WO2012124520A1 - 改変型α－グルコシダーゼ及びその用途 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a modified ⁇ -glucosidase. Specifically, the present invention relates to a modified ⁇ -glucosidase, a design method and a preparation method of the modified ⁇ -glucosidase, and uses of the modified ⁇ -glucosidase.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2011-057386 filed on March 16, 2011, the entire contents of which are incorporated by reference.
  • Sugar hydrolase is an enzyme that cleaves and degrades ester bonds, but many have also been reported to have transglycosylation activity at the same time.
  • ⁇ -Glucosidase which is a typical sugar hydrolase, generally has both hydrolytic activity (hydrolysis reaction) and transglycosylation activity (condensation reaction).
  • ⁇ -Glucosidase exists in nature from microorganisms to higher animals and higher plants.
  • ⁇ -Glucosidase is an industrially useful enzyme and is used for decomposition and synthesis of sugars.
  • JP 2003-88365 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-253302 JP 2009-22204 A JP 2001-046096 A
  • an object of the present invention is to provide an ⁇ -glucosidase suitable for the production of oligosaccharides and having superior transglycosylation activity. It is also an object to provide the usage and the like.
  • the present inventors tried to modify the structure of existing ⁇ -glucosidase at the molecular level for the purpose of designing a novel enzyme with improved oligosaccharide production ability. Specifically, the results of X-ray crystal structure analysis of ⁇ -glucosidase derived from human small intestine (human maltase-glucoamylase) were used for computer simulation and alignment comparison with four homologs. As a result, three amino acids constituting the substrate pocket of the enzyme were identified. Next, amino acids corresponding to the amino acids were identified on the amino acid sequence of Aspergillus niger ⁇ -glucosidase, and mutations were introduced into them.
  • the present inventors have further studied and decided to examine the mutation introduction point by a new method. Specifically, first, three-dimensional structure models were constructed for Aspergillus niger ⁇ -glucosidase and Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase using another computer simulation software. Subsequently, docking simulation analysis was performed to predict the substrate pocket. And based on the prediction result, the amino acid used as an active center was searched, and the position on each three-dimensional structure model was specified.
  • amino acid sequences were compared between Aspergillus niger ⁇ -glucosidase and Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase, and amino acids that did not match among the amino acids constituting the substrate pocket were identified as amino acids suitable for displacement introduction. .
  • mutations are actually introduced into two amino acids.
  • a modified product was obtained.
  • a variant exhibiting a transfer activity specific to ⁇ 1,6 position and a variant exhibiting a transfer activity specific to ⁇ 1,4 position were recognized. This fact confirms that successfully identified amino acid positions are effective for structural modification.
  • a modified ⁇ -glucosidase that has been successfully acquired has great industrial value.
  • the mutation technique found by the present inventors is applicable not only to ⁇ -glucosidase derived from but also to ⁇ -glucosidase derived from other organisms.
  • ⁇ -glucosidase is human maltase-glucoamylase, Aspergillus niger alpha-glucosidase, human neutral ⁇ -glucosidase C (Human Neutral alpha-glucosidase C) ), Mouse lysosomal ⁇ -glucosidase, yeast ⁇ -glucosidase (Yeast GLU2A), Aspergillus nidulans alpha-glucosidase A, Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB), Mucor javanicus alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae alpha-glucosidase, Mortierella alliacea ⁇ -glucosidase (Mortierella allacea) a-glucosidase), Schizosaccharomyces
  • the amino acid sequence of ⁇ -glucosidase is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
  • the amino acid of (1) is the amino acid at position 343 of the amino acid sequence
  • the amino acid of (2) is the amino acid at position 452 of the amino acid sequence
  • the amino acid of (3) is the amino acid at position 496 of the amino acid sequence
  • the amino acid of (4) is the amino acid
  • the amino acid at position (5) is the amino acid at position 495 in the amino acid sequence
  • the amino acid at position (6) is the amino acid at position 498 in the amino acid sequence
  • the amino acid at position (7) is the amino acid at position 499 in the amino acid sequence
  • (8 ) Amino acid at position 531 of the amino acid sequence
  • amino acid (12) at position 662 of the amino acid sequence is amino acid at position (13) of the amino acid sequence.
  • the amino acid to be substituted is the amino acid of (1), and the amino acid after substitution is cysteine, aspartic acid, methionine, histidine, alanine, phenylalanine, glycine, threonine, glutamic acid, valine, glutamine, asparagine or isoleucine, The modified ⁇ -glucosidase according to [3].
  • the amino acid to be substituted is the amino acid (1) and the amino acid (2), The modified ⁇ -glucosidase according to [3], wherein the amino acid after substitution is aspartic acid for the amino acid (1) and alanine or glycine for the amino acid (2).
  • the amino acid to be substituted is the amino acid (1) and the amino acid (3),
  • the modified ⁇ -glucosidase according to [3], wherein the amino acid to be substituted is the amino acid of (5), and the amino acid after substitution is glycine, proline or valine.
  • modified ⁇ -glucosidase and wild-type enzyme described in [9] or [12] are allowed to act on an oligosaccharide or polysaccharide having two or more sugars having an ⁇ -1,4 bond.
  • a method for producing an oligosaccharide [22] Pharmaceutical composition, quasi-drug composition, cosmetic composition containing the modified ⁇ -glucosidase according to any one of [1] to [12] or the enzyme agent according to [17] , Food composition or bait composition.
  • a method for designing a modified ⁇ -glucosidase comprising the following steps (i) and (ii): (i) A step of identifying one or more amino acids selected from the group consisting of the following (1) to (14) in the amino acid sequence of ⁇ -glucosidase, which is an enzyme to be mutated: (1) an amino acid corresponding to amino acid 385 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) an amino acid corresponding to the 491st amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (3) an amino acid corresponding to amino acid 535 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (4) an amino acid corresponding to the 450th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (5) an amino acid corresponding to amino acid 534 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (6) an amino acid corresponding to amino acid position 537 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (7) an amino acid corresponding to amino acid position
  • ⁇ -glucosidase is human maltase-glucoamylase, Aspergillus niger alpha-glucosidase, human neutral ⁇ -glucosidase C (Human Neutral alpha-glucosidase C) ), Mouse lysosomal ⁇ -glucosidase, yeast ⁇ -glucosidase (Yeast GLU2A), Aspergillus nidulans alpha-glucosidase A, Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB), Mucor javanicus alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae alpha-glucosidase, Mortierella alliacea alpha-glucosidase (Mortierella alli acea alpha-glucosidase), Schizosaccharomyces pom
  • the ⁇ -glucosidase has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the amino acid substituted in step (i) is one amino acid selected from (1) to (14), (1) to ( The design method according to [23], which is two amino acids selected from 14) or three amino acids selected from (1) to (14).
  • a method for preparing a modified ⁇ -glucosidase comprising the following steps (I) to (III): (I) A nucleic acid encoding an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 42 and 74 to 78, or an amino acid sequence constructed by the design method described in any one of [23] to [26] is prepared. Step; (II) expressing the nucleic acid; and (III) recovering the expression product. [28] An ⁇ -glucosidase having an ⁇ 1,4-position-specific or ⁇ 1,6-position-specific transfer activity.
  • the amount of oligosaccharide produced was compared between structurally modified TGs with different amino acids after substitution (shown below the graph).
  • the amount of oligosaccharide produced was compared between structurally modified TGs with different amino acids after substitution (shown below the graph).
  • Comparison of substrate specificity for hydrolytic activity Hydrolysis activity of structurally modified TG by 2 amino acid substitution.
  • Oligosaccharide synthesis activity of structurally modified TG by two amino acid substitutions The oligosaccharide synthesis activities of WT (wild type) (A) and structurally modified TG (W343M (B), W343M / S496T (C), W343D / V452G (D)) were compared. Comparison of synthesis amount of oligosaccharides with 3 or more sugars (left) and comparison of synthesis amount of oligosaccharides with 4 or more sugars (right). The amount of oligosaccharide produced was compared between structurally modified TGs with different amino acids after substitution (shown below the graph). Substrate specificity of structurally modified TG by two amino acid substitutions.
  • ⁇ -Glucosidase is also called transglucosidase.
  • ⁇ -glucosidase and “transglucosidase” are used interchangeably.
  • modified ⁇ -glucosidase is an enzyme obtained by modifying or mutating “an underlying ⁇ -glucosidase” by the technique disclosed in this specification.
  • modified ⁇ -glucosidase the term “structure-modified ⁇ -glucosidase”
  • modified enzyme the term “modified enzyme” and the term “structure-modifying enzyme” are used interchangeably.
  • the underlying ⁇ -glucosidase is typically wild type ⁇ -glucosidase. However, this does not preclude application of ⁇ -glucosidase, which has already been subjected to artificial manipulation, to the present invention as a “base ⁇ -glucosidase”.
  • the “base ⁇ -glucosidase” is also referred to herein as “mutation target ⁇ -glucosidase” or “mutation target enzyme”.
  • the amino acid at the point of mutation introduction is expressed by a combination of one letter representing the type of amino acid and a number representing the position of the amino acid. For example, if tryptophan at position 343 is a mutation introduction point, it is expressed as “W343”.
  • the first aspect of the present invention relates to a modified ⁇ -glucosidase (modified enzyme).
  • modified enzyme of the present invention has an amino acid sequence in which one or two or more amino acids selected from the group consisting of the following (1) to (14) are substituted with other amino acids in the amino acid sequence of the enzyme to be mutated: .
  • Amino acid corresponding to amino acid position 385 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid corresponding to amino acid position 491 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (3) Amino acid position 535 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (4) amino acid corresponding to amino acid position 450 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5) amino acid corresponding to amino acid position 534 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (6) amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (7) amino acid corresponding to amino acid position 538 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (8) amino acid corresponding to amino acid position 554 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (9) SEQ ID NO: 1 (10) amino acid corresponding to amino acid position 579 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (11) amino acid position 585 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Amino acid corresponding to noic acid (12) Amino acid
  • the 385th amino acid, 491st amino acid, and 535rd amino acid are used for three-dimensional structure analysis and function prediction of human maltase-glucoamylase (SEQ ID NO: 1), and alignment comparison with homologues, etc.
  • SEQ ID NO: 1 human maltase-glucoamylase
  • homologues homologues
  • the structure of the enzyme is modified by mutating amino acids corresponding to these amino acids to change the properties of ⁇ -glucosidase.
  • the “characteristic” here is transglycosylation activity and hydrolysis activity.
  • the balance between the transglycosylation activity and the hydrolysis activity is shifted in a direction in which the transglycosylation activity is dominant based on the pre-modification.
  • glycosyltransferase activity is improved and / or hydrolysis activity is reduced, or both of them, and the enzyme is capable of efficient glycosyltransferase.
  • amino acids shown in (4) to (14) above were used for structural modification as a result of the comparison of the three-dimensional structure and amino acid sequence of Aspergillus niger ⁇ -glucosidase and Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase. Amino acids predicted to be effective.
  • the structure of the enzyme is altered by mutating amino acids corresponding to these amino acids to change the properties of ⁇ -glucosidase.
  • the term “corresponding” when used for amino acid residues in the present specification means that the protein (enzyme) to be compared makes an equivalent contribution to the performance of its function.
  • the amino acid sequence to be compared with the reference amino acid sequence that is, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is optimal while considering partial homology of the primary structure (amino acid sequence).
  • the amino acid at the position corresponding to a specific amino acid in the reference amino acid sequence is Amino acid ".
  • the “corresponding amino acid” can also be specified by comparing three-dimensional structures (three-dimensional structures).
  • a highly reliable comparison result can be obtained by using the three-dimensional structure information.
  • a method of performing alignment while comparing atomic coordinates of the three-dimensional structures of a plurality of enzymes can be employed.
  • the three-dimensional structure information of the enzyme to be mutated can be obtained from, for example, Protein Data Bank (http://www.pdbj.org/index_j.html).
  • Crystallize the protein is indispensable for determining the three-dimensional structure, but it also has industrial utility as a high purity protein purification method and a high density and stable storage method. In this case, it is preferable to crystallize a protein bound with a substrate or an analog compound thereof as a ligand.
  • Diffraction data is collected by irradiating the produced crystal with X-rays. In many cases, protein crystals are damaged by X-ray irradiation and the diffraction ability deteriorates. In that case, a cryogenic measurement technique in which the crystal is rapidly cooled to about ⁇ 173 ° C.
  • the heavy atom isomorphous substitution method is a method of obtaining phase information by introducing a metal atom having a large atomic number such as mercury or platinum into a crystal and utilizing the contribution of the metal atom to the X-ray diffraction data of the large X-ray scattering ability. .
  • the determined phase can be improved by smoothing the electron density of the solvent region in the crystal. Since water molecules in the solvent region have large fluctuations, almost no electron density is observed, so by approximating the electron density in this region to 0, it is possible to approach the true electron density and thus the phase is improved. . Further, when a plurality of molecules are contained in the asymmetric unit, the phase is further improved by averaging the electron density of these molecules. The protein model is fit to the electron density map calculated using the improved phase in this way. This process is performed on a computer graphic using a program such as QUANTA from MSI (USA). Thereafter, the structure is refined using a program such as X-PLOR of MSI, and the structural analysis is completed.
  • crystal structure of a similar protein When the crystal structure of a similar protein is known with respect to the target protein, it can be determined by a molecular replacement method using the atomic coordinates of the known protein. Molecular replacement and structural refinement can be performed using programs such as CNS_SOLVE ver.11.
  • Examples of the enzyme to be mutated in the present invention include human maltase-glucoamylase, Aspergillus niger alpha-glucosidase, human neutral alpha-glucosidase C (Human Neutral alpha-glucosidase).
  • mice lysosomal alpha-glucosidase mouse lysosomal alpha-glucosidase, yeast ⁇ -glucosidase (Yeast GLU2A), Aspergillus nidulans alpha-glucosidase A, Aspergillus nidulans ⁇ - Glucosidase B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB), Mucor javanicus alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae alpha-glucosidase, Mortierella alliacea ⁇ -ella alliacea alpha-glucosidase), Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase, Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase, Barley ⁇ -glucosulase ⁇ -glucosulase -glucosidase), Arabidopsis
  • Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase SEQ ID NO: 14
  • Spina oleracea alpha-glucosidase SEQ ID NO: 15
  • Sugar radish alpha-glucosidase SEQ ID NO: 16
  • Potato ⁇ -glucosidase SEQ ID NO: 17
  • the amino acid of (1) above is the amino acid at position 343 of SEQ ID NO: 2
  • the amino acid of (2) above is the sequence
  • the amino acid at position 452 of No. 2 is the amino acid at position 496 of SEQ ID NO: 2
  • the amino acid at (4) is at position 410 of SEQ ID NO: 2
  • the amino acid at (5) is SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid of (6) above is the 498th amino acid of SEQ ID NO: 2
  • the amino acid of (7) above is the 499th amino acid of SEQ ID NO: 2
  • the amino acid of (8) above is the 531 amino acid of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid of (9) is the amino acid at position 533 of SEQ ID NO. 2
  • the amino acid of (10) is the amino acid at position 579 of SEQ ID NO. 2
  • the amino acid of (11) is the amino acid at position 585 of SEQ ID NO.
  • Amino acid (12) becomes a 662 amino acid positions of SEQ ID NO: 2
  • amino acids of the (13) becomes 715 of the amino acid of SEQ ID NO: 2
  • amino acids of the above (14) is 721 amino acid positions of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid after substitution is not particularly limited. Therefore, it may be a conservative amino acid substitution or a non-conservative amino acid substitution.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of a certain amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having the same properties.
  • a basic side chain eg lysine, arginine, histidine
  • an acidic side chain eg aspartic acid, glutamic acid
  • an uncharged polar side chain eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine
  • Cysteine eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched side chains eg threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains eg tyrosine, phenylalanine, Like tryptophan and histidine.
  • Conservative amino acid substitutions are typically substitutions between amino acid residues within the same family.
  • amino acids after substitution when ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus niger having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is used as the enzyme to be mutated include cysteine, aspartic acid, methionine, histidine, alanine for the amino acid of (1) , Phenylalanine, glycine, threonine, glutamic acid, valine, glutamine, asparagine or isoleucine, the amino acid of (2) is glycine, aspartic acid, glutamic acid or alanine, and the amino acid of (3) is valine, asparagine, glutamine, It is isoleucine, arginine, cysteine or threonine, the amino acid (5) is glycine, proline or valine, and the amino acid (6) is leucine or serine.
  • amino acids (1) to (14) two or more amino acids may be substituted.
  • combinations of amino acids to be substituted include a combination of (1) and (2) and a combination of (1) and (3). These combinations correspond to the structural modification enzymes obtained in the examples described later.
  • amino acid sequences of the modified enzymes are shown in SEQ ID NOs: 18 to 42 and 74 to 78. These sequences have 1 amino acid substitution for Aspergillus niger ⁇ -glucosidase (for any of amino acids (1) to (3), (5) and (6)), 2 amino acid substitutions ((1) And (2) amino acids, (1) and (3) amino acids, or (2) and (3) amino acids), or three amino acid substitutions ((1) and (2) And (3) the amino acid sequence of the modified enzyme obtained by subjecting the amino acid to (3).
  • the correspondence between SEQ ID NOs and amino acid substitutions is as follows.
  • the serine (S496) at position 496 corresponds to the amino acid (3)
  • the isoleucine (I410) at position 410 corresponds to the amino acid at (4)
  • the glutamic acid at position 531 (E531) corresponds to the amino acid at (8)
  • phenylalanine at position 533 (F533) corresponds to the amino acid at (9)
  • asparagine at position 585 (N585) corresponds to the amino acid at (11)
  • tyrosine at position 662 (Y662) corresponds to the amino acid at (12)
  • position 715 Tyrosine (Y715) corresponds to the amino acid (13)
  • leucine (L721) at position 721 corresponds to the amino acid (14).
  • tyrosine (Y296) at position 296 corresponds to the amino acid (1)
  • asparagine (N456) at position 456 corresponds to the amino acid (3)
  • the methionine at position 363 (M363) corresponds to the amino acid at (4)
  • the alanine at position 455 (A455) corresponds to the amino acid at (5)
  • the tyrosine at position 458 (Y458) is the amino acid at (6).
  • Asparagine at position 459 corresponds to amino acid (7)
  • Aspartic acid at position 488 corresponds to amino acid (8)
  • leucine at position 490 L490
  • Arginine (R565) at position 565 corresponds to the amino acid at (10)
  • glutamine at position 571 corresponds to the amino acid at (11)
  • the 700-position phenylalanine (F700) corresponds to the (13) amino acid
  • Amino acid sequence Amino acid substitution A.
  • the usefulness of the modified ⁇ -glucosidase of A to C, O, and Q to S is particularly high in terms of excellent transglycosylation activity. .
  • the usefulness of V and W is high in terms of extremely low hydrolysis activity.
  • the usefulness of U, X and Y is high in that the decomposition activity for ⁇ -1,6 bond is extremely low.
  • Y is also highly useful in that it has excellent transglycosylation activity.
  • a to c are characteristic in that they exhibit ⁇ 1,6-position specific translocation activity.
  • d and e are excellent in ⁇ -1,4-position specific transfer activity.
  • the protein after the mutation may have the same function as the protein before the mutation. That is, the amino acid sequence mutation does not substantially affect the protein function, and the protein function may be maintained before and after the mutation.
  • a modified enzyme consisting of an amino acid sequence in which one or two or more amino acids selected from the group consisting of the above (1) to (14) are substituted with other amino acids.
  • “Slight difference in amino acid sequence” as used herein typically means deletion of one to several amino acids (upper limit is 3, 5, 7, 10) constituting an amino acid sequence, It means that a mutation (change) has occurred in the amino acid sequence by substitution or addition, insertion, or a combination of 1 to several amino acids (the upper limit is 3, 5, 7, 10).
  • the identity (%) between the amino acid sequence of “substantially identical enzyme” and the amino acid sequence of the modified enzyme as a reference is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98%. Or more, and most preferably 99% or more.
  • the difference in amino acid sequence may occur at a plurality of positions. “Slight differences in amino acid sequence” are preferably caused by conservative amino acid substitutions.
  • the second aspect of the present invention provides a nucleic acid related to the modified enzyme of the present invention. That is, a gene encoding a modified enzyme, a nucleic acid that can be used as a probe for identifying a nucleic acid encoding the modified enzyme, and a primer for amplifying or mutating a nucleic acid encoding the modified enzyme Nucleic acids capable of being provided are provided.
  • the gene encoding the modified enzyme is typically used for the preparation of the modified enzyme. According to a genetic engineering preparation method using a gene encoding a modified enzyme, it is possible to obtain a modified enzyme in a more homogeneous state. This method can also be said to be a suitable method when preparing a large amount of modified enzyme.
  • the use of the gene encoding the modified enzyme is not limited to the preparation of the modified enzyme.
  • the nucleic acid can also be used as an experimental tool for elucidating the mechanism of action of the modified enzyme, or as a tool for designing or preparing a further modified enzyme.
  • a “gene encoding a modified enzyme” refers to a nucleic acid obtained by expressing the modified enzyme, and has a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the modified enzyme.
  • the nucleic acid includes, of course, a nucleic acid obtained by adding a sequence that does not encode an amino acid sequence to such a nucleic acid. Codon degeneracy is also considered.
  • SEQ ID NOs: 43 to 67 and 79 to 83 Examples of sequences (base sequences) of genes encoding modified enzymes are shown in SEQ ID NOs: 43 to 67 and 79 to 83. These sequences are genes encoding a modified enzyme in which a specific amino acid substitution is performed on ⁇ -glucosidase of Aspergillus niger.
  • the correspondence between SEQ ID NOs and amino acid substitutions is as follows.
  • SEQ ID NO: 48: W343F G Examples of sequences (base sequences) of genes encoding modified enzymes are shown in SEQ ID NOs: 43 to 67 and 79 to 83. These sequences are genes encoding
  • SEQ ID NO: 63 W343D and V452G V.
  • SEQ ID NO: 64 W343D and S496I W.
  • SEQ ID NO: 65 W343D and S496R X.
  • SEQ ID NO: 66 W343M and S496C Y.
  • SEQ ID NO: 67 W343M and S496T a.
  • the nucleic acid of the present invention is isolated by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. Can be prepared.
  • a nucleic acid (hereinafter referred to as the following) having a partially different base sequence, although the function of the protein encoded by the same is equivalent to the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • a base sequence defining a homologous nucleic acid is also referred to as “homologous base sequence”).
  • a modified enzyme comprising a nucleotide sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or more bases based on the nucleotide sequence of a nucleic acid encoding the modified enzyme of the present invention.
  • DNA encoding a protein having a characteristic enzyme activity that is, glycosyltransferase activity.
  • Base substitution or deletion may occur at a plurality of sites.
  • the term “plurality” as used herein refers to, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases, although it varies depending on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the nucleic acid. It is.
  • homologous nucleic acids include, for example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) It can be obtained by introducing mutations by mutation introduction methods (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Homologous nucleic acids can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention relates to a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention. Still another embodiment of the present invention provides at least about 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention or a base sequence complementary thereto. Nucleic acids having 99% and 99.9% identical base sequences are provided.
  • Still another embodiment of the present invention is a nucleic acid having a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a base sequence complementary to the base sequence homologous thereto.
  • the “stringent conditions” here are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Such stringent conditions are known to those skilled in the art, such as Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987) Can be set with reference to.
  • hybridization solution 50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denaturation
  • 5 ⁇ Denhardt solution 1% SDS
  • 10% dextran sulfate 10 ⁇ g / ml denaturation
  • incubation at about 42 ° C to about 50 ° C using salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), followed by washing at about 65 ° C to about 70 ° C using 0.1 x SSC, 0.1% SDS can be mentioned.
  • Further preferable stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml as a hybridization solution. Of denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)).
  • nucleic acid having a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a part of a base sequence complementary thereto.
  • a nucleic acid fragment can be used for detecting, identifying, and / or amplifying a nucleic acid having a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid fragment is, for example, a nucleotide portion continuous in the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention (eg, about 10 to about 100 bases in length, preferably about 20 to about 100 bases, more preferably about 30 to about 100). It is designed to include at least a portion that hybridizes (100 base length).
  • a nucleic acid fragment can be labeled.
  • fluorescent substances, enzymes, and radioisotopes can be used.
  • Still another aspect of the present invention relates to a recombinant DNA containing the gene of the present invention (gene encoding a modified enzyme).
  • the recombinant DNA of the present invention is provided, for example, in the form of a vector.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell.
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and in consideration of the type of host cell.
  • Examples of vectors using insect cells as hosts include pAc and pVL, and examples of vectors using mammalian cells as hosts include pCDM8 and pMT2PC.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence / absence (and extent) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press and New York, which can be referred to, are known methods using restriction enzymes and DNA ligases).
  • the host cell is preferably a microorganism such as Escherichia coli (Escherichia coli) or budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) from the viewpoint of ease of handling. Any host cell capable of expressing can be used.
  • E. coli include E. coli BL21 (DE3) pLysS when T7 promoter is used, and E. coli JM109 otherwise.
  • budding yeast include budding yeast SHY2, budding yeast AH22, or budding yeast INVSc1 (Invitrogen).
  • microorganism that is, a transformant
  • the microorganism of the present invention can be obtained by transfection or transformation using the vector of the present invention.
  • calcium chloride method Frnal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), Volume 53, pp. 159 (1970)
  • Hanahan Method Journal of Molecular Biology, Volume 166, 557) (1983)
  • SEM Gene, 96, 23 (1990)
  • Chung et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86) Vol., P.
  • microorganism of the present invention can be used for producing the modified enzyme of the present invention (see the column for the preparation of modified ⁇ -glucosidase described later).
  • the modified enzyme of the present invention is provided, for example, in the form of an enzyme agent.
  • the enzyme agent may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline and the like in addition to the active ingredient (modified enzyme of the present invention).
  • excipient starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • preservatives ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the modified enzyme.
  • a method for producing an oligosaccharide is provided.
  • the first aspect of the method for producing an oligosaccharide of the present invention in order to take advantage of the characteristics of the modified enzyme of the present invention, which is highly specific for ⁇ -1,4 bonds, two or more sugars having ⁇ -1,4 bonds are used. And the modified enzyme of the present invention is allowed to act on the substrate.
  • an enzyme having high specificity for ⁇ -1,4 binding such as modified enzymes W343M, W343M / S496T, C498L, C498S and the like shown in Examples described later, is used.
  • substrates are maltose, maltotriose, panose, pullulan, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, maltooctaose, dextrin, starch (potato starch, sweet potato starch, coast starch, wheat starch, Tapioca starch, etc.).
  • a mixture of two or more kinds of oligosaccharides or polysaccharides may be used as a substrate.
  • an oligosaccharide having few branched chains can be produced specifically and efficiently.
  • the reaction conditions may be the same as those usually employed for the production of oligosaccharides using ⁇ -glucosidase.
  • a modified enzyme exhibiting an ⁇ -1,6 bond-specific transglycosylation activity for example, S495G, S495P, S495V shown in Examples described later
  • substrates in this case are isomaltose, isomaltotriose, panose, isopanose, starch (potato starch, sweet potato starch, coast starch, wheat starch, tapioca starch, etc.).
  • substrates in this case are isomaltose, isomaltotriose, panose, isopanose, starch (potato starch, sweet potato starch, coast starch, wheat starch, tapioca starch, etc.).
  • oligosaccharides with many branched chains can be specifically and efficiently produced.
  • Wild-type enzyme may be used.
  • the wild-type enzyme is not particularly limited as long as it is suitable for the production of the target oligosaccharide.
  • a wild-type enzyme corresponding to the modified enzyme used that is, an enzyme that has been modified to obtain the modified enzyme
  • a modified enzyme having a different origin and a wild-type enzyme may be used in combination.
  • an enzyme obtained by modifying Aspergillus niger ⁇ -glucosidase (modified enzyme) and Aspergillus nidulans wild-type ⁇ -glucosidase B are used in combination.
  • a modified enzyme exhibiting ⁇ -1,6 bond-specific transglycosylation activity and a wild-type enzyme are used in combination, an oligosaccharide is obtained from a substrate having an ⁇ -1,4 bond. It became clear that it could be generated. Therefore, in a further aspect of the present invention, a modified enzyme that exhibits ⁇ -1,6 bond-specific transglycosylation activity for a substrate having an ⁇ -1,4 bond (for example, S495G shown in the Examples below, S495P, S495V) and wild type enzyme are allowed to act to obtain oligosaccharides.
  • the modified enzyme of the present invention can be expected to have an anti-aging effect on starch, an improvement in food flavor, an intestinal effect, and the like due to its sugar transfer activity. Therefore, examples of the use of the modified enzyme of the present invention include prevention of starch aging in food, improvement of food flavor, and intestinal regulation. Assuming application to these uses, the present invention provides, as a further aspect, a composition containing a modified enzyme (pharmaceutical composition, quasi-drug composition, cosmetic composition, food composition or bait composition). )I will provide a.
  • Preparation of the pharmaceutical composition and quasi-drug composition of the present invention can be performed according to a conventional method.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological Saline solution and the like.
  • excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used.
  • disintegrant starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • suspending agent glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • soothing agent benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • stabilizer propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • preservatives benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the dosage form in the case of formulating is also not particularly limited, and the pharmaceutical composition or pharmaceutical of the present invention can be used as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, injections, external preparations, suppositories, etc.
  • An quasi-drug composition can be provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an active ingredient (modified enzyme) in an amount necessary for obtaining an expected therapeutic effect or preventive effect (ie, a therapeutically effective amount).
  • the quasi-drug composition of the present invention contains an active ingredient in an amount necessary for obtaining the expected improvement effect, prevention effect and the like.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition or quasi-drug composition of the present invention generally varies depending on the dosage form and form, but the amount of the active ingredient is, for example, about 0.1% by weight to achieve a desired dose. Set within the range of about 95% by weight.
  • the pharmaceutical composition and quasi-drug composition of the present invention are oral or parenteral (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal injection, transdermal, nasal, transmucosal depending on the dosage form and form. , Application, etc.).
  • the “subject” here is not particularly limited, and includes humans and non-human mammals (including pet animals, domestic animals, laboratory animals. Specifically, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, monkeys, cows, pigs, goats. , Sheep, dogs, cats, chickens, quails, etc.).
  • the application subject is a human.
  • the dosage and usage of the pharmaceutical composition and quasi-drug composition of the present invention are set so as to obtain the expected effect.
  • the symptom, age, sex, weight, etc. of the subject of application are generally considered.
  • a person skilled in the art can set an appropriate dose in consideration of these matters.
  • the administration schedule for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days can be adopted.
  • the symptom of the application target, the duration of effect of the active ingredient, and the like can be considered.
  • the cosmetic composition of the present invention comprises a modified enzyme and components / bases usually used in cosmetics (for example, various oils and fats, mineral oil, petrolatum, squalane, lanolin, beeswax, denatured alcohol, dextrin palmitate, glycerin). Glycerin fatty acid ester, ethylene glycol, paraben, camphor, menthol, various vitamins, zinc oxide, titanium oxide, benzoic acid, edetic acid, chamomile oil, carrageenan, chitin powder, chitosan, fragrance, coloring agent, etc.) Obtainable.
  • the cosmetic composition include emulsions for face or body, lotions, creams, lotions, essences, oils, packs, sheets, and cleaning agents.
  • the addition amount of the modified enzyme in the cosmetic composition is not particularly limited.
  • the modified enzyme can be added so as to be 0.01 to 10% by weight.
  • examples of the “food composition” in the present invention include general foods (rice cooked rice, breads, grains, vegetables, meat, various processed foods, confectionery, milk, soft drinks, alcoholic beverages, etc.), nutritional supplements (Supplements, energy drinks, etc.) and food additives.
  • a dietary supplement or food additive it can be provided in the form of powder, granule powder, tablet, paste, liquid or the like.
  • Examples of the “food composition” of the present invention are pet food (food for dogs, cats, birds, fish, reptiles, amphibians, rodents, etc.) and feed (food for livestock, poultry, fish farming, etc.).
  • a further aspect of the present invention relates to a method for designing a modified enzyme.
  • the following steps (i) and (ii) are performed.
  • amino acid corresponding to amino acid 385 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) amino acid corresponding to 491 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (3) amino acid corresponding to 535 amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • amino acid corresponding to 535 amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Corresponding amino acid (4) Amino acid corresponding to the 450th amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5) Amino acid corresponding to the 534th amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (6) Amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Amino acid corresponding to amino acid position 537 (7) Amino acid corresponding to amino acid position 538 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (8) Amino acid corresponding to amino acid position 554 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (9) Amino acid corresponding to amino acid 556 of the
  • the substitution target amino acids (1) to (14) are amino acids identified as amino acids important for the properties of the enzyme. Therefore, it can be greatly expected that the substitution of these amino acids will change the properties of ⁇ -glucosidase. Properties that are particularly expected to change are transglycosylation activity and hydrolysis activity.
  • the design method of the present invention is particularly useful as a means for designing an enzyme in which the balance between these two activities is changed. For example, the design method of the present invention can be used for the purpose of reducing or eliminating the hydrolysis activity and increasing the transglycosylation activity.
  • the enzyme to be mutated in the design method of the present invention is ⁇ -glucosidase.
  • the enzyme to be mutated is typically a wild-type enzyme (an enzyme found in nature). However, this does not preclude the use of an enzyme that has already undergone some mutation or modification as the enzyme to be displaced.
  • enzymes to be mutated include human maltase-glucoamylase, ⁇ -glucosidase of Aspergillus niger, human neutral ⁇ -glucosidase C (Human Neutral alpha-glucosidase C), Mouse lysosomal ⁇ -glucosidase (Mouse Lysosomal alpha-glucosidase), yeast ⁇ -glucosidase (Yeast GLU2A), Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA), Aspergillus nidulans ⁇ -glucosidase B Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB), Mucor Yabanicus ⁇ -glucosidase (Mucor javanicus alpha-glucosidase), Aspergillus oryzae
  • amino acid sequences of these ⁇ -glucosidases are registered in public databases (SEQ ID NOs: 1 to 17).
  • an enzyme consisting of any one of these amino acid sequences is an enzyme to be mutated.
  • step (ii) is performed after step (i).
  • the type of amino acid after substitution is not particularly limited. Therefore, it may be a conservative amino acid substitution or a non-conservative amino acid substitution.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for preparing a modified enzyme.
  • a modified enzyme successfully obtained by the present inventors is prepared by a genetic engineering technique.
  • a nucleic acid encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 18 to 42 and 74 to 78 is prepared (step (I)).
  • the “nucleic acid encoding a specific amino acid sequence” is a nucleic acid from which a polypeptide having the amino acid sequence is obtained when it is expressed, not to mention a nucleic acid comprising a base sequence corresponding to the amino acid sequence.
  • nucleic acid encoding any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 18 to 42, 74 to 78 refers to standard genetic engineering techniques, molecular organisms with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. It can be prepared in an isolated state by using a scientific method, a biochemical method or the like.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 18 to 42 and 74 to 78 are all amino acid sequences of ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus niger.
  • a nucleic acid that encodes the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18-42 and 74-78 can be obtained by adding a necessary mutation to the gene (SEQ ID NO: 73) encoding Aspergillus niger-derived ⁇ -glucosidase. Gene).
  • a necessary mutation to the gene (SEQ ID NO: 73) encoding Aspergillus niger-derived ⁇ -glucosidase. Gene).
  • Many methods for position-specific base sequence substitution are known in the art (see, for example, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), and an appropriate method is selected from them. Can be used.
  • a position-specific mutation introducing method a position-specific amino acid saturation mutation method can be employed.
  • the position-specific amino acid saturation mutation method is a “Semi-rational, semi-random” technique in which amino acid saturation mutation is introduced by estimating the position where the desired function is involved based on the three-dimensional structure of the protein (J. Mol. Biol. 331, 585-592 (2003)).
  • position-specific amino acid saturation mutation using kits such as KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo), Quick change (Stratagene), Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res. 16,7351-7367 (1988)) can be introduced.
  • KOD-Plus-Mutagenesis Kit Toyobo
  • Quick change Stratagene
  • Overlap extention PCR Nucleic Acid Res. 16,7351-7367 (1988)
  • a DNA polymerase used for PCR Taq polymerase or the like can be used.
  • it is preferable to use a highly accurate DNA polymerase such as KOD-PLUS- (Toyobo), Pfu turbo (Stratagene).
  • a modified enzyme is prepared based on the amino acid sequence designed by the design method of the present invention.
  • a nucleic acid encoding an amino acid sequence constructed by the designing method of the present invention is prepared.
  • a necessary mutation that is, substitution of an amino acid at a specific position in a protein as an expression product
  • a nucleic acid (gene) encoding the modified enzyme is obtained.
  • step (II) the prepared nucleic acid is expressed (step (II)).
  • an expression vector into which the nucleic acid is inserted is prepared, and a host cell is transformed using the expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence / absence (and extent) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
  • the transformant is cultured under conditions where the modified enzyme, which is the expression product, is produced.
  • the transformant may be cultured according to a conventional method.
  • the carbon source used in the medium may be any assimitable carbon compound.
  • glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • the nitrogen source may be any nitrogen compound that can be used.
  • peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean cake alkaline extract, and the like are used.
  • phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary.
  • the culture temperature can be set within the range of 30 ° C to 40 ° C (preferably around 37 ° C).
  • the culture time can be set in consideration of the growth characteristics of the transformant to be cultured and the production characteristics of the modified enzyme.
  • the pH of the medium is adjusted so that the transformant grows and the enzyme is produced.
  • the pH of the medium is about 6.0 to 9.0 (preferably around pH 7.0).
  • the expression product (modified enzyme) is recovered (step (III)).
  • the culture solution containing the cultured microbial cells can be used as it is or after concentration, removal of impurities, etc., it can be used as an enzyme solution.
  • the expression product is once recovered from the culture solution or microbial cells. If the expression product is a secreted protein, it can be recovered from the culture solution, and if not, it can be recovered from the fungus body.
  • the culture supernatant is filtered and centrifuged to remove insolubles, followed by concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, methanol, ethanol, acetone, etc.
  • chromatographic methods such as fractional precipitation, dialysis, heat treatment, isoelectric point treatment, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography (eg, Sephadex gel (GE Healthcare Bioscience)) Separation using a combination of gel filtration, DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), Octyl Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), CM Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience) Purified to obtain a purified product of the modified enzyme It is possible.
  • DEAE Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
  • Octyl Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
  • CM Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
  • the microbial cells are collected by filtering, centrifuging, etc., and then the microbial cells are subjected to mechanical methods such as pressure treatment, ultrasonic treatment, or enzymatic methods such as lysozyme. After disruption by the method, a purified product of the modified enzyme can be obtained by separation and purification in the same manner as described above.
  • the purified enzyme obtained as described above by pulverizing it by, for example, freeze drying, vacuum drying or spray drying.
  • the purified enzyme may be dissolved in a phosphate buffer, triethanolamine buffer, Tris-HCl buffer or GOOD buffer in advance.
  • a phosphate buffer or a triethanolamine buffer can be used.
  • PIPES, MES, or MOPS is mentioned as a GOOD buffer here.
  • cell-free synthesis system (cell-free transcription system, cell-free transcription / translation system) refers to a ribosome derived from a live cell (or obtained by a genetic engineering technique), not a live cell. This refers to the in vitro synthesis of mRNA and protein encoded by a template nucleic acid (DNA or mRNA) using transcription / translation factors.
  • a cell extract obtained by purifying a cell disruption solution as needed is generally used.
  • Cell extracts generally contain ribosomes necessary for protein synthesis, various factors such as initiation factors, and various enzymes such as tRNA.
  • ribosomes necessary for protein synthesis
  • various factors such as initiation factors
  • various enzymes such as tRNA.
  • other substances necessary for protein synthesis such as various amino acids, energy sources such as ATP and GTP, and creatine phosphate are added to the cell extract.
  • a ribosome, various factors, and / or various enzymes prepared separately may be supplemented as necessary during protein synthesis.
  • cell-free transcription / translation system is used interchangeably with a cell-free protein synthesis system, in-vitro translation system or in-vitro transcription / translation system.
  • RNA is used as a template to synthesize proteins.
  • total RNA, mRNA, in vitro transcript and the like are used.
  • the other in vitro transcription / translation system uses DNA as a template.
  • the template DNA should contain a ribosome binding region and preferably contain an appropriate terminator sequence.
  • conditions to which factors necessary for each reaction are added are set so that the transcription reaction and the translation reaction proceed continuously.
  • TG transglucosidase
  • protein engineering was used to study one direction technology for hydrolysis reaction and dehydration condensation reaction.
  • TG is an enzyme used for oligosaccharide production and has an activity of hydrolyzing a glucoside bond, but also has a transglycosylation activity and produces oligosaccharide from maltose.
  • the research was advanced with the aim of developing a TG that performs sugar transfer more efficiently.
  • amino acid at point (amino acid at position 385: Y385, amino acid at position 491: V491, amino acid at position 535: N535) was selected. All are in the region in contact with the substrate and can be expected to be involved in the activity of the substrate (FIG. 1, A).
  • five types of ⁇ -glucosidase homologues were selected, and the sequences near the mutation introduction point were aligned and compared using CLUSTALW. Y385, V491, and N535 were all highly conserved due to the high homology of neighboring sequences, and thus could be expected to be an important region for enzyme function.
  • the amino acids corresponding to these mutagenesis points were identified by Asp. Niger TG (FIG. 1, C).
  • the amino acid corresponding to Y385 is W343, the amino acid corresponding to V491 is V452, and the amino acid corresponding to N535 is S496.
  • Primers for introducing mutations into these amino acids were designed, and mutations were introduced by inverse PCR using random primers. E. coli was transformed and sequence analysis was performed after miniprep to confirm the introduction of mutation.
  • Hydrolysis activity was measured using maltose which is an enzyme substrate. Adjust the substrate to a final concentration of 1% and color the glucose produced by hydrolysis with an aminoantipyrine / phenol coloring solution containing glucose oxidase (GO) and peroxidase (PO), and measure OD500. Quantified with A calibration curve (standard) was prepared from a glucose standard product, and the amount of produced glucose was calculated from the absorbance.
  • maltose which is an enzyme substrate. Adjust the substrate to a final concentration of 1% and color the glucose produced by hydrolysis with an aminoantipyrine / phenol coloring solution containing glucose oxidase (GO) and peroxidase (PO), and measure OD500.
  • Quantified with A calibration curve (standard) was prepared from a glucose standard product, and the amount of produced glucose was calculated from the absorbance.
  • oligosaccharide synthesis activity In order to examine the oligosaccharide synthesis activity, the oligosaccharide produced by HPLC was analyzed. The resulting oligosaccharide was determined using a 50% maltose aqueous solution as a substrate.
  • the number of oligosaccharides produced by each was estimated by graphing the area area of HPLC. An outline of the above screening method is shown in FIG.
  • oligosaccharide synthesis activity was measured using a high-concentration maltose solution as a substrate.
  • the resulting typical HPLC pattern is shown in FIG.
  • the peak of maltose of the substrate decreased, and peaks of glucose, isomaltose, panose, and isomalt triose were observed (FIG. 3, A).
  • two peaks were observed in the tetrasaccharide area (FIG. 3, A).
  • the substrate maltose peak decreased and glucose, maltotriose, and panose peaks were observed (FIG. 3, B to D). Furthermore, a solid peak was observed in the tetrasaccharide area (FIG. 3, B to D). Unlike WT, oligosaccharides produced by structurally modified TGs were greatly reduced in the amount of isomalt-type oligosaccharides produced.
  • the graph of FIG. 4 shows the total area area of 3 sugars or more. Even in WT, oligosaccharides of 3 or more sugars are generated, but in any structurally modified TG, the area area of the generated oligosaccharides is larger than that of WT (approximately 20% increase).
  • amino acid W343C cysteine
  • W343D aspartic acid
  • W343M methionine
  • W343H histidine
  • W343A alanine
  • W343F phenylalanine
  • W343G glycine
  • W343T threonine
  • the amount of oligosaccharides of three or more sugars produced by the structurally modified TG increased compared to WT (FIG. 5, Up).
  • the substituted amino acids are methionine (W343M), aspartic acid (W343D), cysteine (W343C), phenylalanine (W343F), glutamine (W343Q), histidine (W343H).
  • the structurally modified TG was superior to WT in its ability to synthesize (Fig. 5, bottom).
  • W343M, W343D, W343C, W343F, W343Q, and W343H which have significantly higher amounts of tetrasaccharide or higher oligosaccharide synthesis than WT, can be said to be advantageous for the synthesis of longer-chain oligosaccharides.
  • W343D / V452G (343 position W is replaced by D and 452 position V is replaced by G)
  • W343M / S496C (343 position W is replaced by M and 496 position S is replaced by C)
  • W343M / S496T position 343
  • oligosaccharide synthesis was performed using a mixed solution of maltose and isomaltose as a start substrate.
  • the proportion of oligosaccharides produced did not change significantly, but a difference appeared in the type of trisaccharide produced.
  • In the WT type a large amount of isomaltotriose having two ⁇ -1,6 bonds was produced (FIG. 13).
  • structurally modified TGs (W343M and W343M / S496T) produced the most panoses with ⁇ -1,4 bonds and ⁇ -1,6 bonds (FIG. 13, arrows).
  • the starting substrate isomaltose was hardly decomposed.
  • the structurally modified TG is oligosaccharide with sugar transfer to the ⁇ -1,4 position. It was suggested to produce specifically.
  • Sequence number 18 W343C Sequence number 19: W343D Sequence number 20: W343M Sequence number 21: W343H Sequence number 22: W343A Sequence number 23: W343F Sequence number 24: W343G Sequence number 25: W343T Sequence number 26: W343E Sequence number 27: W343V Sequence number 28: W343Q Sequence number 29: W343N Sequence number 30: W343I Sequence number 31: V452G Sequence number 32: V452D Sequence number 33: V452E Sequence number 34: S496V Sequence number 35: S496N Sequence number 36: S496Q Sequence number 37: W343D / V452A Sequence number 38: W343D / V452G Sequence number 39: W343D / S496I Sequence number 40: W343D / S496R Sequence number 41:
  • the amino acid sequences of Aspergillus niger TG and Aspergillus nidulans TG were obtained from a known information database, read into MOE, and subjected to protein modeling on a computer. Based on each amino acid sequence, a highly homologous sequence was searched from the MOE database. As a result, the same sequence was hit in both cases, and human TG was selected. Next, each protein was modeled using this three-dimensional structure as a template. The force field was “AMBER99”, and five intermediate models were created, and finally one model structure was created.
  • Fig. 14 shows the three-dimensional structures successfully modeled. Comparing the structure of Aspergillus niger TG and Aspergillus nidulans TG, although they were modeled based on the same three-dimensional structure of human TG, there was a big difference in each three-dimensional structure. Comparing the simulated substrate pocket, the substrate pocket of Aspergillus nidulans was smaller than that of Aspergillus niger. In Aspergillus niger, the substrate pocket was composed of 30 amino acids, whereas in Aspergillus nidulans, it was composed of 22 amino acids (FIG. 14).
  • amino acid sequence of Aspergillus niger TG and the amino acid sequence of Aspergillus nidulans TG were aligned by CLASTAL-W. Comparing the entire amino acid sequence, the homology of the two proteins was low, and the percentage of amino acid matches was calculated to be 35%. However, when compared only to the sequence of the substrate pocket, the sequence homology is high, with 19 of 30 amino acid matches in the substrate pocket of Aspergillus niger and 19 of 22 in Aspergillus nidulans. Of amino acids matched (FIG. 15). This result suggests that the amino acids involved in the activity are more highly conserved than the entire sequence.
  • primers were designed to introduce mutations into Aspergillus niger TG, and mutations were introduced by the inverse PCR method using random primers. After transformation into E. coli and mini-prep, sequence analysis was performed to confirm the introduction of mutation. Furthermore, it transformed into yeast, expressed recombinant structurally modified TG, and analyzed. The analysis results for two points, S495 and C498, are shown.
  • modified TGs were compared by measuring the oligosaccharide synthesis activity using HPLC.
  • substrates a 50% maltose aqueous solution, an isomaltose aqueous solution, and a maltopentaose aqueous solution that is a pentasaccharide oligosaccharide were used.
  • the reaction was performed at a reaction temperature of 50 ° C. for a predetermined time (48 hours for maltose and maltopentaose, 96 hours for isomaltose).
  • the oligosaccharide synthesis activity of the modified TG was compared by quantifying the area area of HPLC.
  • the total area area of 3 or more sugars and 4 or more sugars was larger in S495G than WT, but decreased in S495P and S495T (FIG. 16).
  • the structurally modified TG was considered to have different reactivity for glucoside bonds, and the hydrolysis activity for various glucoside bonds was examined (FIG. 18). Hydrolysis activity was evaluated by quantifying the amount of glucose produced using maltose aqueous solution and isomaltose aqueous solution as substrates. WT shows that both ⁇ -1,4 and ⁇ -1,6 bonds have substrate affinity for glucoside bonds.
  • the hydrolytic activity of maltose was lower than that of WT, but the hydrolytic activity of isomaltose was relatively increased.
  • the structural modification TG substituted with S495 had improved specificity for the ⁇ -1,6 bond.
  • oligosaccharide synthesis reaction was carried out using an initial substrate of pentasaccharide maltopentaose, and the resulting oligosaccharides were compared between WT TG and structurally modified TG (FIG. 19).
  • WT TG decomposition and production occurred widely from glucose to more than 6 sugars.
  • the amount of monosaccharide was the largest, and hydrolysis proceeded during the reaction.
  • structurally modified TGs an increase in oligosaccharide was observed.
  • structurally modified TGs of S495P type and S495V type had less hydrolyzed saccharides, and more than 6 sugars were produced (FIG. 19c).
  • TGs were compared by measuring oligosaccharide synthesis activity using HPLC.
  • a 60% maltose aqueous solution was used as the substance, and the mixture was incubated at a reaction temperature of 50 ° C. for 48 hours.
  • the oligosaccharide synthesis activity of the structurally modified TG was compared by quantifying the area area of HPLC (FIG. 20). When the total area area of 3 sugars or more was compared, the area area of C498L and C498S was larger than that of WT. Similarly, the total area area of tetrasaccharides or more was increased in C498L and C498S compared to WT.
  • SEQ ID NO: 74 S495G Sequence number 75: S495P Sequence number 76: S495V SEQ ID NO: 77: C498L SEQ ID NO: 78: C498S
  • TG was set to 20 ⁇ g / mL based on the results of preliminary studies. Details of the experimental protocol are shown below.
  • (Protocol) (i) Okayu (Ajinomoto Co., Inc.) is crushed with a mixer and 1/20 volume of 1M NaOAc buffer (pH 5.0) is added. (ii) Prepare 340 ⁇ l of enzyme solution (protein concentration: 20 ⁇ g / mL). (iii) Into a glass test tube, add 0.65 g of porridge (i), 1.45 U of amylase and 340 ⁇ l of enzyme solution. (iv) Incubate in a 37 ° C. water bath and sample 200 ⁇ l into a microtest tube every 30 minutes.
  • FIG. 22 (a) The result of analyzing the generated oligosaccharide by HPLC is shown in FIG.
  • amylase 40-50% of the total sugar becomes maltose (FIG. 22 (a)).
  • trisaccharide maltotriose and tetrasaccharide maltotetraose are produced.
  • Glucose is hardly produced, and decomposition does not proceed from disaccharides.
  • WT wild-type
  • WT type TG with enzyme activity that converts maltose to isomaltose is thought to be able to proceed with oligosaccharide synthesis reaction even when maltose is used as a substrate if used in combination with an enzyme that supplies isomaltose.
  • Oligosaccharide synthesis was performed using TG and STG (S495P). The resulting oligosaccharide was analyzed by HPLC. The reaction was carried out at 50 ° C. for 48 hours using a 50% maltose aqueous solution as a substrate.
  • Oligosaccharide synthesis was performed for S495P alone and when WT type and S495P were mixed (mixing ratio 2: 1, 1: 1, or 1: 2), and the generated oligosaccharide was analyzed by HPLC.
  • WT type and S495P were mixed (mixing ratio 2: 1, 1: 1, or 1: 2)
  • the generated oligosaccharide was analyzed by HPLC.
  • panose which is a trisaccharide
  • the production of oligosaccharides having 4 or more sugars is very small. That is, the reaction of 4 or more sugars does not proceed (S495P in FIG. 24, S495P in FIG. 25).
  • the modified ⁇ -glucosidase of the present invention has high transglycosylation activity. Utilizing this characteristic, it is expected to be used for the production (synthesis) of oligosaccharides.
  • the design method of the present invention is useful as a means for enhancing transglycosylation activity of wild-type enzymes and the like, and can be used for modifying various ⁇ -glucosidases.

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Abstract

糖転移活性が優位なα－グルコシダーゼ及びその用途などを提供することを課題とする。α－グルコシダーゼのアミノ酸配列において、以下の群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型α－グルコシダーゼ：配列番号１に示すアミノ酸配列の385位、491 位、535 位、450 位、534 位、537 位、538 位、554 位、556 位、630位、683 位若しくは689 位のアミノ酸に相当するアミノ酸、又は、配列番号２に示すアミノ酸配列の579 位若しくは585 位アミノ酸に相当するアミノ酸。

Description

改変型α－グルコシダーゼ及びその用途
　本発明は改変型α－グルコシダーゼに関する。詳しくは、改変型α－グルコシダーゼ、改変型α－グルコシダーゼの設計法及び調製法、並びに改変型α－グルコシダーゼの用途に関する。本出願は、２０１１年３月１６日に出願された日本国特許出願第２０１１－０５７３８６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　糖加水分解酵素はエステル結合を切断して分解する酵素であるが、同時に糖転移活性を持つものも多く報告されている。糖加水分解酵素の代表ともいえるα－グルコシダーゼも一般に加水分解活性（加水分解反応）と糖転移活性（縮合反応）を併せもつ。α－グルコシダーゼは微生物から高等動物及び高等植物まで広く天然界に存在する。α－グルコシダーゼは産業上も有用な酵素であり、糖の分解や合成などに利用されている。
　技術の進歩によって酵素の特性を変化（改良）することが可能になってきた。α－グルコシダーゼについても、様々な改変の試みがなされている（例えば特許文献１～３を参照）。
特開２００３－８８３６５号公報 特開２００５－２５３３０２号公報 特開２００９－２２２０４号公報 特開２００１－０４６０９６号公報
　α－グルコシダーゼを産業用途で使用する場合、通常は加水分解活性又は糖転移活性のいずれか一方を使用するため、使用しない方の活性は低いことが好ましい。α－グルコシダーゼをオリゴ糖の製造に使用する場合には、加水分解活性が妨げとなり、オリゴ糖の生成効率が低下する。そこで本発明は、オリゴ糖の製造に適する、糖転移活性が優位なα－グルコシダーゼを提供することを課題とする。また、その用途などを提供することも課題とする。
　本発明者らは、オリゴ糖生成能が向上した新規酵素を設計することを目的として、既存のα－グルコシダーゼを分子レベルで構造改変することを試みた。具体的には、ヒト小腸由来α－グルコシダーゼ（ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ）のX線結晶構造解析結果を利用し、コンピュータシュミレーション及び４種類のホモログとのアライメント比較を行った。その結果、酵素の基質ポケットを構成する３箇所のアミノ酸が同定された。次に、当該アミノ酸に相当するアミノ酸を、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼのアミノ酸配列上で特定した上で、それらに変異を導入した。得られた改変体の特性を調べた結果、酵素の特性（特に加水分解活性と糖転移活性のバランス）が大幅に変化していることが確認された。改変体の中にはα-1,4結合及びα-1,6結合に対する加水分解活性を示さないものや、α-1,6結合に対する加水分解活性が顕著に低下するもの、α-1,3結合とα-1,6結合に対する加水分解活性が大幅に低下するもの等を認めた。特に注目すべきことは、野生型は主にα-1,6位に糖転移したオリゴ糖を生成するのに対し、改変体（W343M型及びW343M/S496T型）は、α-1,4位に糖転移したオリゴ糖のみを生成した。これらの事実は、オリゴ糖の製造等に適するα－グルコシダーゼ（即ち、糖転移活性が優位なα－グルコシダーゼ）を取得する目的で構造改変をする際には、変異を加える位置として、同定に成功した上記アミノ酸位置が有効であることを意味する。また、当該アミノ酸位置は、α-1,4位特異的な糖転移活性を示すという、ユニークな特性のα－グルコシダーゼを取得するための変異位置として特に有効であるといえる。一方、取得に成功した改変型α－グルコシダーゼはそれ自体が産業上の大きな価値を有する。
　本発明者らは更に研究を進め、新しい手法で変異導入点を検討することにした。具体的には、まず、別のコンピューターシミュレーションソフトを使用し、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼとアスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼについて立体構造モデルを構築した。続いてドッキングシミュレーション解析を行い、基質ポケットの予測を行った。そして、予測結果に基づき、活性中心となるアミノ酸を検索し、各立体構造モデル上での位置を特定した。次に、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼとアスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼの間でアミノ酸配列を比較し、基質ポケットを構成するアミノ酸の中で一致しないアミノ酸を、変位導入に適したアミノ酸として特定した。続いて、これらのアミノ酸が変位導入に適したものであるか否か（換言すれば、構造改変に有益なものであるか否か）を確認するために、二つのアミノ酸について実際に変異を導入して改変体を得た。得られた各改変体の特性を調べた結果、α1,6位特異的な転移活性を示す改変体や、α1,4位特異的な転移活性を示す改変体を認めた。この事実は、特定に成功したアミノ酸位置が構造改変に有効であることを裏付ける。一方で、取得に成功した改変型α－グルコシダーゼはそれ自体が産業上の大きな価値を有する。
　一方、更なる検討の結果、取得に成功した改変体がオリゴ糖の生成ないし製造に有用であることが確認された。注目すべきことに、α1,6位特異的な転移活性を示す改変体については、野生型α－グルコシダーゼと併用することによって、α1,4結合を有する基質からもオリゴ糖を生成することが可能であった。
　ところで、効果的な二つのアミノ酸置換を組み合わせることによって相加的又は相乗的効果が生まれる可能性が高いことは多く経験するところである。従って、特定に成功した3箇所の変異位置は単独に限らず、その組合せについても特性の変化（特に糖転移活性の向上）に有効といえる。実際、2箇所のアミノ酸置換を組み合わせた場合にも糖転移活性が向上した（後述の実施例）。
　また、同種の酵素については構造（一次構造、立体構造）の類似性が高く、同様の変異が同様の効果を生む蓋然性が高いという技術常識に鑑みれば、後述の実施例に示したアスペルギルス・ニガー由来のα－グルコシダーゼに限らず、他の生物由来のα－グルコシダーゼについても、本発明者らが見出した変異手法を適用可能といえる。
　以下に示す本発明は、上記の成果及び考察に基づく。
　［１］α－グルコシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型α－グルコシダーゼ：
　(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の385位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の491位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の450位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の534位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の538位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の554位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の556位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(10)配列番号２に示すアミノ酸配列の579位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(11)配列番号２に示すアミノ酸配列の585位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の630位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の683位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　(14)配列番号１に示すアミノ酸配列の689位アミノ酸に相当するアミノ酸。
　［２］α－グルコシダーゼが、ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase）、ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）、マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）、酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）、ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）、アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）、Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）、シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）、デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）、大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）、シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）、ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）、砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）又はジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）ある、［１］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［３］α－グルコシダーゼのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列であり、
　(1)のアミノ酸が該アミノ酸配列の343位アミノ酸、(2)のアミノ酸が該アミノ酸配列の452位アミノ酸、(3)のアミノ酸が該アミノ酸配列の496位アミノ酸、(4)のアミノ酸が該アミノ酸配列の410位アミノ酸、(5)のアミノ酸が該アミノ酸配列の495位アミノ酸、(6)のアミノ酸が該アミノ酸配列の498位アミノ酸、(7)のアミノ酸が該アミノ酸配列の499位アミノ酸、(8)のアミノ酸が該アミノ酸配列の531位アミノ酸、(9)のアミノ酸が該アミノ酸配列の533位アミノ酸、(12)のアミノ酸が該アミノ酸配列の662位アミノ酸、(13)のアミノ酸が該アミノ酸配列の715位アミノ酸、(14)のアミノ酸が該アミノ酸配列の721位アミノ酸となる、［１］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［４］置換されるアミノ酸が(1)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、スレオニン、グルタミン酸、バリン、グルタミン、アスパラギン又はイソロイシンである、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［５］置換されるアミノ酸が(2)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がグリシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［６］置換されるアミノ酸が(3)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン又はバリンである、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［７］置換されるアミノ酸が(1)のアミノ酸及び(2)のアミノ酸であり、
　置換後のアミノ酸が、(1)のアミノ酸についてはアスパラギン酸であり、(2)のアミノ酸についてはアラニン又はグリシンである、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［８］置換されるアミノ酸が(1)のアミノ酸及び(3)のアミノ酸であり、
　置換後のアミノ酸が、(1)のアミノ酸についてはアスパラギン酸又はメチオニンであり、(3)のアミノ酸についてはイソロイシン、アルギニン、システイン又はスレオニンである、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［９］置換されるアミノ酸が(5)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がグリシン、プロリン又はバリンである、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［１０］置換されるアミノ酸が(6)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がロイシン又はセリンである、［３］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［１１］配列番号１８～４２及び７７～７８のいずれかのアミノ酸配列からなる、［１］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［１２］配列番号７４～７６のいずれかのアミノ酸配列からなる、［１］に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
　［１３］［１］～［１２］のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼをコードする遺伝子。
　［１４］配列番号４３～６７及び７９～８３のいずれかの塩基配列を含む、［１３］に記載の遺伝子。
　［１５］［１３］又は［１４］に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
　［１６］［１５］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
　［１７］［１］～［１２］のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼを含む酵素剤。
　［１８］α-1,4結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖に対して、［１］～［８］、［１０］及び［１１］のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼを作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
　［１９］α-1,6結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖に対して、［９］又は［１２］に記載の改変型α－グルコシダーゼを作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
　［２０］野生型酵素を併用することを特徴とする、［１８］又は［１９］に記載のオリゴ糖の製造方法。
　［２１］α-1,4結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖に対して、［９］又は［１２］に記載の改変型α－グルコシダーゼと野生型酵素を作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
　［２２］［１］～［１２］のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼ又は［１７］に記載の酵素剤を含有する医薬組成物、医薬部外品組成物、化粧料組成物、食品組成物又は餌組成物。
　［２３］以下のステップ(i)及び(ii)を含む、改変型α－グルコシダーゼの設計法：
　(i)変異対象酵素であるα－グルコシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定するステップ：
　　(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の385位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の491位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の450位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の534位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の538位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の554位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の556位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(10)配列番号２に示すアミノ酸配列の579位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(11)配列番号２に示すアミノ酸配列の585位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の630位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の683位アミノ酸に相当するアミノ酸；
　　(14)配列番号１に示すアミノ酸配列の689位アミノ酸に相当するアミノ酸：
　(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
　［２４］α－グルコシダーゼが、ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase）、ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）、マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）、酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）、ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）、アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）、Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）、シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）、デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）、大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）、シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）、ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）、砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）又はジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）である、［２３］に記載の設計法。
　［２５］α－グルコシダーゼが、配列番号１～１７のいずれかのアミノ酸配列を含む、［２３］に記載の設計法。
　［２６］α－グルコシダーゼが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(1)～(14)の中から選択される一つのアミノ酸、(1)～(14)の中から選択される二つのアミノ酸又は(1)～(14)の中から選択される三つのアミノ酸である、［２３］に記載の設計法。
　［２７］以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型α－グルコシダーゼの調製法：
　(I)配列番号１８～４２及び７４～７８のいずれかのアミノ酸配列、又は［２３］～［２６］のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
　(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
　(III)発現産物を回収するステップ。
　［２８］α1,4位特異的又はα1,6位特異的な転移活性を有するα－グルコシダーゼ。
ヒトα－グルコシダーゼにおける変異導入点の位置（A)、アライメント比較（B)、アスペルギルス・ニガーのアミノ酸配列における、変異導入点に対応するアミノ酸位置（C）。 酵母を用いた構造改変TG（トランスグルコシダーゼ）スクリーニング系の概要。 HPLCによるオリゴ糖合成活性の比較。WT（野生型）（A)と構造改変TG（W343M（B）、V452G（C）、S496V（D））のオリゴ糖合成活性を比較した。 3糖以上のオリゴ糖の合成量の比較。 3糖以上のオリゴ糖の合成量の比較（上）及び4糖以上のオリゴ糖の合成量の比較（下）。置換後のアミノ酸（グラフの下に表示）が異なる構造改変TGの間で、生成するオリゴ糖の量を比較した。 3糖以上のオリゴ糖の合成量の比較（左）及び4糖以上のオリゴ糖の合成量の比較（右）。置換後のアミノ酸（グラフの下に表示）が異なる構造改変TGの間で、生成するオリゴ糖の量を比較した。 加水分解活性に関する基質特異性の比較。 2アミノ酸置換による構造改変TGの加水分解活性。 2アミノ酸置換による構造改変TGのオリゴ糖合成活性。WT（野生型）（A)と構造改変TG（W343M（B）、W343M/S496T（C）、W343D/V452G（D））のオリゴ糖合成活性を比較した。 3糖以上のオリゴ糖の合成量の比較（左）及び4糖以上のオリゴ糖の合成量の比較（右）。置換後のアミノ酸（グラフの下に表示）が異なる構造改変TGの間で、生成するオリゴ糖の量を比較した。 2アミノ酸置換による構造改変TGの基質特異性。 スタート基質をマルトペンタオースとしたときに生成するオリゴ糖の比較。 スタート基質をマルトースとイソマルトースの混合物にしたときに生成するオリゴ糖の比較。 コンピューターシミュレーションしたα－グルコシダーゼの立体構造モデル。左：アスペルギルス・ニガーのTG、右：アスペルギルス・ニドランスのTG。 コンピューターシミュレーションに基づく変異導入点の検討スキーム。 構造改変TG（S495X)のオリゴ糖合成活性の比較。基質にはマルトースを使用した。3糖以上のオリゴ糖の合成量（上）と4糖以上のオリゴ糖の合成量（下）を比較した。 構造改変TG（S495X)のオリゴ糖合成活性の比較。基質にはイソマルトースを使用した。3糖以上のオリゴ糖の合成量（上）と4糖以上のオリゴ糖の合成量（下）を比較した。 構造改変TG（S495X)の加水分解活性。 構造改変TGのオリゴ糖合成活性の比較。基質にはマルトペンタオースを使用した。(a)WT（野生型）のHPLCチャート。(b)構造改変TG（S495V）のHPLCチャート。(c)生成したオリゴ糖の比率。 構造改変TG（C498X)のオリゴ糖合成活性の比較。基質にはマルトースを使用した。 構造改変TG（C498X)の加水分解活性。 オリゴ糖合成能の比較。(a)TGを添加しない場合、(b)WT（野生型）のTGを添加した場合、(c)構造改変TG（W343M）を添加した場合、(d)３糖以上のエリア面積の比較。 おかゆから生成したオリゴ糖のHPLCチャート（反応開始90分後）。 オリゴ糖合成活性の比較。構造改変TG（S495P)単独の場合とWT型を併用した場合について、3糖以上のオリゴ糖の合成量（上）と4糖以上のオリゴ糖の合成量（下）を比較した。基質にはマルトースを使用した。 マルトース（基質）から生成したオリゴ糖のHPLCチャート（反応開始48時間後）。 オリゴ糖合成能の比較。(a)WT（野生型）のTGを添加した場合、(b)構造改変TG（S495P）を添加した場合、(c)WT（野生型）と構造改変TG（S495P）を併用した場合、(d)３糖以上のエリア面積の比較。 おかゆから生成したオリゴ糖のHPLCチャート（反応開始90分後）。
　説明の便宜上、本発明に関して使用する用語の一部について以下で定義する。
（用語）
　α－グルコシダーゼはトランスグルコシダーゼとも呼ばれる。本明細書では用語「α－グルコシダーゼ」と用語「トランスグルコシダーゼ」を交換可能に使用する。用語「改変型α－グルコシダーゼ」とは、本明細書が開示する手法によって、「基になるα－グルコシダーゼ」を改変ないし変異して得られる酵素である。本明細書において用語「改変型α－グルコシダーゼ」、用語「構造改変α－グルコシダーゼ」、用語「改変型酵素」及び用語「構造改変酵素」は交換可能に用いられる。基になるα－グルコシダーゼは典型的には野生型α－グルコシダーゼである。但し、既に人為的操作が施されているα－グルコシダーゼを「基になるα－グルコシダーゼ」として本発明に適用することを妨げるものではない。「基になるα－グルコシダーゼ」のことを本明細書では「変異対象α－グルコシダーゼ」又は「変異対象酵素」とも呼ぶ。本明細書では、変異導入点のアミノ酸を、アミノ酸の種類を表す１文字とアミノ酸の位置を表す数字との組合せで表現する。例えば、343位のトリプトファンが変異導入点であれば「W343」と表現される。
（改変型α－グルコシダーゼ）
　本発明の第１の局面は改変型α－グルコシダーゼ（改変型酵素）に関する。本発明の改変型酵素は、変異対象酵素のアミノ酸配列において、以下の(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
　(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の385位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の491位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の450位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の534位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の538位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の554位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の556位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(10)配列番号２に示すアミノ酸配列の579位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(11)配列番号２に示すアミノ酸配列の585位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の630位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の683位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(14)配列番号１に示すアミノ酸配列の689位アミノ酸に相当するアミノ酸
　後述の実施例に示す通り、上記385位アミノ酸、491位アミノ酸及び535位アミノ酸は、ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（配列番号１）の立体構造解析及び機能予測、更にはホモログとのアライメント比較などの手法を駆使した結果、酵素の機能に重要であると予測されたアミノ酸である。本発明の一態様では、これらのアミノ酸に相当するアミノ酸を変異させることによって酵素の構造を改変し、α－グルコシダーゼの特性を変化させる。ここでの「特性」は糖転移活性及び加水分解活性である。本発明の改変型酵素では、糖転移活性と加水分解活性のバランスが、改変前を基準として、糖転移活性が優位になる方向にシフトしている。典型的には、改変の結果として、糖転移活性の向上又は加水分解活性の低下或いはこれらの両者が生じ、効率的な糖転移が可能な酵素となっている。
　一方、上記(4)～(14)に示したアミノ酸は、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼとアスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼの立体構造の比較やアミノ酸配列の比較などを駆使した結果、構造改変に有効であると予測されたアミノ酸である。本発明の他の一態様では、これらのアミノ酸に相当するアミノ酸を変異させることによって酵素の構造を改変し、α－グルコシダーゼの特性を変化させる。
　ここで、本明細書においてアミノ酸残基について使用する場合の用語「相当する」とは、比較されるタンパク質（酵素）間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味する。例えば、基準のアミノ酸配列（即ち配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列）に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造（アミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに（このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて立体構造（三次元構造）同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数の酵素の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。変異対象酵素の立体構造情報は例えばProtein Data Bank（http://www.pdbj.org/index_j.html）より取得することができる。
　Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定方法の一例を以下に示す。
（１）タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
（２）作製した結晶にＸ線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はＸ線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に－173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
（３）結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなＸ線散乱能のＸ線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を０に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社（アメリカ）のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
　本発明における変異対象酵素の例はヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase）、ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）、マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）、酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）、ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）、アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）、Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）、シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）、デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）、大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）、シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）、ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）、砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）、ジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）である。公共のデータベースに登録されている、これらのα－グルコシダーゼのアミノ酸配列を以下に示す。
　ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）：配列番号１
　アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase：配列番号２
　ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）：配列番号３
　マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）：配列番号４
　酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）：配列番号５
　アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）：配列番号６
　アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）：配列番号７
　ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）：配列番号８
　アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）：配列番号９
　Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）：配列番号１０
　シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）：配列番号１１
　デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）：配列番号１２
　大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）：配列番号１３
　シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）：配列番号１４
　ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）：配列番号１５
　砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）：配列番号１６
　ジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）：配列番号１７
　ここで、配列番号２のアミノ酸配列を有するアスペルギルス・ニガー由来α－グルコシダーゼを変異対象酵素としたとき、上記(1)のアミノ酸は配列番号２の343位アミノ酸となり、上記(2)のアミノ酸は配列番号２の452位アミノ酸となり、上記(3)のアミノ酸は配列番号２の496位アミノ酸となり、上記（4)のアミノ酸は配列番号２の410位アミノ酸となり、上記(5)のアミノ酸は配列番号２の495位アミノ酸となり、上記(6)のアミノ酸は配列番号２の498位アミノ酸となり、上記(7)のアミノ酸は配列番号２の499位アミノ酸となり、上記(8)のアミノ酸は配列番号２の531位アミノ酸となり、上記(9)のアミノ酸は配列番号２の533位アミノ酸となり、上記(10)のアミノ酸は配列番号２の579位アミノ酸となり、上記(11)のアミノ酸は配列番号２の585位アミノ酸となり、上記(12)のアミノ酸は配列番号２の662位アミノ酸となり、上記(13)のアミノ酸は配列番号２の715位アミノ酸となり、上記(14)のアミノ酸は配列番号２の721位アミノ酸となる。
　置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない。従って、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は典型的には同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　配列番号２のアミノ酸配列を有するアスペルギルス・ニガー由来α－グルコシダーゼを変異対象酵素としたときの置換後のアミノ酸の例を挙げると、(1)のアミノ酸についてはシステイン、アスパラギン酸、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、スレオニン、グルタミン酸、バリン、グルタミン、アスパラギン又はイソロイシンであり、(2)のアミノ酸についてはグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンであり、(3)のアミノ酸についてはバリン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、アルギニン、システイン又はスレオニンであり、（5)のアミノ酸についてはグリシン、プロリン又はバリンであり、(6)のアミノ酸についてはロイシン又はセリンである。
　上記(1)～(14)のアミノ酸の内、二つ以上のアミノ酸が置換されていてもよい。置換されるアミノ酸の組合せとして、(1)と(2)の組合せ及び(1)と(3)の組合せを例示することができる。これらの組合せは、後述の実施例で取得した構造改変酵素に相当する。
　ここで、改変型酵素のアミノ酸配列の例を配列番号１８～４２、７４～７８に示す。これらの配列はアスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼに対して1アミノ酸置換（(1)～(3)、(5)及び(6)のいずれかのアミノ酸に対して）、２アミノ酸置換（(1)と(2)のアミノ酸に対して、(1)と(3)のアミノ酸に対して、又は(2)と(3)のアミノ酸に対して）、又は３アミノ酸置換（(1)と(2)と(3)のアミノ酸に対して）を施すことによって得られる改変型酵素のアミノ酸配列である。配列番号とアミノ酸置換の対応関係は次の通りである。尚、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）において343位のトリプトファン（W343）が(1)のアミノ酸に相当し、同452位のバリン（V452）が(2)のアミノ酸に相当し、同496位のセリン（S496）が(3)のアミノ酸に相当し、同410位のイソロイシン（I410)が(4)のアミノ酸に相当し、同499位のバリン（V499)が(7)のアミノ酸に相当し、同531位のグルタミン酸(E531)が(8)のアミノ酸に相当し、同533位のフェニルアラニン（F533)が(9)のアミノ酸に相当し、同579位のヒスチジン（H579)が(10)のアミノ酸に相当し、同585位のアスパラギン（N585)が(11)のアミノ酸に相当し、同662位のチロシン（Y662)が(12)のアミノ酸に相当し、同715位のチロシン（Y715)が(13)のアミノ酸に相当し、同721位のロイシン（L721)が(14)のアミノ酸に相当しする。また、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼBのアミノ酸配列（配列番号７）において296位のチロシン(Y296)が(1)のアミノ酸に相当し、456位のアスパラギン(N456)が(3)のアミノ酸に相当し、363位のメチオニン(M363)が(4)のアミノ酸に相当し、455位のアラニン(A455)が(5)のアミノ酸に相当し、458位のチロシン(Y458)が(6)のアミノ酸に相当し、459位のアスパラギン(N459)が(7)のアミノ酸に相当し、488位のアスパラギン酸(D488)が(8)のアミノ酸に相当し、490位のロイシン(L490)が(9)のアミノ酸に相当し、565位のアルギニン(R565)が(10)のアミノ酸に相当し、571位のグルタミン(Q571)が(11)のアミノ酸に相当し、646位のイソロイシン(I646)が(12)のアミノ酸に相当し、700位のフェニルアラニン(F700)が(13)のアミノ酸に相当し、706位のイソロイシン(I706)が(14)のアミノ酸に相当する。
　　アミノ酸配列　：　アミノ酸置換
A.　配列番号１８　：　W343C
B.　配列番号１９　：　W343D
C.　配列番号２０　：　W343M
D.　配列番号２１　：　W343H
E.　配列番号２２　：　W343A
F.　配列番号２３　：　W343F
G.　配列番号２４　：　W343G
H.　配列番号２５　：　W343T
I.　配列番号２６　：　W343E
J.　配列番号２７　：　W343V
K.　配列番号２８　：　W343Q
L.　配列番号２９　：　W343N
M.　配列番号３０　：　W343I
N.　配列番号３１　：　V452G
O.　配列番号３２　：　V452D
P.　配列番号３３　：　V452E
Q.　配列番号３４　：　S496V
R.　配列番号３５　：　S496N
S.　配列番号３６　：　S496Q
T.　配列番号３７　：　W343DとV452A
U.　配列番号３８　：　W343DとV452G
V.　配列番号３９　：　W343DとS496I
W.　配列番号４０　：　W343DとS496R
X.　配列番号４１　：　W343MとS496C
Y.　配列番号４２　：　W343MとS496T
a.　配列番号７４　：　S495G
b.　配列番号７５　：　S495P
c.　配列番号７６　：　S495V
d.　配列番号７７　：　C498L
e.　配列番号７８　：　C498S
　後述の実施例（アミノ酸置換の効果の確認）に示した実験結果を踏まえると、特に糖転移活性に優れる点において、A～C、O、Q～Sの改変型α－グルコシダーゼの有用性は高い。また、加水分解活性が極めて低い点においてV及びWの有用性は高い。一方、α-1,6結合に対する分解活性が極めて低い点においてU、X及びYの有用性は高い。Yは糖転移活性に優れる点においてもその有用性は高い。また、a～cはα1,6位特異的な転移活性を示す点が特徴的である。d及びeについては、α-1,4位特異的な転移活性に優れる。
　ところで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部を変異させた場合において変異後のタンパク質が変異前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の変異がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が変異前後において維持されることがある。この技術常識を考慮すれば、上記(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型酵素と比較した場合に、アミノ酸配列の僅かな相違が認められるものの（但し、アミノ酸配列の相違は上記アミノ酸置換が施された位置以外の位置で生ずることとする）、特性に実質的な差が認められないものは、上記改変型酵素と実質同一の酵素とみなすことができる。ここでの「アミノ酸配列の僅かな相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。「実質同一の酵素」のアミノ酸配列と、基準となる上記改変型酵素のアミノ酸配列との同一性（％）は、例えば90%以上であり、好ましくは95%以上であり、より好ましくは98%以上であり、最も好ましくは99%以上である。尚、アミノ酸配列の相違は複数の位置で生じていてもよい。「アミノ酸配列の僅かな相違」は、好ましくは保存的アミノ酸置換により生じている。
（改変型α－グルコシダーゼをコードする核酸等）
　本発明の第２の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
　改変型酵素をコードする遺伝子は典型的には改変型酵素の調製に利用される。改変型酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の改変型酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の改変型酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、改変型酵素をコードする遺伝子の用途は改変型酵素の調製に限られない。例えば、改変型酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは酵素の更なる改変体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
　本明細書において「改変型酵素をコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に当該改変型酵素が得られる核酸のことをいい、当該改変型酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
　改変型酵素をコードする遺伝子の配列（塩基配列）の例を配列番号４３～６７及び７９～８３に示す。これらの配列はアスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼに特定のアミノ酸置換が施された改変型酵素をコードする遺伝子である。配列番号とアミノ酸置換の対応関係は次の通りである。
　　塩基配列　：　アミノ酸置換
A.　配列番号４３　：　W343C
B.　配列番号４４　：　W343D
C.　配列番号４５　：　W343M
D.　配列番号４６　：　W343H
E.　配列番号４７　：　W343A
F.　配列番号４８　：　W343F
G.　配列番号４９　：　W343G
H.　配列番号５０　：　W343T
I.　配列番号５１　：　W343E
J.　配列番号５２　：　W343V
K.　配列番号５３　：　W343Q
L.　配列番号５４　：　W343N
M.　配列番号５５　：　W343I
N.　配列番号５６　：　V452G
O.　配列番号５７　：　V452D
P.　配列番号５８　：　V452E
Q.　配列番号５９　：　S496V
R.　配列番号６０　：　S496N
S.　配列番号６１　：　S496Q
T.　配列番号６２　：　W343DとV452A
U.　配列番号６３　：　W343DとV452G
V.　配列番号６４　：　W343DとS496I
W.　配列番号６５　：　W343DとS496R
X.　配列番号６６　：　W343MとS496C
Y.　配列番号６７　：　W343MとS496T
a.　配列番号７９　：　S495G
b.　配列番号８０　：　S495P
c.　配列番号８１　：　S495V
d.　配列番号８２　：　C498L
e.　配列番号８３　：　C498S
　本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
　本発明の他の態様では、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう。また、相同核酸を規定する塩基配列を「相同塩基配列」ともいう）が提供される。相同核酸の例として、本発明の改変型酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、改変型酵素に特徴的な酵素活性（即ち糖転移活性）を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２～４０塩基、好ましくは２～２０塩基、より好ましくは２～１０塩基である。
　以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
　本発明の他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
　本発明の更に別の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその相同塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃～約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃～約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
　本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10～約100塩基長、好ましくは約20～約100塩基長、更に好ましくは約30～約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
　本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（改変型酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
　使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
　宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ改変型酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
　本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)）、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は、本発明の改変型酵素を生産することに利用することができる（後述の改変型α－グルコシダーゼの調製法の欄を参照）。
（改変型α－グルコシダーゼを含む酵素剤）
　本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明の改変型酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
（改変型α－グルコシダーゼの用途）
　本発明の更なる局面は改変型酵素の用途に関する。当該用途の一つとして、オリゴ糖の製造方法が提供される。本発明のオリゴ糖の製造方法の第１態様では、α-1,4結合に対する特異性が高いという、本発明の改変型酵素の特徴を活かすため、α-1,4結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖を基質として用い、当該基質に対して本発明の改変型酵素を作用させる。当該態様には、後述の実施例に示す改変型酵素W343M、W343M/S496T、C498L、C498S等、α-1,4結合に対する特異性の高い酵素が使用される。基質の例はマルトース、マルトトリオース、パノース、プルラン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、デキストリン、デンプン（馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、コースターチ、小麦澱粉、タピオカ澱粉等）などである。二種類以上のオリゴ糖又は多糖の混合物を基質にしてもよい。本発明の製造方法によれば分岐鎖が少ないオリゴ糖を特異的且つ効率的に製造可能である。反応条件は、α－グルコシダーゼを用いたオリゴ糖の生成に通常採用されるものに準じればよい。
　本発明のオリゴ糖の製造方法の第２態様では、α-1,6結合特異的な糖転移活性を示す改変型酵素（例えば後述の実施例に示すS495G、S495P、S495V）を使用する。この場合の基質の例は、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、デンプン（馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、コースターチ、小麦澱粉、タピオカ澱粉等）である。当該態様によれば、典型的には、分岐鎖の多いオリゴ糖を特異的且つ効率的に製造可能である。
　目的のオリゴ糖（第１態様の場合は分岐鎖が少ないオリゴ糖であり、第２態様の場合は典型的には分岐鎖の多いオリゴ糖）の生成量を高めるために、改変型酵素に加えて野生型酵素を使用することにしてもよい。目的のオリゴ糖の生成に適したものであれば野生型酵素は特に限定されない。例えば、使用する改変型酵素に対応する野生型酵素（即ち、当該改変型酵素を得るために改変を施した酵素）を採用することができる。この例とは対照的に、由来の異なる改変型酵素と野生型酵素を併用することにしてもよい。一例を示せば、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼを改変した酵素（改変型酵素）とアスペルギルス・ニドランスの野生型α－グルコシダーゼBを併用する。
　ここで、後述の実施例に示す通り、α-1,6結合特異的な糖転移活性を示す改変型酵素と野生型酵素を併用すれば、α-1,4結合を有する基質からオリゴ糖を生成できることが明らかとなった。そこで、本発明の更なる態様では、α-1,4結合を有する基質に対して、α-1,6結合特異的な糖転移活性を示す改変型酵素（例えば後述の実施例に示すS495G、S495P、S495V）と野生型酵素を作用させてオリゴ糖を得る。
　本発明の改変型酵素にはその糖転移活性によりデンプンの老化防止効果、食品の風味改善効果、整腸効果等が期待できる。従って、本発明の改変型酵素の用途の例として、食品中のデンプンの老化防止、食品の風味改善、整腸を挙げることができる。これらの用途への適用を想定し、本発明は更なる局面として、改変型酵素を含有する組成物（医薬組成物、医薬部外品組成物、化粧料組成物、食品組成物又は餌組成物）を提供する。
　本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
　製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物を提供できる。
　本発明の医薬組成物には、期待される治療効果や予防効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分（改変型酵素）が含有される。同様に本発明の医薬部外品組成物には、期待される改善効果や予防効果等を得るために必要な量の有効成分が含有される。本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物に含まれる有効成分量は一般に剤型や形態によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．１重量％～約９５重量％の範囲内で設定する。
　本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物はその剤型・形態に応じて経口又は非経口（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜、塗布など）で対象に適用される。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では、適用対象はヒトである。
　本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の投与量・使用量は、期待される効果が得られるように設定される。有効な投与量の設定においては一般に適用対象の症状、年齢、性別、体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば一日一回～数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、適用対象の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
　本発明の化粧料組成物は、改変型酵素と、化粧料に通常使用される成分・基材（例えば、各種油脂、ミネラルオイル、ワセリン、スクワラン、ラノリン、ミツロウ、変性アルコール、パルミチン酸デキストリン、グリセリン、グリセリン脂肪酸エステル、エチレングリコール、パラベン、カンフル、メントール、各種ビタミン、酸化亜鉛、酸化チタン、安息香酸、エデト酸、カミツレ油、カラギーナン、キチン末、キトサン、香料、着色料など）を配合することによって得ることができる。化粧料組成物の形態として、フェイス又はボディー用の乳液、化粧水、クリーム、ローション、エッセンス、オイル、パック、シート、洗浄料などを例示できる。化粧料組成物における改変型酵素の添加量は特に限定されない。例えば0.01重量％～10重量％となるように改変型酵素を添加することができる。
　一方、本発明での「食品組成物」の例として一般食品（米飯類、パン類、穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子類、牛乳、清涼飲料水、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント、栄養ドリンク等）、食品添加物を挙げることができる。栄養補助食品又は食品添加物の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。
　本発明の「餌組成物」の例は、ペットフード（イヌ、ネコ、鳥、魚、爬虫類、両生類、齧歯類などの餌）、飼料（家畜、家禽、養魚などの餌）である。
（改変型α－グルコシダーゼの設計法）
　本発明の更なる局面は改変型酵素の設計法に関する。本発明の設計法では、以下のステップ(i)及び(ii)を実施する。
　ステップ(i)：変異対象酵素であるα－グルコシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定する。
　(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の385位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の491アミノ酸に相当するアミノ酸
　(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の450位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の534位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の538位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の554位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の556位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(10)配列番号２に示すアミノ酸配列の579位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(11)配列番号２に示すアミノ酸配列の585位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の630位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の683位アミノ酸に相当するアミノ酸
　(14)配列番号１に示すアミノ酸配列の689位アミノ酸に相当するアミノ酸
　置換対象アミノ酸(1)～(14)は、酵素の特性に重要なアミノ酸として同定されたアミノ酸である。従って、これらのアミノ酸を置換すればα－グルコシダーゼの特性に変化が生ずると大いに期待できる。変化が特に期待される特性は、糖転移活性と加水分解活性である。本発明の設計法は、これら二つの活性のバランスが変化した酵素を設計する手段として特に有用である。例えば、加水分解活性を低減ないし消失させるとともに糖転移活性を高める目的の下、本発明の設計法を利用することができる。
　本発明の設計法における変異対象酵素はα－グルコシダーゼである。変異対象酵素は典型的には野生型酵素（天然において見出される酵素）である。しかしながら、既に何らかの変異ないし改変が施された酵素を変位対象酵素とすることを妨げるものではない。変異対象酵素の例はヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase）、ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）、マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）、酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）、ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）、アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）、Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）、シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）、デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）、大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）、シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）、ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）、砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）、ジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）である。上述の通り、これらのα－グルコシダーゼのアミノ酸配列は公共のデータベースに登録されている（配列番号１～１７）。好ましい一態様では、これらの中のいずれかのアミノ酸配列からなる酵素を変異対象酵素とする。
　本発明ではステップ(i)の後、以下のステップ(ii)を行う。
　ステップ(ii)：変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築する。
　置換後のアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。従って、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。
（改変型α－グルコシダーゼの調製法）
　本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号１８～４２、７４～７８のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する（ステップ(I)）。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列（アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい）が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号１８～４２、７４～７８のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号１８～４２、７４～７８のアミノ酸配列はいずれも、アスペルギルス・ニガー由来α－グルコシダーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、アスペルギルス・ニガー由来α－グルコシダーゼをコードする遺伝子（配列番号７３）に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号１８～４２、７４～７８のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸（遺伝子）を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である（J.Mol.Biol.331,585-592(2003)）。例えば、KOD-Plus-Mutagenesis Kit (東洋紡社)、Quick change（ストラタジーン社）等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988)）を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-（東洋紡社）、Pfu turbo（ストラタジーン社）などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
　本発明の他の一態様では本発明の設計法によって設計されたアミノ酸配列を基にして改変型酵素を調製する。この態様の場合ステップ(I)では本発明の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意することになる。例えば、本発明の設計法によって構築されたアミノ酸配列に基づいて、改変型酵素をコードする遺伝子に対して必要な変異（即ち、発現産物であるタンパク質における、特定位置でのアミノ酸の置換）を加え、改変型酵素をコードする核酸（遺伝子）を得る。
　ステップ（I)に続いて、用意した核酸を発現させる（ステップ(II)）。例えば、まず上記核酸を挿入した発現ベクターを用意し、これを用いて宿主細胞を形質転換する。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　次に、発現産物である改変型酵素が産生される条件下で形質転換体を培養する。形質転換体の培養は常法に従えばよい。培地に使用する炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
　一方、培養温度は30℃～40℃の範囲内（好ましくは37℃付近）で設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型酵素の産生特性などを考慮して設定することができる。培地のpHは、形質転換体が生育し且つ酵素が産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のpHを6.0～9.0程度（好ましくはpH7.0付近）とする。
　続いて、発現産物（改変型酵素）を回収する（ステップ(III)）。培養後の菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より発現産物を一旦回収する。発現産物が分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Sephadex）ゲル（GEヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B （GEヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースCL-6B （GEヘルスケアバイオサイエンス）、CMセファロースCL-6B（GEヘルスケアバイオサイエンス））などを組み合わせて分離、精製を行ことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。
　上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
　通常は、以上のように適当な宿主－ベクター系を利用して遺伝子の発現～発現産物（改変型酵素）の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
　タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
　用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
Ａ．改変型α－グルコシダーゼの取得１
　α－グルコシダーゼ（別名トランスグルコシダーゼ。以下、「TG」と略称する）をモデルにとり、タンパク質工学を用いて、加水分解反応と脱水縮合反応を一方向化する技術（One direction technology）について検討した。TGはオリゴ糖製造に使用される酵素であり、グルコシド結合を加水分解する活性を有しているが、同時に糖転移活性も有し、マルトースからオリゴ糖類を生成する。より効率的に糖転移を行うTGの開発を目指し、研究を進めた。
（１）コンピュータプログラムを使った変異導入点の検討
　TGを分子レベルで構造改変し、オリゴ糖生成能が向上した新規酵素を設計することを目的として、コンピュータシュミレーションを実施した。X線結晶構造解析が報告されているヒト小腸由来のα－グルコシダーゼ（配列番号１）に関し、TGの立体構造や進化的な知見に基づいた機能予測を基に、コンピュータシュミレーションにより変異導入点を決定した。具体的には、HotSpot Wizardプログラム（非特許文献Pavelkaら Nucleic Acids Res. 37 W376-83. (2009））を用い、ヒトα－グルコシダーゼにおいて変異導入点になると予想されるアミノ酸を計算したところ、3点のアミノ酸（385位アミノ酸：Y385、491位アミノ酸：V491、535位アミノ酸：N535）が選ばれた。いずれも基質に接する領域にあり、基質の活性に関わると予想出来る（図１、A）。次に、α－グルコシダーゼホモログを5種類選び、CLUSTALWを用いて上記変異導入点の近傍の配列をアライメント比較した。Y385、V491及びN535はいずれも近傍の配列の相同性が高く高度に保存されていたことから、酵素の機能に重要な領域であると予想できた。これらの変異導入点に対応するアミノ酸をアスペルギルス・ニガー（Asp. Niger）のTGで同定した（図１、C）。Y385に対応するアミノ酸はW343であり、V491に対応するアミノ酸はV452であり、N535に対応するアミノ酸はS496である。これらのアミノ酸に変異を導入するためのプライマーを設計し、ランダムプライマーを用いたインバースPCR法で変異導入を行った。大腸菌に形質転換し、ミニプレップの後にシーケンス解析を行い、変異導入を確認した。
（２）スクリーニング系の開発
　作成したプラスミドを酵母INVsc1株に形質転換し培養した。培養上清を遠心処理で回収し、分泌された酵素を構造改変TGのサンプルとした。スピンカラムを用いた限外ろ過によりブロスの濃縮と脱塩を行った。その結果、およそ10～50倍に濃縮した酵素サンプルが得られた。
　酵素基質であるマルトースを用い加水分解活性を測定した。基質が最終濃度1%になるように調整し、加水分解により生成するグルコースを、グルコースオキシダーゼ（GO）とペルオキシダーゼ（PO）を含むアミノアンチピリン・フェノール発色液により呈色して、OD500を測定することで定量化した。グルコース標準品により検量線（スタンダード）を作成し、吸光度から生成グルコース量を算出した。
　オリゴ糖合成活性を調べるため、HPLCによる生成オリゴ糖を解析した。基質として50% マルトース水溶液を用いて、生成するオリゴ糖を決定した。HPLCの条件は以下の通りとした。
　カラム：TSKGEL Amido-80 （東ソー）
　溶媒：MeCN/H2O = 2/1
　検出：RI
　HPLCのエリア面積をグラフにすることで、それぞれが生成するオリゴ糖の糖数を推定した。以上のスクリーニング法の概要を図２に示す。
（３）1アミノ酸置換による構造改変TGの評価
　アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（配列番号２）において、上記変異導入点（Y385、V491、N535）に対応する位置、即ち、W343、V452又はS496にPCR法でランダム変異を導入した（1アミノ酸置換）。変異導入後、シーケンスを行い、導入した点変異を同定した。得られた3種類の構造改変TG（W343M、V452G、S496V）について解析した。尚、予備実験を行い、プラスミド由来のタンパク質が培養上清に発現していること、その酵素に加水分解活性があることを確認した。
　まず、高濃度マルトース溶液を基質として、オリゴ糖合成活性を測定した。その結果である、典型的なHPLCパターンを図３に示す。野生型（WT）TGを発現させたサンプルでは、基質のマルトースのピークが減少して、グルコース、イソマルトース、パノース、イソマルトトリオースのピークが見られるようになった（図３、A）。さらに、４糖のエリアに2つに分かれたピークが見られた（図３、A）。
　一方、WTと比較して、構造改変TGにおいては、基質のマルトースのピークが減少して、グルコース、マルトトリオース、パノースのピークが見られるようになった（図３、B～D）。さらに４糖のエリアに1つに固まったピークが見られた（図３、B～D）。構造改変TGの生成するオリゴ糖はWTと異なり、イソマルト系のオリゴ糖の生成量が大きく低下していた。
　次に、HPLCのエリア面積を定量することで、構造可変TGのオリゴ糖合成活性をWTと比較した。図４のグラフは3糖以上のエリア面積の合計を示したものである。WTでも3糖以上のオリゴ糖が生成しているが、いずれの構造改変TGにおいても、生成するオリゴ糖のエリア面積はWTよりも大きくなっている（およそ20%の増加）。
　置換後のアミノ酸の種類と糖転移活性の関係を調べる目的の下、変異導入点（385Y）に対応するアミノ酸W343に関して各種構造改変TGを作製し、オリゴ糖合成能を比較した。その結果、置換後のアミノ酸がシステイン（W343C）、アスパラギン酸（W343D）、メチオニン（W343M）、ヒスチジン（W343H）、アラニン（W343A）、フェニルアラニン（W343F）、グリシン（W343G）、スレオニン（W343T）、グルタミン酸（W343E）、バリン（W343V）、グルタミン（W343Q）、アスパラギン（W343N）又はイソロイシン（W343I）の場合、構造改変TGが生成する３糖以上のオリゴ糖量は、WTよりも増加した（図５、上）。４糖以上のオリゴ糖についても同様の比較をした結果、置換後のアミノ酸がメチオニン（W343M）、アスパラギン酸（W343D）、システイン（W343C）、フェニルアラニン（W343F）、グルタミン（W343Q）、ヒスチジン（W343H）、スレオニン（W343T）、グルタミン酸（W343E）、グリシン（W343G）、アスパラギン（W343N）、バリン（W343V）又はアラニン（W343A）については、構造改変TGの方がWTよりも合成能が優れていた（図５、下）。３糖以上のオリゴ糖の合成量及び４糖以上のオリゴ糖の合成量のいずれについても上位であった構造改変TG、即ち、W343C、W343D、W343Mは、オリゴ糖合成能が特に優れていると評価できる。また、４糖以上のオリゴ糖の合成量がWTよりも顕著に多い、W343M、W343D、W343C、W343F、W343Q及びW343Hは、より長鎖のオリゴ糖の合成に有利といえる。
　HPLCのエリア面積を定量することで、構造可変TGのオリゴ糖合成活性をWTと比較した。アミノ酸V452に関して各種構造改変TGを作製し、オリゴ糖合成能を比較した。その結果、置換後のアミノ酸がグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸の場合は３糖以上のオリゴ糖量は、WTよりも増加した（図６）。また、４糖以上のオリゴ糖についても同様の比較をした結果、置換後のアミノ酸がアスパラギン酸（V452D）については、構造改変TGの方がWTよりも合成能が優れていた（図６）。同様に、アミノ酸S496に関して各種構造改変TGを作製し、オリゴ糖合成能を比較した。その結果、置換後のアミノ酸がバリン、アスパラギン、グルタミンの場合は３糖以上のオリゴ糖と４糖以上のオリゴ糖のどちらの場合も、構造改変TGの方がWTよりも合成能が優れていた（図６）。
　以上のように、構造改変TGではイソマルト系オリゴ糖の生成量が大きく低下していることが分かった。そこで、グルコシド結合に対する反応性が変化したのではないかと考え、各種グルコシド結合に対する加水分解活性を調べた。酵素基質として、2糖であるマルトース（α-1,4）、イソマルトース（α-1,6）の水溶液を作成した。WTはα-1,4結合とα-1,6結合の両方に基質親和性を示した（図７）。対照的に構造改変TGは、α-1,4結合に対する加水分解活性はWT型とほぼ変わらないものの、α-1,6結合に対する加水分解活性は1/5以下に低下していた（図７）。
（４）2アミノ酸置換による構造改変TGの評価
　343位トリプトファンを置換した構造改変TGに、更なる変異（トンネル構造の表面に存在する2つのアミノ酸（V452、S496）のいずれか）を導入することによって、2アミノ酸に変異を導入した構造改変TGを作成した。得られた構造改変TGの加水分解活性測定を行った。図８に示すように、W343D/S496I（343位WをDで置換且つ496位SをIで置換）、W343D/S496R（343位WをDで置換且つ496位SをRで置換）では全く活性が検出できなかった。一方、W343D/V452G（343位WをDで置換且つ452位VをGで置換）、W343M/S496C（343位WをMで置換且つ496位SをCで置換）、W343M/S496T（343位WをMで置換且つ496位SをTで置換）の3種の構造改変TGはイソマルトースの加水分解活性が大きく低下した（およそ1/20）。
　次に、オリゴ糖合成活性を測定した。WT型TGを発現させたサンプルでは3糖に関してパノース及びイソマルトトリオースのピークが見られた（図９、A）。一方、W343Mにおいては、これまでの結果と同様に、3糖に関してマルトトリオース及びパノースのピークが見られるようになった（図９、B）。2アミノ酸置換TGであるW343M/S496TとW343D/V452Gでは3糖に関してピークが１つだけ見られるようになり、マルトトリオースと予想された（図９、C及びDの矢印）。また、4糖の領域でもHPLCで見られるピークは1つだけになり、WT型の分析パターンとは大きく異なる結果とになった（図９、C及びD）。この4糖のピークは2アミノ酸置換TGでのみ見られるピークであり、生成するオリゴ糖がWT型とは異なることを示す
　HPLCのエリア面積を定量することで、構造可変TGのオリゴ糖合成活性をWTと比較した。すべての2アミノ酸置換TGは、生成するオリゴ糖のエリア面積はWTよりも大きくなっていて、3糖以上のオリゴ糖の合成量が20-50%増加していた（図１０）。さらに、W343M/S496Tは４糖以上のオリゴ糖の合成量がWTよりも顕著に多くなり、70%近く増加した（図１０）。
　一方、構造改変TGのグルコシド結合に対する加水分解活性を検討した。W343M/S496Tでは、マルトースとマルトトリオースに対する加水分解活性は50%になり、イソマルトースに対する加水分解活性は10%以下になった（図１１）。コージビオースに対する加水分解活性についてはおよそ40%となり、ニゲロースに対する加水分解活性はおよそ10%に低下した（図１１）。以上の結果から、2アミノ酸を置換した構造改変TGは加水分解活性が低下しており、特にα-1,6結合及びα-1,3結合に対する加水分解活性が大きく低下していることが明らかとなった。
（５）構造改変TGが生成するオリゴ糖の解析
　過去の報告によれば、オリゴ糖合成時に使用する初期基質の糖数を増やすと、TGが生成するオリゴ糖におけるα-1,6結合の割合が増加する。そこで、5糖のマルトペンタオースを基質にしてオリゴ糖合成反応を行い、生成するオリゴ糖をWT型と構造改変TGの間で比較した。まず、スタンダードとしてグルコース(G=1)、マルトース(G=2)、マルトトリオース(G=3)、マルトペンタオース(G=5)を測定してピークの位置を確認した（図１２）。WT型TGではグルコースから7糖以上のエリアまで幅広く分解と生産が起きていた（図１２）。但し、5糖以下の割合が多く、オリゴ糖合成よりも加水分解が進行したと予想された。一方、の構造改変TG（W343MとW343M/S496T）では1糖、2糖まで加水分解されたものは少なく、6糖以上の生成が多くなっていた（図１２）。図１２の矢印で示したエリアは、WTと構造改変TGの間で特に差が大きい。
　次に、スタート基質をマルトースとイソマルトースの混合溶液でオリゴ糖合成を行った。生成するオリゴ糖の割合には大きな変化はなかったが、生成する3糖の種類に差が現れた。WT型ではα-1,6結合が2つあるイソマルトトリオースが多く生成していた（図１３）。一方、構造改変TG（W343MとW343M/S496T）ではα-1,4結合とα-1,6結合を有するパノースが最も多く生成した（図１３、矢印）。また、構造改変TGの場合、スタート基質のイソマルトースはほとんど分解されなかった。
　以上の結果より、WT型のTGが主にα-1,6位に糖転移したオリゴ糖を生成するのとは対照的に、構造改変TGはα-1,4位に糖転移したオリゴ糖を特異的に生成することが示唆された。
　尚、今回の検討において作成した各構造改変TGのアミノ酸配列を以下に示す。
　配列番号１８　：　W343C
　配列番号１９　：　W343D
　配列番号２０　：　W343M
　配列番号２１　：　W343H
　配列番号２２　：　W343A
　配列番号２３　：　W343F
　配列番号２４　：　W343G
　配列番号２５　：　W343T
　配列番号２６　：　W343E
　配列番号２７　：　W343V
　配列番号２８　：　W343Q
　配列番号２９　：　W343N
　配列番号３０　：　W343I
　配列番号３１　：　V452G
　配列番号３２　：　V452D
　配列番号３３　：　V452E
　配列番号３４　：　S496V
　配列番号３５　：　S496N
　配列番号３６　：　S496Q
　配列番号３７　：　W343D/V452A
　配列番号３８　：　W343D/V452G
　配列番号３９　：　W343D/S496I
　配列番号４０　：　W343D/S496R
　配列番号４１　：　W343M/S496C
　配列番号４２　：　W343M/S496T
Ｂ．改変型α－グルコシダーゼの取得２
（１）コンピューターシミュレーションソフトMOEを使った変異導入点の検討
　新しい手法で変異導入点を同定することを目的にして、コンピューターシミュレーションソフトであるMOE(Chemical Computing Group社)を使ってTGの変異導入点を検討した。この際に、類縁のこうじ菌であるアスペルギルス・ニガーとアスペルギルス・ニドランスの配列を比較することで、変異導入点に関する推察を行った。
　アスペルギルス・ニガーのTGとアスペルギルス・ニドランスのTG（α-グルコシダーゼB）のアミノ酸配列を公知の情報データベースから入手して、MOEに読み込みコンピューター上でタンパク質モデリングを行った。それぞれのアミノ酸配列を元に、MOEのデータベースから相同性の高い配列を探索した。その結果、どちらも同じ配列がヒットして、ヒトTGが選ばれた。次に、この立体構造をテンプレートにして、それぞれのタンパク質のモデリングを行った。力場は「AMBER99」で、中間体モデルを5個作成して、最終的に1つのモデル構造を作成した。
　次に、ドッキングシミュレーション解析を行い、基質ポケットの予測を行った。力場を「MMFF99x」に設定して、MOEのSite Finderでポケットの探索を行った。その結果、立体構造的にポケットとなる可能性のある候補領域が複数予測された。そこで、過去の論文などで報告されているTGの活性中心となるアミノ酸を検索して、それぞれのモデル上の位置を決定した。そして、活性中心である複数のアミノ酸が含まれる領域を、シミュレーションで計算された基質ポケットと決定した。
　モデリングに成功したそれぞれの立体構造を図１４に示す。アスペルギルス・ニガーのTGとアスペルギルス・ニドランスのTGの構造を比較すると、同じヒトTGの立体構造を元にしてモデリングしたにも関わらず、それぞれの立体構造には大きな違いが見られた。シミュレーションした基質ポケットを比較すると、アスペルギルス・ニガーと比べてアスペルギルス・ニドランスの基質ポケットは小さくなっていた。アスペルギルス・ニガーでは30アミノ酸で基質ポケットが構成されるのに対して、アスペルギルス・ニドランスでは22アミノ酸で構成されていた（図１４）。
　次に、アスペルギルス・ニガーのTGのアミノ酸配列とアスペルギルス・ニドランスのTGのアミノ酸配列をCLASTAL-Wによりアライメントした。全体のアミノ酸配列を比較すると、この2つのタンパク質の相同性は低く、アミノ酸が一致する割合は35%と計算された。しかし、基質ポケットの配列に限って比較した場合には配列の相同性が高く、アスペルギルス・ニガーの基質ポケットでは30個中19個のアミノ酸が一致していて、アスペルギルス・ニドランスでは22個中19個のアミノ酸が一致した（図１５）。この結果は、活性に関わるアミノ酸は全体の配列よりも高度に保存されていることを示唆している。一方、一致しなかったアミノ酸は進化的な保存性が高くないと判断して、変異を導入できると予測した。そこで、これらのアミノ酸を変異導入候補点とした（図１５）。さらに、すでに変異を導入したW343とS496が選ばれたことから、これまでに用いていたヒトTGを用いたHot spots wizardによるシミュレーションと相関性があると考えた。
　実際にアスペルギルス・ニガーのTGに変異導入するためにプライマーを設計し、ランダムプライマーを用いたインバースPCR（inverse PCR）法で変異導入を行った。大腸菌に形質転換し、ミニプレップ（mini-prep）した後にシーケンス解析を行い、変異導入を確認した。さらに、酵母に形質転換して、組み換え構造改変TGを発現して、解析を行った。実際に作成した中から、S495とC498の2点についての解析結果を示す。
（２）S495改変型TGの評価
　アスペルギルス・ニガーのTGにおいて、495番目のセリン（S495）にPCR法でランダム変異を導入した（1アミノ酸置換）。シーケンスを行い、導入した点変異を同定し、改変型TGについて解析を行った。
　これらの改変型TGについて、HPLCを用いてオリゴ糖合成活性を測定して比較した。基質として、50%マルトース水溶液、イソマルトース水溶液、及び5糖のオリゴ糖であるマルトペンタオース水溶液を用いた。反応温度を50℃として所定時間（マルトース、マルトペンタオースについては48時間、イソマルトースについては96時間）インキュベートした。
　HPLCのエリア面積を定量することで改変型TGのオリゴ糖合成活性を比較した。基質がマルトースの場合には、3糖以上と4糖以上のエリア面積の合計は、WTと比べてS495Gでは大きくなっていたが、S495P及びS495Tでは逆に減少していた(図１６)。
　基質がイソマルトースの場合には、3糖以上のエリア面積の合計は、WTと比べてS495G、S495P及びS495Vで大きくなった(図１７)。また、4糖以上のエリア面積の合計は、WTと比べてS495G及びS495Pで大きくなり、オリゴ糖合成能が向上していることが示唆された(図１７)。HPLCのピークを見ると、3糖ではイソマルトトリオースが増加しており、WTと同様に構造改変TGはα-1,6に糖を転移させる活性があると推測できる。以上の結果から、S495G、S495P及びS495Vの3種類はα1,6結合のオリゴ糖を50%以上増加させることが分かった。
　そこで、構造改変TGはグルコシド結合に対する反応性が異なるのではないかと考え、各種のグルコシド結合に対する加水分解活性を検討した（図１８）。基質としてマルトース水溶液とイソマルトース水溶液を用い、生成するグルコース量を定量することで加水分解活性を評価した。WTはグルコシド結合に対してα-1,4結合とα-1,6結合の両方に基質親和性があることを示している。一方、S495A、S495G、S495P、S495T及びS495Vはマルトースの加水分解活性がWTよりも低下しているが、イソマルトースの加水分解活性は相対的に上昇していた。以上の通り、S495を置換した構造改変TGはα-1,6結合に対する特異性が向上していた。
　最後に、初期基質を5糖のマルトペンタオースにしてオリゴ糖合成反応を行い、生成するオリゴ糖をWT型TGと構造改変TGの間で比較した（図１９）。WT型TGではグルコースから6糖以上のエリアまで、幅広く分解と生産が起きていた。グラフにすると１糖の量が最も多く、反応中に加水分解が進行していた。構造改変TGでは、いずれもオリゴ糖の増加が見られた。特に、S495P型とS495V型の構造改変TGは、加水分解された糖類が少なくなり、6糖以上の生成が多くなっていた（図１９c）。
　以上の通り、α1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TGを3種類取得することに成功した。また、構造改変TGが生成するオリゴ糖はα1,6結合を含む結合様式で重合し、オリゴ糖の生成量が増加することが分かった。
（３）C498改変型TGの評価
　アスペルギルス・ニガーのTGにおいて、498番目のシステイン（C498）にPCR法でランダム変異を導入した（1アミノ酸置換）。シーケンスを行い導入した点変異を同定して、改変型TGについて解析を行った。
　これらの構造改変TGについて、HPLCを用いてオリゴ糖合成活性を測定して比較した。其質として60%マルトース水溶液を用い、反応温度50℃で48時間インキュベートした。
　HPLCのエリア面積を定量することで、構造改変TGのオリゴ糖合成活性を比較した（図２０）。3糖以上のエリア面積の合計を比較したところ、WTと比べてC498LとC498Sはエリア面積が大きくなっていた。また、4糖以上のエリア面積の合計も同様に、WTと比べてC498LとC498Sでは増大を認めた。
　これまでの検討を踏まえると、構造改変TGではグルコシド結合に対する反応性に変化が生じているのではないかと考え、加水分解活性を測定することにした。基質としてマルトース水溶液とイソマルトース水溶液を用い、生成するグルコース量を定量した。図２１で示すように、WTと比べて、C498L及びC498Sはマルトースの加水分解活性が高いことがわかった。また、これらの構造改変TGでは、マルトース加水分解活性とイソマルトース加水分解活性の比率に大幅な変化がみられ、α1,4結合に対する特異性が向上していることもわかる。
　以上の通り、C498では変異導入によりオリゴ糖合成が上昇することが示された。また、オリゴ糖の合成能が高められた構造改変TG（α1,4位特異的な転移活性を示す）を2種類取得することに成功した。
　尚、今回の検討において作成した各構造改変TGのアミノ酸配列を以下に示す。
　配列番号７４　：　S495G
　配列番号７５　：　S495P
　配列番号７６　：　S495V
　配列番号７７　：　C498L
　配列番号７８　：　C498S
Ｃ．構造改変TGの食品分野への適用
　健康食品分野への構造改変TGの応用可能性を評価するため、人工消化モデル系を用いた実験を行った。このモデル系では、おかゆを唾液由来のアミラーゼで分解して生じるオリゴ糖に対してTGがどのように作用するのかを評価する。市販品のおかゆに対して、胃液のpHに近い酸性領域でアミラーゼとTGを作用させ（30分～2時間、37℃で加温）、その後、サンプリングして酵素反応を停止した。そして、生成したオリゴ糖をHPLCで分析した。添加するアミラーゼ量は、唾液中のアミラーゼの量に相当する1.45 U/mlとした。また、事前の予備検討の結果を踏まえ、TG量は20μg/mLとした。以下、実験プロトコールの詳細を示す。
（プロトコール）
　(i) おかゆ（味の素株式会社）をミキサーにかけて破砕し、1M NaOAcバッファー（pH5.0）を1/20量を加える。
　(ii) 340μlの酵素液を作製する（タンパク濃度：20μg/mL）。
　(iii) ガラス試験管に、(i)のおかゆ 0.65 g、アミラーゼ 1.45 U及び酵素液340μlを投入する。
　(iv) 37℃の湯浴でインキュベートし、30分ごとに200μlをマイクロテストチューブにサンプリングする。
　(v) 5分間ボイルして酵素反応を停止させる。
　(vi) 12000rpmで遠心処理した後、上清を新しいチューブに移す。
　(vii) 120μlを分取し、MilliQ（登録商標）水で3倍に希釈する。
　(viii) 以下の条件でHPLC解析する。
（カラム条件）
　カラム; TSKGEL Amido-80
　溶媒; MeCN/H2O = 2/1
　検出器; RI
　流速; 1 ml/分
　生成したオリゴ糖をHPLCで解析した結果を図２２に示す。アミラーゼの添加によって、全体の糖のうち40～50%がマルトースになる（図２２（ａ））。また、3糖のマルトトリオース及び4糖のマルトテトラオースが生成する。グルコースはほとんど生成せず、2糖からは分解が進まなくなる。野生型（WT）TGを添加した場合は、グルコースの生成量が経時的に増加し、反応開始60分後からはイソマルトースの生成を認め、時間経過とともに3糖以上のオリゴ糖は減少した（図２２（ｂ）、（ｄ））。α1,4位特異的な構造改変TGであるW343Mを添加した場合は、野生型TGの場合と同様にマルトースが分解されて糖転移反応が進む。反応開始30分後では、野生型TGとの間で、生成するオリゴ糖に大きな違いはなく、マルトトリオース、マルトース、グルコースのピークが見られる（図２２（ｃ））。その一方で、W343Mはグルコースの生成を抑えながら、マルトースを3糖以上のオリゴ糖に転移していく（図２２（ｃ））。野生型TGとは対照的に、W343Mを添加した場合には3糖以上のオリゴ糖の減少は少なく、最終的に生成されたオリゴ糖の量は格段に多い（図２２（ｄ））。実際のHPLCパターン（反応開始後90分後）を見ると、W343Mを添加した場合には、イソマルトースのピークは認められず、サイズの大きなオリゴ糖のピークが見られた（図２３）。
　以上の通り、構造改変TGであるW343Mを使用すると、野生型TGを使用した場合に比較してイソマルトースの生成量が減少する一方で、マルトトリオースのような鎖長の長いα1,4結合のオリゴ糖の生成量が増加した。反応開始90分後で比較すると、構造改変TGのグルコース生成量は野生型TGに比べて19.2%の減少であり、3糖以上のオリゴ糖の生成量は同42.7%の増加であった。このように、人工消化モデル系においても、オリゴ糖の生成に適するという、構造改変TGの有用性が裏付けられた。
Ｄ．野生型（WT）TGと構造改変TGの併用
（１）マルトースを基質としたオリゴ糖合成
　α1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TGを用い、α1,4結合の２糖であるマルトースを基質にしてオリゴ糖合成反応を試みたところ、オリゴ糖合成が進まなかった。その理由は、α1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TGはα1,4結合に対する反応性が低く、マルトースを基質にしてもオリゴ糖合成反応が十分に進まないことにあると思われた。そこで、イソマルトースを供給する酵素と併用すれば、マルトースを基質にした場合であってもオリゴ糖合成反応を進められるのではないかと考え、マルトースをイソマルトースに変換する酵素活性を持つWT型TGと構造改変TG（S495P）を併用してオリゴ糖合成を行った。生成するオリゴ糖はHPLCで解析した。尚、基質として50%マルトース水溶液を用い、50℃で48時間反応を行うこととした。
　S495P単独の場合と、WT型とS495Pを混合した場合（混合比２：１、１：１又は１：２）についてオリゴ糖合成を行い、生成したオリゴ糖をHPLCで解析した。S495P単独の場合、3糖であるパノースは生成するが4糖以上のオリゴ糖の生成は非常に少ない。即ち、4糖以上の反応が進まない（図２４のS495P、図２５のS495P）。一方、WT型とS495Pを併用した場合には、いずれの割合で混合しても、3糖以上のオリゴ糖量と4糖以上のオリゴ糖量のどちらも増加した（図２４のWT:S495=2:1、WT:S495=1:1、WT:S495=1:2）。特に注目すべきは、S495P単独の場合は生成するオリゴ糖がほとんどパノースであるのに対して、WT型とS495Pを併用した場合にはパノースとイソマルトトリオースの生成を認め（図２５、矢印で示したピーク）、更には4糖以上のオリゴ糖の生成も認められた。以上の通り、WT型とα1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TGの併用は効果があり、α1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TG単独使用では反応が進まないα1,4結合の糖類からもオリゴ糖を生成することが可能であった。
（２）構造改変TGの食品分野への適用
　α1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TGについて、人工消化モデル系を用いた実験を行った。プロトコールは上記Ｃ．の場合と同様である。
　おかゆにアミラーゼのみを添加した場合、生成する糖類は40～50%がマルトースとなる。また、3糖のマルトトリオース及び4糖のマルトテトラオースが生成する。これらはすべてα1,4結合の糖類であることから、α1,6位特異的な転移活性を有する改変型α-グルコシダーゼの単独使用では反応が進まないと思われた。そこで、Ｄの（１）と同様に、WT型TGと構造改変TG（S495P）を併用してオリゴ糖合成を試みた。
　まず、おかゆにアミラーゼとWT型を添加した場合は、30分後から反応が進み、グルコースの生成量が次第に増加した（図２６（ａ））。また、反応開始60分後からイソマルトースが生成し、3糖以上のオリゴ糖については次第に減少した。一方、おかゆにアミラーゼとS495Pを添加した場合はアミラーゼによる糖類の生成しか起こらず、反応開始120分後でも、ほとんどがマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースのままであった（図２６（ｂ））。対照的に、アミラーゼ、WT型及びS495Pの3種類の酵素を併用した場合には（WT型とS495Pの混合比は１：２）、マルトースの分解が生じて糖転移反応が進行した。反応開始60分後以降において、WT型単独と比べて3糖以上のオリゴ糖が増加した（図２６（ｄ））。3種類の酵素を併用した場合はマルトースの減少と3糖以上のオリゴ糖の割合の増加が認められ（図２６（ｃ））、オリゴ糖合成が進んだと考えられる。実際のHPLCパターンを見ると、3種類の酵素を併用した場合には、アミラーゼによって生成したマルトースとマルトトリオースのピークが減少する一方、パノースや4糖のオリゴ糖のピークが見られた（図２７右下、矢印）。また、アミラーゼにWT型のみを併用した場合（図２７左下）と比べると、3糖以上のオリゴ糖がほとんど減少しないことがわかり、3種類の酵素（アミラーゼ、WT型及びS495P）の併用がオリゴ糖の生成に効果的であるといえる。
　以上の通り、オリゴ糖を生成する上で、WT型とα1,6位特異的な転移活性を有する構造改変TGの併用が極めて効果的であることが示された。
　本発明の改変型α－グルコシダーゼは糖転移活性が高い。この特性を活かし、オリゴ糖の製造（合成）への利用が期待される。また、本発明の設計法は野生型酵素などの糖転移活性を高める手段として有用であり、各種α－グルコシダーゼの改変に利用され得る。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (28)

  1. 　α－グルコシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改変型α－グルコシダーゼ：
    　(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の385位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の491位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の450位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の534位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の538位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の554位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の556位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(10)配列番号２に示すアミノ酸配列の579位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(11)配列番号２に示すアミノ酸配列の585位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の630位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の683位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　(14)配列番号１に示すアミノ酸配列の689位アミノ酸に相当するアミノ酸。
  2. 　α－グルコシダーゼが、ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase）、ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）、マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）、酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）、ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）、アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）、Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）、シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）、デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）、大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）、シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）、ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）、砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）又はジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）ある、請求項１に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  3. 　α－グルコシダーゼのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列であり、
    　(1)のアミノ酸が該アミノ酸配列の343位アミノ酸、(2)のアミノ酸が該アミノ酸配列の452位アミノ酸、(3)のアミノ酸が該アミノ酸配列の496位アミノ酸、(4)のアミノ酸が該アミノ酸配列の410位アミノ酸、(5)のアミノ酸が該アミノ酸配列の495位アミノ酸、(6)のアミノ酸が該アミノ酸配列の498位アミノ酸、(7)のアミノ酸が該アミノ酸配列の499位アミノ酸、(8)のアミノ酸が該アミノ酸配列の531位アミノ酸、(9)のアミノ酸が該アミノ酸配列の533位アミノ酸、(12)のアミノ酸が該アミノ酸配列の662位アミノ酸、(13)のアミノ酸が該アミノ酸配列の715位アミノ酸、(14)のアミノ酸が該アミノ酸配列の721位アミノ酸となる、請求項１に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  4. 　置換されるアミノ酸が(1)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、スレオニン、グルタミン酸、バリン、グルタミン、アスパラギン又はイソロイシンである、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  5. 　置換されるアミノ酸が(2)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がグリシン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  6. 　置換されるアミノ酸が(3)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がバリン、アスパラギン又はグルタミンである、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  7. 　置換されるアミノ酸が(1)のアミノ酸及び(2)のアミノ酸であり、
    　置換後のアミノ酸が、(1)のアミノ酸についてはアスパラギン酸であり、(2)のアミノ酸についてはアラニン又はグリシンである、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  8. 　置換されるアミノ酸が(1)のアミノ酸及び(3)のアミノ酸であり、
    　置換後のアミノ酸が、(1)のアミノ酸についてはアスパラギン酸又はメチオニンであり、(3)のアミノ酸についてはイソロイシン、アルギニン、システイン又はスレオニンである、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  9. 　置換されるアミノ酸が(5)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がグリシン、プロリン又はバリンである、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  10. 　置換されるアミノ酸が(6)のアミノ酸であり、置換後のアミノ酸がロイシン又はセリンである、請求項３に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  11. 　配列番号１８～４２及び７７～７８のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  12. 　配列番号７４～７６のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改変型α－グルコシダーゼ。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼをコードする遺伝子。
  14. 　配列番号４３～６７及び７９～８３のいずれかの塩基配列を含む、請求項１３に記載の遺伝子。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
  16. 　請求項１５に記載の組換えDNAを保有する微生物。
  17. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼを含む酵素剤。
  18. 　α-1,4結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖に対して、請求項１～８、１０及び１１のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼを作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
  19. 　α-1,6結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖に対して、請求項９又は１２に記載の改変型α－グルコシダーゼを作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
  20. 　野生型酵素を併用することを特徴とする、請求項１８又は１９に記載のオリゴ糖の製造方法。
  21. 　α-1,4結合を有する2糖以上のオリゴ糖又は多糖に対して、請求項９又は１２に記載の改変型α－グルコシダーゼと野生型酵素を作用させることを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
  22. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変型α－グルコシダーゼ又は請求項１７に記載の酵素剤を含有する医薬組成物、医薬部外品組成物、化粧料組成物、食品組成物又は餌組成物。
  23. 　以下のステップ(i)及び(ii)を含む、改変型α－グルコシダーゼの設計法：
    　(i)変異対象酵素であるα－グルコシダーゼのアミノ酸配列において、以下の(1)～(14)からなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸を特定するステップ：
    　　(1)配列番号１に示すアミノ酸配列の385位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(2)配列番号１に示すアミノ酸配列の491位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(3)配列番号１に示すアミノ酸配列の535位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(4)配列番号１に示すアミノ酸配列の450位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(5)配列番号１に示すアミノ酸配列の534位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(6)配列番号１に示すアミノ酸配列の537位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(7)配列番号１に示すアミノ酸配列の538位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(8)配列番号１に示すアミノ酸配列の554位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(9)配列番号１に示すアミノ酸配列の556位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(10)配列番号２に示すアミノ酸配列の579位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(11)配列番号２に示すアミノ酸配列の585位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(12)配列番号１に示すアミノ酸配列の630位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(13)配列番号１に示すアミノ酸配列の683位アミノ酸に相当するアミノ酸；
    　　(14)配列番号１に示すアミノ酸配列の689位アミノ酸に相当するアミノ酸：
    　(ii)変異対象酵素のアミノ酸配列を基にして、ステップ(i)で特定されたアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
  24. 　α－グルコシダーゼが、ヒト・マルターゼ－グルコアミラーゼ（Human Maltase-glucoamylase）、アスペルギルス・ニガーのα－グルコシダーゼ（Aspergillus niger alpha-glucosidase）、ヒト・ニュートラルα－グルコシダーゼC（Human Neutral alpha-glucosidase C）、マウス・リソソームα－グルコシダーゼ（Mouse Lysosomal alpha-glucosidase）、酵母のα－グルコシダーゼ（Yeast GLU2A）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼA（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA）、アスペルギルス・ニドランスのα－グルコシダーゼB（Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB）、ムコール・ヤバニカスのα－グルコシダーゼ（Mucor javanicus alpha-glucosidase）、アスペルギルス・オリゼのα－グルコシダーゼ（Aspergillus oryzae alpha-glucosidase）、Mortierella alliaceaのα－グルコシダーゼ（Mortierella alliacea alpha-glucosidase）、シゾサッカロミセス・ポンベのα－グルコシダーゼ（Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase）、デバリオミセス・オクシデンタリスのα－グルコシダーゼ（Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase）、大麦のα－グルコシダーゼ（Hordeum vulgare subsp. vulgare alpha-glucosidase）、シロイロナズナのα－グルコシダーゼ（Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase）、ほうれん草のα－グルコシダーゼ（Spinacia oleracea alpha-glucosidase）、砂糖大根のα－グルコシダーゼ（Beta vulgaris alpha-glucosidase）又はジャガイモのα－グルコシダーゼ（Solanum tuberosum alpha-glucosidase）ある、請求項２３に記載の設計法。
  25. 　α－グルコシダーゼが、配列番号１～１７のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の設計法。
  26. 　α－グルコシダーゼが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、ステップ(i)において置換されるアミノ酸が、(1)～(14)の中から選択される一つのアミノ酸、(1)～(14)の中から選択される二つのアミノ酸又は(1)～(14)の中から選択される三つのアミノ酸である、請求項２３に記載の設計法。
  27. 　以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型α－グルコシダーゼの調製法：
    　(I)配列番号１８～４２及び７４～７８のいずれかのアミノ酸配列、又は請求項２３～２６のいずれか一項に記載の設計法によって構築されたアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
    　(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
    　(III)発現産物を回収するステップ。
  28. 　α1,4位特異的又はα1,6位特異的な転移活性を有するα－グルコシダーゼ。
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