WO2012139179A1 - Peptídeos com atividade antimicrobiana, composições medicamentosas para o tratamento e profilaxia de animais, composições para o tratamento e profilaxia de plantas, usos dos ditos peptídeos, e, usos do extrato de paenibacillus elgii ourofinensis - Google Patents

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prophylaxis
animals
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Janaina FERNANDEZ DE ARAÚJO
Alinne PEREIRA DE CASTRO
Lucas CARVALHO
Octávio LUIS FRANCO
Adriane KUROKAWA SILVA
Ricardo HENRIQUE KRUGER
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Uniao Brasiliense de Educacao e Cultura UBEC
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Definitions

  • the present invention relates to lipopeptides with antimicrobial activity and growth promoting activity of organisms, especially plants and animals.
  • the lipopeptides of the invention were identified from extracts obtained from culture of the bacterial isolate of genus Paenibacillus, more specifically of the isolate Paenibacillus elgii.
  • the invention further relates to the use of Paenibacillus isolate extract as a growth promoter and in the treatment and prophylaxis of organisms such as plants and animals.
  • the invention also relates to the use of the peptides of the invention as growth promoter and in the treatment and prophylaxis of organisms such as plants and animals.
  • the present invention relates to animal compositions for the treatment and prophylaxis of animals, said composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of the peptides of the invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • Antibiotics are the most exploited microbial products in the biotechnology industry.
  • Today the technology used to treat veterinary infections and promote animal growth is based on conventional antibiotics.
  • Bacillus subtillis, Escherichia coli and Salmonella enteritidis which cause infections in chickens, have resistance to known antimicrobial agents such as tetracycline, nalidixic acid, ampicillin among others (see Ribeiro, AR, Kellermann, A., Santos, LR, Nascimento VP 2008.
  • Antimicrobial resistance in Salmonella enteritidis isolated from clinical and environmental samples. of broiler and heavy broiler breeders (Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 60 (5): 1259-1262).
  • Antimicrobial agents may be natural or synthetic substances that inhibit or kill microorganisms, including bacteria. There are currently over 15 different classes of antimicrobial substances, which differ in chemical structure and mechanism of action. making them highly specific in the treatment of specific pathogens. The emergence of antimicrobial agents was the great victory of the 20th century in the fields of medicine, veterinary and agriculture, not only for their therapeutic value, but also for their ability to promote, when used in sub-therapeutic amounts, the growth of plants and animals ( see "Use of antimicrobials outside human medicine and antimicrobial resistance in humans", Fact sheet No. 268, 01/2002, available on the Web at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs268/en/).
  • WO 09045023 which composition is based on the use of superabsorbent polymers as a support for (a) beneficial microorganisms that inhibit the growth of pathogens. in plants and (b) a nutrient medium for said beneficial microorganism.
  • WO 09045023 Paenibacillus elgii SD17 is cited as one of the beneficial microorganisms.
  • EP 1788074 describes new strains belonging to the genus Paenibacillus and their use, or the cultivation of these new strains, in plant disease control.
  • Said new strains are Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105 and Paenibacillus sp. BS-0277.
  • document formulations comprising the crude fermentation extract using the new strains and / or the compounds produced in such fermentations, which compounds Fusaricidin A, Fusaricidin B, compound 3 and compound 4 having their chemical formulas defined in claim 3.
  • the present invention aims at providing Paenibacillus sp extract with antimicrobial and / or growth promoting activity of animals intended for slaughter for human consumption comprising novel lipopeptides, not described in the prior art, with antimicrobial activity. More specifically, the invention provides novel peptides obtained from Paenibacillus fermentation extract fractions, preferably Paenibacillus elgii, said novel peptides having antimicrobial and growth promoting activity of organisms, for example, plants and animals. The invention also relates to the use of the extract as a growth promoter and antimicrobial agent in the treatment and prophylaxis of animals intended for human consumption.
  • the present invention comprises the process of obtaining extract comprising at least one of the following compounds:
  • Compound 2 where the process comprises the step of performing the extraction technique on Paenibacillus fermentate.
  • the present invention comprises Paenibacillus extracts comprising at least one of the following compounds:
  • a third embodiment of the invention relates to lipopeptides having antimicrobial and / or growth promoting activity, as follows:
  • a fourth embodiment of the invention relates to a medicated animal treatment and prophylaxis composition
  • a medicated animal treatment and prophylaxis composition comprising: (i) a therapeutically effective amount of at least one of the following compounds:
  • a fifth embodiment of the invention relates to a animal composition for the treatment and prophylaxis of animals comprising: (i) a therapeutically effective amount of Paenibacillus culture extract comprising at least one of the following compounds:
  • Compound 2 and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a sixth embodiment of the invention relates to a plant treatment and prophylaxis composition
  • a plant treatment and prophylaxis composition comprising: (i) an agriculturally effective amount of at least one of the following compounds:
  • a seventh embodiment of the invention relates to the uses of the lipopeptides of the present invention as growth promoters and antimicrobial agents in the treatment or prophylaxis of animals intended for human consumption.
  • An eighth embodiment of the invention concerns the uses of the lipopeptides of the present invention as growth promoters and in the treatment or prophylaxis of plant pathogen infections.
  • Compound 2 as a growth promoter and in the treatment or prophylaxis of conditions involving infections in animals or plants.
  • Figure 1 depicts the FT-MS spectrum of the crude extract produced by P. elgii.
  • Figure 2 represents the structural formula of Permetin A.
  • Figure 3 represents the CID spectrum of the m / z 1110.7 ion of Permetin A.
  • Figure 4 represents the proposed cleavage of Permetin A.
  • Figure 5 represents the structural formula of lipopeptides a) BMY-
  • Figure 6 represents the structural formula of a) Permetin A and b) Unpublished Compound 1.
  • Figure 7 represents the CID spectrum of the m / z 1067.7 ion of the novel compound 1.
  • Figure 8 is a comparative study of fragmentation patterns for a) compound 1 and b) permetin A.
  • Figure 9 represents the molecular formula of lipopeptides a) BMY-28160 and b) Compound 2.
  • Figure 10 represents the CID spectrum of the m / z 1073.7 ion corresponding to compound 2.
  • Figure 11 is a comparative study of fragmentation patterns for lipopeptides a) BMY-28160 and b) compound 2.
  • antimicrobial - term meaning extract and peptides originating from Paenibacillus, preferably Paenibacillus and / g // ' , more preferably
  • Paenibacillus elgii ourofinensis which inhibit, prevent or destroy the growth or proliferation of microbes such as bacteria, fungi, protozoa or similar organisms.
  • growth promoter means non-nutrient substances originating in Paenibacillus which, whether administered to plants by foliar application or to soil, or to animals for human consumption orally (eg incorporated in water or feed) or parenterally, increase yield: (a) in plants through vertical root growth, leaf extension, early flowering, fruit augmentation; (b) in animals, by increasing body mass gain, increasing feed efficiency, decreasing the time required for the animal to reach the ideal slaughter weight, improving organoleptic qualities and decreasing fat, preventing infectious or parasitic pathologies; decreased mortality.
  • therapeutically effective amount means a quantity of the antimicrobial agent that is sufficient to effectively inhibit or prevent the establishment, growth, or spread of an infection caused by microorganisms sensitive to the peptides or Paenibacillus extract of the invention; or an amount of the organism growth promoting agent that is sufficient to effectively promote the growth and development of these organisms such as animals and plants.
  • plant pathogen a term which means any organism that may cause damage and / or disease to plants and includes fungi, prokaryotes (bacteria and mycoplasma), nematodes, protozoa and similar organisms.
  • therapeutic adjuvant a term which refers to agents that help or increase the action of the active ingredient or that affect the absorption, mechanism of action, metabolism or elimination of the active ingredient in order to increase its effects, whether in combat an infection caused by microbes, that is, in the growth process of organisms such as plants and animals; additionally, this term includes prophylactic action in enhancing the immune response developed by the peptides or Paenibacillus extract of the invention.
  • additive - a term meaning substances added to the plant treatment composition to increase the efficiency or modify certain properties of the formulation, such as absorption of the active ingredient, to facilitate application or minimize certain problems.
  • pharmaceutically acceptable carrier or excipient a term which means, in a therapeutically or prophylactically active drug composition, any substance which, at concentrations present in the pharmaceutical form, has no pharmacological activity, being employed in the composition for the purpose of providing the pharmaceutical form of characteristics that ensure its stability, bioavailability, acceptability and ease of administration or application, and which serves as the carrier of the active principle with antimicrobial action and / or growth promoter of the target animal.
  • agriculturally acceptable carrier or substrate - a term in a plant treatment composition means any substance which has no therapeutic or prophylactic action and which serves as the carrier of the active principle with antimicrobial action and / or growth promoter of Target plant.
  • the invention provides novel agents with antimicrobial activity and growth promoting organisms from identification and isolation of these new agents from Paenibacillus.
  • the identification of these agents motivated the production of fermentation broth extract and preparation of peptides with antimicrobial activity and growth promoter of animals and plants.
  • the importance of this preparation lies in the fact that it allows the use of said extract and peptides, among others, in the control of bacteria and fungi that cause loss in economically important livestock (for example, chickens and pigs).
  • said extract and peptides also act as plant growth promoters and as inhibitors of plant infections by phytopathogens.
  • the invention is based on the process of obtaining and isolating and identifying novel lipopeptides found in bacterial isolated extracts. These new bacterial compounds are capable of producing antimicrobial activity (s) against a number of veterinary infection-causing bacteria and fungi, strains that already have resistance to current antibiotics. Specifically, this invention proposes, in one of its embodiments, the use of the culture supernatant and / or extract as novel lipopeptides found in bacterial isolated extracts for the control of veterinary infections and the promotion of animal growth.
  • the separation process provided fractions that were analyzed and at least two of the lipopeptides responsible for antimicrobial activity were identified. This identification was performed by sequencing and the result of this analysis showed that there is no sequence similar to those of the present invention in the protein and peptide databases, indicating that new lipopeptides with antimicrobial activity were isolated.
  • the present invention relates, in a first embodiment, to the process of obtaining a new bacterial extract having at least one biological activity, among antimicrobial activity in relation to microorganisms that cause disease or damage to animals and plants and growth promoting activity of said animals and plants, said new bacterial extract being characterized by comprising at least one of the new compounds described below:
  • the term "compound” and "lipoprotein” will be used interchangeably in the present invention to designate the new chemical elements found in Paenibacillus extract, preferably Paenibacillus elgii extract, more preferably Paenibacillus elgii ourofinensis extract.
  • the term "bacterial extract” is intended in this description to mean the extract obtained from the processing of PaenibacHIus, preferably from the fermented PaenibacHIus.
  • processing of the PaenibacHIus fermentate for extraction is carried out by methods known in the art such as, for example, liquid-liquid extraction using organic solvent such as, but not limited to, n-butanol, or by extraction with ion exchange cartridge.
  • the present invention also relates to specific peptides having the following compounds 1 and / or 2:
  • Lipopeptides of the present invention may be produced by known techniques and obtained in substantially pure form.
  • lipopeptides may be synthesized manually or on an automated synthesizer or may be isolated from the Paenibacillus bacterial fermentation broth.
  • the present invention also relates to medicaments for the treatment and prophylaxis of animal animals for human consumption, said compositions comprising: (i) a therapeutically effective amount of at least one of the compounds of the present invention; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient and (iii) optionally a therapeutic adjuvant.
  • the lipopeptides of the invention possess antimicrobial activity and / or growth promoting activity of said animals.
  • the invention also encompasses a medicament composition for the treatment and prophylaxis of animals intended for human consumption, said compositions comprising: (i) a therapeutically effective amount of Paenibacillus culture extract containing at least one of the compounds of the present invention; (ii) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient; (il) optionally a therapeutic adjuvant; Said extract may be in liquid form, corresponding to the liquid phase (supernatant) separated from the fermentation broth, or may be in the dry state after drying, for example by lyophilization, of said liquid phase.
  • compositions of the invention contain as active ingredient at least one of the lipopeptides of the present invention, or mixtures thereof, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and optionally one or more therapeutic adjuvants. Therefore, the active ingredients according to the invention may be administered individually or together in any conventional oral / parenteral pharmaceutical / veterinary form.
  • the composition of the invention may be in the form of solution, suspension, tablet, pill, capsule, powders, and solid forms may be of the type of rapid release, controlled release or extended release or any combination of these types, and such forms may be added to water or animal feed.
  • the tablet form contains various excipients such as sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate and the like together with disintegrants such as starch or complex silicates. It is also common in this pharmaceutical form for the use of binding agents such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin and acacia and additionally lubricating agents such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and acacia.
  • binding agents such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin and acacia
  • lubricating agents such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and acacia.
  • suitable solid pharmaceutical / veterinary forms include powders which may be of the water dispersible type or may be packaged in hard capsule or soft capsule gelatin capsules, in which case the excipient may include lactose or polyethylene glycols of molecular weight. varied.
  • sweeteners In the case of liquid oral administration dosage forms, sweeteners, flavoring agents, colorants, emulsifying or suspending enhancers and diluents such as water, ethanol, propylene glycol, glycerin and combinations thereof may be used in the excipient.
  • compositions containing the active ingredients of the invention are usually prepared following conventional methods and are administered in appropriate pharmaceutical / veterinary form.
  • solid oral pharmaceutical / veterinary forms may contain, along with the active ingredient, diluents, lubricants, binding agents, disintegrating agents and the like.
  • diluents that may be used in the pharmaceutical / veterinary compositions of the invention are: lactose, dextrose, sucrose, cellulose, cornstarch or potato starch.
  • lubricants that may be used in the pharmaceutical / veterinary compositions of the invention are: silica, talc, stearic acid, magnesium or calcium stearate, and / or polyethylene glycols.
  • binding agents which may be used in the pharmaceutical / veterinary compositions of the invention are: starches, gum arabic, gelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose or polyvinyl pyrrolidone.
  • disintegrating agents which may be used in the pharmaceutical / veterinary compositions of the invention are: starch, alginic acid, starch or sodium starch glycolate; effervescent mixtures; dyes; sugary.
  • wetting agents such as lectin, polysorbates, lauryl sulfates may be used in the pharmaceutical / veterinary compositions of the invention; and, in general, non-toxic pharmacologically inactive substances commonly used in pharmaceutical / veterinary formulations.
  • compositions of the invention may be carried out in known manner, for example, by mixing, granulating, tableting, sugar coating, or film coating processes.
  • Liquid dispersions for oral administration may be, for example, syrups, emulsions and suspensions.
  • syrups may contain one or more carrier agents, for example sucrose or sucrose with glycerin and / or mannitol and / or sorbitol.
  • Suspensions and emulsions may contain as a carrier, for example, a natural gum, agar, sodium alginate, pectin, methylcellulose, carboxymethylcellulose or polyvinyl alcohol.
  • sterile and pharmacologically acceptable oils is conventional and propylene glycol as well as sterile aqueous solutions may be employed.
  • compositions of the present invention may further contain one or more therapeutic adjuvants.
  • adjuvants are: polysaccharide-phosphidium conjugate as described in US Patent 5,785,975; emulsion-based veterinary adjuvants, for example Emulsigen®, Carbigen®, Polygen®, available from MPV Technologies; adjuvants such as acrylic polymer and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, described in US2009 / 0017067; sub-micron oil-in-water emulsion of squalene, polyoxyethylene, sorbitan monooleate and sorbitan trioleate, known by the brand name MF59 TM, available from Novartis, and other examples may be mentioned.
  • the invention also relates to a plant treatment and prophylaxis composition
  • a plant treatment and prophylaxis composition comprising: (i) a therapeutically effective amount of at least one of the lipopeptides of the present invention; (ii) an agriculturally acceptable carrier or substrate; and (iii) optionally at least one additive.
  • said plant treatment and prophylaxis composition comprises: (i) an agriculturally effective amount of the Paenibacillus culture extract comprising the lipopeptides of the present invention; (ii) an agriculturally acceptable carrier or substrate; and (iii) optionally at least one additive.
  • the formulation of the invention may be in liquid form or solid form, for example in wettable powder form. Both formulations, dry or liquid, must be packaged in packaging and conditions that preserve the integrity of the active ingredients. Liquid formulations have shorter shelf life, but dry formulations (eg wettable powder) require less rigid conditions such as storage in a cool place with no light and moisture, and the product can be stored from crop to crop, provided it is stored in a freezer or refrigerator.
  • the formulations of the invention generally contain an amount of active ingredient effective in controlling plant-damaging microorganisms and / or promoting plant growth, said active ingredient comprising the lipopetides of the present invention, described below:
  • Formulations which may be used include powders, granules, pellets, suspensions, emulsions, wettable powders, flowable solids and the like, provided that such forms are consistent with the physicochemical properties of the active ingredient and compatible with the lipopetides of the present invention. mode of application and environmental factors such as soil type, air humidity and temperature. Spray formulations can also be used, especially when application areas are large. More concentrated compositions are also within the protection scope of the present invention, and said compositions are suitable for use as intermediates for the diluted end product to be applied.
  • the formulations of the invention will typically contain effective amounts of the active ingredient, one or more diluents, one or more surfactants and other suitable additives to achieve desirable product characteristics. Furthermore, it should be clear that the active ingredient used in the present invention may also be used alone in special applications where high concentration of the composition of the invention is required.
  • compositions of the invention may be added to the compositions of the invention, such as additives to reduce foaming, dullness, corrosion, microbial growth. unwanted, and other similar agents.
  • Another essential feature of the formulation of the present invention is the need to ensure that all ingredients of the composition are mutually compatible and do not contribute to the loss of antimicrobial and / or growth promoting activity characteristic of the active principle of the invention.
  • compositions of the present invention may also be mixed with other agricultural chemicals, fertilizers, soil conditioners, stabilizers, or with one or more biologically active insecticides, fungicides, acaricides or other compounds to form a multicomponent formulation.
  • other agricultural protection products with the active principle of the formulation of the present invention may be mixed are sodium channel agonist type insecticides (e.g. pyrethroids), sodium channel blocking agents (e.g. pyrazolines), acetylcholinesterase inhibitors (e.g. organophosphates and carbamates), nicotinic binding agents acetylcholine, gabaergic binding agents, octapine agonists or antagonists (e.g. formamidines), pyrrol group insecticides and others.
  • sodium channel agonist type insecticides e.g. pyrethroids
  • sodium channel blocking agents e.g. pyrazolines
  • acetylcholinesterase inhibitors e.g. organophosphates and
  • the organic extract obtained from the liquid-liquid extraction of the fermented Paenibacillus elgii in n-butanol presents a mixture of 5 lipopeptides belonging to the Permetin class.
  • the compounds of m / z 1067.7 and 1053.7 are unpublished.
  • Signal of m / z 1 101.7 was assigned to the presence of permetin A
  • signal of m / z 1087.7 was assigned to the presence of compound BMY- 28160
  • the m / z signal 1073.7 were assigned to compound Pelgipeptin A.
  • These compounds were characterized by ultra-resolution mass spectrometry employing an FT-ICR-MS spectrometer and collision induced dissociation (ICD) experiments. These two experiments confirm the proposed structure for all lipopeptides present in the organic extract produced by Paenibacillus elgii, as detailed below.
  • Permetins are lipopeptides containing 9 amino acids linked to a lipid chain of a 6-carbon ⁇ - hydroxy acid.
  • the m / z signal 101, 7024 was attributed to the presence of Permetin A ( Figure 2).
  • the m / z signal 1 101, 7 was subjected to sequential mass spectrometry (MS / MS) experiments for fragmentation and structural characterization studies.
  • MS / MS mass spectrometry
  • ICD collision induced fragmentation spectrum
  • the m / z signal 1087,6868 which was attributed to the presence of lipopeptide BMY-28160, is a Permetin A analogous lipopeptide.
  • the amino acid at position 2 is a Valine (Val) other than Permetin A where The amino acid of this position 2 is a Leucine / Isoleucine (Leu / lle) as shown in Figure 5.
  • the signals of m / z 1073,6734 were also observed; 1067,7193 and 1053,7042.
  • Wu and co-workers 2 have already identified the m / z signal 1073.6734 which has been assigned to a lipopeptide analog BMY-28160 with a 14 Da difference which has been assigned as a methylene group (-CH 2 -).
  • the amino acid sequence of compound 1 was characterized as an analog of Permetin A, where the amino acid Phenylalanine (Phe) of position 4 of Permetin A was replaced by amino acid leucine / isoleucine (Leu / lle).
  • Figure 6 the amino acid sequence of compound 1 was characterized as an analog of Permetin A, where the amino acid Phenylalanine (Phe) of position 4 of Permetin A was replaced by amino acid leucine / isoleucine (Leu / lle).
  • the m / z signal 1053,7 was subjected to ICD experiments to obtain information on the amino acid sequencing of this new compound.
  • the fragmentation spectrum obtained is shown in Figure 10.

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Abstract

A presente invenção proporciona extratos material fermentado com Paenibacillus sp., preferencialmente o aqui denominado Paenibacillus elgii ourofinensis, com atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento de animais destinados ao abate para consumo humano. A invenção proporciona novos peptídeos obtidos a partir de frações do extrato de fermentação de Paenibacillus elgii ourofinensis, ditos novos peptídeos tendo atividade antimicrobiana e promotora de crescimento de organismos, por exemplo, plantas e animais. A invenção também trata da utilização do extrato dessa nova cepa, Paenibacillus elgii ourofinensis, como promotor de crescimento e como agente antimicrobiano no tratamento e profilaxia de animais destinados ao consumo humano.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção
PEPTÍDEOS COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, COMPOSIÇÕES MEDICAMENTOSAS PARA O TRATAMENTO E PROFILAXIA DE ANIMAIS, COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO E PROFILAXIA DE PLANTAS, USOS DOS DITOS PEPTÍDEOS, E, USOS DO EXTRATO DE PAENIBACILLUS ELGII
OUROFINENSIS
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a lipopeptídeos com atividade antimicrobiana e com atividade promotora de crescimento de organismos, em especial plantas e animais. Os lipopeptídeos da invenção foram identificados a partir de extratos obtidos da cultura do isolado bacteriano do género Paenibacillus, mais especificamente do isolado Paenibacillus elgii. A invenção ainda se refere ao uso do extrato do isolado de Paenibacillus, como promotor de crescimento e no tratamento e profilaxia de organismos, tais como plantas e animais. A invenção também se refere ao uso dos peptídeos da invenção como promotor de crescimento e no tratamento e profilaxia de organismos, tais como plantas e animais. Adicionalmente, a presente invenção trata de composições medicamentosas para tratamento e profilaxia de animais, dita composição compreendendo uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz dos peptídeos da invenção em associação com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Antecedentes da Invenção
Os antibióticos são os produtos microbianos mais explorados na indústria biotecnológica. Atualmente a tecnologia utilizada para o tratamento de infecções veterinárias e na promoção do crescimento animal se baseia em antibióticos convencionais. Por exemplo, foi demonstrado que as bactérias Bacillus subtillis, Escherichia coli e Salmonella enteritidis, que causam infecções em frangos, possuem resistência a agentes antimicrobianos conhecidos tais como tetraciclina, ácido nalidíxico, ampicilina dentre outros (ver Ribeiro, A. R., Kellermann, A., Santos, L. R., Nascimento V.P. 2008. Resistência antimicrobiana em Salmonella enteritidis isoladas de amostras clínicas e ambientais de frangos de corte e matrizes pesadas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 60 (5): 1259-1262). Tais antibióticos convencionais também são utilizados para o tratamento de infecções humanas. Esta sobreposição leva ao aparecimento de um grande aumento de cepas resistentes, o que dificulta o tratamento de infecções em seres humanos. Assim, o isolamento de novas entidades químicas com atividade antimicrobiana para uso exclusivo em animais, trará vantagens significativas na criação de animais para abate, sendo ditas novas entidades utilizadas como promotores de crescimento e no tratamento de infecções veterinárias, vantagens essas que resultarão não só no aumento do lucro dos produtores, mas também na exclusão do uso dos antibióticos atuais em animais consumidos pelo homem.
O surgimento de bactérias resistentes ocorreu logo após o uso clínico de agentes antimicrobianos do tipo penicilina. Desde então ficou evidente que a cada novo agente antimicrobiano que é disponibilizado no mercado rapidamente aparecem bactérias resistentes a esses novos agentes e a rapidez com que essa resistência é desenvolvida é proporcional à dimensão do uso desses novos fármacos. Recentemente foi constatado que o uso de antimicrobianos em animais utilizados na alimentação do homem vem ocasionando o aparecimento de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos usados no tratamento de infecções em seres humanos (para maiores detalhes, ver Wegener H.C. et al. "Public Health Impacts of the Use of Antimicrobials in Food Animais", Proceedings of the WBC Congress, 23rd World Buiatrics Congress, Quebec City, Canada, 2004).
Os agentes antimicrobianos podem ser substâncias naturais ou sintéticas que inibem ou matam microrganismos, incluindo bactérias. Atualmente existem mais de 15 diferentes classes de substâncias antimicrobianas, as quais diferem em estrutura química e mecanismo de ação fazendo com que elas sejam altamente específicas no tratamento de patógenos específicos. O surgimento dos agentes antimicrobianos foi a grande vitória do século 20 nos campos da medicina, veterinária e agricultura, não só pelo seu valor terapêutico, como pela sua propriedade em promover, quando utilizados em quantidades sub-terapêuticas, o crescimento de plantas e animais (ver "Use of antimicrobials outside human medicine and resultant antimicrobial resistance in humans", Fact sheet N°268, 01/2002, disponível na Web em http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs268/en/).
Os problemas do uso de antibióticos como agentes antimicrobianos para o tratamento de seres humanos e animais têm assumido um vulto tão grande que as autoridades governamentais de diversos países têm não só promovido pesquisas para minimizar o impacto da resistência de bactérias patogênicas aos atuais antibióticos, como também se empenhado em campanhas de esclarecimento da população para os riscos cada vez maiores desse aumento de resistência visando à redução do uso de antibióticos em animais, principalmente em quantidades subterapêuticas na promoção do crescimento dos animais e melhorar o rendimento na produção de carne. Exemplos dessas iniciativas governamentais são: (1) o Relatório "Overárching AMR" do Reino Unido, publicado em 2004 (ver "Overview of Antimicrobial Usage and Bacterial Resistance in Selected Human and Animal Pathogens in the UK:2004", disponível na Web em http://www.dardni.gov.uk/index/publications/pubs-dard- animal-health/pubs-vet-meds.htm) e (2) o trabalho realizado por San Martin, B. et al. Financiado pelo Fundo Nacional Chileno para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico (ver San Martin, B. et al. "Evaluation of Antimicrobial Resistance Using Indicator Bactéria Isolated from Pigs and Poultry in Chile", Intern J Appl Res Vet Med, Vol. 3, No. 2, 171-178, 2005).
Um dos caminhos mais promissores na busca para alcançar esse objetivo é a utilização de material biológico que seja eficaz como agente antimicrobiano e como promotor de crescimento de animais, especialmente de frangos e suínos. Em 2004 foi identificada, pelo grupo de Dal-Soo (ver Dal-Soo, K. et al. "Paenibacillus elgii sp. nov., with broad antimicrobial activity", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54, 2031- 2035, 2004), duas cepas (SD17 e SD18) que foram classificadas como uma nova bactéria formadora de esporos com ampla atividade antimicrobiana, ditas cepas tendo sido isoladas de raízes de Perilla frutescens. Posteriormente, Dal- Soo, K. et al. (ver Dal-Soo, K. et al. "Paenibacillus elgii SD17 as a Biocontrol Agent Against Soil-borne Turf Diseases", Plant Pathol. J. 21 (4):328-333, 2005) identificaram, na cepa SD17, atividade antimicrobiana de amplo espectro contra doenças causadas por microrganismos em grama. Os testes laboratoriais realizados com formulação em grânulos preparada com calda de fermentação de Paenibacillus elgii SD17 mostraram eficácia semelhante à dos fungicidas comerciais, enquanto que os testes em campo, com a mesma formulação, mostraram eficácia inferior à dos fungicidas comerciais. Apesar desses resultados em campo, os autores consideraram a formulação em grânulos feita com Paenibacillus elgii SD17 um apropriado agente de biocontrole.
A busca por agentes antimicrobianos para o tratamento de doenças em plantas causadas por microrganismos também resultou na composição descrita no documento WO 09045023, composição essa que é baseada na utilização de polímeros super absorventes como suporte de (a) microrganismos benéficos que inibem o crescimento de patógenos nas plantas e de (b) um meio nutriente para o referido microrganismo benéfico. Na página 13, linha 2 do documento WO09045023 é citado como um dos microrganismos benéficos o Paenibacillus elgii SD17.
No documento EP 1788074 são descritas novas cepas pertencentes ao género Paenibacillus e o seu uso, ou da cultura dessas novas cepas, no controle de doenças em plantas. As referidas novas cepas são Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105 e Paenibacillus sp. BS-0277. Nesse documento são descritas formulações compreendendo o extrato bruto de fermentação utilizando as novas cepas e/ou os compostos produzidos nessas fermentações, compostos esses denominados Fusaricidin A, Fusaricidin B, composto 3 e composto 4 tendo as suas fórmulas químicas definidas na reivindicação 3.
Como pode ser verificado no estado da técnica acima citado não há nenhuma menção ao isolamento de proteínas ou peptídeos com atividade protetora e promotora de crescimento de planta obtido a partir de Paenibacillus sp. Mais que isso, não há nenhum relato sobre a obtenção de proteína ou peptídeo obtido a partir de Paenibacillus sp. com atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento de animais destinados ao abate para consumo humano. Tais proteínas ou peptídeos trazem um avanço importante na busca por alternativas de redução da crescente resistência de bactérias patogênicas aos antibióticos em uso para o tratamento de infecções microbianas em seres humanos.
Sumário da Invenção
A presente invenção objetiva o provimento do extrato de Paenibacillus sp com atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento de animais destinados ao abate para consumo humano compreendendo novos lipopeptídeos, não descritos no estado da técnica, com atividade antimicrobiana. Mais especificamente, a invenção provê novos peptídeos obtidos a partir de frações do extrato de fermentação de Paenibacillus, preferencialmente Paenibacillus elgii, ditos novos peptídeos tendo atividade antimicrobiana e promotora de crescimento de organismos, por exemplo, plantas e animais. A invenção também trata da utilização do extrato como promotor de crescimento e como agente antimicrobiano no tratamento e profilaxia de animais destinados ao consumo humano.
Em uma concretização inicial, a presente invenção compreende o processo de obtenção de extrato compreendendo pelo menos um dos compostos a seguir representados:
Figure imgf000008_0001
Composto 1 ;
Figure imgf000008_0002
Composto 2; onde o processo compreende a etapa de realizar a técnica de extração no fermentado de Paenibacillus.
Em uma segunda concretização, a presente invenção compreende extratos de Paenibacillus compreendendo pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000009_0001
Composto 2.
Uma terceira concretização da invenção refere-se a lipopeptídeos tendo atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento, a seguir representados:
Figure imgf000009_0002
Composto 1 ; e/ou;
Figure imgf000010_0001
Composto 2;
Uma quarta concretização da invenção diz respeito a uma composição medicamentosa para tratamento e profilaxia de animais compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000010_0002
Composto 1 ;
Figure imgf000011_0001
Composto 2; e;
(ii) opcionalmente, um adjuvante terapêutico; e (iii) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Uma quinta concretização da invenção diz respeito a uma composição medicamentosa para tratamento e profilaxia de animais compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz do extrato da cultura de Paenibacillus compreendendo pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000011_0002
Composto 1 ;
Figure imgf000012_0001
Composto 2; e (ii) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Uma sexta concretização da invenção diz respeito a uma composição para tratamento e profilaxia de plantas compreendendo: (i) uma quantidade agricolamente eficaz de pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000012_0002
Composto 1 ;
Figure imgf000013_0001
Composto 2;
e (ii) um veículo ou substrato agricolamente aceitável.
Uma sétima concretização da invenção refere-se aos usos dos lipopeptídeos da presente invenção como promotores de crescimento e como agentes antimicrobianos no tratamento ou profilaxia de animais destinados ao consumo humano.
Uma oitava concretização da invenção diz respeito aos usos dos lipopeptídeos da presente invenção como promotores de crescimento e no tratamento ou profilaxia de infecções causadas em plantas por fitopatógenos.
Uma nona concretização da invenção diz respeito aos usos do extrato da cultura de Paenibacillus compreendendo pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000013_0002
Composto 1 ;
Figure imgf000014_0001
Composto 2; como promotor de crescimento e no tratamento ou profilaxia de condições envolvendo infecções em animais ou em plantas.
Breve Descrição das Figuras
A figura 1 descreve o espectro de FT-MS do extrato bruto produzido pelo P. elgii.
A figura 2 representa a fórmula estrutural da Permetina A.
A figura 3 representa o espectro de CID do íon de m/z 1 101 ,7 da Permetina A.
A figura 4 representa a proposta de clivagem de Permetina A.
A figura 5 representa a fórmula estrutural dos lipopeptídeos a) BMY-
28160 e b) Permetina A.
A figura 6 representa a fórmula estrutural de a) Permetina A e b) Composto 1 inédito.
A figura 7 representa o espectro de CID do íon de m/z 1067,7 do composto inédito 1.
A figura 8 representa um estudo comparativo dos padrões de fragmentação para a) composto 1 e b) Permetina A.
A figura 9 representa a fórmula molecular dos lipopeptídeos a) BMY- 28160 e b) Composto 2. A figura 10 representa o espectro de CID do íon de m/z 1053,7 correspondente ao composto 2.
A figura 1 1 representa um estudo comparativo dos padrões de fragmentação para os lipopeptídeos a) BMY-28160 e b) composto 2.
Descrição Detalhada da Invenção
Para tornar mais claro e completo o entendimento da invenção, os termos empregados nesta descrição são definidos como se segue:
- "antimicrobiano" - termo que significa extrato e peptídeos originárias de Paenibacillus, preferencialmente Paenibacillus e/g//', mais preferencialmente
Paenibacillus elgii ourofinensis que inibem, previnem ou destroem o crescimento ou proliferação de micróbios tais como bactérias, fungos, protozoários ou organismos semelhantes.
- "promotor de crescimento" - substâncias não nutrientes originárias de Paenibacillus que, administradas a plantas por aplicação foliar ou no solo, ou a animais para consumo humano por via oral (por exemplo, incorporadas na água ou na ração) ou por via parenteral, aumentam a produtividade: (a) nas plantas através de crescimento radicular vertical, extensão das folhas, florescência antecipada, aumento de frutos; (b) nos animais, através de aumento do ganho de massa corporal, aumento da eficiência alimentar, diminuição do tempo necessário para o animal alcançar o peso ideal para abate, melhoria nas qualidades organolépticas e diminuição da gordura, prevenção de patologias infecciosas ou parasitárias e diminuição da mortalidade.
- "quantidade terapeuticamente eficaz" - termo que significa uma quantidade do agente antimicrobiano que é suficiente para eficazmente inibir ou prevenir o estabelecimento, crescimento ou a propagação de uma infecção, causada por microrganismos, sensível aos peptídeos ou ao extrato de Paenibacillus da invenção; ou uma quantidade do agente promotor de crescimento de organismos que é suficiente para eficazmente promover o crescimento e desenvolvimento desses organismos, tais como animais e plantas.
- "patógeno de planta" - termo que significa todo e qualquer organismo que pode causar dano e/ou doença a plantas e inclui fungos, procariontes (bactéria e micoplasma), nematódeos, protozoários e organismos semelhantes.
- "adjuvante terapêutico" - termo que corresponde a agentes que ajudam ou aumentam a ação do princípio ativo, ou que afetam a absorção, o mecanismo de ação, o metabolismo ou eliminação do princípio ativo de modo a aumentar seus efeitos, sejam eles no combate a uma infecção causada por micróbios, ou seja, no processo de crescimento dos organismos, tais como plantas e animais; adicionalmente, este termo inclui a atuação profilática na elevação da resposta imunológica desenvolvida pelos peptídeos ou pelo extrato de Paenibacillus da invenção.
- "aditivo" - termo que significa substâncias adicionadas à composição para tratamento de planta para aumentar a eficiência ou modificar determinadas propriedades da formulação, tal como a absorção do princípio ativo, visando facilitar a aplicação ou minimizar determinados problemas.
- "veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável" - termo que significa, em uma composição medicamentosa de atuação terapêutica ou profilática, toda e qualquer substância que, nas concentrações presentes na forma farmacêutica, não possui atividade farmacológica, sendo empregada na composição com a finalidade de dotar a forma farmacêutica de características que assegurem sua estabilidade, biodisponibilidade, aceitabilidade e facilidade de administração ou aplicação, e que serve como portador do princípio ativo com ação antimicrobiana e/ou promotora de crescimento do animal alvo.
- "veículo ou substrato agricolamente aceitável" - termo que significa, em uma composição de tratamento de plantas, toda e qualquer substância que não possui ação terapêutica ou profilática e que serve como portador do princípio ativo com ação antimicrobiana e/ou promotora de crescimento da planta alvo.
A invenção provê novos agentes com atividade antimicrobiana e promotora de crescimento de organismos a partir da identificação e do isolamento desses novos agentes de Paenibacillus. A identificação desses agentes motivou a obtenção do extrato de caldo de fermentação e da preparação de peptídeos com atividade antimicrobiana e promotora de crescimento de animais e plantas. A importância dessa preparação reside no fato de permitir o uso do dito extrato e peptídeos, dentre outros, no controle de bactérias e fungos que causam perda nas criações de animais economicamente importantes (por exemplo, frangos e porcos). Além dessa atividade antimicrobiana, os ditos extrato e peptídeos também agem como promotores de crescimento de plantas e como inibidores de infecções de plantas por fitopatógenos.
Em um primeiro momento, a invenção se baseia no processo de obtenção e isolamento e identificação de novos lipopeptídeos encontrados em extratos isolados bacterianos. Estes novos compostos bacterianos são capazes de produzir atividade(s) antimicrobiana(s) contra inúmeras bactérias e fungos causadores de infecções veterinárias, cepas estas que já possuem resistência contra os antibióticos atuais. Especificamente, esta invenção propõe, em uma de suas concretizações, o uso do sobrenadante e/ou extrato da cultura comrpeendendo novos lipopeptídeos encontrados em extratos isolados bacterianos para o controle de infecções veterinárias e na promoção de crescimento de animais.
Como será detalhado mais adiante, após análises cromatográficas e eletroforéticas da amostra liofilizada de caldo fermentado do novo isolado, o processo de separação forneceu frações que foram analisadas, e foram identificados pelo menos dois dos lipopeptídeos responsáveis pela atividade antimicrobiana. Essa identificação foi realizada por meio de sequenciamento e o resultado dessa análise demonstrou que não existe nos bancos de dados de proteínas e peptídeos outra sequência similar às da presente invenção, indicando que foram isolados novos lipopeptídeos com atividade antimicrobiana.
A presente invenção se refere, em uma primeira concretização, a processo de obtenção de um novo extrato bacteriano tendo pelo menos uma atividade biológica, dentre atividade antimicrobiana com relação a microrganismos que causam doenças ou danos em animais e plantas e atividade promotora de crescimento de ditos animais e plantas, dito novo extrato bacteriano sendo caracterizado por compreender pelo menos um dos novos compostos descritos a seguir:
Figure imgf000018_0001
Composto 2.
O termo "composto" e "lipoproteína" serão utilizados de forma intercambiável na presente invenção para designar os novos elementos químicos encontrados no extrato de Paenibacillus, preferencialmente no extrato de Paenibacillus elgii, mais preferencialmente no extrato de Paenibacillus elgii ourofinensis. O termo "extrató bacteriano" tem a intenção de significar, nesta descrição, o extrato obtido a partir do processamento de PaenibacHIus, preferencialmente do fermentado de PaenibacHIus. Em uma realização preferencial, o processamento do fermentado de PaenibacHIus para extração é realizado pelos métodos conhecidos no estado da técnica como, por exemplo, extração líquido-líquido utilizando solvente orgânico como, por exemplo, mas sem se restringir a, n-butanol, ou por extração com cartucho de troca iônica.
A presente invenção também se refere a peptídeos específicos tendo os compostos 1 e/ou 2, descritos a seguir, em si:
Figure imgf000019_0001
Composto 1 ;
Figure imgf000019_0002
Composto 2 ambos possuindo atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento de plantas e animais, especialmente animais tais como frangos e porcos. Os lipopeptídeos da presente invenção podem ser produzidos por técnicas conhecidas e obtidos na forma substancialmente pura. Por exemplo, os lipopeptídeos podem ser sintetizados manualmente ou em um sintetizador automático ou podem ser isolados a partir do caldo de fermentação de bactérias Paenibacillus.
A presente invenção também diz respeito a composições medicamentosas para tratamento e profilaxia de animais de animais destinados ao consumo humano, ditas composições compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos da presente invenção; e (ii) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável e (iii) opcionalmente, um adjuvante terapêutico. Como mencionado anteriormente, os lipopeptídeos da invenção possuem atividade antimicrobiana e/ou atividade promotora de crescimento dos referidos animais.
A invenção também abrange uma composição medicamentosa para tratamento e profilaxia de animais destinados ao consumo humano, ditas composições compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz do extrato da cultura de Paenibacillus contendo pelo menos um dos compostos da presente invenção; (ii) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável; (iil) opcionalmente, um adjuvante terapêutico;. O dito extrato pode estar na forma líquida, correspondendo à fase líquida (sobrenadante) separada do caldo de fermentação, ou pode estar no estado seco após secagem, por exemplo, por liofilização, da referida fase líquida.
As composições medicamentosas da invenção contêm como princípio ativo pelo menos um dos lipopeptídeos da presente invenção, ou suas misturas, em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um ou mais adjuvantes terapêuticos. Portanto, os princípios ativos, de acordo com a invenção, podem ser administrados individualmente ou conjuntamente em qualquer forma farmacêutica/veterinária convencional de administração oral ou parenteral. Para administração oral, a composição da invenção pode estar na forma de solução, suspensão, comprimido, pílula, cápsula, pós, podendo as formas sólidas ser do tipo de liberação rápida, liberação controlada ou liberação prolongada ou qualquer combinação destes tipos, podendo tais formas serem adicionadas à água ou ração dos animais.
A forma de comprimido contém vários excipientes, tais como citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio e semelhantes juntamente com desintegrantes tal como amido ou silicatos complexos. Também é comum, nesta forma farmacêutica, a utilização de agentes de ligação, tais como polivinilpirrolidona, sacarose, gelatina e acácia e, adicionalmente, agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e acácia.
Outras formas farmacêuticas/veterinárias sólidas apropriadas incluem pós que podem ser do tipo dispersível em água ou podem ser acondicionados em cápsulas de gelatina do tipo cápsula-dura ou cápsula-mole, podendo, neste caso, o excipiente incluir lactose ou polietileno glicóis de pesos moleculares variados.
No caso de formas farmacêuticas líquidas de administração oral, podem ser utilizados, no excipiente, adoçantes, agentes flavorizantes, corantes, agentes emulsificantes ou aperfeiçoadores de suspensão e diluentes tais como água, etanol, propileno glicol, glicerina e suas combinações.
As composições farmacêuticas contendo os princípios ativos da invenção são normalmente preparadas seguindo métodos convencionais e são administrados em forma farmacêutica/veterinária apropriada.
Exemplificando, as formas farmacêuticas/veterinárias orais sólidas podem conter, juntamente com o princípio ativo, diluentes, lubrificantes, agentes de ligação, agentes desagregantes e outros. Exemplos de diluentes que podem ser usados nas composições farmacêuticas/veterinárias da invenção são: lactose, dextrose, sacarose, celulose, amido de milho ou amido de batata. Exemplos de lubrificantes que podem ser usados nas composições farmacêuticas/veterinárias da invenção - são: sílica, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio ou de cálcio, e/ou glicóis de polietileno. Exemplos de agentes de ligação que podem ser usados nas composições farmacêuticas/veterinárias da invenção são: amidos, goma arábica, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou polivinil pirrolidona. Exemplos de agentes desagregantes que podem ser usados nas composições farmacêuticas/veterinárias da invenção são: amido, ácido algínico, alginatos ou glicolato de amido ou sódio; misturas efervescentes; corantes; açucarados. Adicionalmente, podem ser usados nas composições farmacêuticas/veterinárias da invenção agentes umidificantes tais como lectina, polisorbatos, laurilsulfatos; e, em geral, substâncias farmacologicamente inativas e não tóxicas usadas comumente em formulações farmacêuticas/veterinárias. A preparação das ditas composições farmacêuticas/veterinárias da invenção pode ser executada de forma conhecida, por exemplo, por meio de mistura, granulação, prensagem em pastilha, cobertura de açúcar, ou processos de revestimento de filme. As dispersões líquidas para administração oral podem ser, por exemplo, xaropes, emulsões e suspensões. Além do princípio ativo da presente invenção, os xaropes podem conter um ou mais agentes carreadores, por exemplo, sacarose ou sacarose com glicerina e/ou manitol e/ou sorbitol. As suspensões e as emulsões podem conter como carreador, por exemplo, uma goma natural, agar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico. Para a administração parenteral, é convencional a utilização de óleos estéreis e farmacologicamente aceitáveis, podendo ser empregado também o propileno glicol, assim como soluções aquosas estéreis.
As composições medicamentosas da presente invenção podem ainda conter um ou mais adjuvantes terapêuticos. Exemplos de tais adjuvantes são: conjugado polissacarídeo-fosfídio, como descrito na patente US 5,785,975; adjuvantes veterinários baseados em emulsão, por exemplo, Emulsigen®, Carbigen®, Polygen®, disponíveis a partir da empresa MPV Technologies; adjuvantes tais como o polímero acrílico e o dimetil dioctadecil brometo de amónio, descritos no documento US2009/0017067; emulsão sub-micron óleo- em-água de esqualeno, polioxietileno, monooleato de sorbitana e trioleato de sorbitana, conhecido pelo nome de marca MF59™, disponível a partir da empresa Novartis, podendo ainda serem mencionados outros exemplo. Adicionalmente, a invenção também diz respeito a uma composição para tratamento e profilaxia de plantas compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos lipopeptídeos da presente invenção; (ii) um veículo ou substrato agricolamente aceitável; e (iii) opcionalmente, pelo menos um aditivo.
Em outra concretização da invenção, a referida composição para tratamento e profilaxia de plantas compreende: (i) uma quantidade agricolamente eficaz do extrato da cultura de Paenibacillus compreendendo os lipopeptídeos da presente invenção; (ii) um veículo ou substrato agricolamente aceitável; e (iii) opcionalmente, pelo menos um aditivo.
A formulação da invenção pode estar na forma líquida ou na forma sólida, por exemplo, na forma de pó molhável. Ambas as formulações, seca ou líquida, devem ser acondicionadas em embalagens e condições que preservem a integridade dos princípios ativos. As formulações líquidas têm tempo de prateleira menor, mas as formulações secas (por exemplo, pó molhável) requerem condições menos rígidas, tais como armazenamento em local fresco, com ausência de luz e umidade, podendo o produto ser guardado de uma safra para outra, desde que acondicionado em freezer ou geladeira.
As formulações da invenção, de um modo geral, contêm uma quantidade de princípio ativo eficaz no controle de microrganismos prejudiciais às plantas e/ou na promoção do crescimento das plantas, dito princípio ativo compreendendo os lipopetídeos da presente invenção, descritos a seguir:
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Composto 2,
ou suas misturas, em combinação com um veículo agricolamente aceitável, na forma de um diluente líquido ou sólido, preferencialmente sólido. Formulações que podem ser utilizadas incluem pós, grânulos, pellets, suspensões, emulsões, pós molháveis, sólidos escoáveis e semelhantes, desde que tais formas sejam consistentes com as propriedades físico-químicas do ingrediente ativo e compatíveis com os lipopetídeos da presente invenção, com o modo de aplicação e com fatores ambientais tais como tipo de solo, umidade do ar e temperatura. Formulações do tipo spray também podem ser usadas, especialmente quando as áreas de aplicação forem grandes. As composições mais concentradas também estão dentro do âmbito de proteção da presente invenção, sendo que ditas composições são apropriadas para uso como intermediários para o produto final diluído a ser aplicado.
As formulações da invenção conterão tipicamente quantidades eficazes do ingrediente ativo, um ou mais diluentes, um ou mais tensoativos e outros aditivos apropriados para a obtenção das características de produto desejáveis. Além disso, deve ficar claro que o princípio ativo utilizado na presente invenção também pode ser usado sozinho em aplicações especiais onde seja requerida alta concentração da composição da invenção.
Outros agentes de formulação, presentes em quantidades menores, podem ser adicionados às composições da invenção, tais como, aditivos para reduzir espumação, embolotamento, corrosão, crescimento microbiano indesejado, e outros agentes semelhantes. Outra característica essencial da formulação da presente invenção é a necessidade de assegurar que todos os ingredientes da composição sejam mutuamente compatíveis e não contribuam para a perda da atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento característica do princípio ativo da invenção.
As composições da presente invenção também podem ser misturadas com outros produtos químicos agrícolas, fertilizantes, condicionadores de solo, estabilizantes, ou com um ou mais inseticidas, fungicidas, acaricidas ou outros compostos biologicamente ativos para formar uma formulação multicomponente. Exemplos de outros produtos de proteção na agricultura com o princípio ativo da formulação da presente invenção podem ser misturados são inseticidas do tipo agonistas de canal de sódio (por exemplo, piretróides), agentes de bloqueio de canal de sódio (por exemplo, pirazolinas), inibidores de acetilcolinesterase (por exemplo, organofosfatos e carbamatos), agentes de ligação nicotínico acetilcolina, agentes de ligação gabaérgicos, agonistas ou antagonistas de octapina (por exemplo, formamidinas), inseticidas do grupo pirrol e outros.
A seguir é apresentado, a título de exemplo, o isolamento dos compostos compreendidos no extrato de Paenibacillus. Dentre eles, estão descritos e caracterizados os novos e inventivos compostos da presente invenção. No entanto, deve ser entendido que tal exemplo é provido somente para finalidade ilustrativa e que várias modificações ou mudanças, à luz das concretizações aqui reveladas, serão sugestivas aos especialistas na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e alcance desta descrição e escopo das reivindicações que a acompanham.
EXEMPLO
O extrato orgânico obtido da extração liquido-liquido do fermentado do Paenibacillus elgii em n-butanol, apresenta uma mistura de 5 lipopeptídeos pertencentes a classe das Permetinas. Dentre estes os compostos de m/z 1067,7 e 1053,7 são inéditos. O sinal de m/z 1 101 ,7 foi atribuído a presença da permetina A, o sinal de m/z 1087,7 foi atribuído a presença do composto BMY- 28160 e o sinal de m/z 1073,7 foi atribuído ao composto Pelgipeptin A. Estes compostos foram caracterizados por espectrometria de massas de ultra resolução empregando um espectrômetro FT-ICR-MS e experimentos de dissociação induzida por colisão (CID). Estes dois experimentos confirmam a estrutura proposta para todos os lipopeptídeos presentes no extraio orgânico produzidos pelo Paenibacillus elgii, conforme detalhado a seguir.
2.1. Caracterização estrutural dos lipopeptídeos produzidos pelo Paenibacillus elgii.
O extrato orgânico obtido da extração líquido-líquido do fermentado do Paenibacillus elgii em n-butanol, foi submetido a análise por espectrometria de massas de ultra-resolução. O espectro obtido está apresentado na Figura 1.
Os sinais de m/z observados no espectro de massas da Figura 1 foram caracterizados como pertencentes a classe das Permetinas. As Permetinas são lipopeptídeos contendo 9 aminoácidos ligados a uma cadeia lipídica de um β - hidroxi ácido de 6 carbonos.
O sinal de m/z 1 101 ,7024 foi atribuído à presença da Permetina A (Figura 2). O sinal foi obtido com uma variação de ΔΜΜ= 0,5 ppm, o qual está de acordo com a fórmula estrutural proposta para a Permetina A.
O sinal de m/z 1 101 , 7 foi submetido a experimentos de espectrometria de massas sequencial (MS/MS), para estudos de fragmentação e caracterização estrutural. O espectro de fragmentação induzida por colisão (CID) está apresentado na Figura 3.
O espectro de MS/MS obtido para o íon de m/z 1 101 ,7 apresentado na Figura 3 é idêntico ao espectro obtido por Wu e colaboradores no estudo de caracterização da permetina A. Os principais íons fragmentos que evidenciam a presença da Permetina A, estão apresentados na Figura 4.
O sinal de m/z 1087,6868, que foi atribuído à presença do lipopeptídeo BMY-28160, é um lipopeptídeo análogo da Permetina A. No composto BMY- 28160 o aminoácido na posição 2 é uma Valina (Val) diferente da Permetina A onde o aminoácido desta posição 2 é uma Leucina/lsoleucina (Leu/lle) como apresentado na Figura 5. No espectro de massas apresentado na Figura 1 também foram observados os sinais de m/z 1073,6734; 1067,7193 e 1053,7042. Wu e colaboradores2 já identificaram o sinal de m/z 1073,6734, o qual foi atribuído a um análogo do lipopeptídeo BMY-28160 com uma diferença 14 Da, o qual foi atribuído como um grupo metileno (-CH2-).
Entretanto, os sinais de m/z 1067,7193 e 1053,7042 foram identificados pela primeira vez neste extrato bruto e são considerados lipopeptídeos inéditos.
O sinal de m/z 1067,7193 foi atribuído à presença de um lipopeptídeo análogo a Permetina A (Figura 6). O sinal foi obtido com uma variação de ΔΜΜ= 0,5 ppm, a qual está de acordo com a fórmula molecular proposta para o Composto 1.
Experimentos de MS/MS forma realizados para a caracterização estrutural e sequenciamento dos aminoácidos presentes no composto 1. O espectro obtido no experimento de CID esta apresentado na Figura 7.
Com base nos padrões de fragmentação a sequência de aminoácidos do composto 1 foi caracterizada como sendo um análogo da Permetina A, onde o aminoácido Fenilalanina (Phe) da posição 4 da Permetina A foi substituído pelo aminoácido leucina/isoleucina (Leu/lle) Figura 6.
Um estudo comparativo dos padrões de fragmentação da Permetina A e do composto 1 são apresentados na Figura 8.
A formação dos íons fragmentos de m/z 327 e 440 no espectro de CID do composto 1 (Figura 7), confirmam a presença do aminoácido Leucina/isoleucina nas posições 2 e 4.
O sinal de m/z 1053,7 observado no espectro de massas do extrato bruto (Figura 1) foi atribuído a um segundo composto inédito. Este composto foi caracterizado como sendo um lipopeptídeo análogo ao lipopeptídeo BMY- 28160. O sinal foi obtido com uma variação de ΔΜΜ= 1 ,1 ppm, a qual esta de acordo com a fórmula molecular proposta para o composto 2.
A diferença estrutural entre os dois compostos é que para o lipopeptídeo BMY-28160 o aminoácido da posição 4 é uma Fenilalanina (Phe) e para o composto inédito o aminoácido na posição 4 é uma Leucina/lsoleucina (Leu/lle), como apresentado na Figura 9.
O sinal de m/z 1053,7 foi submetido a experimentos de CID com o objetivo de se obter informações a respeito do sequenciamento de aminoácidos deste novo composto. O espectro de fragmentação obtido esta apresentado na Figura 10.
Os íons fragmentos de m/z 227 e 426 observados no espectro da Figura 10, bem como, o estudo comparativo entre os padrões de fragmentação entre o lipopeptídeo BMY-28160 e o composto 2 apresentados na Figura 1 1 , confirmam a atribuição estrutural apresentada para o composto 2 na Figura 9.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na descrição são indicativos do nível daqueles especialistas na técnica à qual a invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados a título de referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou cada pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
Apesar de a invenção precedente ter sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplos para finalidade de clareza e entendimento, ficará óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações que acompanham esta descrição.

Claims

Reivindicações PEPTÍDEOS COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, COMPOSIÇÕES MEDICAMENTOSAS PARA O TRATAMENTO E PROFILAXIA DE ANIMAIS, COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO E PROFILAXIA DE PLANTAS, USOS DOS DITOS PEPTÍDEOS, E, USOS DO EXTRATO DE PAENIBACILLUS ELGII OUROFINENSIS
1. Processo de obtenção de extrato com lipopeptídeos caracterizado por compreender a extração, no material fermentado com Paenibacillus, de pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000029_0001
Composto 2.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o referido Paenibacillus é Paenibacillus elgii e/ou Paenibacillus elgii ourofinensis.
3. Extratos bacterianos de Paenibacillus caracterizados por compreender pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000030_0001
Composto 1 ;
Figure imgf000030_0002
Composto 2.
4. Lipopeptídeo isolado com atividade antimicrobiana e/ou promotora de crescimento caracterizado por compreender pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000031_0001
Composto 1 ;
Figure imgf000031_0002
Composto 2.
5. Composição medicamentosa para tratamento e/ou profilaxia de animais, caracterizada por compreender:
(i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000032_0001
Composto 2; e
(ii) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato compreender extratos de material fermentado com Paenibacillus.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o referido Paenibacillus é Paenibacillus elgii e/ou Paenibacillus elgii ourofinensis.
8. Composição medicamentosa para tratamento e/ou profilaxia de animais, caracterizada por compreender: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz do extrato da cultura de Paenibacillus co postos a seguir:
Figure imgf000033_0001
Composto 1 ;
Figure imgf000033_0002
Composto 2;
e (ii) um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o referido Paenibacillus é Paenibacillus elgii e/ou Paenibacillus elgii ourofinensis.
10. Composição para tratamento e profilaxia de plantas compreendendo: (i) uma quantidade agricolamente eficaz de pelo menos um dos compostos a seguir:
Figure imgf000034_0001
Composto 1 ;
Figure imgf000034_0002
Composto 2;
e (ii) um veículo ou substrato agricolamente aceitável.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato compreender extratos de material fermentado com Paenibacillus.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizada pelo fato de que o referido Paenibacillus é Paenibacillus elgii e/ou Paenibacillus elgii ourofinensis.
13. Uso de pelo menos um dos lipopeptídeos descritos a seguir:
Figure imgf000035_0001
Composto 2;
caracterizado pelo dito uso ser para a preparação de promotores de crescimento e agentes antimicrobianos no tratamento ou profilaxia de animais destinados ao consumo humano.
14. Uso de pelo menos um dos lipopeptídeos descritos a seguir:
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000036_0001
Composto 2;
caracterizado pelo dito uso ser para a preparação de promotores de crescimento e agentes antimicrobianos no tratamento ou profilaxia de infecções causadas em plantas por fitopatógenos.
15. Uso de pelo men guir:
Figure imgf000036_0002
Composto 1 ;
Figure imgf000037_0001
Composto 2;
caracterizado pelo dito uso ser para a preparação de promotores de crescimento e agentes antimicrobianos no tratamento ou profilaxia de condições envolvendo infecções em animais ou em plantas.
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