WO2012137830A1 - 動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法 - Google Patents

動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012137830A1
WO2012137830A1 PCT/JP2012/059219 JP2012059219W WO2012137830A1 WO 2012137830 A1 WO2012137830 A1 WO 2012137830A1 JP 2012059219 W JP2012059219 W JP 2012059219W WO 2012137830 A1 WO2012137830 A1 WO 2012137830A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
sam
culture
cells
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/059219
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
加藤　幸夫
伊佐雄 平田
真佐美 金輪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University NUC filed Critical Hiroshima University NUC
Priority to JP2013508904A priority Critical patent/JP6011879B2/ja
Priority to EP12768652.5A priority patent/EP2695934B1/en
Priority to US14/009,874 priority patent/US10196610B2/en
Publication of WO2012137830A1 publication Critical patent/WO2012137830A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/20—Small organic molecules

Definitions

  • the present invention relates to an animal cell culture kit, an animal cell culture method, an animal cell selective culture method, and a cell differentiation method.
  • a polystyrene culture dish for tissue culture into which various ionic groups have been introduced by plasma irradiation or the like is widely used.
  • the degree of ionization by introducing ionic groups is not constant, and the surface composition is not chemically defined.
  • the immortal cell lines often proliferate well.
  • adhesion factors such as fibronectin and collagen, partial peptides of adhesion factors, extracellular matrix such as polylysine and basement membrane are used as coating agents. These coating agents are expensive and the effect of culture is limited to limited cells.
  • a serum-containing culture solution to which high-concentration serum is added is used for culturing animal cells.
  • the serum-containing culture solution since serum is a natural component, the serum-containing culture solution has disadvantages such as component indefiniteness, lot-to-lot variation, risk of pathogen contamination, and immune reaction risk. For this reason, when a serum-containing culture solution is used, cell proliferation (differentiation) tends to vary.
  • cell proliferation tends to vary.
  • serum-free cultures are being developed.
  • a serum-free culture solution does not contain an adhesion factor in serum, there is a problem that cells are difficult to adhere / grow when attempting to culture in a normal tissue culture polystyrene culture dish.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Non-patent Document 2 the effect of a combination of two types of functional groups on the short-term proliferation of cancer cells and established (immortalized) cells has been studied.
  • Non-patent Document 3 adhesion of vascular endothelial cells to SAM of RGD peptide has been reported.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 there is no mention of cells (primary cells, stem cells, etc.) other than those containing a functional group that promotes growth and immortalized cell lines more than normal polystyrene culture dishes for tissue culture. .
  • the presence of functional groups that significantly suppress cell adhesion is within the expected range.
  • Non-Patent Document 3 it is natural that the RGD peptide promotes cell adhesion.
  • functional group blended SAMs can bring cells to a higher level than normal culture dishes. There was no result.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned matters.
  • the object of the present invention is to provide an animal cell culture kit, an animal cell culture method, an animal cell selective culture method, and a cell that can be suitably used for animal cell culture. It is to provide a differentiation method.
  • the animal cell culture kit according to the first aspect of the present invention comprises: An incubator having a predetermined ratio of one or more functional groups from the group consisting of a hydrophilic functional group and a hydrophobic functional group on a surface thereof, and a serum-free medium. It is characterized by that.
  • the incubator may include a self-assembled monolayer having the functional groups on the surface at a predetermined ratio.
  • the hydrophilic functional group is a hydroxyl group, an amino group or a carboxyl group
  • the hydrophobic functional group is an alkyl group
  • it may have a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 20:80 to promote adhesion and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
  • amino group: hydroxyl group is 40:60
  • carboxyl group: methyl group is 100: 0-80: 20
  • amino group: methyl group is 20: 80-80: 20
  • amino group: carboxyl group is 40: 60-20 : 80 or hydroxyl group: methyl group in a ratio of 100: 0 to 80:20, and may promote the adhesion and proliferation of primary rat mesenchymal stem cells in a heterogeneous cell population.
  • it may have a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 40:60 and promote adhesion and proliferation of human synovial stem cell derived mesenchymal stem cells.
  • it may have a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 60:40 and promote adhesion and proliferation of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells.
  • the hydroxyl group: carboxyl group has a ratio of 100: 0 to 40:60 or the hydroxyl group: methyl group has a ratio of 80:20 to 20:80 to promote adhesion and proliferation of human fibroblasts.
  • the hydroxyl group: carboxyl group may have a ratio of 100: 0 to 0: 100, or the hydroxyl group: methyl group may have a ratio of 80:20 to 20:80 to promote adhesion and proliferation of rat osteoblasts.
  • it may have a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 40:60 and promote adhesion and proliferation of human primary mesenchymal stem cells.
  • it may have a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 40:60 and promote adhesion and proliferation of human mesenchymal stem cells.
  • the animal cell culture method according to the second aspect of the present invention comprises: Using an incubator having a predetermined ratio of one or more functional groups from the group consisting of hydrophilic functional groups and hydrophobic functional groups on the surface, and a serum-free medium, Promote the adhesion and proliferation of certain animal cells, It is characterized by that.
  • the animal cell selective culture method comprises: Using an incubator having a predetermined ratio of one or more functional groups from the group consisting of hydrophilic functional groups and hydrophobic functional groups on the surface, and a serum-free medium, Promote adhesion and proliferation of certain animal cells selectively from heterogeneous cell populations; It is characterized by that.
  • the animal cell culture method comprises: Serum-containing medium, amino group: hydroxyl group 100: 0-20: 80, hydroxyl group: carboxyl group 80: 20-20: 80, carboxyl group: methyl group 100: 0-60: 40, amino group: methyl group
  • Serum-containing medium amino group: hydroxyl group 100: 0-20: 80, hydroxyl group: carboxyl group 80: 20-20: 80, carboxyl group: methyl group 100: 0-60: 40, amino group: methyl group
  • a culture vessel having 80:20 to 20:80 or amino group: carboxyl group on the surface at a ratio of 80:20 to 20:80. Promote the proliferation of leaf stem cells, It is characterized by that.
  • the cell differentiation method comprises: Human bone marrow mesenchymal stem cells are cultured using a culture vessel having a predetermined ratio of one or more functional groups from the group consisting of hydrophilic functional groups and hydrophobic functional groups on the surface and a serum-free differentiation induction medium.
  • the human bone marrow mesenchymal stem cells are differentiated into chondrocytes or bone cells, It is characterized by that.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells may be differentiated into chondrocytes using the incubator having a hydroxyl group: carboxyl group in a ratio of 100: 0 to 20:80 and a serum-free cartilage differentiation inducing medium. .
  • the human bone marrow mesenchymal stem cells may be differentiated into bone cells using the incubator having a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 20:80 and a serum-free osteogenic differentiation induction medium. Good.
  • the cell differentiation method comprises: Human bone marrow mesenchymal stem cells are cultured using an incubator having a predetermined ratio of one or more functional groups from the group consisting of a hydrophilic functional group and a hydrophobic functional group on a surface and an adipogenic differentiation medium, and the human Differentiating bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes, It is characterized by that.
  • the animal cell culture kit according to the present invention includes an incubator having a functional group suitable for adhesion / proliferation of specific animal cells on its surface, so that it is possible to promote the growth of animal cells even in a serum-free medium.
  • (A) is a schematic diagram of alkanethiol
  • (B) is a schematic diagram of SAM.
  • (A) is a graph showing the composition of functional groups on the prepared SAM surface with respect to the mixing ratio of alkanethiols (NH 2 —SH and OH—SH)
  • (B) is alkanethiols (OH—SH and COOH—
  • (C) is a graph showing the composition of functional groups on the prepared SAM surface with respect to the mixing ratio of (SH)
  • (C) shows the composition of functional groups on the prepared SAM surface with respect to the mixing ratio of alkanethiols (COOH-SH and CH 3 -SH).
  • the graph (D) is a graph showing the composition of the functional group on the surface of the prepared SAM with respect to the mixing ratio of alkanethiol (CH 3 —SH and NH 2 —SH).
  • (A) is a diagram showing the MTT test results after 4-day culture in Experiment 1
  • (B) is a diagram showing the MTT test results after 4-day culture in Experiment 2
  • (C) is the result after 4-day culture in Experiment 3. It is a figure which shows a MTT test result. It is the photograph of the cell after culture
  • (A) is SAM (A1)
  • (B) is SAM (A8)
  • (C) is SAM (A14)
  • (D) is SAM (A20).
  • (A) is SAM (A1)
  • (B) is SAM (A7)
  • (C) is a photograph of SAM (A16).
  • (A) is Control
  • (B) is SAM (B5)
  • (C) is SAM (B8)
  • D) is a photograph of SAM (B13).
  • (A) is a figure which shows the MTT test result after 4-day culture in Experiment 5
  • (B) is a figure which shows the MTT test result after 4-day culture in Experiment 6. It is the photograph of the cell after culture
  • (A) is a figure which shows the MTT test result after 4 days culture
  • (B) is the normal culture in Experiment 1. It is a figure which shows the DNA fixed_quantity
  • (A) shows the MTT test results after 7 days culture in Experiment 11-1
  • (B) shows the MTT test results after 8 days culture in Experiment 11-2
  • (C) shows 8 results in Experiment 12
  • (D) is a figure which shows the MTT test result after 7-day culture
  • (A) is Control
  • (B) is SAM (A6)
  • (C) is SAM (A11), (D) is SAM (A15), (D) is a photograph of cells after 7 days culture in Experiment 11-1.
  • E) is a photograph of SAM (A25).
  • (A) is Control
  • (B) is SAM (A4)
  • (C) is SAM (A11)
  • (D) is SAM (A18)
  • (D) E) is a photograph of SAM (A25). It is the photograph of the cell after 8 days culture
  • (A) is a figure which shows the MTT test result after 4-day culture in Experiment 21
  • (B) is a figure which shows the MTT test result after 14-day culture in Experiment 22. It is the photograph of the cell after culture
  • (A) is a figure which shows the MTT test result after 4-day culture
  • (B) is a figure which shows the MTT test result after 4-day culture
  • Experiment 62 it is the photograph of the cell cultured by SAM (A6), (A) is a 10 times magnified photograph, (B) is a 40 times magnified photograph.
  • Experiment 63 it is the photograph of the cell cultured by SAM (A8), (A) is a 10 times magnified photograph, (B) is a 40 times magnified photograph.
  • Experiment 64 it is the photograph of the cell cultured by SAM (A11), (A) is a 10 times magnified photograph, (B) is a 40 times magnified photograph. It is a photograph of cells cultured in a normal culture dish stained with toluidine blue. It is a photograph of the cells cultured with SAM (A8) stained with toluidine blue.
  • the animal cell culture kit according to the present embodiment includes an incubator and a serum-free medium.
  • the incubator has at least one functional group from the group consisting of a hydrophilic functional group and a hydrophobic functional group at a predetermined ratio on the surface. More specifically, the incubator has self-assembled monolayers (hereinafter referred to as SAM) on the surface.
  • SAM is a form in which one or more functional groups from the group consisting of hydrophilic functional groups and hydrophobic functional groups are exposed on the surface at a predetermined ratio. In this case, one SAM may have two or more different hydrophilic functional groups or hydrophobic functional groups, or may have both of them.
  • the hydrophilic functional group include a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, and a nitro group.
  • hydrophobic functional group examples include an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, and a propyl group, a phenyl group, a cyclohexyl group, a cyclopentyl group, and a fluoro group.
  • alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, and a propyl group, a phenyl group, a cyclohexyl group, a cyclopentyl group, and a fluoro group.
  • the hydrophilic functional group may be a positively charged functional group or a negatively charged functional group.
  • the amino group may be NH 3 + by a proton and the carboxyl group may be COO ⁇ by deprotonation.
  • the SAM can be made as follows. Alkanethiol is dissolved in a solvent such as ethanol to prepare an alkanethiol solution. As shown in the schematic diagram of FIG. 1A, alkanethiol has a thiol group (—SH) at one end of a linear alkyl chain and a methyl group (—CH 3 ) at the other end. It has a hydroxyl group (—OH), an amino group (—NH 2 ), or a carboxyl group (—COOH). The number of carbon atoms in the alkyl chain is not particularly limited, but is 5 to 20.
  • the alkanethiol is bonded to the gold vapor deposition substrate by immersing the gold vapor deposition substrate or the like in the prepared alkanethiol solution.
  • a SAM is formed on a gold vapor deposition substrate. Since the thiol group of alkanethiol specifically binds to gold, and the van der Waals force between the alkyl chains creates a high-density and highly-oriented structure of molecules, a monomolecular film with exposed functional groups on the surface is gold. It is formed on a vapor deposition substrate. An incubator is obtained by installing this gold vapor deposition substrate on a polystyrene culture dish or the like. Alternatively, alkanethiol may be directly bonded using a gold-modified culture dish or the like.
  • SAMs having various functional groups on the surface can be obtained by preparing and using an alkanethiol solution by combining one or more of the above-mentioned various alkanethiols.
  • the surface composition of the SAM is almost the same as the composition of the alkanethiol solution used. Therefore, according to the animal cell to be grown, a culture suitable for the growth of the animal cell is prepared by preparing alkanethiol in which alkanethiol having the above four types of functional groups is dissolved in a solvent at a predetermined ratio to form SAM. A vessel is obtained.
  • Serum-free medium is a medium that does not contain serum and has few unknown factors. For this reason, compared with a serum-containing medium, there are advantages such as that certain performance can be obtained, purification from the medium and subsequent processes are easy, accurate evaluation of cell function is easy, and physiological reactivity is easily controlled.
  • the serum-free medium does not contain serum, there is almost no adhesion factor (substrate adhesive cells) in the serum.
  • adhesion factor substrate adhesive cells
  • the animal cell culture kit according to the present embodiment includes an incubator having a SAM in which various functional groups are exposed at a predetermined ratio, and the surface composition of the incubator is bonded to a predetermined animal cell. It is possible to obtain a surface composition suitable for extension and proliferation. Therefore, even in a serum-free medium, adhesion, extension, and proliferation of predetermined animal cells can be promoted. Furthermore, cell differentiation can also be promoted in stem cells such as mesenchymal stem cells that have the ability to differentiate into cells of multiple lineages.
  • a serum-free medium a commonly used basic medium, for example, an isotonic pH equilibrium solution mixed with salts, amino acids, sugars, vitamins and other trace essential nutrients can be combined. It may be a medium containing an additive.
  • a suitable serum-free medium STK1 (trade name), STK2 (trade name), STK3 (trade name) (all manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) and the like can be mentioned.
  • SAM and serum-free medium suitable for adhesion / proliferation of specific target animal cells from heterogeneous cell populations for example, cell populations in bone marrow fluid
  • heterogeneous cell populations for example, cell populations in bone marrow fluid
  • the SAM is formed on the gold vapor deposition substrate and the incubator in which the SAM is placed on the culture dish has been described.
  • the SAM is formed using gold dormant or gold colloid.
  • it may be a substrate made of metal such as aluminum, titanium, platinum, or silver.
  • SAM may be formed on the surface using an inorganic metal oxide such as aluminum oxide, silicon oxide or titanium oxide, or a ceramic substrate such as glass.
  • a SAM-formed substrate obtained by forming SAM on the surface thereof can be laminated on the culture dish to obtain an incubator.
  • the substrate is not provided with a gold vapor deposition substrate or the like, and the culture dish itself is formed from the above-mentioned material, or the culture dish surface is modified with the above-mentioned material, and the SAM is directly formed on the culture dish surface.
  • An incubator may be used.
  • the culture dish is described as an example of the incubator.
  • the culture dish is not limited to the culture dish as long as animal cells can be cultured.
  • the form which the functional group mentioned above was directly added to the surface may be sufficient, without forming SAM using alkanethiol.
  • the above functional group may be added to the surface of a biomaterial for transplantation.
  • it may be in a form in which a functional group is directly added to a silane coupling method to glass or the like, processing of a titanium surface, or various biomaterial polymers.
  • SAMs having various surface compositions were prepared, and various animal cells and culture media were combined, and the effects of the surface composition of SAMs acting on animal cell adhesion and proliferation were examined.
  • SAM was produced on a gold vapor deposition substrate as follows.
  • 1-dodecanethiol (hereinafter referred to as CH 3 —SH) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • 11-mercapto-1-undecanol (hereinafter referred to as OH-SH)
  • 11-mercapto-1-undecanoic acid hereinafter referred to as COOH-SH
  • 11-amino-1-undecanethiol (hereinafter referred to as NH 2 -SH) (Note) used was made by Sigma-Aldrich Corporation.
  • Alkanethiol (CH 3 —SH, OH—SH, COOH—SH, NH 2 —SH) is added to ethanol deoxygenated with nitrogen gas to a total of 1 mmol / L in various combinations and proportions as shown in Table 1. Then, an alkanethiol solution was prepared.
  • the gold vapor deposition substrate was immersed in the prepared alkanethiol solution for 24 hours, and various SAMs (hereinafter referred to as SAM (A1) to SAM (A28), respectively) were produced on the gold vapor deposition substrate.
  • SAM SAM
  • A28 SAM
  • the prepared SAM was stored in 2-propanol until used for experiments.
  • SAM surface composition analysis The surface elemental composition of the prepared SAMs (A1) to (A20) was determined using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS AXIS-HS, Kratos, Manchester, UK). The measurement was performed under a pressure of 10 ⁇ 7 Pa or less.
  • XPS AXIS-HS X-ray photoelectron spectroscopy
  • the surface of the sample was irradiated under conditions of an acceleration voltage of 15 kV and a filament current of 10 mA, and the elemental composition ratio of carbon and oxygen was measured under the condition of a photoelectron desorption angle of 90 degrees.
  • FIG. 2 (A) shows the ratio of functional groups on the prepared SAM surface to the mixing ratio of NH 2 —SH and OH—SH in the alkanethiol solution
  • FIG. 2 (B) shows OH—SH and COOH in the alkanethiol solution.
  • FIG. 2C shows the ratio of the functional group on the prepared SAM surface to the blending ratio of COOH—SH and CH 3 —SH in the alkanethiol solution
  • FIG. 2D shows the ratio of the functional group on the prepared SAM surface to the blending ratio of CH 3 —SH and NH 2 —SH in the alkanethiol solution.
  • FIG. 2A As the ratio of amino groups to hydroxyl groups in the alkanethiol solution increases, a SAM having a surface outermost layer with a high ratio of amino groups to hydroxyl groups is obtained.
  • FIG. 2B, FIG. 2C, and FIG. 2D show the same tendency when an alkanethiol solution having another functional group at the terminal is mixed.
  • the composition of the functional group on the SAM surface can be adjusted according to the mixing ratio of the alkanethiol to be blended.
  • alkanethiol solutions having the mixing ratios shown in Table 2 were prepared, and various SAMs were prepared in the same manner as described above (hereinafter referred to as SAM (B1) to (B13)) and used in the experiments.
  • STK1 and STK2 are serum-free culture solutions containing human serum albumin, transferrin, and several types of growth factor proteins, but no unknown substances.
  • FBS 10% fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco'S modified Eagle's medium
  • a 24-well microplate 24 Well Cell Culture Microplate diameter 16 mm, Corning Life Sciences, Inc.
  • a normal culture dish or Control is a tissue culture culture dish (with polystyrene plasma treatment).
  • Human bone marrow mesenchymal stem cells (2 strains: R-44, R-81) were isolated from the iliac bone by the method of Igarashi et al. (Igarashi A et al. Tissue Eng, 2007).
  • serum medium A the medium was changed at 37 ° C. under 5% CO 2 while changing the medium every three days.
  • 4th to 7th generation cells were used.
  • the cells were dispersed by incubating with trypsin and EDTA for 5 minutes. Then, the enzyme reaction was stopped with a culture solution containing 10% FBS, and the cells were washed three times with serum-free DMEM. Thereafter, the cells were dispersed in a serum-free culture solution (STK1 or STK2) or serum culture solution A and seeded on SAM.
  • STK1 or STK2 serum-free culture solution
  • Table 3 shows combinations of human bone marrow mesenchymal stem cells (h-BM MSC), culture solution and SAM used in the experiment.
  • the cell proliferation was evaluated by the MTT test by the WST assay (dye: WST-8 (2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H- tetrazolium), measured absorbance: 450 nm).
  • the number of cells was measured with Cell Counting Kit-8 (Wako) using WST-8 or Coulter counter (Coulter).
  • DNA was measured with a PicoGreenDsDNA Quantitation kit (Molecular Probe).
  • FIGS. 9A and 9B are MTT test results after 4-day culture in Experiments 5 and 6 performed using serum culture medium A
  • FIG. 10 is a photograph after 4-day culture in Experiment 5.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells strain R44
  • strain R44 adhered to all SAM compositions (A1) to (A28). Due to the presence of the adhesion factor in the serum, the cells are hardly affected by the SAM composition, and are considered to adhere to all SAMs.
  • the degree of proliferation differs depending on the SAM composition, and the SAMs (A1) to (A5), SAMs (A10) to (A12), and SAMs (A17) to (A24) proliferate remarkably.
  • SAMs (A6) to (A9) that promoted growth in serum-free culture medium suppressed growth in serum culture medium A. It is considered that some serum protein adhered to SAMs (A6) to (A8) and hindered proliferation.
  • FIG. 11 and FIG. 12 show the results of quantification of DNA after 4 days of culture in Experiment 1 and Experiment 5, respectively. MTT test results and DNA quantification results were in agreement.
  • FIG. 13A shows the MTT test results after 4 days of culture of the normal culture dish and SAM (A8) of Experiment 1 and the normal culture dish and SAM (A5) of Experiment 5, and FIG. As shown in B), in serum-free medium, the number of cells and DNA increased 2-3 times on day 4 of culture on SAM (A8) compared to normal culture dishes. I understand.
  • the surface hydroxyl group: carboxyl group ratio is 100: 0 to 0: 100, preferably 80:20 to 20:80, more preferably 70:30 to 60:40, and serum-free. It can be seen that by combining with the culture medium (STK2), adhesion and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells can be promoted even in a serum-free culture medium.
  • STK2 culture medium
  • Bone marrow fluid contains hematopoietic cells, vascular cells, stromal cells, mesenchymal stem cells, and the like. That is, a heterogeneous cell population. Bone marrow mesenchymal stem cells are isolated as fibroblast-like cells that adhere to and propagate in culture dishes in the bone marrow. However, it is difficult to obtain homogeneous bone marrow mesenchymal stem cells in a normal culture dish. Therefore, in this experiment, rat bone marrow fluid was directly seeded on various SAM culture dishes, and the influence of the SAM composition on the adhesion and proliferation of mesenchymal stem cells (fibroblast-like cells) was examined.
  • Bone marrow fluid separated from the left and right femurs and tibias of five male Wistar rats aged 5 weeks was diluted with serum-free alpha MEM to a total of 25 ml (bone marrow dilution).
  • a bone marrow dilution is seeded at 0.06 mL / 16 mm well, and further, STMEM, serum culture medium A, or ⁇ MEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) ⁇ MEM + 10% FBS) was added to make the total culture volume 0.5 ml / well.
  • the culture solution was changed every 3 days from 3 days later and cultured for 7 to 8 days.
  • rat bone marrow mesenchymal stem cells 3 ml of bone marrow dilution is seeded on a 100 mm tissue culture culture dish (Corning), cultured for 8 days, and then subconfluent. Cells dispersed with trypsin and EDTA from each culture system were seeded on various SAM substrates at a cell density of 2000 / cm 2 .
  • the cell morphology observation and cell number evaluation method are the same as in Experiments 1-6.
  • Table 4 shows combinations of cells, culture solution, and SAM used.
  • fibroblast-like cells including mesenchymal stem cells
  • SAM serum-free medium
  • A6 fibroblast-like cells (including mesenchymal stem cells) of rat bone marrow
  • A11 fibroblast-like cells
  • A12 mesenchymal stem cells
  • A17 fibroblast-like cells
  • the surface amino group: hydroxyl group is 40:60
  • carboxyl group: methyl group is 100: 0-80: 20
  • amino group: methyl group is 20: 80-80: 20
  • amino group: carboxyl group 40:60 to 20:80 or a SAM having a hydroxyl group: methyl group of 100: 0 to 80:20 and a serum-free culture solution (STK1), so that even in serum-free culture solution, the primary rat bone marrow It can be seen that adhesion and proliferation of mesenchymal stem cells can be promoted.
  • STK1 serum-free culture solution
  • Human synovial mesenchymal stem cells human osteoarthritis-derived mesenchymal stem cells, also called synovial fibroblasts (2 strains) (h-synovial MSC (S6-P2), h-synovial MSC)) Is available from Cell Applications Inc. Obtained from
  • Human dental pulp mesenchymal stem cells (1 strain) (h-Dental pulp MSC) were separated from the extracted dental pulp tissue fragment of the extracted tooth as a population of cells that migrated and grew (Odontblast Differentiation of Human DulpCults in Explant. .-L. Couple et al., Calcif Tissue Int. 2000).
  • the cell morphology observation and cell number evaluation method are the same as in Experiments 1-6.
  • Table 5 shows combinations of cells, culture medium, and SAM used.
  • serum-free by combining a SAM having a surface hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 40:60, preferably 80:20 to 60:40, and a serum-free culture solution (STK2 or STK1). It can be seen that adhesion and proliferation of human synovial-derived mesenchymal stem cells can be promoted even in the culture medium.
  • FIG. 22 shows the MTT test results after 4 days of culture in Experiment 23, and FIG.
  • the SAM composition that promotes the proliferation of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells (5th generation) was also almost in common with human bone marrow and human synovial stem cells. Therefore, by combining a SAM having a hydroxyl group: carboxyl group ratio of 100: 0 to 60:40 on the surface and a serum-free culture solution (STK2), adhesion of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells can be achieved even in a serum-free medium. It turns out that proliferation can be promoted.
  • STK2 serum-free culture solution
  • Human skin fibroblasts were purchased from Kurabo Corporation (Osaka) and maintained in serum culture medium A as described above.
  • the rat skull-derived osteoblasts, Yoshiko et al's method (A subset of osteoblasts expressing high endogenous levels of PPARgamma switches fate to adipocytes in the rat calvaria cell culture model.
  • male Wistar rat calvaria of embryonic day 21 was digested with collagenase over time, the cells were fractionated into 5 fractions, and the 4 fractions excluding the first fraction (fibroblast fraction) were separately separated with 10% FBS-containing alpha. Cultured in MEM. The next day, these fractions were pooled and cultured in the same culture solution supplemented with ascorbic acid (50 ⁇ g / ml). These cells were grown to near confluence and then passaged with trypsin and EDTA as described above.
  • SAM (A8) and SAM (A27) to (A28) also grew to a medium level, but other compositions did not.
  • the SAM composition in which human fibroblasts proliferate in serum-free cultures partially overlapped the SAM composition in which human mesenchymal stem cells proliferate, but the pattern was different.
  • the ratio of hydroxyl group to carboxyl group on the surface is 100: 0 to 40:60, or the ratio of hydroxyl group: methyl group is 80:20 to 20:80, preferably the ratio of hydroxyl group: carboxyl group is 100. : 0 to 80:20, or a combination of a SAM having a hydroxyl group: methyl group ratio of 80:20 to 60:40 and a serum-free medium (STK2), so that human fibroblasts can be used even in a serum-free medium. It can be seen that the adhesion and proliferation of can be promoted.
  • STK2 serum-free medium
  • FIG. 26 shows the MTT test results after 4 days of culture in Experiment 33 using rat osteoblasts
  • FIG. 27 shows the photographs.
  • Rat osteoblasts had good adhesion to SAM (A6) to (A12) and SAM (A25) to (A28) in the presence of serum-free culture medium (STK2).
  • serum-free culture medium STK2
  • the SAM composition in which osteoblasts proliferate in serum-free culture was different from the pattern of mesenchymal stem cells or fibroblasts.
  • the surface hydroxyl group: carboxyl group ratio is 100: 0 to 0: 100
  • the carboxyl group: methyl group ratio is 80:20
  • the hydroxyl group: methyl group ratio is 80: 20-20: 80.
  • Rat bone marrow mesenchymal stem cells were used after being separated and cultured in the same manner as in Experiments 11-13.
  • FIGS. 28A and 28B show the MTT test results after the 4-day culture in Experiment 41 and 42
  • FIGS. 29A and 29B show the DNA quantification results after the 4-day culture in Experiment 41 and 42.
  • photographs after 4 days of cultivation in Experiment 41 and Experiment 42 are shown in FIGS. 30 and 31, respectively.
  • 2h-4days shows the state of cell adhesion 2 hours after seeding and 4 days after seeding (A) with many adhesions and (F) with many non-adherent cells. That is, some SAMs promoted initial adhesion but did not maintain long-term adhesion or proliferation, and others promoted proliferation as well as initial adhesion. SAM has been shown to affect proliferation as well as adhesion.
  • FIG. 32 shows the MTT test results of Experiment 51, and FIG.
  • serum-free medium STK1
  • SAM serum-free medium
  • FIG. 32 shows the MTT test results of Experiment 51, and FIG.
  • serum-free medium STK1
  • SAM serum-free medium
  • STK1 serum-free medium
  • the results of human bone marrow mesenchymal stem cells in Experiments 1 to 4 are all the same.
  • the cell proliferation is observed in SAM (A6) to (A8). Therefore, if the SAM composition is a ratio of hydroxyl group: carboxyl group of 100: 0 to 60:40, human mesenchyme from other tissues such as fat origin, umbilical cord origin, placenta origin, amnion origin, periosteum, etc. It can also be applied to the adhesion and proliferation of stem cells.
  • Pre-cultured human bone marrow mesenchymal stem cells were dispersed in STK2, seeded at a density of 4000 cells / well in a 16 mm culture dish, and cultured. Further, as a reference example, the culture was performed in the same manner as described above using a combination of a confocal glass petri dish and DMEM + 10% FBS or STK2. Table 9 shows combinations of the culture medium and the culture dish used.
  • the primary antibody and the secondary antibody were added and stained for each, and observed with a confocal laser microscope (FV-1000D, manufactured by Olympus Corporation). The adhesion and extension of mesenchymal stem cells to the culture dish were evaluated.
  • the primary antibody used is Actin Cytoskeleton / Focal Adhesion Staining Kit (Merck MILLIPORE), and the secondary antibody is GOAT ANTI-MOUSE IgG (H & L) FLUORESCEIN CONJUGATED (Takara Bio Inc.).
  • the FBS medium containing serum (Experiment 66) has an adhesion factor, so that the presence of filamentous protrusions and the like is observed, and the cells expand and become large.
  • STK2 is a serum-free medium.
  • the cells did not adhere to the glass petri dish, the presence of filamentous protrusions, etc., and the extension of the cells was not observed.
  • the culture medium was changed to STK2, adipose differentiation induction medium, and STK3 to be differentiated into chondrocytes, adipocytes, and bone cells.
  • a fat differentiation induction medium 1% Antibiotic-Antimycotic, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 10-6 MDex, 0.2 mM Mindomethacin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd), 0.01 mg / ml insulin (WakoPure Chemical Industries, Ltd), 0.5 DMEM supplemented with mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Wako PureChemical Industries, Ltd) was used.
  • the cell was cultured like the above using the normal culture dish (Control) instead of SAM (A8) as a reference example. In each experiment, three samples were performed.
  • FIG. 39 shows a photograph in which cells cultured in a normal culture dish are stained
  • FIG. 40 shows a photograph in which cells cultured in SAM (A8) are stained.
  • Table 11 shows the adhesion state and the amount of cells stained with toluidine blue staining.
  • glycosaminoglycan (GAG) produced when cartilage was formed was measured to verify whether differentiation into chondrocytes was promoted. The result is shown in FIG. Note that, for both SAM (A8) and the normal culture dish, the GAG production amount per culture dish was measured on the 28th day after the medium was changed.
  • GAG was about 60 ng / culture, but in SAM (A8), it was about 160 ng / culture, and GAG was produced nearly three times as compared with the normal culture dish.
  • FIG. 42 shows a photograph in which cells cultured in a normal culture dish are stained
  • FIG. 43 shows a photograph in which cells cultured in SAM (A8) are stained. Table 12 shows the results of visual observation of the amount of stained cells.
  • GPDH Glycerol 3-phosphate dehydrogenase
  • human bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated from the incubator on the surface at a ratio. That is, if human bone marrow mesenchymal stem cells are cultured using a cartilage differentiation induction medium, they can be differentiated into chondrocytes.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated into bone cells.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated into adipocytes.
  • cell differentiation can be performed even in a serum-free medium.
  • the serum-free cartilage differentiation-inducing medium and osteogenesis-inducing medium are not limited, and examples include STK2 and STK3 described above.
  • the culture method is excellent not only for cell proliferation but also for cell differentiation.
  • the animal cell culture kit according to the present invention can promote adhesion and proliferation of specific animal cells even in a serum-free medium containing no adhesion factor, and thus is useful for research and development such as regenerative medicine and biopharmaceuticals.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　動物細胞の培養に好適に用い得る動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法を提供する。本発明に係る動物細胞培養キットは、親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地と、を備える。動物細胞培養キットは、特定の動物細胞の接着・増殖に適した官能基を表面に有する培養器を備えるため、無血清培地でも動物細胞の増殖の促進が可能である。

Description

動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法
　本発明は、動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法に関する。
　動物細胞の培養では、プラズマ照射などで様々なイオン基が導入された組織培養用ポリスチレン培養皿が広く用いられている。しかし、イオン基導入によるイオン化の程度は一定ではなく、表面組成が化学的に規定されていない。このような通常の組織培養用ポリスチレン培養皿でも、不死化した株細胞はよく増殖する場合が多い。
　一方で、組織から分離された初代動物細胞は、不均質な細胞集団であるため、あるいは培養系に馴化していないため、増殖速度が低いことが多い。このため、組織培養用ポリスチレン培養皿を用いた場合では、動物細胞を用いた基礎研究、再生医療、バイオ医薬品などの開発が困難である。また、組織培養用ポリスチレン培養皿では、成長因子やサイトカインが添加されても、目的細胞を選択的に増殖させ難い。あるいは不均質な細胞集団から目的細胞以外の混入細胞を除去できない。そのため再生医療あるいはバイオ医薬などの研究開発が困難である。
　上記の通常の組織培養ポリスチレン培養皿の欠点を補うため、コート剤として、フィブロネクチンやコラーゲンなどの接着因子、接着因子の部分ペプチド、ポリリジン、基底膜などの細胞外基質が使用されている。これらのコート剤は、高価であり、また、培養の効果は限られた細胞に限定的であった。
　また、一般的に、動物細胞の培養には、高濃度の血清が添加された血清含有培養液が用いられる。しかし、血清は天然成分であるため、血清含有培養液では、成分不確定、ロット間のバラツキ、病原体混入リスク、免疫反応リスクなどの欠点がある。このため、血清含有培養液を用いた場合、細胞増殖（分化）にバラツキが生じやすい。これらの欠点を克服するため、無血清培養液が開発されつつある。しかし、無血清培養液には血清中の接着因子が含有されていないため、通常の組織培養用ポリスチレン培養皿で培養しようとすると、細胞が接着／増殖しにくいという問題がある。
　更には、近年、ＮＨ２基やＣＯＯＨ基を添加したプラスチック培養皿も販売されているが、細胞増殖への影響は十分には明らかになっていない。また、一部の研究では、培養皿表面に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を備える培養皿について検討されている。ＳＡＭを構成する官能基３種類の組み合わせ（ＣＨ３／ＯＨ，ＣＨ３／ＣＯＯＨ，ＣＨ３／ＮＨ２）及び配合比を変えて、２－１０％牛胎児血清存在下で、癌細胞や株化（不死化）細胞の接着に及ぼす影響が検討されている（非特許文献１）。
　また、２種類の官能基の組み合わせが癌細胞や株化（不死化）細胞の短期間の増殖に及ぼす影響が検討されている（非特許文献２）。
　また、ＲＧＤペプチドのＳＡＭへの血管内皮細胞の接着について報じられている（非特許文献３）。
Ａｒｉｍａ　Ｙ，Ｉｗａｔａ　Ｈ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：３０７４－３０８２，２００７ Ｆｕｓｅ　Ｙ，　Ｈｉｒａｔａ　Ｉ，　Ｋｕｒｉｈａｒａ　Ｈ，　Ｏｋａｚａｋｉ　Ｍ　；「Ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｎ　ｍｉｘｅｄ　ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｒａｔｉｏｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｙｌ　ｇｒｏｕｐｓ．」；Ｄｅｎｔ　Ｍａｔｅｒ　Ｊ．　２００７　２６（６）：８１４－８１９． Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　１９９８，　１２０：６５４８－６５５５
　しかし、非特許文献１及び非特許文献２では、通常の組織培養用ポリスチレン培養皿以上に増殖を促進する官能基配合や不死化株細胞以外についての細胞（初代細胞、幹細胞など）の言及はない。細胞接着を極端に抑制する官能基が存在するのは予想の範囲内である。また、非特許文献３について、ＲＧＤペプチドが細胞接着を促進するのは当然である。つまり、従来、細胞接着に及ぼす官能基配合の基礎研究があったが、官能基配合ＳＡＭにより、通常培養皿と比較してより高レベルに細胞の増殖をもたらすという産業的な発想や研究および実験結果はなかった。
　また、これまでのＳＡＭの研究では血清が用いられていたが、血清タンパク質はＳＡＭへ接着して、細胞との相互作用に干渉する。したがって、化学的規定化下で培養器表面の官能基配合を至適化できなかった。
　本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、動物細胞の培養に好適に用い得る動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法を提供することにある。
　本発明の第１の観点に係る動物細胞培養キットは、
　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地と、を備える、
　ことを特徴とする。
　また、前記培養器が前記官能基を所定の割合で表面に有する自己組織化単分子膜を備えていてもよい。
　また、前記親水性官能基が水酸基、アミノ基又はカルボキシル基であり、前記疎水性官能基がアルキル基であることが好ましい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を１００：０～８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０～８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０～２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を１００：０～８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０～２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～０：１００、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０～２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～０：１００、或いは、カルボキシル基：メチル基を１００：０～８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
　本発明の第２の観点に係る動物細胞の培養方法は、
　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
　所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
　ことを特徴とする。
　本発明の第３の観点に係る動物細胞の選択培養方法は、
　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
　不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
　ことを特徴とする。
　本発明の第４の観点に係る動物細胞の培養方法は、
　血清含有培地と、アミノ基：水酸基を１００：０～２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０～２０：８０、カルボキシル基：メチル基を１００：０～６０：４０、アミノ基：メチル基を８０：２０～２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０～２０：８０の割合で表面に有する培養器とを用いて、ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
　ことを特徴とする。
　本発明の第５の観点に係る細胞分化方法は、
　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
　ことを特徴とする。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させてもよい。
　また、水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させてもよい。
　本発明の第６の観点に係る細胞分化方法は、
　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用いてヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
　ことを特徴とする。
　本発明に係る動物細胞培養キットは、特定の動物細胞の接着・増殖に適した官能基を表面に有する培養器を備えるため、無血清培地でも動物細胞の増殖の促進が可能である。
（Ａ）はアルカンチオールの模式図、（Ｂ）はＳＡＭの模式図である。 実施例において、（Ａ）はアルカンチオール（ＮＨ２－ＳＨ及びＯＨ－ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフ、（Ｂ）はアルカンチオール（ＯＨ－ＳＨ及びＣＯＯＨ－ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフ、（Ｃ）はアルカンチオール（ＣＯＯＨ－ＳＨ及びＣＨ３－ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフ、（Ｄ）はアルカンチオール（ＣＨ３－ＳＨ及びＮＨ２－ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフである。 （Ａ）は実験１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験２における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｃ）は実験３における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１９）の写真である。 実験２における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２０）の写真である。 実験３における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１６）の写真である。 実験４における４日間培養後の細胞数測定結果を示す図である。 実験４における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ｂ５）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ｂ８）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ｂ１３）の写真である。 （Ａ）は実験５における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験６における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験５における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１５）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２１）の写真である。 実験１における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。 実験５における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。 （Ａ）は実験１における通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ８）と、実験５の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ５）の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験１における通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ８）と、実験５の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ５）の４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。 （Ａ）は実験１１－１における７日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験１１－２における８日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｃ）は実験１２における８日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｄ）は実験１３における７日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験１１－１における７日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１５）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。 実験１１－２における８日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ４）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１８）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。 実験１２における８日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１７）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。 実験１３における７日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ９）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ１９）、（Ｆ）はＳＡＭ（Ａ２８）の写真である。 （Ａ）は実験２１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験２２における１４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験２１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１６）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１８）の写真である。 実験２２で１４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１０）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２２）の写真である。 実験２３における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験２３における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１６）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１８）の写真である。 （Ａ）は実験３１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験３２における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験３１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ２２）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２６）の写真である。 実験３３における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験３３における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。 （Ａ）は実験４１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験４２における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 （Ａ）は実験４１における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図、（Ｂ）は実験４２における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。 実験４１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２５）、（Ｆ）はＳＡＭ（Ａ２８）の写真である。 実験４２における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１６）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２４）、（Ｆ）はＳＡＭ（Ａ２８）の写真である。 実験５１における１４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験５１における１４日間培養した細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ８）の写真である。 実験５２における１４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。 実験６１において、ＳＡＭ（Ａ１）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。 実験６２において、ＳＡＭ（Ａ６）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。 実験６３において、ＳＡＭ（Ａ８）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。 実験６４において、ＳＡＭ（Ａ１１）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。 トルイジンブルー染色した通常培養皿で培養した細胞の写真である。 トルイジンブルー染色したＳＡＭ（Ａ８）で培養した細胞の写真である。 ＧＡＧ産生量の測定結果を示すグラフである。 通常培養皿で培養しオイルレッド０染色した細胞の写真である。 ＳＡＭ（Ａ８）で培養しオイルレッド０染色した細胞の写真である。 ＧＰＤＨ量の測定結果を示すグラフである。 ＡＬＰ活性の測定結果を示すグラフである。
　以下、本実施の形態に係る動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法について説明する。本実施の形態に係る動物細胞培養キットは、培養器及び無血清培地から構成される。
　培養器は表面に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で有する。より具体的には、培養器は表面に自己組織単分子膜（Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）（以下、ＳＡＭと記す）を有する。ＳＡＭは、親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基が所定の割合で表面に露出した形態である。この場合、一つのＳＡＭが、異なる２種以上の親水性官能基又は疎水性官能基を有していてもよく、その両方を有していてもよい。親水性官能基として、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基等を例示され、疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、フェニル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、フルオロ基などが例示される。親水性官能基は正電荷官能基又は負電荷官能基であってもよく、例えば、アミノ基はプロトンによりＮＨ３ ＋に、カルボキシル基は脱プロトンによりＣＯＯ－となっていてもよい。
　ＳＡＭは以下のようにして作製され得る。エタノール等の溶媒にアルカンチオールを溶解し、アルカンチオール溶液を調製する。アルカンチオールは、図１（Ａ）の模式図に示すように、直鎖状のアルキル鎖の一方の末端にチオール基（－ＳＨ）を有し、他方の末端にメチル基（－ＣＨ３）、水酸基（－ＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ２）又はカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有している。アルキル鎖の炭素数について特に制限はないが、５～２０である。
　調製したアルカンチオール溶液に金蒸着基板等を浸漬する等により、金蒸着基板にアルカンチオールを結合させる。図１（Ｂ）に模式的に示すように、金蒸着基板上にＳＡＭが形成される。アルカンチオールのチオール基は金と特異的に結合し、さらにアルキル鎖間のファンデルワールス力によって分子同士が高密度・高配向な構造となるため、表面に官能基が露出した単分子膜が金蒸着基板上に形成する。この金蒸着基板を、ポリスチレン製培養皿等に設置することで培養器が得られる。または、金修飾した培養皿等を用い、直接アルカンチオールを結合させてもよい。
　上記の各種アルカンチオールを１種又は複数種組み合わせてアルカンチオール溶液を調製し用いることで、様々な官能基を表面に有するＳＡＭが得られる。ＳＡＭの表面組成は、用いるアルカンチオール溶液の組成とほぼ同様の組成になる。したがって、増殖させる動物細胞に応じ、上記４種の官能基を有するアルカンチオールを所定の割合で溶媒に溶解させたアルカンチオールを調製しＳＡＭを形成することにより、その動物細胞の増殖に適した培養器が得られる。
　無血清培地は、血清を含有していない培地であり、未知の要因が少ない。このため、血清含有培地に比べ、一定の性能が得られる、培地からの精製及び後続のプロセスが容易、細胞機能の正確な評価が容易、生理的反応性の制御が容易等の利点を有する。
　一方で、無血清培地は血清を含有していないため、血清中の接着因子（基質接着性細胞）がほぼない。細胞増殖の過程では、まず、接着因子が培養皿等に接着し、接着因子を介して細胞が接着し増殖するものと考えられる。したがって、無血清培地には、この接着因子がほとんど存在していないため、細胞の接着、増殖が生じにくい。
　しかしながら、本実施の形態に係る動物細胞培養キットでは、種々の官能基が所定の割合で露出した形態のＳＡＭを有する培養器を備えており、培養器の表面組成を所定の動物細胞の接着、伸展、増殖に適した表面組成とすることが可能である。したがって、無血清培地においても、所定の動物細胞の接着・伸展・増殖を促進することができる。更には、複数系統の細胞に分化できる能力を有する間葉系幹細胞等の幹細胞では、細胞分化も促進され得る。
　無血清培地として、一般的に使用されている基本培地、例えば、塩類、アミノ酸、糖、ビタミン及びその他の微量必須栄養素を混合した等浸透圧性ｐＨ平衡溶液等を組み合わせることができ、基本培地に各種添加剤が含有された培地でもよい。例えば、好適な無血清培地として、ＳＴＫ１（商品名）、ＳＴＫ２（商品名）、ＳＴＫ３（商品名）（いずれもＤＳファーマバイオメディカル社製）等が挙げられる。
　また、本動物細胞培養キットでは、以上の事から、不均質な細胞集団（例えば、骨髄液中の細胞集団）から、目的とする特定の動物細胞の接着・増殖に適したＳＡＭと無血清培地とを組み合わせることで、特定の動物細胞を選択的に接着・増殖させることが可能である。
　また、上記では金蒸着基板にＳＡＭを形成し、これを培養皿に設置した培養器について説明したが、金蒸着基板のほか、金泊や金コロイドを用いてＳＡＭを形成させた基板であってもよく、金のほか、アルミニウム、チタン、白金、銀等の金属等の基板であってもよい。更には、酸化アルミニウム、酸化ケイ素、酸化チタン等の無機金属酸化物やガラス等のセラミックの基板を用い表面にＳＡＭが形成されていてもよい。
　また、培養皿に応じた形状に加工された上記基板を用い、その表面にＳＡＭを形成させて得られたＳＡＭ形成基板を培養皿に積層して培養器を得ることができる。
　また、金蒸着基板等の基板を備えず、培養皿そのものが上記の素材から形成された形態や、培養皿表面が上記の素材で修飾された形態であり、培養皿表面に直接ＳＡＭが形成された培養器でもよい。
　また、上記では、培養器として培養皿を例にとって説明したが、動物細胞の培養が可能なものであれば培養皿に限られることはない。また、アルカンチオールを用いてＳＡＭを形成することなく、上述した官能基が表面に直接的に付加された形態であってもよい。例えば、移植用生体材料などの表面に上記の官能基が付加された形態であってもよい。更には、ガラスなどへのシランカップリング法やチタン表面の加工、或いは、各種生体材料ポリマーなどへ直接的に官能基が付加された形態であってもよい。
　以下、実施例に基づいて種々の動物細胞の増殖に適するＳＡＭ組成について説明する。
　種々の表面組成のＳＡＭを作製し、種々の動物細胞及び培地を組み合わせ、動物細胞の接着・増殖に作用するＳＡＭの表面組成の影響について検証した。
（ＳＡＭの作製）
　まず、以下のようにして金蒸着基板上にＳＡＭを作製した。
　１－ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（以下、ＣＨ３－ＳＨと記す）は和光純薬株式会社製を用いた。１１－ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｕｎｄｅｃａｎｏｌ（以下、ＯＨ－ＳＨと記す），１１－ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（以下、ＣＯＯＨ－ＳＨと記す），１１－ａｍｉｎｏ－１－ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（以下、ＮＨ２－ＳＨと記す）はシグマアルドリッチ株式会社製を用いた。
　金蒸着基板をＰｉｒａｎｈａ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝７：３）を用いて表面を洗浄した。窒素ガスで脱酸素化したエタノールに、アルカンチオール（ＣＨ３－ＳＨ、ＯＨ－ＳＨ，ＣＯＯＨ－ＳＨ，ＮＨ２－ＳＨ）を表１に示すように様々な組み合わせ・割合で、合計１ｍｍｏｌ／Ｌになるように溶解し、アルカンチオール溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　調製したアルカンチオール溶液に、金蒸着基板を２４時間浸漬して、種々のＳＡＭ（以下、それぞれＳＡＭ（Ａ１）～ＳＡＭ（Ａ２８）と記す）を金蒸着基板上に作製した。作製したＳＡＭは、実験に用いるまで２－プロパノール中に保存しておいた。
（ＳＡＭの表面組成解析）
　作製したＳＡＭ（Ａ１）～（Ａ２０）の表面元素組成をＸ－ｒａｙ　ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｏｒｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ　ＡＸＩＳ－ＨＳ，Ｋｒａｔｏｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いて求めた。測定は１０－７Ｐａ以下の圧力下で行った。Ａｌ－Ｋａｐｈａ単色Ｘ線は、加速電圧が１５ｋＶ，フィラメント電流が１０ｍＡの条件で試料表面に照射し、光電子脱離角度が９０度の条件における炭素と酸素の元素組成比を測定した。
　図２（Ａ）にアルカンチオール溶液中のＮＨ２－ＳＨとＯＨ－ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合、図２（Ｂ）にアルカンチオール溶液中のＯＨ－ＳＨとＣＯＯＨ－ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合、図２（Ｃ）にアルカンチオール溶液中のＣＯＯＨ－ＳＨとＣＨ３－ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合、図２（Ｄ）にアルカンチオール溶液中のＣＨ３－ＳＨとＮＨ２－ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合をそれぞれ示す。
　図２（Ａ）を見ると、アルカンチオール溶液中の水酸基に対するアミノ基の割合が高くなるにつれ、水酸基に対するアミノ基の割合が高い表面最外層を有するＳＡＭが得られている。図２（Ｂ）、図２（Ｃ）、図２（Ｄ）を見ると、他の官能基を末端に有するアルカンチオール溶液を混合した場合においても同じ傾向である。このように、配合するアルカンチオールの混合比に応じて、ＳＡＭ表面の官能基の組成を調節することが可能であることがわかる。
　以上のようにして作製したＳＡＭを用い、以下の実験にて動物細胞の培養を行った。
　また、一部の実験では、表２に示す混合比のアルカンチオール溶液を調製し、上記同様に各種ＳＡＭを作製して（以下、ＳＡＭ（Ｂ１）～（Ｂ１３）と記す）実験に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（使用培養液）
　無血清培養液としてＳＴＫ１（商品名）及びＳＴＫ２（商品名）（いずれもＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。なお、ＳＴＫ１及びＳＴＫ２には、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、数種類の成長因子の蛋白質が含有されているが、未知物質は一切含有されていない無血清培養液である。
　また、一部の実験では、参考例として、１０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）（以下、ＦＢＳと記す）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ　ＵＴ，ＵＳＡ）１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）（以下、血清培養液Ａ、或いは、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと記す）を使用した。
　また、一部の実験では、組織培養用培養皿（ポリスチレンのプラズマ処理あり）の２４ｗｅｌｌ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（２４　Ｗｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　直径１６ｍｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）（以下、通常培養皿或いはＣｏｎｔｒｏｌと記す）を使用した。
（実験１～６）
　ＳＡＭ表面の官能基の組み合わせが、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ－ＢＭ　ＭＳＣ）の接着・増殖に及ぼす影響について検証した。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）を適宜ＭＳＣと称する。
（使用細胞）
　ヒト骨髄間葉系幹細胞（２株：Ｒ－４４，Ｒ－８１）は五十嵐らの方法（Ｉｇａｒａｓｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ，２００７）で腸骨から分離した。血清培養液Ａにて、３日毎に培養液交換しながら、３７℃で５％ＣＯ２条件下にて培養した。そして、実験には４－７代目の細胞を使用した。細胞がほぼコンフルエントになるまで増殖した後、トリプシンとＥＤＴＡと５分間インキュベートすることにより細胞を分散した。
　そして１０％ＦＢＳ含有培養液にて酵素反応を停止して、細胞を無血清のＤＭＥＭで３回洗浄した。その後、無血清培養液（ＳＴＫ１又はＳＴＫ２）あるいは血清培養液Ａに細胞を分散させ、ＳＡＭ上に播種した。
（ＳＡＭ上での細胞培養）
　保存しておいたＳＡＭ基板（直径約１５ｍｍ）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水）で３回洗浄後、２４Ｗｅｌｌ　Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｌａｔｅ（浮遊培養用培養皿、プラズマ処置なし、直径約１６ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ社）に設置した。
　予め培養しておいたヒト骨髄間葉系幹細胞を回収後、２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で１培養系あたり０．５ｍＬの細胞懸濁液を播種した。
　実験に用いたヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ－ＢＭ　ＭＳＣ）、培養液及びＳＡＭの組み合わせを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（評価手法）
　細胞を培養後、細胞の状態／形態を位相顕微鏡下で観察して、接着／進展細胞（Ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ，Ａ）と浮遊細胞あるいは弱く接着した球形の細胞（Ｆｌｏａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ，Ｆ）に区分した。
　細胞増殖の評価は、ＷＳＴアッセイによるＭＴＴ試験（色素：ＷＳＴ－８（２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４－ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、測定吸光度：４５０ｎｍ）にて測定した。
　細胞数は、ＷＳＴ-８を用いたＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（Ｗａｋｏ）、あるいはコールターカウンター（コールター社）にて測定した。
　一部の実験では、ＤＮＡをＰｉｃｏＧｒｅｅｎＤｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社）にて測定した。
（結果）
　実験１，２，３の４日間培養後のＭＴＴ試験結果をそれぞれ図３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に、４日間培養後の写真をそれぞれ図４、図５、図６に示している。
　ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｒ４４、Ｒ８１株）は、ドナーの違い、植継ぎ回数（４から７回）に関わらず、ＳＡＭ（Ａ５）～（Ａ１１）に高レベルで接着し、ＳＡＭ（Ａ１２）～（Ａ１３）にも低レベルで接着したが、他の組成のＳＡＭ（Ａ１）～（Ａ４）、（Ａ１４）～（Ａ２８）にはほとんど接着しなかった。
　そして、これらの細胞は、ドナー、継代数に関わらず、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ８）（ＯＨ＝１００からＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０までの配合）でよく増殖し、ＳＡＭ（Ａ９）、ＳＡＭ（Ａ１６）でも増殖したが、他のＳＡＭ組成では増殖しなかった。なお、細胞増殖はＳＡＭ（Ａ７）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝８０：２０）あるいはＳＡＭ（Ａ８）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０）で最大であった。
　次に、ヒト骨髄間葉系幹細胞が接着したＳＡＭ組成（ＯＨ：ＣＯＯＨ）の官能基の割合をより細かくして作製したＳＡＭ（Ｂ１）～（Ｂ１３）を用いて行った実験４の細胞数測定結果を図７に示すとともに、培養した細胞の写真を図８に示す。なお本実験では、コールターカウンターにて細胞数を直接測定した。
　ＳＡＭ（Ｂ５）～ＳＡＭ（Ｂ１１）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６５：３５～３０：７０）で、Ｃｏｎｔｒｏｌに比べて細胞が増殖していることがわかる。そして、ＳＡＭ（Ｂ５）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６５：３５）でヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖が最大となった。
（血清存在下でのＳＡＭの影響）
　図９（Ａ）、（Ｂ）は、血清培養液Ａを用いて行った実験５，６の４日間培養後のＭＴＴ試験結果であり、また、図１０は実験５の４日間培養後の写真であるが、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｒ４４株）はすべてのＳＡＭ組成（Ａ１）～（Ａ２８）に接着した。血清中の接着因子の存在により、細胞がＳＡＭ組成の影響を受けにくく、全てのＳＡＭに接着したものと考えられる。なお、ＳＡＭ組成によって増殖の程度は異なっており、ＳＡＭ（Ａ１）から（Ａ５），ＳＡＭ（Ａ１０）～（Ａ１２），ＳＡＭ（Ａ１７）～（Ａ２４）上で顕著に増殖している。
　注目すべきことに、無血清培養液中での増殖を促進したＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ９）は、血清培養液Ａ中での増殖を抑制している。なんらかの血清蛋白質がＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ８）に接着して、増殖を妨害したものと考えられる。
　また無血清培養液中での接着および増殖を抑制した多くのＳＡＭ組成が、血清培養液Ａ中での増殖を促進した。血清中の接着因子や増殖促進因子がこれらのＳＡＭ組成に結合したと考えられる。つまり、血清存在下と無血清では、細胞の接着／増殖に及ぼすＳＡＭ組成の影響が本質的に異なることが判明した。
　なお、一部の実験（実験１、５）では、ＤＮＡ定量でも増殖を評価した。図１１、図１２に実験１、実験５の４日間培養後のＤＮＡ定量結果をそれぞれ示す。ＭＴＴ試験結果とＤＮＡ定量結果は一致した。
　また、実験１の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ８）と、実験５の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ５）の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１３（Ａ）に、ＤＮＡ定量結果を図１３（Ｂ）にそれぞれ示しているが、無血清培養液中では、ＳＡＭ（Ａ８）上で、通常培養皿に比較して細胞数とＤＮＡが培養４日目で２～３倍に増加していることがわかる。
　以上の実験結果から、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～０：１００、好ましくは、８０：２０～２０：８０、より好ましくは７０：３０～６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。
（実験１１～１３）
　ラット初代間葉系幹細胞（ｒａｔ－ｐｒｉｍａｒｙ　ＭＳＣ）の接着・増殖に及ぼすＳＡＭ表面の官能基配合の影響について検証した。
　骨髄液には造血系細胞、血管系細胞、間質細胞、間葉系幹細胞などが存在する。すなわち不均質な細胞集団である。骨髄間葉系幹細胞は、骨髄中の培養皿に接着・進展する線維芽細胞様細胞として分離される。しかし通常培養皿では、均質な骨髄間葉系幹細胞を得ることが困難である。そこで、本実験では、ラット骨髄液を直接各種のＳＡＭ培養皿に播種して、間葉系幹細胞（線維芽細胞様細胞）の接着と増殖に及ぼすＳＡＭ組成の影響を検討した。
　５匹の生後５週目の雄性Ｗｉｓｔａｒラットの左右の大腿骨と脛骨から分離した骨髄液を無血清のａｌｐｈａ　ＭＥＭにて稀釈して計２５ｍｌ（骨髄稀釈液）とした。
　そして各種ＳＡＭ基板を装着した培養皿に、骨髄稀釈液を０．０６ｍＬ／１６ｍｍ　ｗｅｌｌで播種し、さらにＳＴＫ１、血清培養液Ａ、又は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ（以下、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと記す）を追加して培養液の総量を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌとした。
　培養液は３日後より３日毎に交換して７～８日間培養した。
　なお、２代目以降のラット骨髄間葉系幹細胞を得るためには、３ｍｌの骨髄稀釈液を１００ｍｍ組織培養用培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種して、８日間培養して、その後サブコンフルエントになった培養系からトリプシンとＥＤＴＡにて分散した細胞を、２０００／ｃｍ２の細胞密度で、各種のＳＡＭ基板に播種した。
　細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１～６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（結果）
　実験１１では７日間培養、及び、８日間培養を行いそれぞれについて評価を行った。以下では、実験１１の７日間培養について実験１１－１、８日間培養について実験１１－２と記す。実験１１－１の７日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ａ）に、実験１１－２の８日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ｂ）に、実験１２の８日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ｃ）に、実験１３の７日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ｄ）に示す。また、実験１１－１の７日間培養後の写真を図１５に、実験１１－２の８日間培養後の写真を図１６に、実験１２の８日間培養後の写真を図１７に、実験１３の７日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１８に示す。
　無血清培養液ＳＴＫ１存在下で、ラット骨髄の線維芽細胞様細胞（間葉系幹細胞を含む）は、異なるグループとして、ＳＡＭ（Ａ４），（Ａ６），（Ａ１１），（Ａ１２），（Ａ１７）～（Ａ２０），（Ａ２３）～（Ａ２５）上で増殖した。しかも培養７～８日目では、通常培養皿に比較して７～１１倍もの細胞数が得られた。ＳＡＭ接着性の違いを利用して、骨髄の線維芽細胞様細胞（間葉系幹細胞）の分画が可能である。
　なお、血清培養液Ａ或いはαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ存在下でも、いくつかのＳＡＭで、通常培養皿以上の増殖の亢進が観察された。血清存在下と無血清条件下では、ラット骨髄線維芽細胞様細胞（間葉系幹細胞）の増殖のパターンは異なっていることがわかる。
　以上の実験結果から、表面のアミノ基：水酸基が４０：６０、カルボキシル基：メチル基が１００：０～８０：２０、アミノ基：メチル基が２０：８０～８０：２０、アミノ基：カルボキシル基が４０：６０～２０：８０、或いは、水酸基：メチル基が１００：０～８０：２０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ１）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、初代のラット骨髄間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。
（実験２１～２３）
　各種組織由来の間葉系幹細胞の接着と増殖に及ぼすＳＡＭ表面の官能基配合の影響について検証した。
　ヒト滑膜由来間葉系幹細胞（ヒトの変形性関節症由来の間葉系幹細胞、滑膜線維芽細胞とも呼ばれる（２株）（ｈ－ｓｙｎｏｖｉａｌ　ＭＳＣ（Ｓ６－Ｐ２）、ｈ－ｓｙｎｏｖｉａｌ　ＭＳＣ））は、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．から入手した。
　ヒト歯髄間葉系幹細胞（１株）（ｈ－Ｄｅｎｔａｌ　ｐｕｌｐ　ＭＳＣ）は、抜歯した智歯の歯髄組織細片より遊走、成長する細胞集団として分離した（Ｏｄｏｎｔｂｌａｓｔ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｐｕｌｐ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｅｘｐｌａｎｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．　Ｍ．－Ｌ．Ｃｏｕｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔ．２０００）。
　これらの細胞は血清培養液Ａにて、３日毎に培養液交換しながら、３７℃で５％ＣＯ２条件下にて培養した。植継ぎのためには、サブコンフルエントになった培養系をトリプシンとＥＤＴＡと５分間インキュベートした。そして１０％ＦＢＳ含有培養液にて酵素反応を停止して、その後遠心して細胞を無血清のＤＭＥＭで３回洗浄した。そしてＳＴＫ２あるいはＳＴＫ１で懸濁した細胞をＳＡＭ培養皿に実験２１、２３では２０００／ｃｍ２、実験２２では５００／ｃｍ２の細胞密度で播種して、４－１４日間培養した。
　細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１～６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（結果）
　実験２１のＭＴＴ試験結果を図１９（Ａ）に、実験２２のＭＴＴ試験結果を図１９（Ｂ）にそれぞれ示すとともに、実験２１の４日間培養後の写真を図２０に、実験２２の１４日間培養後の写真を図２１にそれぞれ示す。
　ヒト滑膜由来間葉系幹細胞（２代目）は、ドナーの違い、無血清培養液（ＳＴＫ２あるいはＳＴＫ１）の種類の違いに関わらず、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ９）によく接着し、ＳＡＭ（Ａ１０），（Ａ１１）にも接着したが、他の組成のＳＡＭには接着しなかった。
　そして、これらの細胞は、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ８）、（ＯＨ＝１００からＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０の配合比）でよく増殖し、ＳＡＭ（Ａ９）でも増殖したが、他の組成では増殖しなかった。
　なお最大の細胞増殖はＳＡＭ（Ａ７）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝８０：２０）あるいはＳＡＭ（Ａ８）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０）で観察された。そして、図１９（Ｂ）に示すように、通常培養皿よりも７倍の細胞数が得られた。この結果は、ヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖を促進するＳＡＭ組成とほぼ一致した。
　したがって、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～４０：６０、好ましくは、８０：２０～６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２あるいはＳＴＫ１）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。
　また、実験２３の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図２２に、写真を図２３に示す。ヒト歯髄由来間葉系幹細胞（５代目）の増殖を促進するＳＡＭ組成も、ヒト骨髄およびヒト滑膜由来間葉系幹細胞とほとんど共通していた。したがって、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培地中でも、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。
（実験３１～３３）
　ヒト線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびラット骨芽細胞（ｒａｔ－Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の接着と増殖に及ぼす培養皿表面の官能基配合の影響について検証した。
　ヒト皮膚線維芽細胞はクラボー社（大阪）から購入して、上記のように血清培養液Ａにて維持した。
　ラット頭蓋骨由来骨芽細胞は、吉子らの方法（Ａ　ｓｕｂｓｅｔ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｈｉｇｈ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＰＰＡＲｇａｍｍａ　ｓｗｉｔｃｈｅｓ　ｆａｔｅ　ｔｏ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｃａｌｖａｒｉａ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｏｄｅｌ．　Ｙｏｓｈｉｋｏ　Ｙ，Ｏｉｚｕｍｉ　Ｋ，Ｈａｓｅｇａｗａ　Ｔ，Ｍｉｎａｍｉｚａｋｉ　Ｔ，Ｔａｎｎｅ　Ｋ，Ｍａｅｄａ　Ｎ，Ａｕｂｉｎ　ＪＥ．　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１０　５（７）：ｅ１１７８２．）で分離した。
　すなわち胎生２１日の雄性Ｗｉｓｔａｒラット頭蓋冠を経時的にコラゲナーゼで消化し、細胞を５分画し、最初の分画（線維芽細胞分画）を除く４分画を別々に１０％ＦＢＳ含有ａｌｐｈａ　ＭＥＭにて培養した。翌日、これらの分画をプールし、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を添加した同培養液で培養した。これらの細胞はほぼコンフルエントまで増殖した後で、上記のようにトリプシンとＥＤＴＡにて植継いだ。
　細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１～６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表６に示す。なお、これらの細胞は培養皿に２０００／ｃｍ２の細胞密度で播種して培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（結果）
　実験３１のＭＴＴ試験結果を図２４（Ａ）に、実験３２のＭＴＴ試験結果を図２４（Ｂ）にそれぞれ示すとともに、実験３１の４日間培養後の写真を図２５に示す。
　図２４（Ａ）を見ると、無血清培養液（ＳＴＫ２）存在下で、ヒト線維芽細胞は、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ９）とＳＡＭ（Ａ２５）～ＳＡＭ（Ａ２８）によく接着した。そして、ＳＡＭ（Ａ６）～ＳＡＭ（Ａ７）、（ＯＨ＝１００からＯＨ：ＣＯＯＨ＝８０：２０）およびＳＡＭ（Ａ２５）～ＳＡＭ（Ａ２６）（ＯＨ：ＣＨ３＝８０：２０からＯＨ：ＣＨ３＝６０：４０）で最もよく増殖した。
　これらのＳＡＭ組成上では、４日以内に、通常培養皿より２倍以上の細胞数が得られた。なお、ＳＡＭ（Ａ８）とＳＡＭ（Ａ２７）～（Ａ２８）でも中レベルに増殖したが、他の組成では増殖しなかった。無血清培養液で、ヒト線維芽細胞が増殖するＳＡＭ組成は、ヒト間葉系幹細胞が増殖するＳＡＭ組成は部分的に重複していたが、パターンは異なっていた。
　以上のことから、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～４０：６０、或いは、水酸基：メチル基の割合が８０：２０～２０：８０、好ましくは、水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～８０：２０、或いは、水酸基：メチル基の割合が８０：２０～６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト線維芽細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。
　なお、血清培養液Ａにて培養すると、ヒト線維芽細胞は、ＳＡＭ（Ａ６），（Ａ１４）～（Ａ１６）、（Ａ２５）、（Ａ２６）以外の配合では接着増殖した。とくにＳＡＭ（Ａ１）～（Ａ５），（Ａ８），（Ａ１７），（Ａ２０）～（Ａ２４）ではよく接着して通常培養皿以上に増殖した。また血清培養液Ａを使用すると、各種ＳＡＭ上でのヒト線維芽細胞の増殖パターンはヒト骨髄間葉系幹細胞とラット骨髄間葉系幹細胞と類似していた。つまり血清存在下では、細胞の種類や動物種を区別することができなかった。
　また、ラット骨芽細胞を用いた実験３３の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図２６に、写真を図２７に示す。ラット骨芽細胞は、無血清培養液（ＳＴＫ２）存在下で、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ１２）とＳＡＭ（Ａ２５）～（Ａ２８）に接着よくした。そして、すべてのＳＡＭ組成で通常培養皿以上の細胞増殖が観察された。特にＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ７）、ＳＡＭ（Ａ１０）～（Ａ１１）およびＳＡＭ（Ａ２５）～（Ａ２８）（ＯＨ：ＣＨ３＝８０：２０からＯＨ：ＣＨ３＝２０：８０）で最もよく増殖した。無血清培養液で、骨芽細胞が増殖するＳＡＭ組成は、間葉系幹細胞あるいは線維芽細胞のパターンとは異なっていた。
　以上の結果から、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～０：１００、カルボキシル基：メチル基の割合が８０：２０、或いは、水酸基：メチル基の割合が８０：２０～２０：８０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ラット骨芽細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。
（実験４１～４２）
　ラット骨髄間葉系幹細胞（ｒａｔ－ＢＭ　ＭＳＣ）の接着と増殖に及ぼす培養皿表面の官能基配合の影響について検証した。
　ラット骨髄間葉系幹細胞は、実験１１～１３と同様の手法で分離、培養して用いた。
　細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１～６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（結果）
　実験４１及び実験４２の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図２８（Ａ）、（Ｂ）に、実験４１及び実験４２の４日間培養後のＤＮＡ定量結果を図２９（Ａ）、（Ｂ）に、実験４１及び実験４２の４日間培養後の写真を図３０、図３１にそれぞれ示す。
　ＭＴＴ試験結果とＤＮＡ定量結果とはほぼ同じ傾向であることがわかり、無血清培養液（ＳＴＫ２）存在下では、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ１１）でラット骨髄間葉系幹細胞の顕著な増殖が見られる。表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～０：１００、カルボキシル基：メチル基の割合が１００：０～８０：２０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培地中でも、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。なお、図２８中の２ｈ－４ｄａｙｓは播種２時間後および４日後での細胞接着の状態を接着が多いもの（Ａ）、非接着細胞が多いもの（Ｆ）を示している。つまりＳＡＭによっては初期接着を促進したものの長期的な接着あるいは増殖を維持しなかったもの、初期接着のみならず増殖を促進したものなどが存在した。ＳＡＭは接着のみならず増殖にも影響することが示された。
（実験５１、５２）
　ヒト初代間葉系幹細胞（ｈ－ｐｒｉｍａｒｙ　ＭＳＣ）の接着と増殖に及ぼす培養皿表面の官能基配合の影響について検証した。
　ヒト初代骨髄間葉系幹細胞は、広島大学倫理委員会の許可のもとで、腸骨の骨髄液から得た（Ｋｕｂｏ　Ｈ，　Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｍ，　Ｔａｙａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　ｔｏ　Ｃｅｌｌｓ　２００９，１４：４０７－４２４）。
　ヒト骨髄の単核球画分（Ｒ８２株）をＳＴＫ１培地で稀釈して、各１６ｍｍ培養皿に有核細胞７万個／ｃｍ２の細胞密度になるように０．５ｍＬの細胞浮遊液を播種して、播種３日後に０．２５ｍＬのＳＴＫ１を追加した。そして３日毎に０．５ｍＬのＳＴＫ１にて培地交換した。そして播種から１４日目に細胞の写真撮影をしてから、培養液にＷＳＴ－８試薬を追加し、ＭＴＴ　ａｓｓａｙを行った。また、ヒト骨髄液（Ｒ８３株）をそのまま用いた以外は上記と同様にして播種し、ＭＴＴ　ａｓｓａｙを行った。
　細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１～６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（結果）
　実験５１のＭＴＴ試験結果を図３２に、培養後の写真を図３３にそれぞれ示す。無血清培養液（ＳＴＫ１）存在下では、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ１１）でヒト初代間葉系幹細胞の顕著な増殖が見られる。表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０～４０：６０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ１）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト初代間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。
　また、実験５２のＭＴＴ試験結果を図３４に示す。骨髄液を培養した場合、コントロールではほとんど増殖が見られなかったが、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ９）では、顕著に増殖した。
　また、実験１～４におけるヒト骨髄間葉系幹細胞の結果、実験２１、２２におけるヒト滑膜由来間葉系幹細胞の結果、実験２３におけるヒト歯髄間葉系幹細胞の結果を見ると、いずれも同様の傾向を示しており、ＳＡＭ（Ａ６）～（Ａ８）で細胞の増殖が見られる。このことから、ＳＡＭ組成が水酸基：カルボキシル基が１００：０～６０：４０の割合であれば、他の組織、例えば、脂肪由来、臍帯由来、胎盤由来、羊膜由来、骨膜由来など、ヒト間葉系幹細胞の接着、増殖にも適用可能である。
（実験６１～６７）
　続いて、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ－ＢＭ　ＭＳＣ）の培養皿表面への接着、伸展性等について検証した。
　予め培養しておいたヒト骨髄間葉系幹細胞をＳＴＫ２に分散させ、１６ｍｍ培養皿に４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し培養した。また、参考例として、共焦点ガラスシャーレとＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ或いはＳＴＫ２との組み合わせで上記同様に培養した。用いた培養液と培養皿との組み合わせを表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　培養を開始して３時間後及び２４時間後に、それぞれについて、一次抗体及び二次抗体を添加して染色し、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ－１０００Ｄ、株式会社オリンパス製）にて観察し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の培養皿への接着や伸展等を評価した。用いた一次抗体は、Actin Cytoskeleton / Focal Adhesion Staining Kit（Merck MILLIPORE社製）、二次抗体は、GOAT ANTI-MOUSE IgG (H&L) FLUORESCEIN CONJUGATED（タカラバイオ株式会社製）である。
　図３５～図３８に、ＳＡＭ（Ａ１）、（Ａ６）、（Ａ８）、（Ａ１１）の写真を示す。また、それぞれの観察の結果、糸状突起、葉状突起、接着斑及びストレスファイバーの有無、並びに、細胞の大きさ及び形状の評価を表１０に示す。評価は以下の指標にて行った。
　ｄ：脱着或いは浮遊細胞
　Ｓ：小細胞
　Ｌ：大細胞
　Ｒ：丸まって伸展していない形状
　Ｆ：扁平し伸展した形状
　－：存在していない
　±：存否の判断不能
　＋：存在している
　＋＋：多く存在している
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　共焦点用ガラスシャーレに関し、血清を含有するＦＢＳ培地（実験６６）では、接着因子を有するので、糸状突起等の存在が見られ、細胞が伸展し大きくなっているが、無血清培地であるＳＴＫ２（実験６７）では、細胞がガラスシャーレに接着せず、糸状突起等の存在がなく細胞の伸展等も見られなかった。
　一方、実験６２、６３のＳＡＭ（Ａ６）、（Ａ８）では、接着因子を有さない無血清培地であるＳＴＫ２であっても、糸状突起等が多く存在し、細胞が伸展し大きくなっている。細胞とＳＡＭ（Ａ６）、（Ａ８）との相互作用が活発であり、細胞がＳＡＭ表面に良好に接着するとともに伸展も促進され、これにより細胞の増殖も促進され得ることがわかる。
（実験７１）
　続いて、ＳＡＭ（Ａ８）を用い、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ－ＢＭ　ＭＳＣ）の軟骨細胞、脂肪細胞および骨細胞への分化について検証した
　予め培養しておいたヒト骨髄間葉系幹細胞を回収後、１６ｍｍ培養皿に４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し培養した。なお、培養液としてＳＴＫ２を用いた。
　ヒト骨髄間葉系幹細胞がコンフルエントに達するまで増殖した後、軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞へ分化させるべく培養液をそれぞれＳＴＫ２、脂肪分化誘導培地、ＳＴＫ３に交換して培養した。脂肪分化誘導培地として、1% Antibiotic-Antimycotic，10% FBS，2mM L-glutamine，10-6MDex，0.2mMindomethacin（Wako Pure Chemical Industries, Ltd），0.01mg/ml insulin（WakoPureChemical Industries, Ltd），0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine（Wako PureChemicalIndustries, Ltd）を添加したDMEMを用いた。また、それぞれについて、参考例としてＳＡＭ（Ａ８）の代わりに通常培養皿（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて上記同様に細胞を培養した。なお、いずれの実験においても、３検体ずつ行った。
（軟骨細胞への分化の検証）
　培地をＳＴＫ２に交換後、顕微鏡で経時的に観察し、培養皿への細胞の接着状態を観察した。また、トルイジンブルー染色（Toluidine blue staining）を行い、軟骨細胞に分化しているか否かを検証した。
　図３９に、通常培養皿で培養した細胞を染色した写真、図４０に、ＳＡＭ（Ａ８）で培養した細胞を染色した写真をそれぞれ示す。また、表１１に接着状態及びトルイジンブルー染色で染色された細胞の量について示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　通常培養皿では、培地交換して６日後に細胞が培養皿から脱離した。一方、ＳＡＭ（Ａ８）では、細胞が培養皿に接着した状態を保っていた。このため、トルイジンブルー染色は、ＳＡＭ（Ａ８）では培地交換して２９日目、一方の通常培養皿では培地交換して６日後に細胞が培養皿から脱離したため、６日後に行ったものである。トルイジンブルー染色の結果、ＳＡＭ（Ａ８）では、多くの細胞が染色されており、軟骨細胞に分化していることがわかる。
　更に、軟骨が形成された際に産生されるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｏｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｕｃａｎ：ＧＡＧ）の産生量を測定し、軟骨細胞への分化が促進されているかについて検証した。その結果を図４１に示す。なお、ＳＡＭ（Ａ８）及び通常培養皿ともに、培地交換して２８日目に、培養皿あたりのＧＡＧ産生量を測定した。
　通常培養皿では、ＧＡＧは約６０ｎｇ／ｃｕｌｔｕｒｅであったが、ＳＡＭ（Ａ８）では、約１６０ｎｇ／ｃｕｌｔｕｒｅであり、通常培養皿に比べて３倍近くＧＡＧが産生されていた。
　これらの結果から、ＳＡＭ（Ａ８）でヒト骨髄間葉系幹細胞を培養すると、軟骨細胞への分化が促進されることがわかった。
（脂肪細胞への分化の検証）
　脂肪分化誘導培地に交換した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察し、培養皿への細胞の接着状態を観察するとともに、オイルレッドＯ（Oil red O staining）染色により、軟骨細胞に分化しているか否かを検証した。図４２に、通常培養皿にて培養した細胞を染色した写真、図４３に、ＳＡＭ（Ａ８）にて培養した細胞を染色した写真をそれぞれ示す。また、表１２に染色された細胞の量を目視で観察した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ＳＡＭ（Ａ８）にて培養した場合、通常培養皿にて培養した場合に比べ、多くの細胞が染色されていることがわかる。
　また、脂肪細胞にて発現するＧＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）量を測定した。その結果を図４４に示す。通常培養皿に比べ、ＳＡＭ（Ａ８）ではＧＰＤＨ量が多いことがわかる。これらの結果から、ヒト骨髄間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化していることが分かった。
（骨細胞への分化の検証）
　ＳＴＫ３に交換した後、骨細胞に発現するＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性を測定した。なお、本実験では、通常培養皿とＳＴＫ３とを組み合わせた参考例のほか、他の参考例として、通常培養皿とＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳとの組み合わせ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）についても行った。
　ＡＬＰ活性測定の結果を図４５に示す。通常培養皿に比べ、ＳＡＭ（Ａ８）ではＡＬＰ活性が高いことがわかる。この結果から、ヒト骨髄間葉系幹細胞が骨細胞に分化していることが分かった。
　なお、細胞分化は、幹細胞が培養器等に接着、増殖するとともに、適切な分化誘導培地を用いれば生じ得る。それゆえ、実験１～４にて、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖が良好であったＳＡＭ（Ａ６）～ＳＡＭ（Ａ１０）、即ち、水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で表面に有する培養器についても、実験７１同様、ヒト骨髄間葉系幹細胞を分化させ得る。すなわち、軟骨分化誘導培地を用いてヒト骨髄間葉系幹細胞を培養すれば軟骨細胞へと分化させ得る。また、骨形成誘導培地を用いればヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞へと分化させ得る。また、脂肪分化誘導培地を用いればヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞へと分化させ得る。ここで、軟骨分化誘導培地及び骨形成誘導培地については、無血清の培地であっても細胞分化させ得る。無血清の軟骨分化誘導培地及び骨形成誘導培地はそれぞれ制限されるものではなく、一例として上述したＳＴＫ２及びＳＴＫ３がそれぞれ挙げられる。そして、本発明に係る培養器と分化誘導培地を用いて細胞分化させると、通常の培養皿を用いた場合に比べて、多くの細胞が分化しており、本発明に係る培養器を用いた培養方法は細胞の増殖だけでなく、細胞分化に対しても優れていることがわかる。
　なお、本発明は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
　本出願は、２０１１年４月５日に出願された日本国特許出願２０１１－０８４１１９号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１１－０８４１１９号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明に係る動物細胞培養キットでは、接着因子が含有されていない無血清培地でも、特定の動物細胞の接着・増殖を促進できるので、再生医療やバイオ医薬などの研究開発に有用である。

Claims (19)

  1. 　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地と、を備える、
    　ことを特徴とする動物細胞培養キット。
  2. 　前記培養器が前記官能基を所定の割合で表面に有する自己組織化単分子膜を備える、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の動物細胞培養キット。
  3. 　前記親水性官能基が水酸基、アミノ基又はカルボキシル基であり、前記疎水性官能基がアルキル基である、
    　ことを特徴とする請求項１又は２に記載の動物細胞培養キット。
  4. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  5. 　アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を１００：０～８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０～８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０～２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を１００：０～８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  6. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  7. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  8. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０～２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  9. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～０：１００、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０～２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  10. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～０：１００、或いは、カルボキシル基：メチル基を１００：０～８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  11. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  12. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
    　ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
  13. 　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
    　所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
    　ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
  14. 　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
    　不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
    　ことを特徴とする動物細胞の選択培養方法。
  15. 　血清含有培地と、アミノ基：水酸基を１００：０～２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０～２０：８０、カルボキシル基：メチル基を１００：０～６０：４０、アミノ基：メチル基を８０：２０～２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０～２０：８０の割合で表面に有する培養器とを用いて、ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
    　ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
  16. 　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
    　ことを特徴とする細胞分化方法。
  17. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる、
    　ことを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化方法。
  18. 　水酸基：カルボキシル基を１００：０～２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させる、
    　ことを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化方法。
  19. 　親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用いてヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
    　ことを特徴とする細胞分化方法。
PCT/JP2012/059219 2011-04-05 2012-04-04 動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法 Ceased WO2012137830A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013508904A JP6011879B2 (ja) 2011-04-05 2012-04-04 動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法
EP12768652.5A EP2695934B1 (en) 2011-04-05 2012-04-04 Animal cell culture kit, method for culturing animal cells, method for selective culture of animal cells and cell differentiation method
US14/009,874 US10196610B2 (en) 2011-04-05 2012-04-04 Animal cell culture kit, method for culturing animal cells, method for selective culture of animal cells and cell differentiation method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011084119 2011-04-05
JP2011-084119 2011-04-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012137830A1 true WO2012137830A1 (ja) 2012-10-11

Family

ID=46969224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/059219 Ceased WO2012137830A1 (ja) 2011-04-05 2012-04-04 動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10196610B2 (ja)
EP (1) EP2695934B1 (ja)
JP (1) JP6011879B2 (ja)
WO (1) WO2012137830A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015082908A1 (en) * 2013-12-02 2015-06-11 Medway School Of Pharmacy Self-assembled monolayer
JP2020500588A (ja) * 2016-12-12 2020-01-16 カール クリストフ 関節での新規組織形成のための関節インプラント
JP2021003084A (ja) * 2019-06-27 2021-01-14 国立大学法人山口大学 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006093207A1 (ja) * 2005-03-02 2006-09-08 National University Corporation Hokkaido University 細胞の分化／増殖を制御するための基材
JP2009216483A (ja) * 2008-03-10 2009-09-24 Kyushu Univ 混合ｓａｍの作製方法
JP2010029186A (ja) * 2008-07-25 2010-02-12 Becton Dickinson & Co 規定細胞培養表面及び使用方法
WO2010033925A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide-presenting surfaces for long-term culture of pluripotent cells
JP2010166901A (ja) * 2008-12-24 2010-08-05 Institute Of Physical & Chemical Research 卵膜由来細胞の細胞外マトリクスを用いた多能性幹細胞の培養方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006093207A1 (ja) * 2005-03-02 2006-09-08 National University Corporation Hokkaido University 細胞の分化／増殖を制御するための基材
JP2009216483A (ja) * 2008-03-10 2009-09-24 Kyushu Univ 混合ｓａｍの作製方法
JP2010029186A (ja) * 2008-07-25 2010-02-12 Becton Dickinson & Co 規定細胞培養表面及び使用方法
WO2010033925A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide-presenting surfaces for long-term culture of pluripotent cells
JP2010166901A (ja) * 2008-12-24 2010-08-05 Institute Of Physical & Chemical Research 卵膜由来細胞の細胞外マトリクスを用いた多能性幹細胞の培養方法

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARIMA Y; IWATA H., BIOMATERIALS, vol. 28, 2007, pages 3074 - 3082
FAUCHEUX, N ET AL.: "The dependence of fibrillar adhesions in human fibroblasts on substratum chemistry", BIOMATERIALS, vol. 27, no. 2, 2006, pages 234 - 245, XP005071169 *
FUSE Y; HIRATA I; KURIHARA H; OKAZAKI M: "Cell adhesion and proliferation patterns on mixed self-assembled monolayers carrying various ratios of hydroxyl and methyl groups", DENT MATER J., vol. 26, no. 6, 2007, pages 814 - 819
IGARASHI A ET AL., TISSUE ENG., 2007
J AM CHEM SOC, vol. 120, 1998, pages 6548 - 6555
KUBO H; SHIMIZU M; TAYA Y ET AL., GENE TO CELLS, vol. 14, 2009, pages 407 - 424
M. L. COUBLE ET AL.: "Odontoblast Differentiation of Human Dental Pulp Cells in Explant Cultures", CALCIF. TISSUE INT., 2000
ROBERTS, C. ET AL.: "Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG)30H groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces", J. AM. CHEM. SOC., vol. 120, no. 26, 8 July 1998 (1998-07-08), pages 6548 - 6555, XP002928821 *
See also references of EP2695934A4 *
YOKOTA, S. ET AL.: "Biofunctionality of self- assembled nanolayers composed of cellulosic polymers.", CARBOHYDR. POLYM, vol. 74, no. 3, 4 November 2008 (2008-11-04), pages 666 - 672, XP023904821 *
YOSHIKO Y; OIZUMI K; HASEGAWA T; MINAMIZAKI T; TANNE K; MAEDA N; AUBIN JE: "A subset of osteoblasts expressing high endogenous levels of PPAR gamma switches fate to adipocytes in the rat calvaria cell culture model", PLOS ONE, vol. 5, no. 7, 2010, pages 1782

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015082908A1 (en) * 2013-12-02 2015-06-11 Medway School Of Pharmacy Self-assembled monolayer
JP2020500588A (ja) * 2016-12-12 2020-01-16 カール クリストフ 関節での新規組織形成のための関節インプラント
JP2021003084A (ja) * 2019-06-27 2021-01-14 国立大学法人山口大学 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法
JP7372518B2 (ja) 2019-06-27 2023-11-01 国立大学法人山口大学 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2695934B1 (en) 2019-01-09
EP2695934A1 (en) 2014-02-12
JPWO2012137830A1 (ja) 2014-07-28
EP2695934A4 (en) 2014-12-31
JP6011879B2 (ja) 2016-10-19
US20140030804A1 (en) 2014-01-30
US10196610B2 (en) 2019-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating
Villa-Diaz et al. Derivation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells cultured on synthetic substrates
Karp et al. Cultivation of human embryonic stem cells without the embryoid body step enhances osteogenesis in vitro
Lavenus et al. Adhesion and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on titanium nanopores
Luo et al. Three-dimensional hydrogel culture conditions promote the differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocytes
Li et al. Agarose-based spheroid culture enhanced stemness and promoted odontogenic differentiation potential of human dental follicle cells in vitro: Li et al.
WO2011114237A2 (en) Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells
JP2016528898A (ja) 人工心筋（ｅｈｍ）を産生するための方法
JP5138367B2 (ja) 胚性幹細胞から間葉性幹細胞を形成する方法
WO2011110886A1 (en) Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells
Zhou et al. Effects of human fibroblast-derived extracellular matrix on mesenchymal stem cells
CN110475855A (zh) 用于从牙髓组织衍生的细胞制备牙髓干细胞的方法
Rao et al. Adenosine signaling mediates osteogenic differentiation of human embryonic stem cells on mineralized matrices
Viale-Bouroncle et al. Soft matrix supports osteogenic differentiation of human dental follicle cells
Gorska et al. Growth inhibition of osteosarcoma cell lines in 3D cultures: role of nitrosative and oxidative stress
JP6011879B2 (ja) 動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法
Tragoonlugkana et al. The use of human platelet lysate as a coating substance for adipose-derived stem cell expansion
CN110951686A (zh) 一种造血干细胞体外扩增培养体系和方法
Wang et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials
Ahmed et al. Comparing the Stemness Properties of Dental Pulp Cells (DPSCs), Collected, Processed, and Cryopreserved under Different Conditions.
WO2020072791A1 (en) Amniotic fluid cell-derived extracellular matrix and uses thereof
SENAFI Proliferation and osteoblast differentiation mice dental pulp stem cells between enzyme digestion and outgrowth method
CN105854084A (zh) 一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料及其制备方法和应用
Omer et al. Biological responses of dental pulp cells to surfaces modified by collagen 1 and fibronectin
WO2008070258A2 (en) Directed differentiation of human embryonic stem cells into mesenchymal/stromal cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12768652

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013508904

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14009874

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012768652

Country of ref document: EP