WO2012137896A1 - シート状の膵島の製造方法 - Google Patents

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WO2012137896A1
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islet
islets
cadherin
culture
sheet
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宏治 東
泰毅 藤田
矢口　寛
美輪 原田
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
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    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sheet islet resistant to hypoxic conditions, an islet culture, and a kit for producing a sheet islet.
  • pancreatic islets have been developed as a promising new approach to treat insulin-dependent diabetes mellitus (DM).
  • DM insulin-dependent diabetes mellitus
  • islet cell-based treatment is advantageous in that it is minimally invasive and requires a shorter hospital stay following treatment.
  • 44% of DM patients one year after islet cell transplantation successfully recovered insulin production and maintained a stable glycemic profile.
  • the survival rate of the transplanted islet cells has greatly decreased to 14%.
  • the conditions that maximize the life extension of the transplanted cell line need to be optimized. Therefore, various culture methods for improving the function and survival rate of islets subjected to transplantation have been studied.
  • Non-patent Document 1 a technique for transplanting a sheet of islet cells subcutaneously has been developed (Non-patent Document 1).
  • isolated islets are treated with trypsin-EDTA to disperse the islet cells to a single cell state, and the obtained islet cells are plated on a laminin-5-coated plate. After the cells reach confluence, the culture temperature is lowered to 20 ° C. for 20 minutes, whereby islet cells can be collected as a uniformly spread tissue sheet.
  • E-cadherin is a Ca 2+ -dependent cell-cell adhesion molecule (Non-Patent Documents 2 and 3), and is used for cell-cell adhesion and colony formation of mouse embryonic stem cells (ES cells). Essential (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Non-patent Document 6 Non-patent documents 7, 8, and 9
  • Non-patent Document 7 Non-patent documents 7, 8, and 9
  • ES cells made into single cells the cells adhere to each other on the culture dish to form an aggregate, while the culture dish coated with E-cad-Fc fusion protein.
  • mouse ES cells were differentiated into liver cells on a culture dish coated with mouse E-cad-Fc fusion protein (Non-patent Document 10).
  • pancreatic islet when a pancreatic islet is planarized and a sheet-like islet is prepared, it has been essential to treat the islet to a single cell with trypsin-EDTA because of physical requirements.
  • pancreatic islets have a problem that glucose responsiveness is significantly reduced by the effect of trypsin (Non-Patent Document 11), and the sugar responsiveness of sheet-like pancreatic islets obtained by this method is reported. May decrease.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a sheet-like pancreatic islet having resistance to hypoxic conditions by eliminating the problem of decreased glucose responsiveness.
  • the present inventors first cultured pancreatic islets on a non-treated plate in a lump without trypsin treatment.
  • the islets did not take a sheet-like structure in the form of aggregates.
  • cell death was likely to be induced under hypoxic conditions because the oxygen supply system to cells in the pancreatic islet that existed in vivo was lost. Therefore, a sheet-like structure resistant to low oxygen conditions is preferable.
  • normal trypsin-EDTA treatment is performed to form a single cell by creating a sheet-like pancreatic islet, the glucose-responsive function is remarkably reduced because the cell-cell adhesion that controls the glucose-responsive function is lost.
  • the islets were cultured on a culture dish containing the E1 cadherin EC1 domain and a polypeptide having an ability to bind to the E-cadherin fixed or coated on the solid phase surface. Even if the pancreatic islets are not decomposed into single cells by trypsin treatment, the islets have a sheet-like structure, and further, the islets with a sheet-like tissue morphology exhibit higher glucose responsiveness than the islets that form aggregates. As a result of further finding out that it has resistance to low oxygen conditions, the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following.
  • An isolated pancreatic islet is placed on a solid phase surface in a culture vessel in which a polypeptide containing the EC1 domain of E-cadherin and having a binding ability to the E-cadherin is immobilized or coated on the solid phase surface.
  • a method for producing a sheet-like pancreatic islet comprising culturing the islet for a period of time sufficient to exhibit a sheet-like form in a bonded state.
  • the production method of [1] wherein the polypeptide contains an extracellular domain of E-cadherin.
  • polypeptide is a fusion polypeptide comprising an extracellular domain of E-cadherin and an Fc region of an immunoglobulin.
  • a culture vessel containing an EC1 domain of E-cadherin and having a polypeptide capable of binding to E-cadherin fixed or coated on a solid phase surface, and a sheet-like islet, and the sheet-like islet A pancreatic islet culture that can be cultured while adhering to the surface of the solid phase.
  • a sheet-like islet including a culture vessel containing an EC1 domain of E-cadherin and having a solid phase surface fixed or coated with a polypeptide having a binding ability to the E-cadherin, and an isolated islet Kit for manufacturing.
  • the method of the present invention it is possible to produce a sheet-like pancreatic islet that is resistant to hypoxic conditions while suppressing a decrease in glucose response function as compared with the conventional culture method, without performing trypsin treatment. It is.
  • blood vessels are induced into the islet tissue, so that the islet does not suffer from oxygen deficiency.
  • cell death of the islets is induced by lack of oxygen under the hypoxic condition environment at the transplant site.
  • the sheet-like islets obtained by the method of the present invention When the sheet-like islets obtained by the method of the present invention are used, oxygen can be efficiently supplied to each cell even in a hypoxic state, cell death of the islets is suppressed even under hypoxic conditions, and the form of the islets is formed into a sheet. Since it is considered that the glucose response function is increased by making it into a shape, it is advantageous for transplantation medicine.
  • the islet morphology in each culture day of trypsin-treated or untreated cultured on E-cad-Fc coated dishes and untreated dishes is shown.
  • the ischemic index of each islet in each culture day on an untreated dish or an E-cad-Fc coated dish is shown.
  • (A) Cell morphology of islets and (B) Stimulation Index (n 3, mean ⁇ SD, * p ⁇ 0.05) in each culture condition after 11 days of culture.
  • the results of observation of pancreatic islet phase contrast and cell death at each oxygen concentration by PI staining and the total number of cells by DAPI staining are shown.
  • the cell death rate of islets cultured on E-cad-Fc coated dishes and untreated dishes is shown.
  • the present invention provides an isolated pancreatic islet in a culture vessel in which the polypeptide containing the EC1 domain of E-cadherin and having a binding ability to the E-cadherin is immobilized or coated on the solid phase surface.
  • the present invention provides a method for producing a sheet-like islet, comprising culturing the islet for a period of time sufficient to exhibit a sheet-like form in a state where the islet is adhered.
  • An islet is a cell mass scattered in the parenchyma of the pancreas, including ⁇ cells (A cells) that secrete glucagon, ⁇ cells (B cells) that secrete insulin, and ⁇ cells (D cells) that secrete somatostatin. is there.
  • the islets used in the present invention are isolated from mammals.
  • mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, pets such as dogs and cats, humans, Examples include, but are not limited to, primates such as monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees.
  • the mammal is preferably a rodent (such as a mouse) or a primate (such as a human).
  • Isolation of islets from mammalian pancreas can be performed according to a method known per se using collagenase digestion. For example, it can be isolated by static collagenase digestion followed by centrifugation in a Ficoll-Conray gradient (Sutton, R., 1986, Transplantation, 42: 689-691 / Ohtsuka, K., et . Al., 1997, Transplantation, 64: 633-639).
  • the islets are contained in an EC1 domain of E-cadherin in a cell mass state without being dispersed into a single cell state by proteolytic enzyme, and the E-cadherin
  • the polypeptide having the binding ability is subjected to culture in a culture vessel in which the solid phase surface is fixed or coated.
  • the cell mass means a state in which a plurality of cells are bonded together to form one mass.
  • about 10 to 10,000 islet cells are usually contained per islet. Therefore, the number of islet cells contained in the islet (cell mass) subjected to the culture is usually within the range of 10 to 10,000.
  • an isolated islet is cultured in a culture vessel in which the polypeptide containing the EC1 domain of E-cadherin and having the ability to bind to E-cadherin is fixed or coated on the solid surface.
  • E-cadherin expressed on the surface of the cells constituting the islets binds to the polypeptide, and as a result, the islets adhere to the solid phase surface.
  • E-cadherin is a known adhesion molecule involved in Ca 2+ -dependent cell-cell adhesion / binding called adhesion bonding or adherence junction. E-cadherin is widely expressed in parenchymal cells of visceral organs such as the liver, kidney, and lung, and epithelial cells such as keratinocytes, and is known to be an important adhesion molecule responsible for cell-cell adhesion (Mareel et al. ., Int. J. Dev. Biol. 37: 227, 1993; Mays et al., Cord Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 60: 763, 1995; El-Bahrawy & Pignatelli, Microsc. Res. Tech. 43 : 224, 1998; Nollet et al., Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 2: 77, 1999).
  • the E-cadherin used in the method of the present invention is usually derived from a mammal.
  • mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, pets such as dogs and cats, humans, Examples include, but are not limited to, primates such as monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees.
  • the mammal is preferably a rodent (such as a mouse) or a primate (such as a human).
  • “from organism X” means that the polypeptide or polynucleotide amino acid sequence or nucleic acid sequence naturally expressed in organism X or It means having the same or substantially the same amino acid sequence or nucleic acid sequence as the amino acid sequence or nucleic acid sequence of the polynucleotide. “Substantially the same” means that the focused amino acid sequence or nucleic acid sequence is 70% or more (preferably 80% or more, more preferably 90%) of the amino acid sequence or nucleic acid sequence of the factor naturally expressed in the organism X Or more, more preferably 95% or more, most preferably 99% or more), and the function of the factor is maintained.
  • the E-cadherin used in the present invention is preferably an animal derived from the same species as the species from which the pancreatic islet to be cultured is derived.
  • the use of mouse E-cadherin is desirable.
  • E-cadherin derived from a different animal can also be used.
  • E-cadherin derived from mammals.
  • Representative cDNA sequences and amino acids of human E-cadherin are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2
  • typical cDNA sequences and amino acids of mouse E-cadherin are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • E-cadherin binds homophilicly (ie, with the same molecule) via the extracellular region.
  • Extracellular Cadherin (EC) domains there are five regions called repetitive structures consisting of about 110 amino acid residues, so-called Extracellular Cadherin (EC) domains.
  • EC1 Extracellular Cadherin
  • the domains of EC1, EC2, EC3, EC4, and EC5 correspond to 157 to 262, 265 to 375, 378 to 486, 487 to 595, and 596 to 700, respectively.
  • the numerical value is the number of the residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2).
  • the domains of EC1, EC2, EC3, EC4, and EC5 correspond to 159 to 264, 267 to 377, 380 to 488, 489 to 597, and 598 to 702, respectively.
  • the numerical value is the number of the residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4).
  • the domain (EC1) located at the most N-terminal side defines the binding specificity of the molecule, that is, homophilic binding (Nose et al., Cell 61: 147, 1990). Therefore, the polypeptide used in the present invention contains at least the EC1 domain of E-cadherin and has an ability to bind to the E-cadherin.
  • the polypeptide used in the present invention comprises one, preferably two, more preferably three, and even more preferably four domains selected from EC2-5 in addition to the EC1 domain.
  • the polypeptide used in the present invention comprises the extracellular region of E-cadherin.
  • the extracellular region corresponds to the 1st to 697th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the extracellular region corresponds to the first to 699th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the polypeptide used in the present invention may be a fusion polypeptide comprising a sequence derived from E-cadherin and a sequence derived from another protein or peptide.
  • the polypeptide includes an immunoglobulin Fc region, a GST (Glutathione-S-Transferase) protein, an MBP (Mannose-Binding Protein) protein, an avidin protein, a His (oligo-histidine) tag, an HA (Hemagglutinin) tag, Produced as a fusion polypeptide with a Myc tag, VSV-G (Vesicular, Stromatis, Virus, Glycoprotein) tag, etc., and by using a protein A / G column, a specific antibody column, etc., purification of the polypeptide is easy and efficient. Can be done.
  • Fc fusion polypeptides are suitable in the practice of the present invention because their ability to adsorb to a culture substrate made of polystyrene or the
  • the gene encoding the Fc region to be used is not particularly limited to animal species and subtypes, but Fc such as human IgG1 and IgG2 or mouse IgG2a and IgG2b having strong binding to protein A / G.
  • Fc such as human IgG1 and IgG2 or mouse IgG2a and IgG2b having strong binding to protein A / G.
  • a gene encoding the region is preferred.
  • a method for enhancing the binding to protein A by introducing mutations into the Fc region (Nagaoka et al., Protein Eng. 16: 243, 2003). Proteins can also be used.
  • polypeptides preferably used in the present invention include the extracellular region of E-cadherin disclosed in Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24: 1857, 2002 and Protein Eng. 16: 243, 2003. Mention may be made of polypeptides comprising.
  • a fusion gene in which a cDNA encoding the extracellular region of mouse or human E-cadherin and a cDNA encoding the Fc region portion of human IgG and a cDNA of a His tag sequence are introduced into mouse cells, and this is introduced.
  • Purified recombinant proteins Recombinant Human / Mouse E-cadherin-Fc Chimera; R & D systems, Genzyme Techne
  • a culture dish coated with E-cadherin-Fc on the bottom is also commercially available from Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and can be applied to the present invention.
  • the polypeptide is preferably isolated or purified.
  • isolated or purified means that the artificially placed in a state different from the naturally occurring state, for example, an operation to remove components other than the desired component from the naturally occurring state.
  • purity of the isolated or purified polypeptide is usually 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and still more preferably 90%. Above (for example, 100%).
  • the polypeptide is obtained by culturing COS cells, 293 cells, CHO cells, or other mammalian cells into which an expression vector capable of expressing the polypeptide is introduced, and then using the biochemical technique known per se from the culture. It can be produced by isolation or purification.
  • a nucleic acid (such as DNA) encoding the polypeptide contains a nucleic acid sequence that enables transcription and expression of a gene in a wide range of mammalian cells, a so-called promoter sequence, and transcription and control under the control of the promoter. They are linked in such a way that expression is possible. It is desirable that the gene to be transcribed and expressed is further linked to a poly A addition signal.
  • Suitable promoters include promoters derived from viruses such as SV (Simon Virus) 40 virus, cytomegalo virus (CMV), Rous sarcoma virus (Rous sarcoma virus), ⁇ -actin promoter, EF (Elongation). Factor) 1 ⁇ promoter and the like.
  • SV Synmon Virus
  • CMV cytomegalo virus
  • Rous sarcoma virus Rous sarcoma virus
  • ⁇ -actin promoter EF (Elongation). Factor) 1 ⁇ promoter and the like.
  • the members constituting the solid phase in the culture vessel are not particularly limited as long as the production of the sheet-like pancreatic islets can be achieved when used in the production method of the present invention, and usually have no cytotoxicity and can be sterilized.
  • a member having affinity for protein can be used.
  • plastic or glass members are preferred.
  • the member may be metal or ceramic, and is not limited to a certain material.
  • Plastic members are thermosetting and thermoplastic polymers having excellent moldability, such as polystyrene, methacrylic resin, polymethylpentene, ethylene vinyl alcohol copolymer, polypropylene, cellulose, polyethylene, polysulfone, polyacrylonitrile. However, it is not limited to these.
  • the glass-based member means a material in which silicate, borate, phosphate or the like is vitrified without being crystallized.
  • Silicate glass is preferred because of its strong vitrification tendency.
  • crystallized glass which is a kind of composite material produced by heat-treating silicate glass, is more preferable because of its high formability and high impact resistance.
  • Examples of the culture container include petri dishes, plates, flasks, bottles and the like, but are not limited thereto.
  • the form of the culture vessel is not particularly limited as long as the islet adheres to the solid phase surface when subjected to the method of the present invention, and production of a sheet-like islet can be achieved.
  • the surface of the solid phase refers to a portion that enables adhesion of the cultured islets to the solid phase when the islets are cultured in a state of being adhered to the solid phase in the culture vessel.
  • a method for immobilizing or coating the polypeptide on the solid phase surface generally, a method using a non-covalent bond (hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic bond, etc.), covalent bond or the like can be used.
  • Examples of the method of immobilizing or coating the polypeptide on the solid phase surface by non-covalent bonding include a method of allowing the solid phase surface to stand in an appropriate buffer solution (eg, phosphate buffer solution) containing the polypeptide. .
  • buffer solution eg, phosphate buffer solution
  • the conditions of the method are within the range where the production of sheet-like islets can be achieved when used in the production method of the present invention. It is possible to set appropriately.
  • the polypeptide is a fusion polypeptide containing the extracellular region of mouse or human E-cadherin and the Fc region portion of mouse or human IgG, and the member constituting the solid phase is plastic (eg, polystyrene)
  • the solid phase is usually added in neutral phosphate buffered saline containing the polypeptide at a concentration of 0.01 to 1000 ⁇ g / mL (preferably 0.1 to 200 ⁇ g / mL, more preferably 1 to 50 ⁇ g / mL).
  • the polypeptide is fixed or coated on the surface of the solid phase.
  • the surface of a solid phase is treated with a silane coupling agent having a functional group to introduce a functional group into the surface of the solid phase, and the cross-linking agent is used.
  • a silane coupling agent having a functional group to introduce a functional group into the surface of the solid phase
  • the cross-linking agent is used.
  • Examples thereof include a method of binding a polypeptide to a functional group (see, for example, JP-A No. 2003-189843).
  • functional groups that can be introduced include amino groups, aldehyde groups, epoxy groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, and thiol groups.
  • silane coupling agents include ⁇ -aminopropyltriethoxysilane, N- ⁇ - (aminoethyl) ⁇ -aminopropyltrimethoxysilane, N- ⁇ - (aminoethyl) ⁇ -aminopropylmethyldimethoxysilane, and the like. I can list them.
  • cross-linking agents include diethylene glycol diglycidyl ether, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, N, N′-carbodiimidazole, glutaraldehyde, succinic anhydride, phthalic anhydride, hexamethylene A diisocyanate etc. can be mentioned.
  • the strength of the adhesion of the islet to the solid phase surface is not particularly limited as long as the production method of the present invention can achieve the production of a sheet-like islet, but it is usually dissociated unless subjected to physical and / or chemical treatment. It is the strength that does not.
  • Examples of the physical processing include processing by pipetting and tapping.
  • Examples of the chemical treatment include treatment with a chelating agent such as EDTA and EGTA, treatment with a proteolytic enzyme such as trypsin, and the like.
  • a basal medium of a medium used for culturing pancreatic islets a per se known medium that can be used for in vitro culturing of islets can be used.
  • DMEM, EMEM, RPMI-1640, ⁇ -MEM, F-12, F-10, M-199, HAM and the like can be mentioned.
  • a medium modified for islet culture or the like may be used, or a mixture of the above basal medium may be used.
  • the medium used for the culture of islets in the production method of the present invention may contain additives known per se used in normal islet tissue culture.
  • the additive is not particularly limited as long as the production of the sheet-like islet can be achieved by the production method of the present invention.
  • the growth factor eg, insulin
  • the iron source eg, transferrin
  • polyamines eg, putrescine
  • minerals eg sodium selenate etc.
  • saccharides eg glucose etc.
  • organic acids eg pyruvic acid, lactic acid etc.
  • serum proteins eg albumin etc.
  • amino acids eg L-glutamine etc.
  • reducing agents eg For example, 2-mercaptoethanol etc.
  • vitamins eg ascorbic acid, d-biotin etc.
  • antibiotics eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.
  • buffering agents eg HEPES etc.
  • the medium used for the culture of islets in the production method of the present invention may contain serum.
  • the serum concentration is not particularly limited as long as the production of the sheet-like islets can be achieved by the production method of the present invention, but is usually in the range of 0.1 to 30 (v / v)%.
  • culture conditions usually used in the tissue culture technique for islets can be used.
  • the culture temperature is usually in the range of about 30-40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is usually in the range of about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the humidity is usually in the range of about 70 to 100%, preferably about 95 to 100%.
  • the isolated islet is in a sheet-like form in a state where it is adhered to the solid phase surface in a culture vessel in which the polypeptide is fixed or coated on the solid phase surface. Incubated for a sufficient period of time.
  • the isolated islets are cultured in a culture vessel in which the polypeptide is fixed or coated on the solid phase surface, the islets adhere on the solid phase surface and eventually extend on the solid phase surface to form a sheet-like shape. It takes on a form.
  • “Sheet” refers to a shape having a sufficiently large length or width (preferably both of them) relative to the thickness of the islet.
  • the length or width (preferably both of them) of a sheet-like islet is usually 3 times or more, preferably 10 times or more of the thickness.
  • the “thickness” of the islet means the thickness of the thickest portion in the direction perpendicular to the solid phase surface of the culture vessel.
  • the “length” of the islets means the maximum value of the lengths in the direction perpendicular to the thickness direction of the islets.
  • the “width” of the islets means the maximum value of the lengths in the direction perpendicular to both the thickness direction and the length direction of the islets.
  • the sheet-like islet comprises a monolayer of islet cells.
  • pancreatic islet extension begins about 3 days after the start of the culture, and from about 6 days. It takes on a sheet form in about 10 days. Even in the case of using islets of other animal species or polypeptides having other configurations, those skilled in the art can appropriately set a period sufficient for the islets to exhibit a sheet-like form with reference to this culture period. Can be set.
  • the upper limit of the culture period is not particularly limited as long as the obtained sheet-like islet maintains glucose responsiveness, but since the insulin secretion ability may decrease when the culture period is prolonged, the culture period is Usually within 8 weeks, preferably within 4 weeks, more preferably within 1 week.
  • the sheet-like islets obtained by the production method of the present invention have good glucose responsiveness.
  • Glucose responsiveness refers to the ability to sense an increase in glucose concentration and secrete insulin.
  • a sheet-like islet obtained by the production method of the present invention has an insulin concentration of 1000 mg after culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 hour in DMEM containing 4500 mg / l glucose.
  • Insulin concentration in culture medium after 1 hour culture at 37 ° C., 5% CO 2 in DMEM containing 1 / l glucose is usually 1.5 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times That's it.
  • the present invention also includes a culture vessel containing the EC1 domain of E-cadherin and having a polypeptide capable of binding to E-cadherin fixed or coated on a solid surface, and a sheet-like islet, It is possible to provide a pancreatic islet culture that can be cultured in a state where the islet is adhered to the solid surface.
  • the sheet-like pancreatic islets are alive and function in a state of being adhered to the solid phase surface.
  • the culture is alive with the sheet-like islets adhered to the solid surface.
  • the sheet-like pancreatic islets proliferate in a state of being adhered to the solid phase surface.
  • the culture refers to a result obtained by culturing tissue or cells.
  • the culture of the present invention may contain, in addition to the culture vessel and sheet-like islets, a medium used in the above-described method of the present invention, insulin secreted by the islets, and the like.
  • the islet culture of the present invention is useful for the implementation of regenerative medicine using sheet islets.
  • kits For producing a sheet-like islet including a culture vessel containing a polypeptide containing the EC1 domain of E-cadherin and having a binding ability to the E-cadherin fixed or coated on a solid phase surface, and an isolated islet
  • a kit is provided. When the kit of the present invention is used, a sheet-like islet can be easily produced by the production method of the present invention.
  • the kit of the present invention may further contain a reagent used in the production method of the present invention.
  • a reagent used in the production method of the present invention examples include proteolytic enzymes such as collagenase used for isolation of islets, culture media, serum, and the like.
  • Islet was isolated from male mice (C57BL / 6J; Charles River, Japan) having an islet culture weight of 20 to 25 g (9 to 10 weeks of age) by digestion using collagenase from clostridium histypicum Type V (GIBCO).
  • the islets were separated by performing a density gradient method using Biocoll Separation Solution (Biochem AG) and hand-pickup using Pipetteman on the islets.
  • the isolated islets were placed on a 3.5 cm E-cad-Fc coated dish (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and an untreated dish (IWAKI) with 10 (v / v)% FBS (GIBCO) and 1 (v / v) as an antibiotic.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • GEBCO % Anti-Anti
  • pancreatic islet morphology Isolated islets were seeded on 3.5 cm E-cad-Fc coated dishes (Sumitomo Bakelite) and non-treated dishes (IWAKI). Furthermore, the islet cells that were dispersed in a single cell state were similarly seeded by treating the islet to be singled with trypsin-EDTA (GIBCO) for 5 minutes at 37 ° C. Islet and trypsin-EDTA treated pancreatic islet cells use 10% FBS (GIBCO) and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; SIGMA) supplemented with 1% Anti-Anti (GIBCO) as an antibiotic. (37 ° C. CO 2 ; 5%). The islets were seeded on the incubator and the medium was changed after 7 days. Thereafter, the medium was changed every 3 days.
  • GEBCO trypsin-EDTA
  • Example 3 Evaluation of glucose response function by Stimulation Index Under the same culture conditions as in Example 1, islets (40 pieces) isolated from mice were seeded on 3.5 cm E-cad-Fc coated dishes or non-treated dishes and cultured. did. It was investigated whether the insulin secretion amount of the islets can be controlled by the glucose concentration in the culture solution after the start of the culture. Islets cultured on E-cad-Fc coated dishes or non-treated dishes were washed twice with low glucose medium (1,000 mg / l DMEM) and then in low glucose medium (1,000 mg / l DMEM). The amount of insulin secreted in the supernatant was defined as the amount of insulin secreted at low glucose.
  • the islets On each culture day, the islets showed glucose responsiveness on untreated dishes and on E-cad-Fc coated dishes, confirming insulin secretion ability. As a result of calculating the stimulation index, the islets cultured on the E-cad-Fc coat incubator showed islet function equal to or higher than that of the islets cultured on the untreated dish (FIG. 2).
  • Example 4 Effect of trypsin treatment on glucose response function
  • Mouse islets 40 mice were seeded on 3.5 cm E-cad-Fc coated dishes or non-treated dishes. Furthermore, islet cells in a single cell state were prepared by incubating the mouse-derived islets with trypsin-EDTA (GIBCO) at 37 ° C. for 5 minutes, and seeded in the same manner as the islets. After 11 days from the start of culture, the glucose response function of islets and islet cells was examined by SI. Evaluation by ELISA was performed in the same manner as in Example 3. Moreover, SI in each culture day was calculated.
  • the amount of insulin secreted by islet cells dispersed by trypsin-EDTA treatment was lower in both non-treated dishes and E-cad-Fc coated dishes compared to untreated islets.
  • the stimulation index of islet cells dispersed by trypsin-EDTA treatment on the E-cad-Fc coated dish was also lower than that of non-treated islets (FIG. 3). Therefore, it was suggested that trypsin-EDTA treatment decreases the glucose response function.
  • Example 5 Measurement of cell death induction rate in pancreatic islets under hypoxic conditions
  • Pancreatic islets isolated from mice were seeded on 3.5 cm E-cad-Fc coated dishes or non-treated dishes under the same culture conditions as in Example 1. Cultured for 1 week. The islets on the E-cad-Fc coated dish were collected with PBS (GIBCO) containing 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and in a floating state in the same manner as the islets on the untreated dish, hypoxic conditions (O 2 ; 5%) and high oxygen conditions (O 2 ; 20%) for 1 hour incubation (37 ° C.).
  • PBS GBBCO
  • DAPI DAPI Nucleic Acid Stain
  • PI Propium iodide
  • the method of the present invention it is possible to produce a sheet-like islet that is resistant to hypoxic conditions while suppressing a decrease in glucose-responsive function without performing trypsin treatment.
  • blood vessels are induced into the islet tissue, so that the islet does not suffer from oxygen deficiency.
  • cell death of the islets is induced by lack of oxygen under the hypoxic condition environment at the transplant site. If the sheet-like islets obtained by the method of the present invention are used, oxygen can be efficiently supplied to each cell even in a hypoxic state, and cell death of the islets is suppressed even under hypoxic conditions, which is advantageous for transplantation medicine. It is.

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Abstract

　本発明は、単離された膵島を、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中、該固相表面に接着した状態で、当該膵島がシート状の形態を呈するのに十分な期間培養することを含む、シート状の膵島の製造方法を提供する。

Description

シート状の膵島の製造方法
　本発明は、低酸素条件に耐性のあるシート状の膵島の製造方法、膵島培養物、及びシート状の膵島を製造するためのキットに関する。
　膵島を利用した細胞ベースの療法が、インスリン依存型糖尿病（ＤＭ）を治療するための有望な新たなアプローチとして開発されてきている。膵臓の全臓器移植と比較して、膵島細胞ベースの治療は、侵襲が最小限であり、治療に引き続く病院での滞在期間が短くて済む点で有利である。最近の国際的な臨床試験において、膵島細胞を移植されて１年後のＤＭ患者の４４％が、成功裏にインスリン産生を回復し、血糖プロファイルを安定に維持したことが報告されている。しかしながら、移植から２年後において、移植した膵島細胞の生存率が１４％にまで大幅に低下してしまった。従って、ＤＭのための膵島ベースの療法を前進させるためには、移植した細胞系の寿命延長を最大化させる条件を最適化する必要があることは明らかである。そこで、移植に供する膵島の機能や生存率を上げるための様々な培養方法が検討されている。
　従来の一般的な膵島のインビトロ培養法においては、生体より採取した膵島内の細胞は、生体内で行われていた酸素供給システムを喪失し、凝集塊の形態のまま維持されることで、十分な酸素供給を受けられずに、膵島機能の消失を招く。
　上記課題を解決するために、膵島細胞のシートを皮下に移植する技術が開発されている（非特許文献１）。この技術においては、単離した膵島をトリプシン－ＥＤＴＡで処理することにより、膵島細胞をシングルセルの状態にまで分散させ、得られた膵島細胞をラミニン－５でコートしたプレート上に播く。そして、細胞がコンフルエントに達した後で、培養温度を２０℃に２０分間下げることにより、膵島細胞を、均一に広がった組織シートとして回収することができる。
　一方、Ｅ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄ）は、Ｃａ２＋依存的な細胞－細胞接着分子であり（非特許文献２、３）、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の細胞間接着や、コロニー形成に必須である（非特許文献４、５）。
　Ｅ－カドヘリンの細胞外ドメイン及びＩｇＧ Ｆｃドメインからなる融合タンパク質（非特許文献６）でコートしたディッシュ上で、マウスやヒトのＥＳ細胞を成功裏に維持できることが報告されている（特許文献１、非特許文献７、８、９）。Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃ融合タンパク質でコートした培養皿上では、マウスＥＳ細胞はコロニーを形成しないが、多能性を維持し、生殖系列有能キメラマウスを創生することができる（非特許文献７、８）。これらのＥＳ細胞の通常の培養法では、シングルセル化したＥＳ細胞を添加すると培養皿上で細胞同士が接着し、凝集塊を形成する一方で、Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃ融合タンパク質でコートした培養皿上では、シングルセル化したＥＳ細胞のまま培養することが可能となる。また、マウスＥ－ｃａｄ－Ｆｃ融合タンパク質でコートした培養皿上でマウスＥＳ細胞を肝臓の細胞へ分化させたことが報告されている（非特許文献１０）。
国際公開第２００５／０９０５５７号
Biomaterials, vol.30, pp.5943-5949, 2009 Curr Opin Cell Biol, vol.7, pp.619-627, 1995 The Journal of Cell Biology, vol.148, p.399-404, 2000 Development, vol.122, pp.3185-3194, 1996 Stem Cells, vol.22, pp.275-282, 2004 Protein Engineering, vol.6, no.4, pp.243-245, 2003 PLos ONE, issue 1, e15, 2006 The Journal of Biological Chemistry, vol.283, no.39, pp.26468-26476, 2008 BMC Developmental Biology, vol.10, 60, 2010 Biomaterials, vol.32, no.8, pp.2032-2042, 2011 Cell Transplant., vol.18, no.5, pp.541-547, 2009
　従来、膵島を平面化し、シート状の膵島を調製する場合には、物理的な要請から、膵島をトリプシン－ＥＤＴＡによりシングルセルにまで酵素処理することが必須であった。しかしながら、膵島はトリプシンの影響によってグルコース応答性が顕著に低下してしまうという問題点があることが報告されており（非特許文献１１）、この方法では得られたシート状の膵島の糖応答性が低下してしまうことが考えられる。
　本発明は、グルコース応答性の低下という問題点を解消し、低酸素条件に耐性をもつシート状の膵島を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく、まず、膵島をトリプシン処理せずに、塊のまま非処理プレート上で培養した。しかしながら、膵島は、凝集塊の形態のまま、シート状の構造をとらなかった。更に、この培養方法では、生体内では存在した膵島内細胞への酸素供給システムを喪失していることから、低酸素条件で細胞死が誘導されやすいと考えられた。そこで低酸素条件に耐性があるシート状の構造が好ましい。しかし通常のトリプシン－ＥＤＴＡ処理を行いシングルセル化してシート状の膵島を作成すると、グルコース応答性の機能を制御している細胞－細胞間接着を喪失するためにグルコース応答機能が著しく低下してしまうと考えられる。そこで培養条件を鋭意検討したところ、膵島をＥ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養皿上で培養すると、膵島をトリプシン処理によりシングルセルにまで分解しなくても、膵島がシート状の構造を呈し、更に、シート状という組織形態を呈する膵島が凝集塊を形成する膵島よりも高いグルコース応答性が見られること及び低酸素条件に耐性をもつことを見出し、更に検討を重ねた結果、本発明を完成した。
　即ち、本発明は以下に関する。
［１］単離された膵島を、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中、該固相表面に接着した状態で、当該膵島がシート状の形態を呈するのに十分な期間培養することを含む、シート状の膵島の製造方法。
［２］当該ポリペプチドがＥ－カドヘリンの細胞外ドメインを含む、［１］記載の製造方法。
［３］当該ポリペプチドがＥ－カドヘリンの細胞外ドメイン及びイムノグロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドである、［１］記載の製造方法。
［４］Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器、及びシート状の膵島を含み、該シート状の膵島が該固相表面に接着した状態で培養可能となる、膵島培養物。
［５］Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器、及び単離された膵島を含む、シート状の膵島の製造用キット。
　本発明の方法を用いれば、トリプシン処理を行うことなく、従来の培養法と比較してグルコース応答機能の低下を抑制しながら、低酸素条件に耐性のあるシート状の膵島を製造することが可能である。
　通常、体内であれば膵島組織内への血管誘導が生じるため、膵島が酸素不足に陥ることはない。しかしながら、移植した膵島の場合、移植部位における低酸素条件環境下では、酸素不足によって膵島の細胞死が誘導される懸念がある。本発明の方法により得られるシート状の膵島を用いれば、低酸素状態でも効率的にそれぞれの細胞へ酸素供給が可能となり、低酸素条件でも膵島の細胞死が抑制され、かつ膵島の形態をシート状にすることによってグルコース応答機能が増加することが考えられるので、移植医療に有利である。
Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ及び非処理ディッシュ上で培養した、トリプシン処理又は未処理の各培養日数における膵島の形態を示す。 非処理ディッシュ上又はＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上における各培養日数における膵島のｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘを示す。 培養１１日後の各培養条件における（Ａ）膵島の細胞形態および（Ｂ）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ｎ＝３，ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．，＊ｐ＜０．０５）を示す。 各酸素濃度における膵島の位相差像及び細胞死をPI染色、細胞全体数をＤＡＰＩ染色によって観察した結果を示す。 Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ及び非処理ディッシュ上で培養した膵島の細胞死率を示す。
　本発明は、単離された膵島を、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中、該固相表面に接着した状態で、当該膵島がシート状の形態を呈するのに十分な期間培養することを含む、シート状の膵島の製造方法を提供するものである。
　膵島とは、グルカゴンを分泌するα細胞（Ａ細胞）、インスリンを分泌するβ細胞（Ｂ細胞）、及びソマトスタチンを分泌するδ細胞（Ｄ細胞）を含む、膵臓の実質内に散在する細胞塊である。
　本発明において使用される膵島は、哺乳動物から単離されたものである。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。
　哺乳動物の膵臓からの膵島の単離は、コラゲナーゼ消化を用いた自体公知の方法に従い行うことが出来る。例えば、静的なコラゲナーゼ消化と、それに引続くＦｉｃｏｌｌ－Ｃｏｎｒａｙグラディエント中での遠心分離により単離することができる（Sutton, R., 1986, Transplantation, 42:689-691／Ohtsuka, K., et. al., 1997, Transplantation, 64: 633-639）。
　膵島をトリプシン等のタンパク質分解酵素処理によりシングルセルの状態にまで分散させると、結果として得られるシート状の膵島のグルコース応答性が低下してしまう可能性がある。従って、本発明の製造方法においては、タンパク質分解酵素によってシングルセルの状態にまで分散させることなく、膵島が、細胞塊の状態のまま、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中での培養に付される。細胞塊とは、複数個の細胞が相互に接着等することにより一つの塊をなしている状態を意味する。哺乳動物種にもよるが、１つの膵島あたり、通常１０個～１００００個程度の膵島細胞が含まれる。従って、上記培養に付される膵島（細胞塊）に含まれる、膵島細胞の数も、通常１０個～１００００個の範囲内である。
　本発明においては、単離された膵島が、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中で培養される。これにより、膵島を構成する細胞の表面に発現したＥ－カドヘリンが当該ポリペプチドに結合し、結果として、膵島が当該固相表面に接着する。
　Ｅ－カドヘリンは、接着結合又はアドヘレンス・ジャンクション（adherens junction）と呼ばれるＣａ２＋依存性の細胞間接着・結合に関与する公知の接着分子である。Ｅ－カドヘリンは、肝臓や腎臓、肺等の内臓臓器の実質細胞やケラチノサイト等の上皮細胞に広く発現し、その細胞間接着を担う重要な接着分子であることが知られている（Mareel et al.,Int.J.Dev.Biol.37:227,1993; Mays et al.,Cord Spring Harb.Symp.Quant.Biol.60:763,1995; El-Bahrawy & Pignatelli,Microsc.Res.Tech.43:224,1998; Nollet et al.,Mol.Cell.Biol.Res.Commun.2:77,1999）。
　本発明の方法において用いられるＥ－カドヘリンは、通常哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。
　尚、本発明に用いられる各ポリペプチド又はポリヌクレオチドについて、「生物Ｘ由来」とは、該ポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している該ポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸配列又は核酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列又は核酸配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している因子のアミノ酸配列又は核酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該因子の機能が維持されていることを意味する。
　本発明において使用するＥ－カドヘリンとしては、培養対象である膵島が由来する種と同種の動物由来のものが好ましい。例えば、マウスから単離された膵島を用いて本発明を実施する場合、マウスのＥ－カドヘリンの使用が望ましい。また、ヒトから単離された膵島を用いて本発明を実施する場合、ヒトのＥ－カドヘリンの使用が望ましい。しかしながら、本発明の製造方法によってシート状の膵島を製造可能である限り、異種動物由来のＥ－カドヘリンを使用することもできる。
　多くの哺乳動物由来のＥ－カドヘリンのアミノ酸配列やｃＤＮＡ配列が公知である。ヒトＥ－カドヘリンの代表的なｃＤＮＡ配列及びアミノ酸を配列番号１及び２に、マウスＥ－カドヘリンの代表的なｃＤＮＡ配列及びアミノ酸を配列番号３及び４に、それぞれ示す。
　Ｅ－カドヘリンは、細胞外領域を介してホモフィリックに（即ち、同一分子同士で）結合することが知られている。Ｅ－カドヘリンの細胞外領域には、約１１０アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣ）ドメインと呼ばれる領域が５個存在する。例えば、ヒトＥ－カドヘリン（配列番号２）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５７～２６２、２６５～３７５、３７８～４８６、４８７～５９５、５９６～７００に相当する（数値は配列番号２に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。また、マウスＥ－カドヘリン（配列番号４）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５９～２６４、２６７～３７７、３８０～４８８、４８９～５９７、５９８～７０２に相当する（数値は配列番号４に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。
　一般的にカドヘリン分子は、最もＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１）が、当該分子の結合特異性、すなわち、ホモフィリックな結合を規定している（Nose et al., Cell 61: 147, 1990）ため、本発明に用いられるポリペプチドは、少なくともＥ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有する。好ましい態様において、本発明に用いられるポリペプチドは、ＥＣ１ドメインに加えて、ＥＣ２～５から選択される１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、更に好ましくは４つのドメインを含む。より好ましい態様において、本発明に用いられるポリペプチドは、Ｅ－カドヘリンの細胞外領域を含む。ヒトＥ－カドヘリンの場合、細胞外領域は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における、第１～第６９７アミノ酸に相当する。また、マウスＥ－カドヘリンの場合、細胞外領域は、配列番号４で表されるアミノ酸配列における、第１～第６９９アミノ酸に相当する。
　本発明に用いられるポリペプチドは、Ｅ－カドヘリンに由来する配列と他のタンパク質やペプチド由来の配列を含む融合ポリペプチドであってもよい。例えば、当該ポリペプチドを、イムノグロブリンのＦｃ領域やＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タンパク質、ＭＢＰ（Ｍａｎｎｎｏｓｅ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、アビジン・タンパク質、Ｈｉｓ（オリゴ・ヒスチジン）タグ、ＨＡ（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｒｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）タグ等との融合ポリペプチドとして作製し、プロテインＡ／Ｇカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、ポリペプチドの精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にＦｃ融合ポリペプチドは、ポリスチレン等を材料とした培養基材に吸着する能力が高まるため、本発明の実施において好適である。
　イムノグロブリンのＦｃ領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離・同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む塩基配列の配列情報は、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号：ＡＪ２９４７３０、ＡＪ２９４７３１、ＡＪ２９４７３２、及びＡＪ２９４７３３として登録されている。したがって、当業者であれば、Ｆｃ領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｆｃ領域部分をコードするｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。この場合、使用するＦｃ領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインＡ／Ｇとの結合性が強いヒトＩｇＧ１やＩｇＧ２、又はマウスＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等のＦｃ領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Ｆｃ領域に変異を導入することによりプロテインＡとの結合性を高める方法も知られており（Nagaoka et al., Protein Eng. 16: 243, 2003）、当該法により遺伝子改変を加えたＦｃタンパク質も使用することもできる。
　なお、本発明において好適に用いられるポリペプチドの例として、Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24: 1857, 2002及びProtein Eng. 16: 243, 2003に開示されたＥ－カドヘリンの細胞外領域を含むポリペプチドを挙げることが出来る。
　また、マウス又はヒトのＥ－カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、ヒトＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列及びＨｉｓタグ配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ－Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｅ社）が市販されており、これらを本発明に適用することもできる。また、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ－Ｆｃを底面にコートした培養ディッシュも住友ベークライト株式会社等より市販されており、これを本発明に適用することが出来る。
　上記ポリペプチドは好ましくは単離又は精製されている。「単離または精製」とは、天然に存在する状態とは異なる状態に人為的に置かれること、例えば、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離または精製された上記ポリペプチドの純度（全ポリペプチド重量に対する、上記ポリペプチド重量の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。
　上記ポリペプチドは、該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを導入したＣＯＳ細胞や２９３細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を培養し、培養物から、自体公知の生化学的手法により該ポリペプチドを単離又は精製することにより製造することが出来る。該発現ベクターにおいては、該ポリペプチドをコードする核酸（ＤＮＡ等）が、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写及び発現が可能になる様な形で連結される。転写及び発現される遺伝子は、さらにポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、ＳＶ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０ウイルスやサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ Ｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）等のウイルスに由来するプロモーターや、β－アクチン・プロモーター、ＥＦ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。
　培養容器内の固相を構成する部材は、本発明の製造方法において用いられた際に、シート状の膵島の製造を達成し得る範囲において特に限定されず、通常、細胞毒性がなく、滅菌可能で、タンパク質に親和性を有する部材を用いることができる。一般的にプラスチック系、ガラス系の部材が好ましい。しかし、該部材は、金属やセラミックでもよく、一定の素材に限定されるものではない。
　プラスチック系部材とは、成形性に優れた熱硬化性、熱可塑性ポリマーであって、例えば、ポリスチレン、メタクリル樹脂、ポリメチルペンテン、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリプロピレン、セルロース、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリルなどを使用することができるが、これらには限定されない。
　ガラス系の部材とは、ケイ酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩などが、結晶化することなく、ガラス化したものを意味する。ガラス化傾向が強いという理由で、ケイ酸塩ガラスが好ましい。また、成形性に富み、対衝撃性が高いという理由で、ケイ酸塩ガラスを熱処理することによりつくる複合素材の一種である結晶化ガラスがより好ましい。
　培養容器としては、シャーレ、プレート、フラスコ、ボトル等を挙げることができるが、これらに限定されない。培養容器の形態は、本発明の方法に供せられた際に、固相表面へ膵島が接着し、シート状の膵島の製造が達成可能であれば特に限定されない。
　固相表面とは、培養容器中で固相に接着した状態で膵島を培養するとき、培養される膵島の固相への接着を可能にする部分をいい、例えば、培地を加えたときに培地と接する部位をいう。
　ポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングする方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。
　ポリペプチドを非共有結合により固相表面に固定又はコーティングする方法としては、例えば、ポリペプチドを含む適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液等）中に固相表面を静置する方法が挙げられる。該方法の条件（緩衝液の種類、緩衝液中のポリペプチドの濃度、静置時間等）は、本発明の製造方法において用いられた際に、シート状の膵島の製造を達成できる範囲において、適宜設定することが可能である。例えばポリペプチドがマウス又はヒトのＥ－カドヘリンの細胞外領域及び、マウス又はヒトＩｇＧのＦｃ領域部分を含む融合ポリペプチドであり、固相を構成する部材がプラスチック（例、ポリスチレン）である場合、通常０．０１～１０００μｇ／ｍＬ（好ましくは、０．１～２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１～５０μｇ／ｍＬ）の濃度でポリペプチドを含む中性リン酸緩衝生理食塩水中に固相を０．５～２４時間程度静置することによって、該ポリペプチドが該固相の表面に固定又はコーティングされる。
　共有結合によるポリペプチドの固定又はコーティング方法としては、例えば固相表面を、官能基を有するシランカップリング剤で処理することにより、該固相表面に官能基を導入し、架橋剤を用いて当該官能基にポリペプチドを結合させる方法を挙げることが出来る（例えば特開２００３－１８９８４３号公報参照）。導入し得る官能基の例としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等を挙げることができる。シランカップリング剤の例としては、γ－アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ－β－（アミノエチル）γ－アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ－β－（アミノエチル）γ－アミノプロピルメチルジメトキシシラン等を挙げることが出来る。架橋剤の例としては、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－カルボジイミダゾール、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、無水フタル酸、ヘキサメチレンジイソシアネート等を挙げることが出来る。
　このように、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中で、単離した膵島を培養することにより、膵島を構成する細胞の表面に発現したＥ－カドヘリンが当該ポリペプチドに結合し、結果として、膵島が当該固相表面に接着する。
　膵島の固相表面への接着の強度は、本発明の製造方法により、シート状の膵島の製造を達成し得る限り特に限定されないが、通常、物理的及び／又は化学的処理を施さなければ解離しない程度の強度である。該物理的処理としては、ピペッティングやタッピングによる処理等が挙げられる。該化学的処理としてはＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のキレート剤による処理や、トリプシン等のタンパク質分解酵素による処理等が挙げられる。
　本発明の製造方法において、膵島の培養に用いられる培地の基礎培地としては、膵島のインビトロ培養に使用可能な自体公知のものを用いることができ、本発明の製造方法により、シート状の膵島の製造を達成し得る限り特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＨＡＭ等が挙げられる。また、膵島培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
　本発明の製造方法において膵島の培養に用いられる培地は、通常の膵島の組織培養で用いられる自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、本発明の製造方法により、シート状の膵島の製造を達成し得る限り特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で培地に含まれることが好ましい。
　また、本発明の製造方法において膵島の培養に用いられる培地は、血清を含んでいてもよい。血清の濃度は、本発明の製造方法により、シート状の膵島の製造を達成し得る限り特に限定されないが、通常、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。
　本発明の製造方法における膵島のその他の培養条件は、膵島の組織培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０～４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１～１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０～１００％の範囲であり、好ましくは約９５～１００％が例示される。
　本発明の製造方法においては、単離された膵島が、上記ポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中、該固相表面に接着した状態で、当該膵島がシート状の形態を呈するのに十分な期間培養される。単離された膵島を、上記ポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中で培養すると、膵島は該固相表面上に接着し、やがて該固相表面上に伸展し、シート状の形態を呈するようになる。「シート状」とは、膵島の厚さに対して、長さ又は幅（好ましくは、これらの両方）が十分に大きな形状をいう。例えばシート状の膵島の長さ又は幅（好ましくは、これらの両方）は、厚さの、通常３倍以上、好ましくは、１０倍以上である。膵島の「厚さ」とは、培養容器の固相表面に対して垂直方向に最も厚い部分の厚さを意味する。膵島の「長さ」とは、前記膵島の厚さ方向と直交する方向の長さのうちの最大の値を意味する。膵島の「幅」とは、前記膵島の厚さ方向及び長さ方向の双方と直行する方向の長さのうちの最大の値を意味する。一態様において、シート状の膵島は、膵島細胞の単層を含む。シート状の形態を呈するまでに要する時間は、膵島の由来する動物種や、上記ポリペプチドの構成、培養条件により異なるので、一般化することは難しいが、マウスの膵島を、マウスＥ－カドヘリンの細胞外領域及びＩｇＧのＦｃ領域部分を含むポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中で培養する場合には、培養開始後３日程度で、膵島の伸展が始まり、約６日から１０日程度でシート状の形態を呈するようになる。他の動物種の膵島や、他の構成のポリペプチドを用いた場合であっても、この培養期間を参考に、当業者であれば膵島がシート状の形態を呈するのに十分な期間を適宜設定することができる。
　培養期間の上限は、得られるシート状の膵島が、グルコース応答性を維持する限り特に限定されないが、培養期間が長期に及ぶとインスリン分泌能が低下してくる場合があるため、培養期間は、通常８週間以内で好ましくは４週間以内、より好ましくは１週間以内である。
　本発明の製造方法により得られるシート状の膵島は、良好なグルコース応答性を有する。グルコース応答性とは、グルコース濃度の上昇を感知して、インスリンを分泌する能力を意味する。例えば、本発明の製造方法により得られるシート状の膵島を、４５００ｍｇ／ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２にて１時間培養後の培養液中のインスリン濃度が、１０００ｍｇ／ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２にて１時間培養後の培養液中のインスリン濃度の、通常１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上である。
　また、本発明は、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器、及びシート状の膵島を含み、該シート状の膵島が該固相表面に接着した状態で培養可能となる、膵島培養物を提供するものである。
　一態様において、該培養物においては、該シート状の膵島が該固相表面に接着した状態で生存して機能している。
　一態様において、該培養物においては、該シート状の膵島が該固相表面に接着した状態で生存している。また、別の態様において、該培養物においては、該シート状の膵島が該固相表面に接着した状態で増殖している。
　培養物とは、組織や細胞を培養することにより得られる結果物をいう。
　本発明の培養物に関連する各用語の定義及び態様は、上記本発明の製造方法について記載したものと同一である。
　本発明の培養物は、上記培養容器、及びシート状の膵島に加えて、上述の本発明の方法において用いる培地、膵島が分泌したインスリン等を含み得る。
　本発明の膵島培養物は、シート状の膵島を利用した再生医療の実施に有用である。
　Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器、及び単離された膵島を含む、シート状の膵島の製造用キットを提供するものである。本発明のキットを用いると、上記本発明の製造方法により、容易にシート状の膵島を製造することができる。
　本発明のキットに関連する各用語の定義及び態様は、上記本発明の製造方法について記載したものと同一である。
　本発明のキットは、上記本発明の製造方法において用いられる試薬を更に含んでいてもよい。該試薬としては、例えば、膵島の単離に用いられるコラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素、培地、血清等を挙げることが出来る。
　本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
［実施例１］
膵島培養
　体重２０～２５ｇ（９～１０週齢）の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；日本チャールスリバー）から、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｄｙｔｉｃｕｍ　Ｔｙｐｅ　Ｖ（ＧＩＢＣＯ）を用いた消化法により膵島を分離した。この膵島に対してＢｉｏｃｏｌｌ　Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｏｍ　ＡＧ）を用いた密度勾配法およびピペットマンを用いたハンドピックアップを行って、膵島を分離した。分離した膵島を３．５ｃｍ Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ（住友ベークライト株式会社）及び非処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上で、１０（ｖ／ｖ）％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、抗生剤として１（ｖ／ｖ）％ Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ（ＧＩＢＣＯ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ＳＩＧＭＡ）中で培養した（３７℃／ＣＯ２；５％）。膵島を培養器上に播種して７日後に培地交換を行い、以後３日毎に培地交換を行った。
［実施例２］
膵島の形態観察
　分離した膵島を３．５ｃｍ　Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ（住友ベークライト）及び非処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上に播種した。さらに、シングル化する膵島をトリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）にて５分間、３７℃にて処理することにより、シングルセルの状態に分散した膵島細胞を同様に播種した。膵島及びトリプシン-ＥＤＴＡ処理にてシングル化した膵島細胞は１０％　ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、抗生剤として１％　Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ（ＧＩＢＣＯ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；　ＳＩＧＭＡ）を用いて培養した（３７℃　ＣＯ２；５％）。膵島を培養器上に播種して７日後に培地交換を行い、以後３日毎に培地交換を行った。
　その後、隔日毎に膵島の形態を倒立型位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＩＸ－７０）にて観察した。結果を図１に示す。膵島をＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上に播種すると、培養開始３日後には、膵島がディッシュ上に伸展し、培養開始６日後には、シート状の形態を呈した。一方、非処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上に播種しても、組織の形態は変化せずに凝集塊の形態のままであり、１８日間培養しても、シート状の形態を呈することはなかった。シングルセル状態の膵島細胞をＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上に播種すると、該細胞のディッシュへの接着が観察された。一方、シングルセル状態の膵島細胞を非処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上に播種しても、該細胞は壊死してしまった。
［実施例３］
グルコース応答機能のＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘによる評価
　実施例１と同一の培養条件下で、マウスより分離した膵島（４０ピース）を、３．５ｃｍ Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ又は非処理ディッシュ上に播種し、培養した。培養開始後に培養液中のグルコース濃度によって膵島のインスリン分泌量を制御できるかを検討した。Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ又は非処理ディッシュ上で培養した膵島を低グルコース培地（１，０００ ｍｇ／ｌ ＤＭＥＭ）にて２回洗浄し、その後低グルコース培地（１，０００ ｍｇ／ｌ ＤＭＥＭ）中にて１時間培養し、上清中に分泌されたインスリン量を低濃度グルコースにおけるインスリン分泌量とした。その後、高グルコース培地（４，５００ ｍｇ／ｌ ＤＭＥＭ）にて２回洗浄し、その後高グルコース培地（４，５００ ｍｇ／ｌ ＤＭＥＭ）中にて１時間培養し、上清中に分泌されたインスリン量を高濃度グルコースにおけるインスリン分泌量とした。回収した上清を、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）キットであるレビス インスリン－マウス（（株）シバヤキ）を用いて非処理ディッシュ上およびＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上における膵島のインスリン分泌量を測定し、膵島の機能を評価するためにＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ (SI; 低濃度グルコース環境下でのインスリン分泌量に対する、高濃度グルコース環境下でのインスリン分泌量の比)を算出した（図２）。
　各培養日において、膵島は非処理ディッシュ上とＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上でグルコース応答性を示し、インスリン分泌能が確認された。Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘを算出した結果、Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコート培養器上で培養した膵島は非処理ディッシュ上で培養された膵島と同等もしくはそれ以上の膵島機能を示した（図２）。
［実施例４］
グルコース応答機能に対するトリプシン処理の影響
　マウス由来膵島（４０個）を３．５ｃｍ　Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュもしくは非処理ディッシュ上に播種した。さらに、マウス由来膵島をトリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）にて３７℃、５分間インキュベートすることによりシングルセルの状態の膵島細胞を調製し、これを膵島と同様に播種した。培養開始日から１１日後に、膵島及び膵島細胞のグルコース応答機能をＳＩによって検討した。ＥＬＩＳＡによる評価は実施例３と同様の方法により行った。また、各培養日におけるＳＩを算出した。
　トリプシン－ＥＤＴＡ処理により分散した膵島細胞のインスリン分泌量は、該処理をしていない膵島と比較して、非処理ディッシュ上およびＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上のいずれにおいても、低下していた。また、Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上において、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により分散した膵島細胞のｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘも、該処理をしていない膵島と比較して低下していた（図３）。従って、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、グルコース応答機能が低下することが示唆された。
［実施例５］
低酸素条件における膵島内での細胞死誘導率の測定
　実施例１と同一の培養条件下で、マウスより分離した膵島を、３．５ｃｍ Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ又は非処理ディッシュ上に播種し、１週間培養した。Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上の膵島は１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）にて回収し、非処理ディッシュ上の膵島と同様に浮遊状態にて、低酸素条件（Ｏ２；５％）および高酸素条件（Ｏ２；２０％）で１時間インキュベート（３７℃）した。その後、ＤＡＰＩ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（ＤＡＰＩ；Ｌｏｎｚａ） ５μｇ／ｍｌおよびＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ；Ｒｏｃｈｅ） ０．５μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ中で膵島を３０分インキュベート（３７℃）することで染色し、顕微鏡にて観察した（図４）。
　膵島の細胞数を定量化するために、指標としてＤＡＰＩ染色した細胞数をＩｍａｇｅＪにて算出した。また死細胞数を定量化するために指標としてＰＩ染色した細胞数をＩｍａｇｅＪにて算出した。以下の式により、細胞死率を算出した：
細胞死率（％）＝（ＰＩで染色された細胞数／ＤＡＰＩで染色された細胞数）×１００
　結果を図４及び５に示す。酸素濃度が２０％の場合は、非処理ディッシュ上およびＥ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上において細胞死誘導率がほぼ同程度であった。しかしながら、酸素濃度が５％の場合は、非処理ディッシュ上の膵島は中心部からＰＩ染色にて陽性であることから細胞が壊死しており（図４）、Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上の膵島と比較して高い細胞死誘導率が確認された（図５）。以上より、Ｅ－ｃａｄ－Ｆｃコートディッシュ上で培養することにより、低酸素条件下で誘導される膵島細胞の細胞死が抑制されることが示唆された。
　本発明の方法を用いれば、トリプシン処理を行うことなく、グルコース応答性機能低下を抑制しながら、低酸素条件に耐性のあるシート状の膵島を製造することが可能である。
　通常、体内であれば膵島組織内への血管誘導が生じるため、膵島が酸素不足に陥ることはない。しかしながら、移植した膵島の場合、移植部位における低酸素条件環境下では、酸素不足によって膵島の細胞死が誘導される懸念がある。本発明の方法により得られるシート状の膵島を用いれば、低酸素状態でも効率的にそれぞれの細胞へ酸素供給が可能となり、低酸素条件でも膵島の細胞死が抑制されるので、移植医療に有利である。
　本出願は日本で出願された特願２０１１－０８６３３６（出願日：２０１１年４月８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (5)

  1. 　単離された膵島を、Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器中、該固相表面に接着した状態で、当該膵島がシート状の形態を呈するのに十分な期間培養することを含む、シート状の膵島の製造方法。
  2. 　当該ポリペプチドがＥ－カドヘリンの細胞外ドメインを含む、請求項１記載の製造方法。
  3. 　当該ポリペプチドがＥ－カドヘリンの細胞外ドメイン及びイムノグロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドである、請求項１記載の製造方法。
  4. 　Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器、及びシート状の膵島を含み、該シート状の膵島が該ポリペプチドに接着した状態で培養可能となる、膵島培養物。
  5. 　Ｅ－カドヘリンのＥＣ１ドメインを含み、且つ当該Ｅ－カドヘリンへの結合能を有するポリペプチドを固相表面に固定又はコーティングした培養容器、及び単離された膵島を含む、シート状の膵島の製造用キット。
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