WO2012105521A1 - 皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法 - Google Patents

皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012105521A1
WO2012105521A1 PCT/JP2012/052047 JP2012052047W WO2012105521A1 WO 2012105521 A1 WO2012105521 A1 WO 2012105521A1 JP 2012052047 W JP2012052047 W JP 2012052047W WO 2012105521 A1 WO2012105521 A1 WO 2012105521A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sirolimus
ointment
skin
external preparation
active ingredient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/052047
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
眞理 金田
一朗 片山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Priority to CA2825786A priority Critical patent/CA2825786A1/en
Priority to US13/982,014 priority patent/US20130317053A1/en
Priority to JP2012555873A priority patent/JP5652795B2/ja
Priority to AU2012211809A priority patent/AU2012211809A1/en
Priority to EP12742647.6A priority patent/EP2671583A4/en
Publication of WO2012105521A1 publication Critical patent/WO2012105521A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/439—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom the ring forming part of a bridged ring system, e.g. quinuclidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone

Definitions

  • the present invention relates to an external medicine for treating skin diseases and a method for producing the same.
  • tuberous sclerosis a genetic disease called tuberous sclerosis (TSC) is known.
  • This genetic disease is a disease that causes central nervous system disorders (epilepsy, delayed mental development, autism, etc.) and vitiligo in addition to systemic tumors such as skin tumors.
  • the causative gene of this genetic disease is TSC1 encoding a hamartin protein and TSC2 encoding a tuberin protein.
  • the complex of hamartin protein and tuberin protein is located upstream of mTOR and suppresses the function of mTOR. It is believed that suppression of mTOR disappears due to the failure of at least one of the hamartin and tuberin proteins, resulting in tuberous sclerosis.
  • suppression of mTOR is effective, and attempts have been made to use sirolimus, an inhibitor of mTOR.
  • sirolimus was systemically administered to patients with tuberous sclerosis in order to treat brain tumors, kidney tumors and lung tumors, and it was reported that good results were obtained. ing. However, it was confirmed that when the administration of sirolimus was discontinued, the above-mentioned tumor increased again, and it is considered necessary to continue systemic administration of sirolimus for a long time in order to maintain the tumor shrinkage. Yes. This result applies not only to brain tumors, kidney tumors and lung tumors but also to skin tumors, and systemic administration of sirolimus is required over a long period of time to treat this skin tumor.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 describe applying an external medicine for sirolimus to angiofibromas formed on the face of patients with tuberous sclerosis.
  • Non-Patent Document 3 describes that an ointment containing sirolimus is applied to a skin tumor in an animal model of tuberous sclerosis.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 describe applying a formulation containing sirolimus to human psoriasis vulgaris.
  • Non-Patent Document 5 describes that sirolimus is locally applied to human port wine nevus.
  • a compound used for an external medicine has a large molecular size and a decrease in diffusibility when the molecular weight is large, so that the absorption of the compound from the skin decreases ( Michiteru Otani, Nuri-Yaku-no-Sakura, Vol. 2, maruho, Maruho Corporation, page 4, 2009). For this reason, it is recommended that the compound used for external medicine has a molecular weight of 500 Dalton or less.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 describe that angiofibroma has been improved by using a topical sirolimus drug, but it can be said that it is not at a practical level. There is a need for the development of a topical drug that can further increase the absorption of sirolimus from the skin.
  • Non-Patent Document 3 the blood concentration of sirolimus 24 hours after applying an ointment containing 0.4% by mass of sirolimus to a skin tumor was 6.3 ⁇ 0.6 ng / mL. It is described. Similarly, it is described that the blood concentration of sirolimus 24 hours after applying an ointment containing 0.8% by mass of sirolimus to a skin tumor was 12.3 ⁇ 1.5 ng / mL. ing. The blood concentration of sirolimus is almost equal to the general blood concentration (5 to 10 ng / mL) when sirolimus is administered systemically. As described above, in the technique described in Non-Patent Document 3, sirolimus migrates into the blood despite being applied locally, and is affected in the same manner as systemic administration of sirolimus. Side effects will occur.
  • the concentration of sirolimus in a skin tumor 24 hours after applying an ointment containing 0.4% by mass of sirolimus to a skin tumor is 13.8 ⁇ 0.7 ng / mL. This concentration is about 1.9 to 2.5 times the blood concentration (6.3 ⁇ 0.6 ng / mL).
  • the concentration of sirolimus in the skin tumor 24 hours after application of the ointment containing 0.8% by weight of sirolimus to the skin tumor is 59.6 ⁇ 23.5 ng / mL. This concentration is about 2.6 to 7.7 times the blood concentration (12.3 ⁇ 1.5 ng / mL).
  • the concentration of sirolimus present in the skin tumor is only a few times the concentration of sirolimus that migrates into the blood. From this, it can be said that the ointment disclosed in Non-Patent Document 3 is not suitable for local application.
  • Non-Patent Document 4 is a lotion composed of sirolimus, capric acid, isopropyl myristate and benzyl alcohol.
  • the content of sirolimus in this formulation is 2.2% by mass or 8% by mass, and side effects such as contact dermatitis and irritation are caused by applying these formulations to the affected area.
  • sirolimus concentration of 8% by mass is a concentration that deviates from the common general knowledge of those skilled in the art, and it is not practical to use a gel having such a concentration as an external preparation.
  • Non-Patent Document 5 it is not sufficient to apply sirolimus locally to the affected area in order to treat port wine nevus. In addition to using sirolimus, laser irradiation to the affected area is not sufficient. Irradiation is necessary. Thus, in the techniques described in Non-Patent Documents 4 and 5, as described above, sirolimus is poorly absorbed from the skin, so that the amount applied to the affected area can be increased or combined with another treatment method. Needed.
  • Patent Document 1 does not discuss at all whether sirolimus actually exerts a therapeutic effect on various diseases.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and its purpose is to provide an external medicine capable of absorbing a sufficient amount of sirolimus to treat an affected area without causing side effects. It is to provide.
  • a solution containing at least one of sirolimus and its derivative (active ingredient) is gelled, or at least one of the active ingredients.
  • the present invention has been completed.
  • the external preparation for locally treating skin diseases of the present invention includes a gel composition or an ointment composition containing at least one of sirolimus and its derivatives.
  • “treating locally” is intended not to indicate a systemic effect due to a locally applied topical drug.
  • the external preparation of the present invention When applied to the skin, the external preparation of the present invention has the effect of absorbing at least one of sirolimus and a derivative thereof sufficient to treat a skin disease to the affected area without causing side effects. Demonstrate.
  • (A)-(d) is a figure which shows the result obtained using various external preparations.
  • (A) is a figure which shows the hemangiofibroma before apply
  • (b) is a figure which shows the angiofibroma after applying an external preparation.
  • (C) is a partially enlarged view of (a), and (d) is a partially enlarged view of (b).
  • (A) is a figure which shows the hemangiofibroma before apply
  • (b) is a figure which shows the angiofibroma after applying an external preparation.
  • (A) is a figure which shows the hemangiofibroma before apply
  • (b) is a figure which shows the angiofibroma after applying an external preparation.
  • (A) is a figure which shows the hemangiofibroma before apply
  • (b) is a figure which shows the angiofibroma after applying an external preparation.
  • (C) is a partially enlarged view of (a), and (d) is a partially enlarged view of (b).
  • (A) is a figure which shows the hemangiofibroma before apply
  • (b) is a figure which shows the angiofibroma after applying an external preparation.
  • (A) to (d) are graphs showing the results obtained using a topical drug.
  • (A) to (d) are graphs showing the results obtained using a topical drug. It is a graph which shows the relative expression level of mRNA of MITF. It is a graph which shows the relative expression level of TYR mRNA. It is a graph which shows the relative expression level of TYRP mRNA.
  • (A) is a figure which shows the vitiligo before apply
  • (b) is a figure which shows the vitiligo after apply
  • (A) is a figure which shows the vitiligo before apply
  • (b) is a figure which shows the vitiligo after apply
  • (A) to (c) are graphs showing the results obtained using a topical drug.
  • FIG. 3 is a view of a section of skin stained with toluidine blue.
  • FIG. 6 shows the concentration of VEGF expressed in cells of severe, moderate, or mild hemangiofibroma.
  • FIG. 1 is a graph showing the concentration (pg / mL) of VEGF expressed from each cell treated with 0 nM (untreated), 1 nM, and 10 nM sirolimus, respectively, for hemangiofibroma cells, (b) FIG.
  • FIG. 2 is a graph showing the concentration (pg / mL) of VEGF expressed from hemangiofibromatous cells (TSC AF fibro), human fibroblasts (normal fibro), and HaCat before and after treatment with sirolimus; c) Percent decrease in concentration of VEGF caused by treatment of these three cells with sirolimus (ratio: concentration of VEGF after treatment with 20 nM sirolimus / VEGF before treatment with 20 nM sirolimus).
  • D is a graph showing HaCat of 0 nM (untreated), 1 nM, and 10 nM of white. Is a graph showing the concentration (pg / mL) of VEGF expressed from the cells treated with Mus.
  • (A) is a figure which shows the erythema before apply
  • (b) is a figure which shows the erythema after apply
  • (A) is a figure which shows a mode when propylene carbonate is added to the component of the ointment prepared in the present Example, or white petrolatum
  • (b) is the component of the ointment which added propylene carbonate, or It is a figure which shows a mode when white petrolatum to which propylene carbonate is added is stirred.
  • (A) is the figure which observed the ointment prepared using the component of the ointment prepared in this Example with the microscope, (c) is an enlarged view of (a), (b) is white petrolatum. It is the figure observed with the microscope of the ointment prepared using, (d) is an enlarged view of (b). It is a graph which shows the quantity of the melanin produced by a melanocyte. It is a graph which shows the quantity of the melanin produced by a melanocyte. It is a graph which shows transition of the symptom of four patients who have vitiligo developing in the forehead part (exposure part).
  • Embodiment 1 External preparation containing gel composition
  • the present invention provides an external medicine for locally treating skin diseases.
  • treatment is intended to alleviate or eliminate symptoms and can be performed prophylactically (before onset) as well as what can be done therapeutically (after onset). What is obtained is also encompassed.
  • the external preparation of this embodiment includes a gel composition obtained by gelling a solution containing an active ingredient for locally treating a skin disease.
  • gel composition is intended to mean a solution in which an active ingredient is dissolved in a solvent in which the active ingredient is dissolved and solidified in a jelly form.
  • the active ingredient may be at least one of sirolimus and its derivatives.
  • the derivatives of sirolimus are not particularly limited. For example, 42-O- (2-hydroxyethyl) sirolimus (everolimus, RAD001) and sirolimus 42- [3-hydroxy-2- (hydroxymethyl) -2-methylprop Noart (tensirolimus).
  • sirolimus and its derivatives are known to exert the following effects by suppressing mTOR: (i) Inhibiting protein translation and synthesis, cell cycle arrest, and apoptosis Suppresses tumors and angiogenesis; (ii) blocks signal transduction pathways involving IL2 receptors, suppresses T cell activation and proliferation, suppresses immunity; (iii) mediated by mast cells Inhibits inflammation.
  • sirolimus and everolimus are each taken as an immunosuppressant used after kidney transplantation or heart transplantation.
  • Everolimus is also approved in Japan for use as an internal medicine for renal malignant tumors.
  • Tensirolimus has been developed as an internal medicine for end-stage liver cancer.
  • sirolimus and its derivatives are mainly used as internal medicines.
  • sirolimus topical drugs have been developed, but the absorption to the skin is bad, or side effects are caused by the fact that the action is systemic despite being applied locally. Therefore, a practical level of external medicine has not been obtained.
  • sirolimus and its derivatives by gelling a solution containing an active ingredient (sirolimus and its derivatives), the absorption efficiency of the active ingredient from the skin to the affected area is improved, and the skin disease caused by the active ingredient is improved. Local treatment is possible.
  • the solution containing the active ingredient is gelled.
  • the solution may be gelled using a gelling agent.
  • Carbopol (registered trademark) 934NF is used as a gelling agent
  • Carbopol (registered trademark) 934NF is added to the above solution, and the pH of the solution is neutralized by a pH adjusting agent such as trishydroxymethylaminomethane. By adjusting, gelation of the solution can be induced.
  • the external preparation of the present embodiment may be composed of a gel composition, and may further include other components described later as long as the gel form is maintained.
  • the gel composition may be composed of a solution containing an active ingredient and a component that induces gelation (such as a gelling agent). These components may be further included.
  • the gel composition used in the present embodiment is obtained by gelling a solution containing an active ingredient, and the active ingredient is used as a solvent for dissolving the active ingredient before the gelation is induced.
  • a dissolved composition (a solution in which an active ingredient is dissolved) is also included in the present invention.
  • a kit including an active ingredient, a solvent for dissolving the active ingredient, and a component for inducing gelation are also included in the present invention.
  • Such a composition and kit can be used for preparing the gel composition (and the external preparation of the present embodiment).
  • the composition for preparing the gel composition may further include other components
  • the kit for preparing the gel composition may further include other components.
  • kit is intended to include packaging with containers (eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.) containing specific materials. Preferably, an instruction for using the material is provided.
  • container eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.
  • “comprising” is intended to mean being contained within any of the individual containers that make up the kit.
  • the kit of the present invention may be a package in which a plurality of different compositions are packed together, or may be a solution in a form of a solution contained in a container.
  • the kit of the present invention may be prepared by mixing two or more different substances in the same container or in separate containers.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. .
  • the kit of the present invention may be used to constitute the above-described composition, and may comprise separately the substances contained in the above-described composition, or separately comprise the above-described composition and further components. May be.
  • the solvent for dissolving the above-mentioned active ingredient is not particularly limited, and examples thereof include isopropanol, ethanol and propylene carbonate.
  • examples thereof include isopropanol, ethanol and propylene carbonate.
  • isopropanol and ethanol is preferable.
  • the active ingredient is dissolved in a solvent that dissolves the active ingredient, and the resulting solution is gelled, whereby the absorption of the active ingredient from the skin to the affected area is significantly improved.
  • the treatment of skin diseases is realized in a much smaller amount than that of conventional sirolimus.
  • possibility that an active ingredient may remain in an affected part, without leaking in the blood is also considered.
  • the amount of the active ingredient contained in the external preparation of this embodiment is preferably 0.01 to 2% by mass, more preferably 0.03 to 1% by mass, based on the total mass of the external preparation. . If the amount of the active ingredient is within this range, the skin disease can be treated without causing side effects.
  • the amount of the active ingredient contained in the composition for preparing the external medicine is the same as the amount of the active ingredient contained in the external medicine.
  • the amount of the active ingredient provided in the kit for preparing the external medicine is arbitrary, and the amount of the active ingredient finally contained in the manufactured external medicine should be within the above range.
  • the amount of the active ingredient contained in the gel composition may be an amount that allows the amount of the active ingredient contained in the external preparation to be within the above range, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the amount of the solvent for dissolving the active ingredient contained in the external preparation (or gel composition) of the present embodiment is not particularly limited as long as it can sufficiently dissolve the active ingredient.
  • the amount of the solvent used is 100 to 300 times the amount of the active ingredient, preferably 120 to 250 times, more preferably 121.5 to 244 times.
  • the amount of the solvent for dissolving the active ingredient contained in the composition for preparing the external preparation is the same as the amount of the solvent for dissolving the active ingredient contained in the external preparation.
  • the amount of the solvent for dissolving the active ingredient, which is provided in the kit for preparing an external medicine is arbitrary and may be an amount that can sufficiently dissolve the active ingredient.
  • the amount of the component for inducing gelation contained in the external medicine (or gel composition) of the present embodiment is not particularly limited, and the solution containing the active ingredient gels (the external medicine or composition is a gel). It is sufficient if the amount is sufficient to form the following.
  • a gelling agent such as Carbopol (registered trademark) and a pH adjusting agent (trishydroxymethylaminomethane or the like) for inducing gelation
  • the gelling agent Is 1.6% by mass, for example, based on the total mass of the external preparation
  • the pH adjuster is, for example, 0.4% by mass, based on the total mass of the external preparation.
  • the quantity of the component which induces gelation with which the kit for preparing an external preparation is prepared is arbitrary, and should just be the quantity which makes the external preparation manufactured into the form of a gel.
  • the external preparation of this embodiment is used for the treatment of tuberous sclerosis skin tumors, vitiligo and erythema.
  • the external preparation in the ointment form shown in Embodiment 2 is used for the treatment of tuberous sclerosis skin tumors, vitiligo and erythema, and the treatment of atopic dermatitis.
  • Such an effect is based on the fact that the external preparation of this embodiment (and embodiment 2) efficiently penetrates the active ingredient (sirolimus and its derivatives) into the skin.
  • these external medicines are applicable to "any skin disease caused by activation of mTOR".
  • Skin diseases to which the external medicine of this embodiment can be applied include not only diseases that occur in skin tissues such as the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue, but also diseases that occur in the vascular system in the skin tissue.
  • skin diseases include, but are not limited to, skin tumors, atopic dermatitis, rosacea, keloids, pigment spots, depigmentation spots, abnormal formation of vascular system in skin, benign tumor of vascular system in skin , And epithelial nevus.
  • the skin tumor is preferably at least one selected from the group consisting of a tuberous sclerosis skin tumor, a seborrheic keratosis, and a Recklinghausen disease skin tumor.
  • Vascular dysplasia in the skin is preferably simple hemangioma, spider angioma or horned hemangioma.
  • the benign tumor of the vascular system in the skin is preferably strawberry hemangioma or senile hemangioma.
  • the epithelial nevus is preferably at least one selected from the group consisting of rod-like nevus, serial nevus, inflammatory linear rod-like nevi, and sebaceous nevus.
  • the pigment spots are preferably brown spots, and the brown spots are more preferably flat nevus or cafe au lait spots.
  • the depigmentation spots are preferably vitiligo.
  • the external preparation of this embodiment can treat various skin diseases.
  • the present inventors found for the first time that skin tumors of atopic dermatitis, vitiligo, rosacea, keloid, and seborrheic keratosis can be treated using sirolimus and its derivatives. Yes, not reported so far.
  • an ointment containing steroid and tacrolimus As an external medicine for atopic dermatitis, an ointment containing steroid and tacrolimus is known. Steroids cause side effects when used to treat atopic dermatitis. On the other hand, an ointment containing tacrolimus does not cause the side effects of steroids, but causes the side effects of developing tumors.
  • the external preparation of this embodiment does not cause side effects of steroids, has almost the same effect as an ointment containing tacrolimus, and also has an antitumor effect. Therefore, if the external preparation of this embodiment is used for atopic dermatitis, side effects of an ointment containing tacrolimus can be avoided.
  • the external preparation of this embodiment is an external preparation for atopic dermatitis, which is safer than an ointment containing tacrolimus.
  • Atopic dermatitis has been on an increasing trend in recent years, is a disease with a very high frequency of onset, requires long-term treatment, and lowers the patient's QOL.
  • the vitiligo targeted by the external medicine of the present embodiment is not limited to congenital vitiligo such as tuberculous sclerosis, but also includes acquired vitiligo such as vulgaris. There are about 50,000 patients with congenital vitiligo in Japan, and 1/3 of those are those with tuberculous sclerosis. There is currently no cure for vitiligo of tuberous sclerosis. Therefore, it is epoch-making that the external medicine of this embodiment can treat vitiligo of tuberous sclerosis.
  • a benign tumor of the skin such as seborrheic keratosis, is not life-threatening, but is a lesion that is filed for all humans with age. If the symptoms of this benign tumor are severe, it lowers the patient's QOL.
  • atopic dermatitis, vitiligo, rosacea, and benign tumors of the skin reduce the patient's QOL and also reduce the patient's labor productivity. If the external preparation of this embodiment is used, these diseases can be effectively treated without causing side effects, so that the labor productivity of patients can be improved. That is, the external preparation of the present embodiment is useful for socioeconomic and medical economics.
  • the external preparation, gel composition of the present embodiment, and the kit for preparing the external preparation (gel composition) of the present embodiment include the active ingredient, a solvent for dissolving the active ingredient, and gelation.
  • other components may be included.
  • the composition for preparing the external preparation (gel composition) of this embodiment may contain another component other than the said active ingredient and the solvent which dissolves an active ingredient. Examples of such other components include water-soluble polymers, pH adjusting agents, water, and other active ingredients effective for treating the target skin disease.
  • water-soluble polymer examples include polyethylene glycol, starch, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose (HPC), polyvinyl alcohol, polyvinyl methyl ether, and polyvinyl pyrrolidone.
  • the adhesiveness of the external preparation of this embodiment can be improved by mix
  • pH adjuster examples include trishydroxymethylaminomethane.
  • Examples of other active ingredients effective for treating skin diseases include steroids and tacrolimus.
  • the total amount of the other components contained in the external preparation is, for example, 49% by mass based on the total mass of the external preparation.
  • the kit for preparing an external medicine gel composition
  • the total amount of these other components is arbitrary, and the total amount of other components finally contained in the manufactured external medicine However, what is necessary is just to become the said amount.
  • the present invention also provides a method for producing an external medicine for treating skin diseases.
  • the external medicine of this embodiment consists of a gel composition
  • the said method may be a method of manufacturing a gel composition.
  • the method for producing the gel composition only needs to include a step of producing the gel composition.
  • the process of producing a gel composition should just contain gelatinizing the solution containing an active ingredient.
  • the active ingredient may be dissolved in a solvent that dissolves the active ingredient, and the resulting solution may be mixed with a component that induces gelation.
  • the said composition contain the said other component, what is necessary is just to melt
  • the external preparation of this embodiment contains a gel composition and other components
  • the gel composition and other components are mixed by a conventionally known method, and the resulting mixture is formulated into a gel form. do it.
  • the external preparation of this embodiment can be applied to humans and non-human animals.
  • the “non-human animal” include mammals other than humans and birds. Mammals other than humans are not particularly limited. For example, cattle, wild boars, pigs, sheep, goats and other cloven-hoofed animals, horses and other odd-hoofed animals, mice, rats, hamsters, squirrels and other rodents And rabbits such as rabbits, and meat such as dogs, cats, ferrets, and the like.
  • birds For example, a duck, a chicken, a pigeon, a parakeet etc. can be mentioned.
  • these non-human animals are not limited to domestic animals or companion animals (companion animals), and may be wild animals.
  • the present invention also provides a method for treating the above skin diseases.
  • the treatment method of this invention should just include the process of applying the external preparation of this embodiment to the affected part of a skin disease.
  • “application” is intended to attach the external medicine of the present embodiment to the affected area.
  • “Applying an external medicine to the affected area” includes, for example, applying the external medicine to the affected area, spraying the external medicine onto the affected area, and applying the external medicine to the affected area as a patch.
  • the external preparation (gel composition) of the present embodiment can be configured as follows, but the present invention is not limited thereto.
  • the external preparation (gel composition) of the present embodiment can contain Carbopol (registered trademark) 934NF, water, isopropanol, and trishydroxymethylaminomethane in addition to the active ingredient.
  • Carbopol registered trademark 934NF
  • water isopropanol
  • trishydroxymethylaminomethane in addition to the active ingredient.
  • the total of the active ingredient, water and isopropanol is 980.
  • ratio 1 and the ratio 2 described above are compared, the external medicine produced at the ratio 2 has higher transparency than the external medicine produced at the ratio 1.
  • the external preparation of this embodiment includes an ointment composition containing an active ingredient for locally treating skin diseases.
  • ointment composition is intended to have an active ingredient dispersed in a solvent that is incompatible with the active ingredient. It can be said that the external medicine containing the ointment composition is an ointment.
  • the external preparation of this embodiment by dispersing the active ingredient in a solvent that is incompatible with the active ingredient, the absorption efficiency of the active ingredient from the skin to the affected area is improved, and the skin disease caused by the active ingredient is improved.
  • Local treatment is possible.
  • the active ingredient may be dissolved in a solvent that dissolves the active ingredient, and the resulting solution may be mixed with a solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • the external preparation of this embodiment may be composed of an ointment composition, or may contain other components as described above as long as the ointment form is maintained.
  • the ointment composition may be composed of an active ingredient, a solvent that dissolves the active ingredient, and a solvent that is incompatible with the active ingredient, and other ingredients may be added as long as the ointment form is maintained. It may be included.
  • the active ingredient is dispersed in a solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • the present invention includes an active ingredient, a solvent that dissolves the active ingredient, and a solvent that is incompatible with the active ingredient, and a composition before the active ingredient is dispersed in the solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • kits in which an active ingredient, a solvent that dissolves the active ingredient, and a solvent that is incompatible with the active ingredient are separately included in the present invention.
  • Such a composition and kit can be used to prepare the ointment composition (and the external preparation of the present embodiment).
  • the composition for preparing the ointment composition may further include other components
  • the kit for preparing the ointment composition may further include other components.
  • solvent for dissolving the active ingredient described above examples include isopropanol, ethanol and propylene carbonate as described in the first embodiment, but propylene carbonate is preferable in the case of the second embodiment (ointment composition).
  • the solvent that is not compatible with the above-mentioned active ingredient is not particularly limited, and examples thereof include waxes, paraffins, and petroleum jelly.
  • waxes include natural wax such as white beeswax, lanolin, carnauba wax, and whale wax, mineral wax such as montan wax, and synthetic wax.
  • paraffins include liquid paraffin and solid paraffin.
  • petrolatum include white petrolatum and yellow petrolatum.
  • the active ingredient is dissolved in a solvent that dissolves the active ingredient, and the resulting solution is mixed with a solvent that is incompatible with the active ingredient, so that the active ingredient is not compatible with the active ingredient. Evenly dispersed as fine particles. Such dispersion significantly improves the absorption of the active ingredient from the skin to the affected area.
  • treatment of a skin disease is implement
  • the active ingredient is dispersed as described above, there is a possibility that the active ingredient may remain in the affected area without leaking into the blood. If the external preparation of this embodiment is used, a skin disease can be treated without causing side effects as in conventional external preparations.
  • the amount of the active ingredient contained in the external preparation of this embodiment is preferably 0.01 to 2% by mass, more preferably 0.03 to 1% by mass, based on the total mass of the external preparation. . If the amount of the active ingredient is within this range, the skin disease can be treated without causing side effects.
  • the amount of the active ingredient contained in the composition for preparing the external medicine is the same as the amount of the active ingredient contained in the external medicine.
  • the amount of the active ingredient provided in the kit for preparing the external medicine is arbitrary, and the amount of the active ingredient finally contained in the manufactured external medicine should be within the above range.
  • the amount of the active ingredient contained in the ointment composition may be an amount that allows the amount of the active ingredient contained in the external preparation to be within the above range, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the amount of the solvent for dissolving the active ingredient contained in the external preparation (or ointment composition) of the present embodiment is not particularly limited as long as it can sufficiently dissolve the active ingredient.
  • the amount of the solvent in which the active ingredient is dissolved is 2 to 100 times the amount of the active ingredient, preferably 3 to 50 times, more preferably 5 to 29 times.
  • the amount of the solvent contained in the composition for preparing an external preparation is also the same as the amount of the solvent that dissolves the active ingredient contained in the external preparation.
  • the amount of the solvent for dissolving the active ingredient, which is provided in the kit for preparing an external medicine is arbitrary and may be an amount that can sufficiently dissolve the active ingredient.
  • the amount of the solvent incompatible with the active ingredient contained in the external preparation (or ointment composition) of the present embodiment is not particularly limited, and the active ingredient is uniformly dispersed as fine particles in the solvent incompatible with the active ingredient. It is sufficient if the amount is sufficient.
  • the amount of the solvent incompatible with the active ingredient used is 50 to 1000 times the amount of the active ingredient, preferably 70 to 500 times, more preferably 94 to 470 times.
  • the amount of this solvent contained in the composition for preparing the external preparation is the same as the amount of the solvent incompatible with the active ingredient contained in the external preparation.
  • the amount of the solvent incompatible with the active ingredient provided in the kit for preparing a topical drug is arbitrary, and may be an amount that can sufficiently disperse the active ingredient.
  • the external preparation, ointment composition of the embodiment, and the composition and kit for preparing the external preparation (ointment composition) of the present embodiment include the active ingredient, the solvent for dissolving the active ingredient, the effective
  • other components may be included.
  • the description of Embodiment 1 described above can be used, and is omitted here.
  • the present invention also provides a method for producing an external medicine for treating skin diseases.
  • the external medicine of this embodiment consists of an ointment composition
  • the said method may be a method of manufacturing an ointment composition.
  • the method for producing an ointment composition only needs to include a step of producing an ointment composition.
  • the step of preparing the ointment composition may involve dispersing the active ingredient in a solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • the active ingredient may be dissolved in a solvent that dissolves the active ingredient, and the resulting solution may be mixed with a solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • the above solution in which the active ingredient is dissolved is added to a solvent that is incompatible with the active ingredient, and stirred using a rotation and revolution mixer manufactured by Shinki Co., Ltd. or a homomixer manufactured by Primics Co., Ltd.
  • the active ingredient can be dispersed in the form of an emulsion.
  • the size of the active ingredient particles can be made uniform, and the homogenized active ingredient can be successfully dispersed in a solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • the mixture may be stirred at 2000 rpm for 1 minute at room temperature, then stirred at 1000 rpm for 5 minutes, and then stirred at 500 rpm for 3 minutes.
  • the stirring conditions when using a homomixer can be appropriately set by those skilled in the art based on, for example, instructions attached to the homomixer. In particular, by using this homomixer, a large amount of the external preparation of this embodiment can be prepared.
  • the solvent incompatible with the active ingredient is a solid at room temperature
  • the solvent is heated until it becomes liquid, and the resulting liquid solvent and the solution in which the active ingredient is dissolved may be mixed.
  • various components that are solid at room temperature wax, paraffins, petroleum jelly) and the like are heated to a melting point (for example, 70 ° C.), dissolved, and mixed. And this mixture is cooled to near room temperature (for example, 40 degreeC), this mixture is added to the solution in which the active ingredient melt
  • the active ingredient and other components may be dissolved in a solvent that dissolves the active ingredient, and the resulting solution may be mixed with a solvent that is incompatible with the active ingredient.
  • the external preparation of this embodiment contains an ointment composition and other components, the ointment composition and other components are mixed by a conventionally known method, and the resulting mixture is formulated into an ointment form. do it.
  • Embodiment 2 Active ingredients, kits, other components, diseases to which external medicines are applied, animals to which external medicines are applied, methods for treating skin diseases, etc. It is the same as Embodiment 1 mentioned above, or a person skilled in the art can appropriately modify and use it based on Embodiment 1.
  • the external preparation (ointment composition) of the present embodiment can be configured as follows, but the present invention is not limited thereto.
  • the external preparation (ointment composition) of the present embodiment can contain propylene carbonate, solid paraffin and white petrolatum in addition to the active ingredient.
  • the external preparation (ointment composition) of the present embodiment can further contain liquid paraffin in addition to propylene carbonate, solid paraffin and white petrolatum.
  • the external preparation (ointment composition) of the present embodiment can further contain white beeswax in addition to propylene carbonate, solid paraffin, white petrolatum and liquid paraffin.
  • the total of the active ingredient, propylene carbonate, solid paraffin and liquid paraffin is 105.
  • Active ingredient: propylene carbonate: solid paraffin: white petrolatum: liquid paraffin: white beeswax 2: 58: 45: 895: 0: 0 (hereinafter referred to as ratio 4), active ingredient: carbonic acid
  • the external preparation prepared at the ratio 3 has higher transparency than the external preparation prepared at the ratio 4, and exists on the surface of the external preparation.
  • the amount of water can be reduced.
  • the ratio 3 and the ratio 5 described above are compared, the external medicine produced at the ratio 3 is smoother than the external medicine produced at the ratio 5, and is present on the surface of the external medicine. The amount of water can be reduced.
  • the present invention can also be configured as follows.
  • the gel composition is preferably a gelled solution containing at least one of sirolimus and its derivatives.
  • the solution is preferably a solution in which at least one of sirolimus and its derivative is dissolved in at least one of isopropanol and ethanol.
  • Skin diseases to which the present invention is applied include skin tumors, atopic dermatitis, rosacea, keloids, pigment spots, depigmentation spots, vascular dysplasia in the skin, benign tumors of the vascular system in the skin, and epithelial mothers
  • at least one selected from the group consisting of plaques and at least one selected from the group consisting of tuberous sclerosis skin tumors, seborrheic keratosis, and Recklinghausen disease skin tumors
  • Vascular dysplasia in the skin is preferably simple hemangioma, spider angiomas or horned hemangioma
  • the benign tumor of the vasculature in the skin is preferably strawberry hemangioma or senile hemangioma
  • the epithelial nevus is preferably at least one selected from the group consisting of rod-shaped nevus, serial nevus, inflammatory linear rod-like nevus, and sebaceous nevi,
  • the gel composition preferably contains at least one of Carbopol (registered trademark) 934NF, water, isopropanol, and trishydroxymethylaminomethane.
  • the gel composition has a mass ratio of at least one of sirolimus and its derivatives, Carbopol® 934NF, water, isopropanol, and trishydroxymethylaminomethane from 2 to 4: 16: 490 to 833. 145 to 488: 4, and the sum of the ratio of at least one of sirolimus and its derivatives, the ratio of water and the ratio of isopropanol is preferably 980.
  • the gel composition has a mass ratio of 2: 16: 490: 488: at least one of the sirolimus and derivatives thereof, Carbopol® 934NF, water, isopropanol, and trishydroxymethylaminomethane. 4 is preferred.
  • the ointment composition preferably contains at least one of propylene carbonate, solid paraffin, white petrolatum, liquid paraffin, and honey beeswax.
  • the ointment composition has a mass ratio of at least one of sirolimus and its derivatives, propylene carbonate, solid paraffin, white petrolatum, liquid paraffin, and white beeswax from 0.3 to 10:50 to 59.4. : 30 to 45: 895: 0 to 10: 0 to 5, and the ratio of at least one of sirolimus and its derivatives, the ratio of propylene carbonate, the ratio of solid paraffin, the ratio of liquid paraffin, and the ratio of beeswax wax And the total is 105.
  • the ointment composition has a mass ratio of 2: 58: 30: 895: 10: 5 of at least one of sirolimus and its derivatives, propylene carbonate, solid paraffin, white petrolatum, liquid paraffin, and white beeswax. It is preferable that
  • composition of the present invention is characterized by containing at least one of sirolimus and a derivative thereof for preparing an external medicine for locally treating skin diseases.
  • the kit of the present invention is characterized by comprising at least one of sirolimus and its derivatives for preparing a topical medicine for locally treating a skin disease.
  • the method for producing an external preparation of the present invention is characterized by including a step of producing a gel composition or an ointment composition containing at least one of sirolimus and a derivative thereof.
  • the solution may be prepared using the composition or kit described above.
  • Preparation of the external preparation of the present invention ⁇ Preparation Example 1: Preparation of gel containing 0.4% by mass of sirolimus> 4 mg of sirolimus reagent (Calbiochem, 553210) was dissolved in 486 mg of isopropanol (Wako Pure Chemical Industries, 166-04836). 490 mg of the resulting lysate was mixed with a mixture of 16 mg of Carbopol® 934NF polymer (Lubrizol) and 490 mg of H 2 O. To the obtained mixture, 4 mg of trishydroxymethylaminomethane (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 203-06272) was mixed. In this way, a gel (gel 1) containing 0.4% by mass of sirolimus was prepared.
  • Preparation Example 2 Preparation 1 of gel containing 0.2% by mass of sirolimus> Except that 2 mg of sirolimus reagent was dissolved in 488 mg of isopropanol, the same operation as in Preparation Example 1 was performed to prepare a gel (gel 2) containing 0.2% by mass of sirolimus.
  • Preparation 2 of gel containing 0.2% by mass of sirolimus> A gel (gel 3) containing 0.2% by mass of sirolimus was prepared in the same manner as in Preparation Example 2, except that Rapamune was used instead of the sirolimus reagent. Specifically, 2 mg of Rapamune tablets were crushed and passed through a 75 ⁇ m mesh to remove impurities (excipients, etc.), and then the pulverized product was dissolved in 488 mg of isopropanol.
  • ⁇ Preparation Example 4 Preparation of an ointment containing 1% by mass of sirolimus> 10 mg of a sirolimus reagent (Calbiochem, 553210) was dissolved in 50 mg of propylene carbonate (Wako Pure Chemical Industries, 168-04972). White beeswax 5 mg, liquid paraffin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 128-04375) 10 mg, solid paraffin (Wako Pure Chemical Industries, 415-25791) 30 mg, and white petrolatum (propet) (Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.) 895 mg (manufactured by Merck or Astra Japan) was mixed while being heated to 70 ° C. and dissolved.
  • a sirolimus reagent Calbiochem, 553210
  • Preparation 1 of an ointment containing 0.2% by mass of sirolimus The same operation as in Preparation Example 4 was performed except that 2 mg of sirolimus reagent was dissolved in 58 mg of propylene carbonate to prepare an ointment (ointment 2) containing 0.2% by mass of sirolimus.
  • ⁇ Preparation Example 6 Preparation 2 of ointment containing 0.2% by mass of sirolimus> An ointment (ointment 3) containing 0.2% by mass of sirolimus was prepared in the same manner as in Preparation Example 5, except that Rapamune (Pfizer, 29269) was used instead of the sirolimus reagent. Specifically, 2 mg of Rapamune tablets were pulverized, passed through a 75 ⁇ m mesh to remove impurities, and the pulverized product was dissolved in 58 mg of propylene carbonate.
  • ⁇ Reference Example 1 Preparation of an ointment containing 0.2% by mass of sirolimus using a commercially available ointment as a base> An ointment (Reference Example 1) containing 0.2% by mass of sirolimus was prepared based on Protopic (registered trademark) ointment 0.03% for children (Astellas Pharma Inc.).
  • ⁇ Reference Example 2 Preparation of another ointment containing 0.2% by mass of sirolimus using a commercially available ointment as a base> Protopic (registered trademark) ointment 0.03% Instead of for children, Protopic (registered trademark) ointment was used in the same manner as in Reference Example 1 except that 0.1% was used. An ointment containing sirolimus (Reference Example 2) was prepared.
  • the transwell was moved onto an assay tray to which a medium (TESTSKIN (registered trademark) LSE (registered trademark) ASSAY MEDIUM (TOYOBO)) was added, and incubated in an incubator for 24 hours.
  • the temperature in the incubator was 37 ° C. and the concentration of CO 2 was 5%.
  • the external medicine on the surface of the transwell was wiped off with filter paper, and this surface was further washed with a medium. Thereby, the external medicine remaining on the surface was removed.
  • the transwell was placed on a heat tray with a wrap.
  • the temperature of the heat tray was set to 60 ° C., and the transwell was heated for 60 seconds to 90 seconds.
  • the tissue was removed from the transwell.
  • the epidermis was removed from the tissue, and then the dermis layer was collected.
  • the collected dermis layer was placed in an Eppendorf tube.
  • the concentration of sirolimus in the dermis layer was measured using an LC / ESI / MS system.
  • LC / ESI-MS system HPLC P4000, AS3000mostthermostat (Thermo Fisher KK, San Jose, CA, USA) was used.
  • LCQSIFinigan Mat (Thermo Fisher KK, San Jose, CA, USA) was used as a detector for ESI / MS.
  • HTC-Pal AMR Inc., Tokyo, Japan
  • X caliber ver1.2 Thermo Fisher KK, San Jose, CA, USA was used for data analysis.
  • the test method described above was performed three times for each topical drug, and the average value and standard deviation of the concentration of sirolimus in the dermis layer were calculated. Whether or not there was a statistically significant difference in the results of the tests obtained using each topical drug was confirmed by calculating the p-value using an unpaired student t test. A p-value less than 0.05 was considered statistically significant.
  • FIG. 2 shows the results of a test using gel 2, gel 3, ointment 2, and ointment 3.
  • the concentration of sirolimus in the dermis is 1.823 ⁇ 0.146 ng / mg
  • the concentration of sirolimus is 1.073 ⁇ 0.199 ng / mg
  • the concentration of sirolimus in the dermis is 1.087 ⁇ 0.073 ng / mg
  • the concentration of sirolimus in the dermis was 0.26 ⁇ 0.098 ng / mg.
  • the p value between the gel 2 and the ointment 2 was less than 0.05, and it was confirmed that there was a significant difference between the gel 2 and the ointment 2.
  • the p value between the gel 3 and the ointment 3 was less than 0.05, and it was confirmed that there was a significant difference between the gel 3 and the ointment 3. . From these results, it was found that the gel penetrates the skin more efficiently than the ointment. This is considered to be because sirolimus was dissolved in a solvent (isopropanol) when producing the gel.
  • an ointment for lesions with a lot of wrinkles, good absorption of external medicine, and easy to receive irritation (such as atopic dermatitis). It is considered preferable to use a gel for (eg, vitiligo).
  • the p value between gel 2 and gel 3 was less than 0.05, and it was confirmed that there was a significant difference between gel 2 and gel 3.
  • the p value between the ointment 2 and the ointment 3 is less than 0.05, and it was confirmed that there is a significant difference between the ointment 2 and the ointment 3. . From these results, it was found that the external preparation prepared using the reagent sirolimus can penetrate sirolimus into the skin more efficiently than the external preparation prepared using the tablet sirolimus. Therefore, it was found that a more effective external medicine can be prepared by using the reagent sirolimus.
  • the amount of sirolimus absorbed into the skin of the ointment 3 prepared using Rapamune and the ointment 2, ointment 4, ointment 5 and ointment 6 prepared using the reagent of sirolimus were applied to the skin of the mouse several times.
  • these ointments were applied to mouse skin twice a week for 4 weeks. After 4 weeks, the skin of the mouse was collected, and the amount of sirolimus in the skin was measured using the LC-ESI / MS method.
  • the external medicine prepared using the reagent sirolimus is more efficient than the external medicine prepared using the tablet sirolimus.
  • the result was that it could penetrate into the skin well.
  • the ointment 2 prepared using the sirolimus reagent is absorbed into the dermis by the application to the skin of the mouse a plurality of times, and the amount of the ointment 3 prepared using the sirolimus tablet is absorbed into the dermis. It turns out that it can approach the quantity.
  • sirolimus in a tablet, it can be said that a sufficient amount of sirolimus to treat the disease can be delivered to the affected area by applying it multiple times. This is not only true for ointments, but also for gels.
  • ⁇ Test method> The patients with tuberous sclerosis were divided into a group of patients treated with the ointment 3 (4 people) and a group of patients treated with the gel 3 (8 people).
  • the above-mentioned external medicine was applied twice a day for 12 weeks. Specifically, a topical drug is applied to either the left or right vascular fiber type of the patient's face, and only the base (control) containing no active ingredient (sirolimus) is applied to the other hemangiofibroma. did. Treatment was discontinued 12 weeks after the start of treatment. Then, the follow-up of the angiofibroma was observed for 3 months after the treatment was stopped. Note that one of the patients treated with Gel 3 was excluded during the study because he did not properly perform the topical application as determined.
  • angiofibroma was taken to evaluate the angiofibroma. Assessment of hemangiofibroma was performed by assigning a four-point score with a degree of flushing, reduction of papules, and flattening of the aspect, and a comprehensive perspective (overall score).
  • the score is 0, and if the flushing is improved 49% compared to before the start of the treatment, the score is set to 1.
  • the score is 0 when the papules are not reduced compared to before the start of treatment, and the score is 1 when papules are reduced by 49% compared to before the start of treatment.
  • the score was 2 when papule was reduced by more than 80% compared to before the start of treatment, the score was 3.
  • the score is 0; if the aspect is flattened 49% compared to before the start of treatment, the score is 1; The score was 2 when the aspect was flattened by 50-80% compared to before the start of treatment, and the score was 3 when flattened by 80% or more.
  • FIGS. 3 to 5 show photographs of angiofibromas before the start of treatment with gel 3 and 12 weeks after the start of the treatment. As shown in FIGS. 3-5, Gel 3 was applied to the angiofibroma of the patient's left cheek and a control was applied to the angiofibroma of the patient's right cheek.
  • FIG. 3 (a), FIG. 4 (a), and FIG. 5 (a) are photographs showing an angiofibroma before the start of treatment using the gel 3
  • FIG. 4 (b) and FIG. 5 (b) are photographs showing hemangiofibroma 12 weeks after the start of the treatment using the gel 3.
  • FIG. FIGS. 3C and 3D are enlarged views of the left cheek of FIGS. 3A and 3B, respectively. As can be seen by comparing (a) and (b) in FIG. 3, (c) and (d) in FIG. 3, (a) and (b) in FIG. 4, and (a) and (b) in FIG. In addition, the angiofibroma coated with the gel 3 improved, but the angiofibroma coated with the control did not change.
  • FIGS. 6 to 7 show photographs of angiofibromas before the start of treatment using ointment 3 and 12 weeks after the start of treatment.
  • ointment 3 was applied to the angiofibroma of the patient's left cheek, and a control was applied to the angiofibroma of the patient's right cheek.
  • ointment 3 was applied to the angiofibroma on the right cheek of the patient, and control was applied to the angiofibroma on the left cheek of the patient.
  • FIG. 6 (a) and FIG. 7 (a) are photographs showing angiofibromas before the start of treatment with the ointment 3
  • FIG. 6 (b) and FIG. 7 (b) are ointments.
  • 3 is a photograph showing hemangiofibroma 12 weeks after the start of treatment with 3
  • 6 (c) and 6 (d) are enlarged views of the left cheek of FIGS. 6 (a) and 6 (b), respectively.
  • FIG. 8 is a graph showing the score of each patient 12 weeks after treatment with Gel 3 or control.
  • (A) of FIG. 8 is a graph showing an overall score
  • (b) is a graph showing a flushed score
  • (c) is a graph showing a papule score
  • (d) is a graph showing a papule score. It is a graph which shows the score of an aspect. The score obtained by application of gel 3 is shown on the left side of FIGS. 8A to 8D, and the score obtained by application of control is shown on the right side of FIG.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are 4, 4, 4, 3 when gel 3 is used, respectively. , And 3.75, both of which were 0 when the control was used.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are 4, 4, 4, and 4 when gel 3 is used, respectively. 3 and 3.75, both of which were 0 when the control was used.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are 3, 3, 4, 2 and 3, both were 0 when the control was used.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are all 4 when gel 3 is used, All were 0 when the control was used.
  • FIG. 9 is a graph showing the score of each patient 12 weeks after the treatment using the ointment 3 or the control.
  • (A) of FIG. 9 is a graph showing an overall score
  • (b) is a graph showing a flushing score
  • (c) is a graph showing a papule score
  • (d) is It is a graph which shows the score of an aspect. The score obtained by applying the ointment 3 is shown on the left side of FIGS. 9A to 9D, and the score obtained by applying the control is shown on the right side of FIG.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4 and patient 1 to patient 4 are 4, 4, 2, 1 when ointment 3 is used, respectively. .5 and 2.9, both of which were 0 when the control was used.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are 4, 4, 2, when ointment 3 is used, respectively. 1.5 and 2.9, both were 0 when the control was used.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are 3, 1.5, when ointment 3 is used, respectively. 1, 1, and 1.7, and all were 0 when the control was used.
  • the average scores of patient 1, patient 2, patient 3, patient 4, and patient 1 to patient 4 are 4, 4, 2, when ointment 3 is used, respectively. 1.5 and 2.9, both were 0 when the control was used.
  • the blood of the patient was collected before the start of treatment using the gel 3 or the ointment 3 and after the end of the treatment (12 weeks after the treatment), a blood test was performed, and the components in the blood were measured.
  • the results of blood tests performed on patient 1 and patient 2 are shown in the following table.
  • WBC white blood cell count.
  • RBC red blood cell count.
  • Hb hemoglobin amount.
  • Ht indicates hematocrit.
  • Plat indicates platelets.
  • Neuro indicates neutrophils.
  • Lym indicates lymphocytes.
  • Eo indicates eosinophils.
  • Bo indicates a basophil.
  • Cr represents creatinine.
  • AST refers to aspartate aminotransferase.
  • ALT refers to alanine aminotransferase.
  • ⁇ GTP refers to gamma glutamyl transferase.
  • Tch1 indicates total cholesterol.
  • TG indicates triglyceride.
  • Glu indicates blood glucose.
  • CRP refers to C-reactive protein.
  • each blood component of each patient did not change significantly before the start of treatment and 12 weeks after the start of treatment.
  • the external preparation of the present invention can effectively treat tuberous sclerosis hemangiofibroma without causing side effects. This indicates that the external preparation of the present invention is also effective against other skin tumors (for example, benign tumors of the skin) based on dysregulation of mTOR. Moreover, it was shown that the external medicine of the present invention penetrated into the dermis by treating facial angiofibroma of tuberous sclerosis.
  • vitiligo using the external preparation of the present invention One of the causes of vitiligo is caused by the fact that melanocytes do not produce melanin. Proteins involved in the production of melanin in melanocytes are MITF, TYR, DCT, TYRP1.
  • vitiligo often occurs in patients suffering from diseases (such as tuberous sclerosis) resulting from activation of mTOR.
  • diseases such as tuberous sclerosis
  • the present inventors consider that the mechanism by which vitiligo occurs in such patients is as follows. As a result of activation of mTOR in the patient's melanocytes, the activity of S6K1 increases. And by this increase in the activity of S6K1, the activity of PI3K is suppressed. Since PI3K not only activates the Akt signaling pathway, but also activates the MAPK signaling pathway, suppression of PI3K activity suppresses the Akt signaling pathway and the MAPK signaling pathway.
  • MITF When MITF is not expressed or the activity of MITF is decreased, the activity of TYR and TYRP1 is decreased, and melanin is not produced in melanocytes. In this way, vitiligo occurs.
  • the present inventors considered that the activation of mTOR is involved in the occurrence of vitiligo, and therefore the external preparation of the present invention is effective for the treatment of vitiligo. Therefore, in this example, the following test was performed to examine the influence of sirolimus on the expression of the above-described protein, and it was confirmed that activation of mTOR was involved in the occurrence of vitiligo. And the effect with respect to the vitiligo of the external preparation of this invention was confirmed.
  • Sirolimus is added at a final concentration of 0 nM (ie, sirolimus is not added to the medium), 1, 10 and 20 nmol / L sirolimus is added to the wells, respectively, and the plate is placed at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours Or incubated for 48 hours.
  • RNA-lysis buffer 175 ⁇ L was added to the well from which PBS was removed. This RNA-lysis buffer was included in the SV-Total-RNA Solution System kit (Promega, Z3105).
  • the melanocytes were peeled off from the plate using a cell scraper.
  • RNA lysis buffer containing melanocytes was collected in a 1.5 mL Eppendorf tube. And RNA was extracted from the collect
  • RNA Using this RNA, real-time RT-PCR was performed to detect the expression of MITF mRNA, TYR mRNA, TYRP1 mRNA, and GAPDH mRNA.
  • the expression levels of MITF mRNA, TYR mRNA, and TYRP1 mRNA were calculated as relative expression levels relative to the GAPD mRNA expression level.
  • TagMan registered trademark Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Hs00165156_m1) was used.
  • TYR mRNA TagMan (registered trademark) Gene® Expression® Assays (Applied® biosystems, Hs00165976_m1) was used.
  • TYRP1 mRNA TagMan (registered trademark) Gene® Expression® Assays (Applied® biosystems, Hs00167051_m1) was used.
  • GAPDH TagMan (registered trademark) Gene® Expression® Assays (Applied® biosystems, Hs99999905_m1) was used.
  • FIG. 10 is a graph showing the average value and standard deviation of the relative expression level of MITF mRNA.
  • “1” in FIG. 10 indicates melanocytes incubated for 24 hours without treatment with sirolimus
  • “2” means melanocytes treated with 1 nM sirolimus for 24 hours
  • “3” indicates 20 nM Means melanocytes treated with sirolimus for 24 hours
  • “4” means melanocytes incubated for 48 hours without being treated with sirolimus
  • “5” means melanocytes treated with 1 nM sirolimus for 48 hours.
  • “6” means melanocytes treated with 20 nM sirolimus for 48 hours.
  • the relative expression level of MITF mRNA in “2” and “3” is significantly higher than the relative expression level of MITF mRNA in “1”.
  • the relative expression level of MITF mRNA in “5” and “6” is significantly higher than the relative expression level of MITF mRNA in “4”. Therefore, it was confirmed that treatment of melanocytes with 1 nM or 20 nM sirolimus for 24 hours or 48 hours increased the expression level of MITF mRNA.
  • FIG. 11 and FIG. 12 are graphs showing the average value and standard deviation of the relative expression levels of TYR and TYRP mRNA, respectively.
  • “1” in FIGS. 11 and 12 indicates melanocytes incubated for 24 hours without treatment with sirolimus
  • “2” indicates melanocytes treated with 1 nM sirolimus for 24 hours
  • “3” indicates Means melanocytes treated for 24 hours with 20 nM sirolimus
  • “4” means melanocytes treated for 48 hours without being treated with sirolimus
  • “5” treated for 48 hours with 1 nM sirolimus It means melanocyte
  • “6” means another melanocyte treated with 20 nM sirolimus for 48 hours.
  • the relative expression level of TYR is 0.640 ⁇ 0.036, and at “2”, the relative expression level of TYR is 0.820 ⁇ 0.047.
  • the relative expression level of TYR is 0.921 ⁇ 0.029, and in “4”, the relative expression level of TYR is 0.771 ⁇ 0.009.
  • the relative expression level of TYR was 0.760 ⁇ 0.044, and in “6”, the relative expression level of TYR was 0.858 ⁇ 0.022.
  • the relative expression level of TYRP is 1.031 ⁇ 0.027, and in “2”, the relative expression level of TYRP is 1.333 ⁇ 0.055.
  • the relative expression level of TYRP is 1.652 ⁇ 0.031, and in “4”, the relative expression level of TYRP is 1.338 ⁇ 0.029.
  • the relative expression level of TYRP was 1.450 ⁇ 0.028, and in “6”, the relative expression level of TYRP was 1.514 ⁇ 0.124.
  • TYR the expression level of TYR was increased by treating melanocytes with 1 nM or 20 nM sirolimus for 24 hours or treating melanocytes with 20 nM sirolimus for 48 hours.
  • FIG. 12 it was confirmed that the expression level of TYRP was increased by treating melanocytes with 1 nM or 20 nM sirolimus for 24 hours or 48 hours.
  • Melanocytes (melanocytes derived from two normal persons (hereinafter referred to as melanocyte 1 and melanocyte 2)) were seeded on 6 wells. The number of melanocytes was 2 ⁇ 10 5 per well, and medium 254 / HMGS2 (PMA ( ⁇ ) (no antibiotics) was used as the medium.
  • sirolimus was added to each well so as to be 0 nM, 1 nM, or 10 nM, and culture was performed for 4 days.
  • the pellet (melanocyte) was suspended in 1 mL of PBS. Using 30 ⁇ L of the suspension, the number of melanocytes in the suspension was counted.
  • the remaining 970 ⁇ L of the suspension was centrifuged at 1500 rpm and 4 ° C. for 5 minutes.
  • the solution was centrifuged at 16000 g for 20 minutes, and then the absorbance of the supernatant at 400 nm was measured. At the same time, the absorbance of the standard was also measured.
  • melanin-containing NaOH 1 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL. Standard curves were generated by measuring the absorbance at 400 nm of various concentrations of melanin-containing NaOH.
  • FIG. 13 shows a photograph (a) of vitiligo before the start of application of gel 3, and a photograph (b) of vitiligo 6 weeks after the start of application of gel 3.
  • FIG. 14 the photograph (a) of the vitiligo before the application start of the ointment 3 and the photograph (b) of the vitiligo 6 weeks after the application start of the ointment 3 are shown.
  • the arrows in FIGS. 13 and 14 indicate vitiligo.
  • FIG. 13B and FIG. 14B the vitiligo shown in FIG. 13A disappears.
  • the papules and red aspect are also relieved. Therefore, it was shown that vitiligo can be treated by applying gel 3 or ointment 3.
  • the gel 3 or the ointment 3 was applied twice a day for 3 months to vitiligo that developed in the forehead (exposed area) or vitiligo that developed in the abdomen (non-exposed area).
  • Vitiligo symptoms were determined with a spectrocolorimeter (spectral colorimeter manufactured by Konica Minolta, Inc .: M-2600d) where vitiligo had developed, and the transition of vitiligo symptoms was confirmed.
  • FIG. 25 shows data of four patients with vitiligo on the forehead (exposed part), and FIG. 26 shows data of four patients with vitiligo on the abdomen (non-exposed part). Show.
  • the vitiligo became smaller with time in any patient. That is, it has been clarified that the external preparation of the present invention has a therapeutic effect on vitiligo that has developed in various parts of the body. Moreover, it became clear that the external medicine of this invention has a higher therapeutic effect with respect to the vitiligo developing in the forehead part (exposed part) than the vitiligo developing in the abdomen (non-exposed part).
  • Tacrolimus or pimecrolimus is used as a treatment for atopic dermatitis. It is known that the effect on atopic dermatitis such as tacrolimus is exhibited by binding tacrolimus or the like to FKBP12 (immunophilin) and suppressing calcineurin. However, tacrolimus has a side effect of causing tumors.
  • sirolimus binds to FKBP12 like tacrolimus, but suppresses mTOR rather than calcineurin.
  • sirolimus and tacrolimus have different molecules to be suppressed. It is known that suppression of mTOR by sirolimus suppresses inflammation via mast cells. Furthermore, by suppressing mTOR, antitumor effects such as suppression of cell proliferation and induction of apoptosis are also exhibited.
  • the present inventors considered that the external preparation of the present invention is effective for the treatment of atopic dermatitis. Unlike the tacrolimus and the like, the topical drug of the present invention does not cause a tumor, and thus can be a safer therapeutic drug for atopic dermatitis. Therefore, in this example, the following test was performed to confirm the effect of the external preparation of the present invention on atopic dermatitis.
  • ⁇ Test method> Atopic dermatitis was induced on the skin of the back of the mouse by applying an ointment containing the mite antigen (Biosta AD, manufactured by Biosta, Inc., AD001) for 2 weeks. Specifically, the back hair of the mouse was shaved to expose the back skin. Then, the ointment containing the antigen of mite is applied to the ointment application start date (day 0), and from the application start date, 4, 7, 11, 14, 18, 21 On day and day 25, it was applied to the exposed skin of the back.
  • an ointment containing the mite antigen Biosta AD, manufactured by Biosta, Inc., AD001
  • the ointment 2 On the 13th day from the start of application of the ointment containing the mite antigen, the ointment 2, the ointment identical to the ointment 2 except that it does not contain sirolimus (control), and 0.1% by mass of tacrolimus (Protopic (registered trademark) ointment 0.1%, positive control) was applied to the site of the skin where atopic dermatitis was induced twice a week for 2 weeks. Specifically, these ointments were applied to the skin site on the 13th, 17th, 20th, 24th and 27th days, respectively. On day 0, day 7, day 13, day 14, day 17, day 21, day 24, and day 28, the site of the skin to which the ointment was applied was observed, and atopic dermatitis Evaluation was performed.
  • sirolimus control
  • tacrolimus Protopic (registered trademark) ointment 0.1%, positive control
  • the evaluation of atopic dermatitis was performed by assigning 4 grade scores to the degree of erythema, edema and wrinkles.
  • the score is 0 if the erythema has not changed compared to before the start of treatment, the score is 1 for mild erythema, the score is 2 for moderate erythema, and severe. In the case of erythema, the score was 3. For edema, the score is 0 if edema has not changed compared to before the start of treatment, the score is 1 for mild edema, the score is 2 for moderate edema, and severe edema In this case, the score was 3.
  • the score is 0 if the hemorrhoids have not changed compared to before the start of treatment, the score is 1 for mild hemorrhoids, the score is 2 for moderate hemorrhoids, and severe hemorrhoids In this case, the score was 3. The total score of erythema, edema and wrinkles was taken as the overall score.
  • the mouse On day 28, the mouse was killed and a picture of the back of the mouse was taken. Moreover, the skin which induced atopic dermatitis was extract
  • FIG. 15 is a graph showing the overall score in each of three mice at each time point of treatment with the ointment described above.
  • A) of FIG. 15 is a graph which shows the comprehensive score in each mouse
  • (b) is a graph which shows the comprehensive score in each mouse
  • FIG. (C) is a graph showing an overall score in each mouse when a negative control was used. “A” to “I” in (a) to (c) of FIG. 15 indicate the mice used in the test. In (a) to (c) of FIG.
  • “1” to “5” on the horizontal axis indicate the start of treatment (day 0), the seventh day from the start of treatment, the 14th day from the start of treatment, The 21st day from the start of the treatment and the 28th day from the start of the treatment are shown.
  • the score of A's mouse is 0, 2, 4.5, 7.5, and 5.5, respectively.
  • the mouse scores were 0, 4, 7.5, 7.5, and 5, respectively, and the C mouse scores were 0, 2.5, 7.5, 7.5, and 4, respectively.
  • the scores of D mice are 0, 3, 8, 8.5, and 7.5, respectively.
  • the mouse scores were 0, 4.5, 5.5, 5.5, and 4.5, respectively, and the F mouse scores were 0, 2, 6, 5, and 5, respectively.
  • the scores of G mice are 0, 4, 5, 6, and 7.5, respectively. Scores were 0, 5.5, 7, 9, and 8.5, respectively, and I scores were 0, 3.5, 6.5, 7, and 8, respectively.
  • FIG. 16 shows the average value ( ⁇ ) of each score shown in (a) of FIG. 15, the average value (square) of each score shown in (b) of FIG. 15, and (c) of FIG. It is a graph which shows the average value (diamond) of each score.
  • the scores of mice using ointment 2 are 0, 3.16, 6.5, 6.3, and 5.66, respectively.
  • the scores for mice with positive controls were 0, 2.83, 6.5, 7.5, and 4.83, respectively, and the scores for mice with controls were 0, 4.33, 6 respectively. .16, 7.33, and 8.
  • FIG. 17 shows photographs of the backs of mice ((a) to (d)), photographs of skin sections stained with hematoxylin-eosin ((e) to (h)), and sections of skin stained with toluidine blue.
  • the photographs ((i) to (l)) are shown.
  • (a), (e) and (i) are photographs of an untreated mouse in which neither the ointment containing the mite antigen nor the above-mentioned external medicine was applied
  • (f) And (j) are photographs of mice coated with the tick antigen and the control
  • (c) (g) and (k) represent the ointment containing the mite antigen and the ointment 2 above.
  • FIG. 17 (D), (h) and (l) are photographs of mice applied with an ointment containing a tick antigen and a positive control.
  • the epidermis is indicated by an arrow
  • cells to the dermis are indicated by an arrowhead.
  • the mast cell is indicated by an arrow.
  • FIG. 17 (a) to (d) are compared, and erythema, edema, and wrinkles have occurred in the mice to which the ointment containing mite antigen was applied (atopic dermatitis has developed). It can be seen that mice to which ointment 2 or positive control was applied had reduced levels of erythema, edema and wrinkles compared to mice to which negative control was applied.
  • FIG. 17 (e) to (h) are compared, in the mice to which the negative control was applied, there was a marked infiltration of cells into the dermis compared to the untreated mice. On the other hand, mice to which ointment 2 or positive control was applied had less cell infiltration into the epidermis than mice to which negative control was applied.
  • FIG. 17 (i) to (l) are compared, the mast cell infiltration that is not seen in untreated mice is observed in the mice to which the negative control was applied.
  • mice with ointment 2 or positive control have less mast cell infiltration as seen in mice with negative control.
  • Erythema is an active site of angiogenesis. It is known that such erythema often occurs in patients suffering from diseases (such as tuberous sclerosis) resulting from activation of mTOR. The present inventors considered that the mechanism by which erythema occurs in such diseases is as follows.
  • HIF1 ⁇ As a result of the activation of mTOR in the cells of the patient, the activity of HIF1 ⁇ increases, and the activated HIF1 ⁇ forms a heterodimer with HIF1 ⁇ .
  • This heterodimer binds to the HRE sequence of DNA, thereby inducing VEGF transcription and increasing VEGF expression.
  • Angiogenesis is caused by the expressed VEGF. In this way, erythema occurs.
  • the present inventors considered that the activation of mTOR is involved in the occurrence of erythema, and thus the external preparation of the present invention is effective for the treatment of erythema. Therefore, in this example, the following tests were conducted to find out that VEGF is expressed in cells of patients with tuberous sclerosis and that sirolimus suppresses the expression of VEGF. And the effect with respect to the erythema of the patient of tuberous sclerosis of the external preparation of this invention was confirmed.
  • Hemangiofibroma cells are the primary primary culture method of fibroblasts (Toshio Kuroki et al .: New culture cell experiment method for molecular biology research, experimental medicine, separate volume, BioManual UP series, 2nd revised edition, sheep soil Isolated from the face of each patient. All cells obtained from patients were used after obtaining patient consent.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FIG. 18 The result of the test described above is shown in FIG. In FIG. 18, A shows severe hemangiofibroma cells, B shows moderate hemangiofibromas cells, and C shows mild hemangiofibromas cells.
  • the concentration of VEGF when using severe angiofibroma cells is 468.857 pg / mL
  • the concentration of VEGF when using moderate angiofibroma cells is 260.85. 286 pg / mL
  • the concentration of VEGF using mild hemangiofibromatous cells is 147.429 pg / mL.
  • VEGF is expressed in hemangiofibroma cells, and the VEGF expression level increases as the symptom of hemangiofibroma increases.
  • Angiofibroma cells, human fibroblasts, and HaCat isolated from patients with tuberous sclerosis were used. Isolation of hemangiofibroma cells was performed using the primary culture method described above after excising hemangiofibroma from a patient desiring to excise the hemangiofibroma.
  • Human fibroblasts were obtained from tissue of patients who were not tuberous sclerosis (TSC) using the primary culture method described above.
  • TSC tuberous sclerosis
  • HaCat was purchased from the German Cancer Research Center (dkfz). All cells obtained from patients were used after obtaining patient consent.
  • Hemangiofibroma cells, human fibroblasts, and HaCat were cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 using DME medium. During the cultivation of these cells, sirolimus was added to the medium to a final concentration of 0 nM (ie, sirolimus was not added to the medium (control)), 1 nM, 10 nM or 20 nM. Again, the cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was collected 48 hours or 72 hours after the addition of sirolimus. The concentration of VEGF in the collected culture supernatant was measured using a kit for detecting VEGF (Quantikine (registered trademark) Human VEGF, manufactured by R & D SYSTEMS (registered trademark)).
  • VEGF Quantantikine (registered trademark) Human VEGF, manufactured by R & D SYSTEMS (registered trademark)
  • FIG. 19 (a) is a graph showing the concentration (pg / mL) of VEGF in the culture supernatant 48 hours after sirolimus was added during the culture of hemangiofibroma cells.
  • B of FIG. 19 shows VEGF in the culture supernatant 72 hours after sirolimus was added during the culture of HaCat, human fibroblasts (normal fibro), and hemangiofibroma cells (TSC AF fibro). It is a graph which shows the density
  • FIG. 19 (c) shows the percentage reduction in the concentration of VEGF caused by treatment of these three types of cells with sirolimus (ratio: concentration of VEGF after treatment with 20 nM sirolimus / treatment with 20 nM sirolimus). It is a graph which shows the density
  • FIG. 19 (d) is a graph showing the concentration (pg / mL) of VEGF in the culture supernatant 48 hours after sirolimus was added during the HaCat culture.
  • the concentration of VEGF was 260.2857 pg / mL, and the angiofibroma cells were treated with 1 nM sirolimus. In this case, the concentration of VEGF was 113.428 pg / mL, and when the angiofibroma cells were treated with 10 nM sirolimus, the concentration of VEGF was 92.4285 pg / mL.
  • FIG. 19 (a) shows that the amount of VEGF expressed decreases as the sirolimus concentration increases.
  • FIG. 19 (c) is a graph showing the result of dividing the concentration of VEGF when the cells were treated with 20 nM sirolimus shown in FIG. 19 (b) by the concentration of VEGF when the cells were not treated with sirolimus. is there. As shown in FIG. 19 (c)
  • FIG. 19 (d) shows that the VEGF expression level decreases as the sirolimus concentration increases.
  • Fig. 29 shows the measurement results. As is clear from FIG. 29, the expression level of HIF1 ⁇ was decreased in melanocytes treated with sirolimus.
  • the ointment 3 was applied to the erythema of a patient with tuberous sclerosis twice a day for 12 weeks.
  • FIG. 20 the photograph (a) of the erythema before the application start of the ointment 3 and the photograph (b) of the erythema 12 weeks after the application start of the ointment 3 are shown.
  • the arrow in FIG. 20 indicates erythema.
  • FIG. 20B the erythema shown in FIG. 20A has disappeared. Therefore, it was confirmed that erythema can be treated by applying ointment 3.
  • the topical medicine of the present invention is effective against rosacea that is also actively vascularized.
  • Propylene carbonate was colored blue. Next, colored propylene carbonate was added to a mixture of liquid paraffin, solid paraffin and white petrolatum, which are components of the ointment prepared in this example. As a control, colored propylene carbonate was added to white petrolatum. When colored propylene carbonate was added to the above mixture, the propylene carbonate became fine particles and precipitated as shown in the reagent bottle on the left side of FIG. On the other hand, when colored propylene carbonate was added to white petrolatum, propylene carbonate precipitated without forming fine particles as shown in the reagent bottle on the right side of FIG.
  • the mixture in which colored propylene carbonate was precipitated was stirred at 2000 rpm for 1 minute at room temperature using a rotating and rotating mixer, then stirred at 1000 rpm for 5 minutes, and then stirred at 500 rpm for 3 minutes.
  • the same operation was performed on white petrolatum in which colored propylene carbonate was precipitated.
  • the result of stirring is shown in FIG.
  • the left reagent bottle shows the result of stirring the mixture in which the colored propylene carbonate was precipitated
  • the right reagent bottle shows the result of stirring the white petrolatum in which the colored propylene carbonate was precipitated.
  • the propylene carbonate particles are larger than the case when propylene carbonate is stirred with the above mixture. I can confirm.
  • FIG. 22 (a) is a micrograph of an ointment prepared using the mixture
  • FIG. 22 (c) is an enlarged view of FIG. 22 (a)
  • FIG. 22 (b) is a photomicrograph of an ointment prepared using white petrolatum
  • FIG. 22 (d) is an enlarged view of FIG. 22 (b).
  • the bars in (c) and (d) of FIG. 22 indicate 25 ⁇ m.
  • propylene carbonate particles are indicated by arrows
  • water (black) is indicated by arrows.
  • propylene carbonate is dispersed as uniform fine particles of 10 ⁇ m or less in the ointment.
  • propylene carbonate is dispersed in fine particles of various sizes in the ointment and is not uniform. .
  • sirolimus is considered to be dispersed as uniform fine particles in the ointment prepared in this example.
  • sirolimus is dispersed as uniform fine particles, by applying the ointment prepared in this example to the skin, the absorption of sirolimus from the skin to the affected area is significantly improved, and sirolimus is in the blood. It is thought that it stays in the affected part without leaking into the body.
  • ⁇ Preparation Example 8 Preparation of gel containing 0.2% by mass of sirolimus> A gel (gel 5) containing 0.2% by mass of sirolimus was prepared in the same manner as in Preparation Example 7, except that Rapamune was used instead of the sirolimus reagent. Specifically, 2 mg of Rapamune tablets were crushed and passed through a 75 ⁇ m mesh to remove impurities (excipients, etc.), and then the pulverized product was dissolved in 145 mg of isopropanol.
  • ⁇ Preparation Example 9 Preparation of ointment containing 0.2% by mass of sirolimus> 2 mg of a sirolimus reagent (Calbiochem, 553210) was dissolved in 58 mg of propylene carbonate (Wako Pure Chemical Industries, 168-04972). Solid paraffin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 415-25791) 45 mg and white petrolatum (propeto) (Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd., Merck Co., Ltd. or Astra Japan Co., Ltd.) 895 mg are heated to 70 ° C. and dissolved. And mixed.
  • ⁇ Preparation Example 10 Preparation of an ointment containing 0.2% by mass of sirolimus> 2 mg of a sirolimus reagent (Calbiochem, 553210) was dissolved in 50 mg of propylene carbonate (Wako Pure Chemical Industries, 168-04972). Liquid paraffin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 128-04375) 10 mg, solid paraffin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 415-25791), and white petrolatum (propet) (manufactured by Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd., Merck) 895 mg or Astra Japan Co., Ltd.) was mixed while heating to 70 ° C. and dissolving.
  • Liquid paraffin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 128-04375
  • solid paraffin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 415-25791
  • white petrolatum propet
  • FIG. 30 shows the results of the test described above, and Table 2 shows actual numerical data of the test.
  • FIG. 31 shows the results of the test described above, and Table 3 shows the actual numerical data of the test.
  • FIG. 32 shows the result of combining the test results of gels 2 to 5 described in (Test method and test result-1) and (Test method and test result-2) described above into one graph.
  • the present invention can treat skin diseases locally. Therefore, it can be used not only in the pharmaceutical industry of the present invention but also in the cosmetics industry.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

　本発明の外用薬は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有しているゲル組成物または軟膏組成物を含んでいるものであって、これによって、副作用を引き起こすことなく、皮膚疾患を処置するに十分な量のシロリムスを患部へ吸収させることが可能な外用薬を提供する。

Description

皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法
　本発明は、皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法に関する。
　近年、生活環境などの変化に伴って、皮膚疾患の発症が増加している。皮膚疾患を治療するためには、皮膚疾患の発症の分子メカニズムを知ることが重要である。バイオテクノロジーを駆使した、皮膚疾患の発症の分子メカニズムの研究が行われており、これまでに、種々の皮膚疾患の原因遺伝子が特定されている。
　例えば、結節性硬化症（ＴＳＣ）と呼ばれる遺伝病が知られている。この遺伝病は、皮膚腫瘍などの全身性の腫瘍に加えて、中枢神経障害（てんかん、精神発達の遅延、自閉症など）および白斑を生じる疾患である。この遺伝病の原因遺伝子は、ｈａｍａｒｔｉｎタンパク質をコードするＴＳＣ１、およびｔｕｂｅｒｉｎタンパク質をコードするＴＳＣ２であることが知られている。ｈａｍａｒｔｉｎタンパク質およびｔｕｂｅｒｉｎタンパク質の複合体は、ｍＴＯＲの上流に位置しており、ｍＴＯＲの機能を抑制している。ｈａｍａｒｔｉｎタンパク質およびｔｕｂｅｒｉｎタンパク質の少なくとも１つが機能しなくなることによってｍＴＯＲに対する抑制が消失し、その結果として、結節性硬化症が発症すると考えられている。このようなメカニズムによって発症する結節性硬化症の治療には、ｍＴＯＲの抑制が有効であり、ｍＴＯＲの阻害剤であるシロリムスを用いることが試みられている。
　海外では、結節性硬化症の患者の脳腫瘍、腎腫瘍および肺腫瘍を治療する目的で、シロリムスがこの患者に対して全身性に投与されており、良好な治療成績が得られたことが報告されている。しかし、シロリムスの投与を中止すると、上述した腫瘍が再び増大したことが確認されたので、腫瘍の縮小化を維持するにはシロリムスの全身性投与を長期間続けることが必要であると考えられている。この結果は、脳腫瘍、腎腫瘍および肺腫瘍だけでなく、皮膚腫瘍に対しても当てはまり、この皮膚腫瘍を治療するには、シロリムスの全身性投与を長期間にわたって行うことが必要である。
　しかし、シロリムスの全身性投与は副作用を引き起こすという欠点があり、長期間続けることが困難である。そこで、副作用を引き起こすことなく結節性硬化症の皮膚腫瘍を治療するために、シロリムスを皮膚腫瘍に対して局所的に適用することが考えられており、シロリムスの外用薬の開発が行われている（非特許文献１～３参照）。非特許文献１および２には、結節性硬化症の患者の顔に形成されている血管線維腫に、シロリムスの外用薬を塗布することが記載されている。非特許文献３には、結節性硬化症の動物モデルにおける皮膚腫瘍に、シロリムスを含んでいる軟膏を塗布することが記載されている。
　また、結節性硬化症の皮膚腫瘍以外の皮膚疾患を、シロリムスの外用薬を用いて治療することも試みられている（非特許文献４および５参照）。非特許文献４には、ヒトの尋常性乾癬に、シロリムスを含んでいる処方物を塗布することが記載されている。非特許文献５には、ヒトのポートワイン母斑に、シロリムスを局所的に適用することが記載されている。
　また、シロリムスなどのマクロライドを、様々な形態にて患者に投与使用とする試みもなされている（特許文献１および非特許文献６参照）
日本国公表特許公報「特表２００８－５３３１５３（２００８年８月２１日公表）」
Anna K. Haemel, et. al., Arch Dermatol. Jul;146(7):715-8, 2010 Elizabeth Kaufman Mcnamara, et. al., Journal of Dermatological Treatment, Early Online, 1-3, 2010 Aubrey Rauktys, et. al., BMC Dermatology, 8:1, 2008 A. D. Ormerod, et. al., British Journal of Dermatology, 152, p.758-764, 2005 Thuy L. Phung, et. al., Lasers in Surgery and Medicine 40:1-5, 2008 第６１回日本皮膚科学会　要旨集、２０１０年９月１１日
　一般的に、外用薬に用いられる化合物は、分子量が大きいと、分子サイズが大きくなったり、拡散性が低下したりするので、該化合物の皮膚からの吸収が低下することが知られている（大谷道輝、ぬり薬の薀蓄、Ｖｏｌ．　２、ｍａｒｕｈｏ、マルホ株式会社、第４頁、２００９年）。このため、外用薬に用いられる化合物は分子量が５００Ｄａｌｔｏｎ以下であることが推奨されている。
　しかし、シロリムスの分子量は９１４Ｄａｌｔｏｎであるので、皮膚からの吸収が悪い。非特許文献１および２には、シロリムスの外用薬を用いることによって、血管線維腫が改善されたことが記載されているが、実用レベルではないといえる。シロリムスの皮膚からの吸収をより増加させることができる外用薬の開発が求められる。
　非特許文献３には、０．４質量％のシロリムスを含んでいる軟膏を皮膚腫瘍に塗布してから２４時間後のシロリムスの血中濃度が、６．３±０．６ｎｇ／ｍＬであったことが記載されている。同様に、０．８質量％のシロリムスを含んでいる軟膏を皮膚腫瘍に塗布してから２４時間後のシロリムスの血中濃度が、１２．３±１．５ｎｇ／ｍＬであったことが記載されている。このようなシロリムスの血中濃度は、シロリムスを全身性投与するときの一般的な血中濃度（５～１０ｎｇ／ｍＬ）とほぼ等しい。このように、非特許文献３に記載の技術では、局所的に適用されたにもかかわらずシロリムスが血中にも移行し、シロリムスの全身性投与と同様の影響を受けることになり、その結果、副作用が生じることになる。
　また、非特許文献３によれば、０．４質量％のシロリムスを含んでいる軟膏を皮膚腫瘍に塗布してから２４時間後の皮膚腫瘍中のシロリムスの濃度が１３．８±０．７ｎｇ／ｍＬである。この濃度は上記血中濃度（６．３±０．６ｎｇ／ｍＬ）の約１．９～２．５倍である。０．８質量％のシロリムスを含んでいる軟膏を皮膚腫瘍に塗布してから２４時間後の、皮膚腫瘍中のシロリムスの濃度は、５９．６±２３．５ｎｇ／ｍＬである。この濃度は上記血中濃度（１２．３±１．５ｎｇ／ｍＬ）の約２．６～７．７倍である。このように、非特許文献３に開示されている軟膏を用いた場合、皮膚腫瘍中に存在するシロリムスの濃度は、血中に移行するシロリムスの濃度のわずか数倍である。このことから、非特許文献３に開示されている軟膏は局所的な適用に適していないといえる。
　非特許文献４に開示されている処方物は、シロリムス、カプリン酸、ミリスチン酸イソプロピルおよびベンジルアルコールから構成されたローションである。この処方物におけるシロリムスの含有量は２．２質量％または８質量％であり、これらの処方物を患部に塗布することによって、接触皮膚炎や刺激感という副作用が引き起こされている。また、２．２質量％のシロリムスを含んでいる処方物を患部に塗布しても、患部が改善されなかった患者がいたことが報告されている。さらに、８質量％というシロリムス濃度は、当業者の技術常識を逸脱した濃度であり、このような濃度のゲルを外用薬として用いることは実用的でない。また、非特許文献５に記載の技術では、ポートワイン母斑を治療するために、シロリムスを患部に局所的に適用するだけでは不十分であり、シロリムスを用いることに加えて患部へのレーザーの照射が必要である。このように、非特許文献４および５に記載の技術では、上述したようにシロリムスの皮膚からの吸収が悪いため、患部に塗布する量を増加させたり、別の治療法と組み合わせたりすることが必要とされる。
　特許文献１では、シロリムスが様々な疾患に対して実際に治療効果を発揮するか否かに関して何ら検討されていない。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、副作用を引き起こすことなく、皮膚疾患を処置するに十分な量のシロリムスを患部へ吸収させることが可能な外用薬を提供することにある。
　上記の課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討したところ、シロリムスおよびその誘導体（有効成分）の少なくとも１つを含有している溶液をゲル化したもの、または有効成分の少なくとも１つを、有効成分と相溶しない溶媒に分散させたものを皮膚に適用することによって、従来のシロリムスを含んでいる外用薬を皮膚に適用した場合よりも顕著に、シロリムスの皮膚から患部への吸収を向上させ得ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の皮膚疾患を局所的に処置するための外用薬は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有しているゲル組成物または軟膏組成物を含んでいる。
本明細書中において、「局所的に処置する」は、局所的に適用された外用薬に起因する全身性の作用が示されないことが意図される。上記構成を有する外用薬を皮膚に適用することによって、シロリムスおよびその誘導体の皮膚から患部への吸収が顕著に向上されるだけでなく、シロリムスおよびその誘導体が血中に漏出することなく患部に留まる。すなわち、本発明の外用薬を用いれば、皮膚疾患を効果的に処置できる上に、シロリムスおよびその誘導体による全身性の作用が示されない（副作用が生じない）。
　本発明の外用薬は、皮膚に適用されることによって、副作用を引き起こすことなく、皮膚疾患を処置するに十分な量のシロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを患部へ吸収させることができるという効果を発揮する。
各種外用薬を用いて得られた結果を示す図である。 （ａ）～（ｄ）は、各種外用薬を用いて得られた結果を示す図である。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の血管線維腫を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の血管線維腫を示す図である。（ｃ）は（ａ）の一部の拡大図であり、（ｄ）は（ｂ）の一部の拡大図である。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の血管線維腫を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の血管線維腫を示す図である。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の血管線維腫を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の血管線維腫を示す図である。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の血管線維腫を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の血管線維腫を示す図である。（ｃ）は（ａ）の一部の拡大図であり、（ｄ）は（ｂ）の一部の拡大図である。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の血管線維腫を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の血管線維腫を示す図である。 （ａ）～（ｄ）は、外用薬を用いて得られた結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、外用薬を用いて得られた結果を示すグラフである。 ＭＩＴＦのｍＲＮＡの相対的な発現量を示すグラフである。 ＴＹＲのｍＲＮＡの相対的な発現量を示すグラフである。 ＴＹＲＰのｍＲＮＡの相対的な発現量を示すグラフである。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の白斑を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の白斑を示す図である。 （ａ）は、外用薬を塗布する前の白斑を示す図であり、（ｂ）は、外用薬を塗布した後の白斑を示す図である。 （ａ）～（ｃ）は、外用薬を用いて得られた結果を示すグラフである。 外用薬を用いて得られた結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、マウスの背中の図であり、（ｅ）～（ｈ）は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したマウスの皮膚の切片の図であり、（ｉ）～（ｌ）は、トルイジンブルーで染色した皮膚の切片の図である。 重症、中等症、または軽症の血管線維腫の細胞にて発現されたＶＥＧＦの濃度を示す図である。 （ａ）は血管線維腫の細胞をそれぞれ０ｎＭ（未処理）、１ｎＭ、１０ｎＭのシロリムスで処理した各細胞から発現されたＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフであり、（ｂ）は上記シロリムスで処理する前および後の、血管線維腫の細胞（ＴＳＣ　ＡＦ　ｆｉｂｒｏ）、ヒト線維芽細胞（ｎｏｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏ）、およびＨａＣａｔから発現されたＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフであり、（ｃ）は、これらの３種類の細胞をシロリムスで処理したことよって引き起こされたＶＥＧＦの濃度の減少割合（比：２０ｎＭのシロリムスで処理した後のＶＥＧＦの濃度／２０ｎＭのシロリムスで処理する前のＶＥＧＦの濃度）を示すグラフであり、（ｄ）はＨａＣａｔをそれぞれ０ｎＭ（未処理）、１ｎＭ、１０ｎＭのシロリムスで処理した各細胞から発現されたＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 （ａ）は、本発明の外用薬を塗布する前の紅斑を示す図であり、（ｂ）は、本発明の外用薬を塗布した後の紅斑を示す図である。 （ａ）は、炭酸プロピレンを、本実施例にて調製した軟膏の成分、または白色ワセリンに添加したときの様子を示す図であり、（ｂ）は、炭酸プロピレンを添加した軟膏の成分、または炭酸プロピレンを添加した白色ワセリンを攪拌したときの様子を示す図である。 （ａ）は本実施例にて調製した軟膏の成分を用いて調製した軟膏を顕微鏡にて観察した図であり、（ｃ）は（ａ）の拡大図であり、（ｂ）は白色ワセリンを用いて調製した軟膏の顕微鏡にて観察した図であり、（ｄ）は（ｂ）の拡大図である。 メラノサイトによって生産されるメラニンの量を示すグラフである。 メラノサイトによって生産されるメラニンの量を示すグラフである。 前額部（露光部）に白斑が発症している４人の患者の症状の推移を示すグラフである。 腹部（非露光部）に白斑が発症している４人の患者の症状の推移を示すグラフである。 尋常性白斑の症状の推移を示す図である。 尋常性白斑の症状の推移を示す図である。 メラノサイトにて発現しているＨＩＦ１αの量を示すグラフである。 本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量に関して、基剤の組成が及ぼす影響を示すグラフである。 本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量に関して、基剤の組成が及ぼす影響を示すグラフである。 本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量に関して、基剤の組成が及ぼす影響を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
　〔実施形態１：ゲル組成物を含んでいる外用薬〕
　本発明は、皮膚疾患を局所的に処置するための外用薬を提供する。本明細書中にて使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減または排除が意図され、治療的（発症後）に行われ得るものだけでなく、予防的（発症前）に行われ得るものもまた包含される。
　本実施形態の外用薬は、皮膚疾患を局所的に処置するための有効成分を含有している溶液をゲル化したゲル組成物を含んでいる。本明細書中にて使用される場合、「ゲル組成物」は、有効成分を、該有効成分を溶解させる溶媒に溶解させた溶液が、ゼリー状に固化したものが意図される。
　有効成分は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つであればよい。シロリムスの誘導体としては、特に限定されないが、例えば、４２－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）シロリムス（エベロリムス、ＲＡＤ００１）、およびシロリムス４２－［３－ヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）－２－メチルプロパノアート（テンシロリムス）が挙げられる。
　このような、シロリムスおよびその誘導体は、ｍＴＯＲを抑制することによって、以下の効果を発揮することが知られている：（ｉ）タンパク質の翻訳および合成の抑制、細胞周期の停止、ならびにアポトーシスを引き起こし、腫瘍および血管新生を抑制する；（ｉｉ）ＩＬ２受容体が関与するシグナル伝達経路を遮断して、Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制し、免疫を抑制する；（ｉｉｉ）肥満細胞を介した炎症を抑制する。このため、シロリムスおよびエベロリムスはそれぞれ、腎臓移植後または心臓移植後に用いられる免疫抑制剤として内服されている。また、エベロリムスは、腎の悪性腫瘍に対する内服剤としての使用が日本国においても認められている。テンシロリムスは、末期の肝癌に対する内服剤として開発されている。
　このように、シロリムスおよびその誘導体は、主に内服薬として使用されている。一方、上述したように、シロリムスの外用薬が開発されているが、皮膚に対する吸収性が悪かったり、局所的に適用されているにもかかわらず作用が全身性に発現することによって副作用を引き起こしたりするため、実用レベルの外用薬は得られていない。これに対して、本発明では、有効成分（シロリムスおよびその誘導体）を含有している溶液をゲル化することによって、有効成分の皮膚から患部への吸収効率が向上し、有効成分による皮膚疾患の局所的な処置が可能となる。
　このように、皮膚疾患を局所的に処置するには、有効成分を含んでいる溶液がゲル化されていればよい。溶液のゲル化を行うには、この溶液を、ゲル化剤を用いてゲル化すればよい。例えば、ゲル化剤としてカーボポール（登録商標）９３４ＮＦを用いた場合、上記溶液にカーボポール（登録商標）９３４ＮＦを添加し、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどのｐＨ調整剤によって溶液のｐＨを中性に調整することによって、溶液のゲル化を誘導することができる。
　本実施形態の外用薬は、ゲル組成物からなるものであってもよいし、ゲルの形態が維持されるのであれば、後述する他の成分がさらに含まれていてもよい。ゲル組成物も同様に、有効成分を含有している溶液およびゲル化を誘導する成分（ゲル化剤など）からなるものであってもよいし、ゲルの形態が維持されるのであれば、他の成分がさらに含まれていてもよい。このように、本実施形態に用いられるゲル組成物は、有効成分を含んでいる溶液をゲル化したものであり、ゲル化が誘導される前の、有効成分が該有効成分を溶解させる溶媒に溶解されている組成物（有効成分を溶解した溶液）もまた、本発明に含まれる。同様に、有効成分、該有効成分を溶解させる溶媒、およびゲル化を誘導する成分が別々に備えられているキットも、本発明に含まれる。このような組成物およびキットは、上記ゲル組成物（および本実施形態の外用薬）を調製するために用いることができる。もちろん、ゲル組成物を調製するための上記組成物が他の成分をさらに含んでいてよいし、ゲル組成物を調製するための上記キットが他の成分をさらに備えていてもよい。
　本明細書中にて使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは、上記材料を使用するための指示書を備えている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明のキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であってもよく、容器中に内包された溶液形態の組成物を梱包していてもよい。本発明のキットは、異なる２つ以上の物質を同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明のキットは、上述した組成物を構成するためにもちいられてもよく、上述した組成物に含まれる物質を別々に備えていても、上述した組成物とさらなる成分とを別々に備えていてもよい。
　上述した有効成分を溶解させる溶媒は、特に限定されないが、例えば、イソプロパノール、エタノールおよび炭酸プロピレンが挙げられるが、ゲル組成物の場合、イソプロパノールおよびエタノールの少なくとも１つが好ましい。
　本発明において、有効成分を有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液をゲル状にしたことによって、有効成分の皮膚から患部への吸収が顕著に向上する。本発明を用いれば、皮膚疾患の処置が、従来の外用薬におけるシロリムスの量よりもはるかに少ない量で実現する。また、本発明において、有効成分を含んでいる溶液がゲル化していることによって、有効成分が血中に漏出することなく患部に留まる可能性も考えられる。本発明を用いれば、上記「背景技術」にて示した従来の外用薬のように副作用を生じることなく、皮膚疾患を処置することができる。
　本実施形態の外用薬に含まれる有効成分の量は、外用薬の総質量を基準として、０．０１～２質量％であることが好ましく、０．０３～１質量％であることがより好ましい。有効成分の量がこの範囲内であれば、副作用を引き起こすことなく、皮膚疾患を処置することができる。なお、外用薬を調製するための組成物に含まれる有効成分の量も、外用薬に含まれる有効成分の量と同様である。外用薬を調製するためのキットに備えられる有効成分の量は任意であり、製造される外用薬に最終的に含まれる有効成分の量が、上記範囲内となればよい。また、ゲル組成物に含まれる有効成分の量は、外用薬に含まれる有効成分の量が上記範囲内となる量であればよく、当業者が適宜設定することができる。
　本実施形態の外用薬（またはゲル組成物）に含まれる、有効成分を溶解させる溶媒の量は、特に限定されず、有効成分を十分に溶解することができる量であればよい。例えば、用いるこの溶媒の量は、有効成分の量の１００～３００倍であり、１２０～２５０倍であることが好ましく、１２１．５～２４４倍であることがより好ましい。なお、外用薬を調製するための組成物に含まれる、有効成分を溶解させる溶媒の量も、外用薬に含まれる、有効成分を溶解させる溶媒の量と同様である。外用薬を調製するためのキットに備えられる、有効成分を溶解させる溶媒の量は任意であり、有効成分を十分に溶解することができる量であればよい。
　本実施形態の外用薬（またはゲル組成物）に含まれるゲル化を誘導する成分の量は、特に限定されず、有効成分を含有している溶液がゲル化する（外用薬または組成物がゲルの形態になる）に十分な量であればよい。例えば、ゲル化を誘導する成分として、カーボポール（登録商標）のようなゲル化剤と、ゲル化を誘導するためのｐＨ調整剤（トリスヒドロキシメチルアミノメタンなど）とを用いる場合、ゲル化剤の量が外用薬の総質量を基準として例えば１．６質量％であり、ｐＨ調整剤が外用薬の総質量を基準として例えば０．４質量％である。なお、外用薬を調製するためのキットに備えられる、ゲル化を誘導する成分の量は任意であり、製造される外用薬をゲルの形態にする量であればよい。
　後述する実施例では、本実施形態の外用薬を、結節性硬化症の皮膚腫瘍、白斑および紅斑の処置に用いている。また、実施形態２にて示す軟膏の剤形の外用薬を、結節性硬化症の皮膚腫瘍、白斑および紅斑の処置、ならびにアトピー性皮膚炎の処置に用いている。このような効果は、本実施形態（および実施形態２）の外用薬が有効成分（シロリムスおよびその誘導体）を皮膚内に効率よく浸透させていることに基づいているので、本明細書を読んだ当業者は、これらの外用薬が、「ｍＴＯＲの活性化によって引き起こされた任意の皮膚疾患」に適用可能であることを容易に理解し得る。本実施形態の外用薬を適用し得る皮膚疾患には、表皮、真皮、および皮下組織などの皮膚組織に生じる疾患だけでなく、皮膚組織内の血管系に生じる疾患も含まれる。このような皮膚疾患としては、特に限定されないが、例えば、皮膚腫瘍、アトピー性皮膚炎、酒さ、ケロイド、色素斑、脱色素斑、皮膚における血管系の形成異常、皮膚における血管系の良性腫瘍、および上皮系母斑が挙げられる。
　皮膚腫瘍は、結節性硬化症の皮膚腫瘍、脂漏性角化症、およびレックリングハウゼン病の皮膚腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。皮膚における血管系の形成異常は単純性血管腫、クモ状血管腫または被角血管腫であることが好ましい。皮膚における血管系の良性腫瘍はイチゴ状血管腫または老人性血管腫であることが好ましい。上皮系母斑は、疣状母斑、列序性母斑、炎症性線状疣状表皮母斑、および脂腺母斑からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。色素斑は褐色斑であることが好ましく、褐色斑は扁平母斑またはカフェオレ斑であることがより好ましい。脱色素斑は白斑であることが好ましい。
　このように本実施形態の外用薬は、種々の皮膚疾患を処置することができる。なお、アトピー性皮膚炎、白斑、酒さ、ケロイド、および脂漏性角化症の皮膚腫瘍が、シロリムスおよびその誘導体を用いて処置可能であることは、本発明者らが初めて見出したことであり、これまでに報告されていない。
　アトピー性皮膚炎に対する外用薬としては、ステロイド、およびタクロリムスを含んでいる軟膏が知られている。アトピー性皮膚炎の治療に用いられた場合、ステロイドは副作用を引き起こす。一方、タクロリムスを含んでいる軟膏は、ステロイドの副作用は引き起こさないが、腫瘍を発生させるという副作用を引き起こす。本実施形態の外用薬は、ステロイドの副作用を引き起こさず、タクロリムスを含んでいる軟膏が有する効果をほぼ有しており、さらに抗腫瘍効果も有している。よって、本実施形態の外用薬をアトピー性皮膚炎に用いれば、タクロリムスを含んでいる軟膏の副作用を回避することができる。すなわち、本実施形態の外用薬は、タクロリムスを含んでいる軟膏よりも安全性の高い、アトピー性皮膚炎の外用薬である。アトピー性皮膚炎は、近年、増加傾向にあり、発症の頻度が極めて高い疾患であり、長期間の処置を必要とし、患者のＱＯＬが低下させてしまう。
　本実施形態の外用薬が処置の対象とする白斑は、結節性硬化症の白斑などの先天性白斑に限定されず、尋常性白斑などの後天性白斑も含まれる。本邦における先天性白斑の患者は５万人程度であり、そのうち１／３を結節性硬化症の白斑の患者が占めている。結節性硬化症の白斑に対する治療法は現在存在しない。それ故、本実施形態の外用薬が結節性硬化症の白斑を処置できることは、画期的である。
　また、後天性白斑の患者は、およそ２０万人であり、そのうち７５～８０％を尋常性白斑の患者が占めている。尋常性白斑は、生命を脅かす疾患ではないが、この疾患に罹患することによって患者のＱＯＬは低下する。尋常性白斑に対する治療法として、ステロイドやビタミンＤの軟膏が外用されるが、このような軟膏の処置効果が弱く、十分な治療成績が得られない。このため、尋常性白斑を治療するために、エキシマレーザーの照射、ＰＵＶＡの照射（メトキシソラレンと紫外線Ａの併用による治療法）、ｎｂＵＶＢ（ナローバンドＵＶＢ）の照射などが行われる。しかし、このようなレーザーまたは紫外線の使用は、通院が必要になったり、発癌の危険性があったりする。本実施形態の外用薬は、このような必要性および危険性を伴うことなく、尋常性白斑を有効に処置することができる。
　酒さの患者は極めて多く、特に海外において酒さの発症の頻度が高い。酒さは、症状がひどくなれば、患者のＱＯＬを低下させる。このため、酒さの治療が求められていたが、酒さに対する有効な治療剤がなかった。それ故、本実施形態の外用薬が酒さを処置できることは、医薬業界において極めて重大な影響を与える。
　脂漏性角化症などの皮膚の良性腫瘍は、生命を脅かすものではないが、加齢に伴い全てのヒトに出願する病変である。この良性腫瘍の症状がひどければ、患者のＱＯＬを低下させる。
　上述したように、アトピー性皮膚炎、白斑、酒さ、および皮膚の良性腫瘍は、患者のＱＯＬを低下させてしまい、この患者の労働生産力も低下させてしまう。本実施形態の外用薬を用いれば、これらの疾患を、副作用を引き起こすことなく有効に処置することができるので、患者の労働生産力を向上させることができる。すなわち、本実施形態の外用薬は、社会経済的、医療経済的にも役立つ。
　上述したように、本実施形態の外用薬、ゲル組成物、ならびに本実施形態の外用薬（ゲル組成物）を調製するためのキットは、上記有効成分、有効成分を溶解させる溶媒およびゲル化を誘導する成分以外に、他の成分を含んでいてもよい。また、本実施形態の外用薬（ゲル組成物）を調製するための組成物は、上記有効成分および有効成分を溶解させる溶媒以外に、他の成分を含んでいてもよい。このような他の成分としては、例えば、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、水、および目的の皮膚疾患を処置するに有効な他の有効成分が挙げられる。
　水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。なお、ヒドロキシプロピルセルロースを本実施形態の外用薬に配合することによって、本実施形態の外用薬の粘着度を向上させることができる。すなわち、ヒドロキシプロピルセルロースを本実施形態の外用薬に配合することによって、外用薬が皮膚から剥がれにくくすることができる。
　ｐＨ調整剤としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどが挙げられる。
　皮膚疾患を処置するに有効な他の有効成分としては、例えば、ステロイド剤、タクロリムスなどが挙げられる。
　本実施形態の外用薬、ゲル組成物ならびに本実施形態の外用薬（ゲル組成物）を調製するための組成物が上述した他の成分を含んでいる場合、これらに含まれる他の成分の総量は、製造される外用薬がゲルの形態となる点および有効成分の効果が抑制されない点などを考慮して、当業者が適宜設定することができる。例えば、外用薬に含まれる他の成分の総量は、外用薬の総質量を基準として例えば４９質量％である。外用薬（ゲル組成物）を調製するためのキットが他の成分を備えている場合、この他の成分の総量は任意であり、製造される外用薬に最終的に含まれる他の成分の総量が、上記量となればよい。
　また、本発明は、皮膚疾患を処置するための外用薬を製造する方法を提供する。本実施形態の外用薬が、ゲル組成物からなるものである場合、上記方法はゲル組成物を製造する方法であり得る。ゲル組成物を製造する方法は、ゲル組成物を作製する工程を包含していればよい。ゲル組成物を作製する工程は、有効成分を含有している溶液をゲル化することを含んでいればよい。ゲル化の手順は、例えば、有効成分を、有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液をゲル化を誘導する成分と混合すればよい。なお、上記他の成分をゲル組成物に含有させる場合、有効成分と他の成分とを有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液を、ゲル化を誘導する成分と混合すればよい。また、本実施形態の外用薬が、ゲル組成物および他の成分を含んでいる場合、ゲル組成物および他の成分を従来公知の方法によって混合し、生じた混合物をゲルの形態に剤形化すればよい。
　本実施形態の外用薬は、ヒトおよび非ヒト動物に適用することができる。「非ヒト動物」としては、例えば、ヒトを除く哺乳類、および鳥類を挙げることができる。ヒトを除く哺乳類としては、特に限定されるものではなく、例えば、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、ハムスター、リスなどのげっ歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などを挙げることができる。また、鳥類としては、特に限定されるものではなく、例えば、アヒル、ニワトリ、ハト、インコなどを挙げることができる。また、これらの非ヒト動物は、家畜またはコンパニオンアニマル（愛玩動物）であることに限定されるものではなく、野生動物であってもよい。
　また、本発明は上述した皮膚疾患の処置方法を提供する。本発明の処置方法は、本実施形態の外用薬を皮膚疾患の患部に適用する工程を含んでいればよい。本明細書において「適用」は、本実施形態の外用薬を患部に付着させることが意図される。「外用薬を患部に適用すること」は、例えば、外用薬を患部に塗布すること、外用薬を患部にスプレーすること、および外用薬を貼付剤として患部に貼り付けることを包含する。
　本実施の形態の外用薬（ゲル組成物）は、以下のように構成することも可能であるが、本発明はこれらに限定されない。
　例えば、本実施の形態の外用薬（ゲル組成物）は、有効成分の他に、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ、水、イソプロパノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含むことが可能である。
　このとき、有効成分、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ、水、イソプロパノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンの質量の比は、有効成分：カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ：水：イソプロパノール：トリスヒドロキシメチルアミノメタン＝２～４：１６：４９０～８３３：１４５～４８８：４であり得る。但し、上記比において、有効成分、水およびイソプロパノールの合計は、９８０となる。
　更に具体的には、上記比は、有効成分：カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ：水：イソプロパノール：トリスヒドロキシメチルアミノメタン＝２：１６：８３３：１４５：４であってもよく（以下、比率１と呼ぶ）、有効成分：カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ：水：イソプロパノール：トリスヒドロキシメチルアミノメタン＝２：１６：４９０：４８８：４であってもよい（以下、比率２と呼ぶ）。上述した比率１と比率２とを比較した場合、比率２にて作製された外用薬の方が、比率１にて作製された外用薬よりも透明度が高い。
　〔実施形態２：軟膏組成物を含んでいる外用薬〕
　本実施形態の外用薬は、皮膚疾患を局所的に処置するための有効成分を含有している軟膏組成物を含んでいる。本明細書中にて使用される場合、「軟膏組成物」は、有効成分が、有効成分と相溶しない溶媒中に分散しているものが意図される。軟膏組成物を含んでいる外用薬は、軟膏剤であるといえる。
　このように、本実施形態の外用薬では、有効成分を、有効成分と相溶しない溶媒中に分散させることによって、有効成分の皮膚から患部への吸収効率が向上し、有効成分による皮膚疾患の局所的な処置が可能となる。このような分散を行うには、例えば、有効成分を、有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液と、有効成分と相溶しない溶媒とを混合すればよい。
　本実施形態の外用薬は、軟膏組成物からなるものであってもよいし、軟膏の形態が維持されるのであれば、上述した他の成分がさらに含まれていてもよい。軟膏組成物も同様に、有効成分、有効成分を溶解させる溶媒および有効成分と相溶しない溶媒からなるものであってもよいし、軟膏の形態が維持されるのであれば、他の成分がさらに含まれていてもよい。このように、本実施形態の外用薬は、有効成分と相溶しない溶媒中に有効成分が分散している。また、有効成分と、有効成分を溶解させる溶媒、有効成分と相溶しない溶媒と含んでおり、有効成分が有効成分と相溶しない溶媒中に分散される前の組成物も、本発明に含まれる。同様に、有効成分、有効成分を溶解させる溶媒、および有効成分と相溶しない溶媒が別々に備えられているキットも、本発明に含まれる。このような組成物およびキットは、上記軟膏組成物（および本実施形態の外用薬）を調製するために用いることができる。もちろん、軟膏組成物を調製するための上記組成物が他の成分をさらに含んでいてよいし、軟膏組成物を調製するための上記キットが他の成分をさらに備えていてもよい。
　上述した有効成分を溶解させる溶媒は、実施形態１にて説明したように、例えば、イソプロパノール、エタノールおよび炭酸プロピレンが挙げられるが、本実施形態２（軟膏組成物）の場合、炭酸プロピレンが好ましい。
　上述した有効成分と相溶しない溶媒は、特に限定されないが、例えば、ロウ類、パラフィン類、ワセリンなどが挙げられる。ロウ類としては、例えば、サラシミツロウ、ラノリン、カルナバロウ、鯨ロウなどの天然ロウ、モンタンロウなどの鉱物ロウ、合成ロウなどが挙げられる。パラフィン類としては、例えば、流動パラフィン、固形パラフィンなどが挙げられる。ワセリンとしては、白色ワセリン、黄色ワセリンなどが挙げられる。
　本実施形態において、有効成分を、有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液と、有効成分と相溶しない溶媒とを混合したことによって、有効成分が、有効成分と相溶しない溶媒中に細かな粒子として均一に分散する。このような分散によって、有効成分の皮膚から患部への吸収が顕著に向上する。本実施形態の外用薬を用いれば、皮膚疾患の処置が、従来の外用薬におけるシロリムスの量よりもはるかに少ない量で実現する。また、有効成分が上述したように分散していることによって、有効成分が血中に漏出することなく患部に留まる可能性も考えられる。本実施形態の外用薬を用いれば、従来の外用薬のように副作用を生じることなく、皮膚疾患を処置することができる。
　本実施形態の外用薬に含まれる有効成分の量は、外用薬の総質量を基準として、０．０１～２質量％であることが好ましく、０．０３～１質量％であることがより好ましい。有効成分の量がこの範囲内であれば、副作用を引き起こすことなく、皮膚疾患を処置することができる。なお、外用薬を調製するための組成物に含まれる有効成分の量も、外用薬に含まれる有効成分の量と同様である。外用薬を調製するためのキットに備えられる有効成分の量は任意であり、製造される外用薬に最終的に含まれる有効成分の量が、上記範囲内となればよい。また、軟膏組成物に含まれる有効成分の量は、外用薬に含まれる有効成分の量が上記範囲内となる量であればよく、当業者が適宜設定することができる。
　本実施形態の外用薬（または軟膏組成物）に含まれる、有効成分を溶解させる溶媒の量は、特に限定されず、有効成分を十分に溶解することができる量であればよい。例えば、有効成分を溶解させる溶媒の量は、有効成分の量の２～１００倍であり、３～５０倍であることが好ましく、５～２９倍であることがより好ましい。なお、外用薬を調製するための組成物に含まれるこの溶媒の量も、外用薬に含まれる、有効成分を溶解させる溶媒の量と同様である。外用薬を調製するためのキットに備えられる、有効成分を溶解させる溶媒の量は任意であり、有効成分を十分に溶解することができる量であればよい。
　本実施形態の外用薬（または軟膏組成物）に含まれる、有効成分と相溶しない溶媒の量は、特に限定されず、有効成分が、有効成分と相溶しない溶媒に微粒子として均一に分散するに十分な量であればよい。例えば、用いる、有効成分と相溶しない溶媒の量は、有効成分の量の５０～１０００倍であり、７０～５００倍であることが好ましく、９４～４７０倍であることがより好ましい。なお、外用薬を調製するための組成物に含まれるこの溶媒の量も、外用薬に含まれる、有効成分と相溶しない溶媒の量と同様である。外用薬を調製するためのキットに備えられる、有効成分と相溶しない溶媒の量は任意であり、有効成分を十分に分散させることができる量であればよい。
　上述したように、実施形態の外用薬、軟膏組成物、ならびに本実施形態の外用薬（軟膏組成物）を調製するための組成物およびキットは、上記有効成分、有効成分を溶解させる溶媒、有効成分と相溶しない溶媒以外に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分については、上述した実施形態１の説明を援用することができ、ここでは省略する。
　また、本発明は、皮膚疾患を処置するための外用薬を製造する方法を提供する。本実施形態の外用薬が、軟膏組成物からなるものである場合、上記方法は軟膏組成物を製造する方法であり得る。軟膏組成物を製造する方法は、軟膏組成物を作製する工程を包含していればよい。軟膏組成物を作製する工程は、有効成分を、有効成分と相溶しない溶媒に分散させることを包んでいればよい。有効成分を、有効成分と相溶しない溶媒に分散させる手順は、有効成分を、有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液を有効成分と相溶しない溶媒と混合すればよい。
　具体的には、有効成分が溶解した上記溶液を、有効成分と相溶しない溶媒に添加し、シンキ株式会社製の自転公転ミキサーまたはプライミクス株式会社製のホモミキサーを用いて、攪拌することによって、有効成分をエマルジョンの形態にて分散させることができる。これらのミキサーを用いることによって、有効成分の粒子の大きさを均一化し、かつ均一化された有効成分を、有効成分と相溶しない溶媒中に首尾よく分散させることができる。自転公転ミキサーを用いる場合、例えば、室温で、１分間、２０００ｒｐｍにて攪拌し、次いで５分間、１０００ｒｐｍにて攪拌し、そして３分間、５００ｒｐｍにて攪拌を行えばよい。ホモミキサーを用いる場合の攪拌の条件は、例えば、ホモミキサーに添付された説明書等に基づいて当業者が適宜設定することができる。特に、このホモミキサーを用いることによって、本実施形態の外用薬を大量に調製することができる。
　なお、有効成分と相溶しない溶媒が室温において固体である場合、この溶媒が液体になるまで加温し、生じた液体の溶媒と、有効成分が溶解した溶液と混合すればよい。例えば、室温において固体である各種成分（ロウ類、パラフィン類、ワセリン）などを融点（例えば７０℃）に加温して溶解し、混合する。そして、この混合物を室温付近にまで（例えば４０℃）に冷却し、この混合物を有効成分が溶解した溶液に添加し、上記攪拌を行うことによって軟膏組成物を製造する。
　上記他の成分を軟膏組成物に含有させる場合、有効成分と他の成分とを、有効成分を溶解させる溶媒に溶解し、生じた溶液を、有効成分と相溶しない溶媒と混合すればよい。また、本実施形態の外用薬が、軟膏組成物および他の成分を含んでいる場合、軟膏組成物および他の成分を従来公知の方法によって混合し、生じた混合物を軟膏の形態に剤形化すればよい。
　なお、実施形態２にて説明した本発明の構成以外の構成（有効成分、キット、他の成分、外用薬が適用される疾患、外用薬が適用される動物、皮膚疾患の処置方法など）は、上述した実施形態１と同じであるか、実施形態１に基づいて当業者が適宜改変して援用することができる。
　本実施の形態の外用薬（軟膏組成物）は、以下のように構成することも可能であるが、本発明はこれらに限定されない。
　例えば、本実施の形態の外用薬（軟膏組成物）は、有効成分の他に、炭酸プロピレン、固形パラフィンおよび白色ワセリンを含むことが可能である。本実施の形態の外用薬（軟膏組成物）は、炭酸プロピレン、固形パラフィンおよび白色ワセリンに加えて、更に流動パラフィンを含むことも可能である。本実施の形態の外用薬（軟膏組成物）は、炭酸プロピレン、固形パラフィン、白色ワセリンおよび流動パラフィンに加えて、更にサラシミツロウを含むことが可能である。
　このとき、有効成分、炭酸プロピレン、固形パラフィン、白色ワセリン、流動パラフィンおよびサラシミツロウの質量の比は、有効成分：炭酸プロピレン：固形パラフィン：白色ワセリン：流動パラフィン：サラシミツロウ＝０．３～１０：５０～５９．４：３０～４５：８９５：０～１０：０～５であり得る。但し、上記比において、有効成分、炭酸プロピレン、固形パラフィンおよび流動パラフィンの合計は、１０５となる。
　更に具体的には、上記比は、有効成分：炭酸プロピレン：固形パラフィン：白色ワセリン：流動パラフィン：サラシミツロウ＝２：５８：３０：８９５：１０：５であってもよく（以下、比率３と呼ぶ）、有効成分：炭酸プロピレン：固形パラフィン：白色ワセリン：流動パラフィン：サラシミツロウ＝２：５８：４５：８９５：０：０であってもよく（以下、比率４と呼ぶ）、有効成分：炭酸プロピレン：固形パラフィン：白色ワセリン：流動パラフィン：サラシミツロウ＝２：５８：３５：８９５：１０：０であってもよい（以下、比率５と呼ぶ）。上述した比率３と比率４とを比較した場合、比率３にて作製された外用薬の方が、比率４にて作製された外用薬よりも、透明度が高いとともに、外用薬の表面に存在する水の量を少なくすることができる。上述した比率３と比率５とを比較した場合、比率３にて作製された外用薬の方が、比率５にて作製された外用薬よりも、滑らかであるとともに、外用薬の表面に存在する水の量を少なくすることができる。
　本発明は、以下のように構成することも可能である。
　ゲル組成物は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有している溶液をゲル化したものであることが好ましい。
　本発明において、溶液は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを、イソプロパノールおよびエタノールの少なくとも１つに溶解させたものであることが好ましい。
　本発明が適用される皮膚疾患は、皮膚腫瘍、アトピー性皮膚炎、酒さ、ケロイド、色素斑、脱色素斑、皮膚における血管系の形成異常、皮膚における血管系の良性腫瘍、および上皮系母斑からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましく、結節性硬化症の皮膚腫瘍、脂漏性角化症、およびレックリングハウゼン病の皮膚腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つであることがより好ましい。皮膚における血管系の形成異常は単純性血管腫、クモ状血管腫または被角血管腫であることが好ましく、皮膚における血管系の良性腫瘍はイチゴ状血管腫または老人性血管腫であることが好ましく、上皮系母斑は、疣状母斑、列序性母斑、炎症性線状疣状表皮母斑、および脂腺母斑からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましく、色素斑は褐色斑であることが好ましく、褐色斑は扁平母斑またはカフェオレ斑であることがより好ましく、脱色素斑は白斑であることが好ましい。
　ゲル組成物は、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ、水、イソプロパノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンの少なくとも１つを含んでいることが好ましい。
　ゲル組成物は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つと、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦと、水と、イソプロパノールと、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとの質量の比が、２～４：１６：４９０～８３３：１４５～４８８：４であり、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つの比と、水の比と、イソプロパノールの比との合計が、９８０であることが好ましい。
　ゲル組成物は、前記シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つと、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦと、水と、イソプロパノールと、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとの質量の比が、２：１６：４９０：４８８：４であることが好ましい。
　軟膏組成物は、炭酸プロピレン、固形パラフィン、白色ワセリン、流動パラフィンおよびサラシミツロウの少なくとも１つを含んでいることが好ましい。
　軟膏組成物は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つと、炭酸プロピレンと、固形パラフィンと、白色ワセリンと、流動パラフィンと、サラシミツロウとの質量の比が、０．３～１０：５０～５９．４：３０～４５：８９５：０～１０：０～５であり、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つの比と、炭酸プロピレンの比と、固形パラフィンの比と、流動パラフィンの比と、サラシミツロウの比との合計が、１０５であることが好ましい。
　軟膏組成物は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つと、炭酸プロピレンと、固形パラフィンと、白色ワセリンと、流動パラフィンと、サラシミツロウとの質量の比が、２：５８：３０：８９５：１０：５であることが好ましい。
　また、本発明の組成物は、皮膚疾患を局所的に処置するための外用薬を調製するための、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。
　また、本発明のキットは、皮膚疾患を局所的に処置するための外用薬を調製するための、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを備えていることを特徴としている。
　また、本発明の外用薬を製造する方法は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有しているゲル組成物または軟膏組成物を作製する工程を包含していることを特徴としている。上記溶液は、上述した組成物またはキットを用いて調製されてもよい。
　本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。以下実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明する。
　〔本発明の外用薬の調製〕
　＜調製例１：０．４質量％のシロリムスを含むゲルの調製＞
　シロリムスの試薬（Calbiochem社製、553210）４ｍｇをイソプロパノール（和光純薬工業株式会社製、166-04836）４８６ｍｇに溶解させた。得られた溶解物４９０ｍｇをカーボポール（登録商標）９３４ＮＦポリマー（Lubrizol社製）１６ｍｇとＨ２Ｏ４９０ｍｇとの混合物と混合した。得られた混合物に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（和光純薬工業株式会社製、203-06272）４ｍｇを混合した。このようにして、０．４質量％のシロリムスを含むゲル（ゲル１）を調製した。
　＜調製例２：０．２質量％のシロリムスを含むゲルの調製１＞
　シロリムスの試薬２ｍｇをイソプロパノール４８８ｍｇに溶解させたことを除いて、調製例１と同様の作業を行い、０．２質量％のシロリムスを含むゲル（ゲル２）を調製した。
　＜調製例３：０．２質量％のシロリムスを含むゲルの調製２＞
　シロリムスの試薬の代わりにＲａｐａｍｕｎｅを用いたことを除いて、調製例２と同様の作業を行い、０．２質量％のシロリムスを含むゲル（ゲル３）を調製した。具体的には、２ｍｇのＲａｐａｍｕｎｅの錠剤を粉砕し、不純物（賦形剤など）を取り除くために７５μｍのメッシュを通してから、粉砕物をイソプロパノール４８８ｍｇに溶解させた。
　＜調製例４：１質量％のシロリムスを含む軟膏の調製＞
　シロリムスの試薬（Calbiochem社製、553210）１０ｍｇを炭酸プロピレン（和光純薬工業株式会社製、168-04972）５０ｍｇに溶解させた。サラシミツロウ５ｍｇ、流動パラフィン（和光純薬工業株式会社製、128-04375）１０ｍｇ、固形パラフィン（和光純薬工業株式会社製、415-25791）３０ｍｇ、および白色ワセリン（プロペト）（丸石製薬株式会社製、Merck社製、またはアストラジャパン株式会社製）８９５ｍｇを、７０℃に加熱し溶解させながら混合した。
　この混合物の温度が４０℃になるまで冷却した後、上述したシロリムスの試薬と炭酸プロピレンとの溶解物を添加した。これによって生じた混合物を自転公転ミキサー（シンキ株式会社製、Nano Pulverizer NP-100）を用いて常温で、１分間、２０００ｒｐｍにて攪拌し、次いで５分間、１０００ｒｐｍにて攪拌し、そして３分間、５００ｒｐｍにて攪拌した。このようにして、１質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏１）を調製した。
　なお、この調製例４では、自転公転ミキサーを用いたが、プライミクス株式会社製のホモミキサーを用いてもよい。このホモミキサーを用いることによって、軟膏を大量に調製することができる。
　＜調製例５：０．２質量％のシロリムスを含む軟膏の調製１＞
　シロリムスの試薬２ｍｇを炭酸プロピレン５８ｍｇに溶解させたことを除いて、調製例４と同様の作業を行い、０．２質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏２）を調製した。
　＜調製例６：０．２質量％のシロリムスを含む軟膏の調製２＞
　シロリムスの試薬の代わりにＲａｐａｍｕｎｅ（ファイザー社製、29269）を用いたことを除いて、調製例５と同様の作業を行い、０．２質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏３）を調製した。具体的には、２ｍｇのＲａｐａｍｕｎｅの錠剤を粉砕し、不純物を取り除くために７５μｍのメッシュを通してから、粉砕物を炭酸プロピレン５８ｍｇに溶解させた。
　＜参考例１：市販の軟膏を基剤として用いた０．２質量％のシロリムスを含む軟膏の調製＞
　プロトピック（登録商標）軟膏０．０３％小児用（アステラス製薬株式会社）を基剤として０．２質量％のシロリムスを含んでいる軟膏（参考例１）を調製した。
　＜参考例２：市販の軟膏を基剤として用いた０．２質量％のシロリムスを含む別の軟膏の調製＞
　プロトピック（登録商標）軟膏０．０３％小児用の代わりに、プロトピック（登録商標）軟膏０．１％を用いたことを除いて、参考例１と同様の作業を行い、０．２質量％のシロリムスを含んでいる軟膏（参考例２）を調製した。
　〔本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量の確認〕
　本実施例では、以下のような試験を実施して、本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量を確認した。
　＜試験方法＞
　ＴＥＳＴＳＫＩＮ（登録商標）ＬＳＥ－ｄ、およびＴＥＳＴＳＫＩＮ（登録商標）ＬＳＥ－ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）の各トランスウェル内の皮膚に、上述の本発明の外用薬（軟膏２および３、並びに、ゲル２および３）をそれぞれ塗布した。なお、リング内の吸収面の直径は、１ｃｍであった。
　培地（ＴＥＳＴＳＫＩＮ（登録商標）ＬＳＥ（登録商標）ASSAY MEDIUM(TOYOBO)）を添加したアッセイトレイ上にトランスウェルを移動させ、インキュベーター内にて２４時間インキュベートした。インキュベーター内の温度は、３７℃であり、ＣＯ２の濃度は５％であった。
　インキュベート後に、トランスウェルの表面の外用薬をろ紙でふき取り、さらにこの表面を培地で洗浄した。これによって、表面に残存する外用薬を除去した。
　ラップを敷いたヒートトレイにトランスウェルを載せた。ヒートトレイの温度を６０℃に設定し、トランスウェルを６０秒～９０秒間加温した。
　トランスウェルから組織を取り出した。この組織から表皮を除去し、次いで真皮層を採取した。採取した真皮層をエッペンドルフチューブに入れた。
　ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳシステムを用いて、真皮層中のシロリムスの濃度を測定した。ＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳシステムとして、HPLC P4000,AS3000 thermostat（Thermo Fisher KK, San Jose, CA, USA）を使用した。ＥＳＩ／ＭＳの検出器として、LCQ Finigan Mat（Thermo Fisher KK, San Jose, CA, USA）を使用した。オートサンプラーとしてＨＴＣ－Ｐａｌ（AMR Inc, Tokyo, Japan）を使用した。データの解析処理には、X caliber ver1.2 （Thermo Fisher KK, San Jose, CA, USA）を使用した。
　上述した試験方法を各外用薬について３回行い、真皮層中のシロリムスの濃度の平均値および標準偏差を算出した。各外用薬を用いて得られた試験の結果に統計的有意差があるか否かを、対応のないｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を用いてｐ値を算出することによって確認した。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的有意差があるとみなした。
　＜試験結果＞
　ゲル２、軟膏２および参考例１を用いて得られた試験の結果を図１に示す。図１に示すように、ゲル２を用いた場合、真皮中のシロリムスの濃度が８．０８±３．８５ｎｇ／ｍｇであり、軟膏２を用いた場合、真皮中のシロリムスの濃度が１０．０３±２．６８ｎｇ／ｍｇであり、タクロリムスの軟膏基剤を用いた場合、真皮中のタクロリムスの濃度が１．８２±０．３１９ｎｇ／ｍｇであった。また、ゲル２と参考例１との間のｐ値および軟膏２と参考例１との間のｐ値は、どちらも０．０５未満であった。このｐ値から、ゲル２および軟膏２と参考例１との間に有意差があることが確認された。以上のことから、参考例１よりもゲル２および軟膏２の方が、有効成分をより効率よく皮膚へ浸透できることが分かった。
　ゲル２、ゲル３、軟膏２、および軟膏３を用いた試験の結果を図２に示す。図２の（ａ）～（ｄ）に示すように、ゲル２を用いた場合、真皮中のシロリムスの濃度が１．８２３±０．１４６ｎｇ／ｍｇであり、ゲル３を用いた場合、真皮中のシロリムスの濃度が１．０７３±０．１９９ｎｇ／ｍｇであり、軟膏２を用いた場合、真皮中のシロリムスの濃度が１．０８７±０．０７３ｎｇ／ｍｇであり、軟膏３を用いた場合、真皮中のシロリムスの濃度が０．２６±０．０９８ｎｇ／ｍｇであった。
　図２の（ａ）に示すように、ゲル２と軟膏２との間のｐ値は０．０５未満であり、ゲル２と軟膏２との間に有意差があることが確認された。また、図２の（ｂ）に示すように、ゲル３と軟膏３との間のｐ値は０．０５未満であり、ゲル３と軟膏３との間に有意差があることが確認された。これらの結果から、軟膏よりもゲルの方が、シロリムスをより効率よく皮膚へ浸透させることが分かった。これは、ゲルを作製する際に、シロリムスを溶媒（イソプロパノール）に溶解させたためであると考えられる。したがって、糜爛部分が多く、外用薬の吸収が良く、刺激を受けやすい病変（アトピー性皮膚炎など）に対しては軟膏を使用することが好ましく、外用薬の吸収が悪く、刺激を受けにくい病変（白斑など）に対してはゲルを使用することが好ましいと考えられる。
　図２の（ｃ）に示すように、ゲル２とゲル３との間のｐ値は０．０５未満であり、ゲル２とゲル３との間に有意差があることが確認された。また、図２の（ｄ）に示すように、軟膏２と軟膏３との間のｐ値は０．０５未満であり、軟膏２と軟膏３との間に有意差があることが確認された。これらの結果から、錠剤のシロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）を用いて調製した外用薬よりも、試薬のシロリムスを用いて調製した外用薬の方が、シロリムスをより効率よく皮膚へ浸透できることが分かった。したがって、試薬のシロリムスを用いることによってより効果の高い外用薬を調製できることが分かった。
　〔軟膏の外用薬をマウスの皮膚に複数回塗布した後に、マウスの皮膚内に吸収されるシロリムスの量の確認〕
　＜試験方法＞
　上述した調製例５に従い、０．０３質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏４）、０．０６質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏５）、０．１質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏６）を調製した。
　Ｒａｐａｍｕｎｅを用いて作製した軟膏３、ならびにシロリムスの試薬を用いて作製した軟膏２、軟膏４、軟膏５および軟膏６を、それぞれマウスの皮膚に複数回塗布し、皮膚内に吸収されたシロリムスの量を測定した。具体的には、これらの軟膏をマウスの皮膚に１週間当たり２回、４週間塗布した。４週間後にマウスの皮膚を回収し、LC-ESI/MS 法を用いて、皮膚内のシロリムスの量を測定した。
　＜試験結果＞
　軟膏３（０．２質量％）を用いた場合、真皮中のシロリムスの量は、２９４．２±１００．７ｐｇ／ｍＬであり、軟膏２（０．２質量％）を用いた場合、真皮中のシロリムスの量は、３３３．１±１２３ｐｇ／ｍＬであり、軟膏４（０．０３質量％）を用いた場合、真皮中のシロリムスの量は、６７．５９±２２．１ｐｇ／ｍＬであり、軟膏５（０．０６質量％）を用いた場合、真皮中のシロリムスの量は、８０．３１±２０．６ｐｇ／ｍＬであり、軟膏６（０．１質量％）を用いた場合、真皮中のシロリムスの量は、１０３．０６±２２．３ｐｇ／ｍＬであった。
　上述した人工皮膚に外用薬を一回塗布するという試験では、錠剤のシロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）を用いて調製した外用薬よりも、試薬のシロリムスを用いて調製した外用薬の方が、シロリムスをより効率よく皮膚へ浸透できるという結果が得られた。一方、マウスの皮膚に複数回塗布することによって、錠剤のシロリムスを用いて調製した軟膏３が真皮中に吸収される量を、シロリムスの試薬を用いて調製した軟膏２が真皮中に吸収される量に近づけることができることが分かった。よって、錠剤のシロリムスを用いて調製した軟膏であっても、複数回塗布することによって、疾患を処置するに十分な量のシロリムスを患部へ送達することができるといえる。なお、これは、軟膏だけに当てはまるものではなく、ゲルについても当てはまると考えられる。
　〔本発明の外用薬を用いた結節性硬化症の患者の血管線維腫の処置〕
　本実施例では、以下のような試験を実施して、本発明の外用薬の、結節性硬化症の皮膚腫瘍に対する効果を確認した。したがって、結節性硬化症以外の皮膚の良性腫瘍（脂漏性角化症など）に対しても効果が期待される。
　＜試験方法＞
　結節性硬化症の患者を、上記軟膏３を用いて処置される患者のグループ（４人）、および上記ゲル３を用いて処置される患者のグループ（８人）に分けた。各患者に対して、上述した外用薬を１日２回、１２週間塗布した。具体的には、患者の顔面の左側および右側のどちらか一方の血管線維種に外用薬を塗布し、他方の血管線維腫に、有効成分（シロリムス）を含まない基剤のみ（コントロール）を塗布した。処置の開始から１２週間後に処置を中止した。そして、処置を中止してから３ヶ月間、血管線維腫の経過観察を行った。なお、ゲル３を用いて処置される患者の一人が、決められた通りの外用を適切に行わなかったため、試験中に除外された。
　処置の開始前、処置の開始から１２週間後に、血管線維腫の写真を撮影し、血管線維腫の評価を行った。血管線維腫の評価は、潮紅の軽快、丘疹の縮小化、および局面の平坦化の程度、ならびに総合的な観点（総合的なスコア）を４段階のスコアに割り当てることによって行った。
　すなわち、潮紅の軽快については、潮紅が処置の開始前と比べて軽快していない場合、スコアを０とし、潮紅が処置の開始前と比べて４９％軽快された場合、スコアを１とし、潮紅が処置の開始前と比べて５０～８０％軽快された場合、スコアを２とし、潮紅が処置の開始前と比べて８０％以上軽快された場合、スコアを３とした。
　丘疹の縮小化については、丘疹が処置の開始前と比べて縮小していない場合、スコアを０とし、丘疹が処置の開始前と比べて４９％縮小化された場合、スコアを１とし、丘疹が処置の開始前と比べて５０～８０％縮小化された場合、スコアを２とし、丘疹が処置の開始前と比べて８０％以上縮小化された場合、スコアを３とした。
　局面の平坦化については、局面が処置の開始前と比べて平坦化されていない場合、スコアを０とし、局面が処置の開始前と比べて４９％平坦化された場合、スコアを１とし、局面が処置の開始前と比べて５０～８０％平坦化された場合、スコアを２とし、８０％以上平坦化された場合、スコアを３とした。
　総合的なスコアについては、上述した潮紅、丘疹および局面のスコアを合計したものの平均を総合スコアとした。
　＜試験結果＞
　図３～５に、ゲル３を用いた処置の開始前および処置の開始から１２週間後の血管線維腫の写真を示す。図３～５に示すように、患者の左頬の血管線維腫には、ゲル３を塗布し、患者の右頬の血管線維腫には、コントロールを塗布した。
　図３の（ａ）、図４の（ａ）、および図５の（ａ）は、上記ゲル３を用いた処置の開始前の血管線維腫を示す写真であり、図３の（ｂ）、図４の（ｂ）、および図５の（ｂ）は、上記ゲル３を用いた処置の開始から１２週間後の血管線維腫を示す写真である。図３の（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ図３の（ａ）および（ｂ）の左頬の拡大図である。図３の（ａ）と（ｂ）、図３の（ｃ）と（ｄ）、図４の（ａ）と（ｂ）、および図５の（ａ）と（ｂ）を比較すれば分かるように、ゲル３を塗布した血管線維腫は軽快したが、コントロールを塗布した血管線維腫は変化しなかった。
　図６～７に、軟膏３を用いた処置の開始前および処置の開始から１２週間後の血管線維腫の写真を示す。図６に示すように、患者の左頬の血管線維腫には、軟膏３を塗布し、患者の右頬の血管線維腫には、コントロールを塗布した。また、図７に示すように、患者の右頬の血管線維腫には、軟膏３を塗布し、患者の左頬の血管線維腫には、コントロールを塗布した。
　図６の（ａ）および図７の（ａ）は、軟膏３を用いた処置の開始前の血管線維腫を示す写真であり、図６の（ｂ）および図７の（ｂ）は、軟膏３を用いた処置の開始から１２週間後の血管線維腫を示す写真である。図６の（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ図６の（ａ）および（ｂ）の左頬の拡大図である。図６の（ａ）と（ｂ）、図６の（ｃ）と（ｄ）、図７の（ａ）と（ｂ）を比較すれば分かるように、軟膏３を塗布した血管線維腫は軽快したが、コントロールを塗布した血管線維腫は変化しなかった。
　上述した血管線維腫の評価の結果を図８～９に示す。
　図８は、ゲル３またはコントロールを用いた処置から１２週間後の各患者のスコアを示すグラフである。図８の（ａ）は、総合的なスコアを示すグラフであり、（ｂ）は、潮紅のスコアを示すグラフであり、（ｃ）は、丘疹のスコアを示すグラフであり、（ｄ）は局面のスコアを示すグラフである。図８の（ａ）～（ｄ）の左側にゲル３の塗布によって得られたスコアを示し、同図の右側にコントロールの塗布によって得られたスコアを示す。
　図８の（ａ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、ゲル３を用いた場合、４、４、４、３、および３．７５であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。図８の（ｂ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４、および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、ゲル３を用いた場合、４、４、４、３、および３．７５であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。図８の（ｃ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４、および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、ゲル３を用いた場合、３、３、４、２、および３であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。図８の（ｄ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４、および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、ゲル３を用いた場合、いずれも４であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。
　なお、図８の（ａ）～（ｄ）のそれぞれにおいて、ゲル３を用いた場合の平均のスコアとコントロールを用いた場合の平均のスコアとに統計的有意差があるか否かを、対応のあるｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を用いてｐ値を算出することによって確認した。その結果、いずれのｐ値も０．０５未満であり、統計的有意差があることが明らかになった。
　図９は、軟膏３またはコントロールを用いた処置から１２週間後の各患者のスコアを示すグラフである。図９の（ａ）は、総合的なスコアを示すグラフであり、（ｂ）は、潮紅のスコアを示すグラフであり、（ｃ）は、丘疹のスコアを示すグラフであり、（ｄ）は局面のスコアを示すグラフである。図９の（ａ）～（ｄ）の左側に軟膏３の塗布によって得られたスコアを示し、同図の右側にコントロールの塗布によって得られたスコアを示す。
　図９の（ａ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、軟膏３を用いた場合、４、４、２、１．５、および２．９であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。図９の（ｂ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４、および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、軟膏３を用いた場合、４、４、２、１．５、および２．９であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。図９の（ｃ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４、および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、軟膏３を用いた場合、３、１．５、１、１、および１．７であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。図９の（ｄ）に示すように、患者１、患者２、患者３、患者４、および患者１～患者４の平均のスコアは、それぞれ、軟膏３を用いた場合、４、４、２、１．５、および２．９であり、コントロールを用いた場合、いずれも０であった。
　なお、図９の（ａ）～（ｄ）のそれ場合の平均のスコアとコントロールを用いた場合の平均のスコアとに統計的有意差があるか否かを、対応のあるｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を用いてｐ値を算出することによって確認した。その結果、いずれのｐ値も０．０５未満であり、統計的有意差があることが明らかになった。
　以上の結果から、ゲル３および軟膏３を用いることによって、血管線維腫が軽快することが分かった。
　また、ゲル３または軟膏３を用いた処置の開始前および処置の終了日（処置から１２週間）後に患者の血液を採取して、血液検査を行い、血中の成分を測定した。患者１および患者２に対して行った血液検査の結果を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　「ＷＢＣ」は白血球数を示す。「ＲＢＣ」は赤血球数を示す。「Ｈｂ」は血色素量を示す。「Ｈｔ」はヘマトクリットを示す。「Ｐｌａｔ」は血小板を示す。「Ｎｅｕ」は好中球を示す。「Ｌｙｍ」はリンパ球を示す。「Ｅｏ」は好酸球を示す。「ｂａ」は好塩基球を示す。「Ｃｒ」はクレアチニンを示す。「ＡＳＴ」はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを示す。「ＡＬＴ」はアラニンアミノトランスフェラーゼを示す。「γＧＴＰ」は、ガンマグルタミルトランスフェラーゼを示す。「Ｔｃｈｌ」は総コレステロールを示す。「ＴＧ」トリグリセリドを示す。「Ｇｌｕ」は血糖を示す。「ＣＲＰ」は、Ｃ反応蛋白質を示す。
　表１に示すように、各患者の各血液成分は、処置の開始前と処置の開始から１２週間後とにおいて顕著に変化していなかった。
　処置の開始から１２週間後のゲル３または軟膏３を塗布した皮膚において、接触皮膚炎が発症しているか否かを調べた。その結果、接触皮膚炎は発症していなかった。
　処置の開始から１２週間後の患者の血液を採取し、LC-ESI-MS法を用いて血中のシロリムスの検出を試みた。しかし、血中のシロリムスを検出することができなかった。この結果から、ゲル３または軟膏３を皮膚に塗布した場合、シロリムスが真皮中に浸透することができるが、血中に放出されないことが分かった。
　上述した血液成分が変化していなかったこと、接触皮膚炎が発症していなかったこと、シロリムスが血中に放出されなかったことは、ゲルおよび軟膏３３の適用に起因する副作用が生じなかったことを示している。
　以上の結果から、本発明の外用薬を用いれば、副作用を生じることなく、結節性硬化症の血管線維腫を効果的に処置できることが分かった。これは、本発明の外用薬が、ｍＴＯＲの調節異常に基づく他の皮膚腫瘍（例えば、皮膚の良性腫瘍）に対しても有効であることを示している。また、結節性硬化症の顔面の血管線維腫が処置されたことによって、本発明の外用薬の真皮内へ浸透したことが示された。
　〔本発明の外用薬を用いた白斑の処置〕
　白斑が発症する原因の一つは、メラノサイトがメラニンを産生しなくなることによって生じる。メラノサイトにおけるメラニンの産生に関与するタンパク質は、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１である。
　白斑が、ｍＴＯＲの活性化に起因する疾患（結節性硬化症など）に罹患した患者においてしばしば発生することが知られている。このような患者において白斑が発生するメカニズムは、以下のとおりであると本発明者らは考えている。上記患者のメラノサイト内においてｍＴＯＲが活性化された結果、Ｓ６Ｋ１の活性が上昇する。そして、このＳ６Ｋ１の活性の上昇によって、ＰＩ３Ｋの活性が抑制される。ＰＩ３ＫはＡｋｔのシグナル伝達経路を活性化するだけでなく、ＭＡＰＫのシグナル伝達経路も活性化するので、ＰＩ３Ｋの活性の抑制によって、Ａｋｔのシグナル伝達経路およびＭＡＰＫのシグナル伝達経路が抑制される。これにより、Ａｋｔのシグナル伝達経路の下流にあるｐ３８およびＭＡＰＫのシグナル伝達経路の下流にあるＭＥＫの活性が抑制される。その結果、ｐ３８およびＭＥＫを介した、ＭＩＴＦの発現が抑制されたり、ＭＩＴＦの活性化が抑制されたりする。
　ＭＩＴＦが発現しなくなったり、ＭＩＴＦの活性が低下したりすることによって、ＴＹＲおよびＴＹＲＰ１の活性が低下し、メラノサイトにおいてメラニンが産生されなくなる。このようにして、白斑が生じる。
　このように、本発明者らは、白斑の発生にｍＴＯＲの活性化が関与しているので、本発明の外用薬が白斑の処置に有効であると考えた。そこで、本実施例では、以下のような試験を実施して、シロリムスの上述したタンパク質の発現に対する影響を調べ、白斑の発生にｍＴＯＲの活性化が関与していることを確認した。そして、本発明の外用薬の白斑に対する効果を確認した。
　＜シロリムスによるＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１の発現量の増加の確認＞
　（試験方法）
　１．４×１０５個のメラノサイトを６ウェルのカルチャープレートのウェルに播種し、ｍｅｄｉｕｍ　２５４（倉敷紡績株式会社製、Ｍ２５４５００）をウェルに添加した。次いで、このプレートを、３７℃および５％ＣＯ２の環境下にて２４時間インキュベートした。
　シロリムスを終濃度が０ｎＭ（すなわち、シロリムスを培地に加えない。）、１、１０および２０ｎｍｏｌ／Ｌのシロリムスをそれぞれウェルに添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ２の環境下にて２４時間または４８時間インキュベートした。
　インキュベート後のウェルからｍｅｄｉｕｍ　２５４を除去した。そして、このウェルにＰＢＳを添加し、ウェルからＰＢＳを除去するという操作を３回行った。この操作によって、メラノサイトをＰＢＳで洗浄した。
　ＰＢＳを除去したウェルに１７５μＬのRNA lysis bufferを添加した。このRNA lysis bufferは、SV Total RNA Solution Systemのキット（Promega社製、Z3105）に付属されていたものである。
　セルスクレーパーを用いて、メラノサイトをプレートから剥がした。
　メラノサイトを含んでいるRNA lysis bufferを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに回収した。そして、回収したｂｕｆｆｅｒからＲＮＡを抽出した。
　このＲＮＡを用いて、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行い、ＭＩＴＦのｍＲＮＡ、ＴＹＲのｍＲＮＡ、およびＴＹＲＰ１のｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現を検出した。そして、ＭＩＴＦのｍＲＮＡ、ＴＹＲのｍＲＮＡ、およびＴＹＲＰ１のｍＲＮＡの発現量をそれぞれＧＡＰＤのｍＲＮＡの発現量に対する相対的な発現量として算出した。
　このような実験を３回行い、各ｍＲＮＡの相対的な発現量の平均値および標準偏差を算出した。また、各外用薬を用いて得られた試験の結果に統計的有意差があるか否かを、対応のないｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を用いてｐ値を算出することによって確認した。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的有意差があるとみなした。
　ＭＩＴＦのｍＲＮＡの発現を検出するために、TagMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied biosystems社製、Hs00165156_ｍ１）を用いた。ＴＹＲのｍＲＮＡの発現を検出するために、TagMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied biosystems社製、Hs00165976_m1）を用いた。ＴＹＲＰ１のｍＲＮＡの発現を検出するために、TagMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied biosystems社製、Hs00167051_m1）を用いた。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現を検出するために、TagMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied biosystems社製、Hｓ99999905_ｍ１）を用いた。
　（試験結果）
　上述した試験の結果を図１０～１２に示す。
　図１０は、ＭＩＴＦのｍＲＮＡの相対的な発現量の平均値および標準偏差を示すグラフである。図１０における「１」は、シロリムスで処理されることなく２４時間インキュベートされたメラノサイトを示し、「２」は、１ｎＭのシロリムスで２４時間処理されたメラノサイトを意味し、「３」は、２０ｎＭのシロリムスで２４時間処理されたメラノサイトを意味し、「４」は、シロリムスで処理されることなく４８時間インキュベートされたメラノサイトを意味し、「５」は、１ｎＭのシロリムスで４８時間処理されたメラノサイトを意味し、「６」は、２０ｎＭのシロリムスで４８時間処理されたメラノサイトを意味する。
　図１０に示すように、「１」では、ＭＩＴＦの相対的な発現量は１００．００±３．３７であり、「２」では、ＭＩＴＦの相対的な発現量は１５２．４８±３．４７であり、「３」では、ＭＩＴＦの相対的な発現量は１５２．１８±１４．７５であり、「４」では、ＭＩＴＦの相対的な発現量は１０７．９５±１．３８であり、「５」では、ＭＩＴＦの相対的な発現量は１２９．４１±３．４３であり、「６」では、ＭＩＴＦの相対的な発現量は１４１．５６±３．５２であった。図１０中の＊＊は、それぞれの発現量の間のｐ値が０．０１未満であることを示しており、＊＊＊は、それぞれの発現量の間のｐ値が０．００１未満であることを示す。
　図１０に示されるように、「２」および「３」におけるＭＩＴＦのｍＲＮＡの相対的な発現量は、「１」におけるＭＩＴＦのｍＲＮＡの相対的な発現量よりも有意に高い。同様に、「５」および「６」におけるＭＩＴＦのｍＲＮＡの相対的な発現量は、「４」におけるＭＩＴＦのｍＲＮＡの相対的な発現量よりも有意に高い。よって、１ｎＭまたは２０ｎＭのシロリムスでメラノサイトを２４時間または４８時間処理することによって、ＭＩＴＦのｍＲＮＡの発現量が増加したことが確認された。
　図１１および図１２は、それぞれＴＹＲおよびＴＹＲＰのｍＲＮＡの相対的な発現量の平均値および標準偏差を示すグラフである。図１１および図１２における「１」は、シロリムスで処理されることなく２４時間インキュベートされたメラノサイトを示し、「２」は、１ｎＭのシロリムスで２４時間処理されたメラノサイトを示し、「３」は、２０ｎＭのシロリムスで２４時間処理されたメラノサイトを意味し、「４」は、シロリムスで処理されることなく４８時間処理されたメラノサイトを意味し、「５」は、１ｎＭのシロリムスで４８時間処理されたメラノサイトを意味し、「６」は、２０ｎＭのシロリムスで４８時間処理された別のメラノサイトを意味する。
　図１１に示すように、「１」では、ＴＹＲの相対的な発現量は０．６４０±０．０３６であり、「２」では、ＴＹＲの相対的な発現量は０．８２０±０．０４７であり、「３」では、ＴＹＲの相対的な発現量は０．９２１±０．０２９であり、「４」では、ＴＹＲの相対的な発現量は０．７７１±０．００９であり、「５」では、ＴＹＲの相対的な発現量は０．７６０±０．０４４であり、「６」では、ＴＹＲの相対的な発現量は０．８５８±０．０２２であった。
　図１２に示すように、「１」では、ＴＹＲＰの相対的な発現量は１．０３１±０．０２７であり、「２」では、ＴＹＲＰの相対的な発現量は１．３３３±０．０５５であり、「３」では、ＴＹＲＰの相対的な発現量は１．６５２±０．０３１であり、「４」では、ＴＹＲＰの相対的な発現量は１．３３８±０．０２９であり、「５」では、ＴＹＲＰの相対的な発現量は１．４５０±０．０２８であり、「６」では、ＴＹＲＰの相対的な発現量は１．５１４±０．１２４であった。
　図１１に示すように、１ｎＭまたは２０ｎＭのシロリムスで２４時間メラノサイトを処理するか、２０ｎＭのシロリムスで４８時間メラノサイトを処理することによって、ＴＹＲの発現量が増加したことが確認された。また、図１２に示すように、１ｎＭまたは２０ｎＭのシロリムスで２４時間または４８時間メラノサイトを処理することによって、ＴＹＲＰの発現量が増加したことが確認された。
　このように、メラノサイトをシロリムスで処理することによって、ＭＩＴＦ、ＴＹＲおよびＴＹＲＰの発現量が増加することは、メラニンの産生が増加することを示している。
　＜シロリムスによるメラニン生産量の増加の確認＞
　（試験方法）
　６ウェルに対して、メラノサイト（２人の正常な人に由来するメラノサイト（以下、各々をメラノサイト１およびメラノサイト２と呼ぶ））を播種した。なお、メラノサイトの数は、１ウェルあたり２×１０５個であり、培地としてはｍｅｄｉｕｍ２５４／ＨＭＧＳ２(ＰＭＡ（－)（抗生剤無し）を用いた。
　２４時間後、各ウェルに対して０ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭとなるようにシロリムスを添加し、４日間の培養を行った。
　４日間の培養の後、各ウェルをＰＢＳにて２回洗浄した。
　ＰＢＳによる洗浄の後、各ウェルに対して１ｍＬのＥＤＴＡ／トリプシン（２：１）溶液を加えて、メラノサイトをウェルから剥がした。メラノサイトを含む溶液を１．５ｍＬのチューブへ入れた後、当該チューブを１５００ｒｐｍ、４℃にて５分間、遠心分離した。
　遠心分離の後、チューブ内の上清を捨てた後、ペレット（メラノサイト）を１ｍＬのＰＢＳ中にけん濁した。３０μＬのけん濁液を用いて、けん濁液中のメラノサイトの数をカウントした。
　残りの９７０μＬのけん濁液を１５００ｒｐｍ、４℃にて５分間、遠心分離した。
　遠心分離の後、チューブ内の上清を捨ててペレットを得た後、当該ペレットに対して１ｍＬのＮａＯＨ（１Ｎ）を添加した。当該溶液を１００℃にて３０分間煮沸した後、室温にまで冷却した。
　冷却の後、溶液を１６０００ｇにて２０分間遠心分離した後、上清の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、このとき同時に、スタンダードの吸光度も測定した。
　市販のメラニンを１ＮのＮａＯＨに溶解し、様々な濃度のメラニン含有ＮａＯＨ（１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）を作製した。様々な濃度のメラニン含有ＮａＯＨの４００ｎｍにおける吸光度を測定して標準曲線を作製した。
　上記標準曲線から、メラノサイトを溶解したＮａＯＨに含有されるメラニンの量を計算した。そして、当該メラニンの量を、細胞数１×１０４当りの量に補正した。
　（試験結果）
　細胞数１×１０４当りの量に補正したメラニンの量を、図２３および図２４に示す。なお、図２３は、メラノサイト１のデータを示し、図２４は、メラノサイト２のデータを示している。
　図２３および２４から明らかなように、シロリムスにて処理されたメラノサイトでは、メラニンの生産量が増加していた。また、シロリムスの濃度が上昇するのに伴って、メラニンの生産量も増加していた。
　＜本発明の外用薬の白斑に対する効果の確認－１＞
　結節性硬化症の患者における白斑に、上記ゲル３または上記軟膏３を１日当たり２回、６週間塗布した。図１３に、ゲル３の塗布開始前の白斑の写真（ａ）、およびゲル３の塗布開始から６週間後の白斑の写真（ｂ）を示す。図１４に、軟膏３の塗布開始前の白斑の写真（ａ）、および軟膏３の塗布開始から６週間後の白斑の写真（ｂ）を示す。図１３および図１４中の矢印は白斑を示す。図１３の（ｂ）および図１４の（ｂ）では、同図の（ａ）に示された白斑が消退している。また、丘疹および紅色局面も軽快している。よって、ゲル３または軟膏３を塗布することによって白斑を処置できることが示された。
　前額部（露光部）に発症している白斑、または、腹部（非露光部）に発症している白斑に、上記ゲル３または上記軟膏３を１日当たり２回、３ヶ月間塗布した。白斑が発症している箇所を分光測色計（コニカミノルタ社製の分光測色計：Ｍ－２６００ｄ）によって白斑の症状を判定し、白斑の症状の推移を確認した。
　図２５に、前額部（露光部）に白斑が発症している４人の患者のデータを示し、図２６に腹部（非露光部）に白斑が発症している４人の患者のデータを示す。
　図２５および図２６から明らかなように、何れの患者においても、時間が経過するに従って、白斑が小さくなった。つまり、本発明の外用薬は、様々な体の部位に発症した白斑に対して治療効果を有していることが明らかになった。また、本発明の外用薬は、腹部（非露光部）に発症している白斑よりも、前額部（露光部）に発症している白斑に対する治療効果がより高いことが明らかになった。
　＜本発明の外用薬の白斑に対する効果の確認－２＞
　尋常性白斑（頚部または腹部に発症した尋常性白斑）に、上記ゲル３または上記軟膏３を１日当たり２回、２ヶ月間塗布した。図２７および図２８に、２人の患者の尋常性白斑の写真を示す。図２７および図２８から明らかなように、２人の患者の何れにおいても、尋常性白斑が消退した。
　〔本発明の外用薬を用いたアトピー性皮膚炎の処置〕
　アトピー性皮膚炎の処置薬としては、タクロリムスまたはピメクロリムスが使用されている。タクロリムスなどのアトピー性皮膚炎に対する効果は、タクロリムスなどがＦＫＢＰ１２（イムノフィリン）と結合して、カルシニューリンを抑制することによって発揮されることが知られている。しかし、タクロリムスなどは、腫瘍を発生させるという副作用を有している。
　一方、シロリムスは、タクロリムスと同様にＦＫＢＰ１２に結合するが、カルシニューリンではなくｍＴＯＲを抑制する。このように、シロリムスとタクロリムスとでは、抑制の対象となる分子が異なっている。シロリムスによるｍＴＯＲの抑制によって、マストセルを介した炎症が抑制されることが知られている。さらに、このｍＴＯＲの抑制によって、細胞増殖の抑制やアポトーシスの誘導などの抗腫瘍効果も発揮される。本発明者らは、これらの知見に基づき、本発明の外用薬がアトピー性皮膚炎の処置に有効であると考えた。本発明の外用薬は、タクロリムスなどと異なり、腫瘍を発生させることがないため、より安全なアトピー性皮膚炎の治療薬になり得る。そこで、本実施例では、以下のような試験を実施して、本発明の外用薬のアトピー性皮膚炎に対する効果を確認した。
　＜試験方法＞
　マウスの背中の皮膚に、ダニの抗原を含んでいる軟膏（ビオスタＡＤ、ビオスタ株式会社製、ＡＤ００１）を２週間塗布することによってこの皮膚にアトピー性皮膚炎を誘発した。具体的には、マウスの背中の毛を剃り、背中の皮膚を露出させた。そして、ダニの抗原を含んでいる軟膏を、この軟膏の塗布開始日（０日目）、この塗布開始日から４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目、および２５日目に、背中の露出した皮膚に塗布した。
　ダニの抗原を含んでいる軟膏の塗布開始日から１３日目に、上記軟膏２、シロリムスを含んでいないことを除いて軟膏２と同一である軟膏（コントロール）、および０．１質量％のタクロリムスを含む軟膏（プロトピック（登録商標）軟膏０．１％、ポジティブコントロール）を、それぞれアトピー性皮膚炎が誘発された皮膚の部位に、週２回、２週間塗布した。具体的には、これらの軟膏を、それぞれ１３日目、１７日目、２０日目、２４日目および２７日目に上記皮膚の部位に塗布した。０日目、７日目、１３日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目および２８日目に、上記軟膏を塗布した皮膚の部位を観察し、アトピー性皮膚炎の評価を行った。
　アトピー性皮膚炎の評価は、紅斑、浮腫および糜爛の程度に４段階のスコアを割り当てることによって行った。
　すなわち、紅斑については、紅斑が処置の開始前と比べて変化しなかった場合、スコアを０とし、軽度の紅斑の場合、スコアを１とし、中程度の紅斑の場合、スコアを２とし、重度の紅斑の場合、スコアを３とした。浮腫については、浮腫が処置の開始前と比べて変化しなかった場合、スコアを０とし、軽度の浮腫の場合、スコアを１とし、中程度の浮腫の場合、スコアを２とし、重度の浮腫の場合、スコアを３とした。糜爛については、糜爛が処置の開始前と比べて変化しなかった場合、スコアを０とし、軽度の糜爛の場合、スコアを１とし、中程度の糜爛の場合、スコアを２とし、重度の糜爛の場合、スコアを３とした。紅斑、浮腫および糜爛のスコアの合計を総合的なスコアとした。
　２８日目にマウスを殺傷し、マウスの背中の写真を撮影した。また、アトピー性皮膚炎を誘発した皮膚を採取した。採取した皮膚の切片を作製し、切片に対してヘマトキシリン－エオシン染色を行うか、またはトルイジンブルー染色を行った。
　＜試験結果＞
　アトピー性皮膚炎の評価の結果を図１５および図１６に示す。図１５は、上述した軟膏を用いた処置の各時点における、３匹のマウスのそれぞれにおける総合的なスコアを示すグラフである。図１５の（ａ）は、ポジティブコントロールを用いた場合の各マウスにおける総合的なスコアを示すグラフであり、（ｂ）は、軟膏２を用いた場合の各マウスにおける総合的なスコアを示すグラフであり、（ｃ）は、ネガティブコントロールを用いた場合の各マウスにおける総合的なスコアを示すグラフである。図１５の（ａ）～（ｃ）における「Ａ」～「Ｉ」は、試験に用いたマウスを示す。図１５の（ａ）～（ｃ）において、横軸の「１」～「５」は、それぞれ処置の開始（０日目）、処置の開始から７日目、処置の開始から１４日目、処置の開始から２１日目、および処置の開始から２８日目を示す。
　図１５の（ａ）に示すように、１、２、３、４、および５において、Ａのマウスのスコアは、それぞれ０、２、４．５、７．５および５．５であり、Ｂのマウスのスコアは、それぞれ０、４、７．５、７．５および５であり、Ｃのマウスのスコアは、それぞれ０、２．５、７．５、７．５および４であった。図１５の（ｂ）に示すように、１、２、３、４、および５において、Ｄのマウスのスコアは、それぞれ０、３、８、８．５、および７．５であり、Ｅのマウスのスコアは、それぞれ０、４．５、５．５、５．５、および４．５であり、Ｆのマウスのスコアは、それぞれ０、２、６、５、および５であった。図１５の（ｃ）に示すように、１、２、３、４、および５において、Ｇのマウスのスコアは、それぞれ０、４、５、６、および７．５であり、Ｈのマウスのスコアは、それぞれ０、５．５、７、９、および８．５であり、Ｉのマウスのスコアは、それぞれ０、３．５、６．５、７、および８であった。
　また、図１６は、図１５の（ａ）に示した各スコアの平均値（×）、同図の（ｂ）に示した各スコアの平均値（正方形）および同図の（ｃ）に示した各スコアの平均値（菱形）を示すグラフである。図１６に示すように、１、２、３、４、および５において、軟膏２を用いたマウスのスコアは、それぞれ０、３．１６、６．５、６．３、および５．６６であり、ポジティブコントロールを用いたマウスのスコアは、それぞれ０、２．８３、６．５、７．５、および４．８３であり、コントロールを用いたマウスのスコアは、それぞれ０、４．３３、６．１６、７．３３、および８であった。
　図１５および図１６に示すように、ネガティブコントロールを用いた場合、時間経過と共にスコアが大きくなったが、軟膏２およびポジティブコントロールを用いた場合、時間経過と共にスコアが小さくなった。これは、ネガティブコントロールを塗布することによってアトピー性皮膚炎が処置されないが、軟膏２またはポジティブコントロールを塗布することによってアトピー性皮膚炎が処置されることを示している。なお、軟膏２を用いた場合のスコアとポジティブコントロールを用いた場合のスコアとが同様の値であるので、軟膏２とポジティブコントロールとがアトピー性皮膚炎に対して同等の効果を有していることが認められる。
　図１７に、マウスの背中の写真（（ａ）～（ｄ））、ヘマトキシリン－エオシン染色を行った皮膚の切片の写真（（ｅ）～（ｈ））、トルイジンブルー染色を行った皮膚の切片の写真（（ｉ）～（ｌ））を示す。図１７において、（ａ）、（ｅ）および（ｉ）はダニの抗原を含んでいる軟膏も上述した外用薬も塗布されていない未処置のマウスの写真であり、（ｂ）、（ｆ）および（ｊ）はダニの抗原を含んでいる軟膏および上記コントロールを塗布したマウスの写真であり、（ｃ）、（ｇ）および（ｋ）はダニの抗原を含んでいる軟膏および上記軟膏２を塗布したマウスの写真であり、（ｄ）、（ｈ）および（ｌ）はダニの抗原を含んでいる軟膏およびポジティブコントロールを塗布したマウスの写真である。図１７の（ｅ）～（ｈ）では、表皮を矢印で示し、真皮への細胞を矢じりで示す。図１７の（ｉ）～（ｌ）では、マストセルを矢印で示す。
　図１７の（ａ）～（ｄ）を対比すると、ダニの抗原を含んでいる軟膏が塗布されたマウスでは、紅斑、浮腫および糜爛が生じている（アトピー性皮膚炎が発症している）。軟膏２またはポジティブコントロールが塗布されたマウスは、ネガティブコントロールが塗布されたマウスと比べて、紅斑、浮腫および糜爛の程度が低減されていることが分かる。
　図１７の（ｅ）～（ｈ）を対比すると、ネガティブコントロールが塗布されたマウスは、未処置のマウスに比べて著明な真皮への細胞の浸潤が認められる。一方、軟膏２またはポジティブコントロールが塗布されたマウスは、ネガティブコントロールが塗布されたマウスと比べて、表皮への細胞の浸潤が少ない。
　図１７の（ｉ）～（ｌ）を対比すると、ネガティブコントロールが塗布されたマウスは、未処置のマウスには見られないマストセルの浸潤が認められる。一方、軟膏２またはポジティブコントロールが塗布されたマウスは、ネガティブコントロールが塗布されたマウスに見られるようなマストセルの浸潤が少ない。
　以上の結果から、軟膏２を塗布することによって、アトピー性皮膚炎が軽快することが分かった。軟膏２を塗布したマウスとポジティブコントロールを塗布したマウスとでは、アトピー性皮膚炎の同等の症状の軽快が認められる。
　〔本発明の外用薬を用いた結節性硬化症の患者の紅斑の処置〕
　紅斑は、血管新生の盛んな部位である。このような紅斑が、ｍＴＯＲの活性化に起因する疾患（結節性硬化症など）に罹患した患者においてしばしば発生することが知られている。本発明者らは、このような疾患において紅斑が発生するメカニズムが以下のとおりであると考えた。
　すなわち、上記患者の細胞内においてｍＴＯＲが活性化された結果、ＨＩＦ１αの活性が上昇し、活性化したＨＩＦ１αがＨＩＦ１βとヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーがＤＮＡのＨＲＥ配列に結合することによって、ＶＥＧＦの転写を誘導して、ＶＥＧＦの発現を増加させる。発現されたＶＥＧＦによって血管新生が引き起こされる。このようにして、紅斑が発生する。
　このように、本発明者らは、紅斑の発生にｍＴＯＲの活性化が関与しているので、本発明の外用薬が紅斑の処置に有効であると考えた。そこで、本実施例では、以下のような試験を実施して、結節性硬化症の患者の細胞においてＶＥＧＦが発現していること、およびシロリムスがこのＶＥＧＦの発現を抑制することを見出した。そして、本発明の外用薬の結節性硬化症の患者の紅斑に対する効果を確認した。
　＜結節性硬化症の患者から単離した血管線維腫がＶＥＧＦを発現することの確認＞
　（試験方法）
　重症の血管線維腫を有する患者、中等症の血管線維腫を有する患者、および軽症の血管線維腫を有する患者からそれぞれ、重症、中等症、または軽症の血管線維腫の細胞を単離した。血管線維腫の細胞は、線維芽細胞の一般的な初代培養法（黒木登志男他編：分子生物学研究のための新培養細胞実験法　実験医学　別冊　バイオマニュアルＵＰシリーズ　改定第２版、羊土社　参照）にしたがって各患者の顔面から単離した。患者から取得した細胞はいずれも患者の同意を得た上で用いた。
　単離した各細胞をＤＭＥ培地を用いて３７℃および５％ＣＯ２の環境下にて４８時間培養し、培養上清を回収した。そして、培養上清中のＶＥＧＦの濃度を、ＶＥＧＦを検出するキット（Quantikine（登録商標）　Human VEGF、R＆D SYSTEMS（登録商標）社製）を用いて測定した。
　（試験結果）
　上述した試験の結果を図１８に示す。図１８において、Ａは重症の血管線維腫の細胞を示し、Ｂは中等症の血管線維腫の細胞を示し、Ｃは軽症の血管線維腫の細胞を示す。図１８に示すように、重症の血管線維腫の細胞を用いた場合のＶＥＧＦの濃度は４６８．８５７ｐｇ／ｍＬであり、中等症の血管線維腫の細胞を用いた場合のＶＥＧＦの濃度は２６０．２８６ｐｇ／ｍＬであり、軽症の血管線維腫の細胞を用いた場合のＶＥＧＦの濃度は１４７．４２９ｐｇ／ｍＬである。このように、血管線維腫の細胞においてＶＥＧＦが発現しており、血管線維腫の症状が重くなるほど、ＶＥＧＦの発現量が高くなることが分かった。
　＜シロリムスによるＶＥＧＦの発現の抑制の確認＞
　（試験方法）
　結節性硬化症の患者から単離した血管線維腫の細胞、ヒト線維芽細胞、ＨａＣａｔを用いた。血管線維腫の細胞の単離は、この血管線維腫の切除を希望する患者から血管線維腫を切除し、上述した初代培養法を用いて行った。ヒト線維芽細胞は、結節性硬化症（ＴＳＣ）でない患者の組織から、上述した初代培養法を用いて取得した。ＨａＣａｔは、ドイツ連邦共和国癌研究センター（ｄｋｆｚ）から購入した。患者から取得した細胞はいずれも患者の同意を得た上で用いた。
　血管線維腫の細胞、ヒトの線維芽細胞、およびＨａＣａｔを、ＤＭＥ培地を用いて３７℃および５％ＣＯ２の環境下にて培養した。これらの細胞の培養中に、シロリムスを終濃度が０ｎＭ（すなわち、シロリムスを培地に加えない（コントロール）。）、１ｎＭ、１０ｎＭまたは２０ｎＭとなるように培地に加えた。再び、細胞を３７℃および５％ＣＯ２の環境下にてインキュベートし、シロリムスを加えてから４８時間後または７２時間後に培養上清を回収した。ＶＥＧＦを検出するキット（Quantikine（登録商標）　Human VEGF、R＆D SYSTEMS（登録商標）社製）を用いて、回収した培養上清中のＶＥＧＦの濃度を測定した。
　（試験結果）
　上述した試験の結果を図１９に示す。
　図１９の（ａ）は血管線維腫の細胞の培養中にシロリムスを加えてから４８時間後の、培養上清中のＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。図１９の（ｂ）は、ＨａＣａｔ、ヒト線維芽細胞（ｎｏｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏ）、および血管線維腫の細胞（ＴＳＣ　ＡＦ　ｆｉｂｒｏ）の培養中にシロリムスを加えてから７２時間後の培養上清中のＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）と、これらの細胞の培養中にシロリムスを加えないで同様に７２時間培養したときの培養上清中のＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。図１９の（ｃ）は、これらの３種類の細胞をシロリムスで処理したことによって引き起こされたＶＥＧＦの濃度の減少割合（比：２０ｎＭのシロリムスで処理した後のＶＥＧＦの濃度／２０ｎＭのシロリムスで処理する前のＶＥＧＦの濃度）を示すグラフである。図１９の（ｄ）はＨａＣａｔの培養中にシロリムスを加えてから４８時間後の、培養上清中のＶＥＧＦの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
　図１９の（ａ）に示すように、シロリムスで血管線維腫の細胞を処理しない場合（０ｎＭ）、ＶＥＧＦの濃度が２６０．２８５７ｐｇ／ｍＬであり、１ｎＭのシロリムスで血管線維腫の細胞を処理した場合、ＶＥＧＦの濃度が１１３．１４２８ｐｇ／ｍＬであり、１０ｎＭのシロリムスで血管線維腫の細胞を処理した場合、ＶＥＧＦの濃度が９２．４２８５ｐｇ／ｍＬであった。
　図１９の（ａ）によれば、シロリムスの濃度を増加させるほど、ＶＥＧＦの発現量が低減されることが示された。
　図１９の（ｂ）に示すように、シロリムスでＨａＣａｔを処理しない場合（コントロール）、ＶＥＧＦの濃度が１８４９．９ｐｇ／ｍＬであり、２０ｎＭのシロリムスでＨａＣａｔを処理した場合、ＶＥＧＦの濃度が７４９．９ｐｇ／ｍＬであり、シロリムスでヒト線維芽細胞を処理しない場合（コントロール）、ＶＥＧＦの濃度が１４９２．７ｐｇ／ｍＬであり、２０ｎＭのシロリムスでヒト線維芽細胞を処理した場合、ＶＥＧＦの濃度が５０１．３ｐｇ／ｍＬであり、シロリムスで血管線維腫の細胞を処理しない場合（コントロール）、ＶＥＧＦの濃度が８５８．４ｐｇ／ｍＬであり、２０ｎＭのシロリムスで血管線維腫の細胞を処理した場合、ＶＥＧＦの濃度が１６８ｐｇ／ｍＬであった。
　図１９の（ｃ）は、図１９の（ｂ）に示す、２０ｎＭのシロリムスで細胞を処理した場合のＶＥＧＦの濃度をシロリムスで細胞を処理しない場合のＶＥＧＦの濃度で除した結果を示すグラフである。図１９の（ｃ）に示すように、ＨａＣａｔの場合、２０ｎＭのシロリムスで処理することによってＶＥＧＦの濃度が０．４０５３ｐｇ／ｍＬとなり（約４０％に低下し）、ヒト線維芽細胞の場合、２０ｎＭのシロリムスで処理することによってＶＥＧＦの濃度が０．３３５８ｐｇ／ｍＬとなり（約３０％に低下し）、血管線維腫の細胞の場合、２０ｎＭのシロリムスで処理することによってＶＥＧＦの濃度が０．１９５７ｐｇ／ｍＬとなった（約２０％に低下した）。
　図１９の（ｄ）によれば、シロリムスの濃度を増加させるほど、ＶＥＧＦの発現量が低減されることが示された。
　図１９の（ｂ）および（ｃ）によれば、ヒト線維芽細胞およびＨａＣａｔよりも血管線維腫の細胞の方が、シロリムスによるＶＥＧＦの発現抑制の影響を受けやすいことが分かった。
　また、メラノサイトを様々な濃度のシロリムスにて処理したときの、ＨＩＦ１αの発現量の変化を検討した。具体的には、メラノサイトを、３７℃および５％ＣＯ２の環境下にて培養した。これらの細胞の培養中に、シロリムスを終濃度が０ｎＭ（すなわち、シロリムスを培地に加えない（コントロール）。）、１ｎＭまたは１０ｎＭとなるように培地に加えた。再び、細胞を３７℃および５％ＣＯ２の環境下にてインキュベートし、シロリムスを加えてから４８時間後にメラノサイトを回収した。メラノサイトにて発現しているＨＩＦ１αのｍＲＮＡの量をｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲによって測定し、当該ｍＲＮＡの量を、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの量に基づいて補正した。
　図２９に測定結果を示す。図２９から明らかなように、シロリムスによって処理されたメラのノサイトでは、ＨＩＦ１αの発現量が低下していた。
　＜本発明の外用薬の紅斑に対する効果の確認＞
　結節性硬化症の患者の紅斑に、上記軟膏３を１日当たり２回、１２週間塗布した。図２０に、軟膏３の塗布開始前の紅斑の写真（ａ）、および軟膏３の塗布開始から１２週間後の紅斑の写真（ｂ）を示す。図２０中の矢印は紅斑を示す。図２０（ｂ）では、同図の（ａ）に示された紅斑が消退している。よって、軟膏３を塗布することによって紅斑を処置できることが確認された。
　このように、実際に、軟膏３によってヒトにおける血管新生が盛んな局面がほぼ消失した。したがって、同様に血管新生が盛んな酒さに対しても本発明の外用薬が有効であるといえる。
　〔軟膏中のシロリムスの状態〕
　本実施例にて調製した軟膏中にてシロリムスがどのような状態であるのかを確認するために、シロリムスの溶媒である炭酸プロピレンが軟膏中にてどのような状態であるのかを調べた。
　炭酸プロピレンを青色に着色した。次いで、着色した炭酸プロピレンを、本実施例にて調製した軟膏の成分である流動パラフィン、固形パラフィンおよび白色ワセリンの混合物に添加した。また、コントロールとして、着色した炭酸プロピレンを、白色ワセリンに添加した。着色した炭酸プロピレンを上記混合物に添加した場合、図２１の（ａ）の左側の試薬ビンに示すように、炭酸プロピレンは微粒子になり沈殿した。一方、着色した炭酸プロピレンを白色ワセリンに添加した場合、図２１の（ａ）の右側の試薬ビンに示すように、炭酸プロピレンは微粒子を形成することなく沈殿した。
　次いで、着色した炭酸プロピレンが沈殿した混合物を、自転公転ミキサーを用いて常温で、２０００ｒｐｍにて１分間攪拌し、次いで、１０００ｒｐｍにて５分間攪拌し、そして５００ｒｐｍにて３分間攪拌した。同様の操作を、着色した炭酸プロピレンが沈殿した白色ワセリンに対しても行った。攪拌の結果を図２１の（ｂ）に示す。図２１の（ｂ）において、左側の試薬ビンは、着色した炭酸プロピレンが沈殿した混合物を攪拌した結果を示し、右側の試薬ビンは、着色した炭酸プロピレンが沈殿した白色ワセリンを攪拌した結果を示す。図２１の（ｂ）に示すように、炭酸プロピレンを白色ワセリンと一緒に攪拌した場合の方が、炭酸プロピレンを上記混合物と一緒に攪拌した場合よりも、炭酸プロピレンの粒子が大きいことが肉眼でも確認できる。
　また、炭酸プロピレンを上記混合物と一緒に攪拌することによって調製した軟膏、および炭酸プロピレンを白色ワセリンと一緒に攪拌することによって調製した軟膏を、顕微鏡を用いて観察した。観察の結果を図２２に示す。図２２の（ａ）は、混合物を用いて調製した軟膏の顕微鏡写真であり、図２２の（ｃ）は、図２２の（ａ）の拡大図である。図２２の（ｂ）は、白色ワセリンを用いて調製した軟膏の顕微鏡写真であり、図２２の（ｄ）は、図２２の（ｂ）の拡大図である。図２２の（ｃ）および（ｄ）におけるバーは、２５μｍを示す。図２２にて炭酸プロピレンの粒子を矢印で示し、水（黒色）を矢じりで示す。
　図２２の（ａ）および（ｃ）から分かるように、混合物を用いて調製した軟膏では、炭酸プロピレンが軟膏中において１０μｍ以下の均一な微粒子になって分散している。一方、図２２の（ｂ）および（ｄ）から分かるように、白色ワセリンを用いて調製した軟膏では、炭酸プロピレンが軟膏中において様々な大きさの微粒子になって分散しており、均一ではない。
　このような結果は、炭酸プロピレンのみを用いた場合だけでなく、シロリムスが溶解した炭酸プロピレンを用いた場合にも得られると考えられる。すなわち、本実施例にて調製した軟膏中にてシロリムスは、均一な微粒子として分散していると考えられる。このように、シロリムスが均一な微粒子として分散しているため、本実施例にて調製した軟膏を皮膚に塗布することによって、シロリムスの皮膚から患部への吸収が顕著に向上し、シロリムスが血中に漏出することなく患部に留まると考えられる。
　〔基剤に関する検討〕
　＜調製例７：０．２質量％のシロリムスを含むゲルの調製＞
　シロリムスの試薬（Calbiochem社製、553210）２ｍｇをイソプロパノール（和光純薬工業株式会社製、166-04836）１４５ｍｇに溶解させた。得られた溶解物１４７ｍｇをカーボポール（登録商標）９３４ＮＦポリマー（Lubrizol社製）１６ｍｇとＨ２Ｏ８３３ｍｇとの混合物と混合した。得られた混合物に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（和光純薬工業株式会社製、203-06272）４ｍｇを混合した。このようにして、０．２質量％のシロリムスを含むゲル（ゲル４）を調製した。
　＜調製例８：０．２質量％のシロリムスを含むゲルの調製＞
　シロリムスの試薬の代わりにＲａｐａｍｕｎｅを用いたことを除いて、調製例７と同様の作業を行い、０．２質量％のシロリムスを含むゲル（ゲル５）を調製した。具体的には、２ｍｇのＲａｐａｍｕｎｅの錠剤を粉砕し、不純物（賦形剤など）を取り除くために７５μｍのメッシュを通してから、粉砕物をイソプロパノール１４５ｍｇに溶解させた。
　＜調製例９：０．２質量％のシロリムスを含む軟膏の調製＞
　シロリムスの試薬（Calbiochem社製、553210）２ｍｇを炭酸プロピレン（和光純薬工業株式会社製、168-04972）５８ｍｇに溶解させた。固形パラフィン（和光純薬工業株式会社製、415-25791）４５ｍｇ、および白色ワセリン（プロペト）（丸石製薬株式会社製、Merck社製、またはアストラジャパン株式会社製）８９５ｍｇを、７０℃に加熱し溶解させながら混合した。
　この混合物の温度が４０℃になるまで冷却した後、上述したシロリムスの試薬と炭酸プロピレンとの溶解物を添加した。これによって生じた混合物を自転公転ミキサー（シンキ株式会社製、Nano Pulverizer NP-100）を用いて常温で、１分間、２０００ｒｐｍにて攪拌し、次いで５分間、１０００ｒｐｍにて攪拌し、そして３分間、５００ｒｐｍにて攪拌した。このようにして、０．２質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏７）を調製した。
　＜調製例１０：０．２質量％のシロリムスを含む軟膏の調製＞
　シロリムスの試薬（Calbiochem社製、553210）２ｍｇを炭酸プロピレン（和光純薬工業株式会社製、168-04972）５０ｍｇに溶解させた。流動パラフィン（和光純薬工業株式会社製、128-04375）１０ｍｇ、固形パラフィン（和光純薬工業株式会社製、415-25791）３５ｍｇ、および白色ワセリン（プロペト）（丸石製薬株式会社製、Merck社製、またはアストラジャパン株式会社製）８９５ｍｇを、７０℃に加熱し溶解させながら混合した。
　この混合物の温度が４０℃になるまで冷却した後、上述したシロリムスの試薬と炭酸プロピレンとの溶解物を添加した。これによって生じた混合物を自転公転ミキサー（シンキ株式会社製、Nano Pulverizer NP-100）を用いて常温で、１分間、２０００ｒｐｍにて攪拌し、次いで５分間、１０００ｒｐｍにて攪拌し、そして３分間、５００ｒｐｍにて攪拌した。このようにして、０．２質量％のシロリムスを含む軟膏（軟膏８）を調製した。
　＜本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量の確認－２＞
　（試験方法および試験結果－１）
　Ｒａｐａｍｕｎｅを用いて作製した本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量に対して、基剤の組成が及ぼす影響を検討した。具体的には、軟膏３、軟膏７、ゲル３およびゲル５について、外用薬が人工皮膚から吸収される量を測定した。
　具体的な測定方法は、〔本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量の確認〕の欄にて既に説明したので、ここではその説明を省略し、試験結果について説明する。なお、本実施例では、４０ｍｇの軟膏３、軟膏７、ゲル３およびゲル５を用いて、各々３つのサンプルについて試験を行っている。
　上述した試験の結果を図３０に示すとともに、当該試験の実際の数値データを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　図３０および表２から明らかなように、Ｒａｐａｍｕｎｅを用いて作製した本発明の外用薬の場合、軟膏３、軟膏７、ゲル３およびゲル５の中では、ゲル３が、人工皮膚から吸収されるシロリムスの量が最も多かった。
　（試験方法および試験結果－２）
　シロリムスの試薬を用いて作製した本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量に対して、基剤の組成が及ぼす影響を検討した。具体的には、軟膏２、軟膏８、ゲル２およびゲル４について、外用薬が人工皮膚から吸収される量を測定した。
　具体的な測定方法は、〔本発明の外用薬が人工皮膚から吸収される量の確認〕の欄にて既に説明したので、ここではその説明を省略し、試験結果について説明する。なお、本実施例では、４０ｍｇの軟膏２、軟膏８、ゲル２およびゲル４を用いて、各々３つのサンプルについて試験を行っている。
　上述した試験の結果を図３１に示すとともに、当該試験の実際の数値データを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　図３１および表３から明らかなように、シロリムスの試薬を用いて作製した本発明の外用薬の場合、軟膏２、軟膏８、ゲル２およびゲル４の中では、ゲル２が、人工皮膚から吸収されるシロリムスの量が最も多かった。
　（試験方法および試験結果－３）
　上述した（試験方法および試験結果－１）および（試験方法および試験結果－２）に記載したゲル２～５の試験結果を１つのグラフにまとめた結果を図３２に示す。
　図３２から明らかなように、シロリムスの試薬を用いて作製した本発明の外用薬と、Ｒａｐａｍｕｎｅを用いて作製した本発明の外用薬とを比較すれば、シロリムスの試薬を用いて作製した本発明の外用薬の方が、人工皮膚から吸収されるシロリムスの量が多かった。
　〔皮膚への影響の検討〕
　様々な濃度のシロリムス（０質量％、０．０５質量％、０．２質量％、０．４質量％）を含有するゲルおよび軟膏１００ｍｇをＢＡＬＢ／ｃマウスの両耳に単回塗布して、１時間、８時間、２４時間、４８時間および７日後に炎症を生じているか否か確認した。更に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部に１日１回、５日間連続塗布して外用による局所の皮膚炎の有無を観察した。
　上述したゲルおよび軟膏では、全ての時間において、皮膚の異常は観察されなかった。
　本発明は、皮膚疾患を局所的に処置することができる。このため、本発明の医薬品業界だけでなく、化粧品業界にも利用できる。

Claims (15)

  1. 　シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有しているゲル組成物または軟膏組成物を含んでいることを特徴とする皮膚疾患を局所的に処置するための外用薬。
  2. 　前記ゲル組成物は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有している溶液をゲル化したものであることを特徴とする請求項１に記載の外用薬。
  3. 　前記溶液は、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを、イソプロパノールおよびエタノールの少なくとも１つに溶解させたものであることを特徴とする請求項２に記載の外用薬。
  4. 　前記皮膚疾患が、皮膚腫瘍、アトピー性皮膚炎、酒さ、ケロイド、色素斑、脱色素斑、皮膚における血管系の形成異常、皮膚における血管系の良性腫瘍、および上皮系母斑からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の外用薬。
  5. 　前記皮膚腫瘍が、結節性硬化症の皮膚腫瘍、脂漏性角化症、およびレックリングハウゼン病の皮膚腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項４に記載の外用薬。
  6. 　前記色素斑が褐色斑であることを特徴とする請求項４に記載の外用薬。
  7. 　前記褐色斑が扁平母斑またはカフェオレ斑であることを特徴とする請求項６に記載の外用薬。
  8. 　前記脱色素斑が白斑であることを特徴とする請求項４に記載の外用薬。
  9. 　前記ゲル組成物は、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦ、水、イソプロパノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンの少なくとも１つを含んでいることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の外用薬。
  10. 　前記シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つと、カーボポール（登録商標）９３４ＮＦと、水と、イソプロパノールと、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとの質量の比が、２～４：１６：４９０～８３３：１４５～４８８：４であり、
    　前記シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つの比と、前記水の比と、前記イソプロパノールの比との合計が、９８０であることを特徴とする請求項９に記載の外用薬。
  11. 　前記軟膏組成物は、炭酸プロピレン、固形パラフィン、白色ワセリン、流動パラフィンおよびサラシミツロウの少なくとも１つを含んでいることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の外用薬。
  12. 　前記シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つと、炭酸プロピレンと、固形パラフィンと、白色ワセリンと、流動パラフィンと、サラシミツロウとの質量の比が、０．３～１０：５０～５９．４：３０～４５：８９５：０～１０：０～５であり、
    　前記シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つの比と、前記炭酸プロピレンの比と、前記固形パラフィンの比と、前記流動パラフィンの比と、前記サラシミツロウの比との合計が、１０５であることを特徴とする請求項１１に記載の外用薬。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の外用薬を調製するための、
    　シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含んでいることを特徴とする組成物。
  14. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の外用薬を調製するための、シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを備えていることを特徴とするキット。
  15. 　シロリムスおよびその誘導体の少なくとも１つを含有しているゲル組成物または軟膏組成物を作製する工程を包含していることを特徴とする請求項１～１２のいずれか１項に記載の外用薬を製造する方法。
PCT/JP2012/052047 2011-01-31 2012-01-30 皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法 Ceased WO2012105521A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2825786A CA2825786A1 (en) 2011-01-31 2012-01-30 Externally-used drug for treating skin disorder and method for producing same
US13/982,014 US20130317053A1 (en) 2011-01-31 2012-01-30 Externally-used drug for treating skin disorder and method for producing same
JP2012555873A JP5652795B2 (ja) 2011-01-31 2012-01-30 皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法
AU2012211809A AU2012211809A1 (en) 2011-01-31 2012-01-30 Externally-used drug for treating skin disorder and method for producing same
EP12742647.6A EP2671583A4 (en) 2011-01-31 2012-01-30 EXTERNALLY USED MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF SKIN DISEASES AND MANUFACTURING METHOD THEREFOR

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011018273 2011-01-31
JP2011-018273 2011-08-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012105521A1 true WO2012105521A1 (ja) 2012-08-09

Family

ID=46602734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/052047 Ceased WO2012105521A1 (ja) 2011-01-31 2012-01-30 皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20130317053A1 (ja)
EP (1) EP2671583A4 (ja)
JP (1) JP5652795B2 (ja)
AU (1) AU2012211809A1 (ja)
CA (1) CA2825786A1 (ja)
WO (1) WO2012105521A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016152519A1 (ja) * 2015-03-23 2016-09-29 国立大学法人大阪大学 びまん性神経線維腫用の外用薬
KR101828631B1 (ko) * 2013-09-27 2018-02-13 가톨릭대학교 산학협력단 라파마이신 및 미코페놀산을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물
JP2020504182A (ja) * 2017-01-06 2020-02-06 パルヴェラ セラピューティクス エルエルシー ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
WO2020175131A1 (ja) * 2019-02-27 2020-09-03 国立大学法人大阪大学 脈管異常治療用外用剤
WO2020184131A1 (ja) * 2019-03-08 2020-09-17 国立大学法人大阪大学 シロリムスまたはその誘導体を含有する全身作用型外用剤
JPWO2021075328A1 (ja) * 2019-10-16 2021-04-22
WO2021225149A1 (ja) * 2020-05-08 2021-11-11 国立大学法人熊本大学 新規血管障害治療剤
JP2021530463A (ja) * 2018-07-02 2021-11-11 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物および使用方法
JP2022009168A (ja) * 2015-09-24 2022-01-14 ドレクセル ユニバーシティ 真皮障害を治療または予防するための新規組成物および方法
JP2022511270A (ja) * 2018-08-30 2022-01-31 ケミストリーアールエックス． シロリムス含有組成物
JP2022512671A (ja) * 2018-10-11 2022-02-07 ドレクセル ユニバーシティ 皮膚症状を治療または予防する方法
JP2024028808A (ja) * 2017-11-23 2024-03-05 トルク アーゲー 皮膚障害の治療

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9205080B2 (en) 2006-11-16 2015-12-08 Transderm, Inc. Methods of treating keratin hyperproliferation disorders using mTOR inhibitors
AU2014209141B2 (en) * 2013-01-24 2018-05-10 Palvella Therapeutics, Inc. Compositions for transdermal delivery of mTOR inhibitors
US20200261427A1 (en) * 2019-02-20 2020-08-20 Al Therapeutics, Inc. Topical rapamycin formulations and their use in treating facial angiofibromas and other skin disorders
CN112439071B (zh) * 2019-09-04 2022-05-20 武汉科福新药有限责任公司 透皮促渗组合物及其在噻吗洛尔制剂中的应用
EP4114357B1 (en) 2020-03-02 2025-10-01 Shanghai Aucta Pharmaceuticals Co., Ltd. Topical formulations containing mtor inhibitors
CN113181367A (zh) * 2021-03-30 2021-07-30 首都医科大学附属北京儿童医院 一种治疗结节性硬化症血管纤维瘤药物的制备方法
EP4085898A1 (en) 2021-05-05 2022-11-09 Sodha Pharma Consulting GmbH Topical formulation comprising sirolimus
CN116509849B (zh) * 2023-05-26 2025-01-24 首都医科大学附属北京儿童医院 雷帕霉素在制备辅助治疗咖啡斑药物中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0517481A (ja) * 1990-09-04 1993-01-26 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 軟膏剤
WO1999055332A1 (en) * 1998-04-27 1999-11-04 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Medicinal compositions
JP2001522801A (ja) * 1997-11-07 2001-11-20 アバディーン ユニバーシティ 皮膚浸透増強成分
JP2008513388A (ja) * 2004-09-16 2008-05-01 バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト 動物の皮膚病を処置するための皮膚投与可能な製剤
JP2008533153A (ja) * 2005-03-14 2008-08-21 マクロケム コーポレイション ヒトの皮膚を介したマクロライドの浸透増強
JP2009525294A (ja) * 2006-02-02 2009-07-09 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 結節性硬化症処置

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT956034E (pt) * 1996-07-30 2002-12-31 Novartis Ag Composicoes farmaceuticas para o tratamento da rejeicao de transplantes estados inflamatorios ou auto-imunes compreendendo ciclosporina a e 40-o-(2-hidroxietil)-rapamicina
US6936426B2 (en) * 2000-10-06 2005-08-30 Harbor-Ucla Research And Education Institute Detection of antibody mediated inflammatory auto-immune disorders
US20040018228A1 (en) * 2000-11-06 2004-01-29 Afmedica, Inc. Compositions and methods for reducing scar tissue formation
US20050250804A1 (en) * 2004-05-06 2005-11-10 Glenmark Pharmaceuticals Limited Pharmaceutical gel formulations
WO2011079154A1 (en) * 2009-12-21 2011-06-30 Sarah Bacus Compositions and methods for treatment of vitiligo

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0517481A (ja) * 1990-09-04 1993-01-26 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 軟膏剤
JP2001522801A (ja) * 1997-11-07 2001-11-20 アバディーン ユニバーシティ 皮膚浸透増強成分
WO1999055332A1 (en) * 1998-04-27 1999-11-04 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Medicinal compositions
JP2008513388A (ja) * 2004-09-16 2008-05-01 バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト 動物の皮膚病を処置するための皮膚投与可能な製剤
JP2008533153A (ja) * 2005-03-14 2008-08-21 マクロケム コーポレイション ヒトの皮膚を介したマクロライドの浸透増強
JP2009525294A (ja) * 2006-02-02 2009-07-09 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 結節性硬化症処置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ICHIRO KATAYAMA: "Kessetsusei Kokasho no Ganmen Kekkan Sen'isho ni Taisuru Rapamycin Nanko Gaiyo Ryoho ni Kansuru Kenkyu", KOSEI RODO KAGAKU KENKYUHI HOJOKIN NANJISEI SHIKKAN KOKUFUKU KENKYU JIGYO SHINKEI HIFU SHOKOGUN NI KANSURU CHOSA HOKOKU HEISEI 21 NENDO SOKATSU - BUNTAN KENKYU HOKOKUSHO, 31 March 2010 (2010-03-31), pages 63 - 65, XP008169477 *
See also references of EP2671583A4 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101828631B1 (ko) * 2013-09-27 2018-02-13 가톨릭대학교 산학협력단 라파마이신 및 미코페놀산을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물
JP2016175884A (ja) * 2015-03-23 2016-10-06 国立大学法人大阪大学 びまん性神経線維腫用の外用薬
US10117857B2 (en) 2015-03-23 2018-11-06 Osaka University External medicine for diffuse plexiform neurofibroma
WO2016152519A1 (ja) * 2015-03-23 2016-09-29 国立大学法人大阪大学 びまん性神経線維腫用の外用薬
JP2022009168A (ja) * 2015-09-24 2022-01-14 ドレクセル ユニバーシティ 真皮障害を治療または予防するための新規組成物および方法
JP7573078B2 (ja) 2015-09-24 2024-10-24 ドレクセル ユニバーシティ 真皮障害を治療または予防するための新規組成物および方法
JP2023154020A (ja) * 2015-09-24 2023-10-18 ドレクセル ユニバーシティ 真皮障害を治療または予防するための新規組成物および方法
JP7332666B2 (ja) 2015-09-24 2023-08-23 ドレクセル ユニバーシティ 真皮障害を治療または予防するための新規組成物および方法
JP7416849B2 (ja) 2017-01-06 2024-01-17 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
JP7108631B2 (ja) 2017-01-06 2022-07-28 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
JP7698749B2 (ja) 2017-01-06 2025-06-25 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
JP2024041830A (ja) * 2017-01-06 2024-03-27 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
JP2020504182A (ja) * 2017-01-06 2020-02-06 パルヴェラ セラピューティクス エルエルシー ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
JP2022104987A (ja) * 2017-01-06 2022-07-12 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物およびその使用方法
JP2024028808A (ja) * 2017-11-23 2024-03-05 トルク アーゲー 皮膚障害の治療
JP2021530463A (ja) * 2018-07-02 2021-11-11 パルヴェラ セラピューティクス、インク． ｍＴＯＲ阻害剤の無水組成物および使用方法
JP2022511270A (ja) * 2018-08-30 2022-01-31 ケミストリーアールエックス． シロリムス含有組成物
JP2022512671A (ja) * 2018-10-11 2022-02-07 ドレクセル ユニバーシティ 皮膚症状を治療または予防する方法
CN113453758A (zh) * 2019-02-27 2021-09-28 国立大学法人大阪大学 脉管异常治疗用外用剂
JPWO2020175131A1 (ja) * 2019-02-27 2021-12-23 国立大学法人大阪大学 脈管異常治療用外用剤
WO2020175131A1 (ja) * 2019-02-27 2020-09-03 国立大学法人大阪大学 脈管異常治療用外用剤
WO2020184131A1 (ja) * 2019-03-08 2020-09-17 国立大学法人大阪大学 シロリムスまたはその誘導体を含有する全身作用型外用剤
WO2021075328A1 (ja) * 2019-10-16 2021-04-22 国立大学法人大阪大学 てんかん治療用又は自閉症スペクトラム障害治療用外用剤
JPWO2021075328A1 (ja) * 2019-10-16 2021-04-22
JP7601398B2 (ja) 2019-10-16 2024-12-17 国立大学法人大阪大学 てんかん治療用又は自閉症スペクトラム障害治療用外用剤
JPWO2021225149A1 (ja) * 2020-05-08 2021-11-11
WO2021225149A1 (ja) * 2020-05-08 2021-11-11 国立大学法人熊本大学 新規血管障害治療剤
JP7745891B2 (ja) 2020-05-08 2025-09-30 国立大学法人 熊本大学 新規血管障害治療剤
US12564576B2 (en) 2020-05-08 2026-03-03 National University Corporation Kumamoto University Therapeutic agent for vascular disorder

Also Published As

Publication number Publication date
US20130317053A1 (en) 2013-11-28
AU2012211809A1 (en) 2013-09-05
EP2671583A1 (en) 2013-12-11
JP5652795B2 (ja) 2015-01-14
CA2825786A1 (en) 2012-08-09
EP2671583A4 (en) 2014-09-03
JPWO2012105521A1 (ja) 2014-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5652795B2 (ja) 皮膚疾患を処置するための外用薬およびその製造方法
Sheng et al. The application of corticosteroids for pathological scar prevention and treatment: current review and update
Mir-Palomo et al. Inhibition of skin inflammation by baicalin ultradeformable vesicles
US9839638B2 (en) Compositions and methods for protecting cells during cancer chemotherapy and radiotherapy
Ge et al. Naringenin promoted spinal microglia M2 polarization in rat model of cancer-induced bone pain via regulating AMPK/PGC-1α signaling axis
AU2009329035A1 (en) Topical formulation(s) for the treatment of inflammation, skin and mucosal disorders and other diseases thereof
Wang et al. The flavonoid baicalein promotes NMDA receptor‐dependent long‐term potentiation and enhances memory
Souto et al. Lipid nanocarriers for hyperproliferative skin diseases
Alqarni et al. Exploring acemannan-loaded nanogel formulation for the treatment of IMQ-induced psoriasis-like inflammation: In vitro characterization and in vivo efficacy assessment
Zhou et al. Improving anti-oxidant stress treatment of subarachnoid hemorrhage through self-assembled nanoparticles of oleanolic acid
EP3275441B1 (en) External medicine for diffuse plexiform neurofibroma
EP3427733A1 (en) Agent for treating fabry disease, analgesic for external use and perspiration accelerator
Powale et al. Preparation and Characterization of Ethosomes for Topical Delivery of Clindamycin.
Kumar et al. Enhanced Anti‐Psoriasis Efficacy of Curcumin via Optimized Nanostructured Lipid Carrier‐Embedded Nanogel System
Guo et al. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex improves the percutaneous therapeutic effect of eugenol on psoriasis mice
Kaur et al. Emerging Therapeutic Agents and Nanotechnology-Driven Innovations in Psoriasis Management
KR102071614B1 (ko) 6-디아조-5-옥소-l-노르루신을 포함하는 염증성 피부 질환 치료용 약제학적 조성물
JP2018193329A (ja) トランスグルタミナーゼ発現促進剤
Khan et al. Exploring Therapeutic Approaches for Vitiligo: An Inclusive Review from Translational Modalities to Alternative Therapies
WO2020175131A1 (ja) 脈管異常治療用外用剤
CN121015680B (zh) 野黄芩苷与红景天苷联合在治疗日光性皮炎中的应用
CN101953836A (zh) 氟非尼酮在制备治疗银屑病的药物中的应用
CN120154719A (zh) Bcl2抑制剂在治疗先天性巨大黑痣中的应用
Dong et al. Taohong Siwu Decoction Alleviates Hand-Foot Skin Reaction by Regulating RAGE-mediated Keratinocyte Apoptosis and Autophagy
Sood et al. Zebularine Ameliorates Imiquimod‐Induced Psoriasis by Inhibiting Oxidative Stress and Inflammation With Concomitant Inhibition of NF‐κB/MAPK and DNMT1

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12742647

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012555873

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2825786

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13982014

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2012742647

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012742647

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012211809

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20120130

Kind code of ref document: A