WO2012081898A2 - 위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법 - Google Patents

위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법 Download PDF

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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a marker for predicting the prognosis of gastric cancer, a composition and kit for predicting the prognosis of gastric cancer, including an agent for measuring the expression level thereof, and a method for predicting the prognosis of gastric cancer using the marker.
  • Stomach cancer symptoms range from no symptoms to severe pain.
  • the symptoms of gastric cancer do not have any characteristics but show general digestive symptoms.
  • most of the early symptoms of gastric cancer and even if it is mild enough to feel a slight indigestion or stomach discomfort, most people overlook it, causing the death rate of stomach cancer.
  • the first is gastrointestinal X-ray imaging, which includes dual imaging, compression, and mucosal imaging.
  • gastroscopy allows direct visual observation of the stomach gland, and even the smallest lesions that do not appear on X-rays. Not only can it be done, but it is possible to perform a direct biopsy at places where stomach cancer is suspected, increasing the diagnosis rate.
  • this method has the disadvantages of hygiene problems and the patient suffering during the examination. Therefore, in recent years, a study for diagnosing gastric cancer by measuring the expression level of a gene marker specifically expressed in gastric cancer has been made, but relatively little research on genetic markers for predicting the prognosis of gastric cancer patients.
  • Phase IIIB 39.6%
  • Phase IV 26.3%
  • gastric cancer treatment methods include surgery, endoscopic treatment, chemotherapy and radiotherapy.
  • treatment for gastric cancer is determined by considering the size, location and extent of gastric cancer, the general health of the patient, and many other factors.
  • stage B / II gastric cancer In stage B / II gastric cancer, about 30% of patients with surgery alone are known to relapse within 5 years. In this case, it is impossible to predict in which patients the gastric cancer recurs, and treatment is performed in different ways depending on the doctor. Therefore, if the prognosis of gastric cancer patients can be accurately predicted, the appropriate treatment direction such as surgery or chemotherapy may be determined according to the prognosis, and thus, the technology can predict the prognosis of gastric cancer patients accurately. Required.
  • the present inventors have studied how to predict the prognosis of gastric cancer accurately and determine the appropriate treatment direction according to the predicted prognosis. By measuring the expression level of the marker, it was confirmed that the prognosis of gastric cancer can be accurately predicted, and completed the present invention.
  • the objectives of the present invention are C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1, THBS4, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, NOX4, TFDP1, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LP ANR1 PR , CASP8, CLYBL, CST2, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B and PCDHGA8 genes.
  • To provide a marker for predicting the prognosis of gastric cancer including.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the prognosis of gastric cancer comprising an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for predicting the prognosis of gastric cancer, including an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of the gastric cancer.
  • Another object of the present invention is a) obtaining the expression level, or expression pattern of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of the gastric cancer from a sample taken from the gastric cancer patient; And b) comparing the expression level or expression pattern obtained in step a) with the expression level of the mRNA or protein of the gene of the patient of known gastric cancer, or the expression pattern.
  • Still another object of the present invention is a) a step of obtaining a numerical expression value by measuring the expression level of mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of the gastric cancer from a sample taken from the gastric cancer patient; b) applying the expression value obtained in step a) to a prognostic prediction model to obtain a gastric cancer prognostic prediction score; And c) comparing the gastric cancer prognosis prediction score obtained in step b) with a reference value to determine the prognosis of the gastric cancer.
  • the prognosis of gastric cancer can be predicted quickly and accurately, and an appropriate treatment direction can be determined according to the predicted prognosis, thereby greatly contributing to the reduction of mortality due to gastric cancer.
  • patients predicted to have a negative prognosis among stage Ib / II gastric cancer patients according to the present invention are developed for stage III gastric cancer because the prognosis is similar to stage III gastric cancer patients and resistant to conventional standard chemotherapy.
  • the use of targeted therapies will greatly contribute to increased survival.
  • 1 is a graph showing the correlation between risk based on quantile normalization and self-standardization using comparative genes.
  • Figure 2 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the C20orf103, COL10A1 gene.
  • Figure 3 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the MATN3, FMO2 gene.
  • Figure 4 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the FOXS1, COL8A1 gene.
  • Figure 5 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of THBS4, ALAS1 gene.
  • Figure 6 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the CASP8, CLYBL gene.
  • Figure 7 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the CST2 HSPC159 gene.
  • Figure 8 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of MADCAM1, MAF gene.
  • Figure 9 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the REG3A, RNF152 gene.
  • Figure 11 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of GPNMB, HIST1H2AJ gene.
  • Figure 12 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the RPL9, DPP6 gene.
  • Figure 13 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the ARL10, ISLR2 gene.
  • Figure 14 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of GPBAR1, CPS1 gene.
  • Figure 15 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of BCL11B, PCDHGA8 gene.
  • 2 to 15 p value is the result of the log rank test by dividing the expression level of the gene into high or low expression.
  • FIG. 16 is a Keplan-Meier plot showing the disease-free survival of the positive or negative prognostic groups (High risk) classified according to the prognostic prediction model using the genes listed in Table 5.
  • FIG. 16 is a Keplan-Meier plot showing the disease-free survival of the positive or negative prognostic groups (High risk) classified according to the prognostic prediction model using the genes listed in Table 5.
  • FIG. 17 is a Keplan-Meier plot showing disease-free survival in patients with stage Ib / II gastric cancer classified into a positive or negative prognosis group according to a prognostic prediction model using the genes listed in Table 5.
  • FIG. 17 is a Keplan-Meier plot showing disease-free survival in patients with stage Ib / II gastric cancer classified into a positive or negative prognosis group according to a prognostic prediction model using the genes listed in Table 5.
  • FIG. 18 is a Keplan-Meier plot showing disease-free survival of positive or negative prognostic groups (high risk) classified according to prognostic prediction models using the genes listed in Table 7.
  • FIG. HR in FIG. 18 is the cumulative risk water content ratio, and the p value was calculated using 100 permutations.
  • FIG. 19 is a Keplan-Meier plot for a group of patients sorted according to pathological stage (IB + II vs III + IV) classified according to prognostic prediction model using the genes listed in Table 7 (high vs low) . p values were calculated by a two-sided log-rank test.
  • Figure 20 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the CDC25B, CDK1 gene.
  • Figure 21 shows the Keplan-Meyer plot according to the expression level of the CLIP4, LTB4R2 gene.
  • Figure 23 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of ADRA2C, CSK gene.
  • Figure 24 shows the Keplan-Meier plot according to the expression level of the FZD9, GALR1 gene.
  • FIG. 25 shows Keplan-Meier plots according to expression levels of GRM6 and INSR genes.
  • FIG. 26 shows Keplan-Meier plots according to the expression levels of LPHN1 and LYN genes.
  • 20-27 p value is the result of the log rank test by dividing the expression level of the gene into high or low expression.
  • FIG. 28 shows cut-off analysis of GCPS of the genes listed in Table 10. The best discrimination was when patients were divided into 75% high risk group and 25% low risk group.
  • FIG. 29 shows disease-free survival of stage II gastric cancer patients in a discovery set based on optimized cut-off of GCPS of the genes listed in Table 10.
  • FIG. 30 shows the distribution of the GCPS of the genes listed in Table 10 in the discovery set vs. verification set, showing that the distribution of the GCPS in the discovery set and the verification set is consistent. This indicates the analytical strength of this assay.
  • FIG. 32 shows disease-free survival of stage II gastric cancer patients who received surgery and radiation based on GCPS of the genes listed in Table 11. Blue represents a high risk as defined by the GCPS.
  • FIG. 33 shows disease-free survival of stage II gastric cancer patients who received surgery based on GCPS of the genes listed in Table 11.
  • FIG. Blue indicates high risk classified by GCPS.
  • the present invention is C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1, THBS4, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, NOX4, TFDP1, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM1, , INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ALAS1, CASP8, CLYBL, CST2, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2B, GPBDGA Provided are markers for predicting prognosis of gastric cancer comprising one or more genes selected from the group consisting of genes.
  • the present invention provides a composition for predicting the prognosis of gastric cancer comprising an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of the gastric cancer.
  • the prognosis of gastric cancer is different even from the same pathological stage of gastric cancer. Survival of gastric cancer patients can be improved by appropriate treatment according to the prognosis. Accordingly, the present invention measures markers for predicting prognosis of gastric cancer and its expression level in order to accurately predict the prognosis of a patient diagnosed with gastric cancer and to set an appropriate treatment direction according to the predicted prognosis in order to increase the survival rate of gastric cancer patients. It provides a composition for predicting the prognosis of gastric cancer comprising the agent.
  • the term "marker” refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively associated with the presence of a biological phenomenon
  • the marker of the present invention refers to a gene that becomes a standard for predicting a patient with a good or poor prognosis after the development of gastric cancer.
  • the markers of the present invention have a significantly low p value, which is highly reliable for predicting the prognosis of gastric cancer.
  • the markers described in Tables 5, 7, 10, and 11 may be classified into a positive prognosis group or a negative prognosis group according to its expression level. In the Keplan-Meier plot showing the survival rate of these groups, the survival rate of the positive prognosis group is higher than that of the negative prognosis group. Can be.
  • prognosis means an expectation for a medical ear (e.g., long-term viability, disease free survival rate, etc.), and includes a positive prognosis (positive prognosis) or a negative prognosis (negative prognosis), the negative Prognosis includes disease progression or mortality such as recurrence, tumor growth, metastasis, drug resistance, etc., and positive prognosis includes improvement or stabilization of diseases such as disease regression, tumor regression, etc. stabilization).
  • the term "prediction" means to estimate in advance with respect to the medical ear, and for the purposes of the present invention, the progress of the disease of the patient diagnosed with gastric cancer (the progression, improvement, recurrence of gastric cancer, tumor growth, Drug resistance).
  • a patient diagnosed with gastric cancer is classified into a positive prognostic group or a negative prognostic group to predict the prognosis of the gastric cancer patient, and further, a patient group diagnosed with the same pathological stage of gastric cancer is classified according to the prognosis
  • the prognosis of gastric cancer patients was predicted in advance (Examples 7 to 9).
  • the marker for predicting prognosis of gastric cancer is a combination of C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1 and THBS4 genes, ALAS1, C20orf103, CASP8, CLYBL, COL10A1, CST2, FMO2, FOXS1, HSPC159, MADCAM1 Combination of REG3A, RNF152, THBS4, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B and PCDHGA8 genes, C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4DP, LTB4DP Combination, or a combination of ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 and NOX4 genes, more preferably C20orf103,
  • the inventors have found that the genes can accurately predict the prognosis of gastric cancer through the following process.
  • the present inventors extracted RNA from formalin fixed paraffin embedded gastric cancer tumor tissue, and using the extracted RNA using the whole genome DASL assay kit (Whole-Genome DASL assay kit), after measuring the gene expression level, gene expression Standard statistical analysis was performed using the Cox proportional hazard model, where levels were treated as continuous variables.
  • gene expression Standard statistical analysis was performed using the Cox proportional hazard model, where levels were treated as continuous variables.
  • univariate analysis was performed to determine the prognostic predictive genes of 369 gastric cancers (Table 2) and the pathological stage Ib / II gastric cancers (Table 3), which are highly correlated with disease-free survival. I identified it.
  • a prognostic prediction model including the genes of Table 5 was generated by applying the superPC algorithm to the expression level of the identified genes, and gastric cancer patients were classified into a positive prognosis group or a negative prognosis group according to the prediction model.
  • the Keplan-Meier plot for the sorted population showed that the survival rate of the positive prognostic group was higher than that of the negative prognostic group, thereby verifying the validity and reliability of the prognostic prediction model using the marker of the present invention. (Example 7 and Figs. 16 and 17).
  • the prognostic prediction model including the genes of Table 7 was generated by applying the gradient lasso algorithm to the expression level of the identified genes, and according to the prediction model, gastric cancer patients were classified into a positive prognostic group or a negative prognostic group. It was confirmed that these classifications were consistent with the clinical results (Example 8 and FIGS. 18, 19).
  • the term "agent for measuring the expression level of the markers” refers to a molecule that can be used to confirm the expression level of the marker gene of the present invention or a protein encoded by these genes, preferably the marker It may be an antibody, primer or probe specific for.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker of the present invention, which antibody is cloned into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene. From the obtained protein, it can be prepared by a conventional method. It also includes partial peptides that can be made from these proteins.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 ′ hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and is the starting point for copying the template. By short nucleic acid sequence is meant to function.
  • PCR amplification using the sense and antisense primers of the marker polynucleotide of the present invention can predict the prognosis of gastric cancer through the generation of a desired product. PCR conditions, sense and antisense primer lengths can be modified based on what is known in the art.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases, which can achieve specific binding with mRNA. You can check the presence. Probes may be made in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. In the present invention, hybridization may be performed using a probe complementary to the marker polynucleotide of the present invention to predict the prognosis of gastric cancer through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
  • Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, and the like) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • the expression level of the marker for predicting prognosis of gastric cancer can be known by confirming the mRNA expression level of the marker gene or the expression level of the protein encoded by these genes.
  • mRNA expression level measurement can be known by measuring the amount of mRNA in the process of confirming the presence and expression of mRNA of the marker gene in a biological sample in order to predict the prognosis of gastric cancer.
  • Analytical methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting (northern) blotting) or DNA microarray chips, but are not limited thereto.
  • the term "measurement of protein expression level” is a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed in a marker gene in a biological sample in order to predict the prognosis of gastric cancer.
  • the amount of protein can be determined using an antibody that binds specifically to the antibody.
  • Western blotting Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunoelectrolysis Yeong-dong, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (immunoprecipitation assay), complement fixation assay (complete fixation assay), FACS, protein chip (protein chip) and the like, but are not limited thereto.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • radioimmunoassay radioimmunodiffusion
  • Ouchterlony immunodiffusion Ouchterlony immunodiffusion
  • rocket immunoelectrolysis Yeong-dong, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (immunoprecipitation assay), complement fixation assay (complete fixation assay), FACS, protein chip (protein chip) and the like, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a kit for predicting the prognosis of gastric cancer comprising an agent for measuring the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of the gastric cancer.
  • the kit of the present invention may be used for confirming the expression level of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer in order to predict the prognosis of the gastric cancer.
  • the kit of the present invention may be an RT-PCR kit, a real time RT-PCR kit, a real time QRT-PCR kit, a microarray chip kit or a protein chip kit.
  • the kit of the present invention includes not only a primer, a probe, or an antibody that selectively recognizes a marker for measuring the expression level of a marker for predicting the prognosis of gastric cancer, but also one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods. May be included.
  • the kit for measuring the mRNA expression level of the marker gene may be a kit containing the necessary elements necessary to perform RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor, DEPC-water ( DEPC-water), sterile water, and the like.
  • the kit for measuring the expression level of the protein encoded by the marker genes in the present invention is labeled with a substrate, a suitable buffer, a coloring enzyme or a fluorescent material for immunological detection of the antibody Secondary antibodies, color development substrates, and the like.
  • the kit of the present invention may be a kit for detecting a marker for predicting the prognosis of gastric cancer, including the essential elements necessary for performing the DNA microarray chip.
  • the DNA microarray chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
  • the present invention comprises the steps of: a) obtaining the expression level, or expression pattern of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of the gastric cancer from a sample taken from the gastric cancer patient; And b) comparing the expression level or expression pattern obtained in step a) with the expression level of the mRNA or protein of the gene of the patient of known gastric cancer, or the expression pattern. .
  • sample taken from gastric cancer patient may be, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, and plasma derived from the stomach of a gastric cancer patient, and preferably gastric tumor tissue.
  • a gastric cancer patient with a known prognosis refers to a patient diagnosed with gastric cancer and whose progression of the disease is known. For example, it is confirmed that the patient has a negative prognosis after recurring within 3 years after undergoing surgery for gastric cancer. Patients who have been cured after surgery due to gastric cancer or who have been confirmed to have a positive prognosis, and have obtained gene expression levels or expression patterns from samples taken from these patients and from patients with known prognosis. By comparison, the prognosis of the patient who wants to know the prognosis can be accurately predicted.
  • the expression level or expression pattern of the marker gene from a plurality of gastric cancer patients is measured, and the measured values are databased together with the prognosis of these patients, and then the expression level of the patient to know the prognosis.
  • expression patterns may be input to the database to predict prognosis.
  • known algorithms, statistical analysis programs, etc. for comparing the expression level or expression pattern can be used.
  • the database may be further subdivided into patients with gastric cancer pathological stages, treated therapies, and the like.
  • the gastric cancer patients of step a) and b) are patients who have received the same kind of treatment, and the treatment is radiation therapy, chemotherapy, chemoradiotherapy, adjuvant chemotherapy. , Gastrectomy, chemotherapy or chemoradiotherapy following gastrectomy, and gastrectomy without adjuvant chemotherapy or postoperative radiation.
  • the gastric cancer may be stage Ib gastric cancer or stage II gastric cancer.
  • the expression level of the marker gene can be measured at the mRNA level or the protein level, and the separation of mRNA or protein from the biological sample can be performed using a known process.
  • the expression level of the gastric cancer marker gene measured from the sample of gastric cancer patient with known prognosis can be compared with the expression level of the gastric cancer marker gene measured from the sample of the patient with the prognosis, Judgment can predict the prognosis of gastric cancer. That is, when comparing the expression levels, if the sample of the patient to know the prognosis showed a similar expression level or expression pattern as the sample of the patient known as a positive prognosis, it can be determined that it will have a positive prognosis. If an expression pattern or expression pattern similar to a sample of a patient known as a negative prognosis was shown, it can be determined that it will have a negative prognosis.
  • the expression level of the marker gene is normalized compared to the expression level of one or more genes selected from the group consisting of the genes listed in Table 4, and then the prognosis using the normalized expression level. Can be predicted.
  • the present invention comprises the steps of: a) obtaining a numerical expression value by measuring the expression level of mRNA or protein of the predictive markers for gastric cancer from a sample taken from the cancer patient; b) applying the expression value obtained in step a) to a prognostic prediction model to obtain a gastric cancer prognostic prediction score; And c) comparing the gastric cancer prognosis prediction score obtained in step b) with a reference value to determine the prognosis of the patient.
  • Step a) is a step of quantitatively measuring the expression level of the marker gene.
  • the quantified expression value of the marker gene can be obtained using known software, kits, systems, and the like, which quantify the expression level measured by the analytical method for measuring the mRNA level or protein level described above.
  • the measurement of the expression level of the marker gene can be performed using nCounter assay kit (NanoString Technologies).
  • the expression level of the marker gene can be normalized compared to the expression level of the comparative gene.
  • the expression level of the measured marker gene can be normalized by comparing the expression level of any one or more comparative genes selected from the group consisting of the comparative genes listed in Table 4.
  • step a) C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 and TFDP1 genes, or ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, Expression levels of mRNA or protein of the LYN, MATN3, MRGPRX3 and NOX4 genes can be measured.
  • Step b) is a step of obtaining the gastric cancer prognostic prediction score by applying the expression value obtained in step a) to the prognostic prediction model.
  • the prognostic prediction model is represented by the following equation.
  • n is the numerical expression value of the n th gene
  • ⁇ n is the Cox Regression estimate of the n th gene
  • S represents gastric cancer prognosis prediction score.
  • Step c) is a step of determining the prognosis of the patient by comparing the gastric cancer prognosis prediction score obtained in step b) with a predefined reference value.
  • the reference value is a cut-off value for the third quartile of the plurality of gastric cancer prognostic predictive score distributions obtained by substituting the expression level of marker genes obtained from a plurality of gastric cancer patients into the above equation. It can be set to one of cut-off values.
  • the reference value is a cut-off value for the second quartile of the plurality of gastric cancer prognostic prediction score distribution obtained by substituting the expression level value of marker genes obtained from a plurality of gastric cancer patients into the above equation. It can be set to one of the cut-off values for the quartiles.
  • the reference value is a cut-off value for the fourth quartile of the third quartile of the plurality of gastric cancer prognostic prediction score distributions obtained by substituting the expression level values of marker genes obtained from the plurality of gastric cancer patients into the above formula. It can be set to one of the cut-off values.
  • the cut-off values for the quartiles are to be defined as values corresponding to 1/4, 2/4, 3/4, and 4/4 when multiple gastric cancer patients are distributed in the order of magnitude of the gastric cancer prognostic prediction score. Can be.
  • the cut-off value for the fourth quartile may be the largest score among gastric cancer prognostic prediction scores obtained from the patient.
  • the gastric cancer prognosis prediction score obtained in step b) may be determined that the gastric cancer prognosis prediction score obtained in step b) has a negative prognosis if it is equal to or larger than the reference value.
  • the cut-off value may be 0.2205 or -0.4478, and the gastric cancer prognosis prediction score obtained in step b) is equal to or larger than the cut-off value, and has a negative prognosis. You can decide.
  • the cut-off when measuring the expression level of the C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 and TFDP1 genes in step a), the cut-off may be 0.2205, and in step a) ADRA2C, C20orf103, CLIP4 When the expression levels of the genes CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 and NOX4 are measured, the cut-off may be -0.4478.
  • a gradient lasso algorithm to generate a prognostic prediction model including the genes of Tables 10 and 11, and comparing the expression value of the gene to the above formulas compared with the reference value gastric cancer prognosis prediction score
  • gastric cancer patients were classified into a positive prognosis group or a negative prognosis group.
  • the Keplan-Meier plots for the sorted populations showed that the survival rate of the negative high risk group was significantly lower than the survival rate of the positive low risk group. The validity and reliability of the predictive model was verified (Example 9 and FIGS. 29, 31, 32).
  • the present invention it is possible to accurately predict the prognosis of gastric cancer, and obtain an advantage of making an appropriate treatment plan according to the predicted prognosis. For example, one may decide to pursue standard treatment or less invasive treatment options for patients determined to have a positive prognosis, and use for patients with advanced stage gastric cancer for patients determined to have a negative prognosis. It may be decided to pursue a treatment method or very aggressive or experimental treatment. In particular, even in patients diagnosed with stage Ib or stage II gastric cancer, the prognosis may be different, so an appropriate treatment method may be selected according to the prognosis predicted by the present invention. For example, a patient who is predicted to have a negative prognosis among patients diagnosed with stage Ib or stage II gastric cancer may use a treatment method such as surgery or an anticancer agent, which is performed for patients with stage III gastric cancer.
  • the High Pure RNA Paraffin Kit Roche Diagnostic, Mannheim, Germany
  • EZNA ® FFPE RNA Isolation Kit Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA
  • RNA concentration of extracted RNA was determined using a NanoDrop 8000 spectrophotometer (Thermo Scientific) and stored at low temperature at -80 ° C until use. In the experiment, samples with RNA concentrations of less than 40 ng / ⁇ l, A260 / A280 ratios of less than 1.5 or A260 / 230 ratios of less than 1.0 were not used for analysis as unsuitable samples.
  • Example 2 The Illumina Whole-Genome DASL r (cDNA -mediated Annealing, Selection, Extension, and Ligation, Illumina, USA) assay was carried out with 200 ng RNA extracted according to the manufacturer's instructions in. First, the total RNA is reverse transcribed into cDNA using biotinylated oligodT and random primers, and then the biotinylated cDNA is annealed to a pair of query oligos, followed by a query oligo. The PCR template was prepared by extending the length and ligation.
  • stage Ib / II patients since it is important to predict the prognosis of stage Ib / II patients, a sample obtained from stage Ib / II patients among the samples is targeted, and gastric cancer specific to the stage Ib / II in the same manner as described above. Prognostic predictive genes were identified and the results are shown in Table 3.
  • the p value in Table 3 indicates the degree of gene expression affecting the clinical prognosis. The lower the p value, the greater the effect on the prognosis, and the hazard ratio affects the recurrence rate of gastric cancer. It is meaningful to increase or decrease the number.
  • Tables 2 and 3 show that the prognostic predictive genes identified in the entire patient population and the prognostic predictive genes identified in the Ib / II patient population are consistent with each other, but are specific to the Ib / II prognostic predictor genes. Also it can be confirmed that a large number exists.
  • the present inventors have attempted to identify comparative genes for self-normalizing the measured gene expression levels for reliable use of predicted gastric cancer prognostic predictive genes in the clinic. Accordingly, the gene expression level data measured by the WG-DASL of Example 3 was analyzed to identify 50 comparative genes showing the smallest change among different cases and without prognostic ability, and are shown in Table 4. . One or two or more of the 50 comparative genes listed in Table 4 may be used in combination to normalize the gastric cancer prognostic predictive gene expression levels.
  • a threshold p value for prognostic prediction can be determined at a desired level, and the default p value in the BRB array tool program is 0.001.
  • This cut-off p value may be less than or equal to 0.01 in any interval, and SuperPC analysis may include a subset of the prognostic predictive genes described in Tables 2 and 3 by predefined p-values and principal component calculations.
  • the cut-off p value was 0.00001 and two principal components were used to generate the prognostic prediction model.
  • the SuperPC prognosis prediction model was composed of seven prognostic prediction genes, and the prediction model is shown in FIG. 16. (Table 5 and FIG. 16). In addition, Keplan-Meier plots showing the survival rate according to the expression level of the selected seven prognostic predictive genes are shown in FIGS.
  • the patient cohort is classified into a positive prognosis group or a negative prognosis group according to the expression level of each of the seven genes listed in Table 5, and the survival rate of the positive prognosis group is the survival rate of the negative prognosis group. Came out higher than.
  • the Keplan-Meier curve showing the disease-free survival rate of the Ib / II gastric cancer patients classified into the positive prognosis group or the negative prognosis group among the patients classified according to the prognostic prediction model, and showing the disease-free survival of the classified groups is shown in FIG. 17. It was. As a result, the survival rate of stage Ib / II gastric cancer patients classified as positive prognostic groups according to the SuperPC prognostic prediction model was significantly higher than that of stage Ib / II gastric cancer patients classified as negative prognostic groups (FIG. 17). ).
  • the prognostic index can be calculated through the following equation. If the prognostic index of any sample calculated by the following equation is greater than -0.077491, the sampled patient can be classified as a negative prognostic group.
  • wi and xi represent the i-th weight and the expression level of the logged gene, respectively.
  • the present inventors used multivariate Cox analysis as a standard statistical analysis to determine whether the prognostic prediction by the prognostic predictive gene of the present invention provides meaningful prognostic information than the conventional prognostic factors. Specifically, we examined a multivariate Cox model showing disease-free survival as assessed by SuperPC prognostic markers (Table 5) and 10-fold cross-validation, tumor cell infiltration depth (pT stage), and number of lymph nodes where tumor cells metastasized (P Node). It was.
  • a gradient lasso algorithm (Sohn I et al: Bioinformatics 2009; 25: 1775-81) was used to select genes useful for prognostic prediction among 369 gastric cancer prognostic predictive genes identified in Example 5 above.
  • the prognostic score can be calculated using the following equation, and if the prognostic score of any sample is positive, it is predicted to have a positive prognosis.
  • the rib one out cross-test uses N-1 samples (training data) except one sample (test data) from the patient group to generate a prognostic prediction algorithm by gradient lasso, and the other sample is used as the prognostic algorithm. It is applied to the group of positive prognosis or negative prognosis. This process was repeated for N samples of the patient group. After the classification into positive and negative prognostic groups for all samples was completed, statistical analysis was used to compare survival rates between positive and negative prognostic groups.
  • the patient population was then classified into either a positive prognostic group or a negative prognostic group according to a prognostic prediction model (gradient lasso and rib one out cross-test) using the 26 selected genes. Furthermore, the patient groups classified into positive and negative prognostic groups were reclassified according to the pathological stage so as to predict the prognosis according to the pathological stage.
  • a prognostic prediction model grade lasso and rib one out cross-test
  • the disease-free survival rates for the groups classified into positive and negative prognostic groups were then shown via Keplan-Meier plots to determine whether the predicted prognosis was consistent with the actual clinical outcome using 26 prognostic predictive genes. (FIG. 18).
  • the 5-year disease-free survival rate in the positive low risk group was significantly higher than the 5-year disease free survival rate in the high risk group (71.7% vs 47.7%), with a relapse rate of 2.12.
  • the prognosis of gastric cancer patients classified using 26 prognostic predictive genes was found to be consistent with the actual clinical results.
  • the cohort of 432 patients totaled 145 patients (84.8% disease-free survival for 5 years) in the low-risk, low-risk stage Ib / II group; 90 (high disease free survival rate of 61.1% for 5 years) in the high-risk, stage Ib / II group; 83 people in the low-risk, stage III / IV group (48.9% disease-free survival over 5 years); And 114 patients (36.9% disease-free survival over 5 years) in the high-risk, stage III / IV group (high stage, III / IV).
  • the survival rate of the positive risk group (low risk Ib / II) was significantly higher than that of the negative risk group (high risk Ib / II) among the stage Ib / II, and the stage III / IV also showed a positive prognosis group ( The survival rate of low risk III / IV) was significantly higher than that of the negative risk group (high risk III / IV) (FIG. 19).
  • results can be classified according to the prognosis of patients with pathological stage by statistical analysis algorithm for the expression level of prognostic predictive gene, and the survival rate of gastric cancer patients can be improved by selecting the appropriate treatment according to the predicted prognosis.
  • Means For example, after measuring the expression level of prognostic predictive genes from patients diagnosed with Ib / II, self-normalizing by measuring relative expression levels with comparative genes, and then categorized as negative prognostic group Ib / II according to the gradient lasso algorithm. It can be determined that they will have a similar prognosis for stage III, and such patients can extend the survival of the patient by using the treatment methods used for patients in stage III.
  • Known prognostic factors for predicting the prognosis of gastric cancer include tumor cell infiltration depth judgment (pT stage) and the number of lymph nodes to which tumor cells have metastasized (P Node).
  • the present inventors used multivariate Cox analysis as a standard statistical analysis to determine whether the prognostic prediction by the prognostic predictive gene of the present invention provides meaningful prognostic information than the conventional prognostic factors. Specifically, gradient lasso label (26 prognostic predictive genes listed in Table 7) and rib one out cross-check, tumor cell infiltration depth (pT stage), number of lymph nodes to which tumor cells have metastasized (P Node) or pathological stage ( A multivariate Cox model showing disease-free survival assessed by AJCC 6th edition) was investigated. At this time, the pT stage was divided into pT1 / T2 and T3, and the P Node logged by replacing 0 with 0.1.
  • GCPS gastric cancer prognostic score
  • Cut-off analysis confirmed that GCPS, which distributes 25% of patients into the negative prognostic group, was the most robust (FIG. 28).
  • the cut-off was chosen for future verification in an independent verification cohort.
  • the gene expression based on the predictive model was 5% of the high risk group (bottom graph) compared to the 8 year disease free survival rate of 84.3% of the low risk group (top graph).
  • the disease-free survival rate was 42.6% (p ⁇ 0.0001).
  • the predefined cut-off (0.2205) of GCPS from the Discovery Cohort was applied to the Validation Cohort and the Keplan-Meier plot based on the class distribution, resulting in a high risk among patients with stage 2 gastric cancer who received chemoradiotherapy. It can be seen that the patient can be accurately identified (FIG. 31).
  • a discovery set and a verification set are developed to develop a second generation GCPS. Bound to cohort.
  • gradient lasso Least Absolute Shrinkage and Selection Operator
  • n is the numerical expression value of the n th gene
  • ⁇ n is the regression estimate of the n th gene described in Tables 10 and 11
  • S represents the gastric cancer prognosis prediction score.
  • the cut-off was applied to the final validation set of 306 patients, distributing patients with GCPS lower than Q1 into the low risk group and patients with GCPS greater than Q3 into the high risk group.
  • the survival rate of patients predicted in the high risk group bottom graph

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Abstract

본 발명은 위암의 예후를 예측하기 위한 마커, 이의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물 및 키트, 및 상기 마커를 이용하여 위암의 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 위암의 예후를 신속하고 정확하게 예측하고, 예측된 예후에 따른 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 위암으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있다. 특히, 본 발명에 의하여 병기 Ib/II기 위암 환자 중 음성적 예후를 가질 것이라고 예측된 환자에 대하여 병기 III기 위암 환자를 대상으로 시술되는 치료방법을 사용함으로써 생존율 증가에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법
본 발명은 위암의 예후를 예측하기 위한 마커, 이의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물 및 키트, 및 상기 마커를 이용하여 위암의 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.
2005년에 암으로 사망한 사람은 총 65,479명으로 전체 사망자의 26.7%가 암으로 사망하였다. 사망이 가장 많은 암종은 폐암으로 인구 10만명당 28.4명(21.1%)이었으며, 다음으로는 위암 22.6명(16.8%), 간암 22.5명(16.7%), 대장암 12.5명(9.3%)의 순이었다. 전세계적으로 위암은 암으로 인한 사망 중 2번째로 많은 사망 요인으로 알려져 있다.
위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한, 위암의 증상은 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.
현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이었다. 그 첫번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단율을 높이고 있다. 하지만, 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있었다. 따라서, 최근에는 위암에서 특이적으로 발현되는 유전자 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암을 진단하려는 연구가 이루어지고 있으나, 위암 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 마커에 대한 연구는 상대적으로 덜 이루어지고 있다.
위암 환자의 생존율은 진단받은 시점의 병리학적 병기에 의존한다. 삼성의학센터의 자료에 따르면, 병리학적 병기에 따른 위암 환자의 5년 생존율은 다음과 같다(Kim S et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 63:1279-85).
II기: 76.2%, IIIA기 : 57.6%,
IIIB기 : 39.6%, IV기 : 26.3%
이러한 결과를 보면, 위암의 조기발견이 생존율의 증가에 크게 기여할 수 있음을 알 수 있다. 그러나, 같은 병기로 진단된 위암이라도 그 예후는 환자마다 차이가 있으므로 위암의 효과적인 치료를 위해서는 위암의 조기발견 뿐만 아니라, 위암의 예후를 정확하게 예측하는 것이 무엇보다 중요하다.
한편, 위암으로 진단되면, 의사는 필요한 검사를 시행하고 이를 토대로 환자에게 가장 적절하다고 판단되는 치료 계획을 세우게 된다. 위암의 치료방법으로는 수술, 내시경적 치료, 항암화학요법, 방사선요법 등이 있다. 일반적으로 위암에 대한 치료는 위암의 크기, 위치 및 범위, 환자의 일반적 건강상태 그리고 다른 여러 인자들을 고려하여 결정하게 된다.
ΙB/II기 위암의 경우에는 수술만으로 치료하는 경우 약 30%의 환자가 5년 내에 재발하는 것으로 알려져 있다. 이 경우, 어느 환자에서 위암이 재발할지 예측할 수 없어서 의사에 따라 각기 다른 방법으로 치료가 이루어지고 있다. 따라서, 위암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다면, 예후에 따라 수술 또는 항암화학요법 등의 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 위암환자의 생존에 크게 기여할 수 있으므로, 위암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있는 기술이 요구된다.
종래에는 위암 환자의 예후를 예측하기 위하여 해부학적인 관찰방법(암세포의 침윤 정도 및 전이된 림프절의 개수)을 사용하였으나, 의사의 주관적인 판단이 개입될 수 있고, 예후를 정확하게 예측하는데 한계가 있었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 위암의 예후를 정확하게 예측하고, 예측된 예후에 따른 적절한 치료방향을 결정함으로써 위암 환자의 생존율을 높일 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 위암의 예후 예측용 마커를 동정하고, 상기 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암의 예후를 정확히 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1, THBS4, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, NOX4, TFDP1, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ALAS1, CASP8, CLYBL, CST2, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B 및 PCDHGA8 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암의 예후 예측용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 위암 환자로부터 채취한 시료로부터 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및 b) 단계 a)에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 위암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 위암 환자로부터 채취한 시료로부터 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하여 수치화된 발현 값을 얻는 단계; b) 단계 a)에서 얻은 발현 값을 예후 예측 모델에 적용하여 위암 예후 예측 스코어를 얻는 단계; 및 c) 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어를 기준값과 비교하여 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함하는 위암의 예후를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 위암의 예후를 신속하고 정확하게 예측하고, 예측된 예후에 따른 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 위암으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있다. 특히, 본 발명에 의하여 병기 Ib/II기 위암 환자 중 음성적 예후를 가질 것이라고 예측된 환자는 예후가 병기 III기 위암 환자와 비슷하며 기존 표준 항암치료에 내성이 있으므로, 병기 III기 위암을 대상으로 개발되는 표적치료제를 사용함으로써 생존율 증가에 크게 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 quantile normalization 및 비교유전자를 사용한 자가-표준화에 기반한 위험율 사이의 상관관계를 보인 그래프이다.
도 2는 C20orf103, COL10A1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 3은 MATN3, FMO2 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 4는 FOXS1, COL8A1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 5는 THBS4, ALAS1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 6은 CASP8, CLYBL 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 7은 CST2 HSPC159 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 8은 MADCAM1, MAF 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 9는 REG3A, RNF152 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 10은 UCHL1, ZBED5 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 11은 GPNMB, HIST1H2AJ 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 12는 RPL9, DPP6 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 13은 ARL10, ISLR2 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 14는 GPBAR1, CPS1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 15는 BCL11B, PCDHGA8 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 2 내지 15의 p 값은 유전자의 발현수준을 고발현 또는 저발현으로 구분하여 로그 순위 검정한 결과 값이다.
도 16은 표 5에 기재된 유전자를 사용한 예후 예측 모델에 따라 분류된 양성적 예후 그룹(Low risk) 또는 음성적 예후 그룹(High risk)의 무병생존율을 보인 케플란-마이어 플롯이다.
도 17은 표 5에 기재된 유전자를 사용한 예후 예측 모델에 따라 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류된 Ib/II기 위암 환자의 무병생존율을 보인 케플란-마이어 플롯이다.
도 18은 표 7에 기재된 유전자를 사용한 예후 예측 모델에 따라 분류된 양성적 예후 그룹(low risk) 또는 음성적 예후 그룹(high risk)의 무병생존율을 보인 케플란-마이어 플롯이다. 도 18의 HR은 누적위험 함수비율이며, p 값은 100개의 순열을 사용하여 계산하였다.
도 19는 표 7에 기재된 유전자를 사용한 예후 예측 모델에 따라 분류된 환자(high vs low)를 병리학적 병기(IB+II vs III+IV)에 따라 분류한 환자그룹에 대한 케플란-마이어 플롯이다. p 값은 양면 로그 순위 검정(two-sided log-rank test)에 의해 계산하였다.
도 20은 CDC25B, CDK1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 21은 CLIP4, LTB4R2 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 22는 NOX4, TFDP1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 23은 ADRA2C, CSK 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 24는 FZD9, GALR1 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 25는 GRM6, INSR 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 26은 LPHN1, LYN 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 27은 MRGPRX3 유전자의 발현수준에 따른 케플란-마이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 20 내지 27의 p 값은 유전자의 발현수준을 고발현 또는 저발현으로 구분하여 로그 순위 검정한 결과 값이다.
도 28은 표 10에 기재된 유전자의 GCPS의 컷-오프 분석을 나타낸다. 최상의 변별은 환자를 고위험 그룹 75% 및 저위험 그룹 25%로 분류한 경우였다.
도 29는 표 10에 기재된 유전자의 GCPS의 최적화된 컷-오프에 기반한 디스커버리 세트에서의 II기 위암 환자의 무병생존율를 나타낸다.
도 30은 표 10에 기재된 유전자의 GCPS의 디스커버리 세트 vs 검증 세트에서의 분포로서, 디스커버리 세트와 검증세트에서의 GCPS의 분포가 일치함을 보이고 있다. 이는 본 assay의 분석적 강력함을 나타낸다.
도 31은 기정의된 GCPS 알고리즘 및 컷-오프에 따른 검증 코호트의 무병생존율을 나타낸다(red=high risk).
도 32은 표 11에 기재된 유전자의 GCPS에 기반한 수술 및 방사선치료를 받은 II기 위암 환자의 무병생존율을 나타낸다. 파란색은 GCPS에 의해서 정의된 고위험을 나타낸다.
도 33은 표 11에 기재된 유전자의 GCPS에 기반한 수술만 받은 II기 위암 환자의 무병생존율을 나타낸다. 파란색은 GCPS에 의해서 분류된 고위험을 나타낸다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1, THBS4, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, NOX4, TFDP1, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ALAS1, CASP8, CLYBL, CST2, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B 및 PCDHGA8 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암의 예후 예측용 마커를 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
임상적으로 위암의 예후는 같은 병리학적 병기의 위암이라도 그 예후는 각기 다르며, 예후에 따른 적절한 치료방법을 사용하여야 위암 환자의 생존율을 높일 수 있다. 따라서, 본 발명은 위암 환자의 생존율을 증가시키기 위하여 위암으로 진단받은 환자의 예후를 정확히 예측하고, 예측된 예후에 따른 적절한 치료방향을 설정하기 위하여, 위암의 예후 예측용 마커 및 이의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 마커는 위암 발병 이후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다.
본 발명의 마커들은 p 값이 유의하게 낮아 위암의 예후 예측에 대한 신뢰도가 높으며, 특히, 표 5, 7, 10 및 11에 기재된 마커들은 이의 발현수준에 따라 환자군을 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류할 수 있으며, 이들 그룹의 생존율을 보인 케플란-마이어 플롯을 보면, 양성적 예후 그룹의 생존율이 음성적 예후 그룹의 생존율에 비해 높아 상기 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 위암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 위암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 위암으로 진단받은 환자를 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류하여 위암 환자의 예후를 예측하였으며, 나아가 같은 병리학적 병기의 위암으로 진단받은 환자그룹을 예후에 따라 분류하여 위암 환자의 예후를 미리 예측하였다(실시예 7 내지 9).
바람직하게, 상기 위암의 예후 예측용 마커는 C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1 및 THBS4 유전자의 조합, ALAS1, C20orf103, CASP8, CLYBL, COL10A1, CST2, FMO2, FOXS1, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, THBS4, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B 및 PCDHGA8 유전자의 조합, C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자의 조합, 또는 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자의 조합일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자의 조합, 또는 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자의 조합일 수 있다.
본 발명자들은 다음과 같은 과정을 통하여 상기 유전자들이 위암의 예후를 정확하게 예측할 수 있음을 규명하였다. 본 발명자들은 포르말린 고정 파라핀 포매된 위암 종양조직으로부터 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 사용하여 전체 지놈 DASL 에세이 키트(Whole-Genome DASL assay kit)를 사용하여, 유전자 발현수준을 측정한 후, 유전자 발현수준을 연속변수로 처리한 콕스 비례적 위험 모델(Cox proportional hazard model)을 사용하여 표준 통계 분석(standard statistical analysis)을 수행하였다. 그 결과, 단변량 분석(Univariate analysis)을 통하여 무병생존율과 큰 연관성을 가지는 369개의 위암의 예후 예측용 유전자(표 2) 및 병리학적 병기 Ib/II기 위암의 예후 예측용 유전자(표 3)를 동정하였다. 이후, 동정된 유전자의 발현수준에 대하여 superPC 알고리즘을 적용하여 표 5의 유전자를 포함하는 예후 예측 모델을 생성하고, 예측 모델에 따라 위암 환자를 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류하였다. 이후, 분류된 집단에 대한 케플란-마이어 플롯을 생성한 결과, 양성적 예후 그룹의 생존율이 음성적 예후 그룹의 생존율에 비해 높게 나옴으로써 본 발명의 마커를 사용한 예후 예측 모델의 유효성 및 신뢰성이 검증되었다(실시예 7 및 도 16, 17). 또한, 동정된 유전자의 발현수준에 대하여 gradient lasso 알고리즘을 적용하여 표 7의 유전자를 포함하는 예후 예측 모델을 생성하고, 예측 모델에 따라 위암 환자를 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류한 결과, 이들 분류가 임상적 결과와 일치하였음을 확인하였다(실시예 8 및 도 18, 19).
본 발명에서 용어, "상기 마커들의 발현수준을 측정하는 제제" 란 본 발명의 마커 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암의 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 위암의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 위암의 예후 예측용 마커의 발현수준은 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 알 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 위암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 위암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법 (Radioimmunoassay), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 위암의 예후를 예측하기 위하여 위암의 예후 예측용 마커의 발현수준을 확인하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 실시간 QRT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
본 발명의 키트에는 위암의 예후 예측용 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 마커 유전자들에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 위암의 예후 예측용 마커를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 마이크로어레이 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 위암 환자로부터 채취한 시료로부터 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및 b) 단계 a)에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 위암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "위암 환자로부터 채취한 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 위암 환자의 위 유래의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장일 수 있으며, 바람직하게는 위 종양 조직일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예후가 알려진 위암 환자"는 위암으로 진단받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 밝혀진 환자를 의미하며, 예컨대 위암으로 인한 외과 수술을 받은 후 3년 안에 재발하여 음성적 예후를 가진 것으로 확정된 환자 또는 위암으로 인한 외과 수술을 받은 후 완치되어 긍정적 예후를 가진 것으로 확정된 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 다수의 위암 환자로부터 마커 유전자의 발현수준 또는 발현패턴을 측정하고, 측정된 값을 이들 환자의 예후와 함께 데이터베이스화한 후, 예후를 알고자하는 환자의 발현수준 또는 발현패턴을 상기 데이터베이스에 입력하여 예후를 예측할 수 있다. 이 경우, 발현수준 또는 발현패턴을 비교하기 위한 공지의 알고리즘, 통계분석 프로그램 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 데이터베이스는 위암 환자를 병리학적 병기, 치료받은 치료법 등으로 더욱 세분화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 a) 및 b)의 위암 환자는 동일한 종류의 치료를 받은 환자로서, 상기 치료는 방사선 치료, 화학치료, 화학방사선 치료, 보조항암화합요법(adjuvant chemotherapy), 위 절제술, 위 절제술 후 화학치료 또는 화학방사선치료, 및 보조항암화합요법 또는 수술 후 방사선 치료 없는 위 절제술일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 위암은 Ib기 위암 또는 II기 위암일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 분석방법들을 통하여, 예후가 알려진 위암 환자의 시료로부터 측정한 위암 마커 유전자의 발현량과 예후를 알고자 하는 환자의 시료로부터 측정한 위암 마커 유전자의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 위암의 예후를 예측할 수 있다. 즉, 발현량을 비교한 결과, 예후를 알고자 하는 환자의 샘플이 양성적 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 양성적 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있고, 반대로 음성적 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 음성적 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마커 유전자의 발현수준은 표 4에 기재된 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현수준과 비교하여 정규화(nomalization)한 후, 정규화된 발현수준을 사용하여 예후를 예측할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 위암 환자로부터 채취한 시료로부터 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하여 수치화된 발현 값을 얻는 단계; b) 단계 a)에서 얻은 발현 값을 예후 예측 모델에 적용하여 위암 예후 예측 스코어를 얻는 단계; 및 c) 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어를 기준값과 비교하여 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함하는 위암의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
상기 단계 a)는 마커 유전자의 발현수준을 정량적으로 측정하는 단계이다. 마커 유전자의 수치화된 발현 값은 상기에서 설명한 mRNA 수준 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법에 의하여 측정된 발현수준을 수치화하여 주는 공지의 소프트웨어, 키트 및 시스템 등을 이용하여 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마커 유전자의 발현수준의 측정은 nCounter assay 키트(NanoString Technologies)를 사용하여 수행할 수 있다. 이때, 마커 유전자의 발현수준은 비교유전자의 발현수준과 비교하여 정규화시킬 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 측정된 마커 유전자의 발현수준을 표 4에 기재된 비교유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비교유전자의 발현수준과 비교함으로써 정규화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 a)에서 C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자, 또는 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있다.
상기 단계 b)는 단계 a)에서 얻은 발현 값을 예후 예측 모델에 적용하여 위암 예후 예측 스코어를 얻는 단계이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 예후 예측 모델은 하기 식으로 표현된다.
[S=β1ｘ1 + ... + βnｘn]
여기서 ｘn는 n번째 유전자의 수치화된 발현 값이며,
βn는 n번째 유전자의 콕스회기추정값(Cox Regression estimate)이며, 및
S는 위암 예후 예측 스코어를 나타낸다.
상기 단계 c)는 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어를 미리 정의된 기준값과 비교하여 환자의 예후를 결정하는 단계이다.
상기 기준값은 다수의 위암 환자로부터 얻은 마커 유전자의 발현수준 값을 상기 식에 대입하여 얻은 다수의 위암 예후 예측 스코어 분포의 제3사분위수(third quartile)에 대한 컷-오프 값 내지 제4사분위수에 대한 컷-오프 값 중 하나의 값으로 정할 수 있다. 또한, 상기 기준값은 다수의 위암 환자로부터 얻은 마커 유전자의 발현수준 값을 상기 식에 대입하여 얻은 다수의 위암 예후 예측 스코어 분포의 제2사분위수(second quartile)에 대한 컷-오프 값 내지 제3사분위수에 대한 컷-오프 값 중 하나의 값으로 정할 수 있다. 바람직하게, 상기 기준값은 다수의 위암 환자로부터 얻은 마커 유전자의 발현수준 값을 상기 식에 대입하여 얻은 다수의 위암 예후 예측 스코어 분포의 제3사분위수에 대한 컷-오프 값 내지 제4사분위수에 대한 컷-오프 값 중 하나의 값으로 정할 수 있다.
상기 사분위수에 대한 컷-오프 값은 다수의 위암 환자를 위암 예후 예측 스코어의 크기 순서대로 분포시킨 경우, 1/4, 2/4, 3/4 및 4/4 지점에 해당하는 값으로 정의될 수 있다. 이때, 상기 제4사분위수에 대한 컷-오프 값은 환자로부터 얻은 위암 예후 예측 스코어 중 가장 큰 스코어일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어가 상기 기준값과 동일하거나, 또는 큰 수인 경우 부정적 예후를 가질 것으로 결정할수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컷-오프 값은 0.2205 또는 -0.4478일 수 있으며, 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어가 상기 컷-오프 값과 동일하거나, 큰 수인 경우 부정적 예후를 가질 것으로 결정할 수 있다. 바람직하게, 단계 a)에서 C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자의 발현수준을 측정한 경우, 상기 컷-오프는 0.2205일 수 있으며, 단계 a)에서 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자의 발현수준을 측정한 경우, 상기 컷-오프는 -0.4478일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, gradient lasso 알고리즘을 적용하여 표 10 및 11의 유전자를 포함하는 예후 예측 모델을 생성하고, 상기 유전자의 발현 값을 상기 식에 대입하여 얻은 위암 예후 예측 스코어를 기준값과 비교하여, 위암 환자를 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류하였다. 이후, 분류된 집단에 대한 케플란-마이어 플롯을 생성한 결과, 음성적 예후 그룹(high risk)의 생존율이 양성적 예후 그룹(low risk)의 생존율에 비해 현저히 낮게 나옴으로써 본 발명의 마커를 사용한 예후 예측 모델의 유효성 및 신뢰성이 검증되었다(실시예 9 및 도 29, 31, 32). 나아가, 위 절제술만을 받은 환자를 대상으로 상기 마커 유전자의 발현수준을 측정하여 얻은 위암 예후 예측 스코어에 따라 환자를 분류한 결과, 역시 음성적 예후 그룹(high risk)의 생존율이 현저히 낮게 나옴으로써, 위 절제술만을 받은 환자의 예후 역시 본 발명의 마커로 예측할 수 있음을 확인하였다(실시예 9 및 도 33).
따라서, 본 발명에 의하면 위암의 예후를 정확하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다. 예컨대, 양성적 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 표준 치료 또는 덜 침범적인 치료(invasive treatment) 옵션을 추구하도록 결정할 수 있고, 음성적 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 상위 단계의 병기 위암 환자에게 사용하는 치료방법 또는 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정할 수 있다. 특히, Ib기 또는 II기 위암으로 진단받은 환자들이라도 예후는 서로 다를 수 있으므로 본 발명에 의하여 예측된 예후에 따른 적절한 치료방법을 선택할 수 있다. 예컨대, 병기 Ib기 또는 II기 위암으로 진단받은 환자 중에서 음성적 예후를 가질 것이라고 예측된 환자에 대해서는 III기 위암 환자를 대상으로 시술되는 수술, 항암제 등의 치료방법을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 위암환자의 선정
삼성의학센터(Samsung Medical Center) 및 삼성암연구기관(Samsung Cancer Research Institute)에서 연구를 진행하였으며, 본 연구는 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 수행하였다. 본 연구는 삼성의학센터 이사회로부터 승인을 받았다. 1994년부터 2005년 12월까지의 기간 동안에 5-FU/LV(INT-0116 레지멘) 보조항암화합요법 후에 위 절제술을 받은 1557명의 환자 중에서 다음의 기준에 따라 1152명의 환자 코호트(cohort)를 선별하였다.
1)조직학적으로 위선종의 확진, 잔여 종양 없이 종양 절제를 받은 경우,
2) D2 림프절 박리(D2 lymph node dissection),
3) 18세 이상의 남, 여,
4) AJCC(American Joint Committee on Cancer) 6판에 따른 병리학적 Ib기(T2bN0, T1N1이나, T2aN0 아님) 내지 IV기,
5) 수술기록 및 치료기록의 완전한 보존 및 다음의 방법에 따라 5-플루오로우라실/류코보린(5-fluorouracil/leucovorin) 보조항암화합요법(INT-0116 레지멘)을 최소 2회 받은 환자. 즉, 화학방사능요법(1일당 180 cGy로 총 4500 cGy 방사능, 1주일/5일, 5주 동안)을 받은 후, 5일 동안 5-플루오로우라실(400 mg/m2/day) 및 류코보린(leucovorin 20 mg/m2/day)을 투여 받고(1회), 추가 1회의 5-플루오로우라실(400 mg/m2/day) 및 류코보린(leucovorin 20 mg/m2/day)을 투여 받은 환자.
1557명의 환자군 중에서 하기의 이유로 405명의 환자를 분석에서 제외하였다.
1) 2 회 미만의 5-FU/LV 보조항암화합요법을 받은 환자 (N=144),
2) 현미경적 절제면 양성(microscopically positive resection margin) 환자 (N=73),
3) 중복암(double primary cancer) 환자 (N=53),
4) 위 부분절제술 후 남은 위(remnant stomach)에서 위암 재발 환자 (N=5),
5) 의학기록이 완전하게 남아있지 않은 환자 (N=11),
6) INT-0116 레지멘이 아닌 다른 것을 사용한 환자 (N=65)
7) 기타 (N=54).
이로써, 1차 선별된 1557명의 환자 중에서 1152명의 환자를 2차 선별하고, 이 중에서 최종 432명의 환자를 임의로 선별하여 연구를 수행하였으며, 환자에 대한 의학적 특성을 표 1에 나타내었다. 432명의 환자를 위암의 병리학적 병기에 따라 분류하면 Ib기 68명, II기 167명, IIIA기 111명, IIIB기 19명, IV기 67명으로 구성되어 있었다(표 1).
표 1
Figure PCTKR2011009603-appb-T000001
실시예 2 : 위종양으로부터 RNA 추출
상기 실시예 1에서 최종 선별된 위암 환자의 위암 종양으로부터 RNA를 추출하였다. 이를 위하여, 가장 큰 종양을 포함하는 원발성 종양 파라핀 블락(primary tumor paraffin block)을 선별하였다. 포르말린 고정 파라핀 포매된 조직(formalin-fixed, paraffin-embedded tissue)으로부터 4μm 두께로, 2 내지 4 섹션에서 RNA를 추출하고, 추출 튜브로 옮기기 전에 비-종양 요소들은 미세해부(microdissection)에 의해 제거하였다. 이후, 제조사의 지시에 따라 High Pure RNA Paraffin 키트(Roche Diagnostic, Mannheim, Germany) 또는 E.Z.N.A.ⓡ FFPE RNA Isolation 키트(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도는 NanoDrop 8000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 결정하고, 사용하기 전까지 -80℃의 온도에서 저온 보관하였다. 실험에서는 RNA 농도가 40 ng/㎕ 미만이고, A260/A280 비율이 1.5 미만 또는 A260/230 비율이 1.0 미만인 샘플은 부적합한 샘플로서 분석에 사용하지 않았다.
실시예 3 : 전체 지놈 발현 프로파일링(Whole genome expression profiling)
상기 실시예 2에서 추출한 RNA 200 ng을 가지고 제조사의 지시에 따라 Illumina Whole-Genome DASLⓡ(cDNA-mediated Annealing, Selection, Extension, and Ligation, Illumina, 미국) 에세이를 수행하였다. 먼저, 전체 RNA를 비오틴화 올리고-dT(biotinylated oligodT) 및 임의의 프라이머(random primers)를 사용하여 cDNA로 역전사 시킨 후, 비오틴화 cDNA를 쿼리 올리고(query oligos) 한 쌍에 어닐링 시킨후, 쿼리 올리고 사이를 연장시키고, 라이게이션하여 PCR 주형을 제작하였다. 이후, 범용 PCR 프라이머(universal PCR primers) 한 쌍을 사용하여 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 HumanRef-8 Expression BeadChip(> 24,000 annotated transcripts)에 혼성화 시켰다. 혼성화 시킨 후, HumanRef-8 BeadChips을 iScan(Illumina, 미국)을 사용하여 스캔하였다.
실시예 4 : 프로브 및 샘플의 선별(Quality control of Whole-Genome DASL assay)
상기 실시예 3에서 사용한 HumanRef-8 Expression BeadChip의 24,526개의 프로브 중에서 "absent"로 불리는 프로브를 필터링 제거하였다. 필터링 결과 남은 17,418개의 프로브를 차후의 분석에 사용하였다. 프로브의 강도는 밑이 2인 로그(logarithm with base 2)에 의하여 변경하였고, quantile normalization 알고리즘을 사용하여 정규화(normalization) 하였다. 그 결과, 17,418개의 프로브 및 432개의 샘플을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
실시예 5 : 위암 예후 예측 유전자의 동정
유전자의 발현수준이 무병생존율(disease free survival, DFS) 등의 임상적 결과와 연관된 유전자를 동정하기 위하여, 연속변수(continuous variables)로 유전자 발현수준을 처리한 콕스 비례적 재해 모델(Cox proportional hazard model)을 사용하여 표준 통계 분석(standard statistical analysis)을 수행하였다. 그 결과, 단변량 분석(Univariate analysis)을 통하여 17,418개의 프로브 중에서 무병생존율과 큰 연관성을 가지는 369개의 프로브를 동정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다(p < 0.001).
또한, Ib/II기(stage Ib/II) 환자의 예후를 예측하는 것이 중요하기 때문에 샘플 중에서 Ib/II기 환자로부터 수득한 샘플을 대상으로 하여, 상기와 동일한 방법으로 Ib/II기에 특이적인 위암 예후 예측 유전자를 동정하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3의 p값(p value)은 유전자의 발현수준이 임상적 예후에 영향을 미치는 정도를 나타내는 것으로 p값이 낮을수록 예후에 영향을 크게 미치게 되며, hazard ratio는 위암의 재발률에 영향을 미치는 정도를 나타내는 것으로서 수치의 증감에 의미가 있다.
표 2 및 표 3을 보면, 전체 환자 집단을 대상으로 동정한 예후 예측 유전자와 Ib/II기 환자 집단을 대상으로 동정한 예후 예측 유전자가 서로 일치하기는 하나, Ib/II기에 특이적인 예후 예측 유전자도 상당수 존재함을 확인할 수 있었다.
표 2
Figure PCTKR2011009603-appb-T000002
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표 3
Figure PCTKR2011009603-appb-T000003
Figure PCTKR2011009603-appb-I000009
Figure PCTKR2011009603-appb-I000010
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실시예 6 : 자가-정규화(self-normalization)를 위한 비교유전자(reference genes)의 동정
전체 환자군을 대상으로 한번에 정규화를 할 수 없으므로 임상분야에서 발견된 예후 예측 유전자의 수를 줄이기 위한 방책 중 하나는 각 케이스에서의 자가-정규화이다. 현재, 유전자의 발현수준을 측정하기 위하여 실시간 QRT-PCR(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)이 많이 사용되고 있는데, 실시간 QRT-PCR을 사용하는 경우에 quantile normalization을 수행할 수 있도록 인간의 모든 유전자를 측정할 수 없으며, 또한 실시간 QRT-PCR의 신호가 새로운 샘플을 사용할 때보다 오래된 파라핀 블락을 사용할 때 신호가 훨신 더 낮게 나오는 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 임상에서 동정된 위암 예후 예측 유전자의 신뢰성 있는 사용을 위하여, 측정된 유전자 발현수준을 자가-정규화 하기 위한 비교유전자를 동정하고자 하였다. 이에 따라, 상기 실시예 3의 WG-DASL로 측정된 유전자 발현수준 데이터를 분석하여, 각기 다른 사례 중에서 최소의 변화를 보이며, 예후 예측능이 없는 50개의 비교유전자를 동정하였고, 이를 표 4에 나타내었다. 위암 예후 예측 유전자 발현수준의 정규화를 위하여 표 4에 기재된 50개의 비교 유전자 중 하나 또는 둘 이상의 유전자를 조합하여 사용할 수 있다.
표 4
Figure PCTKR2011009603-appb-T000004
Figure PCTKR2011009603-appb-I000021
이후, 비교유전자에 의한 자가-정규화의 유효성을 확인하기 위하여, WG-DASL 데이터에 대한 quantile normalization 및 자가-정규화된 데이터 사이의 상관관계를 알아보았다. 상기 두 정규화 방법에 기반한 위험율(hazard ratio)은 도 1에 도시하였다. 그 결과, quantile normalization 및 자가-정규화 방법 사이에 긴밀한 상관관계가 있음을 알 수 있었다(도 1).
실시예 7 : 위암 예후 예측 유전자에 기반한 예후 예측 알고리즘 개발 및 평가 - ①
7-1 : Supervised Principal Component analysis을 사용한 예후 예측 모델
예후 예측 모델을 만들기 위하여 Bair 및 Tibshirani에 의해서 개발된 교사적 주성분 분석법(rvised Principal Component analysis, SuperPC)를 사용하였다(PLoS Biol. 2004 Apr;2(4):E108. Epub 2004 Apr 13). SuperPC 분석에 기반한 위암 예후 예측 모델을 개발하고 평가하기 위하여 Richard Simon에 의해서 개발된 BRB 어레이툴(BRB Array Tools, Simon R et al, Cancer Inform 2007; 3:11-7) 프로그램을 사용하였다.
SuperPC 분석에서는 바람직한 수준에서 예후의 예측을 위한 역치 p값을 정할 수 있고, BRB 어레이툴 프로그램에서 디폴트 p 값은 0.001이다. 이러한 컷-오프 p 값은 어느 구간에서나 0.01 이하일 수 있으며, SuperPC 분석은 기정의된 p값 및 주성분 계산에 의하여 표 2 및 표 3에 기재된 예후 예측 유전자의 부분집합을 포함할 수 있다. 유효성이 인정된 예후 예측 모델을 만들기 위하여 BRB 어레이툴로 SuperPC 분석과 10배 교차검증을 결합하였다. SuperPC 분석의 하나의 예로, 예후 예측 모델을 생성하기 위하여 컷-오프 p값이 0.00001이고 2개의 주성분을 사용하였으며, SuperPC 예후 예측 모델은 7개의 예후 예측 유전자로 구성되었으며, 예측 모델을 도 16에 도시하였다(표 5 및 도 16). 또한, 선별된 7개의 예후 예측 유전자의 발현수준에 따른 생존율을 보인 케플란-마이어 플롯을 도 2 내지 5에 도시하였다.
표 5
Figure PCTKR2011009603-appb-T000005
도 2 내지 5를 보면, 표 5에 기재된 7개의 유전자 각각의 발현수준에 따라 환자 코호트가 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류됨을 알 수 있으며, 양성적 예후 그룹의 생존율이 음성적 예후 그룹의 생존율에 비해 높게 나왔다. 이러한 결과는 임상적으로 본 발명의 위암 예후 예측 유전자의 발현수준을 측정함으로써 위암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있음을 나타낸다.
또한, 도 16을 보면 표 5에 기재된 7개의 유전자의 예후 예측 모델을 생성하여 모델에 따라 환자를 분류한 결과, 양성적 예후 그룹으로 분류된 집단의 생존율(low risk)이 음성적 예후 그룹의 생존율(high risk)에 비해 현저히 높아 실질적인 임상결과와 상응하는 결과가 도출되었다(도 16). 이러한 결과는 표 5에 기재된 7개의 예후 예측 유전자가 위암의 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
또한, 상기 예후 예측 모델에 따라 분류된 환자 중 Ib/II기 위암 환자를 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 재분류하고, 분류된 집단의 무병생존율을 보인 케플란-마이어 곡선을 도 17에 도시하였다. 그 결과, SuperPC 예후 예측 모델에 따라 양성적 예후 그룹으로 분류된 Ib/II기 위암 환자의 생존율이 음성적 예후 그룹으로 분류된 Ib/II기 위암 환자의 생존율에 비해 현저히 높은 결과가 도출되었다(도 17).
특히, SuperPC 예후 예측 모델(표 5의 7개의 유전자의 발현수준을 사용)에서는 하기 식을 통하여 예후지수를 계산할 수 있다. 만약, 하기 식에 의하여 계산된 어떤 샘플의 예후지수가 -0.077491보다 크면 샘플을 채취한 환자는 음성적 예후 집단으로 분류할 수 있다.
∑Iwi xi - 4.51425
[wi 및 xi는 각각 i번째 가중치(weight) 및 로그화된 유전자의 발현수준을 나타낸다]
7-2 : 종래 예후 인자와의 비교 평가
본 발명자들은 본 발명의 예후 예측 유전자에 의한 예후 예측이 종래 예후 인자보다 의미 있는 예후 정보를 제공하는지 알아보기 위하여 표준통계분석으로 다변량 콕스 분석을 사용하였다. 구체적으로, SuperPC 예후 표지(표 5) 및 10배 교차검증, 종양 세포 침윤 깊이(pT stage), 종양세포가 전이된 림프절의 수(P Node)에 의하여 평가된 무병생존율을 보인 다변량 콕스 모델을 조사하였다.
다변량 분석 결과, pT stage 및 P Node와는 독립적으로 7개의 예후 예측 유전자는 치료적 위절제술 및 보조항암화합요법을 받은 위암 환자의 무병생존율에 대한 우수한 예측인자임을 확인할 수 있었다(HR=1.9232, 95% CI, 1.4066, 2.6294, P <0.0001, 표 6).
표 6
Figure PCTKR2011009603-appb-T000006
실시예 8 : 위암 예후 예측 유전자에 기반한 예후 예측 알고리즘 개발 및 평가 - ②
8-1 : gradient lasso 방법을 사용한 예후 예측 모델
gradient lasso 알고리즘(Sohn I et al: Bioinformatics 2009; 25:1775-81)을 사용하여 상기 실시예 5에서 동정된 위암 예후 예측 유전자 369개 중에서 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있는 유전자를 선별하였다. gradient lasso 예후 예측 모델에서는 하기 식을 이용하여 예후 스코어를 계산할 수 있으며, 임의의 샘플의 예후 스코어가 양수(positive)이면, 양성적 예후를 가질 것으로 예측된다.
Figure PCTKR2011009603-appb-I000022
[
Figure PCTKR2011009603-appb-I000023
는 트레이닝세트로부터 예측된 회귀계수(regression coefficient) 이며, X는 트레이닝세트의 유전자 발현수준의 벡터이다.]
gradient lasso를 사용하여 유전자를 선별한 후에, 독립적인 데이터 세트(data set)를 사용하여 유효성이 검증되어야 한다. 이를 위하여, 리브 원 아웃 교차검증(leave one out cross validation, LOOCV)을 사용하였다. 구체적으로, 리브 원 아웃 교차검정은 환자군으로부터 하나의 샘플(테스트 데이터)을 제외한 N-1 샘플(트레이닝 데이터)을 gradient lasso에 의한 예후 예측 알고리즘을 생성하는데 사용하고, 나머지 하나의 샘플을 상기 예후 알고리즘에 적용하여 양성적 예후 집단 또는 음성적 예후 집단으로 분류하는 것이다. 이러한 과정을 환자군의 N개의 샘플에 대하여 반복적으로 실시하였다. 모든 샘플에 대한 양성적 예후 집단 및 음성적 예후 집단으로의 분류가 완료된 후에, 통계분석을 통하여 양성적 예후 집단과 음성적 예후 집단 사이의 생존율을 비교하였다.
리브 원 아웃 교차검정을 하는 동안에 gradient lasso 알고리즘에 의해 26개의 예후 예측 유전자가 선별되었으며, 선별된 유전자를 표 7에 나타내었다. 또한, 선별된 26개의 예후 예측 유전자의 발현수준에 따른 생존율을 보인 케플란-마이어 플롯을 도 5 내지 15에 도시하였다. 도 5 내지 15를 보면, 표 7에 기재된 26개의 유전자 각각의 발현수준에 따라 환자 집단이 양성적 예후 집단 또는 음성적 예후 집단으로 분류됨을 알 수 있으며, 양성적 예후 집단의 생존율이 음성적 예후 집단의 생존율에 비해 높게 나왔다. 이러한 결과는 임상적으로 본 발명의 위암 예후 예측 유전자의 발현수준을 측정함으로써 위암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있음을 나타낸다.
표 7
Figure PCTKR2011009603-appb-T000007
이후, 선별된 26개의 유전자를 사용한 예후 예측 모델(gradient lasso 및 리브 원 아웃 교차검정)에 따라 환자 집단을 양성적 예후 그룹 또는 음성적 예후 그룹으로 분류하였다. 나아가, 병리학적 병기에 따라 예후를 예측할 수 있도록 양성적 예후 그룹 및 음성적 예후 그룹으로 분류된 환자그룹을 다시 병리학적 병기에 따라 재분류하였다.
8-2 : gradient lasso 방법을 사용한 예후 예측 모델의 평가
이후, 26개의 예후 예측 유전자를 사용하여 예측된 예후가 실질적인 임상 결과와 일치하는지 확인하기 위하여, 양성적 예후 그룹 및 음성적 예후 그룹으로 분류된 그룹에 대한 무병생존율을 케플란-마이어 플롯을 통하여 나타내었다(도 18). 그 결과, 양성적 예후 그룹(low risk)의 5년 동안의 무병생존율이 음성적 예후 그룹(high risk)의 5년 동안의 무병생존율에 비해 상당히 높았으며(71.7% vs 47.7%), 재발율이 2.12인 위험율(hazard ratio)에 상응하는 결과를 보였다(95% CI, 1.57, 2.88, P = 0.04, 도 18). 이로써, 26개의 예후 예측 유전자를 사용하여 분류한 위암 환자의 예후가 실질적인 임상결과와 일치하는 것을 알 수 있었다.
병리학적 병기에 따라 예후를 예측할 수 있도록 양성적 예후 그룹 및 음성적 예후 그룹으로 분류된 환자를 다시 병리학적 병기에 따라 재분류한 예후 예측 결과가 실질적인 임상결과와 일치하는지 확인하기 위하여, 각 병리학적 병기의 환자를 예후에 따라 분류한 그룹에 대한 무병생존율을 보인 케플란-마이어 플롯을 도 19에 도시하였다. 그 결과, 총 432명으로 구성된 환자 코호트가 저위험, Ib/II기 그룹(low-risk, stage Ib/II)에 145명(5년 동안의 무병생존율 84.8%); 고위험, Ib/II기 그룹(high-risk, stage Ib/II)에 90명(5년 동안의 무병생존율 61.1%); 저위험, III/IV기 그룹(low-risk, stage III/IV)에 83명(5년 동안의 무병생존율 48.9%); 및 고위험, III/IV기 그룹 (high-risk, stage III/IV)에 114명(5년 동안의 무병생존율 36.9%)으로 분류되었다. 구체적으로, Ib/II기 중에서도 양성적 예후 그룹(low risk Ib/II)의 생존율이 음성적 예후 그룹(high risk Ib/II)의 생존율에 비해 현저히 높았으며, III/IV기 역시 양성적 예후 그룹(low risk III/IV)의 생존율이 음성적 예후 그룹(high risk III/IV)의 생존율에 비해 현저히 높음을 확인할 수 있었다(도 19).
이러한 결과는 예후 예측 유전자의 발현수준에 대하여 통계분석 알고리즘으로 처리함으로써 병리학적 병기의 환자를 예후에 따라 정확하게 분류할 수 있고, 예측된 예후에 따른 적절한 치료법을 선택함으로써 위암 환자의 생존율을 높일 수 있음을 의미한다. 예컨대, Ib/II기로 진단받은 환자로부터 예후 예측 유전자의 발현수준을 측정하고, 비교유전자와의 상대적인 발현수준을 측정함으로써 자가-정규화한 후, gradient lasso 알고리즘에 따라 음성적 예후 그룹 Ib/II기로 분류되면 III기와 유사한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있고, 이러한 환자는 III기의 환자에게 사용하는 치료방법을 사용함으로써 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.
8-3 : 종래 예후 인자와의 비교 평가
위암의 예후를 예측하기 위한 공지된 예후 인자로서, 종양 세포 침윤 깊이 판단(pT stage) 및 종양세포가 전이된 림프절의 수(P Node)가 있다. 본 발명자들은 본 발명의 예후 예측 유전자에 의한 예후 예측이 종래 예후 인자보다 의미 있는 예후 정보를 제공하는지 알아보기 위하여 표준통계분석으로 다변량 콕스 분석을 사용하였다. 구체적으로, gradient lasso 표지(표 7에 기재된 26개의 예후 예측 유전자) 및 리브 원 아웃 교차검증, 종양 세포 침윤 깊이(pT stage), 종양세포가 전이된 림프절의 수(P Node) 또는 병리학적 병기(AJCC 6판)에 의하여 평가된 무병생존율을 보인 다변량 콕스 모델을 조사하였다. 이때, pT stage는 pT1/T2 및 T3로 나누었고, P Node는 0 값을 0.1로 대체하여 로그화하였다.
다변량 분석 결과, pT stage 및 P Node와는 독립적으로, 26개의 예후 예측 유전자는 치료적 위절제술 및 보조항암화합요법을 받은 위암 환자의 무병생존율에 대한 우수한 예측인자임을 확인할 수 있었다(HR=1.859, 95% CI, 1.367, 2.530, P = 0.000078, 표 8). 마찬가지로, 표 9에 나타난 바와 같이, 마지막 병리학적 병기에서도 26개의 예후 예측 유전자에 의해 독립적으로 무병생존율을 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다(HR=1.773, 95% CI, 1.303, 2.413, P < 0.00001, 표 9의 Pstage는 pTstage 및 P Node의 결합임).
표 8
Figure PCTKR2011009603-appb-T000008
표 9
Figure PCTKR2011009603-appb-T000009
실시예 9 : 위암 예후 예측 유전자에 기반한 예후 예측 알고리즘 개발 및 평가 - ③
9-1 : nCounter assay를 사용한 II기 위암 환자를 위한 위암 예후 예측 스코어 개발 및 검증
WG-DASL에 사용된 코호트로부터 얻은 II기 위암 환자(N=186)의 종양 샘플을 대상으로 gradient lasso 알고리즘을 적용하여, 강력한(robust) 예후 정보를 제공하는 8개의 위암 예후 예측 유전자의 조합을 동정하였다(표 10). 상기 8개 유전자의 정규화된 발현수준과 콕스 회기추정값의 선형결합(linear combination)에 의하여 위암 예후 예측 스코어(Gastric Cancer Prognostic Score, GCPS)를 개발하였다. 유전자의 발현수준의 측정은 nCounter assay 키트(시스템; NanoString Technologies)를 사용하여 수행하였다.
표 10
Figure PCTKR2011009603-appb-T000010
25%의 환자를 음성적 예후 그룹으로 분배하는 GCPS가 가장 강력(robust)하였음을 컷-오프(cut-off) 분석으로 확인하였다(도 28). 독립적 검증 코호트에서의 향후의 검증을 위하여 상기 컷-오프를 선택하였다. 상기 최적화된 커-오프를 코호트에 적용한 결과, 도 29에 나타난 바와 같이, 예측 모델에 근거한 유전자 발현으로 저위험 그룹(상단 그래프)의 5년 무병생존율 84.3%에 비해 고위험 그룹(하단 그래프)의 5년 무병생존율이 42.6%로 확인되었다(p<0.0001).
overfitting의 문제로 인하여, 유전자 동정에 사용하지 않은 독립적 환자 코호트를 대상으로 고정된 알고리즘 및 컷-오프로 GCPS를 검증할 필요가 있다. 이를 위하여, 먼저 검증을 위한 환자 코호트를 확보하였다. 상기 위암 예후 예측 유전자 동정을 위하여 사용한 환자(N=186, 디스커버리 코호트)가 받은 화학방사선요법과 동일한 화학방사선요법을 받은 2기 위암 환자의 독립적 검증 코호트(N=216)에 상기 GCPS를 적용하였다. 그 결과, 위험 스코어 분포는 도 30과 매우 유사하였으며, 이러한 결과는 본 분석(assay)의 강력한 분석적 성과를 나타낸다.
디스커버리 코호트에서 얻은 GCPS의 기정의된 컷-오프(0.2205)를 검증 코호트에 적용하고, 클래스 분배에 근거하여 케플란-마이어 플롯을 생성시킨 결과, 알고리즘이 화학방사선요법을 받은 2기 위암 환자중에서 고위험 환자를 정확하게 동정할 수 있음을 알 수 있었다(도 31). 도 31에 나타난 바와 같이, 상기 8개의 예후 예측 유전자의 GCPS는, 216명의 2기 위암 환자를 고위험 그룹(5 year-DFS, 58.7%, 하단 그래프) 및 저위험 그룹 (5-year DFS, 86.3%, 상단 그래프)으로 성공적으로 예측하였다(P=.00004, HR=3.15).
9-2 : GCPS의 최적화
상기 실시예를 통하여, 위암 예후 예측 유전자 발현 프로파일링으로 화학방사선요법을 받은 2기 환자중에서 고위험 환자를 동정할 수 있음을 검증한 이후, 2세대 GCPS를 개발하기 위하여 디스커버리 세트와 검증 세트를 하나의 코호트로 결합하였다. 무병생존율에 대한 콕스 비례위험모델에 기반한 예측모델을 개발하기 위하여 gradient lasso(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) 알고리즘을 사용하였다. 표 11은 상기 디스커버리 세트와 검증 세트가 결합된 2상 데이터 세트(phase 2 data set, N=402)를 사용하여 얻은 예측모델에 포함된 13개 유전자(프로브)의 리스트를 나타낸다.
표 11
Figure PCTKR2011009603-appb-T000011
환자의 GCPS는 [S=β1ｘ1 + ... + βnｘn]로 계산하였다. 여기서 ｘn는 n번째 유전자의 수치화된 발현 값이며, βn는 표 10 및 11에 기재된 n번째 유전자의 회기추정값(Regression estimate)이며, 및 S는 위암 예후 예측 스코어를 나타낸다. 이후, 위험 스코어의 분포의 제1사분위수 및 제3사분위수에 대한 컷-오프를 상기 2상 데이터 세트로부터 추정하였다(Q1=-0.9843, Q3=-0.4478). 상기 컷-오프를 최종 검증 세트인 306명의 환자에 적용하여, Q1보다 낮은 GCPS를 갖는 환자를 저위험 그룹으로, Q3보다 큰 GCPS를 갖는 환자를 고위험 그룹으로 분배하였다. 그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이 고위험 그룹(최하단 그래프)으로 예측되었던 환자의 생존율이 다른 그룹의 환자에 비해 현저히 낮음을 케플란-마이어 플롯으로 확인하였다(도 32).
9-3 : 수술만 받은 II기 위암 환자에서 2세대 GCPS의 검증
화학 또는 방사선치료 없이 수술만 받은 환자를 대상으로 GCPS의 성능을 테스트하기 위하여, 삼성메디컬센터에서 보조항암화합요법(adjuvant chemotherapy) 또는 수술 후 방사선 치료 없이 오직 근치적 위절제술(curative gastrectomy)을 받은 2기로 진단받은 환자 306명의 암 조직을 조사하였다. 환자는 하기 기준에 따라 선별하였다.
삼성메디컬 센터에서 1995년 4월부터 2006년 9월까지 보조항암화합요법 또는 수술후 방사선 치료 없이 오직 근치적 위암절제술을 받은 병리학적 병기 2기로 진단받은 위함 환자 476명중에서 하기 기준에 따라 306명의 환자를 선별하였다.
1) 조직학적으로 위선종의 확진,
2) 잔여 종양 없이 종양 절제,
3) D2 림프절 박리,
4) 18세 이상,
5) AJCC(American Joint Committee on Cancer) 6판에 따른병리학적 병기 II(T1N2, T2aN1, T2bN1 및 T3N0),
6) 수술기록 및 치료기록의 완전한 보존.
476명의 환자 코호트중에서 170명의 환자는 하기 이유로 분석에서 제외하였다.
1) 의학기록이 완전하게 남아있지 않은 환자 (N=66),
2) 질병없이 사망 또는 원인불명으로 사망 (N=43),
3) 수정된 병리학적 병기 (N=45),
4) 이용가능한 파라핀 블락이 없음 (N=15),
5) 이중 원발성 암 (N=1).
도 33에 나타난 바와 같이, 오로지 수술만 받은 2기 위암 환자 코호트에 2세대 GCPS를 적용한 결과, GCPS가 화학-방사선치료를 받은 환자 코호트를 사용하여 개발되었음에도 불구하고, GCPS에 따라 고위험 그룹(최하단 그래프)로 분류된 환자는 저위험 그룹에 비해 나쁜 예후를 가졌음을 확인할 수 있었다(p=0.00287). 이는 GCPS에 의하여 정의된 고위험 환자는 본질적으로 항암제 및 방사선 치료에 의하여 병이 호전되지 않는 나쁜 예후를 가지고 있으며, 이러한 환자를 위한 새로운 치료법을 개발해야 함을 나타낸다.

Claims (24)

  1. C20orf103 (chromosome 20 open reading frame 103), COL10A1 (collagen, type X, alpha 1), MATN3 (matrilin 3), FMO2 (flavin containing monooxygenase 2), FOXS1 (forkhead box S1), COL8A1 (collagen, type VIII, alpha 1), THBS4 (thrombospondin 4), CDC25B (cell division cycle 25 homolog B), CDK1 (cyclin-dependent kinase 1), CLIP4 (CAP-GLY domain containing linker protein family, member 4), LTB4R2 (leukotriene B4 receptor 2), NOX4 (NADPH oxidase 4), TFDP1(transcription factor Dp-1), ADRA2C(adrenergic, alpha-2C-, receptor), CSK(c-src tyrosine kinase), FZD9(frizzled family receptor 9), GALR1(galanin receptor 1), GRM6(glutamate receptor, metabotropic 6), INSR(insulin receptor), LPHN1(latrophilin 1), LYN(v-yes-1 Yamaguchi sarcoma viral related oncogene homolog), MRGPRX3(MAS-related GPR, member X3), ALAS1(aminolevulinate, delta-, synthase 1), CASP8(caspase 8, apoptosis-related cysteine peptidase), CLYBL(citrate lyase beta like), CST2(cystatin SA), HSPC159(lectin, galactoside-binding-like), MADCAM1(mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1), MAF(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), REG3A(regenerating islet-derived 3 alpha), RNF152(ring finger protein 152), UCHL1( ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (ubiquitin thiolesterase)), ZBED5(zinc finger, BED-type containing 5 ), GPNMB(glycoprotein (transmembrane) nmb), HIST1H2AJ(histone cluster 1, H2aj), RPL9( ribosomal protein L9 ), DPP6(dipeptidyl-peptidase 6), ARL10(ADP-ribosylation factor-like 10), ISLR2( immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat 2), GPBAR1(G protein-coupled bile acid receptor 1), CPS1(carbamoyl-phosphate synthase 1, mitochondrial), BCL11B(B-cell CLL/lymphoma 11B (zinc finger protein)) 및 PCDHGA8(protocadherin gamma subfamily A, 8) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암의 예후 예측용 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마커는 C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1 및 THBS4 유전자인 것인 마커.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마커는 ALAS1, C20orf103, CASP8, CLYBL, COL10A1, CST2, FMO2, FOXS1, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, THBS4, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B 및 PCDHGA8 유전자인 것인 마커.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마커는 C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자인 것인 마커.
  5. 제1항에 있어서, 상기 마커는 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자인 것인 마커.
  6. 제1항에 있어서, 상기 위암은 Ib기 위암 또는 II기 위암인 것인 마커.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체인 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 키트.
  11. a) 위암 환자로부터 채취한 시료로부터 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 위암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후를 예측하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시료는 위 종양 조직인 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 방법은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하는 방법이고, 상기 단백질의 발현수준을 측정하는 방법은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준은 표 4에 기재된 비교유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비교유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 비교유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준과 비교함으로써 정규화되는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 단계 a) 및 단계 b)의 위암 환자는 동일한 종류의 치료를 받은 환자로서, 상기 치료는 방사선 치료, 화학치료, 화학방사선 치료, 보조항암화합요법(adjuvant chemotherapy), 위 절제술, 위 절제술 후 화학치료 또는 화학방사선치료, 및 보조항암화합요법 또는 수술 후 방사선 치료 없는 위 절제술로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. a) 위암 환자로부터 채취한 시료로부터 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하여 수치화된 발현 값을 얻는 단계;
    b) 단계 a)에서 얻은 발현 값을 예후 예측 모델에 적용하여 위암 예후 예측 스코어를 얻는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어를 기준값과 비교하여 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함하는 위암의 예후를 예측하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단계 a)에서 C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자, 또는 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 단계 b)의 예후 예측 모델은 하기 식으로 표현되는 것인 방법:
    [S=β1ｘ1 + ... + βnｘn]
    여기서 ｘn는 n번째 유전자의 수치화된 발현 값이며,
    βn는 n번째 유전자의 콕스회기추정값(Cox Regression estimate)이며, 및
    S는 위암 예후 예측 스코어를 나타낸다.
  19. 제16항에 있어서, 상기 단계 c)의 기준값은 하기 식에 따라 다수의 위암 환자로부터 얻은 위암 예후 예측 스코어 분포의 제3사분위수(third quartile)에 대한 컷-오프 값(cut-off) 내지 제4사분위수(fourth quartile)에 대한 컷-오프 값 중 하나의 값으로 정의되는 것인 방법:
    [S=β1ｘ1 + ... + βnｘn]
    여기서 ｘn는 n번째 유전자의 수치화된 발현 값이며,
    βn는 n번째 유전자의 콕스회기추정값(Cox Regression estimate)이며, 및
    S는 위암 예후 예측 스코어를 나타낸다.
  20. 제16항에 있어서, 상기 단계 c)의 기준값은 하기 식에 따라 다수의 위암 환자로부터 얻은 위암 예후 예측 스코어 분포의 제2사분위수(second quartile)에 대한 컷-오프 값 내지 제3사분위수에 대한 컷-오프 값 중 하나의 값으로 정의되는 것인 방법:
    [S=β1ｘ1 + ... + βnｘn]
    여기서 ｘn는 n번째 유전자의 수치화된 발현 값이며,
    βn는 n번째 유전자의 콕스회기추정값(Cox Regression estimate)이며, 및
    S는 위암 예후 예측 스코어를 나타낸다.
  21. 제16항에 있어서, 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어가 상기 기준값과 동일하거나, 또는 큰 수인 경우 부정적 예후를 가질 것으로 결정하는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 제3사분위수에 대한 컷-오프 값은 0.2205 또는 -0.4478이며, 단계 b)에서 얻은 위암 예후 예측 스코어가 상기 컷-오프 값과 동일하거나, 또는 큰 수인 경우 부정적 예후를 가질 것으로 결정하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 단계 a)에서 C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 및 TFDP1 유전자의 발현수준을 측정한 경우, 상기 컷-오프는 0.2205인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 단계 a)에서 ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 및 NOX4 유전자의 발현수준을 측정한 경우, 상기 컷-오프는 -0.4478인 방법.
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