WO2012097579A1

WO2012097579A1 - 治疗黄褐斑的药物组合物及其制备方法

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Publication number: WO2012097579A1
Application number: PCT/CN2011/077177
Authority: WO
Inventors: 孙德军; 殷金龙; 孙妙囡; 赵轶卓; 郭春生; 高艳辉; 李雪
Original assignee: JILIN ZIXIN PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTION LLC
Current assignee: JILIN ZIXIN PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTION LLC
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2012-07-26
Anticipated expiration: 2013-07-21
Also published as: CN102078486A; US20130295080A1; EP2666469A4; CN102078486B; EP2666469A1; EP2666469B1

Description

治疗黄褐斑的药物组合物及其制备方法技术领域

本发明涉及一种祛黄褐斑的药物组合物及其制备方法。

背景技术

黄褐斑对女性的危害最广。黄褐斑主要因女性内分泌失调，精神压力大，各种疾病（肝肾功能不全，妇科病、糖尿病）等以及体内缺少维生素及外用化学药物刺激引起。对于皮肤的黄褐斑，主要本着预防与治疗结合的方法。调理好女性内分泌环境，保持心情舒畅，积极预防妇科疾病等是预防黄褐斑的有效手段。治疗黄褐斑，可以用一些这方面的专门药物调理，像治疗黄褐斑效果显著的有婉香年华活肤蛋白。

人参：五加科植物人参 Ginseng的根。人参中可分离出 30余种人参皂甙（可以分为三组，即齐墩果酸组、原人参二醇组和原人参三醇组），分别称为人参皂甙 (Ginsenoside) -RX (注： X = 0、 al、 a2、 a3、 bl、 b2、 b3、 c、 d、 e、 f、 gl、 g2、 g3、 hl、 h2、 h3、 sl、 s2 )，尚有假人参阜武 (Pseudoginsenoside saponin) Fl l 等。

白芍：为双子叶植物药毛茛科植物芍药（栽培种）的根。味苦酸，凉入肝、脾经。养血柔肝，缓中止痛，敛阴收汗。治胸腹胁肋疼痛，泻痢腹痛，自汗盗汗，阴虚发热，月经不调，崩漏，带下。

茯苓：为寄生在松树根上的菌类植物。茯苓味甘、淡、性平，归心经、肺经、脾经、肾经。具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用。

甘草：为双子叶植物豆科甘草的根及根茎。性平，味甘，归十二经。有解毒、祛痰、止痛、解痉以至抗癌等药理作用。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。

山药：为薯蓣的根，味甘、温、平、无毒。归肺、脾、肾经。不燥不腻；具有健脾补肺、益胃补肾、固肾益精、聪耳明目、助五脏、强筋骨、长志安神、延年益寿的功效。主治脾胃虚弱、倦怠无力、食欲不振、久泄久痢、肺气虚燥、痰喘咳嗽、肾气亏耗、腰膝酸软、下肢痿弱、消渴尿频、遗精早泄、带下白浊、皮肤赤肿、肥胖等病症。

薄荷：为唇形科（Labiatae ) 多年生宿根性草本植物薄荷属（Mentha) 的地上部分，味辛，凉。入肺、肝经。疏风，散热，辟秽，解毒。治外感风热，头痛，目赤，咽喉肿痛，食滞气胀，口疮，牙痛，疮疥，瘾疹。丹参：为双子叶植物唇形科丹参的干燥根及根茎。苦，微寒。归心、肝经。活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神。月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛。

桃仁：为蔷薇叶植物桃的种子。苦、甘，平。归心、肝、大肠经。活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘。用于经闭，痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤，肠燥便秘。

橘皮：橘皮是芸香科植物橘的果皮，味辛、苦温。入脾、肺两经。有理气调中，燥湿化痰功效，可用于治疗脾胃气滞，脘腹胀满，呕吐，或湿浊中阻所致胸闷、纳呆、便溏。

赶黄草：为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜的干燥地上部分。性温、味甘、无毒，具清热、利尿消尿、解毒、活血、平肝、健脾、祛黄疸等功效。主治黄疸、水肿、经闭、血崩、带下、跌打损伤，以及各型肝炎、胆囊炎、脂肪肝等。发明内容

本发明的目的是提供一种祛黄褐斑的药物组合物及其制备方法。

本发明提供的一种制备祛黄褐斑的药物组合物的方法，包括如下步骤：将如下四种物质混合，得到混合物，即得到祛黄褐斑的药物组合物：

A、人参和丹参乙醇提取物； B、薄荷和橘皮的挥发油； C、人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物； D、果蔬发酵转化液；

所述 A按照包括如下步骤的方法制备得到：将人参和丹参混合，再用乙醇水溶液对人参和丹参的混合物进行回流提取，得到提取液和残渣 1，收集提取液，即得到人参和丹参乙醇提取物；

所述 B按照包括如下步骤的方法制备得到：将薄荷、橘皮浸泡在水中，蒸馏提取，得到馏出液和残渣 2，收集馏出液，即得到薄荷和橘皮的挥发油；

所述 C按照包括如下步骤的方法制备得到：将白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药、赶黄草、所述 A制备中得到的残渣 1、所述 B制备中得到的残渣 2和水混合，进行煎煮，过滤，收集滤液，加入无水乙醇，静置、收集上清液，即得到人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物；

所述 D 按照包括如下步骤的方法制备得到：将果蔬、嗜乳酸杆菌 (Lactobacillus acidophilus) 长双歧杆菌 ( Bifidobac treium Ion gum ) 菌液、德氏乳杆菌保加利亚种 Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus 菌液、嗜热链球菌（^ rep ococras thermophilus) 菌液混合，发酵，得到发酵产物，即得到果蔬发酵转化液。所述人参、白芍、茯苓、甘草、橘皮、山药、薄荷、核桃、丹参和赶黄草的质量比为（1.5-2.5): ( 1.5-2.5)： (1.9-2.9): (0.5-1.5): (0.8-1.7): (1.5-2.5): (0.8-1.7)： (0.8-1.7)： (1.5-2.5) 和（3.5-4.5);

所述人参、白芍、茯苓、甘草、橘皮、山药、薄荷、核桃、丹参和赶黄草的质量比具体为（1.5、 2或 2.5) ： (1.5、 2或 2.5)： (1.9, 2.4或 2.9)： (0.5、 lg或 1.5): (0.8, 1.2或 1.7): (1.5, 2或 2.5)、 (0.8： 1.2或 1.7): (0.8, 1.2或 1.7): (1.5、 2或 2.5) 和（3.5、 4或 4.5)。

所述 A的制备方法中：

每次所述回流提取的时间为 2 h -5h，每次所述回流提取的时间具体为 2 h、 3 h或 5h;

所述乙醇水溶液的浓度为 70%-95% (体积百分含量）；所述乙醇水溶液的浓度具体为 70%、 90%或 95%；

所述 B的制备方法中：

所述浸泡的时间为（1-60) min, 所述浸泡的时间具体为 1 min、 30 min或 60min;

所述蒸馏的温度为 90°C-100°C，所述蒸馏的温度具体为 90°C、 95°C或 100

V；

所述 c的制备方法中：

所述煎煮的温度为 90°C-100°C，所述煎煮的温度具体为 90°C、 95°C或 100 V，所述煎煮的时间为 lh-2h，所述煎煮的时间具体为 lh或 2h;

所述加入无水乙醇的方式为向所述滤液中加入乙醇，使滤液中乙醇的体积百分含量为 40%;

所述发酵的温度为 18°C-37°C，所述发酵的温度具体为 18°C、 23°C或 37°C，所述发酵时间为 10天 -180天，所述发酵时间具体为 10天、 15天或 180天，所述发酵方式为边搅拌边发酵。

所述 A的制备方法中：还包括如下步骤：将所述提取液去除乙醇、浓缩和干燥，得到干燥产物，即得到人参和丹参乙醇提取物；

所述 C的制备方法中，在所述收集上清液的步骤后，还包括如下步骤：将上清液去除乙醇、过滤取滤液、滤液浓缩、干燥，得到干燥产物，即为人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物；

所述 D的制备方法中，

在所述发酵之前，还包括将果蔬粉碎成 40-50目大小的步骤；在所述发酵之后，还包括如下步骤：将所述发酵产物过滤、收集滤液、超滤、收集超滤后液体，即为果蔬发酵转化液。

超滤为将滤液经 10万分子量分超滤（进液压力 1.3 kg, 出液压力 0.5 kg)。所述果蔬为如下 54种果蔬的混合物：

魔芋、茄子、芦笋、菠菜、豆芽、花椰菜、甘蓝、萝卜、黄瓜、豌豆、红椒、芹菜、葱、蒜、葡萄、柚子、西瓜、桃、橘、蓝莓、甜橙、香蕉、荔枝、苦瓜、韭菜、石榴、火龙果、胡萝卜、蕃茄、白菜、西芹、甜椒、莴苣、梨、姜、芋头、菜豆、南瓜、莲藕、樱桃、猕猴桃、酸梅、草莓、无花果、金桔、芦柑、南国梨、香瓜、哈密瓜、木瓜、洋葱、桑椹、甜菜和柠檬。

所述果蔬中每种果蔬的质量相同。

所述方法中，每 1L混合物按照如下方法制备：将（5-50) g所述人参和丹参乙醇提取物、（5-50) g所述薄荷和橘皮的挥发油、（50-200) g所述人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物和所述果蔬酵素混合，用所述果蔬酵素补足体积；

每 1L混合物具体按照如下方法制备：将（5、 15或 50) g所述人参和丹参乙醇提取物、（5、 20或 50) g所述薄荷和橘皮的挥发油、（50、 160或 200) g所述人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物和所述果蔬酵素混合，用所述果蔬酵素补足体积；

所述 A的制备方法中：

所述乙醇水溶液、所述人参、所述丹参的配比为（1-10) ml: 0.5g: 0.5g_; 所述乙醇水溶液、所述人参、所述丹参的配比具体为（1、 5或 10) ml: 0.5g: 0.5g_;

所述 B的制备方法中：

所述薄荷、橘皮和水的配比为（l-10)g_: (l-10)g: (l-lO)ml;

所述薄荷、橘皮和水的配比为（1、 5或 10)g: (1、 5或 10)g: (1、 5或 10)ml; 所述 C的制备方法中：

所述白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比为（1-10) g: (1-10) g: (l-10)g: (l-10)g: (l-10)g: (l-10)g: (10-100) ml;

所述白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比为（1、 2或 10)g: (1、 2·4或 10)g: (1、 5或 10)g: (1、 1·2或 10)g: (1、 2或 10)g: (1、 4或 10)g: (50、 60或 100) ml;

赶黄草为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜的干燥地上部分。所述 D的制备方法中：

所述嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus)菌液、所述长双歧杆菌 {Bifidobactreium longum )菌液、所述德氏乳杆菌保加利亚种 Lactobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus ) 菌液禾口所述嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus) 菌液、所述果蔬和水的配比为（2000-8000) ml: (2000-8000) ml: (2000-8000) ml: (2000-8000) ml: (1000-1500) kg: (1000-1500) kg;

所述嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus)菌液、所述长双歧杆菌 {Bifidobactreium longum )菌液、所述德氏乳杆菌保加利亚种 Lactobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus ) 菌液禾口所述嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus) 菌液、所述果蔬和水的配比为（2000、 5000或 8000) ml: (2000、 5000或 8000) ml, (2000、 5000或 8000) ml: (2000、 5000或 8000) ml: (1000、 1200或 1500) kg: (1000、 1200或 1500) kg。

所述嗜乳酸杆菌（Zsc o^ ^ s Wc^ ^)菌液按照如下方法制备：将嗜乳酸杆菌 (Zsc o^ J^ sc ^p ^) 发酵培养，得到发酵产物，即为嗜乳

Lactobaci 1 lus acidophi 1_US) 狼所述发酵温度为 2(TC-4rC，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h;

所述长双歧杆菌 iBifidobactreiim longum ) 菌液按照如下方法制备：将长双歧杆菌 Bifidobactreium longum ) 发酵培养，得到发酵产物，即为长双歧杆菌 Bifidobactreium longum ) 菌液；所述发酵温度为 20°(3-4Γ(3，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h;

所述德氏乳杆菌保加利亚种（ Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 菌液按照如下方法制备：将德氏乳杆菌保加利亚禾中 iUictobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus^) 发酉孝培养，得到发酉孝产物，艮卩为德氏乳杆菌保力口禾 1J亚禾中

delbruecki i subsp. bulgaricus) 菌液；所述发酵温度为 20°C-4rC，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h;

所述嗜热链球菌（^rep ococras ^er?c>^ i/s)菌液按照如下方法制备：将嗜热链球菌（^rep ococras thermophi lus、鶴得到发酵产物，即为嗜热链球菌（^rep ococras thermophilus) 教所述发酵温度为 20°( -4Γ( ，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h。

所述嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus) 为嗜乳酸杆菌 {Lactobacillus acidophilus) CGMCC 1. 1854 ，所述长双歧杆菌 {Bifidobactreium longum ) 为长双歧杆菌 (Bifidobactreium longum ) CGMCC 1. 2186，所述德氏乳杆菌保加利亚种 (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus) 为德氏乳杆菌保力口利亚种 ( Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480，所述嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus)为嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus) CGMCC 1. 2471。

所述发酵培养的培养基配方：将 10g蛋白胨、 10g牛肉膏、 5g酵母抽提物、 20g 葡萄糖、 lg吐温 -80、 2gK₂HP04、 lg吐温 -80、 5gNaAC、 2g柠檬酸三铵、 0. 2gMgS0₄、 0. 05gMnS0₄和水混合，用水补至 1L得到的培养基。由所述的方法制备的改善疲劳的药物也是本发明保护的范围；

由所述的方法制备的祛黄褐斑的药物也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明方法提取的人参丹参提取物、薄荷、橘皮挥发油、人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药、赶黄草水提取物、果蔬酵素（发酵转化液），提取时间短。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例 1、祛黄褐斑的人参酵素组合物的获得

方法一：

人参酵素组合物的活性成分的原料如下： 200g人参、 200g白芍、 240g茯苓、 100g甘草、 120g橘皮、 200g山药、 120g薄荷、 120g桃仁、 200g丹参、 400g赶黄草。

一、人参、丹参提取物的制备

1、原料的准备：人参（吉林紫鑫药业股份有限公司）、丹参（吉林紫鑫药业股份有限公司）符合《中华人民共和国药典》的规定。投料前严格按照企业标准要求进行质量的监控。

2、按配方量称取人参、丹参，经过水洗、沥干，用 10倍量（w/v) 90%乙醇水溶液回流提取 2次，每次提取 3小时；过滤，合并滤液（提取液），减压回收乙醇。滤渣即为人参渣和丹参渣。

3、 3、滤液浓缩至相对密度 1. 10-1. 15时（60°C， 0. 07MPa) , 喷雾干燥（入口温度为 170°C，出口温度 70°C )，得喷雾干燥细粉，即为人参乙醇提取物；二、薄荷、橘皮挥发油的制备

1、原料的准备：薄荷、橘皮（吉林紫鑫药业股份有限公司）符合《中华人民共和国药典》的规定。投料前严格按照企业标准要求进行质量的监控。

2、按配方量称取薄荷、橘皮，经过水洗、沥干，将药材用水浸渍 30分钟，加入水量以浸透没进药材为宜，一般加入药材量的 5倍量水，蒸馏温度 100°C，按 5: 1 比例另器收集蒸馏液（收集的是蒸馏液水的 1/5体积；工艺此时挥发油可以提取干净了。），收集蒸馏容器中的剩余的药材即为薄荷渣和橘皮渣。薄荷、橘皮和水的配比为 5 g: 5 g: 5 ml o

三、人参、丹参、薄荷、橘皮与其它 6味（白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药、赶黄草）水提取物的制备

1、原料的准备：白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药、赶黄草（吉林紫鑫药业股份有限公司），符合《中华人民共和国药典》的规定。投料前严格按照企业标准要求进行质量的监控。

2、按配方量称取白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药、赶黄草，经过水洗、沥干。

3、取人参渣、丹参渣、薄荷渣、橘皮渣与白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药、赶黄草等 6味药材合并加水煎煮（lOCTC ) 两次，用水量分别为药材量的 6倍， 5 倍，时间分别为 2， 1小时，合并二次滤液浓缩至相对密度为 1. 12-1. 20 (也是减压浓缩），加乙醇搅拌至含醇量为 40%，静置 24小时，取上清液回收乙醇至尽过滤，滤液浓缩至相对密度 1. 10— 1. 15 时（60°C， 0. 07MPa) , 喷雾干燥（入口温度为 170°C，出口温度 70°C )，得喷雾干燥细粉；即为水提取物；白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比为 2g: 2. 4g_: lg_: 1. 2 g_: 2g_: 4 g_: 60 ml ;

二、果蔬发酵转化液的制备

1、选用的果蔬材料

表 1 果蔬材料

豆芽维生素、皂香、胺基酸、果蔬发酵转化物甜椒维生素 C、矿物质、果蔬发酵转化物花椰菜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物莴苣维生素 A、矿物质、果蔬发酵转化物甘蓝维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物梨果糖、矿物质、果蔬发酵转化物

萝卜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物姜维生素、矿物质、果蔬发酵转化物

黄瓜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物芋头维生素 Bl、 B2、 C、矿物质、果蔬发酵转化物豌豆维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物菜豆维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物红椒维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物南瓜胡萝卜素、矿物质、果蔬发酵转化物

维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物莲藕铁、单宁、果蔬发酵转化物

葱维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物樱桃矿物质、果蔬发酵转化物

蒜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物猕猴桃维生素 C、果蔬发酵转化物

葡萄维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物酸梅有机酸、维他命、果蔬发酵转化物

柚子维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物草莓维生素 C 、矿物质、鞣花酸、果蔬发酵转化物西瓜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物无花果消化果蔬发酵转化物、维生素、矿物质桃维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物金桔维生素 Bl、 B2、 C、果蔬发酵转化物橘维生素 Bl、 B2、 C、果蔬发酵转化物芦柑维生素 C、柠檬酸、果蔬发酵转化物拔翁维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物南国梨维生素 Bl、 B2、 C、柠檬酸、果蔬发酵转化物甜澄维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物香瓜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物香蕉维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物哈密瓜果糖、钾、维生素 A、果蔬发酵转化物荔枝维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物木瓜维生素 B、 C、 E、柠檬酸、胡萝卜素、果蔬发酉转化物

苦瓜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物洋葱维生素 B、 C、胡萝卜素、果蔬发酵转化物韭菜维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物桑椹维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物石榴维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物甜菜甜菜碱、果蔬发酵转化物

火龙果维生素 Bl、 B2、柠檬酸、果蔬发酵转化物宁檬柠檬酸、果蔬发酵转化物

2、果蔬发酵转化

1 ) 菌种选择与购买

益生菌种购于中科院微生物所，益生菌分别为嗜乳酸杆菌 (Zs_{C 0}½c ^ acidophilus) CGMCC 1. 1854、长双歧杆菌 Bifidobactreiim longum ) CGMCC 1. 2186、德氏乳杆菌保加利亚种（Lactobaci l lus delbruecki isubsp. bulgaricus )CGMCC 1. 1480、嗜热链球菌（S rep ococci/s thermophilus) CGMCC 1. 2471 , 所有菌种结尾砂土管保存菌种，作为出发菌株；

2 ) 主种子制备益生菌主种子制备（主种子传代不超过 10代，本制备传 4代）

①用无菌不锈钢匙分别取嗜乳酸杆菌、Lactobacillus acidophilus) CGMCC 1. 1854、长双歧杆菌 Bifidobactreiim longim ) CGMCC 1. 2186、德氏乳杆菌保力口利亚种 (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480、嗜热链球菌（^ rep ococras thermophilus) CGMCC 1. 2471砂土管 1/10量，其余冻存，分别接在 50ml (250三角瓶) MRS液体培养基 ( 10g/l蛋白胨、 lOg/1牛肉膏、 5g/l 酵母抽提物、 20g/l葡萄糖、 lg/1吐温- 80、 2g/lK₂HP04、 lg/1吐温- 80、 5g/lNaAC、 2g/l柠檬酸三铵、 0. 2g/lMgS0₄、 0. 05g/lMnS0₄， 121 °C灭菌 20min)中， 37°C、 100 转摇床培养 16h;

②各挑取一环，分别划线接种在 MRS固体培养基（10g/l蛋白胨、 lOg/1牛肉膏、 5g/l酵母抽提物、 20g/l葡萄糖、 lg/1吐温 -80、 2g/lK₂HP04、 lg/1吐温 -80、 5g/lNaAC、 2g/l柠檬酸三铵、 0. 2g/lMgS0₄、 0. 05g/lMnS0₄、 1. 5%琼脂， 121 °C灭菌 20min) 上， 37°C培养箱培养 16h;

③分别挑取长势最旺的一个菌落，各自接在 50ml MRS液体培养基中， 30°C、 180转摇床培养 16h;

④各自接在 500ml MRS液体培养基中， 37°C、 100转摇床培养 16h，加入甘油至 20%，摇匀，以 lml分装入冻存管，分别作为益生菌嗜乳酸杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热链球菌主种子， -4CTC以下温度保藏；

3、工作种子的制备

益生菌工作种子制备（工作种子传代不超过 5代，本制备传 4代）

①用无菌接种环分别取嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus) CGMCC 1. 1854、长双歧杆菌 Bifidobactreiim longim ) CGMCC 1. 2186、德氏乳杆菌保力口利亚种 (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480、嗜热链球菌（^ rep ococras thermophilus) CGMCC 1. 2471主种子，分别划线接种在 MRS 固体培养基上， 37°C培养箱培养 16h;

②分别挑取长势最旺的一个菌落，各自接在 50mlMRS液体培养基中， 37°C、 100转摇床培养 16h;

③各自接在 500mlMRS液体培养基中， 37°C、 100转摇床培养 16h，；

④各自再转接至 5000mlMRS液体培养基中， 37°C、 100转搅拌，培养 16h; 即得嗜乳酸杆菌 actobacillus acidophilus) CGMCC 1. 1854菌液、长双歧杆菌

{Bifidobactreium longum ) CGMCC 1. 2186菌液、德氏乳杆菌保加利亚种

(Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480菌液、嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus) CGMCC 1. 2471菌液。以上菌液均为发酵容器中所有发酵产物。

4、果蔬处理

1 ) 取上述材料称重；

2 ) 洗净去杂，控干水分，称重 '

3 ) 粉碎成 40-50目，投入发酵罐；

对于 3吨的发酵罐 (有效使用溶剂 =3吨 χθ. 8=2. 4吨）实际投料控制在 2400kg; 按果蔬与水 1 : 1的比例，果蔬投料 1200公斤，水加入量为 1200kg。

5、果蔬快速酶解物发酵转化

再向发酵罐中加入嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus) CGMCC 1. 1854 菌液、长双歧杆菌 fidobactreium longum ) CGMCC 1. 2186 菌液、德氏乳杆菌保力口利亚种 (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480菌液、嗜热链球菌（^ rep ococras thermophilus) CGMCC 1. 2471 菌液各 5000ml，控制发酵罐温度 23°C，搅拌 15d;

3 ) 200目滤布过滤，弃果蔬渣，取滤液；

4) 滤液经 10万分子量分超滤（进液压力 1. 3 kg, 出液压力 0. 5 kg)、得到 1200-1500 kg澄清液体，密封、转入 4 °C贮藏，即得到果蔬发酵转化液。

6、检测

果蔬发酵转化液主要产物是乳酸、乙酸，因此将酸度作为其特征成分进行鉴定，具体如下：

果蔬发酵转化液酸度：指滴定 100ml果蔬发酵转化液，消耗的 0. IN NaOH溶液的毫升数，检验时一般采用 10ml样品。

测定步骤：取 10ml果蔬发酵转化液 +20ml水 +0. 5%酚酞指示剂 0. 5ml ，用 0. IN NaOH标液滴定到微红色 30秒不褪色。计算：酸度 =消耗的 0. IN NaOH标液体积 X 10。

结果：该产品酸度为 42。

三、组合物的制备

将上述得到的各提取物与果蔬发酵转化液按如下配方混合：

15g丹参、人参提取物、 20g薄荷、橘皮挥发油、 160g提取后丹参、人参、薄荷、橘皮药渣与其它 6味水提取物与果蔬发酵转化液混合，用果蔬发酵转化液补充体积至 lOOOOml , 即得到组合物，制成 1000瓶， 10ml/瓶备用。

方法二、人参酵素组合物的活性成分的原料如下： 150g人参、 150g白芍、 190g茯苓、 50g甘草、 80g橘皮、 150g山药、 80g薄荷、 80g桃仁、 150g丹参、 350g赶黄草。

一、人参提取物的制备：

提取方法与方法一基本相同，不同的是将人参用 1倍量（v/w) 70%乙醇水溶液回流提取；每次所述回流提取的时间为 2h;

二、薄荷、橘皮挥发油的制备

提取方法与方法一基本相同，不同的是将薄荷、橘皮和水的配比具体为 lg: lg: lml ; 浸泡的时间为 lmin; 所述蒸馏的温度为 90°C。

三、人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草水提取物的制备：

提取方法与方法一基本相同，不同的是所述白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比为 lg: lg: 5g: lg: lg: lg: 50 ml ; 煎煮的温度为 90°C ; 四、果蔬发酵转化液的制备

提取方法与方法一基本相同，不同的是加入嗜乳酸杆菌 03C O½c A/S acidophilus) CGMCC 1. 1854

longum )CGMCC 1. 2186菌液、德氏乳杆菌保加利亚种 (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480 菌液、嗜热链球菌（S rep ococci/s thermophilus) CGMCC 1. 2471 菌液各 2000ml，果蔬投料 1000公斤，水加入量为 1000kg。

果蔬发酵转化液的发酵的温度为 18°C，发酵时间为 10天。

所述嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus)菌液、所述长双歧杆菌 {Bifidobactreium longum )菌液、所述德氏乳杆菌保加利亚种 Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) 菌液禾口所述嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 菌液的制备中的发酵温度均为 20°C，发酵时间均为 15 h。

检测方法与方法一相同，结果与方法一无显著差异。

五、组合物的制备

与方法一基本相同，不同的是 5g人参提取物、 5g薄荷和橘皮挥发油、 50g人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草水提取物与果蔬发酵转化液混合，用果蔬发酵转化液补充体积至 lOOOOml , 即得到组合物。

方法三、

人参酵素组合物的活性成分的原料如下： 250g人参、 250g白芍、 290g茯苓、 150g甘草、 170g橘皮、 250g山药、 170g薄荷、 170g桃仁、 250g丹参、 450g赶黄草。一、人参提取物的制备：

提取方法与方法一基本相同，不同的是将人参用 5倍量（v/w) 95%乙醇水溶液回流提取；

二、薄荷、橘皮挥发油的制备

提取方法与方法一基本相同，不同的是将薄荷、橘皮和水的配比具体为 10g: 10g: 10ml ; 浸泡的时间为 60min; 所述蒸馏的温度为 95°C。

提取方法与方法一基本相同，不同的是所述白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比具体为 10g: 10g: 10g: 10g: lOg: lOg: 100；煎煮的温度为 95°C。

四、果蔬发酵转化液的制备

longum )CGMCC 1. 2186菌液、德氏乳杆菌保加利亚种 (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480 菌液、嗜热链球菌（S rep ococci/s thermophilus) CGMCC 1. 2471 菌液各 8000ml，果蔬投料 1500公斤，水加入量为 1500kg。

果蔬发酵转化液的发酵的温度为 37°C，发酵时间为 180天。

所述嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus)菌液、所述长双歧杆菌 {Bifidobactreium longum )菌液、所述德氏乳杆菌保加利亚种 Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) 菌液禾口所述嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 菌液的制备中的发酵温度均为 41 °C，发酵时间均为 36 h。

检测方法与方法一相同，结果与方法一无显著差异。

五、组合物的制备

与方法一基本相同，不同的是 50g人参提取物、 50g薄荷和橘皮挥发油、 200g 人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草水提取物与果蔬发酵转化液混合，用果蔬发酵转化液补充体积至 lOOOOml , 即得到组合物。

实施例 2、人参祛斑口服液的制备

本产品工艺采用常规的口服液生产工艺：混合→过滤→瞬时灭菌→灌装→压盖→检漏→澄明度检査→外包装→检验→入库，其中检漏以前的工艺都在 10万级洁净区。生产工艺设计和设备条件符合我国 GMP要求。

具体生产方法： 1、将实施例 1方法一得到的组合物与调味剂（具体为白砂糖，购自长春欧亚百货商都， w/v ) 混合配料后，投入配液罐内，混合 30 min, 确保均匀，瞬时高热灭菌。即得到人参祛斑口服液。

2、灌装口服液瓶：用口服液灌装机灌装口服液瓶，每瓶灌装 10ml，填充期间应注意监测产品装量差异，控制在差异范围内。

3、压盖：用口服液压盖机对口服液瓶压盖，筛选去不合格品。

4、检漏：采用真空检漏仪对压盖后的口服液检漏。

5、内包装：采用纸板盒，每盒 10瓶。

6、外包装：外包装采用瓦楞纸箱。

7、按照企业标准进行检验。

8、入库：产品经检验合格后方可入库。

实施例 3、人参祛斑口服液祛斑的实验研究

1、材料和方法

1. 1 试验药物

人参祛斑口服液由实施例 2制备，维生素 (片（四川福瑞药业有限公司）。 1. 2 动物雌性昆明种小鼠，体重 28 ± 2g，由吉林大学大学实验动物研究中心提供。

1. 3 试剂黄体酮注射液：每支 10mg /m, l 批号 060314，浙江仙琚制药股份有限公司。超氧化物歧化酶（ SOD ) 批号： 20060803, 丙二醛（MDA)批号： 20060802, 一氧化氮 (NO) 批号： 20060728，考马斯亮兰，批号： 20060731。试剂盒均为南京建成生物工程研究所。鼠抗人单克隆抗体 HMB45 (melanoma 黑素瘤）即用型试剂盒 MAB- 0098, 福建迈新生物技术开发有限公司；浓缩型 DAB试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1. 4方法

雌小鼠 84只，随机分为 6 组。正常组按 2m 1/kg体重肌肉注射灭菌注射用水；其余 5组以黄体酮注射液于小鼠后腿肌肉注射，两腿交替，剂量为 20mg/kg 黄体酮（相当于人临床等效剂量的 8倍）。每周注射 6d，连续 30d。造模同时开始灌服治疗药物或蒸馏水 0. 2ml/10g, 每天 1 次，连续 30d。人参祛斑口服液低、中、高剂量分别为 12、 24、 36g /kg ( 相当于临床用量 5、 10、 15倍）。维生素 C 剂量 0. lg/kg (相当于人临床用量的 10倍）。末次给药 lh后，各组小鼠眼睚采血 lm , l 盛于含有肝素（己干燥）的加盖塑料管内，测定全血粘度值。处死各组小鼠，背部去毛，取肝脏、皮肤组织，用预冷生理盐水（4e )冲洗，滤纸拭干，取皮肤、肝脏各 0. 5g，以 IB 9 (W /V)加入冰生理盐水，于冰浴制成 10%组织匀浆，匀浆液以 2500rpm 离心，取上清液并进行相关指标的测定。

1. 4. 1对小鼠全血粘度的影响

以血粘仪检测全血粘度，结果从表 2 可见，与正常对照组比较，模型对照组、维生素 C组小鼠不同切变率全血粘度均比正常对照组小鼠有明显升高。与模型对照组比较，人参祛斑酵素高剂量组可明显降低全血粘度值，说明人参祛斑酵素能够明显改善黄褐斑小鼠的血液流变性，降低血液粘稠度。

表 2 人参祛斑酵素对小鼠全血粘度的影响（ X士 s)

与模型组比较 * P< 0. 05， * * P< 0. 01 (下同)

1. 4. 2 S0D、 MDA、 NO 指标检测

按试剂盒说明书方法和操作要求用 722S分光光度计进行测定。

对小鼠肝脏 S0D、 MDA、 NO含量的影响从表 3 可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝脏 SOD 活性有所下降，而 MDA 、 NO的含量升高，其中 MDA含量有明显的差异。与模型对照组比较，人参祛斑酵素高剂量组和维生素 C组 S0D活性明显升高，高剂量组 MDA含量有明显降低。表 3 人参祛斑酵素对小鼠肝脏 MDA、 S0D、 NO含量的影响（x士 s)

对小鼠皮肤 MDA、 S0D、 NO含量的影响见表 4，从表 4可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠皮肤 S0D活性下降，而 MDA 、 N0的含量升高，其中 MDA 含量有明显的差异。与模型对照组比较，人参祛斑酵素高、中剂量组 S0D 活性明显升高， MDA含量明显降低。维生素 C组与模型对照组比较， MDA含量有明显降低。

表 4 人参祛斑酵素对小鼠皮肤 MDA、 S0D、 NO含量的影响（x士 s)

1. 4. 3 皮肤黑色素细胞的病理形态学观察

剥取小鼠背部皮肤一块，去毛， 10%中性甲醛固定。常规石腊包埋，连续 5Lm 厚切片， HE 染色。黑色素标记采用免疫组织化学方法，链霉菌素采用生物素法。一抗选用鼠抗人单克隆抗体 HMB45(melanoma 黑素瘤)， DAB显色，苏木素复染。用 PBS代替一抗做阴性对照。黑色素阳性目标计算机图象分析:各组随机选取 8 只小鼠的皮肤，各制成 1 张病理切片，每片观察 5个互不重叠的视野，找到阳性目标后， MIAS2000型计算机图像分析系统对目标图象进行定量分析，得出每张切片 5个视野及每组 8 只动物黑色素阳性目标的平均面积、平均光密度、积分光密度。

小鼠皮肤黑色素细胞的病理形态学观察 H E染色:光镜下不能发现黑色素细胞。 HMB45 标记观察：正常组毛囊、皮脂腺基底细胞中可见少量黑色素细胞。模型组黑色素细胞成簇分布于毛囊、皮脂腺基底细胞中，表皮基底细胞和棘细胞层中亦有散在分布。 4个用药组表皮基底层及毛囊基底细胞中仅散见黑色素细胞。

对小鼠皮肤黑色素细胞的影响见表 5，从表 5可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠皮肤黑色素细胞阳性目标面积、平均光密度、积分光密度值均比正常对照组小鼠有明显升高。与模型对照组比较，人参祛斑酵素高、中剂量组可明显降低小鼠皮肤黑色素细胞阳性细胞的平均光密度、积分光密度值。

表 5人参祛斑酵素对小鼠皮肤黑色素细胞的影响 (X士 s)

黄褐斑是一种多因素、多系统、多环节所致的色素性皮肤病，发病机理复杂，真正的发病原因目前尚不十分清楚。其作为一种色素增加性皮肤病，黑素生成过多是其根本原因，黑素细胞合成黑素是一个非常复杂的过程，受到多种因素的影响。黄褐斑患者存在血流动力学指标异常，认为血液流变学改变与黄褐斑关系密切。

检测了血液流变学指标为治疗该病提供了实验依据。

近年许多研究表明氧自由基与皮肤黑色素的形成及色素沉着有关。 MDA 可导致蛋白质分子发生交联，形成荧光发色团（色素）。 SOD除能有效清除自由基外，还具有抑制酪氨酸酶的活性，降低色素沉着的作用。大量资料表明，黄褐斑患者血中 SOD 和过氧化氢酶（ CAT) 活性显著降低， LP0和 MDA含量明显增高。以上研究提示，氧化与抗氧化失衡可能是产生黄褐斑的重要因素。

在影响黑素细胞功能的诸多信号介导途径中， NO被认为是一种极为重要的信号分子而发挥作用。 NO能刺激酪氨酸酶的活性，提高新合成黑素的量。

本实验研究结果显示，人参祛斑口服液具有活血化瘀的作用，能够明显降低黄褐斑小鼠全血粘度值，改善血液粘稠度，此外，黄褐斑模型组小鼠肝脏和皮肤组织中的 S0D活性较正常组明显降低，而 MDA、 N0高于正常组，给药后可以显著降低 MDA的含量并升高 S0D的活性，提示人参祛斑口服液可能是通过提高自由基清除酶的活性，减少脂质过氧化反应，降低黑素的生成。

Claims

1、一种制备祛黄褐斑的药物组合物的方法，包括如下步骤：将如下四种物质混合，得到混合物，即得到祛黄褐斑的药物组合物： A、人参和丹参乙醇提取物； B、薄荷和橘皮的挥发油；（：、人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物；

D、果蔬发酵转化液；

所述 D 按照包括如下步骤的方法制备得到：将果蔬、嗜乳酸杆菌 {Lactobacillus acidophilus)菌液、长双歧杆菌 ( Bifidobactreium longum ) 菌液、德氏乳杆菌保； ¾ 禾 IJ 亚种（ Lactobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus ) 菌液、嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus) 菌液混合，发酵，得到发酵产物，即得到果蔬发酵转化液。

2、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于：

所述人参、白芍、茯苓、甘草、橘皮、山药、薄荷、核桃、丹参和赶黄草的质量比为（1.5-2.5): (1.5-2.5)： (1.9-2.9)： (0.5-1.5): (0.8-1.7)： (1.5-2.5)： (0.8-1.7)： (0.8-1.7)： (1.5-2.5)和（3.5-4.5)；所述人参、白芍、茯苓、甘草、橘皮、山药、薄荷、核桃、丹参和赶黄草的质量比具体为（1.5、 2或 2.5) ： (1.5、 2或 2.5): (1.9、 2.4 或 2.9): (0.5、 lg或 1.5): (0.8, 1.2或 1.7): (1.5、 2或 2.5)、 (0.8： 1.2或 1.7): (0.8, 1.2或 1.7): (1.5、 2或 2.5)和（3.5、 4或 4.5)。

3、根据权利要求 1或 2所述的方法，其特征在于：

所述 A的制备方法中：每次所述回流提取的时间为 2 h -5h，每次所述回流提取的时间具体为 2 h、 3 h或 5h;

所述乙醇水溶液的浓度为 70%-95% (体积百分含量）；所述乙醇水溶液的浓度具体为 70%、 90%或 95%;

所述 B的制备方法中：

所述浸泡的时间为（1-60 ) min,所述浸泡的时间具体为 1 min、 30 min 或 60min_;

所述蒸馏的温度为 90°C-10(TC，所述蒸馏的温度具体为 90°C、 95 °C 或 100°C ;

所述 c的制备方法中：

所述煎煮的温度为 90°C-10(TC，所述煎煮的温度具体为 90°C、 95 °C 或 100°C，所述煎煮的时间为 lh-2h，所述煎煮的时间具体为 lh或 2h;

4、根据权利要求 1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述 C的制备方法中，在所述收集上清液的步骤后，还包括如下步骤: 将上清液去除乙醇、过滤取滤液、滤液浓缩、干燥，得到干燥产物，即为人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物；

所述 D的制备方法中，

5、根据权利要求 1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述果蔬为如下 54种果蔬的混合物：

魔芋、茄子、笋、菝菜、豆芽、花椰菜、甘蓝、萝卜、黄瓜、豌豆、红椒、芹菜、葱、蒜、葡萄、柚子、西瓜、桃、橘、蓝莓、甜橙、香蕉、荔枝、苦瓜、韭菜、石榴、火龙果、胡萝卜、蕃茄、白菜、西芹、甜椒、莴苣、梨、姜、芋头、菜豆、南瓜、莲藕、樱桃、猕猴桃、酸梅、草莓、无花果、金桔、芦柑、南国梨、香瓜、哈密瓜、木瓜、洋葱、桑椹、甜菜和柠檬；

所述果蔬中每种果蔬的质量相同。

6、根据权利要求 1-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述方法中，每 1L混合物按照如下方法制备：将（5-50)g所述人参和丹参乙醇提取物、（5-50) g所述薄荷和橘皮的挥发油、（50-200) g所述人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物和所述果蔬发酵转化液混合，用所述果蔬发酵转化液补足体积；

每 1L混合物具体按照如下方法制备：将（5、 15或 50) g所述人参和丹参乙醇提取物、（5、 20或 50) g所述薄荷和橘皮的挥发油、 (50、 160或 200) g所述人参、丹参、薄荷、橘皮、白芍、茯苓、甘草、桃仁、山药和赶黄草的水提取物和所述果蔬发酵转化液混合，用所述果蔬发酵转化液补足体积；

所述 A的制备方法中：

所述乙醇水溶液、所述人参、所述丹参的配比为（1-10) ml: 0.5g: 0.5g_;

所述乙醇水溶液、所述人参、所述丹参的配比具体为（1、 5或 10) ml: 0.5g: 0.5g;

所述 B的制备方法中：

所述薄荷、橘皮和水的配比为（l-10)g_: (l-10)g: (l-lO)ml;

所述薄荷、橘皮和水的配比为（1、 5或 10)g: (1、 5或 10)g: (1、 5 或 10) ml;

所述 C的制备方法中：

所述白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比为（1-10) g: (l-10)g: (l-10)g: (l-10)g: (l-10)g: (l-10)g: (10-100) ml;

所述白芍、茯苓、甘草、核桃、山药、赶黄草和水的配比为（1、 2或 10)g: (1、 2.4或10)_§: (1、 5或 10)g: (1、 1.2或 10)g: (1、 2或 10)g: (1、 4或 10)g: (50、 60或 100) ml; 所述 D的制备方法中：

所述嗜乳酸杆菌 sc o½c i/s acidophilusH 所述长双歧杆菌 Bifidobactreium longum ) 菌液、所述德氏乳杆菌保加利亚种 (. Lactobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus) 菌液禾口所述嗜热链球菌（5^re/^ococ«/s thermophilus) 菌液、所述果蔬和所述水的配比为 (2000-8000) ml: (2000-8000) ml: (2000-8000) ml: (2000-8000) ml: (1000-1500) kg: (1000-1500) kg;

所述嗜乳酸杆菌 sc o½c i/s acidophilusH 所述长双歧杆菌 Bifidobactreium longum ) 菌液、所述德氏乳杆菌保加利亚种 (. Lactobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus) 菌液禾口所述嗜热链球菌（5^re/^ococ«/s thermophilus) 菌液、所述果蔬和所述水的配比为 (2000、 5000或 8000) ml: (2000, 5000或 8000) ml, (2000, 5000或 8000) ml: (2000、 5000或 8000) ml: (1000、 1200或 1500) kg: (1000、 1200或 1500) kg。

7、根据权利要求 1-6中任一所述方法，其特征在于：

所述嗜乳酸杆菌 Lactobacillus acidophilus)菌液按照如下方法制备：将嗜乳酸杆菌（Zsc o½c i/s s«Wo^ ^) 发酵培养，得到发酵产物，即为嗜乳酸杆菌（Zsc o½c i/s s«Wo^ ^)菌液；所述发酵温度为 20°C-4rC，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h;

所述长双歧杆菌 iBifidobactreiim longum ) 菌液按照如下方法制备：将长双歧杆菌 fidobactreium longum ) 发酵培养，得到发酵产物，即为长双歧杆菌 fidobactreium longum ) 菌液；所述发酵温度为 20°C-4rC，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h;

所述德氏乳杆菌保加利亚种（ Lactobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus^ 菌液按照如下方法制备：将德氏乳杆菌保力口禾 II亚禾中 iUictobacillus delbruecki i subsp. bulgaricus) 发酉孝培养，得到发酵产物，即为德氏乳杆菌保加利亚种（ Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)菌液；所述发酵温度为 20°C- 41°C，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41°C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h;

所述嗜热链球菌 Str印 tococcus thermophilus)菌液按照如下方法制备：将嗜热链球菌（^rep ococras thennophi lus)发翁凫养，得到发酵产物，即为嗜热链球菌（^ rep ococras thermophilusH 所述发酵温度为 20°C-4rC，所述发酵温度具体为 20°C、 37°C或 41 °C，所述发酵时间为 15 h-36 h，所述发酵时间具体为 15 h、 16 h或 36h。

8、根据权利要求 1-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述嗜乳酸杆菌、Lactobacillus acidophilus)为嗜乳酸杆菌 {Lactobacillus acidophilus) CGMCC 1. 1854，所述长双歧杆菌 ( Bifidobactreium longum ) 为长双歧杆菌 {Bifidobactreium longum ) CGMCC 1. 2186 , 所述德氏乳杆菌保加利亚种（ Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) 为德氏乳杆菌保力口禾 U亚种 ( Lactobac illus delbrueckiisubsp. bulgaricus ) CGMCC 1. 1480 ，所述嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus) 为嗜热链球菌 {Streptococcus thermophilus) CGMCC 1. 2471。

9、由权利要求 1-8中任一所述的方法制备的祛黄褐斑的药物。