WO2012121310A1 - ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置 - Google Patents

ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2012121310A1
WO2012121310A1 PCT/JP2012/055884 JP2012055884W WO2012121310A1 WO 2012121310 A1 WO2012121310 A1 WO 2012121310A1 JP 2012055884 W JP2012055884 W JP 2012055884W WO 2012121310 A1 WO2012121310 A1 WO 2012121310A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bead
beads
target molecule
hydrophobic
array
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/055884
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博行 野地
亮太 飯野
卓 新木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to RU2013144617/28A priority Critical patent/RU2548619C1/ru
Priority to JP2013503587A priority patent/JP5337324B2/ja
Priority to BR112013022933-0A priority patent/BR112013022933B1/pt
Priority to EP12754743.8A priority patent/EP2685266A1/en
Priority to US14/003,509 priority patent/US9329174B2/en
Priority to CN201280012033.7A priority patent/CN103415774B/zh
Priority to CA2829185A priority patent/CA2829185C/en
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Priority to AU2012226920A priority patent/AU2012226920B2/en
Publication of WO2012121310A1 publication Critical patent/WO2012121310A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US14/513,660 priority patent/US10018627B2/en
Priority to US15/082,195 priority patent/US20160223531A1/en
Priority to US15/351,522 priority patent/US10267793B2/en
Priority to US16/260,413 priority patent/US10809257B2/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50853—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates with covers or lids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B01J2219/00317—Microwell devices, i.e. having large numbers of wells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00457—Dispensing or evacuation of the solid phase support
    • B01J2219/00459—Beads
    • B01J2219/00466—Beads in a slurry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B01J2219/00619—Delimitation of the attachment areas by chemical means using hydrophilic or hydrophobic regions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0642—Filling fluids into wells by specific techniques
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0858—Side walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B01L2300/165—Specific details about hydrophobic, oleophobic surfaces

Definitions

  • Single-molecule measurement is known as a method of performing various measurements by observing biomolecules such as proteins and nucleic acids in an individually identified manner. Several methods are known for performing this single molecule measurement.
  • Patent Document 1 describes a microchamber used for detection of single-molecule enzyme activity.
  • the microchamber has a container portion that can enclose a droplet and has a capacity of 1000 fL (femtoliter) or less that can be filled with the droplet.
  • a container part is comprised by the hollow which at least a 1st member or a 2nd member has by bonding together a 1st member and a 2nd member.
  • Non-Patent Document 1 describes a method of performing a single molecule enzyme assay using an array of femtoliter droplets in which droplets are covered with oil and can be directly accessed from the outside.
  • a hydrophilic region pattern is formed by forming a hydrophobic region having a height of 17 nm on the hydrophilic surface.
  • Non-Patent Document 2 describes a method for detecting a protein using a single molecule enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the target molecule is specifically encapsulated in a femtoliter droplet (ultrafine droplet), then an antibody labeled with an enzyme is connected to the target molecule, and the activity of the labeled enzyme is detected by the method described above. It is a method to do.
  • a method for specifically encapsulating a target molecule in an ultrafine droplet a method using beads labeled with another antibody or the like that specifically binds to the target molecule can be considered. In this method, after the target molecule is bound to the bead, the bead is encapsulated in an ultrafine solution.
  • a target molecule that is present in a very small amount in the solution, for example, a target molecule of about 30 aM as described above, a very large number of ultra-fine droplets of about 1 million. It is necessary to prepare an array and capture the beads in this array.
  • the bead encapsulating method according to the present invention is used, a large number of beads can be efficiently encapsulated in an array, so that it is possible to contribute to a technique capable of detecting a low concentration target molecule with high sensitivity.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for demonstrating the bead enclosure method based on this invention, and shows the sectional side view of the array 1.
  • FIG. It is a figure which shows typically one Embodiment of the target molecule detection apparatus which concerns on this invention. It is a figure showing the fluorescence image of the array which enclosed the bead in one Example of this invention. It is a graph which shows the fluorescence intensity when a target molecule is detected by a conventional method.
  • (A)-(f) is a figure showing the microscope image of the array which enclosed the bead in the other Example of this invention.
  • the lower layer portion 10 is formed with a plurality of accommodating portions 13 that can accommodate only one bead 41, 41 ′ separated from each other by a side wall 12 having a hydrophobic upper surface. Further, the upper layer portion 20 faces the surface of the lower layer portion 10 where the accommodating portion 13 is formed.
  • the hydrophilic solvent 42 may further contain, for example, a substance for specifically detecting the target molecule captured by the bead 41 ′ in addition to the beads 41 and 41 ′.
  • a substance may be, for example, a fluorescent substrate that is decomposed by a predetermined enzyme bound to a target molecule captured by a bead 41 ′ or a molecule specifically bound to the target molecule to release a fluorescent substance.
  • the molecule that specifically binds to the target molecule may be, for example, a secondary antibody or a nucleic acid.
  • the predetermined enzyme include ⁇ -galactosidase and peroxidase.
  • the fluorescent substrate include Fluorescein-di- ⁇ -galactopyranoside (FDG), Amplex red (registered trademark), and the like.
  • the degassing step is a step of degassing the space 30 between the lower layer portion 10 and the upper layer portion 20 after the bead introduction step and before the hydrophobic solvent step.
  • a degassing method for example, a method of leaving the array 1 in a reduced pressure environment can be suitably used. Specifically, there is a method of leaving the array 1 for about 30 seconds in a vacuum desiccator of about 0.1 atm.
  • the deaeration process is not an essential process, but by performing the deaeration process, the air in the storage unit 13 is removed, and the hydrophilic solvent 42 including the beads 41 and 41 ′ is contained in the storage unit 13. It can be introduced efficiently. Accordingly, it is possible to efficiently enclose the beads 41 and 41 ′ in the accommodating portion 13, and it is more preferable to perform a deaeration process.
  • the hydrophobic solvent 43 may be any solvent that is difficult to mix with the hydrophilic solvent 42 used in the bead introduction step.
  • the hydrophobic solvent 43 include at least one selected from the group consisting of saturated hydrocarbons, unsaturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, silicone oils, perfluorocarbons, halogenated solvents, and hydrophobic ionic liquids. A mixture or the like can be preferably used.
  • saturated hydrocarbons include alkanes and cycloalkanes.
  • alkane include decane and hexadecane.
  • Examples of the unsaturated hydrocarbon include squalene.
  • aromatic hydrocarbons include benzene and toluene.
  • the method for detecting a target molecule includes a reaction step, a bead encapsulation step, and a detection step.
  • the total number of beads is obtained by using the number of accommodating portions 13 in which beads 41 or beads 41 ′ are accommodated and the number of accommodating portions 13 in which beads 41 ′ capturing target molecules are accommodated. Of these, the ratio of the number of beads capturing the target molecule can be calculated. This makes it possible to quantify the concentration of the target molecule.
  • the array 1 includes a lower layer portion 10 and an upper layer portion 20.
  • the lower layer portion 10 includes a plate-like member 11 and a side wall 12 having a hydrophobic upper surface.
  • a plurality of accommodating portions 13 are formed separated from each other by the side walls 12.
  • the plate member 11 preferably has a hydrophilic surface. “Hydrophilic surface” refers to a surface that has a higher affinity with a hydrophilic solvent than with a hydrophobic solvent.
  • the plate-like member 11 may be a solid material, but for example, glass, silicon, polymer resin, or the like can be used.
  • the side wall 12 is a structure that separates each of the plurality of accommodating portions 13 provided on the surface of the plate-like member 11, preferably on the hydrophilic surface.
  • the side wall 12 has a hydrophobic upper surface. “Hydrophobic” is used herein in the same meaning as “lipophilic” and means that the affinity with a hydrophobic solvent is higher than the affinity with a hydrophilic solvent.
  • the side wall 12 only needs to have a hydrophobic upper surface, that is, a surface facing the upper layer portion 20, and the side surface, that is, the inner wall in the accommodating portion 13, may be hydrophobic or hydrophilic.
  • the side wall 12 may be composed of a hydrophilic structure and a hydrophobic layer formed on the upper surface thereof.
  • a hydrophilic structure for example, glass, silicon, polymer resin, or the like can be used.
  • a hydrophobic layer for example, a water-repellent resin, a fluorine-based polymer resin, or the like can be used.
  • the fluoropolymer resin include amorphous fluororesins. Amorphous fluororesin is preferably used because it has high hydrophobicity and low toxicity to biological samples.
  • amorphous fluororesin for example, at least one selected from CYTOP (registered trademark), TEFLON (registered trademark) AF2400, and TEFLON (registered trademark) AF1600 can be suitably used.
  • CYTOP registered trademark
  • TEFLON registered trademark
  • AF1600 TEFLON (registered trademark) AF1600
  • CYTOP registered trademark
  • TEFLON registered trademark
  • the side wall 12 may be made of a hydrophobic material.
  • a fluorine-based polymer resin for example, a paraxylylene-based polymer resin, or the like can be used.
  • the fluoropolymer resin include amorphous fluororesins.
  • the amorphous fluororesin the above-described resins can be suitably used.
  • the side wall 12 should just be comprised so that the some accommodating part 13 may be formed on the plate-shaped member 11, for example, is a plate-shaped structure by which the hole is formed in the position in which the accommodating part 13 is formed. There may be.
  • the height (thickness in the vertical direction) of the side wall 12 from the surface of the plate-like member 11 is such that the beads 41 and 41 ′ accommodated in the accommodating part 13 are not discharged from the accommodating part 13 in the hydrophobic solvent introducing step described later. Any height is acceptable.
  • most of the beads 41, 41 ′ accommodated in the accommodating portion 13, and preferably all of the beads 41, 41 ′ may have a height that falls below the upper surface of the side wall 12.
  • the height of the side wall 12 is 1 time or more of the average particle diameter of the beads 41 and 41 ′ from the viewpoint of efficiently storing the beads 41 and 41 ′ in the storage unit 13.
  • the height of the side wall 12 is preferably 1.5 times or less the average particle diameter of the beads 41 and 41 ′ from the viewpoint of accommodating only one bead 41 and 41 ′ in the accommodating portion 13.
  • Each of the plurality of accommodating portions 13 is a recess that can accommodate only one bead 41, 41 ′, and is separated from each other by the side wall 12.
  • the accommodating portion 13 has a part of the surface of the plate-like member 11 as a bottom surface, and the bottom surface is hydrophilic.
  • the accommodating part 13 should just be a shape and a size in which only one bead 41, 41 'is accommodated.
  • the shape of the region surrounded by the bottom surface and the side surface of the accommodating portion 13 may be, for example, a cylindrical shape, a prismatic shape, or the like.
  • each accommodating portion 13 only needs to be larger than the average particle diameter of the beads 41 and 41 ′. However, it is preferably 1.5 to 2 times the average particle diameter of the beads 41 and 41 ′, for example.
  • the depth of each accommodating part 13 is the same as the height of the side wall 12 in this embodiment. In addition, it is preferable that the depth of the accommodating part in this invention is 1 time or more of the average particle diameter of a bead from a viewpoint of accommodating a bead efficiently in an accommodating part. Moreover, it is preferable that the depth of the accommodating part in this invention is 1.5 times or less of the average particle diameter of a bead from a viewpoint of accommodating only one bead in an accommodating part.
  • the bottom surface of the accommodating portion 13 is hydrophilic, and the top surface of the side wall 12 is hydrophobic.
  • the upper layer portion 20 is opposed to the surface of the lower layer portion 10 where the accommodating portion 13 is formed with a space 30 therebetween. That is, there is a space 30 between the side wall 12 and the hydrophobic layer 22. This space 30 constitutes a flow path. With this configuration, the array 1 has a flow cell structure.
  • the distance between the upper surface of the side wall 12 and the hydrophobic layer 22 plate-like member 21, that is, the width in the vertical direction of the space 30 suffices to be at least larger than the average particle diameter of the beads 14, 14 ′, and is 10 to 150 ⁇ m. Is preferred.
  • the upper surface of the space 30 is the surface of the hydrophobic layer 22, and the lower surface of the space 30 is the upper surface of the side wall 12 and the accommodating portion 13. Therefore, all portions of the space 30 other than the bottom surface of the accommodating portion 13 are hydrophobic.
  • the hydrophilic solvent 42 containing the beads 41 and 41 ′ can be efficiently introduced into each accommodating portion 13 in a bead introduction step described later.
  • the hydrophobic solvent 43 is not allowed to enter the respective accommodating portions 13. Therefore, by introducing the hydrophobic solvent 43 into the space 30, it is possible to efficiently form droplets in which the beads 41 and 41 ′ are sealed in each housing portion 13.
  • the array 1 for example, an array in which 1 million or more accommodating portions are formed. Even in such an array with a large area, it is possible to efficiently encapsulate beads in each accommodating portion by using the bead encapsulating method or the method for detecting target molecules according to this embodiment. Therefore, according to this embodiment, target molecules can be detected with high sensitivity, and therefore an array capable of detecting even a very low concentration of target molecules of about 0.1 aM can be provided.
  • the kit according to this embodiment includes at least the array 1 and the beads 41.
  • the array 1 As the array 1, the array 1 having the above-described configuration can be suitably used.
  • Each of the accommodating portions 13 of the array 1 is configured to accommodate only one bead 41 included in the kit.
  • the beads 41 provided in this kit may be those that specifically capture target molecules, for example, those that are bound with molecules that specifically bind to the target molecules.
  • the target molecule and the molecule that specifically binds to the target molecule those described above can be preferably used.
  • This kit may further include a substance for specifically detecting the target molecule.
  • a substance for specifically detecting the target molecule those described above can be preferably used.
  • the kit may further include a water-soluble solvent, a hydrophobic solvent, and the like.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an embodiment of the target molecule detection apparatus according to the present invention.
  • the target molecule detection device 50 includes an array 1, an image sensor 51, and a light source 52. Since the above-described configuration can be suitably used as the array 1, the description thereof is omitted here.
  • the image sensor 51 is a sensor that detects light emitted from each of the storage units 13 when beads capturing the target molecule are stored.
  • it may be a sensor that detects fluorescence emitted by decomposing a fluorescent substrate by a predetermined enzyme bound to a target molecule or a molecule specifically bound thereto.
  • a CMOS image sensor or the like can be suitably used as the image sensor 51.
  • the light source 52 is a light source that irradiates the array 1 with light.
  • the light source 52 is provided on the array 1, but the present invention is not particularly limited to this, and for example, light may be emitted from the side of the array 1.
  • an interference filter, a light guide array, or the like may be provided between the array 1 and the image sensor 51.
  • An excitation filter or the like may be provided between the light source 52 and the array 1.
  • This application includes the following inventions.
  • the bead encapsulating method according to the present invention preferably further includes a degassing step of degassing the space after the bead introducing step and before the hydrophobic solvent introducing step.
  • the hydrophilic solvent is selected from the group consisting of water, hydrophilic alcohol, hydrophilic ether, ketone, nitrile solvent, dimethyl sulfoxide, and N, N-dimethylformamide. It is preferably at least one or a mixture containing the same.
  • a method for detecting a target molecule includes a reaction step of reacting a target molecule with a bead that specifically captures the target molecule, and the reaction step, after the reaction step, A bead enclosing step for performing any of the above-described bead encapsulating methods using beads, and a detection for detecting whether or not the beads capturing the target molecule are accommodated in each of the accommodating portions after the bead enclosing step. And a process.
  • a molecule that specifically binds to the target molecule is bound to the bead.
  • the array according to the present invention has a space between a lower layer portion in which a plurality of accommodating portions are separated from each other by a side wall having a hydrophobic upper surface, and a surface of the lower layer portion where the accommodating portion is formed. And an upper layer portion opposed to each other.
  • each of the housing portions has a hydrophilic bottom surface.
  • the surface of the upper layer portion facing the lower layer portion is hydrophobic.
  • a through hole for introducing a fluid into the space is formed in at least one of the upper layer portion and the lower layer portion.
  • a kit according to the present invention includes any one of the above-described arrays and beads, and each of the storage units can store only one bead. To do.
  • ⁇ -galactosidase labeled streptavidin streptavidin, purchased from SIGMA (hereinafter also simply referred to as “streptavidin”) was used as a target molecule.
  • streptavidin purchased from SIGMA
  • biotinylated beads obtained by biotinylating amino beads having an average particle diameter of 3 ⁇ m (material: polystyrene; micromer-NH 2 -3 ⁇ m; purchased from Micromod) were used as beads.
  • buffer A 100 mM phosphate buffer, pH 8.0
  • the amino beads were collected by centrifugation at 10000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. and suspended in 500 ⁇ L of buffer A (suspension A). Then, 50 ⁇ L of NHS-PEO4-Biotin (2 ⁇ g / 50 ⁇ L DMSO) was added to suspension A, and the mixture was reacted at 25 ° C. with gentle mixing for at least 3 hours (the tube was mixed with end-over-end).
  • biotinylated beads were washed.
  • the biotinylated beads were collected by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the aqueous phase was removed with a pipetman.
  • 1 mL of buffer A was added to the precipitate of biotinylated beads and suspended. This was repeated 6 times to remove unreacted NHS-PEO4-Biotin. Then, it was suspended in 500 ⁇ L of buffer A (suspension B). This suspension B was stored at 4 ° C.
  • the concentration of biotinylated beads in suspension B was examined. Using a hemocytometer, the concentration of biotinylated beads was calculated by counting the number of biotinylated beads in a certain volume (about 3.0 ⁇ 10 8 beads / mL). In order to facilitate the counting, for example, the suspension B was diluted with buffer A about 5 times and counted.
  • streptavidin was captured using biotinylated beads by the following method.
  • biotinylated beads were diluted (8 ⁇ 10 6 beads / 500 ⁇ L). Further, streptavidin labeled with ⁇ -galactosidase was diluted to a concentration twice the target concentration with buffer B (containing 100 mM phosphate buffer, pH 8.0, 0.1% TWEEN 20 (detergent)) (total amount). 500 ⁇ L).
  • the reaction was performed by centrifuging at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to collect the beads after the reaction (a mixture of a complex of streptavidin and biotinylated beads and unreacted biotinylated beads), and the aqueous phase was removed with Pipetman. . 1 mL of buffer A was added to the bead precipitate and suspended. This was repeated 4 times for washing to remove unreacted target molecules.
  • buffer C 100 mM phosphate buffer, pH 7.5, 1 mM MgCl 2
  • the final concentration of beads was approximately 6.5 ⁇ 10 6 beads / 15 ⁇ L buffer C.
  • hydrophilic / hydrophobic pattern glass lower layer part 10
  • upper surface glass upper layer part 20
  • FIG. 7 is a view for explaining a method of producing a hydrophilic / hydrophobic patterned glass in one embodiment of the present invention.
  • a hydrophilic / hydrophobic pattern was formed on glass by photolithography and dry etching.
  • three steps were performed: a CYTOP (registered trademark) coating step, a photolithography step, and an etching / resist removal step.
  • CYTOP registered trademark
  • CTL- on a glass product name: NEO MICRO COVER GLASS Thickness No. 1; manufactured by MATSUNAMI
  • plate member 11 having a length of 24 mm and a width of 32 mm. 809 (trade name, manufactured by ASAHI GLASS) was applied to form a hydrophobic resin layer 61.
  • photoresist 62 (trade name: AZ-4903, manufactured by AZ Electronic Materials USA) was applied.
  • UV was exposed from above through a photomask 63 having a target pattern, and development processing with alkali was performed.
  • the photoresist 62 was dissolved only in the portion irradiated with UV, and the surface of the hydrophobic resin layer 61 was exposed.
  • O 2 plasma etching was performed using RIE-10NR (Samco) under predetermined process conditions (O 2 50 sccm; Pressure 10 Pa; Power 50 W; Time 30 min).
  • the upper surface glass was produced with the following method.
  • As the top glass a glass having a thickness of 5 mm in which a through hole having a diameter of 1 mm was formed was used.
  • One side of this glass was covered with about 70 ⁇ L of CYTOP (registered trademark) CTL-809 (trade name, manufactured by ASAHI GLASS), and spin-coated by the following program C.
  • CYTOP registered trademark
  • CTL-809 trade name, manufactured by ASAHI GLASS
  • FDG Fluorescein-di- ⁇ -galactopyranoside
  • FIG. 3 is a diagram showing a fluorescence image of an array in which beads are encapsulated in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows one subarray. As shown in FIG. 3, several bright spots were detected in the fluorescent image (138 in one field of view). This bright spot indicates the position where there is a housing portion in which biotinylated beads capturing streptavidin are enclosed. Therefore, it was found that if the method according to the present invention is used, 1 fM streptavidin can be sufficiently detected.
  • Comparative Example 1 As a comparative example of the present invention, a target molecule was detected using a conventional bulk measurement method.
  • FIGS. 5 (a) to 5 (f) are microscopic images of arrays in which beads are encapsulated in another embodiment of the present invention.
  • 5A, 5C, and 5E are diagrams showing a bright field image of one subarray.
  • FIGS. 5B, 5D, and 5F show the fluorescence images of the subarrays shown in FIGS. 5A, 5C, and 5E, respectively.
  • . 5A to 5B show the results for 1 fM streptavidin
  • FIGS. 5C to 5D show the results for 100 aM streptavidin.
  • FIGS. 5E to 5F Is the result for 10 aM streptavidin.
  • the theoretical value was calculated as the ratio (%) of the number of molecules of streptavidin to the total number of reacted beads.
  • the experimental value was calculated as the ratio (%) of the number of beads that captured streptavidin to the number of beads contained in the array.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the concentration of streptavidin and the ratio of the number of beads that have captured streptavidin in another example of the present invention.
  • graph a shows theoretical values
  • round points show experimental values
  • a graph b shows a graph obtained by approximating the average value of the experimental values with a straight line.
  • Example 3 Using the flow cell structure array prepared in Example 1, a bead solution (6.5 ⁇ 10 6 beads / 30 ⁇ L) was introduced (loaded) into the array by the method described above, and enclosed (trapped) in droplets. The trap efficiency at this time (ratio of the number of trapped beads to the number of loaded beads (%)) was calculated.
  • FIG. 8 is a diagram showing bead trapping efficiency when an array having a flow cell structure is used (Example 3) and when an array having no flow cell structure is used (Comparative Example 2).
  • a bead solution diluted to the same concentration (2.2 ⁇ 10 8 beads / mL 6.5 ⁇ 10 6 beads / 30 ⁇ L) as in the case of using an array having a flow cell structure (Example 3) by the method shown below. Used to encapsulate beads in hydrophilic / hydrophobic patterned glass.
  • Hydrophilic / hydrophobic patterned glass made by the method described above was adhered to the bottom of a Petri dish (35 mm Petri dish; manufactured by Becton Dickinson).
  • Araldite AR-R30 manufactured by NICHIBAN was used as an adhesive.
  • FC40 Fluorinert (registered trademark) FC40, manufactured by SIGMA
  • the present invention can be suitably used for a method, an array, an apparatus and the like for detecting a low concentration target molecule.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

　低濃度のターゲット分子を高感度に検出可能な技術を提供する。ビーズ（４１）、（４１'）を１個のみ収容可能な複数の収容部（１３）が、疎水性の上面を有する側壁（１２）によって互いに隔てられて形成されている下層部（１０）と、下層部（１０）における収容部（１３）が形成されている面に対向している上層部（２０）との間の空間（３０）に、ビーズ（４０）、（４１'）を含む親水性溶媒（４２）を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に空間（３０）に疎水性溶媒（４３）を導入する疎水性溶媒導入工程とを含む。

Description

ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置
　本発明は、ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置に関する。
　タンパク質、核酸等の生体分子を個々識別した態様で観察することにより種々の測定を行なう方法として、一分子測定が知られている。この一分子測定を行なうための手法がいくつか知られている。
　特許文献１には、一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバが記載されている。このマイクロチャンバは、液滴を封入することができ、この液滴により充填可能な容量が１０００ｆＬ（フェムトリットル）以下である容器部を有する。容器部は、第１の部材と第２の部材とを貼り合わせることにより、少なくとも第１の部材又は第２の部材が有する窪みによって構成される。この液滴中で酵素反応を行うことにより、反応生成物の分子数が極めて少数でも濃度を高くすることができるため、酵素一分子の活性を検出することができる。
　非特許文献１には、液滴がオイルで覆われており、外部から液滴に直接アクセス可能なフェムトリットルオーダーの液滴のアレイを用いて、一分子酵素アッセイを行なう方法が記載されている。このアレイでは、親水性表面に高さ１７ｎｍの疎水性領域が形成されることにより、親水性領域のパターンが形成されている。
　非特許文献２には、一分子の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてタンパク質を検出する方法が記載されている。この方法では、タンパク質特異的な抗体で覆われた微細なビーズによって微量のタンパク質を捕捉し、ビーズとタンパク質との複合体を蛍光標識させる。この複合体を含むビーズを遠心力によって反応チャンバーに導入し、タンパク質を捕捉しているビーズの数を数えることによって、タンパク質を定量測定する。
日本国公開特許公報「特開２００４－３０９４０５号公報（２００４年１１月４日公開）」
S. Sakakihara et al., Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362 David M Rissin et al., Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1641
　低濃度の疾病マーカー等を検出し、疾病、感染症等の早期発見を行なうために、バイオセンシング技術のさらなる高感度化が求められている。例えば、体積１ｍｍ３の腫瘍に含まれる１００万個の癌細胞からマーカータンパク質（各細胞から１００分子ずつ）が５Ｌの血中に分泌された場合、このタンパク質の血中濃度は３０ａＭ程度である。このような非常に低濃度のターゲット分子を検出しうる技術が求められている。
　このようなターゲット分子を検出するために、上述した一分子酵素アッセイを用いて一分子単位の感度で検出する方法が考えられる。すなわち、ターゲット分子を特異的にフェムトリットルオーダーの液滴（超微小液滴）に封入した後、酵素によって標識された抗体等をターゲット分子に接続し、上述した方法で標識酵素の活性を検出する方法である。ターゲット分子を特異的に超微小液滴に封入する方法としては、ターゲット分子に特定的に結合する別の抗体等で標識されたビーズ等を用いる方法が考えられる。この方法では、ビーズにターゲット分子を結合させた後、ビーズを超微小溶液に封入する。
　ここで、溶液中に極わずかにしか存在しないターゲット分子、例えば上述したような３０ａＭ程度のターゲット分子等を効率的に検出するためには、１００万個程度の非常に多数の超微小液滴アレイを用意し、このアレイにビーズを捕捉する必要がある。
　しかし、非特許文献２に記載の方法では、ビーズを強い遠心力によりアレイに導入する必要があり、時間と労力を要する。また、非特許文献２に記載の方法で用いているアレイの数は５万個程度であり、１００万個程度のアレイに適用することは極めて困難である。そのため、非特許文献２に記載の方法では、多数のビーズをアレイに効率よく封入させることが困難である。また、特許文献１及び非特許文献１には、このような問題を解決する方法は記載されていない。
　本発明の目的は、多数のビーズをアレイに効率よく封入させる技術を提供することにある。
　上記の課題を解決するために、本発明に係るビーズ封入方法は、ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とする。
　上記の課題を解決するために、本発明に係るアレイは、複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とする。
　本発明に係るビーズ封入方法を用いれば、多数のビーズをアレイに効率よく封入させることができるので、低濃度のターゲット分子を高感度に検出可能な技術に寄与することが可能となる。
（ａ）～（ｅ）は、本発明に係るビーズ封入方法を説明するための模式図であり、アレイ１の側方断面図を示す。 本発明に係るターゲット分子検出装置の一実施形態を模式的に示す図である。 本発明の一実施例においてビーズを封入したアレイの蛍光像を表す図である。 従来の方法によってターゲット分子を検出した場合における蛍光強度を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、本発明の他の実施例においてビーズを封入したアレイの顕微鏡画像を表す図である。 本発明の他の実施例において、ストレプトアビジンの濃度と、ストレプトアビジンを捕捉したビーズの数の割合との関係を示すグラフである。 本発明の一実施例において親水／疎水パターンガラスを作製する方法を説明するための図である。 フローセル構造を有するアレイを用いた場合（実施例３）と、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合（比較例２）との、ビーズのトラップ効率を示す図である。
　以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
　〔ビーズ封入方法〕
　本実施形態に係るビーズ封入方法について、図１（ａ）～（ｅ）を参照して説明する。図１（ａ）～（ｅ）は、本発明に係るビーズ封入方法を説明するための模式図であり、アレイ１の側方断面図を示す。
　本実施形態では、下層部１０と上層部２０とを備えたアレイ１にビーズ４１、４１’を封入する場合について説明する。下層部１０は、ビーズ４１、４１’を１個のみ収容可能な複数の収容部１３が、疎水性の上面を有する側壁１２によって互いに隔てられて形成されている。また、上層部２０は、下層部１０における収容部１３が形成されている面に対向している。
　ビーズは、平均粒子径１μｍ～４μｍであることが好ましい。これにより、アレイへの効率的な封入とアレイの高密度化とを達成することができる。なお、「平均粒子径」とは、ここでは電子顕微鏡観察又は動的光散乱法を用いて測定した数値をいう。
　本実施形態では、ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズを用いる場合について説明するが、本発明は特にこれに限定されない。本実施形態では、封入するビーズは、ターゲット分子を捕捉していないビーズ４１と、ターゲット分子を捕捉したビーズ４１’との混合物である。
　ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズとして、例えば、ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子が結合されているビーズを用いることができる。ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子は、ビーズの表面にある修飾基に、例えばリンカーを介して結合させてもよい。例えば、アミノ基修飾ビーズの表面にあるアミノ基に、Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（Ｎ―ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等を持つ架橋剤を介して共有結合させることにより結合させることができる。
　「ターゲット分子」とは、検出対象である分子（標的分子）、すなわちここではビーズに捕捉させることによって検出しようとする分子をさす。ターゲット分子としては、例えばタンパク質、核酸、糖等の生体分子、ならびにウイルス粒子そのものなどが挙げられる。
　ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子（以下、「ターゲット捕捉分子」ともいう。）としては、ターゲット分子に応じて選択すればよく、例えばタンパク質、抗体、核酸等を用いることができる。なお、ターゲット捕捉分子は、ビーズ１個あたり１０万分子以上結合されていることが好ましい。例えばターゲット捕捉分子が抗体の場合には、解離定数がｎＭオーダー程度であるが、上述した構成であれば、ビーズとターゲット分子とを反応させる際のターゲット捕捉分子の濃度を充分に高くすることができる（例えば、ビーズの濃度が８×１０６粒子／ｍＬの場合、ターゲット捕捉分子が約１ｎＭとなる）。
　本実施形態に係るビーズ封入方法は、ビーズ導入工程と、脱気工程と、疎水性溶媒導入工程とを含む。各工程について、以下に詳細に説明する。
　（ビーズ導入工程）
　ビーズ導入工程について、図１（ａ）～（ｂ）を参照して説明する。
　ビーズ導入工程は、下層部１０と上層部２０との間の空間３０に、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を導入する工程である。親水性溶媒４２を導入する方法としては、下層部１０と上層部２０との間の空間３０に、下層部１０と上層部２０とが対向する面に平行な方向に導入すればよい。例えば、上層部２０及び下層部１０の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から、空間３０内に導入してもよい。
　親水性溶媒４２としては、例えば、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。親水性アルコールとしては、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、グリセリン等が挙げられる。親水性エーテルとしては、例えばテトラヒドロフラン、ポリエチレンオキサイド、１，４－ジオキサン等が挙げられる。ケトンとしては、例えばアセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。ニトリル系溶媒としては、例えばアセトニトリル等が挙げられる。
　親水性溶媒４２は、ビーズ４１、４１’の他に、例えばビーズ４１’に捕捉されたターゲット分子を特異的に検出するための物質をさらに含んでいてもよい。このような物質としては、例えば、ビーズ４１’に捕捉されたターゲット分子又はこれに特異的に結合した分子に結合した所定の酵素によって分解されて、蛍光物質を遊離する蛍光基質などであってもよい。ターゲット分子に特異的に結合する分子としては、例えば二次抗体、核酸等であってもよい。また、所定の酵素としては、例えばβ－ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。蛍光基質としては、例えばＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄｉ－β－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＦＤＧ）、Ａｍｐｌｅｘ　ｒｅｄ（登録商標）等が挙げられる。
　（脱気工程）
　脱気工程について、図１（ｃ）を参照して説明する。
　脱気工程は、ビーズ導入工程の後であって疎水性溶媒工程より前に、下層部１０と上層部２０との間の空間３０内を脱気する工程である。脱気する方法としては、例えば、アレイ１を減圧環境下において放置する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１を約３０秒放置する方法などである。
　本発明において、脱気工程は必須の工程ではないが、脱気工程を行なうことにより、収容部１３内の空気が除去され、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を収容部１３内に効率よく導入することができる。したがって、ビーズ４１、４１’を収容部１３内に効率よく封入させることが可能になるため、脱気工程を行なうことがより好ましい。
　（疎水性溶媒導入工程）
　疎水性溶媒導入工程について、図１（ｄ）～（ｅ）を参照して説明する。
　疎水性溶媒導入工程は、下層部１０と上層部２０との間の空間３０に疎水性溶媒４３を導入する工程である。疎水性溶媒導入工程は、ビーズ導入工程の後に行われる工程であり、脱気工程の後に行われることがより好ましい。
　疎水性溶媒４３は、ビーズ導入工程で用いた親水性溶媒４２と混ざり合いにくい溶媒であればよい。疎水性溶媒４３として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
　疎水性溶媒導入工程を行なうことにより、収容部１３の各々に、疎水性溶媒４３により覆われたドロップレット（液滴）を効率よく形成させることができる。また、各ドロップレット内にビーズ４１、４１’を効率よく封入することができる。
　本実施形態では、下層部１０と上層部２０との間の空間３０を用いてビーズ４１、４１’を導入することにより、大きな面積（例えば１ｃｍ２以上の面積）に多数作製した収容部１３の各々に、ビーズを高い効率で封入することができる。
　本実施形態によれば、多数の収容部を有する大面積のドロップレットアレイを実現することが可能である。例えば、１００万個以上の収容部を有するアレイであっても、効率よくビーズ４１、４１’を各収容部に封入することが可能である。したがって、本実施形態であれば、ターゲット分子を高感度に検出することができるため、０．１ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子であっても検出することが可能となる。
　〔ターゲット分子を検出する方法〕
　次に、本実施形態に係るターゲット分子を検出する方法について、説明する。
　本実施形態に係るターゲット分子を検出する方法は、反応工程と、ビーズ封入工程と、検出工程とを含む。
　本実施形態では、ビーズとして、ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズを用いる。例えば、ビーズは、ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子が結合されているものであってもよい。なお、ビーズ、ターゲット分子、及びターゲット分子を特異的に捕捉するための分子については、本実施形態に係るビーズ封入方法において例示したものと同様のものを好適に用いることができる。
　反応工程は、ビーズとターゲット分子とを反応させる工程である。例えばビーズを含む溶液と、ターゲット分子を含む溶液とを混合させることにより反応させることができる。
　ビーズ封入工程は、反応工程において反応させたビーズを用いて上述したビーズ封入方法を行なう工程である。すなわち、ビーズ封入工程は、ビーズ導入工程と、疎水性溶媒導入工程とを含む工程、または、ビーズ導入工程と、脱気工程と、疎水性溶媒導入工程とを含む工程である。なお、ビーズ導入工程、脱気工程及び疎水性溶媒導入工程については、上述した「ビーズ封入方法」における各工程と同様に行なうことができるため、ここでは説明を省略する。
　検出工程は、ビーズ封入工程の後に、収容部１３の各々にターゲット分子を捕捉したビーズ４１’が収容されているか否かを検出する工程である。
　ターゲット分子を捕捉したビーズ４１’が収容されているか否かを検出する方法としては、例えば抗原抗体反応、ストレプトアビジン－ビオチン反応、核酸の相補的な結合等、公知の分子認識反応を好適に用いることができる。例えば、ターゲット分子又はこれに特異的に結合した分子に結合した所定の酵素によって、蛍光基質が分解されて遊離した蛍光物質を検出する方法が挙げられる。蛍光物質の検出方法としては、蛍光顕微鏡、イメージセンサ等を用いて各収容部における蛍光強度を検出する方法などが挙げられる。
　また、検出工程においては、各収容部１３にビーズ４１又はビーズ４１’が収容されているか否かをも検出することが好ましい。各収容部１３にビーズ４１又はビーズ４１’が収容されているか否かを検出する方法としては、例えば顕微鏡下においてビーズ４１又はビーズ４１’の有無を観察することにより検出することができる。また、ビーズ４１、４１’の有無を検出する方法として、ビーズによる散乱光を検出する方法、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）による電位計測を利用する方法などもある。
　検出工程の結果、ビーズ４１又はビーズ４１’が収容されている収容部１３の数と、ターゲット分子を捕捉したビーズ４１’が収容されている収容部１３の数とを用いて、ビーズの全数のうちターゲット分子を捕捉したビーズの数の割合を算出することができる。これにより、ターゲット分子の濃度を定量化することが可能となる。
　本実施形態であれば、多数の収容部を有する大面積のドロップレットアレイを実現させることが可能であり、１００万個以上の収容部を有するアレイであっても、効率よくビーズ４１、４１’を各収容部に封入することが可能である。したがって、本実施形態であれば、ターゲット分子を高感度に検出することができるため、１０ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子であっても検出することが可能となる。
　〔アレイ〕
　次に、本実施形態に係るアレイ１の構成について、図１（ａ）を参照して詳細に説明する。アレイ１は、本実施形態に係るビーズ封入方法に用いるためのアレイであってもよいし、本実施形態に係るターゲット分子を検出する方法に用いるためのアレイであってもよい。
　アレイ１は、下層部１０と、上層部２０とを備えている。
　下層部１０は、板状部材１１と疎水性の上面を有する側壁１２とを備えている。下層部１０には、複数の収容部１３が側壁１２によって互いに隔てられて形成されている。
　板状部材１１は親水性表面を有していることが好ましい。「親水性表面」とは、親水性溶媒との親和性が疎水性溶媒との親和性よりも高い表面を指す。板状部材１１としては、固体材料であればよいが、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等を用いることができる。
　側壁１２は、板状部材１１の表面上、好ましくは親水性表面上に設けられている、複数の収容部１３の各々を隔てる構造物である。側壁１２は、疎水性の上面を有している。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
　なお、側壁１２は、その上面、すなわち上層部２０と対向する面が疎水性であればよく、側面、すなわち収容部１３内の内壁は、疎水性であっても親水性であってもよい。
　例えば、側壁１２は、親水性の構造物と、その上面に形成されている疎水性層とにより構成されていてもよい。親水性の構造物には、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等を用いることができる。疎水性層には、例えば撥水性の樹脂、フッ素系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂は、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いという理由で、好ましく用いられる。
　上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
　また例えば、側壁１２は、疎水性の材料により構成されていてもよい。側壁１２として、例えばフッ素系高分子樹脂、パラキシリレン系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂としては上述の樹脂を好適に用いることができる。
　側壁１２は、板状部材１１上に複数の収容部１３が形成されるように構成されていればよく、例えば収容部１３が形成される位置に孔が形成されている板形状の構造物であってもよい。
　板状部材１１の表面からの側壁１２の高さ（垂直方向の厚み）は、収容部１３に収容されたビーズ４１、４１’が、後述する疎水性溶媒導入工程において収容部１３から排出されない程度の高さであればよい。例えば収容部１３に収容されたビーズ４１、４１’の大部分、好ましくは全てが側壁１２の上面よりも下に収まる高さであってもよい。
　なお、側壁１２の高さは、ビーズ４１、４１’を収容部１３に効率よく収容するという観点から、ビーズ４１、４１’の平均粒子径の１倍以上であることが好ましい。また側壁１２の高さは、ビーズ４１、４１’を１個のみ収容部１３に収容させるという観点から、ビーズ４１、４１’の平均粒子径の１．５倍以下であることが好ましい。
　複数の収容部１３の各々は、ビーズ４１、４１’を１個のみ収容可能な凹部であり、互いに側壁１２によって隔てられている。収容部１３は、板状部材１１の表面の一部を底面としており、底面が親水性である。
　収容部１３は、ビーズ４１、４１’が１個のみ収容される形状及び大きさであればよい。収容部１３の底面及び側面によって囲まれた領域の形状は、例えば円柱形状、角柱形状等であってもよい。
　各収容部１３の水平方向の幅Ａ（水平方向の断面が円であればその直径、正方形であればその一辺の長さなど）は、ビーズ４１、４１’の平均粒子径よりも大きければよいが、例えばビーズ４１、４１’の平均粒子径の１．５倍～２倍であることが好ましい。各収容部１３の深さは、本実施形態では側壁１２の高さと同じである。なお、本発明における収容部の深さは、ビーズを収容部に効率よく収容するという観点から、ビーズの平均粒子径の１倍以上であることが好ましい。また本発明における収容部の深さは、ビーズを１個のみ収容部に収容させるという観点から、ビーズの平均粒子径の１．５倍以下であることが好ましい。
　本実施形態では、収容部１３の底面が親水性であり、かつ側壁１２の上面が疎水性である。これにより、後述するビーズ導入工程において、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を効率よく収容部１３の中に導入することができるとともに、後述する疎水性溶媒導入工程において疎水性溶媒４３が収容部１３に入り込むことを防止することができる。したがって、ビーズ４１、４１’を含む液滴を含む収容部１３を、疎水性溶媒によって効率よく密閉することができる。
　上層部２０は、板状部材２１と、疎水性層２２とを備えている。疎水性層２２は、板状部材２１における、下層部１０に対向する面上に設けられている。板状部材２１としては、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等を用いることができる。また、疎水性層２２としては、例えば撥水性の樹脂、フッ素系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。
　上層部２０は、下層部１０における収容部１３が形成されている面に対して空間３０を隔てて対向している。すなわち、側壁１２と疎水性層２２との間に空間３０があいている。この空間３０は、流路を構成する。この構成により、アレイ１はフローセル構造となっている。
　空間３０は、下層部１０と上層部２０との間に、下層部１０と上層部２０とが互いに対向する面と平行な方向に流体を流すための流路として用いられうる。
　側壁１２の上面と疎水性層２２板状部材２１との間の距離、すなわち空間３０の垂直方向の幅は、少なくともビーズ１４、１４’の平均粒子径より大きければよく、１０～１５０μｍであることが好ましい。
　下層部１０又は上層部２０には、空間３０に流体を導入するための貫通孔（図示せず）が形成されていてもよい。例えば、下層部１０は、収容部１３が形成されている領域と、収容部１３が形成されていない領域とを有していてもよい。そして、下層部１０における収容部１３が形成されていない領域、又は上層部２０におけるこの領域と対向する部分に、貫通孔が形成されていてもよい。
　本実施形態においては、空間３０の上面が疎水性層２２の表面であり、空間３０の下面が側壁１２の上面及び収容部１３である。したがって、空間３０のうち、収容部１３の底面以外の部分は全て疎水性となっている。これにより、後述するビーズ導入工程において、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を効率よく各収容部１３内に導入することができる。また、後述する疎水性溶媒導入工程において、各収容部１３内に疎水性溶媒４３を入り込ませることがない。したがって、疎水性溶媒４３を空間３０内に導入することにより、各収容部１３にビーズ４１、４１’が封入されたドロップレットを効率よく形成させることができる。
　本実施形態に係るアレイ１の一例としては、例えば１００万個以上の収容部が形成されたアレイである。このような大面積のアレイであっても、本実施形態に係るビーズ封入方法又はターゲット分子を検出する方法を用いることにより、効率よくビーズを各収容部に封入することが可能である。したがって、本実施形態であれば、ターゲット分子を高感度に検出することができるため、０．１ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子をも検出可能なアレイを提供することができる。
　〔キット〕
　次に、本実施形態に係るキットの構成について説明する。
　本実施形態に係るキットは、アレイ１とビーズ４１とを少なくとも備える。アレイ１としては、上述した構成のアレイ１を好適に用いることができる。アレイ１の収容部１３の各々は、このキットが備えるビーズ４１を１個のみ収容可能であるように構成されている。
　このキットが備えるビーズ４１は、ターゲット分子を特異的に捕捉するものであってもよく、例えばターゲット分子に特異的に結合する分子が結合したものであってもよい。ターゲット分子、及びこれに特異的に結合する分子としては、前述したものを好適に用いることができる。
　また、このキットは、ターゲット分子を特異的に検出するための物質をさらに備えていてもよい。ターゲット分子を特異的に検出するための物質としては、上述したものを好適に用いることができる。また、キットは、水溶性溶媒、疎水性溶媒等をさらに備えていてもよい。
　〔ターゲット分子検出装置〕
　次に、本実施形態に係るターゲット分子検出装置５０の構成について、図２を参照して説明する。図２は、本発明に係るターゲット分子検出装置の一実施形態を模式的に示す図である。
　本実施形態に係るターゲット分子検出装置５０は、アレイ１と、イメージセンサ５１と、光源５２とを備える。アレイ１としては、上述した構成を好適に用いることができるため、ここでは説明を省略する。
　イメージセンサ５１は、収容部１３の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するセンサである。例えば、ターゲット分子又はこれに特異的に結合した分子に結合した所定の酵素によって、蛍光基質が分解されて発せられる蛍光を検出するセンサであってもよい。イメージセンサ５１としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ等を好適に用いることができる。
　光源５２は、アレイ１に光を照射する光源である。なお、図２では、光源５２はアレイ１の上に設けられているが、本発明は特にこれに限定されず、例えばアレイ１の横から光を照射するものであってもよい。
　なお、アレイ１とイメージセンサ５１との間には、干渉フィルタ、ライトガイドアレイ等が設けられていてもよい。また、光源５２とアレイ１との間には励起フィルタ等が設けられていてもよい。
　本実施形態であれば、アレイ１とイメージセンサ５１とが直結されているため、顕微鏡等の他の装置を用いることなく、各収容部１３にターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを容易に検出することができる。したがって、簡便かつ高速に検出することが可能になる。また、安価な商品として提供することができる。
　本願には、以下の発明が含まれる。
　本発明に係るビーズ封入方法は、ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とする。
　また、本発明に係るビーズ封入方法では、上記ビーズ導入工程の後であって上記疎水性溶媒導入工程より前に、上記空間内を脱気する脱気工程をさらに含むことが好ましい。
　また、本発明に係るビーズ封入方法では、上記親水性溶媒は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることが好ましい。
　また、本発明に係るビーズ封入方法では、上記疎水性溶媒は、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることが好ましい。
　上記の課題を解決するために、本発明に係るターゲット分子を検出する方法は、ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズと、当該ターゲット分子とを反応させる反応工程と、上記反応工程の後に、上記ビーズを用いて上述したいずれかのビーズ封入方法を行なうビーズ封入工程と、上記ビーズ封入工程の後に、上記収容部の各々に上記ターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを検出する検出工程とを含むことを特徴とする。
　また、本発明に係るターゲット分子を検出する方法では、上記ビーズには、上記ターゲット分子に特異的に結合する分子が結合していることが好ましい。
　本発明に係るアレイは、複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とする。
　また、本発明に係るアレイでは、上記収容部の各々は、底面が親水性であることが好ましい。
　また、本発明に係るアレイでは、上記上層部における上記下層部に対向する面が疎水性であることが好ましい。
　また、本発明に係るアレイでは、上記上層部及び上記下層部の少なくとも一方に、上記空間に流体を導入するための貫通孔が形成されていることが好ましい。
　上記の課題を解決するために、本発明に係るキットは、上述したいずれかのアレイと、ビーズとを備え、上記収容部の各々は、上記ビーズを１個のみ収容可能であることを特徴とする。
　上記の課題を解決するために、本発明に係るターゲット分子検出装置は、上述したいずれかのアレイと、上記収容部の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するイメージセンサとを備えることを特徴とする。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
　各実施例で用いた材料及び方法について説明する。
　（材料）
　各実施例では、ターゲット分子として、β－ガラクトシダーゼでラベルされたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＳＩＧＭＡ社より購入）（以下、単に「ストレプトアビジン」ともいう。）を用いた。また、ビーズとして、平均粒子径３μｍのアミノビーズ（材質：ポリスチレン；ｍｉｃｒｏｍｅｒ－ＮＨ２－３μｍ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社より購入）をビオチン化したビオチン化ビーズを用いた。
　（ビオチン化ビーズの作製）
　以下の方法により、アミノビーズのアミノ基にＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎを反応させ、アミノビーズをビオチン化した。
　まず、アミノビーズ２５０μＬにバッファーＡ（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ８．０）を７５０μＬ加えた。
　次に、１００００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心してアミノビーズを集め、５００μＬのバッファーＡに懸濁した（懸濁液Ａ）。そして、懸濁液ＡにＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎ（２μｇ／５０μＬ　ＤＭＳＯ）を５０μＬ加え、少なくとも３時間、ゆるやかに混合しながら２５℃で反応させた（ｅｎｄ－ｏｖｅｒ－ｅｎｄでチューブをｍｉｘした）。
　次に、得られたビオチン化ビーズを洗浄した。１００００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心してビオチン化ビーズを集め、水相をピペットマンで取り除いた。このビオチン化ビーズの沈殿に１ｍＬのバッファーＡを加え、懸濁させた。これを６回繰り返し、未反応のＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎを除いた。そして、５００μＬのバッファーＡに懸濁した（懸濁液Ｂ）。この懸濁液Ｂを４℃で保存した。
　次に、懸濁液Ｂにおけるビオチン化ビーズの濃度を調べた。血球計算盤を用いて、一定体積内のビオチン化ビーズの個数をカウントすることにより、ビオチン化ビーズの濃度を算出した（約３．０×１０８ビーズ／ｍＬ）。なお、カウントしやすくするために、例えば、懸濁液ＢをバッファーＡにより５倍程度に希釈してカウントした。
　以上の方法により、ビオチン化ビーズを得た。
　（ストレプトアビジンの捕捉）
　次に、以下の方法により、ビオチン化ビーズを用いてストレプトアビジンを捕捉した。
　まず、ビオチン化ビーズを希釈した（８×１０６ビーズ／５００μＬ）。また、β－ガラクトシダーゼでラベルされたストレプトアビジンを、バッファーＢ（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ８．０，０．１％　ＴＷＥＥＮ２０（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含む）により目的の濃度の２倍の濃度に希釈した（全量５００μＬ）。
　そして、ビオチン化ビーズ５００μＬと、希釈したストレプトアビジン５００μＬとをチューブ内で混合し（全量１ｍＬ）、ゆるやかにチューブを上下させ、２５℃で３０分反応させた。
　次に、１００００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心して反応後のビーズ（ストレプトアビジンとビオチン化ビーズとの複合体と、未反応のビオチン化ビーズとの混合物）を集め、水相をピペットマンで取り除いた。このビーズの沈殿に１ｍＬのバッファーＡを加え、懸濁した。これを４回繰り返すことによって洗浄し、未反応のターゲット分子を除いた。
　次に、洗浄後のビーズの沈殿に、バッファーＣ（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ７．５，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を１５μＬ加えて懸濁した。ビーズの濃度は最終的に約６．５×１０６ビーズ／１５μＬ　バッファーＣとなった。
　（アレイの作製）
　次に、以下の方法により、図１（ａ）～（ｅ）に示すアレイ１と同様のフローセル構造のアレイを作製した。以下の説明において、アレイ１における構成要素と同じ機能を有する構成要素には同じ符号を付して説明する。
　まず、親水／疎水パターンガラス（下層部１０）と、上面ガラス（上層部２０）（縦２４ｍｍ×横２６ｍｍ×厚さ５ｍｍ、ＳｉＯ２、直径１ｍｍの貫通孔あり）とを準備した。
　（親水／疎水パターンガラスの作製）
　親水／疎水パターンガラスを作製するために具体的に用いた方法を、図７を参照して説明する。図７は、本発明の一実施例において親水／疎水パターンガラスを作製する方法を説明するための図である。
　本実施例では、フォトリソグラフィとドライエッチングとにより、ガラス上に親水／疎水パターンを作製した。親水／疎水パターンの作製では、ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程、フォトリソグラフィ工程、エッチング・レジスト除去工程の３つの工程を行なった。
　ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程では、まず、縦２４ｍｍ×横３２ｍｍのガラス（商品名：ＮＥＯ　ＭＩＣＲＯ　ＣＯＶＥＲ　ＧＬＡＳＳ　Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　Ｎｏ．１；ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）（板状部材１１）上にＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ－８０９（商品名、ＡＳＡＨＩ　ＧＬＡＳＳ社製）を塗布し、疎水性の樹脂層６１を形成させた。
　続いて、フォトリソグラフィ工程では、ポジ型のフォトレジスト６２（商品名：ＡＺ－４９０３、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ＵＳＡ社製）を塗布した。次に、目的のパターンのフォトマスク６３を介して上部からＵＶを露光し、アルカリによる現像処理を行なった。この現像処理によって、ＵＶが照射された部分のみ、フォトレジスト６２が溶解し、疎水性の樹脂層６１の面がむき出しになった。
　その後、エッチング・レジスト除去工程では、このガラスを、一部が溶解したフォトレジスト６２’を介してＯ２プラズマによりエッチングすることで、樹脂層６１の一部を除去した。これにより、疎水性の側壁１２が形成された。最後に、有機溶媒でフォトレジスト６２’を溶解させることにより、親水／疎水パターンを形成した。
　さらに詳しい手順は以下の通りである。図７中、（１）～（２３）で示す数字は、下記の（１）～（２３）に対応する。
　＜ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程（下記プロセスで膜厚約３．３～３．５μｍのＣＹＴＯＰ（登録商標）層を作製）＞
　（１）まず、ガラス（板状部材１１）の洗浄及びＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ－８０９の塗布を行なった。
　（２）次に、このガラスを１０Ｎ　ＫＯＨに一晩浸しておいた。
　（３）ＫＯＨに浸したカバーガラスを脱イオン水で１０回以上洗った。
　（４）１８０℃のホットプレートでガラスを乾燥させた。
　（５）乾燥させたガラスを室温に戻した。
　（６）ガラス上にＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ－８０９を約７０μＬ垂らした。
　（７）下記のプログラムＡでスピンコートした。
　［プログラムＡ］
Ｓｌｏｐｅ　５秒
５００ｒｐｍ　１０秒
Ｓｌｏｐｅ　５秒
２０００ｒｐｍ　３０秒
Ｓｌｏｐｅ　５秒
Ｅｎｄ　
　（８）ホットプレート上で１８０℃，１時間ベークした。
　以上の（６）～（８）を４回繰り返すことで、深さ３．３～３．５μｍの疎水性の樹脂層６１が形成された。
　＜フォトリソグラフィ工程＞
　続いてフォトリソグラフィを行なった。
　（９）ポジ型のフォトレジスト６２（ＡＺ－４９０３）を、ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程で作製した樹脂層６１上に垂らした。量は、ガラス上で垂らしたレジストが直径約８ｍｍに広がる程度とした。
　（１０）下記のプログラムＢでスピンコートした。
　［プログラムＢ］
Ｓｌｏｐｅ　５秒
５００ｒｐｍ　１０秒
Ｓｌｏｐｅ　５秒
４０００ｒｐｍ　６０秒
Ｓｌｏｐｅ　５秒
Ｅｎｄ
　（１１）ガラスのエッジに残ったレジストを、１００％ＥｔＯＨを含ませたガーゼでふき取った。
　（１２）５５℃　３分ベークした。
　（１３）１１０℃　５分ベークした。
　（１４）フォトマスク６３をアセトンで洗浄し、マスクアライナー（ＳＡＮ－ＥＩ　ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ社製）にセットした。
　（１５）フォトレジスト６２を塗布したガラスをマスクアライナーの試料台にセットし、試料台をリフトアップすることにより、ガラスとフォトマスク６３とをコンタクトさせた。
　（１６）ＵＶを３５秒間照射した（Ｐｏｗｅｒ＝２５６）。
　（１７）ガラスをＡＺ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ＵＳＡ社製）に５分以上浸し、現像した。
　（１８）ＭｉｌｌｉＱ（蒸留水）で１０分程すすいだ。
　＜エッチング・レジスト除去工程＞
　続いて、エッチング及びレジストの除去を行なった。
　（１９）ＲＩＥ－１０ＮＲ（Ｓａｍｃｏ社製）を用いて、所定のプロセス条件（Ｏ２　５０ｓｃｃｍ；Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　１０Ｐａ；Ｐｏｗｅｒ　５０Ｗ；Ｔｉｍｅ　３０ｍｉｎ）によりＯ２プラズマエッチングを行なった。
　（２０）エッチング後のガラスをアセトンに浸け、１５分間ソニケーションを行なった。
　（２１）アセトンを交換し、もう一度１５分間ソニケーションを行なった。
　（２２）ＥｔＯＨで１５分間ソニケーションを行なった。
　（２３）ＭｉｌｌｉＱ（蒸留水）で洗浄した。
　以上の方法により、ガラス上に複数のウェル（収容部１３）を形成させた。各ウェルの底面及び側面によって囲まれた領域は円柱形状であった。各ウェルの水平方向の断面は、直径５μｍの円形状であり、各ウェルを隔てる側壁の高さは約３．３～３．５μｍであった。また、隣接する２つのウェルの間の距離Ｂは５μｍであった。
　（上面ガラスの作製）
　また、上面ガラスを以下の方法にて作製した。上面ガラスとして、直径１ｍｍの貫通孔が形成されている厚さ５ｍｍのガラスを用いた。このガラスの一方の面をＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ－８０９（商品名、ＡＳＡＨＩ　ＧＬＡＳＳ社製）約７０μＬで覆い、下記プログラムＣによりスピンコートした。
　［プログラムＣ］
Ｓｌｏｐｅ　　　５秒
５００ｒｐｍ　　１０秒
Ｓｌｏｐｅ　　　５秒
２０００ｒｐｍ　３０秒
Ｓｌｏｐｅ　　　５秒
Ｅｎｄ
その後、ホットプレート上で１８０℃，１時間ベークした。
　以上の方法により、一方の面に厚さ１μｍの疎水性層を備えた上面ガラスを作製した。
　（親水／疎水パターンガラスと上面ガラスとの貼り合わせ）
　次に、パラフィルム（Ｐｅｃｋｉｎｅｙ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ社製）の裏紙に高真空グリース（ＤＯＷ　ＣＯＲＮＩＮＧ　ＴＯＲＡＹ社製）を付し、親水/疎水パターンガラスのうち、親水／疎水パターンが形成された面側であって親水／疎水パターンが形成されていない部分に張り付けた。上面ガラスを、コーティング剤でコートされた面が親水／疎水パターンガラス側になるように、親水／疎水パターンガラスの親水／疎水パターンが形成された面上に貼り付けた。
　これにより、親水／疎水パターンガラスと上面ガラスとの間に空間が形成された。この空間の垂直方向の幅、すなわち親水／疎水パターンガラスの側壁の上面と上面ガラスとの間の距離は、約１５０μｍであった。
　（ドロップレットへのビーズの封入）
　次に、以下の方法により、ストレプトアビジンと反応後のビーズをドロップレットに封入した。
　まず、５０ｍＭ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄｉ－β－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＦＤＧ）（Ｍａｒｋｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）／ＤＭＳＯをＦＤＧバッファー（１００ｍＭ　ＫＰｉ　ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ＝７．５），１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，４μＬ／ｍＬ　２－ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）で希釈し、４ｍＭ　ＦＤＧ溶液を準備した。そして、ビーズ（６．５×１０６ビーズ／１５μＬ　バッファーＣ）１５μＬと、４ｍＭＦＤＧ溶液１５μＬとを混ぜ、ビーズ溶液を作製した。
　次に、このビーズ溶液３０μＬを、上面ガラスの貫通孔からイエローチップで流路内にロードした（図１（ａ）～（ｂ））。
　次に、各ウェル内の空気を抜くため、脱気を１分行なった（図１（ｃ））。脱気は、０．１気圧の減圧デシケータ内に、アレイを約３０秒放置することにより行った。その後５分間静置し、ビーズをウェルの底に沈めた。
　その後、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ４０（ＳＩＧＭＡ社製）２００μＬ～１０００μＬを、上面ガラスの貫通孔から流路内にロードした（図１（ｄ）～（ｅ））。
　その結果、ウェル部分にのみ水相がトラップされてドロップレットが形成され、ビーズがドロップレット内に封入された。
　〔実施例１〕
　上述した方法を用いて、ビオチン化ビーズと１ｆＭのストレプトアビジンとを反応させた後、ＦＤＧとともにアレイに導入し、ビーズを各ドロップレットに封入した。アレイとしては、２７４４個の収容部が形成された５１２μｍ×５１２μｍのサブアレイを２０個×２０個にて配置した、合計１０９７６００個の収容部を有する１．０ｃｍ×１．０ｃｍのアレイを用いた。このアレイを蛍光顕微鏡（ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ社製））にて観察した。
　図３は、本発明の一実施例においてビーズを封入したアレイの蛍光像を表す図である。なお、図３は、１個のサブアレイについて示す。図３に示すように、蛍光像において、輝点がいくつか検出された（一視野中に１３８個）。この輝点は、ストレプトアビジンを捕捉したビオチン化ビーズが封入された収容部がある位置を示す。したがって、本発明に係る方法を用いれば、１ｆＭのストレプトアビジンを十分検出可能であることがわかった。
　〔比較例１〕
　本発明の比較例として、従来のバルク（Ｂｕｌｋ）計測法を用いてターゲット分子を検出した。
　実施例１で用いた濃度（１ｆＭ）よりも１２．５倍濃い濃度である１２．５ｆＭストレプトアビジンとＦＤＧとを混ぜ、蛍光分光器によって蛍光を測定した。また、コントロールとして、５００倍の濃度である６．３ｐＭのストレプトアビジンを用いて、同様に実験を行なった。
　この結果を図４に示す。図４は、従来の方法によってターゲット分子を検出した場合における蛍光強度を示すグラフである。なお、図４において、グラフａは１２．５ｆＭのストレプトアビジンを用いた場合の結果を示し、グラフｂは６．３ｐＭのストレプトアビジンを用いた場合の結果を示す。
　図４に示すように、従来の方法を用いた場合には、１２．５ｆＭのストレプトアビジンを検出することができなかった。したがって、従来の方法では、１２．５ｆＭは検出限界以下であることが示された。
　〔実施例２〕
　次に、ビオチン化ビーズと、５種類の異なる濃度（１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭ、１ａＭ、０．１ａＭ）のストレプトアビジンとをそれぞれ反応させた後、ＦＤＧとともにアレイに導入し、ビーズを各ドロップレットに封入した。アレイとしては、実施例１と同様の構成のアレイを用いた。このアレイについて、顕微鏡下、明視野像と蛍光像とを観察した。
　（検出結果）
　図５（ａ）～（ｆ）は、本発明の他の実施例においてビーズを封入したアレイの顕微鏡画像を表す図である。なお図５（ａ）、図５（ｃ）及び図５（ｅ）は１個のサブアレイの明視野像を現す図である。また、図５（ｂ）、図５（ｄ）及び図５（ｆ）は、それぞれ図５（ａ）、図５（ｃ）及び図５（ｅ）が示すサブアレイの蛍光像を表す図である。また、図５（ａ）～（ｂ）は１ｆＭのストレプトアビジンについての結果であり、図５（ｃ）～（ｄ）は１００ａＭのストレプトアビジンについての結果であり、図５（ｅ）～（ｆ）は１０ａＭのストレプトアビジンについての結果である。
　１ｆＭのストレプトアビジンを用いた場合、１つのサブアレイに封入されたビーズの全数は１７３５個であり、そのうちストレプトアビジンを捕捉したビーズは１３８個であった。１００ａＭのストレプトアビジンを用いた場合、１つのサブアレイに封入されたビーズの全数は２００８個であり、そのうちストレプトアビジンを捕捉したビーズは６個であった。１０ａＭのストレプトアビジンを用いた場合、１つのサブアレイに封入されたビーズの全数は１３６０個であり、そのうちストレプトアビジンを捕捉したビーズは１個であった。
　（理論値と実験値との比較）
　また、ストレプトアビジンの各濃度において、ビーズの全数に対する、ストレプトアビジンを捕捉したビーズ（アクティブビーズ）の数の割合（％）についての理論値と実験値とを算出した。
　理論値は、反応させたビーズの全数に対するストレプトアビジンの分子数の割合（％）として算出した。また、実験値は、アレイに収容されたビーズの数に対するストレプトアビジンを捕捉したビーズの数の割合（％）として算出した。
　図６は、本発明の他の実施例において、ストレプトアビジンの濃度と、ストレプトアビジンを捕捉したビーズの数の割合との関係を示すグラフである。図６において、グラフａは理論値を示し、丸い点は実験値を示し、点線で囲まれた丸は、実験値の平均を示す（Ｎ＝２～３）。グラフｂは、実験値の平均値を直線によって近似したグラフを示す。
　図６に示すように、理論値と実験値とがほぼ重なったことから、本実施例の方法は、定量性が高く、ターゲット分子の濃度を正確に測定することが可能であることが示された。以上の結果より、本実施例の方法であれば、０．１ａＭ程度の濃度であっても十分検出可能であることが示された。
　〔実施例３〕
　実施例１において作製したフローセル構造のアレイを用いて、上述した方法によりビーズ溶液（６．５×１０６ビーズ／３０μＬ）をアレイに導入（ロード）し、ドロップレットに封入（トラップ）させた。このときのトラップ効率（ロードしたビーズの数に対するトラップされたビーズの数の割合（％））を算出した。
　この結果を図８に示す。図８は、フローセル構造を有するアレイを用いた場合（実施例３）と、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合（比較例２）との、ビーズのトラップ効率を示す図である。
　〔比較例２〕
　本比較例では、フローセル構造を有しないアレイ（上述した親水／疎水パターンガラスのみからなるアレイ）を用いて、ビーズ（Φ＝３μｍのアミノビーズ；ｍｉｃｒｏｍｅｒ－ＮＨ２－３μｍ；ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）の封入を行なった。
　下記に示す方法により、フローセル構造を有するアレイを用いた場合（実施例３）と同濃度（２．２×１０８ビーズ／ｍＬ＝６．５×１０６ビーズ／３０μＬ）に希釈したビーズ溶液を用いて、親水／疎水パターンガラスにビーズを封入した。
　（１）バッファー（１００ｍＭ　ＫＰｉ　ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ＝７．５），１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，２μＬ／ｍＬ　２－ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）でビーズを２．２×１０８ビーズ／ｍＬに希釈した。
　（２）ペトリディッシュ（３５ｍｍペトリディッシュ；Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の底面に、親水／疎水パターンガラス（上述した方法で作製したもの）を接着させた。接着剤としては、アラルダイト　ＡＲ－Ｒ３０（ＮＩＣＨＩＢＡＮ社製）を用いた。
　（３）親水／疎水パターンガラス上を、ビーズ溶液５００μＬで覆った。
　（４）脱気した後、５分間インキュベートを行なった。
　（５）親水／疎水パターンガラス上にＦＣ４０（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ４０，ＳＩＧＭＡ社製）を２ｍＬロードし、ビーズを封入した。
　（６）ドロップレットの蒸発を防ぐために、油相上を水で覆った。
　その後、ドロップレットに閉じ込められたビーズの数をカウントし、トラップ効率（ロードしたビーズの数に対するトラップされたビーズの数の割合（％））を算出した。
　この結果を図８に示す。図８に示されるように、フローセル構造を有するアレイを用いた場合には、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合よりもトラップ効率が２５倍以上高かった。フローセル構造を有しないアレイを用いた場合、高さ方向に散乱可能な距離が増すので、ビーズが基板に近づきにくくなったと考えられる。
　また、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合、ビーズ溶液によってアレイの基板一面を覆う必要があり、大量のビーズ溶液（フローセル構造を有するアレイを用いる場合の約１６倍）が必要になる。したがって、フローセル構造を有するアレイを用いれば、少量のビーズ溶液によって効率よくビーズを封入することが可能になる。
　本発明は、低濃度のターゲット分子を検出するための方法、アレイ、装置等に好適に利用することができる。
　１　　　アレイ
　１０　　下層部
　２０　　上層部
　１２　　側壁
　１３　　収容部
　３０　　空間
　４１、４１’　ビーズ
　４２　　親水性溶媒
　４３　　疎水性溶媒

Claims (12)

  1. 　ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、
    　上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とするビーズ封入方法。
  2. 　上記ビーズ導入工程の後であって上記疎水性溶媒導入工程より前に、上記空間内を脱気する脱気工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のビーズ封入方法。
  3. 　上記親水性溶媒は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のビーズ封入方法。
  4. 　上記疎水性溶媒は、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のビーズ封入方法。
  5. 　ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズと、当該ターゲット分子とを反応させる反応工程と、
    　上記反応工程の後に、上記ビーズを用いて請求項１～４のいずれかに記載のビーズ封入方法を行なうビーズ封入工程と、
    　上記ビーズ封入工程の後に、上記収容部の各々に上記ターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを検出する検出工程とを含むことを特徴とする、ターゲット分子を検出する方法。
  6. 　上記ビーズには、上記ターゲット分子に特異的に結合する分子が結合していることを特徴とする請求項５に記載のターゲット分子を検出する方法。
  7. 　複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、
    　上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とするアレイ。
  8. 　上記収容部の各々は、底面が親水性であることを特徴とする請求項７に記載のアレイ。
  9. 　上記上層部における上記下層部に対向する面が疎水性であることを特徴とする請求項７又は８に記載のアレイ。
  10. 　上記上層部及び上記下層部の少なくとも一方に、上記空間に流体を導入するための貫通孔が形成されていることを特徴とする請求項７～９のいずれかに記載のアレイ。
  11. 　請求項７～１０のいずれかに記載のアレイと、
    　ビーズとを備え、
    　上記収容部の各々は、上記ビーズを１個のみ収容可能であることを特徴とするキット。
  12. 　請求項７～１０のいずれかに記載のアレイと、
    　上記収容部の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するイメージセンサとを備えることを特徴とするターゲット分子検出装置。
PCT/JP2012/055884 2011-03-08 2012-03-07 ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置 Ceased WO2012121310A1 (ja)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280012033.7A CN103415774B (zh) 2011-03-08 2012-03-07 颗粒封入方法、检测靶分子的方法、阵列、试剂盒及靶分子检测装置
JP2013503587A JP5337324B2 (ja) 2011-03-08 2012-03-07 ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置
BR112013022933-0A BR112013022933B1 (pt) 2011-03-08 2012-03-07 método de selagem de microesferas, método para detecção de molécula alvo, matriz, kit e dispositivo para detecção de molécula alvo
EP12754743.8A EP2685266A1 (en) 2011-03-08 2012-03-07 Bead sealing method, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
US14/003,509 US9329174B2 (en) 2011-03-08 2012-03-07 Bead trapping method and method for detecting target molecule
CA2829185A CA2829185C (en) 2011-03-08 2012-03-07 Bead sealing method, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
AU2012226920A AU2012226920B2 (en) 2011-03-08 2012-03-07 Bead sealing method, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
RU2013144617/28A RU2548619C1 (ru) 2011-03-08 2012-03-07 Способ герметизации гранул, способ обнаружения молекулы-мишени, матрица, набор и устройство для обнаружения молекулы-мишени
US14/513,660 US10018627B2 (en) 2011-03-08 2014-10-14 Method for sealing substances, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
US15/082,195 US20160223531A1 (en) 2011-03-08 2016-03-28 Method for detecting target molecule
US15/351,522 US10267793B2 (en) 2011-03-08 2016-11-15 Kit for sealing beads and detecting target molecule
US16/260,413 US10809257B2 (en) 2011-03-08 2019-01-29 Method for detecting target molecule

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011050629 2011-03-08
JP2011-050629 2011-03-08

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/003,509 A-371-Of-International US9329174B2 (en) 2011-03-08 2012-03-07 Bead trapping method and method for detecting target molecule
US14/513,660 Continuation-In-Part US10018627B2 (en) 2011-03-08 2014-10-14 Method for sealing substances, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
US15/082,195 Division US20160223531A1 (en) 2011-03-08 2016-03-28 Method for detecting target molecule

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012121310A1 true WO2012121310A1 (ja) 2012-09-13

Family

ID=46798265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/055884 Ceased WO2012121310A1 (ja) 2011-03-08 2012-03-07 ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置

Country Status (9)

Country Link
US (4) US9329174B2 (ja)
EP (1) EP2685266A1 (ja)
JP (1) JP5337324B2 (ja)
CN (1) CN103415774B (ja)
AU (1) AU2012226920B2 (ja)
BR (1) BR112013022933B1 (ja)
CA (1) CA2829185C (ja)
RU (1) RU2548619C1 (ja)
WO (1) WO2012121310A1 (ja)

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015222208A (ja) * 2014-05-23 2015-12-10 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分析用のデバイス、分析装置および分析方法
CN105209638A (zh) * 2013-03-14 2015-12-30 生命技术公司 基质阵列和其制备方法
WO2016006208A1 (ja) * 2014-07-08 2016-01-14 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質封入方法及びターゲット分子を検出する方法
JP2016183954A (ja) * 2015-03-26 2016-10-20 東ソー株式会社 微小粒子保持装置
KR20170057241A (ko) 2014-09-22 2017-05-24 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 카가쿠기쥬츠신코키코 타겟 분자의 검출 방법 및 이것에 사용되는 키트
JP2017134005A (ja) * 2016-01-29 2017-08-03 凸版印刷株式会社 アレイデバイス及び生体分子解析用キット
JP2017154036A (ja) * 2016-02-29 2017-09-07 住友理工株式会社 流体デバイス用シリコーン部材およびその製造方法
JP2017198626A (ja) * 2016-04-28 2017-11-02 凸版印刷株式会社 粒子の収容方法、及び、粒子の封入方法
JP2018009968A (ja) * 2016-06-30 2018-01-18 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス ウェルプレート及びその使用方法
US10018627B2 (en) 2011-03-08 2018-07-10 Japan Science And Technology Agency Method for sealing substances, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
JP2018518655A (ja) * 2015-04-03 2018-07-12 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ サンプル分析用デバイス及び方法
WO2018181488A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質検出方法及び微小物質検出用デバイス
WO2018181443A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス
JP2018531369A (ja) * 2015-07-22 2018-10-25 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 空間的に分離してビーズを保持するビーズウェル形状及びシグナル検出セグメントを有する流体デバイス並びに関連する方法
US10267793B2 (en) 2011-03-08 2019-04-23 Japan Science And Technology Agency Kit for sealing beads and detecting target molecule
US10324041B2 (en) 2016-12-21 2019-06-18 Abbott Japan Co., Ltd. Optical imaging system using lateral illumination for digital assays
WO2019131592A1 (ja) * 2017-12-26 2019-07-04 凸版印刷株式会社 標的分子の検出における偽陰性判定の発生を抑制する方法および検出デバイス
JP2019141047A (ja) * 2014-01-31 2019-08-29 凸版印刷株式会社 生体分子解析方法及び生体分子解析キット
WO2019168200A1 (ja) * 2018-03-02 2019-09-06 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素反応生成物の検出方法
WO2020085104A1 (ja) * 2018-10-24 2020-04-30 凸版印刷株式会社 免疫測定用カップ及びその製造方法、並びに免疫測定方法
WO2020235247A1 (ja) 2019-05-20 2020-11-26 日本航空電子工業株式会社 触媒反応の生成物の電気化学的検出方法およびトランスデューサ
WO2020250559A1 (ja) 2019-06-13 2020-12-17 日本航空電子工業株式会社 触媒反応の生成物の電気化学的検出方法、電気化学検出装置およびトランスデューサ
US11008603B2 (en) 2016-09-05 2021-05-18 Japan Science And Technology Agency Method and kit for detecting pathogenic microorganism
US11022598B2 (en) 2015-04-03 2021-06-01 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
US11047854B2 (en) 2017-02-06 2021-06-29 Abbott Japan Llc Methods for reducing noise in signal-generating digital assays
JP2021173599A (ja) * 2020-04-23 2021-11-01 凸版印刷株式会社 免疫測定用デバイス
WO2022202218A1 (ja) 2021-03-26 2022-09-29 国立研究開発法人産業技術総合研究所 ウエルアレイと粒子とを用いた生体物質検出方法、ウエルアレイ及び検出装置
WO2022202217A1 (ja) 2021-03-26 2022-09-29 国立研究開発法人産業技術総合研究所 ウエルアレイを用いたウイルス検出方法、ウエルアレイ及び検出装置
JP2024079799A (ja) * 2019-03-01 2024-06-11 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2856177B1 (en) * 2012-05-25 2020-11-18 The University of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
JP6311609B2 (ja) * 2012-10-17 2018-04-18 コニカミノルタ株式会社 希少細胞の回収方法および検出方法
WO2015188171A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Berkeley Lights, Inc. Isolating microfluidic structures and trapping bubbles
EP3270160B1 (en) * 2015-03-13 2020-03-18 Sysmex Corporation Method for detecting test substance and reagent kit used in said method
US10101250B2 (en) 2015-04-22 2018-10-16 Berkeley Lights, Inc. Manipulation of cell nuclei in a micro-fluidic device
JP7009993B2 (ja) 2015-09-08 2022-01-26 凸版印刷株式会社 生体物質検出方法および生体物質導入方法
JP7337760B2 (ja) 2015-10-07 2023-09-04 凸版印刷株式会社 生体分子の分析方法
GB201701691D0 (en) * 2017-02-01 2017-03-15 Illumina Inc System and method with reflective fiducials
US11896944B2 (en) 2017-02-01 2024-02-13 Illumina, Inc. System and method with fiducials responding to multiple excitation frequencies
GB201701686D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illunina Inc System & method with fiducials having offset layouts
GB201701689D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials of non-closed shapes
GB201701688D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials in non-recliner layouts
JP7556790B2 (ja) 2018-05-18 2024-09-26 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 基板の表面特性を改善する為の組成物、デバイス、及び方法
JP7203532B2 (ja) 2018-08-10 2023-01-13 シスメックス株式会社 被検物質の検出方法
EP3857228A4 (en) 2018-09-26 2022-07-06 The University of North Carolina at Chapel Hill COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING ASSAYS
US12220699B2 (en) 2019-01-21 2025-02-11 Forward Biotech, Inc. Liquid evaluation
US20220226815A1 (en) * 2019-05-09 2022-07-21 The Research Foundation For The State University Of New York Method and device for parallel single-cell processing
WO2020241689A1 (ja) * 2019-05-30 2020-12-03 凸版印刷株式会社 ウェルに液体を導入する方法
US12421487B2 (en) 2019-09-30 2025-09-23 Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. Cell screening device and cell screening kit
CN114514308B (zh) * 2019-09-30 2024-09-10 东京应化工业株式会社 细胞筛选器件及细胞筛选试剂盒
WO2023107663A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Forward Biotech, Inc. Liquid evaluation device
JP2024101477A (ja) * 2023-01-17 2024-07-29 キヤノン株式会社 個別分離区画を用いる検出のための情報処理システム
WO2025022240A2 (en) * 2023-07-21 2025-01-30 3M Innovative Properties Company Filmless, chemically differentiated, nanostructured substrate on a rigid substrate

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004309405A (ja) 2003-04-10 2004-11-04 Univ Tokyo 一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバ
JP2008111798A (ja) * 2006-10-31 2008-05-15 Shimadzu Corp マイクロ反応装置
JP2009109213A (ja) * 2007-10-26 2009-05-21 Hitachi Maxell Ltd 機能性粒子を利用したマイクロデバイスおよびそれを用いた処理方法
JP2009162549A (ja) * 2007-12-28 2009-07-23 Nec Corp 電気泳動チップ

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7214540B2 (en) 1999-04-06 2007-05-08 Uab Research Foundation Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth
AU2001239760B2 (en) 2000-02-10 2005-11-24 Illumina, Inc. Array of individual arrays as substrate for bead-based simultaneous processing of samples and manufacturing method therefor
WO2004074818A2 (en) 2002-12-20 2004-09-02 Biotrove, Inc. Assay apparatus and method using microfluidic arrays
CN104069784B (zh) * 2003-08-27 2017-01-11 哈佛大学 流体物种的电子控制
JP2005113136A (ja) 2003-09-19 2005-04-28 Foundation For The Promotion Of Industrial Science 流体分散可能物質を基板上にパターニングする方法及び装置とそのための有孔シート材並びにその製造方法
JP4547301B2 (ja) 2005-05-13 2010-09-22 株式会社日立ハイテクノロジーズ 液体搬送デバイス及び分析システム
US8481125B2 (en) * 2005-05-21 2013-07-09 Advanced Liquid Logic Inc. Mitigation of biomolecular adsorption with hydrophilic polymer additives
DE602006018794D1 (de) 2006-04-18 2011-01-20 Advanced Liquid Logic Inc Biochemie auf tröpfchenbasis
US8440392B2 (en) 2007-03-22 2013-05-14 Advanced Liquid Logic Inc. Method of conducting a droplet based enzymatic assay
US20110065086A1 (en) 2008-02-21 2011-03-17 Otc Biotechnologies, Llc Methods of producing homogeneous plastic-adherent aptamer-magnetic bead-fluorophore and other sandwich assays
BRPI0908876A2 (pt) 2008-02-29 2018-03-13 Univ Northwestern barreiras para facilitação de reações biológicas
WO2010009365A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
JP5030897B2 (ja) 2008-08-28 2012-09-19 メタウォーター株式会社 微生物計測方法
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
WO2011109379A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
CN101947124B (zh) * 2010-06-25 2012-07-04 博奥生物有限公司 一种集成式微流控芯片装置及其使用方法
WO2012045012A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
US9952237B2 (en) 2011-01-28 2018-04-24 Quanterix Corporation Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles
US10018627B2 (en) 2011-03-08 2018-07-10 Japan Science And Technology Agency Method for sealing substances, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
EP2685266A1 (en) 2011-03-08 2014-01-15 Japan Science And Technology Agency Bead sealing method, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
US9797837B2 (en) 2012-08-31 2017-10-24 The University Of Tokyo Detector and detection method

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004309405A (ja) 2003-04-10 2004-11-04 Univ Tokyo 一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバ
JP2008111798A (ja) * 2006-10-31 2008-05-15 Shimadzu Corp マイクロ反応装置
JP2009109213A (ja) * 2007-10-26 2009-05-21 Hitachi Maxell Ltd 機能性粒子を利用したマイクロデバイスおよびそれを用いた処理方法
JP2009162549A (ja) * 2007-12-28 2009-07-23 Nec Corp 電気泳動チップ

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID M RISSIN ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY
DAVID M RISSIN ET AL.: "Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations", NATURE BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 28, no. 6, June 2010 (2010-06-01), pages 595 - 599, XP002662812, DOI: doi:10.1038/NBT.1641 *
S. SAKAKIHARA ET AL., LAB CHIP, vol. 10, 2010, pages 3355 - 3362
See also references of EP2685266A4

Cited By (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10809257B2 (en) 2011-03-08 2020-10-20 Japan Science And Technology Agency Method for detecting target molecule
US10018627B2 (en) 2011-03-08 2018-07-10 Japan Science And Technology Agency Method for sealing substances, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
US10267793B2 (en) 2011-03-08 2019-04-23 Japan Science And Technology Agency Kit for sealing beads and detecting target molecule
CN110066853A (zh) * 2013-03-14 2019-07-30 生命技术公司 基质阵列和其制备方法
JP2016513468A (ja) * 2013-03-14 2016-05-16 ライフ テクノロジーズ コーポレーション マトリックスアレイ及びそれを製造するための方法
CN105209638A (zh) * 2013-03-14 2015-12-30 生命技术公司 基质阵列和其制备方法
CN110066853B (zh) * 2013-03-14 2023-03-28 生命技术公司 基质阵列和其制备方法
JP2019141047A (ja) * 2014-01-31 2019-08-29 凸版印刷株式会社 生体分子解析方法及び生体分子解析キット
JP2015222208A (ja) * 2014-05-23 2015-12-10 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分析用のデバイス、分析装置および分析方法
KR20170027716A (ko) * 2014-07-08 2017-03-10 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 카가쿠기쥬츠신코키코 물질 봉입 방법 및 타깃 분자를 검출하는 방법
JPWO2016006208A1 (ja) * 2014-07-08 2017-04-27 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質封入方法及びターゲット分子を検出する方法
AU2015286488B2 (en) * 2014-07-08 2020-07-16 Japan Science And Technology Agency Substance sealing method and target molecule detecting method
US20170176430A1 (en) * 2014-07-08 2017-06-22 Japan Science And Technology Agency Substance sealing method and target molecule detecting method
US10451619B2 (en) 2014-07-08 2019-10-22 Japan Science And Technology Agency Substance sealing method and target molecule detecting method
KR102437408B1 (ko) * 2014-07-08 2022-08-29 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 카가쿠기쥬츠신코키코 물질 봉입 방법 및 타깃 분자를 검출하는 방법
WO2016006208A1 (ja) * 2014-07-08 2016-01-14 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質封入方法及びターゲット分子を検出する方法
KR20170057241A (ko) 2014-09-22 2017-05-24 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 카가쿠기쥬츠신코키코 타겟 분자의 검출 방법 및 이것에 사용되는 키트
JP2016183954A (ja) * 2015-03-26 2016-10-20 東ソー株式会社 微小粒子保持装置
US11633738B2 (en) 2015-04-03 2023-04-25 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
JP2024020244A (ja) * 2015-04-03 2024-02-14 アボット・ラボラトリーズ サンプル分析用デバイス及び方法
JP2018518655A (ja) * 2015-04-03 2018-07-12 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ サンプル分析用デバイス及び方法
JP2022020665A (ja) * 2015-04-03 2022-02-01 アボット・ラボラトリーズ サンプル分析用デバイス及び方法
US11022598B2 (en) 2015-04-03 2021-06-01 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
JP2018531369A (ja) * 2015-07-22 2018-10-25 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 空間的に分離してビーズを保持するビーズウェル形状及びシグナル検出セグメントを有する流体デバイス並びに関連する方法
JP2017134005A (ja) * 2016-01-29 2017-08-03 凸版印刷株式会社 アレイデバイス及び生体分子解析用キット
JP2017154036A (ja) * 2016-02-29 2017-09-07 住友理工株式会社 流体デバイス用シリコーン部材およびその製造方法
JP2017198626A (ja) * 2016-04-28 2017-11-02 凸版印刷株式会社 粒子の収容方法、及び、粒子の封入方法
JP2018009968A (ja) * 2016-06-30 2018-01-18 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス ウェルプレート及びその使用方法
US11008603B2 (en) 2016-09-05 2021-05-18 Japan Science And Technology Agency Method and kit for detecting pathogenic microorganism
US10324041B2 (en) 2016-12-21 2019-06-18 Abbott Japan Co., Ltd. Optical imaging system using lateral illumination for digital assays
US11635387B2 (en) 2016-12-21 2023-04-25 Abbott Japan Co., Ltd Optical imaging system using lateral illumination for digital assays
US11073481B2 (en) 2016-12-21 2021-07-27 Abbott Japan Llc Optical imaging system using lateral illumination for digital assays
US11047854B2 (en) 2017-02-06 2021-06-29 Abbott Japan Llc Methods for reducing noise in signal-generating digital assays
US12422429B2 (en) 2017-02-06 2025-09-23 Abbott Japan Llc Methods for reducing noise in signal-generating digital assays
WO2018181488A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質検出方法及び微小物質検出用デバイス
JP7212940B2 (ja) 2017-03-29 2023-01-26 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質検出方法及び微小物質検出用デバイス
CN110462365B (zh) * 2017-03-29 2022-03-11 国立研究开发法人科学技术振兴机构 微小物质封入方法及微小物质检测方法以及微小物质检测用装置
JPWO2018181443A1 (ja) * 2017-03-29 2020-02-06 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス
CN110476067A (zh) * 2017-03-29 2019-11-19 国立研究开发法人科学技术振兴机构 微小物质检测方法及微小物质检测用装置
CN110462365A (zh) * 2017-03-29 2019-11-15 国立研究开发法人科学技术振兴机构 微小物质封入方法及微小物质检测方法以及微小物质检测用装置
US12196654B2 (en) 2017-03-29 2025-01-14 Japan Science And Technology Agency Microscopic body detection method and microscopic body detection device
US11231370B2 (en) 2017-03-29 2022-01-25 Japan Science And Technology Agency Microscopic body enclosing method, microscopic body detection method, and microscopic body detection device
WO2018181443A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス
JPWO2018181488A1 (ja) * 2017-03-29 2020-02-06 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質検出方法及び微小物質検出用デバイス
JP7125763B2 (ja) 2017-03-29 2022-08-25 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス
WO2019131592A1 (ja) * 2017-12-26 2019-07-04 凸版印刷株式会社 標的分子の検出における偽陰性判定の発生を抑制する方法および検出デバイス
JP7329851B2 (ja) 2018-03-02 2023-08-21 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素反応生成物の検出方法
US12173348B2 (en) 2018-03-02 2024-12-24 Japan Science And Technology Agency Method for detecting enzymatic reaction product
JPWO2019168200A1 (ja) * 2018-03-02 2021-02-12 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素反応生成物の検出方法
WO2019168200A1 (ja) * 2018-03-02 2019-09-06 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素反応生成物の検出方法
JPWO2020085104A1 (ja) * 2018-10-24 2021-09-16 凸版印刷株式会社 免疫測定用カップ及びその製造方法、並びに免疫測定方法
EP3872490A4 (en) * 2018-10-24 2021-11-24 Toppan Printing Co., Ltd. MUGS FOR IMMUNOASSAYS, PROCESS FOR THEIR PRODUCTION AND IMMUNOASSAY PROCESS
WO2020085104A1 (ja) * 2018-10-24 2020-04-30 凸版印刷株式会社 免疫測定用カップ及びその製造方法、並びに免疫測定方法
JP7318659B2 (ja) 2018-10-24 2023-08-01 凸版印刷株式会社 免疫測定用カップ及びその製造方法、並びに免疫測定方法
JP7747101B2 (ja) 2019-03-01 2025-10-01 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法
JP2024079799A (ja) * 2019-03-01 2024-06-11 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法
WO2020235247A1 (ja) 2019-05-20 2020-11-26 日本航空電子工業株式会社 触媒反応の生成物の電気化学的検出方法およびトランスデューサ
TWI762906B (zh) * 2019-05-20 2022-05-01 日商日本航空電子工業股份有限公司 觸媒反應產物之電化學檢測方法及換能器
JP7219919B2 (ja) 2019-05-20 2023-02-09 日本航空電子工業株式会社 触媒反応生成物の電気化学的測定方法及びトランスデューサ
CN113825830A (zh) * 2019-05-20 2021-12-21 日本航空电子工业株式会社 催化反应生成物的电化学检测方法和传感器
JP2020190425A (ja) * 2019-05-20 2020-11-26 日本航空電子工業株式会社 触媒反応生成物の電気化学的測定方法及びトランスデューサ
US12320773B2 (en) 2019-05-20 2025-06-03 Japan Aviation Electronics Industry, Limited Electrochemical detection method for catalytic reaction product, and transducer
EP4234678A2 (en) 2019-05-20 2023-08-30 Japan Aviation Electronics Industry, Limited Electrochemical detection method for product of catalyzed reaction
EP3974513A4 (en) * 2019-05-20 2022-09-14 Japan Aviation Electronics Industry, Limited ELECTROCHEMICAL DETECTION PROCEDURE FOR THE PRODUCT OF A CATALYzed REACTION AND TRANSDUCER
CN113966385A (zh) * 2019-06-13 2022-01-21 日本航空电子工业株式会社 催化反应生成物的电化学检测方法、电化学检测装置和传感器
JP2020201211A (ja) * 2019-06-13 2020-12-17 日本航空電子工業株式会社 触媒反応生成物の電気化学的測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
EP4403619A2 (en) 2019-06-13 2024-07-24 Japan Aviation Electronics Industry, Limited Electrochemical detection method for catalyst reaction product, electrochemical detection device, and transducer
EP4403619A3 (en) * 2019-06-13 2024-11-27 Japan Aviation Electronics Industry, Limited Electrochemical detection method for catalyst reaction product, electrochemical detection device, and transducer
WO2020250559A1 (ja) 2019-06-13 2020-12-17 日本航空電子工業株式会社 触媒反応の生成物の電気化学的検出方法、電気化学検出装置およびトランスデューサ
JP7201178B2 (ja) 2019-06-13 2023-01-10 日本航空電子工業株式会社 触媒反応生成物の電気化学的測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
EP3985091A4 (en) * 2019-06-13 2022-09-28 Japan Aviation Electronics Industry, Limited CATALYST REACTION PRODUCT ELECTROCHEMICAL DETECTION METHOD, ELECTROCHEMICAL DETECTION DEVICE AND TRANSDUCER
US12535462B2 (en) 2019-06-13 2026-01-27 Japan Aviation Electronics Industry, Limited Electrochemical detection method for catalytic reaction product, electrochemical detection apparatus and transducer
JP2021173599A (ja) * 2020-04-23 2021-11-01 凸版印刷株式会社 免疫測定用デバイス
JP7532867B2 (ja) 2020-04-23 2024-08-14 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 免疫測定用デバイス
WO2022202217A1 (ja) 2021-03-26 2022-09-29 国立研究開発法人産業技術総合研究所 ウエルアレイを用いたウイルス検出方法、ウエルアレイ及び検出装置
WO2022202218A1 (ja) 2021-03-26 2022-09-29 国立研究開発法人産業技術総合研究所 ウエルアレイと粒子とを用いた生体物質検出方法、ウエルアレイ及び検出装置

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013022933A2 (pt) 2016-12-06
EP2685266A4 (en) 2014-01-15
US20130345088A1 (en) 2013-12-26
RU2548619C1 (ru) 2015-04-20
CA2829185A1 (en) 2012-09-13
JP5337324B2 (ja) 2013-11-06
AU2012226920A1 (en) 2013-10-10
US20160223531A1 (en) 2016-08-04
JPWO2012121310A1 (ja) 2014-07-17
US20170115284A1 (en) 2017-04-27
CN103415774A (zh) 2013-11-27
US10267793B2 (en) 2019-04-23
EP2685266A1 (en) 2014-01-15
US20190154682A1 (en) 2019-05-23
CN103415774B (zh) 2014-09-24
AU2012226920B2 (en) 2015-02-19
CA2829185C (en) 2017-11-14
US10809257B2 (en) 2020-10-20
BR112013022933B1 (pt) 2020-07-07
RU2013144617A (ru) 2015-04-20
US9329174B2 (en) 2016-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5337324B2 (ja) ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置
JP6611714B2 (ja) 物質封入方法及びターゲット分子を検出する方法
US20130099143A1 (en) Structure for particle immobilization and apparatus for particle analysis
JPWO2014034781A1 (ja) 検出装置及び検出方法
US10032615B2 (en) Systems and methods for single cell culture and analysis by microscopy and MALDI mass spectrometry
US10018627B2 (en) Method for sealing substances, method for detecting target molecule, array, kit, and target molecule detection device
EP4592379A1 (en) Method for forming microdroplets
Toppi et al. Photolithographic patterning of fluoracryl for biphilic microwell-based digital bioassays and selection of bacteria
JP2018072134A (ja) 検出方法及びデバイス
JP6808940B2 (ja) アレイデバイス、生体分子解析用キット及び溶媒の封止方法
Yang Development of 3D Printing Enabled Methodologies for Microfluidic Cell Analysis and Surface Plasmon Resonance Sensing Enhanced by Nanoconjugates
CN121878204A (zh) 一种高通量生物检测系统及其方法
Xu Assembly of ordered microsphere arrays: Platforms for microarrays

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12754743

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013503587

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2829185

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14003509

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012754743

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013144617

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012226920

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20120307

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013022933

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013022933

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130906