиквитин дрожжей, состоящий из 76 аминокислотных остатков, является представителем семейства убиквитин-подобных белков эукариот, к которому относятся сравнительно небольшие структурно консервативные белки, обладающие экстраординарной скоростью сворачивания, высокой
растворимостью и термостабильностью; in vivo белки этого семейства служат для обратимой модификации и изменения функционального состояния других белков. Представители семейства убиквитин-подобных белков содержат консервативный С-концевой мотив Gly-Gly, являющийся сайтом процессинга [Miiller et al., 2001 , Nature, v. 2, 202-210]. Присутствие этого сайта в составе гибридных белков с убиквитином приводит к тому, что в клетках дрожжей гибриды подвергаются высокоспецифичному внутриклеточному процессингу под действием убиквитин-специфичных протеиназ DUB, в результате чего в составе конечных продуктов экспрессии убиквитиновый компонент
отсутствует.
Позднее было обнаружено, что помимо убиквитина для усиления экспрессии могут использоваться и другие представители белков
убиквитинового семейства, в частности, дрожжевой вариант белка SUMO. Зрелый белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, кодируемый
уникальным геном SMT3 (Johnson et al, 1997, EMBO J, v. 16, 5509-5519; Muller et al , 1998, EMBO J, v. 17, 61-70), содержит в своем составе 98
аминокислотных остатков, из которых остатки 13-98 важны для формирования его нативной структуры [Mossessova Е. & Lima C.D., 2000, Mol. Cell, v. 5, 865-876]. Аналогично убиквитин-специфичным протеиназам, SUMO- специфичные протеиназы дрожжей обеспечивает высокую эффективность и специфичность процессинга SUMO-содержащих гибридных белков [Malakhov et al., 2004, J. Struct. Funct. Genom., v.5, 75-86; Butt et al., 2005, Protein Expr. Purif., v.43, 1-9].
Однако, эффективность технологии гибридизации рекомбинантных белков паутины с убиквитином или другими убиквитин-подобными белками для увеличения биосинтеза белков паутины не была продемонстрирована. Таким образом, разработка способа микробиологического биосинтеза, позволяющего существенно повысить продукцию рекомбинантных белков паутины, обладающих свойствами, приближенными к свойствам природных белков, является актуальной задачей, решение которой открывает
принципиальную возможность создания на основе рекомбинантных белков паутины биоматериалов с уникальными свойствами.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения впервые предложен способ получения рекомбинантных белков паутины пауков-кругопрядов (Araneidae) в клетках дрожжей, обеспечивающий продукцию рекомбинантных белков в количествах, в десятки раз превышающих количества рекомбинантных белков паутины, продуцируемых в соответствии со способами, известными из
предшествующего уровня техники.
Согласно предложенному способу рекомбинантные белки паутины пауков-кругопрядов экспрессируют в клетках дрожжей в виде гибрида с убиквитин-подобным белком, занимающим в составе гибрида Ν-концевое положение и содержащим сайт процесинга, распознаваемый природными дрожжевыми протеиназами, предпочтительно, убиквитин-специфичными протеиназами DUB или SUMO-специфичными протеиназами дрожжей, в результате чего в ходе экспрессии гибридные белки подвергаются процессингу под действием протеиназ, что обеспечивает накопление в клетках дрожжей зрелого белка паутины, не содержащего гибридный компонент, причем белок накапливается в водонерастворимой фракции дрожжевых клеток.
Предпочтительно, способ согласно изобретению предусматривает получение рекомбинантного белка паутины, консенсусные
последовательности которого происходят из каркасных белков большой ампуловидной железы и/или белков малой ампуловидной железы, или белка ловчей нити паука-кругопряда.
В одном из предпочтительных воплощений способ согласно изобретению предусматривает получение рекомбинантных белков паутины, консенсусные последовательности которых происходят из каркасных белков большой ампуловидной железы Nephila clavipes и/или Nephila madagascariensis, и убиквитин-подобный белок выбирают из группы, включающей убиквитин и белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В одном из наиболее предпочтительных воплощений способ согласно изобретению направлен на получение рекомбинантного белка 2Е12 каркасной нити паука-кругопряда Nephila madagascariensis в клетках Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора гена GAL1 дрожжей, причем ген рекомбинантного белка слит с последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
В ещё одном наиболее предпочтительном воплощении способ согласно изобретению направлен на экспрессию гена рекомбинантного белка 1F9 каркасной нити паука-кругопряда Nephila clavipes в клетках Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора гена GAL1 дрожжей, причем ген рекомбинантного белка слит с последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
В одном из аспектов изобретение направлено на слитый белок,
включающий последовательности рекомбинантного белка паутины паука- кругопряда и убиквитин-подобного белка, занимающего в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины, причем последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, которые происходят из повторяющихся последовательностей белков каркасной нити MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы, белков MiSpl и MiSp2 малой ампуловидной железы и белка Flag ловчей нити паука-кругопряда.
В одном из предпочтительных воплощений изобретение направлено на слитый белок, в котором убиквитин-подобный белок представляет собой убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и
последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков каркасной нити MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и выбираемые из группы: AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
Наиболее предпочтительно, слитый белок включает рекомбинантный белок 1F9 каркасной нити паука-кругопряда Nephila clavipes,
последовательность которого слита с последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
В ещё одном наиболее предпочтительном воплощении слитый белок включает рекомбинантный белок 2Е12 каркасной нити паука-кругопряда Nephila madagascariensis, последовательность которого слита с
последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO
Saccharomyces cerevisiae.
В одном из аспектов изобретение направлено на рекомбинантную ДНК, кодирующую слитый белок, включающий в себя рекомбинантный белок паутины паука-кругопряда и убиквитин-подобный белок, занимающий в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к
рекомбинантному белку паутины, причем последовательность
рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, которые происходят из повторяющихся последовательностей белков
каркасной нити MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы, белков MiSpl и MiSp2 малой ампуловидной железы и белка ловчей нити паука-кругопряда.
Предпочтительно, рекомбинантная ДНК кодирует слитый белок, в котором убиквитин-подобный белок представляет собой убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и последовательность
рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда включает консенсусные последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков MaSp 1 и MaSp2 большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
Наиболее предпочтительно, рекомбинантная ДНК согласно изобретению, кодирует слитый белок, включающий последовательности рекомбинантного белка 1 F9 каркасной нити паука-кругопряда Nephila clavipes и убиквитина или белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий
последовательность, как представлено в Перечне последовательностей
(SEQ ID ΝΟ: 1 и SEQ ID NO:3, соответственно).
В ещё одном наиболее предпочтительном воплощении рекомбинантная ДНК кодирует слитый белок, включающий последовательности
рекомбинантного белка 2Е12 каркасной нити паука-кругопряда Nephila madagascariensis и убиквитина или белка SUMO Saccharomyces cerevisiae.
В одном из аспектов изобретение касается векторов экспрессии, которые включают последовательности ДНК, кодирующие рекомбинантные белки паутины паука-кругопряда, слитые с последовательностью гена убиквитин- подобного белка, занимающего в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины, и последовательности высокоэффективных регулируемых промоторов дрожжей.
В предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает векторы экспрессии, которые содержат рекомбинантную ДНК, кодирующую слитый белок, в котором убиквитин-подобный белок представляет собой убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков MaSpl и
MaSp2 большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila
madagascariensis и выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
В одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретение обеспечивает вектор экспрессии, представляющий бирепликонный вектор pPDX3-HUB-2E12, содержащий область инициации репликации эндогенной 2- мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1,
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 2Е12, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae.
В другом наиболее предпочтительном воплощении изобретение
обеспечивает вектор экспрессии, представляющий бирепликонный вектор pPDX3-HUB- lF9, содержащий область инициации репликации эндогенной 2- мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1,
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 1F9, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae.
В ещё одном наиболее предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает вектор экспрессии, представляющий бирепликонный вектор pPDX3-SUMO-lF9, включающий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1, последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 1F9, слитую с последовательностью, кодирующей белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение обеспечивает
хозяйские клетки дрожжей, продуцирующие рекомбинантные белки паутины паука-кругопряда. Наиболее предпочтительными хозяйскими клетками согласно изобретению являются клетки дрожжей Saccharomyces cerevisisae. В ещё одном аспекте изобретение обеспечивает штаммы-продуценты
рекомбинантых белков 1F9 и 2Е12 каркасной нити паука-кругопряда.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Электрофорез в 12% ПААГ с ДДС-Na фракций 1F9 после
хроматографии на катионообменной колонке HiPrep 16/10 SP FF.
Дорожки: 1 - исходный раствор перед нанесением на колонку; 2 - проскок; 3 - 6 - фракции, содержащие белок 1F9, 7 - образец стандартного 1F9.
Фиг. 2. Электрофорез в 12% ПААГ с ДДС-Na фракций 2Е12 после
хроматографии на катионообменной колонке HiPrep 16/10 SP FF.
Дорожки: 1 - Исходный раствор перед нанесением на колонку; 2 - проскок; 3 - Стандарты молекулярных масс (сверху вниз, в кДа): 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17; 4- фракция, содержащая 2Е12, 5 - образец стандартного 2Е12.
Фиг. 3. Карта вектора pPDX3-HUB-lF9.
Обозначения: SPIDROIN - синтетический ген рекомбинантного белка 1F9 (спидроин - 1 паука N.clavipes); HUB - ген убиквитина дрожжей S.cerevisiae; GAL 1 - промоторная область гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae; URA3 и PGK1- структурные гены URA3 и PGK1 дрожжей S.cerevisiae, соответственно; cyclT - последовательность терминатора транскрипции гена CYC1 дрожжей
S.cerevisiae; 2 mkm - фрагмент эндогенной 2-микронной плазмиды дрожжей S.cerevisiae, содержащий область начала репликации; pUC18 - фрагмент плазмиды pUC 18, содержащий ген бета-лактамазы (ApR) и область начала репликации, обеспечивающий селективную амплификацию вектора в клетках Е. coli.
Фиг. 4. Карта вектора pPDX3-SUMO-lF9.
Обозначения: SPIDROIN - синтетический ген рекомбинантного белка 1F9 (рекомбинантный спидроин- 1 паука N.clavipes); SUMO - ген SMT3 дрожжей S.cerevisiae, кодирующий белок SUMO; GAL1 - промоторная область гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae; URA3 и PGK1 - структурные гены URA3 и PGK1 дрожжей S.cerevisiae, соответственно; eye IT - последовательность
терминатора транскрипции гена CYC1 дрожжей S.cerevisiae; 2 mkm - фрагмент эндогенной 2-микронной плазмиды дрожжей S.cerevisiae, содержащий область начала репликации дрожжей; pUC18 - фрагмент плазмиды pUC18,
содержащий ген бета-лактамазы (ApR) и область начала репликации для обеспечения селективной амплификации вектора в клетках E.coli.
Фиг. 5. Схема вектора pPDX3-HUB-2E12.
Условные обозначения: SPIDROIN - последовательность ДНК, кодирующая рекомбинантный белок 2Е12; HUB - последовательность ДНК, кодирующая убиквитин дрожжей S.cerevisiae; GAL1 - промоторная область гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae; URA3 и PGK1 - структурные гены URA3 и PGK1 дрожжей S.cerevisiae, соответственно; cyclT - последовательность
терминатора транскрипции гена CYC1 дрожжей S.cerevisiae; 2 mkm - фрагмент эндогенной 2-микронной плазмиды дрожжей S.cerevisiae, содержащий область начала репликации; pUC18 - фрагмент плазмиды pUC18, содержащий ген бета-лактамазы (ApR) и область начала репликации, обеспечивающий селективную амплификацию вектора в клетках E.coli.
Фиг. 6. Фотография искусственной нити из белка 1F9 в сосуде с этанолом.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что экспрессия рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда в клетках дрожжей в виде слитого белка с убиквитин-подобным белком, занимающим в составе гибрида Ν-концевое положение, позволяет в десятки раз увеличить продукцию рекомбинантного белка паутины, причем рекомбинантный белок, экспрессируемый в виде гибридного белка, накапливается в клетках дрожжей в водонерастворимой фракции в виде процессированного белка, не
содержащего гибридный компонент.
Следовательно, в одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает способ получения рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда в клетках дрожжей, предусматривающий конструирование вектора экспрессии, трансформацию клеток дрожжей полученным вектором экспрессии и экспрессию в трансформированных клетках гена рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда, отличающийся тем, что используют вектор экспрессии, который включает последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок паутины паука-кругопряда, слитую с
последовательностью, кодирующей убиквитин-подобный белок, занимающий в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к
рекомбинантному белку паутины и содержащий сайт процессинга,
распознаваемый природными дрожжевыми протеиназами, предпочтительно, убиквитин-специфичными протеиназами DUB или SUMO-специфичными протеиназами дрожжей, в результате чего в ходе экспрессии гибридные белки подвергаются процессингу под действием протеиназ, что обеспечивает накопление в клетках дрожжей в водонерастворимой фракции
рекомбинантного белка паутины в виде процессированного белка, не
содержащего гибридный компонент.
Рекомбинантные белки, получаемые способом согласно изобретению, имеют явно выраженную перидическую структуру, которая может быть представлена в виде ряда консенсусных последовательностей, выведенных путем выравнивания повторяющихся единиц природных белков паутины пауков-кругопрядов. Рекомбинантные белки согласно изобретению
представляют собой белки, последовательности которых содержат как повторы одной консенсусной последовательности, так и комбинации повторов консенсусных последовательностей различного типа, происходящих из каркасных белков большой ампуловидной железы и/или белков малой ампуловидной железы, и/или белков Flag ловчей нити паука-кругопряда, в частности, выбираемых из группы, включающей консенсусные
последовательности :
MaSpl
GGAGQGGYGRGGAGQGGAGAAAAAAAA
MaSp2
GGAGPGRQQGYGPGSSGAAAAAAA MiSp l
GAGAGAGAAAGAGAGAGGAGYGGQGGYGAGAGAGAAAAAGAGAGGAGGYGR
MiSp2
GAGVGAGAAAGFAAGAGGAGGYR
Flag
ISEELTIGGAGAGGVGPGGSGPGGVGPGGSGPGGVGPGGSGPGGVGSGGSGPGGVGPGGS
GPGGVGSGGFGPGGIGPGGSGPGGVGPGGVGGPYGPGGSGPGGAGGAGGSYGPGGPYGPG
GSGGPGGAGGPYGPGGAGGPYGPGGPYGPGGAGGPGGEGPGGAGGPYGPGGPGGAGPGGY
GPGGAGPGGYGPGGAGPGGYGPGGAGSGGYGPGGAGPGGYGPGGPGPGGYGPGGAGPGGY
GPGGTGPGGSAPGGAGPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGGPGGAGPGGAGPGGAGPGGAG
PGGAGPGGAGPGGAGPGGAGPGGAGPGGAGPGGVGTGGLGRGGAGRGGAGRGGAGRGGAG
RGGAGRGGTGGVGGAGGAGGAGGVGGAGGSGGTTVIEDLDITIDGADGPIT,
где MaSpl и MaSpl - белки каркасной нити большой ампуловидной железы Latrodectus hesperus [Lawrence В. A. et al., 2004, Biomacromolecules, v. 5, 689- 695];
MiSpl и MiSpl - белки малой ампуловидной железы Nephila clavipes [Colgin M. A. & Lewis R. V., 1998, Protein Sci., v. 7, 667-672];
Flag - белок ловчей нити Nephila madagascariensis [Hayashi C. & Lewis R. V., 1998, J. Mol. Biol., v. 275, 773-784].
Предпочтительно, согласно предложенному способу, используют консенсусные последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
Конструирование искусственных генов, кодирующих рекомбинантные белки большой и/или малой ампуловидных желёз, или белки Flag ловчей нити паука-кругопряда включает реконструкцию последовательности ДНК, кодирующей консенсусную последовательность или комбинации повторов консенсусных последовательностей различного типа, происходящие из повторяющихся последовательностей указанных выше белков;
конструирование и химический синтез серии праймеров к консенсусной последовательности/последовательностям; единовременный отжиг смеси всех синтезированных праймеров, необходимых для образования двухцепочечной молекулы ДНК, и последующую обработку их лигазой для удаления
однонитевых разрывов ДНК, или реакцию ПЦР с последовательным
использованием необходимых праймеров и поэтапным достраиванием растущего фрагмента ДНК, причем образуемый фрагмент («мономер») затем подвергается поэтапному удвоению в составе плазмиды до получения гена необходимой длины [Богуш В. Г. с соавт., 2001 , Биотехнология, т.2, 1 1-22; Богуш В. Г. с соавт., 2006, Биотехнология, т.4, 3- 12; Bogush V.G. & Debabov V.G., 2009, J. Neuroimmune Pharmacol., v.4, 17-27].
Последовательности соответствующих кДНК могут быть выведены на основе последовательности природного белка с учетом вырожденности кода и частоты встречаемости кодонов у дрожжей. В частности, при конструировании гена, кодирующего белок 1F9 и содержащего 9 копий "мономера", фрагменты, кодирующие наиболее типичные первичные повторы, были выбраны из последовательности природного белка и отличались друг от друга набором делеций. Реконструированная последовательность ДНК включала
приблизительно 400 п.н. и кодировала полипептид, соответствующий 134 аминокислотным остаткам. «Редкие» кодоны в последовательности
искусственного гена были заменены на наиболее часто используемые у дрожжей. «Мономер» был получен с помощью химико-ферментативного синтеза, и мультимерная форма получена путем пошаговой мультипликации мономера в составе рекомбинантной плазмиды [Богуш В. Г. с соавт., 2001 , Биотехнология, т.2, 1 1-22].
При конструировании гена 2Е12 были использованы последовательности спидроинов типа 2 большой ампуловидной железы, содержащиеся в базе данных белковых последовательностей NCBI и включающие более 200 аминокислотных остатков. На основании математического анализа всех последовательностей были разработаны последовательности блоков (каждый состоял из 3-5 первичных повторов) и составлена формула полного
искусственного гена [Bogush V.G. et al., 2009, J. Neuroimmune Pharmacol., v.4, 17-27].
В одном из предпочтительных воплощений предложенный способ получения рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда в клетках дрожжей предусматривает слияние гена рекомбинантного белка паутины с последовательностью ДНК, кодирующей убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретения в клетках Saccharomyces cerevisiae получают рекомбинантный белок 1F9 каркасной нити паутины паука-кругопряда Nephila clavipes, причем
структурный ген белка 1F9 слит с последовательностью ДНК, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae. Ещё в одном наиболее предпочтительном воплощении изобретения в клетках Saccharomyces cerevisiae получают рекомбинантный белок 2Е 12 каркасной нити паутины паука-кругопряда Nephila madagascariensis, причем ген белка 2Е12 слит с последовательностью ДНК, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae.
В еще одном наиболее предпочтительном воплощении изобретения в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae экспрессируют слитый белок, содержащий последовательность рекомбинантного белка 1F9, причем последовательность белка 1F9 слита с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Рекомбинантные белки, получаемые согласно предложенному способу, были выделены из водонерастворимой фракции хозяйских клеток Saccharomyces cerevisiae с помощью
хроматографии на катионообменной колонке (примеры 9 и 1 1).
Электрофоретический анализ фракций (Фиг. 1 и 2) показал, что
рекомбинантные белки 1F9 и 2Е12 накапливаются во фракции водонерастворимых белков клеток дрожжей (в водорастворимой фракции рекомбинантные белки практически отсутствуют) и не содержат компонент убиквитин-подобного белка. На это указывает электрофоретическая
подвижность анализируемых белков и отсутствие в геле полос,
соответствующих по подвижности слитым белкам (убиквитин-1Б9 и
убиквитин-2Е12). Аналогичные результаты получены для рекомбинантных белков, выделенных и очищенных из водонерастворимой фракции хозяйских клеток Saccharomyces cerevisiae, продуцирующих рекомбинантные белки паутины, слитые с белком SUMO. Продукция рекомбинантных белков клетками Saccharomyces cerevisiae составляет не менее 100 мг/л
ферментационной культуры.
Отсутствие рекомбинантных белков, получаемых в соответствии с предложенным изобретением, в водорастворимой фракции позволяет практически избежать потери белка в процессе выделения и очистки в отличие от известного способа [Богуш В. Г. с соавт., 2001 , Биотехнология, т.2, 1 1-22], согласно которому только около 80% целевого белка обнаруживалось в водонерастворимой фракции.
Таким образом, при осуществлении способа получения рекомбинантного белка паутины согласно изобретению рекомбинантный белок, синтезируемый в клетках Saccharomyces cerevisiae, накапливается во фракции
водонерастворимых белков в виде процессированного белка, не содержащего гибридный компонент, причем клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок паутины, накапливают в десятки раз больше рекомбинантного белка, чем в соответствии со способами, известными из предшествующего уровня техники.
Очищенные рекомбинантные белки паутины паука-кругопряда, согласно изобретению, способны образовывать надмолекулярные структуры различных типов, в частности анализируемые белки формируют не растворяющиеся в воде нити (Пример 12, Фиг. 8). В ещё одном из аспектов изобретение направлено на слитые белки, включающие последовательности рекомбинантного белка паутины паука- кругопряда и убиквитин-подобный белок, занимающий в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины, причем последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, которые происходят из
повторяющихся последовательностей белков MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы, белков MiSpl и MiSp2 малой ампуловидной железы и белка Flag ловчей нити паука-кругопряда.
В одном из предпочтительных воплощений изобретение направлено на слитый белок, в котором убиквитин-подобный белок представляет собой убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и
последовательность рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда включает консенсусные последовательности, происходящие из
повторяющихся последовательностей белков MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и
выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
Наиболее предпочтительно, слитый белок содержит последовательность рекомбинантного белка 1F9 каркасной нити паука-кругопряда Nephila clavipes, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO Saccharomyces cerevisiae, как представлено в Перечне последовательностей (SEQ ID ΝΟ: 1 и SEQ ID NO:3, соответственно). В ещё одном наиболее предпочтительном воплощении слитый белок содержит последовательность рекомбинантного белка 2Е12 каркасной нити паука-кругопряда Nephila madagascariensis , слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
В ещё одном аспекте изобретение охватывает рекомбинантные ДНК, кодирующие слитые белки. Синтезированные и клонированные
последовательности ДНК, используемые в соответствии с изобретением для получения рекомбинантных белков паутины, кодируют слитые белки, включающие последовательности рекомбинантного белка паутины паука- кругопряда и убиквитин-подобного белка, занимающего в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку, причем последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, которые происходят из повторяющихся последовательностей белков MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы, белков MiSp l и MiSp2 малой ампуловидной железы и белка ловчей нити Flag паука-кругопряда.
Предпочтительно, рекомбинантная ДНК кодирует слитый белок, в котором убиквитин-подобный белок представляет собой убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и последовательность
рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда включает консенсусные последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков MaSp 1 и MaSp2 большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA Наиболее предпочтительно, рекомбинантные ДНК, используемые в соответствии с изобретением для получения рекомбинантных белков паутины, кодируют рекомбинантный белок 1 f9 каркасной нити паука-кругопряда
Nephila clavipes или рекомбинантный белок 2Е12 каркасной нити паука- кругопряда Nephila madagascariensis, последовательности которых слиты с последовательностью, кодирующей убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, как представлено в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: l , SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3). ДНК настоящего изобретения включают также кодирующие последовательности с учетом вырожденности кода и последовательности, используемые в качестве праймеров в реакциях амплификации.
Белки согласно изобретению получают в клетках дрожжей с
использованием векторов экспрессии, в состав которых входят ген слитого белка, содержащего последовательности рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда и убиквитин-подобного белка, и высокоэффективные регулируемые промоторы дрожжей, в частности такие промоторы, как GAL1 , GPD1 , CUP1. В качестве подходящих векторов для конструирования векторов экспрессии в соответствии с изобретением могут быть использованы
эписомные векторы, содержащие область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, что обеспечивает их способность поддерживаться в клетках дрожжей в эписомном многокопийном состоянии.
В одном из предпочтительных воплощений изобретения конструируют векторы экспрессии, несущие рекомбинантную ДНК, кодирующую слитый белок, где убиквитин-подобный белок представляет собой убиквитин или белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и последовательность рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда включает консенсусные последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков MaSpl и MaSp2 большой ампуловидной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis . В одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретения конструируют экспрессионные бирепликонные векторы pPDX3-HUB- lF9 (Фиг. 3) и pPDX3-HUB-2E12 (Фиг. 5) , которые получают путем клонирования последовательностей структурных генов белка 1F9 или белка 2Е 12,
соответственно, в плазмиде pPDX3-HUB, несущей в своем составе под контролем промоторной области GAL1 дрожжей ген убиквитина
Saccharomyces cerevisiae, причем в каждом случае осуществляют слияние в одной рамке считывания последовательности структурного гена белка 1F9 или белка 2Е12 и гена убиквитина.
В ещё одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретения конструируют экспрессионный бирепликонный вектор pPDX3-SUMO-lF9, который получают путем клонирования последовательности гена белка 1F9 в плазмиде pPDX3-SUMO, несущей в своем составе под контролем промоторной области GAL1 дрожжей структурный ген SMT3 Saccharomyces cerevisiae, кодирующий белок SUMO Saccharomyces cerevisiae, причем в результате клонирования осуществляют слияние в одной рамке считывания
последовательности гена белка 1F9 и гена SMT3 (Фиг. 4). Векторы экспрессии pPDX3-FiUB-lF9, pPDX3-HUB-2E12 и PPDX3-SUM0-1F9 содержат область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, что
обеспечивает их способность поддерживаться в клетках дрожжей
Saccharomyces. cerevisiae в эписомном многокопийном состоянии.
В соответствии с одним из аспектов изобретение обеспечивает
хозяйские клетки дрожжей, продуцирующие рекомбинантные белки паутины пауков-кругопрядов. В качестве подходящих хозяйских клеток для получения рекомбинантных белков паутины используют клетки дрожжей, которые выбирают из группы, включающей Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris и Schizosaccharomyces pombe.
Предпочтительными хозяйскими клетками являются клетки Saccharomyces cerevisisae. Наиболее предпочтительно, в качестве хозяйских клеток
используют реципиентный штамм Saccharomyces cerevisiae D702, который является диплоидным, что обеспечивает повышенную стабильность его экспрессионных характеристик. Saccharomyces cerevisiae D702 содержит гомозиготные мутации в хромосомных аллелях структурного гена PGK1, кодирующего фосфоглицерат киназу, что обеспечивает стабильное
поддержание вектора на средах, содержащих любой единственный источник углерода, усваиваемый дрожжами Saccharomyces cerevisiae, и гена GAL80, кодирующего белок - репрессор промотора GAL1, а также гомозиготную мутацию, приводящую к изменению регуляции гена GAL4, кодирующего белок - активатор промотора GAL1, вследствие чего осуществляется галактозо- регулируемая экспрессия генов, находящихся под контролем промотора GAL 1.
В одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретения клетки реципиентного штамма Saccharomyces cerevisiae D702 трансфомируют экспрессионным вектором pPDX3-HUB- lF9. Полученный в результате штамм SCR-702-1F9, продуцирующий рекомбинантный белок 1F9 каркасной нити паутины паука-кругопряда Nephila clavipes, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) как штамм
Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3583.
Еще в одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретения клетки реципиентного штамма Saccharomyces cerevisiae D702 трансфомируют экспрессионным вектором pPDX3-HUB-2E12. Полученный в результате штамм SCR-702-2E12 , продуцирующий рекомбинантный белок 2Е12 каркасной нити паутины паука-кругопряда Nephila madagascariensis, депонирован во
Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3584.
Еще в одном из наиболее предпочтительных воплощений изобретения клетки реципиентного штамма Saccharomyces cerevisiae D702 трансфомируют экспрессионным вектором pPDX3-SUMO-lF9.
Характеристика штаммов-продуцентов.
Генотип:
SCR-702-lf9 (a/α Ieu2lleu2 игаЗ/игаЗ trplltrpl gal80 :LEU2lgal80: LEU2 lys7ILYS7 his3/HIS3 his4/H!S4 pgkl : URA3/pgkl: URA3 GAL4:(STA2p-GAL4, TRPl)/GAL4:(STA2p-GAL4, TRP1) STA2/STA2 suc°ISUC2) /pPDX3-lf
SCR-702-2E12 (a/a Ieu2lleu2 игаЗ/игаЗ trplltrpl gal80:LEU2lgal80:LEU2 lys7ILYS7 his3/H!S3 his4/HIS4 pgkl URA3/pgkl URA3 GAL4:(STA2p-GAL4, TRPl)/GAL4:(STA2p-GAL4, TRP1) STA2/STA2 sue0 /SUC 2) /pPDX3-2E12
Морфологические признаки:
При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на
агаризованной среде YPD следующего состава (в мас.%): пептон-2, дрожжевой экстракт - 1 , глюкоза - 2, агар -2, вода - остальное, клетки штаммов- продуцентов Saccharomyces cerevisiae имеют овальную форму, 3 - 7 мкм в диаметре. Клетки почкуются. Почкование истинное, многостороннее.
Истинного мицелия не образуют. Колонии имеют следующий вид:
1 ) на агаризованной среде YPD колонии белого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и сметанообразной
консистенцией;
2) на агаризованной среде с крахмалом (состав в мас.%: пептон-2, дрожжевой экстракт -1 , крахмал - 1 , агар -2, вода - остальное) колонии белого цвета с узорчатым краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и крупчатой консистенцией.
Рост в жидкой среде с крахмалом: при 28°С в течение первых 24 ч
культивирования - жидкость мутная, осадок белый, не комкуется,
пристеночных пленок не образует.
Физико-химические признаки:
Оба штамма - факультативные анаэробы. Температура роста - 20-33°С
(оптимум - 28°С). рН культивирования - 3,8-7,4 (оптимум - 5,0).
Ассимиляция источников углерода:
Оба штамма сбраживают глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, декстрины, крахмал. Не сбраживают лактозу, галактозу, инулин, ксилозу, арабинозу.
Ассимиляция источников азота:
Оба штамма усваивают аминокислоты, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний. Хранение:
Штаммы хранят при температуре -70°С в 20% водном растворе глицерина. Возможно хранение на агаризованной богатой среде с глюкозой в течение 3 месяцев при +4°С.
Стабильность:
Стабильность заявляемых штаммов сохраняется при 20 последовательных пересевах на агаризованной среде YPD при температуре 28°С.
Патогенность: Не являются патогененными.
Изобретение илюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения оъёма притязяний.
Примеры.
Пример 1. Конструирование вектора pPDX3 -HUB
Структурный ген убиквитина дрожжей амплифицируют в реакции ПНР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК лабораторного штамма S. cerevisiae Y618 [Kartasheva et al, 1996, Yeast, v.12, 1297-13], выделяемой no методу Сидорука [Сидорук с соавт., 2008, Сборник тезисов и докладов
«Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии», Дубна, ОИЯИ, стр.100]. Праймерами для амплификации служат N513 (5'- ataccatggaacatcatcatcatcatcatggaggcatgcagatcttcgtcaagactttga) и N514 (5'- actggatccacctcttagccttagcacaac). Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК размером 510 п. о. элюируют из агарозного геля с
использованием кита Qiagen (Qiagen, cat.N° 28706), обрабатывают
рестриктазами Ncol и BamHI и клонируют в расщепленной по тем же сайтам лабораторной плазмиде pUC18x-GALl-NcoI, несущей Hindlll Ncol фрагмент ДНК, кодирующий промоторную область гена GAL1 дрожжей ^.cerevisiae. В результате получают плазмиду р101-25, содержащую в своем составе
нуклеотидную последовательность, кодирующую убиквитин дрожжей
S. cerevisiae, слитую с нуклеотидной последовательностью промоторной области гена GAL1 дрожжей S. cerevisiae. Плазмида pi 01-25 содержит сайт узнавания рестриктазы Xhol в полилинкерной области следом за сайтом клонирования BamHI.
Hindlll/Xhol фрагмент ДНК плазмиды pi 01-25, включающий
промоторную область гена GAL1 и нуклеотидную последовательность, кодирующую убиквитин, клонируют в лабораторном векторе pPDX3, ДНК которого расщеплена по тем же сайтам. В результате клонирования получают вектор pPDX3-HUB, который используют для клонирования генов
рекомбинантных белков паутины.
Пример 2. Конструирование экспрессионного вектора pPDX3-HUB- lF9
Экспрессионный вектор pPDX3-HUB-lF9 (Фиг. 3) получают в результате клонирования Bglll/Xhol фрагмента ДНК лабораторной плазмиды pUC21-lF9 размером 3.6 т.п.н., включающего ген белка 1F9, в векторе pPDX3-HUB, ДНК которого расщеплена по сайтам BamHI и Xhol. В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3-HUB- lF9, в составе которого структурный ген белка 1 F9 слит в одной рамке считывания со структурным геном, кодирующим убиквитин. Вектор используют для экспрессии белка 1F9 в клетках дрожжей S.cerevisiae.
Пример 3. Конструирование экспрессионного вектора pPDX3-HUB-2E12
Экспрессионный вектор pPDX3-HUB-2E12 получают в результате клонирования Bglll/Xhol фрагмента ДНК лабораторной плазмиды pUC21-2E 12 размером 4.2 т.п.н., включающего ген белка 2Е12, в векторе pPDX3-HUB, ДНК которого расщеплена по сайтам BamHI и Xhol. В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3-HUB-2E12, в составе которого структурный ген белка 2Е 12 слит в одной рамке считывания со структурным геном, кодирующим убиквитин. Вектор используют для экспрессии белка 2Е12 в клетках дрожжей S.cerevisiae.
Пример 4. Конструирование вектора pPDX3-SUMO.
Структурный ген SMT3 дрожжей S.cerevisiae, кодирующий белок SUMO, амплифицируют в реакции ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК лабораторного штамма S.cerevisiae как в примере 1. „„
28
Амплификацию проводят в две стадии. Сначала амплифицируют два перекрывающихся фрагмента ДНК, для чего используют следующие пары праймеров:
Фрагмент 1 размером 129 п. о.:
N450 (5 ' -atatccatggaaaagagatctgactcagaagtcaatcaagaa)
N454 (5'-cttgaagaaaatctctgaa)
Фрагмент 2 размером 230 п. о.:
N453 (5'-ttcagagattttcttcaag)
N452 (5'-atatcaattggatccaccaatctgttctctgtga).
Амплифицированные фрагменты ДНК элюируют из агарозного геля и используют для ПЦР-лигирования. Для этого смесь фрагментов 1 и 2 используют в качестве матрицы для ПЦР, праймерами служат N450 и N452. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 290 п. о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами Bglll и BamHI и клонируют в сайт BamHI лабораторной плазмиды pUC18x-GALl -BamHI, несущей
Hindlll/BamHI фрагмент ДНК, кодирующий промоторную область гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae, содержащую ATG кодон и сайт BamHI (подчеркнут) в последовательности ATGCATGGATCC . В результате осуществляют слияние последовательности гена SMT3 дрожжей S.cerevisiae и последовательности, кодирующей промоторную область гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae. В результате получают плазмиду pi 01-18, в составе которой клонированный ген SMT3 секвенируют.
Полученная плазмида р 101 - 18 содержит фрагмент ДНК, в составе которого ген SMT3 дрожжей слит с промоторной областью гена GAL1 дрожжей. В полилинкерной части плазмиды р 101 - 18 следом за сайтом клонирования BamHI находится сайт узнавания рестриктазы Xhol.
Hindlll/Xhol фрагмент ДНК плазмиды р 101 - 18, включающий промоторную область гена GAL1 и клонированный ген SMT3, клонируют в лабораторном векторе pPDX3, ДНК которого расщеплена по тем же сайтам. В результате клонирования получают вектор pPDX3-SUMO, который используют для клонирования генов рекомбинантных белков паутины.
Пример 5. Конструирование экспрессионного вектора pPDX3-SUMO-lF9.
Экспрессионный вектор pPDX3-SUMO- lF9 (Фиг. 4) получают в
результате клонирования Bglll/Xhol фрагмента ДНК лабораторной плазмиды pUC21- lF9 размером 3.6 т.п.н., включающего ген белка 1F9, в векторе pPDX3- SUMO, ДНК которого расщеплена по сайтам BamHI и Xhol. В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3-HUB-lF9, в составе которого структурный ген белка 1F9 слит в одной рамке считывания со структурным геном, кодирующим убиквитин. Вектор используют для экспрессии белка 1F9 в клетках дрожжей S.cerevisiae.
Пример 6. Конструирование штамма SCR-702-1F9 - продуцента белка 1F9 (ВКПМ Y-3583).
Штамм SCR-702-1F9 получают в результате трансформации
лабораторного штамма D702 экспрессионным вектором pPDX3-HUB-lF9. Для осуществления трансформации клетки штамма D702 подращивают в течение 18-24 часов при температуре 28°С на агаризованной среде YPGE, следующего состава в мас.%: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1 , бактоагар - 2, этанол - 2, глицерин - 3, вода - остальное. Трансформацию выращенных клеток штамма D702 проводят по методу Ito с соавт. [Ito et al., 1983, J.
Bacterid., v.153, 163- 168]. Трансформанты отбирают по способности расти на среде YPD следующего состава в мас.%: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1 , глюкоза - 2, бактоагар - 2, вода - остальное. Один из полученных трансформантов называют SCR-702-1F9.
Пример 7. Конструирование штамма SCR-702-2E12 - продуцента белка 2Е12.
Штамм SCR-702-2E12 получают в результате трансформации
лабораторного штамма D702 экспрессионным вектором pPDX3-HUB-2E12. Трансформацию осуществляют как в примере 6. Штамм SCR-702-2E12 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов как штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3584. Пример 8. Конструирование штамма D702-SUMO- lF9-npoflyueHTa белка 1F9.
Штамм D702-SUMO-1F9 получают в результате трансформации
лабораторного штамма D702 экспрессионным вектором pPDX3-SUMO- lF9. Трансформацию осуществляют как в примере 4 за исключением того, что используют плазмиду pPDX3-SUMO-lF9.
Пример 9. Анализ экспрессии рекомбинантных белков 1F9 и 2Е12 в клетках штаммов Saccharomyces cerevisiae.
Клетки S. cerevisiae ВКПМ Y-3583, ВКПМ Y-3584 или D702-SUMO-1F9 культивируют в колбах при 30°С на ротационной качалке со скоростью 250 об/мин на жидкой среде YPD состава, в мас.%: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1 , глюкоза - 2, вода - остальное, засевая в титре 5х105-5х106 мл"1. Образцы для анализа отбирают через 46 часов роста культуры. Конечная оптическая плотность культуры составляет ОД6оо=40-45. Клетки отделяют от среды культивирования осаждением с помощью центрифугирования при 10 000 g в течение 1 мин и используют для последующего анализа экспрессии белков 1F9 и 2Е12 микрометодом в пробирке на 1,5 мл. Для этого осадок клеток суспендируют в "буфере для разрушения" (0,05 М фосфата натрия, 2,5 мМ ЭДТА, 5% глицерина) из расчета 100 мкл буфера на 100 мкл влажного осадка клеток. Разрушение клеток осуществляют с помощью стеклянных шариков (d=0,45 - 0,65 мм) на встряхивателе для пробирок типа «Вортекс». Для этого 570 мг шариков смешивают с 200 мкл суспензии клеток, смесь встряхивают при 0°С в течение 90 сек, к содержимому пробирок добавляют 250 мкл
«буфера для разрушения», и встряхивание повторяют еще 60 сек. В пробирки вносят 500 мкл «буфера для разрушения», содержимое пробирок
перемешивают, после чего полученные образцы центрифугируют в течение 10 мин при 16000g. В супернатанте, содержащем водорастворимые белки дрожжевых клеток, с помощью 1М раствора ацетата натрия доводят рН до 4,0 и выпавший материал удаляют центрифугированием в течение 5 мин. при 16 тыс. об/мин; супернатант затем прогревают при 65°С 20 минут и выпавшие в осадок балластные белки удаляют центрифугированием; полученный раствор диализуют 40 минут против 10 мМ ацетата натрия, рН 4,0. Осадок
водонерастворимых белков суспендируют в 750 мкл «буфера для разрушения», переносят в новые пробирки и центрифугируют в течение 15 мин при 16000g. Полученный осадок (100 мкл), содержащий целевые белки, суспендируют в 400 мкл буфера «6,5G» (6,5 М раствор гуанидин гидрохлорида или гуанидин тиоцианата в буфере, содержащем 0.1 М фосфата натрия, 0.01 М Tris-HCl, рН 6.5.) и целевые белки экстрагируют в течение ночи на магнитной мешалке при температуре +4°С. Затем суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 16000g, супернатант с перешедшим в него целевым белком диализуют против 300 мл 5мМ ацетата натрия в течение 1 ,5 часов. Полученный образец
центрифугируют в течение 15 мин при 16000g, и супернатант используют для электрофоретического анализа уровня продукции целевого белка.
Электрофоретический анализ целевого белка проводят 12% ПААГ- ДДС- Na по стандартной процедуре Лэммли [Laemmli, 1970, Nature, v.227, 680-685]. Для анализа раствор разводят приблизительно в 500 - 1000 раз «буфером для образцов» (0.0625 М Tris-HCl, рН 6.8, 2 мае. % ДДс-Na, 0.0025 мае. %
бромфенол blue). И кипятят в водяной бане в течение 5 минут. Аликвоты в 3 - 15 мкл наносят на 12% ПААГ и подвергают электрофорезу в аппарате Bio Rad MiniPROTEAN пока фронт красителя будет на расстоянии 1 см до конца геля. Гели отмывают в воде и окрашивают в 0,2% растворе Кумасси R-250
(Fermentas). Электрофоретический анализ показывает, что белки 1F9 и 2Е12 накапливаются во фракции водонерастворимых белков клеток дрожжей S.
cerevisiae и не содержат компонент SUMO или убиквитина (Фиг. 1 и 2). На это указывает электрофоретическая подвижность анализируемых белков и отсутствие в геле полос белка, соответствующих по подвижности гибридным белкам 1F9 и 2Е12, слитых с белком SUMO или убиктивином.
Количественную оценку чистоты препаратов осуществляли с помощью программы «Видеоденситометр Сорбфил 1.0», для чего окрашенные гели после электрофореза сканировали, полученное изображение вводили в
компьютер и оценку количества белка в пятне и на каждой дорожкке определяли с помощью указанной программы. В качестве стандартов сравнения использовали высокоочищенные препараты исследуемых белков, известное количество которых наносили на соседние дорожки в том же геле. Чистота препаратов белков, оцененная таким способом составляла 96% и выше.
Пример 10. Продукция белков 1F9 и 2Е12 штаммами Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3583 и ВКПМ Y-3584
Для получения посевного материала штаммы ВКПМ Y-3583 и ВКПМ Y- 3584 выращивают в среде YPD на ротационной качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 28°С в течение 20-24 часов. 50 мл посевного
материала используют для засева 3 -литрового ферментера Anglicon,
содержащего 950 мл среды YPD. Ферментацию проводят при температуре 28°С, аэрации 1 л/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин. Через 24 часа после засева ферментера начинают подпитку среды культивирования 50%-м раствором глюкозы со скоростью 2 мл/ч и устанавливают рН-статирование культуры на уровне рН 6.8±0.1 , используя для подтитровки растворы 10% серной кислоты и 10%) NaOH. Среднее общее время ферментирования составляет 72 часа. По данным электрофоретического анализа продукция белка 1F9 в этих условиях составляет не менее 200 мг/л культуральной жидкости и продукция белка 2Е12 в этих условиях составляет не менее 100 мг/л культуральной жидкости.
Пример 1 1. Выделение и очистка рекомбинантных белков 1 F9 и 2Е 12 из водонерастворимой фракции клеток Saccharomyces cerevisiae
Выделение и очистку белков 1F9 и 2Е12 из водонерастворимой фракции клеток штаммов-продуцентов ВКПМ Y-3583 и ВКПМ Y-3583 проводят с использованием методов, описанных Богушем с соавт. [Богуш В. Г. с соавт., 2001 , Биотехнология, т.2, 1 1-22; Богуш В. Г. с соавт., 2006, Биотехнология, т.4, 3-12; Bogush V.G. et al., 2009, J. Neuroimmune Pharmacol., v.4, 17-27]. При наращивании биомассы дрожжей S. cerevisiae в 3 -литровом ферментере на среде YPD без подпитки в присутствии 2%> глюкозы в стартовой среде с одной ферментации получают в среднем 400 - 500 г влажной клеточной биомассы. 1 кг промытой влажной биомассы суспендируют в «буфере для разрушения», и клетки разрушают с помощью стеклянных шариков в проточной мельнице в течение 1 ,5 часов, центрифугируют полученную суспензию и собирают осадок. Экстракцию целевого белка из осадка осуществляют с помощью раствора 10% лития хлористого в 90%-й муравьиной кислоте в течение 16 - 18 часов с последующим центрифугированием. Осадок отбрасывают, а супернатант подвергают ультрафильтрации с последующей диафильтрацией через
мембрану М50 для перевода в10 мМ ацетат натрия, рН 4,0 и удаления белков клетки хозяина с молекулярной массой ниже 50 к Да.
Окончательную очистку проводят с помощью ионно-обменной
хроматографии на катионообменной колонке HiPrep 16/10 SP FF (GE
Healthcare) в системе ФПЛС. После прохождения фильтрата через колонку и последующей промывки колонки 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7,0 и затем 10 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 4,0, белки 1F9 и 2Е12 элюируют с колонки 10%-м раствором NaCl в том же буфере и идентифицируют
электрофоретически в 12% ПААГ-ДДс-Na, фракции с целевым белком объединяют, диализуют против деионизованной воды, замораживают при - 70С° и лиофильно высушивают. Лиофилизованный препарат представляет собой субстанцию белого цвета, похожую на вату.
Пример 12. Определение характеристик белков 1F9 и 2Е12
Для проведения анализа полученного препарата чистого
рекомбинантного белка предварительно растворяют навеску препарата в 90%>- й муравьиной кислоте с 10%-м хлоридом лития в течение не менее 2 часов, диализуют против деионизованной воды (1-1 ,5 часа) и анализируют с
помощью SDS-электрофореза в 12% ПААГ. Наличие одной полосы в геле, соответствующей молекулярномой массе рекомбинантного белка,
подтверждает гомогенность получаемого препарата. Полученные препараты обоих белков характеризуются коэффициентом экстинкции, равным
приблизительно 0,48+0,02 ОЕ280/мг. Эта величина соответствует теоретически рассчитанной, исходя из аминокислотного состава этих белков (0,49 ОЕ280/м) и свидетельствует о высокой чистоте полученных препаратов.
Для анализа способности очищенных рекомбинантных белков паутины паука-кругопряда образовывать надмолекулярные структуры различных типов эти белки были протестированы на способность формировать не
растворяющиеся в воде нити. Нити получают в результате спиннинга
(прядения) концентрированного раствора белка через узкое отверстие. Для этого навеску очищенного лиофильно высушенного препарата белка
растворяют в 90%-й муравьиной кислоте с 10%-м хлоридом лития в течение не менее 2 часов, диализируют против деионизованной воды в течение 1-1 ,5 часов и нерастворившийся материал удаляют центрифугированием. Раствор белка пропускают через специально сконструированный микроспиннерет с внутренним диаметром около 50 мкм со скоростью 5 - 10 мкл/мин в
коагуляционную ванну с 96% этанолом. При этом образуется
водонерастворимая нить, которая свободно ниспадает на дно сосуда. Вновь образованные искусственные нити в сосуде с этанолом представлены на Фиг. 8. Новообразованную нить выдерживают в сосуде с 96% спиртом в течение 20 минут, затем максимально растягивают в 75%-м этаноле, отжигают,
выдерживают в деионизованной воде и высушивают на воздухе. Нити, подвергнутые всем этапам воздействия, характеризуются значениями
относительной разрывной нагрузки в 10 - 15 сН/текс (13 мПа).
Приведенные результаты показывают, что при осуществлении
предложенного способа получения рекомбинантных белков паутины паука- кругопряда достигнуто существенное повышение выхода рекомбинантных белков, причем получаемые рекомбинантные белки характеризуются высокой чистотой и физико-химическими свойствами, характерными для природных белков паутины. Предложенный способ получения рекомбинантного белка паутины позволяет получать препараты рекомбинантного белка с очень высокой степенью очистки в промышленном масштабе, разрабатывать способы микропрядения для получения на его основе искусственных волокон, а также способы формирования пленок, гидрогелей, микрогелей и микрокапсул на основе рекомбинантных белков паутины для использования в биотехнологии, медицине, косметологии, автомобильной и авиационной промышленности и других областях техники.

Claims

Формула изобретения
1. Способ получения белка паутины паука-кругопряда в клетках дрожжей, предусматривающий конструирование вектора экспрессии, содержащего последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок паутины, трансформацию клеток дрожжей полученным вектором экспрессии и экспрессию в трансформированных клетках белка паутины паука-кругопряда, отличающийся тем, что используют вектор экспрессии, который включает в себя последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок паутины паука-кругопряда, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин- подобный белок, занимающий в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины.
2. Способ получения белка паутины паука-кругопряда по п. 1, отличающийся тем, что используют вектор экспрессии, который содержит
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок паутины паука-кругопряда, консенсусные последовательности которого происходят из каркасных белков большой и/или малой ампульных желёз, или белков ловчей нити.
3. Способ получения белка паутины паука-кругопряда по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хозяйских клеток используют клетки Saccharomyces cerevisiae.
4. Способ получения белка паутины паука-кругопряда по п. 1 , отличающийся тем, что используют вектор экспрессии, который содержит
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок паутины паука-кругопряда, консенсусные последовательности которого происходят из каркасных белков большой ампульной железы Nephila clavipes и/или Nephila madagascariensis, и убиквитин-подобный белок выбирают из группы, включающей убиквитин и белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
5. Способ получения белка паутины паука-кругопряда по п. 1 , отличающийся тем, что используют бирепликонный вектор pPDX3-HUB-2E12, включающий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей,
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ промоторную область гена дрожжей GAL1, последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 2Е12 каркасной нити паука-кругопряда Nephila madagascariensis, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae.
6. Способ получения белка паутины паука-кругопряда по п. 1, отличающийся тем, что используют бирепликонный вектор pPDX3-HUB-lF9, включающий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1, последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 1F9 каркасной нити паука— кругопряда Nephila clavipes, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин
Saccharomyces cerevisiae.
7. Способ получения белка паутины паука-кругопряда по п. 1, отличающийся тем, что используют бирепликонный вектор pPDX3-SUMO-lF9, включающий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1, последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 1F9 каркасной нити паука-кругопряда Nephila clavipes, слитую с последовательностью, кодирующей белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
8. Слитый белок, включающий в себя рекомбинантный белок паутины паука- кругопряда и убиквитин-подобный белок, занимающий в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины, причем последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные последовательности, которые происходят из
повторяющихся последовательностей белков каркасной нити MaSpl и/или MaSp2 большой ампульной железы, белков MiSpl и/илиМ.8р2 малой
ампульной железы, или белка Flag ловчей нити паука-кругопряда.
9. Слитый белок по п. 8, в котором последовательность убиквитин-подобного белка выбирают из группы, включающей убиквитин и белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а последовательность рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда включает консенсусные последовательности,
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ происходящие из повторяющихся последовательностей белков каркасной нити MaSpl и MaSp2 большой ампульной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
10. Слитый белок по п. 8, отличающийся тем, что содержит
последовательности рекомбинантного белка 1F9 каркасной нити паука- кругопряда Nephila clavipes и убиквитина дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий последовательность SEQ ID ΝΟ: 1, как представлено в Перечне последовательностей .
1 1. Слитый белок по п. 8, отличающийся тем, что содержит
последовательности рекомбинантного белка каркасной нити 2Е12 паука- кругопряда Nephila madagascariensis и убиквитина дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий последовательность SEQ ID NO:2, как представлено в Перечне последовательностей.
12. Слитый белок по п. 8, отличающийся тем, что содержит
последовательности рекомбинантного белка 1F9 каркасной нити паука- кругопряда Nephila clavipes и белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий последовательность SEQ ID NO:3, как представлено в Перечне последовательностей.
13. Рекомбинантная ДНК, кодирующая слитый белок, включающий в себя последовательности рекомбинантного белка паутины паука-кругопряда и убиквитин-подобного белка, занимающего в составе слитого белка Ν-концевое положение по отношению к рекомбинантному белку паутины, причем последовательность рекомбинантного белка паутины включает консенсусные
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ последовательности, которые происходят из повторяющихся
последовательностей белков каркасной нити MaSpl и/или MaSp2 большой ампульной железы, белков MiSpl и/или MiSp2 малой ампульной железы, или белка Flag ловчей нити.
14. Рекомбинантная ДНК по п. 13, где убиквитин-подобный белок выбирают из группы, включающей убиквитин и белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и консенсусные последовательности рекомбинантного аналога белка паутины паука-кругопряда представляют собой последовательности, происходящие из повторяющихся последовательностей белков каркасной нити MaSp 1 и MaSp2 большой ампульной железы Nephila clavipes и Nephila madagascariensis и выбираемые из группы:
AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG
AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG
AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG
GPGGYGPGQQGPGAAAAASA
GRGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGQQGPGGSGAAAAAA
GRGPGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GPGGYGPGQQGPGAAAAAAA
GSGAGGYGPGQQGPGGPGAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSSAAAAAA
GSGPGGYGPGQQGPGGSGAAAAAAAA
GRGPGGYGQGQQGPGGPGAAAAAA
15. Рекомбинантная ДНК по п. 13, кодирующая слитый белок, содержащий последовательности рекомбинантного белка 1F9 каркасной нити паука- кругопряда Nephila clavipes и убиквитина дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий последовательность SEQ ID ΝΟ: 1 , как представлено в Перечне последовательностей.
16 . Рекомбинантная ДНК по п. 13, кодирующая слитый белок, содержащий последовательности рекомбинантного белка 2Е12 каркасной нити паука- кругопряда Nephila madagascariensis и убиквитина дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий последовательность SEQ ID NO:2, как представлено в Перечне последовательностей.
17. Рекомбинантная ДНК по п. 13, кодирующая слитый белок,содержащий последовательности рекомбинантного белка 1F9 каркасной нити паука-
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ кругопряда Nephila clavipes и белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и имеющий последовательность SEQ ID NO:3, как представлено в Перечне последовательностей.
18. Вектор экспрессии, содержащий рекомбинантную ДНК по п.13.
19. Вектор экспрессии по п. 18, включающий рекомбинантную ДНК,
кодирующую аналог белка паутины паука-кругопряда, консенсусные
последовательности которого происходят из повторяющихся
последовательностей каркасных белков большой ампульной железы Nephila clavipes и/или Nephila madagascariensis, и убиквитин-подобный белок выбирают из группы, включающей убиквитин и белок SUMO дрожжей
Saccharomyces cerevisiae.
20. Вектор экспрессии по п. 18, представляющий бирепликонный вектор pPDX3-HUB-2E12 и содержащий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1,
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный аналог белка 2Е12, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae.
21. Вектор экспрессии по п. 18, представляющий бирепликонный вектор pPDX3-HUB-lF9 и содержащий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1,
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный аналог белка 1F9, слитую с последовательностью, кодирующей убиквитин Saccharomyces cerevisiae.
22. Вектор экспрессии по п. 18, представляющий бирепликонный вектор pPDX3-SUMO-lF9, включающий область инициации репликации эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, промоторную область гена дрожжей GAL1,
последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок 1F9, слитую с последовательностью, кодирующей белок SUMO Saccharomyces cerevisiae.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
23. Хозяйская клетка дрожжей, продуцирующая рекомбинантный белок каркасной нити паутины паука-кругопряда, трансформированная вектором экспрессии по п. 18.
24. Хозяйская клетка дрожжей по п. 23, отличающаяся тем, что является клеткой Saccharomyces cerevisiae .
25. Штамм Saccharomyces cerevisiae, продуцирующий рекомбинантный белок 1F9 каркасной нити паутины паука-кругопряда и трансформированный вектором экспрессии pPDX3-HUB-lF9, депонированый во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва) под No ВКПМ Y-3583.
26. Штамм Saccharomyces cerevisiae, продуцирующий рекомбинантный белок 2Е12 каркасной нити паутины паука-кругопряда и трансформированный вектором экспрессии pPDX3-HUB-2E12, депонированый во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва) под No ВКПМ Y-3584.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
PCT/RU2010/000752 2010-11-25 2010-12-13 Способ получения белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, хозяйская клетка и штаммы-продуценты Ceased WO2012070977A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10859885.5A EP2644616B1 (en) 2010-11-25 2010-12-13 Method for producing spider silk protein, a fused protein, recombinant dna, an expression vector, a host cell and strain-producers
US13/989,727 US9475852B2 (en) 2010-11-25 2010-12-13 Method for producing web protein, a fused protein, recombinant DNA, an expression vector, a host cell and strain-producers

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010148011/10A RU2451023C1 (ru) 2010-11-25 2010-11-25 Способ получения рекомбинантного белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, клетка-хозяин и штаммы-продуценты
RU2010148011 2010-11-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012070977A1 true WO2012070977A1 (ru) 2012-05-31

Family

ID=46146105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000752 Ceased WO2012070977A1 (ru) 2010-11-25 2010-12-13 Способ получения белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, хозяйская клетка и штаммы-продуценты

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9475852B2 (ru)
EP (1) EP2644616B1 (ru)
RU (1) RU2451023C1 (ru)
WO (1) WO2012070977A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017115005A1 (en) 2015-12-29 2017-07-06 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Production of fusion proteins in trichoderma
KR102790669B1 (ko) 2016-02-11 2025-04-04 시비스 머테리얼 사이언스 리미티드 합성 드래그라인 거미 실크를 포함하는 복합체
CN106434699A (zh) * 2016-07-15 2017-02-22 安徽农业大学 Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用
EP4139338A4 (en) 2020-04-23 2025-07-09 Seevix Mat Sciences Ltd MODIFIED SPIDER SILK FIBERS AND THEIR USE
CN113755512B (zh) * 2020-12-03 2023-11-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种制备串联重复蛋白质的方法与应用
US12391912B2 (en) 2021-10-26 2025-08-19 Rensselaer Polytechnic Institute Systems and methods for increased production of recombinant biopolymers via genome engineering and downregulation of basal expression
US11951159B1 (en) * 2022-11-02 2024-04-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Cattle fever tick-infestation vaccines and uses thereof
CN119372237B (zh) * 2024-12-12 2025-12-26 华中农业大学 利用马克斯克鲁维酵母制备猪流行性腹泻病毒表位纳米颗粒的方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006008163A2 (en) 2004-07-22 2006-01-26 Technische Universitaet Muenchen Recombinant spider silk proteins
US20090226969A1 (en) * 2005-12-30 2009-09-10 Spiber Technologies Ab Spider Silk Proteins and Methods for Producing Spider Silk Proteins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6068994A (en) 1989-08-07 2000-05-30 Chiron Corporation Ubiquitin expression system
US5989894A (en) 1990-04-20 1999-11-23 University Of Wyoming Isolated DNA coding for spider silk protein, a replicable vector and a transformed cell containing the DNA
WO2003020916A2 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 University Of Wyoming Spider silk protein encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and method of use thereof
AU2007342011A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Lifesensors, Inc. Methods and compositions for enhanced protein expression and purification

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006008163A2 (en) 2004-07-22 2006-01-26 Technische Universitaet Muenchen Recombinant spider silk proteins
US20090226969A1 (en) * 2005-12-30 2009-09-10 Spiber Technologies Ab Spider Silk Proteins and Methods for Producing Spider Silk Proteins

Non-Patent Citations (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCIDIACONO S. ET AL., APPL.MICROBIOL.BIOTECHNOL., vol. 49, 1998, pages 1 - 38
BOGUSH V. G.; DEBABOV V.G., J. NEUROIMMUNE PHARMACOL., vol. 4, 2009, pages 17 - 27
BOGUSH V.G. ET AL., J. NEUROIMMUNE PHARMACOL., vol. 4, 2009, pages 17 - 27
BOGUSH V.G. ET AL.: "Molekulyarnoe klonirovanie i ekspressiya v drozhzhakh sinteticheskikh genov belkov - analogov belka karkasnoi niti spidroina 1", BIOTEKHNOLOGIYA, vol. 2, 2001, pages 11 - 22, XP008169108 *
BOGUSH V.G. ET AL.: "oluchenie, ochistka i pryadenie rekombinantnogo analoga spidroina 1", BIOTEKHNOLOGIYA, no. 4, 2006, pages 3 - 12, XP008169110 *
BOGUSH V.G., BIOTECHNOLOGIES, vol. 2, 2001, pages 11 - 22
BOGUSH V.G., BIOTECHNOLOGIES, vol. 4, 2006, pages 3 - 12
BOGUSH V.G., BIOTECHNOLOGIES, vol. T.2, 2001, pages 11 - 22
BOGUSH V.G., BIOTECHNOLOGIES, vol. T.4, 2006, pages 3 - 12
BOGUSH V.G.; DEBABOV V.G., J. NEUROIMMUNE PHARMACOL., vol. 4, 2009, pages 17 - 27
BUTT ET AL., PROTEIN EXPR. PURIF., vol. 43, 2005, pages 1 - 9
COLGIN M. A.; LEWIS R. V., PROTEIN SCI., vol. 7, 1998, pages 667 - 672
COLGIN M.A.; LEWIS R., PROTEIN SCI., vol. 7, 1998, pages 667 - 672
FAHNESTOCK S.R.; BEDZYK L.A., APPL.MICROBIOL.BIOTECHNOL, vol. 47, 1997, pages 33 - 39
FAHNESTOCK S.R.; IRWIN S.L., APPL.MICROBIOL.BIOTECHNOL., vol. 47, 1997, pages 23 - 32
FAHNESTOCK; BEDZYK, APPL.MICROBIOL.BIOTECHNOL, vol. 47, 1997, pages 33 - 39
FAHNESTOCK; IRWIN, APPL.MICROBIOL.BIOTECHNOL., vol. 47, 1997, pages 23 - 32
GOSLINE J.M. ET AL., ENDEAVOR, vol. 10, 1986, pages 37 - 43
GUERETTE P. ET AL., J. SCIENCE, vol. 272, 1996, pages 112 - 115
GUERETTE P. ET AL., SCIENCE, vol. 272, 1996, pages 112 - 115
HAYASHI C.; LEWIS R. V., J. MOL. BIOL., vol. 275, 1998, pages 773 - 784
HAYASHI C.Y.; LEWIS R.V., J.MOL.BIOL., vol. 275, 1998, pages 773 - 784
HAYASHI ET AL., INT.J.BIOL.MACROMOL., vol. 24, 1999, pages 271 - 275
HINMAN, TIBTECH, vol. 1, 2000, pages 374 - 379
HINNMAN M.; LEWIS R., J.BIOL.CHEM., vol. 267, 1992, pages 19320 - 19324
HUMMERICH, D. ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 43, 2004, pages 13604 - 13612
ITO ET AL., J. BACTERIOL., vol. 153, 1983, pages 163 - 168
JOERG HERRMANN ET AL.: "Ubiquitin and Ubiquitin-Like Proteins in Protein Regulation", CIRCULATION RESEARCH, vol. 100, 2007, pages 1276 - 1291, XP055110818 *
JOHNSON ET AL., EMBO J, vol. 16, 1997, pages 5509 - 5519
K. VASANTHAVADA ET AL., CELL. MOL. LIFE SCI, vol. 63, 2006, pages 1986 - 1999
KARTASHEVA ET AL., YEAST, vol. 12, 1996, pages 1297 - 13
KOHLER T.; VOLLRATH F., J.EXP.ZOOL., vol. 271, 1995, pages 1 - 17
LAEMMLI, NATURE, vol. 227, 1970, pages 680 - 685
LAWRENCE B. A. ET AL., BIOMACROMOLECULES, vol. 5, 2004, pages 689 - 695
LEWIS, R. V. ET AL., PROTEIN EXPR. PURIF., vol. 7, 1996, pages 400 - 406
MALAKHOV ET AL., J. STRUCT. FUNCT. GENOM., vol. 5, 2004, pages 75 - 86
MICHAEL J. MCPHERSON ET AL.: "Recombinant Production of Self-Assembling Peptides", ADVANCES IN CHEMICAL ENGINEERING, vol. 35, 2009, pages 79 - 117, XP008169093 *
MICHAEL P. MALAKHOV ET AL.: "SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient and purification of proteins", JOURNAL OF STRUCTURAL AND FUNCTIONAL GENOMICS, vol. 5, 2004, pages 75 - 86, XP002340858 *
MOSSESSOVA E.; LIMA C.D., MOL. CELL, vol. 5, 2000, pages 865 - 876
MULLER ET AL., EMBO J, vol. 17, 1998, pages 61 - 70
MULLER ET AL., NATURE, vol. 2, 2001, pages 202 - 210
PRINCE J.T. ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 34, 1995, pages 10879 - 10884
SCHELLER, J. ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 19, 2001, pages 573 - 577
See also references of EP2644616A4 *
SHATZMAN; ROSENBERG, METHODS ENZYNOL., vol. 152, 1987, pages 661 - 673
SIDORUK: "Actual problems of genetics, radiobiology and radioecology", COLLECTED THESES AND REPORTS, DUBNA, JINR, 2008, pages 100
WINKLER S. ET AL., INT.J.BIOL.MACROMOL, vol. 24, 1999, pages 265 - 270
XU M.; LEWIS R., PROC.NATL.ACAD.SCI., USA, vol. 87, 1990, pages 7120 - 7124

Also Published As

Publication number Publication date
RU2451023C1 (ru) 2012-05-20
US9475852B2 (en) 2016-10-25
EP2644616B1 (en) 2016-11-30
EP2644616A4 (en) 2014-12-03
US20140094589A1 (en) 2014-04-03
EP2644616A1 (en) 2013-10-02
EP2644616A8 (en) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2451023C1 (ru) Способ получения рекомбинантного белка паутины, слитый белок, рекомбинантная днк, вектор экспрессии, клетка-хозяин и штаммы-продуценты
CN112552393B (zh) 一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统
CN102443057B (zh) 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法
KR20250177398A (ko) 재조합 소분자 콜라겐 및 그의 발현 시스템과 제조 방법
CN105061589B (zh) 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法
WO2025185547A1 (zh) 重组vii型胶原蛋白及其制备方法和应用
EP4567044A1 (en) High-stability recombinant collagen, and construction method therefor and use thereof
CN118359703B (zh) 一种重组透皮类胶原蛋白及其制备方法和应用
CN116574173B (zh) 蛋白稳定性增强的重组人源纤连蛋白突变体及其表达菌株
EP4696779A1 (en) Batroxobin fermentation culture medium and fermentation method therefor
CN118546240A (zh) 一种重组人纤连蛋白及其制备方法和应用
RU2478706C1 (ru) Способ получения суспензий гидрогелевых микрочастиц с заданными размерами на основе рекомбинантного белка паутины и их применение
WO2025081737A1 (zh) 一种在微生物中形成可逆无膜细胞器的方法
CN118561987A (zh) 一种可自组装的重组胶原蛋白及其制备方法与应用
CN113249241B (zh) 一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用
JP2003125791A (ja) 酵母プロモーター
CN102260331B (zh) 毕赤酵母壁蛋白Gcw34及其表面展示系统和构建方法
CN112980753B (zh) 用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统
US20210079064A1 (en) Preparation of Type I Collagen-Like Fiber and Method for Regulating and Controlling the D-periodic of Fiber Thereof
CN114540363B (zh) 一种类人胶原蛋白重组毕赤酵母工程菌的构建和蛋白快速纯化方法
CN119504980A (zh) 一种重组xii型胶原蛋白及其制备方法和应用
KR102488022B1 (ko) 재조합 실크 단백질 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 고분자량 재조합 실크 단백질의 생산 방법
JP2026512110A (ja) バトロキソビンの発現精製方法及び応用
CN113214409B (zh) 一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体mtm及其应用
CN114807200B (zh) 一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10859885

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010859885

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010859885

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13989727

Country of ref document: US