WO2012157403A1 - 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法 - Google Patents
表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2012157403A1 WO2012157403A1 PCT/JP2012/060814 JP2012060814W WO2012157403A1 WO 2012157403 A1 WO2012157403 A1 WO 2012157403A1 JP 2012060814 W JP2012060814 W JP 2012060814W WO 2012157403 A1 WO2012157403 A1 WO 2012157403A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- thin film
- hole
- sensor structure
- ligand
- surface plasmon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
Definitions
- the present invention relates to a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS), and a fluorescence detection method using the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus. .
- SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
- SPR surface plasmon resonance
- a metal thin film 104 is formed on the upper surface of a dielectric member 102, and a ligand-containing layer 108 having a ligand fixing region 106 is arranged on the metal thin film 104.
- a sensor structure 110 is provided.
- the dielectric member 102 side of the sensor structure 110 includes a light source 114 that irradiates the excitation light 112 toward the metal thin film 104, and receives reflected light 116 that is irradiated from the light source 114 and reflected by the metal thin film 104.
- a light receiving means 118 is provided.
- a ligand is fixed to the ligand fixing region 106 on the metal thin film 104, and a sample solution containing a specific analyte is supplied thereto.
- the excitation light 112 is irradiated from below the dielectric member 102 toward the metal thin film 104 at the resonance angle ⁇ 1, and the reflected light 116 reflected by the metal thin film 104 is received by the light receiving means 118.
- the resonance angle ⁇ 1 changes depending on the presence or absence of the analyte
- the resonance angle ⁇ 1 at this time is obtained by examining in advance the resonance angle ⁇ 1 when the sample solution not containing the analyte is supplied to the ligand fixing region 106. It can be determined that the predetermined analyte is included.
- SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
- SPR surface plasmon resonance
- a metal thin film 204 is first formed on the upper surface of a dielectric member 202, and a ligand-containing layer 208 having a ligand fixing region 206 on the metal thin film 204.
- a sensor structure 210 is provided.
- a light source 214 that irradiates the excitation light 212 toward the metal thin film 204, and a light receiving unit that receives the reflected light 216 irradiated from the light source 214 and reflected by the metal thin film 204. 218 is provided.
- a light detection means 222 that receives the fluorescence 220 emitted from the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the ligand fixing region 206 is provided.
- the light collecting member 224 for efficiently collecting the fluorescence 220 and the light contained in the area other than the fluorescence 220 are removed, and only the necessary fluorescence 220 is selected.
- a wavelength selection function member 226 is provided.
- a ligand is fixed to the ligand fixing region 206 on the metal thin film 204, and an analyte labeled with a fluorescent substance is captured on the ligand.
- the light source 214 irradiates the dielectric member 202 with the excitation light 212, and the excitation light 212 is incident on the metal thin film 204 at the resonance angle ⁇ 2, thereby causing a dense wave (surface plasmon) on the metal thin film 204.
- the excitation light 212 and electronic vibration in the metal thin film 204 are coupled to reduce the amount of reflected light 216. If a point where the signal of the received reflected light 216 changes (the amount of light decreases) is found, the resonance angle ⁇ 2 at which the rough wave (surface plasmon) occurs can be obtained.
- the ligand fixing region 306 on the metal thin film 304 is disposed in the middle of the horizontal channel 308, and after fixing the ligand to the ligand fixing region 306 in the horizontal channel 308, By feeding a sample solution 310 containing a specific substance (analyte) into the horizontal channel 308, the analyte is captured in the ligand fixing region 306.
- Reference numeral 302 in the figure denotes a dielectric member.
- the sample solution 310 is circulated using a one-way liquid pump or reciprocated using a reciprocating liquid pump. It is devised so that the reaction of the specific substance occurs in any part of the fixed region 306.
- a method of storing the sample solution is also known.
- a well member 408 having a plurality of through holes 410 is disposed on a ligand fixing region 406 on a metal thin film 404 as shown in FIG.
- the analyte is captured in the ligand fixing region 406 in the through hole 410.
- This method has an advantage that the structure can be simplified as compared with the case of using a flow path because it is not necessary to prepare a liquid feed pump unlike the method of performing liquid transfer using a flow path.
- the structure can be simplified as in the SPR apparatus, and the manufacturing cost can be reduced. It is thought that you can.
- the flow of the sample solution is unlikely to occur in the through hole of the well member, and when the specific substance to be detected is extremely small, the specific substance is surely a ligand in the ligand fixing region. May not be captured.
- the present invention can detect a specific substance with high accuracy even when a sensor structure including a well member is used, and is manufactured by simplifying the structure compared to a liquid feeding method using a flow path. It is an object of the present invention to provide a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus capable of reducing costs and a fluorescence detection method using the same.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring device of the present invention is A sensor member comprising: a dielectric member; a metal thin film formed on the dielectric member; and a ligand fixing region formed on the metal thin film; and the ligand fixing region fixed on the sensor member; A well member having a through hole at a corresponding position, and a sensor structure, A light source for irradiating excitation light toward the metal thin film of the sensor structure, and the ligand fixing region on the metal thin film by irradiating the metal thin film with the excitation light from the light source to enhance the electric field on the metal thin film An apparatus main body having at least light detection means for exciting the fluorescent material held in the light source and detecting the fluorescence excited thereby, With The sensor structure is a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement device configured to be used by being attached to and detached from the device body, or fixed to the device body, The irradiation position of
- the specific substance can be detected with high accuracy by changing the irradiation position of the excitation light.
- the sensor structure including the well member does not require a liquid feeding means such as a flow path or a pump, the manufacturing cost for the apparatus can be suppressed.
- the fluorescence detection method of the present invention comprises: A sensor member comprising a dielectric member, a metal thin film formed on the dielectric member, and a ligand fixing region formed on the metal thin film, and fixed on the sensor member, the ligand fixing region And a well member having a through hole at a corresponding position, and a step of causing the ligand fixed to the ligand fixing region of the sensor structure to capture the analyte, and further labeling the analyte with a fluorescent substance, Irradiating excitation light from the dielectric member side to the metal thin film of the sensor structure in a state where the analyte is labeled with a fluorescent material, and exciting the fluorescent material; Measuring the excited fluorescence with a light detection means; A fluorescence detection method having at least In the step of exciting the fluorescent material, The excitation light is irradiated so that the center of the optical axis of the excitation light is located at a position separated by a predetermined distance from the position of
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is The irradiation position of the excitation light is When the shortest distance from the center of gravity of the bottom surface region defined by the through hole of the well member to the outer edge of the through hole is 100%, the position is separated from the center of gravity by 1 to 75%. It is characterized by.
- the fluorescence detection method of the present invention comprises: In the step of exciting the fluorescent material,
- the irradiation position of the excitation light is When the shortest distance from the position of the center of gravity of the bottom surface area defined by the through hole of the well member to the outer edge of the through hole is 100%, the position is separated from the position of the center of gravity by 1 to 75%. It is characterized by. If the excitation light irradiation position is defined in such a range, the specific substance can be detected with high accuracy.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is The sensor structure is used after being stirred.
- the fluorescence detection method of the present invention comprises: In the step of labeling the analyte with a fluorescent substance, The sensor structure is agitated.
- the analyte can be surely captured by the ligand in the ligand fixing region when the sample solution is supplied into the through hole. Therefore, the specific substance can be detected with high accuracy.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is
- the through hole of the well member is provided with a reverse taper that gradually decreases in diameter toward the bottom of the through hole. If the through hole is configured in this way, it is possible to reliably collect the fluorescence generated in a radial manner during fluorescence detection. Therefore, the specific substance can be detected with high accuracy.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is The shape of the through hole of the well member is a point-symmetric shape.
- the sample solution when the sample solution is stored in the through hole, the sample solution can easily flow in the through hole, and the analyte can be reliably captured by the ligand in the ligand fixing region. Therefore, the specific substance can be detected with high accuracy.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is One ligand is fixed to the ligand fixing region. With this configuration, one type of analyte can be detected.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is A plurality of types of ligands are fixed to the ligand fixing region. If comprised in this way, the test
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is One well hole is provided in the well member. Thus, if there is one through-hole, processing is easy and high positioning accuracy of the ligand fixing region is not required, so that the sensor structure can be easily manufactured.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is The well member is provided with a plurality of the through holes. Thus, if there are a plurality of through holes, inspection under the same conditions, multi-item inspection, and further reference can be performed with one sensor structure.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is Position adjustment means for adjusting the sensor structure and the light source by moving relative to each other is provided.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus of the present invention is The inner wall surface of the through hole of the well member is subjected to a surface treatment for preventing non-specific adsorption.
- a specific substance can be detected with high accuracy, and since the structure is simple, surface plasmon excitation enhanced fluorescence that can reduce manufacturing costs can be achieved.
- a measuring apparatus and a fluorescence detection method using the same can be provided.
- FIG. 1 is a schematic diagram of the SPFS apparatus of the present invention.
- FIG. 2 is a perspective view of a sensor structure used in the SPFS device of the present invention.
- FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the irradiation position of the excitation light in the sensor structure used in the SPFS apparatus of the present invention.
- FIG. 4 is a top view for explaining the irradiation position of the excitation light in the sensor structure used in the SPFS device of the present invention.
- FIG. 5 is a graph showing the reaction amount distribution of the ligand-containing layer located in the through hole of the well member in the sensor structure used in the SPFS apparatus of the present invention.
- FIG. 6 is a schematic view for explaining the reverse taper attached to the through hole of the well member in the sensor structure used in the SPFS device of the present invention.
- FIG. 7 is a top view for explaining the shape of the through hole of the well member in the sensor structure used in the SPFS device of the present invention.
- FIG. 8 is a top view for explaining a state in which a plurality of types of ligands are fixed to a ligand fixing region located in one through hole in the sensor structure used in the SPFS device of the present invention.
- FIG. 9 is a top view for explaining a state in which different types of ligands are fixed to the ligand fixing regions located in the through holes in the plurality of through holes in the sensor structure used in the SPFS device of the present invention. It is.
- FIG. 8 is a schematic view for explaining the reverse taper attached to the through hole of the well member in the sensor structure used in the SPFS device of the present invention.
- FIG. 7 is a top view for explaining the shape of the through hole
- FIG. 10 is a schematic view of a sensor structure in another embodiment used in the SPFS apparatus of the present invention.
- FIG. 11 is a graph showing the reaction amount distribution of the ligand-containing layer located in the through hole of the well member in the sensor structures of Examples 1 to 3.
- FIG. 12 is a schematic diagram of a conventional SPR device.
- FIG. 13 is a schematic diagram of a conventional SPFS apparatus.
- FIG. 14 is a schematic diagram for explaining a supply method using a channel as a method of supplying a sample solution to a ligand fixing region in a conventional sensor structure.
- FIG. 15 is a schematic diagram for explaining a supply method using a well member as a method for supplying a sample solution to a ligand fixing region in a conventional sensor structure.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring device (SPFS device) of the present invention is a device that performs fluorescence detection with high sensitivity by surely exciting a fluorescent substance labeled with an analyte captured by a ligand fixed in a ligand fixing region. It is.
- the “surface plasmon” in the present specification is used in a broad sense, and includes “localized plasmon”. Further, the “bottom area defined by the through hole of the well member” is an area defined by the opening end of the through hole on the metal thin film side.
- the SPFS device 1 of the present invention includes a dielectric member 12, a metal thin film 14 formed on the upper surface of the dielectric member 12, and an analyte to be detected on the upper surface of the metal thin film 14.
- a well having a sensor member 10 having a ligand fixing region 16 for fixing a ligand that specifically adsorbs, and having a through hole 20 on the sensor member 10 at a position corresponding to the ligand fixing region 16.
- a sensor structure 22 to which the member 18 is fixed is provided.
- a ligand is fixed on the entire surface of the metal thin film 14, and in this state, a well member 18 is formed on the metal thin film 14.
- the ligand is already immobilized on the ligand fixing region 16 on the metal thin film 14 before the well member 18 is fixed, the ligand is not attached to the inner wall surface of the through hole 20 of the well member 18 and the detection efficiency is increased. It is preferable for increasing the ratio.
- the ligand is immobilized on the entire surface of the metal thin film 14, it is not necessary to use a separate member for restricting the ligand to the ligand-fixed region 16 when the ligand is immobilized.
- the ligand fixing region 16 is included in the same region or includes the ligand fixing region 16, and is fixed to a slightly wider region. You can also. In this case, it is preferable to immobilize the ligand on the metal thin film 14 using a frame member different from the well member 18.
- the ligand may be immobilized only on the metal thin film 14 located on the bottom surface of the through hole 20 by arranging 18 and injecting a solution containing the ligand into the through hole 20.
- a well-known processing method can be used, for example, the solution containing proteins, such as BSA and casein, and a phospholipid analog synthetic polymer (NOF Corporation) By using the contained solution, nonspecific adsorption can be effectively prevented.
- the solution containing proteins such as BSA and casein
- a phospholipid analog synthetic polymer NOF Corporation
- the dielectric member 12 is a hexahedron having a substantially trapezoidal cross section (a truncated quadrangular pyramid shape), and the well member 18 has a square shape corresponding to the shape of the dielectric member 12. It is configured.
- the shape of the dielectric member 12 is not limited to the form shown in FIG. 2, and may be, for example, a pyramid shape such as a quadrangular pyramid, a cone, a triangular pyramid, a polygonal pyramid, or a truncated pyramid shape. Is.
- the sensor structure 22 includes a light source 26 that is incident on the dielectric member 12 and irradiates the excitation light 24 toward the metal thin film 14 on the dielectric member 12 side.
- a light receiving means 30 is provided for receiving the reflected light 28 reflected by the light.
- the excitation light 24 emitted from the light source 26 is preferably laser light, and an LD laser having a wavelength of 200 to 900 nm and 0.001 to 1,000 mW, or a semiconductor laser having a wavelength of 230 to 800 nm and 0.01 to 100 mW is suitable. .
- light detection means 34 for receiving the fluorescence 32 generated in the ligand fixing region 16 is provided.
- the light detection means 34 it is preferable to use an ultrasensitive photomultiplier tube or a CCD image sensor capable of multipoint measurement.
- a light collecting member 36 for efficiently collecting light and a fluorescent light 32 only in the light are selected.
- the wavelength selection function member 38 is provided, and this constitutes the apparatus main body.
- the SPFS apparatus 1 shown in FIG. 1 intends the form that the sensor structure 22 is attached to and detached from the apparatus main body, it is not limited to such a form.
- the sensor structure 22 may be configured to be used while being fixed to the apparatus main body.
- any condensing system can be used as long as it condenses the fluorescent signal efficiently.
- a simple condensing system a commercially available objective lens used in a microscope or the like can be used.
- the magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
- an optical filter As the wavelength selection function member 38, an optical filter, a cut filter, or the like can be used.
- the optical filter include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
- the cut filter includes external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), and plasmon scattering light (excitation light originated from the sensor)
- a ligand that specifically adsorbs to the analyte to be detected in the ligand fixing region 16 on the metal thin film 14 of the sensor structure 22 is supplied into the through hole 20 in a state where the sensor structure 22 is fixed, and the sensor structure 22 is agitated.
- the ligand fixing region 16 it is preferable to fix the ligand to the ligand fixing region 16 before the fluorescence detection in advance in order to reduce the time required for the fluorescence detection. You can go right before.
- the light source 26 irradiates the metal thin film 14 with the excitation light 24, and the excitation light 24 is at a specific angle (resonance angle (angle formed by the excitation light 24 and the perpendicular of the metal thin film 14 when the electric field is enhanced) ⁇ a).
- a specific angle resonance angle (angle formed by the excitation light 24 and the perpendicular of the metal thin film 14 when the electric field is enhanced) ⁇ a.
- the fluorescent material generated in the ligand fixing region 16 on the metal thin film 14 is efficiently excited, thereby increasing the amount of fluorescence 32 emitted from the fluorescent material, and collecting this fluorescence 32.
- the light detection means 34 By receiving light by the light detection means 34 through the optical member 36 and the wavelength selection function member 38, it is possible to detect an extremely small amount and / or extremely low concentration of the analyte.
- the material of the metal thin film 14 of the sensor structure 22 is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably made of gold. It consists of a metal alloy. Such a metal is suitable for the metal thin film 14 because it is stable against oxidation and the electric field enhancement due to the dense wave (surface plasmon) becomes large.
- examples of the method for forming the metal thin film 14 include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like.
- the sputtering method and the vapor deposition method are preferable because the thin film formation conditions can be easily adjusted.
- the thickness of the metal thin film 14 ranges from gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. It is preferable to be within. From the viewpoint of the electric field enhancement effect, within the range of gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 10-70 nm More preferably.
- the thickness of the metal thin film 14 is within the above range, close-packed waves (surface plasmons) are easily generated, which is preferable. Moreover, if it is the metal thin film 14 which has such thickness, a magnitude
- specimens used at the time of analyte detection include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (eg, cerebrospinal fluid, ascites, pleural effusion).
- the analyte contained in the sample is, for example, a nucleic acid (DNA, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), which may be single-stranded or double-stranded, or nucleoside.
- Nucleotides and their modified molecules Nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules thereof, Specific examples thereof include a complex, and may be a carcinoembryonic antigen such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), a tumor marker, a signal transduction substance, a hormone, and the like, and is not particularly limited.
- AFP ⁇ -fetoprotein
- the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence 32 by being irradiated with predetermined excitation light 24 or excited by using a field effect.
- the fluorescence 32 as used in this specification includes various light emission, such as phosphorescence.
- the dielectric member 12 various optically transparent inorganic substances, natural polymers, and synthetic polymers can be used. From the viewpoints of chemical stability, manufacturing stability, and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2). 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
- the well member 18 various materials such as synthetic resin, metal, and ceramics can be used.
- the through hole 20 can be provided by machining.
- an adhesive, matching oil, a transparent adhesive sheet or the like having the same optical refractive index as that of the dielectric member 12.
- the size of the through hole 20 of the well member 18 is preferably set to have a capacity of, for example, 80 to 100 ⁇ l.
- such an SPFS device 1 adjusts the optimum angle (resonance angle ⁇ a) of surface plasmon resonance by the excitation light 24 irradiated from the light source 26 to the metal thin film 14,
- a computer (not shown) for processing information input to the light detection means 34 may be included.
- the angle variable unit (not shown) synchronizes the light receiving means 30 and the light source 26 in order to obtain the total reflection attenuation (ATR) condition by a servo motor, and allows an angle change of 45 to 85 °, and the resolution. Is preferably 0.01 ° or more.
- the excitation light irradiated from the light source 26 to the metal thin film 14.
- the excitation light 24 is arranged such that the optical axis center of the excitation light 24 is positioned at a position separated from the gravity center position A of the bottom surface region defined by the through hole 20 of the well member 18 by a predetermined distance H.
- the irradiation position is set.
- the symbol r is the shortest distance from the center of gravity position A of the bottom surface region of the through hole 20 to the outer edge of the through hole 20.
- the irradiation position of the excitation light 24 when the irradiation position of the excitation light 24 is moved, it is preferable to move the light source 26 using the position adjusting means 40 described above.
- the sensor structure 22 itself may be moved.
- the light source 26 and the sensor structure 22 are not particularly limited as long as they can be moved relative to each other.
- the sample solution containing the sample is supplied into the through hole 20 of the well member 18 so that the sample (analyte) is reliably captured by the ligand fixed in the ligand fixing region 16. After that, the sensor structure 22 is stirred.
- the stirring method here is preferably stirring by circular motion, and can be performed using, for example, a dedicated stirring device (not shown).
- a dedicated stirring device not shown.
- the sample solution is moved in a circle in the through hole 20 of the well member 18.
- how the reaction amount of the ligand and the analyte in the ligand fixing region 16 is distributed is examined by staining the ligand fixing region 16 after stirring with gold colloid. Starting from the center of gravity position A of the defined bottom area, it was confirmed that portions with a high reaction amount were distributed in a donut shape.
- the reaction amount value is highest at a position B moved by a predetermined distance from the gravity center position A of the bottom surface region defined by the through hole 20 of the well member 18 as shown in FIG. I understand that
- the present inventor has found that the detection efficiency of the fluorescence 32 can be effectively increased by setting the irradiation position B of the excitation light 24 according to the position where the value of the reaction amount is the highest.
- the distribution of the reaction amount is different if the measurement conditions such as the size of the through hole 20 and the type of the ligand are different. It was found that when the shortest distance r is set to 100%, the value of the reaction amount generally increases when the position is in the range of 1 to 75% from the center of gravity position A.
- the movement range of the irradiation position of the excitation light 24 is within a range in which the diameter of the optical axis of the excitation light 24 is within the through hole 20.
- the distribution of the reaction amount after stirring of the sensor structure 22 is examined, and the irradiation position of the excitation light 24 is set at the position where the value of the reaction amount is the highest.
- the detection efficiency of the fluorescence 32 can be effectively increased.
- the sensor structure 22 used in the SPFS apparatus 1 of the present invention uses the well member 18, a liquid feeding means such as a pump like the flow path type sensor structure 300 as shown in FIG.
- the manufacturing cost can be reduced by simplifying the apparatus.
- the through hole 20 of the well member 18 is straight.
- the reverse taper gradually decreases in diameter toward the bottom of the through hole 20. 44 may be attached.
- the reason is that the fluorescence 32 generated from the fluorescent material is diffused radially, and the diffused fluorescence 32 is efficiently collected by the light detection means 34.
- the inclination angle ⁇ b of the inverse taper 44 is preferably in the range of more than 0 ° and 45 ° or less in order to increase the light collection efficiency.
- the shape of the through hole 20 is not limited to a circle as in the present embodiment, and may be an ellipse or a triangle, but the quadrangle shown in FIG. A point-symmetric shape such as the hexagon shown in FIG. 7 (b) is preferable because a reaction distribution appears remarkably when stirring is performed.
- the irradiation position of the excitation light 24 is set with the shortest distance r from the gravity center position A of the bottom surface region of the through hole 20 to the outer edge of the through hole 20 being 100%. It should be specified.
- a plurality of types of ligands 16 a to 16 d fixed to the ligand fixing region 16 may be provided for one through hole 20.
- a well member 18 having a plurality of through holes 20 may be used. In this case, different ligands 16e to 16h may be fixed to each through hole 20. It is.
- the sensor structure 22 rotates relative to the light source 26. If such a moving means (not shown) is provided separately, fluorescence detection can be performed smoothly.
- the well member 18 is fixed on the metal thin film 14, but as shown in FIG. 10, the metal thin film 14 is partially formed on the sensor structure 22 by a method such as patterning. Further, a structure may be adopted in which a ligand fixing region 16 is formed on the metal thin film 14 and a well member 18 is placed on the dielectric member 12 so as to surround the ligand fixing region 16 and the metal thin film 14. It is.
- the SPFS device 1 and the fluorescence detection method using the SPFS device 1 according to the present invention have been described above.
- the present invention is not limited to the above-described embodiment.
- the configuration of the device main body described in the above-described embodiment is further simplified. It is also possible to make various changes without departing from the object of the present invention.
- Example 1 After the metal thin film 14 was formed on the upper surface of the dielectric member 12, a ligand that specifically adsorbs to the analyte to be detected was fixed on the metal thin film 14 to form the ligand fixing region 16.
- a well member 18 having a circular through hole 20 having a diameter of 5 mm was prepared, and this was fixed on the metal thin film 14 with matching oil to form a sensor structure 22.
- a sample solution containing a specimen was injected into the through-hole 20 of the sensor structure 22, and this was set in a stirring device that was stirred by a circular motion and stirred.
- the specimen (analyte) in the ligand fixing region 16 was stained with colloidal gold, and the staining state was confirmed with a CCD camera. It was confirmed that a reaction distribution was generated in a donut shape starting from the center of gravity A of the bottom region defined by the hole 20.
- the reaction distribution was graphed as shown in FIG.
- the X axis of the graph is from the center of gravity position A of the bottom surface region of the through hole 20 when the shortest distance r from the center of gravity A of the bottom surface region of the through hole 20 of the well member 18 to the outer edge of the through hole 20 is 100%.
- the Y-axis is the reaction amount, and represents the ratio when the maximum value of the reaction amount is 100%.
- Example 2 A sensor structure 22 is manufactured in the same manner as in Example 1 except that the well member 18 having a circular through hole 20 having a diameter of 6.5 mm is used, and the sensor structure 22 is set in a stirring device that stirs in a circular motion. I let you.
- the specimen in the ligand fixing region 16 is stained with colloidal gold, and the staining state is confirmed by a CCD camera. It was confirmed that the reaction distribution occurred in a donut shape starting from the center of gravity position A of the bottom surface area.
- reaction amount shows the maximum value at a position 15% away from the center of gravity position A of the bottom surface region defined by the through hole 20 of the well member 18. confirmed.
- Example 3 A sensor structure 22 was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the well member 18 having a circular through hole 20 having a diameter of 12 mm was used, and this was set in a stirring device that was stirred by a circular motion and stirred. .
- the specimen in the ligand fixing region 16 was stained with colloidal gold, and the staining state was confirmed with a CCD camera. It was confirmed that the reaction distribution occurred in a donut shape starting from the center of gravity position A of the bottom surface area.
- reaction amount shows the maximum value at a position spaced 50% from the center of gravity position A of the bottom surface region defined by the through hole 20 of the well member 18. confirmed.
- Example 4 A sensor structure 22 was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the well member 18 having a circular through hole 20 having a diameter of ⁇ 18 mm was used, and this was set in a stirring device for stirring by circular motion and stirred. .
- the specimen in the ligand fixing region 16 is stained with colloidal gold, and the staining state is confirmed by a CCD camera. It was confirmed that the reaction distribution occurred in a donut shape starting from the center of gravity position A of the bottom surface area.
- reaction amount shows the maximum value at a position 61% away from the center of gravity position A of the bottom surface region defined by the through hole 20 of the well member 18. confirmed.
- the size of the through hole 20 in Examples 1 to 4 is generally the minimum size to the maximum size of the through hole 20 of the well member 18 that is commercially available. Therefore, from the results of Examples 1 to 4, even if the size of the through hole 20 of the well member 18 is changed, the moving distance from the center of gravity position A of the bottom surface region defined by the through hole 20 of the well member 18 is 1 to 75. It was confirmed that if the irradiation position of the excitation light 24 was set at a position within the range of%, a generally good reaction occurred.
- SPFS device Surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring device
- Sensor member 12 ... Dielectric member 14 ... Metal thin film 16 ; Ligand fixed area
- Well member Center of gravity position of bottom surface area defined by through hole B Irradiation position of excitation light irradiated to metal thin film from light source H: Separation distance (predetermined distance) r: Shortest distance from the center of gravity of the bottom region of the through hole to the outer edge of the through hole 100 ...
- Surface plasmon resonance device (SPR device) DESCRIPTION OF SYMBOLS 102 ...
- Dielectric member 104 ... Metal thin film 106 ... Ligand fixed area
- SPFS device Surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring device
- Dielectric member 204 Dielectric member 204
- Metal thin film 206 ... Ligand fixing region 208 ... Ligand-containing layer 210 ...
- Sensor structure 212 ... Excitation light 214 ... Light source 216 ... Reflection Light 218 ... Light receiving means 220 ... Fluorescence 222 ... Light detecting means 224 ... Condensing member 226 ... Wavelength selection function member 300 ...
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
Abstract
[課題] ウェル部材を用いても特定物質を精度良く検出することができ、構造を簡素化して製造コストを抑えることのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供すること。 [解決手段] 誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、を備え、前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されている。
Description
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこの表面プラズモン励起増強蛍光測定装置を用いた蛍光検出方法に関する。
従来から、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光とが共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用し、例えば生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下ＳＰＲ装置ともいう）が用いられている。
このようなＳＰＲ装置１００は、図１２に示したように、誘電体部材１０２の上面に金属薄膜１０４が形成されており、この金属薄膜１０４上にリガンド固定領域１０６を有するリガンド含有層１０８が配設されて成るセンサ構造体１１０を備えている。
さらに、センサ構造体１１０の誘電体部材１０２側には、金属薄膜１０４に向かって励起光１１２を照射する光源１１４を備え、さらに光源１１４から照射され、金属薄膜１０４で反射した反射光１１６を受光する受光手段１１８が備えられている。
そして、ＳＰＲ装置１００の使用において、まず金属薄膜１０４上のリガンド固定領域１０６にリガンドを固定しておき、ここに特定のアナライトを含んだ試料溶液を供給する。
さらにこの状態で、誘電体部材１０２の下方より金属薄膜１０４に向かって励起光１１２を共鳴角θ１で照射し、金属薄膜１０４に反射した反射光１１６を受光手段１１８で受光する。
金属薄膜１０４に向かって共鳴角θ１で励起光１１２を照射すると、金属薄膜１０４上に粗密波（表面プラズモン）が生じ、励起光１１２と金属薄膜１０４中の電子振動とがカップリングして、反射光１１６の光量減少が生ずる。
この現象は、アナライトの有無によって共鳴角θ１が変わるため、アナライトを含まない試料溶液をリガンド固定領域１０６に供給したときの共鳴角θ１を予め調べておくことで、この時の共鳴角θ１と異なった場合に所定のアナライトを有すると判断することができる。
これにより、所定のアナライトが試料溶液中に含有されているか否かを知ることができる。
一方、このような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、ＳＰＲ装置１００よりもさらに高精度にアナライトの検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置ともいう）も開発されている。
一方、このような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、ＳＰＲ装置１００よりもさらに高精度にアナライトの検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置ともいう）も開発されている。
このようなＳＰＦＳ装置２００は、図１３に示したように、まず誘電体部材２０２の上面に金属薄膜２０４が形成されており、さらにこの金属薄膜２０４上にリガンド固定領域２０６を有するリガンド含有層２０８が配設されて成るセンサ構造体２１０を備えている。
そして、センサ構造体２１０の誘電体部材２０２側には、金属薄膜２０４に向かって励起光２１２を照射する光源２１４と、光源２１４から照射され金属薄膜２０４で反射した反射光２１６を受光する受光手段２１８が設けられている。
一方、センサ構造体２１０のリガンド含有層２０８側には、リガンド固定領域２０６で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光２２０を受光する光検出手段２２２が設けられている。
なお、リガンド含有層２０８と光検出手段２２２との間には、蛍光２２０を効率よく集めるための集光部材２２４と、蛍光２２０以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光２２０のみを選択する波長選択機能部材２２６が設けられている。
そして、ＳＰＦＳ装置２００の使用においては、まず金属薄膜２０４上のリガンド固定領域２０６にリガンドを固定しておき、このリガンドに蛍光物質で標識されたアナライトが捕捉された状態とする。
そしてこの状態で、光源２１４より誘電体部材２０２内に励起光２１２を照射し、この励起光２１２が共鳴角θ２で金属薄膜２０４に入射することで、金属薄膜２０４上に粗密波（表面プラズモン）を生じさせる。
なお、金属薄膜２０４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２１２と金属薄膜２０４中の電子振動とがカップリングし、反射光２１６の光量減少が生ずるため、受光手段２１８で受光される反射光２１６のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ２を得ることができる。
この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜２０４上のリガンド固定領域２０６の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光２２０の光量が増大することとなる。
この増大した蛍光２２０を、集光部材２２４および波長選択機能部材２２６を介して光検出手段２２２で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
近年、ＳＰＲ装置１００やＳＰＦＳ装置２００では、更なる精度向上に向けた技術開発が盛んに行われている。
ところで、ＳＰＲ装置１００のリガンド固定領域１０６やＳＰＦＳ装置２００のリガンド固定領域２０６へ試料溶液を供給する方法としては、例えば流路を用いて送液する供給方法が知られている。
ところで、ＳＰＲ装置１００のリガンド固定領域１０６やＳＰＦＳ装置２００のリガンド固定領域２０６へ試料溶液を供給する方法としては、例えば流路を用いて送液する供給方法が知られている。
図１４に示したセンサ構造体３００は、金属薄膜３０４上のリガンド固定領域３０６が横形流路３０８の途中に配置されており、横形流路３０８内のリガンド固定領域３０６にリガンドを固定した後、横形流路３０８内に特定物質（アナライト）を含有した試料溶液３１０を送液することで、リガンド固定領域３０６にアナライトが捕捉されるようになっている。なお、図中の符号３０２は誘電体部材である。
このような横形流路３０８を備えたセンサ構造体３００では、試料溶液３１０を、一方向送液ポンプを用いて循環させたり、往復送液ポンプを用いて往復送液させたりすることにより、リガンド固定領域３０６のいずれの箇所においても特定物質の反応が生じるように工夫されている。
一方、ＳＰＲ装置１００においてリガンド固定領域１０６へ試料溶液を供給する別の方法としては、試料溶液を貯める方法も知られている。
特許文献１に開示されたセンサ構造体４００では、図１５に示したように金属薄膜４０４上のリガンド固定領域４０６の上に、複数の貫通穴４１０を有するウェル部材４０８を配設し、各貫通穴４１０内に試料溶液４１２を供給して貯留させることで、貫通穴４１０内のリガンド固定領域４０６にアナライトが捕捉されるようにしている。
特許文献１に開示されたセンサ構造体４００では、図１５に示したように金属薄膜４０４上のリガンド固定領域４０６の上に、複数の貫通穴４１０を有するウェル部材４０８を配設し、各貫通穴４１０内に試料溶液４１２を供給して貯留させることで、貫通穴４１０内のリガンド固定領域４０６にアナライトが捕捉されるようにしている。
この方法は、流路を用いて送液を行う方法のように送液ポンプを用意する必要がないため、流路を用いた場合よりも構造を簡素化できる利点がある。
ところで、上記したようなウェル部材を備えたセンサ構造体をＳＰＦＳ装置でも用い、試料溶液を貯めて蛍光測定を行うようにすれば、ＳＰＲ装置と同様に構造を簡素化でき、製造コストを抑えることができると考えられる。
しかしながら、ウェル部材を用いて試料溶液を貯める方法では、試料溶液の流れがウェル部材の貫通穴内で生じ難く、検出対象となる特定物質が極微量の場合、特定物質が確実にリガンド固定領域のリガンドに捕捉されない場合があった。
特にこのことはＳＰＲ装置よりもさらに高精度が要求されるＳＰＦＳ装置にとって致命的な問題であり、この問題がＳＰＦＳ装置においてウェル部材を備えたセンサ構造体の使用を困難にさせている要因の一つとなっている。
本発明は、このような現状に鑑み、ウェル部材を備えたセンサ構造体を用いても特定物質を精度良く検出することができ、流路を用いた送液方法よりも構造を簡素化して製造コストを抑えることのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することを目的とする。
本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、
前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、
を備え、
前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されていることを特徴とする。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、
前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、
を備え、
前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されていることを特徴とする。
このように励起光の照射位置を変えれば特定物質を精度良く検出することができる。しかもウェル部材を備えたセンサ構造体は、流路やポンプなどの送液手段を必要としないので、装置にかかる製造コストを抑えることができる。
さらに本発明の蛍光検出方法は、
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体の前記リガンド固定領域に固定されたリガンドにアナライトを捕捉させ、さらに前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記アナライトを蛍光物質で標識した状態で、前記センサ構造体の金属薄膜に前記誘電体部材側から励起光を照射して、前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光が照射されることを特徴とする。
このような蛍光検出方法であれば、特定物質を精度良く検出することができる。
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体の前記リガンド固定領域に固定されたリガンドにアナライトを捕捉させ、さらに前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記アナライトを蛍光物質で標識した状態で、前記センサ構造体の金属薄膜に前記誘電体部材側から励起光を照射して、前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光が照射されることを特徴とする。
このような蛍光検出方法であれば、特定物質を精度良く検出することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１～７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする。
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１～７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする。
さらに本発明の蛍光検出方法は、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１～７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする。
このような範囲に励起光の照射位置を規定すれば、精度良く特定物質を検出することができる。
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１～７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする。
このような範囲に励起光の照射位置を規定すれば、精度良く特定物質を検出することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記センサ構造体は、撹拌されて使用されることを特徴とする。
前記センサ構造体は、撹拌されて使用されることを特徴とする。
さらに本発明の蛍光検出方法は、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記センサ構造体は、撹拌されることを特徴とする。
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記センサ構造体は、撹拌されることを特徴とする。
このように撹拌がなされれば、貫通穴内に試料溶液を供給した際に、アナライトを確実にリガンド固定領域のリガンドに捕捉させることができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材の前記貫通穴には、前記貫通穴の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパーが付されていることを特徴とする。
このように貫通穴が構成されていれば、蛍光検出の際に放射状に生ずる蛍光を確実に集光することができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。
前記ウェル部材の前記貫通穴には、前記貫通穴の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパーが付されていることを特徴とする。
このように貫通穴が構成されていれば、蛍光検出の際に放射状に生ずる蛍光を確実に集光することができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材の前記貫通穴の形状が、点対称な形状であることを特徴とする。
前記ウェル部材の前記貫通穴の形状が、点対称な形状であることを特徴とする。
このような形状であれば、貫通穴内に試料溶液を貯めた際に貫通穴内で試料溶液の流れを生じ易くすることができ、アナライトを確実にリガンド固定領域のリガンドに捕捉させることができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが１種類であることを特徴とする。
このように構成すれば、１種類のアナライトを検出することができる。
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが１種類であることを特徴とする。
このように構成すれば、１種類のアナライトを検出することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが複数種類であることを特徴とする。
このように構成すれば、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを１つのセンサ構造体で行うことができる。
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが複数種類であることを特徴とする。
このように構成すれば、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを１つのセンサ構造体で行うことができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材には、前記貫通穴が１つ設けられていることを特徴とする。
このように貫通穴が１つであれば、加工が容易であり、リガンド固定領域の高い位置決め精度も要求されないのでセンサ構造体の製造を容易に行うことができる。
前記ウェル部材には、前記貫通穴が１つ設けられていることを特徴とする。
このように貫通穴が１つであれば、加工が容易であり、リガンド固定領域の高い位置決め精度も要求されないのでセンサ構造体の製造を容易に行うことができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材には、前記貫通穴が複数設けられていることを特徴とする。
このように貫通穴が複数で有れば、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを１つのセンサ構造体で行うことができる。
前記ウェル部材には、前記貫通穴が複数設けられていることを特徴とする。
このように貫通穴が複数で有れば、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを１つのセンサ構造体で行うことができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記センサ構造体と前記光源とを、相対的に移動させて調整する位置調整手段を有することを特徴とする。
前記センサ構造体と前記光源とを、相対的に移動させて調整する位置調整手段を有することを特徴とする。
このように構成すれば、ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置に対して離間した位置に励起光を照射する際に、正確な位置調整を容易に行うことができる。
さらに貫通穴を複数有するセンサ構造体や複数種類のリガンドが固定されたセンサ構造体を用いた場合には、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを効率良く進めることができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材の前記貫通穴の内壁面に、非特異吸着防止用の表面処理が施されていることを特徴とする。
前記ウェル部材の前記貫通穴の内壁面に、非特異吸着防止用の表面処理が施されていることを特徴とする。
このように構成されていれば、貫通穴内に試料溶液を供給した際に、貫通穴の内壁面に試料溶液中の検体（アナライト）が吸着し難くなるため、試料溶液中の特定物質が貫通穴底面に位置するリガンド固定領域で捕捉される条件が高まり、結果として検出精度を向上させることができる。
本発明によれば、ウェル部材を備えたセンサ構造体を用いても、特定物質を精度良く検出することができ、しかも構造が簡単であるため、製造コストを抑えることのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することができる。
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）は、リガンド固定領域に固定されたリガンドに捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うものである。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）は、リガンド固定領域に固定されたリガンドに捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うものである。
また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」も含まれるものである。
さらに「ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域」とは、貫通穴の金属薄膜側の開口端で区画された領域のことである。
さらに「ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域」とは、貫通穴の金属薄膜側の開口端で区画された領域のことである。
本発明のＳＰＦＳ装置１は、図１に示したように、まず誘電体部材１２と、誘電体部材１２の上面に形成された金属薄膜１４と、金属薄膜１４上面に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定するためのリガンド固定領域１６と、を備えたセンサ部材１０を有し、このセンサ部材１０の上に、リガンド固定領域１６と対応する位置に貫通穴２０を有するウェル部材１８が固定されたセンサ構造体２２が備えられている。
このようなセンサ構造体２２は、例えば誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４の全面にリガンドを固定しておき、この状態で金属薄膜１４上にウェル部材１８を固定することで製造できる。
この製造方法はウェル部材１８を固定する前に、既にリガンドを金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６に固定化しているので、ウェル部材１８の貫通穴２０の内壁面にリガンドが付かず、検出効率を高める上で好ましい。また金属薄膜１４の全面にリガンドを固定するので、リガンドを固定化する際に、リガンドの固定をリガンド固定領域１６のみに制限するための別部材を用いる必要がなく簡易な製造ができる。
なお、リガンドを必ずしも金属薄膜１４上の全面に固定する必要がないことは勿論であり、リガンド固定領域１６と同一の領域、或いはリガンド固定領域１６を含み、それよりも僅かに広い領域に固定することもできる。この場合には、ウェル部材１８と異なる枠部材を用いてリガンドを金属薄膜１４上に固定化することが好ましい。
このようにウェル部材１８の貫通穴２０で規定される底面領域の全域にわたりリガンドを固定することが、非特異吸着を防止してノイズを低減する上では好ましい。
また別の製造方法として、誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４上に、予め貫通穴２０の内壁面に非特異吸着防止用の表面処理を施したウェル部材１８を配設し、貫通穴２０内にリガンドを含有した溶液を注入することで、貫通穴２０の底面に位置する金属薄膜１４の上にのみリガンドを固定化させるようにしても良い。
また別の製造方法として、誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４上に、予め貫通穴２０の内壁面に非特異吸着防止用の表面処理を施したウェル部材１８を配設し、貫通穴２０内にリガンドを含有した溶液を注入することで、貫通穴２０の底面に位置する金属薄膜１４の上にのみリガンドを固定化させるようにしても良い。
なお貫通穴２０の内壁面に施された表面処理については、公知の処理方法を用いることができ、例えばＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含有した溶液やリン脂質類似合成ポリマー（日油株式会社）を含んだ溶液を用いれば、非特異吸着を効果的に防止することができる。
またセンサ構造体２２は、図２に示したように誘電体部材１２が断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）であり、ウェル部材１８が誘電体部材１２の形状に合わせて方形に構成されている。
なお、誘電体部材１２の形状は図２に示した形態に限定されるものではなく、例えば四角錐，円錐，三角錐，多角錐などの角錐形状、または截頭角錐形状などであっても良いものである。
図２に示したような截頭四角錐形状の誘電体部材１２を用いた場合には、センサ構造体２２の高さを低く抑えることができ、ＳＰＦＳ装置１の小型化に寄与することができる。
そして、センサ構造体２２の誘電体部材１２側には、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって励起光２４を照射する光源２６を備え、さらに光源２６から照射され金属薄膜１４に反射した反射光２８を受光する受光手段３０が備えられている。
そして、センサ構造体２２の誘電体部材１２側には、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって励起光２４を照射する光源２６を備え、さらに光源２６から照射され金属薄膜１４に反射した反射光２８を受光する受光手段３０が備えられている。
ここで光源２６および受光手段３０には、照射位置や受光位置を調整するための位置調整手段４０，４２が設けられている。
光源２６から照射される励起光２４としてはレーザ光が好ましく、波長２００～９００ｎｍ、０．００１～１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０～８００ｎｍ、０．０１～１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
光源２６から照射される励起光２４としてはレーザ光が好ましく、波長２００～９００ｎｍ、０．００１～１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０～８００ｎｍ、０．０１～１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
一方、センサ構造体２２のウェル部材１８側には、リガンド固定領域１６で生じた蛍光３２を受光するための光検出手段３４が設けられている。
光検出手段３４としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
光検出手段３４としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
また、センサ構造体２２のリガンド固定領域１６と光検出手段３４との間には、光を効率よく集光するための集光部材３６と、光の内で蛍光３２のみを選択するように形成された波長選択機能部材３８が設けられており、これにて装置本体を構成している。
なお、図１に示したＳＰＦＳ装置１は、センサ構造体２２が装置本体に対して着脱されて使用されるような形態を意図しているが、このような形態に限定されるものではなく、センサ構造体２２が装置本体に対して固定されて使用されるような形態であっても良いものである。
ここで集光部材３６としては、蛍光シグナルを効率よく集光するものであれば、任意の集光系を用いることができる。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用することができる。対物レンズの倍率としては、１０～１００倍が好ましい。
一方、波長選択機能部材３８としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。
光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサ構造体２２の面に付着した付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
このようにして構成されるＳＰＦＳ装置１を用いて蛍光を検出する方法としては、まずセンサ構造体２２の金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定した状態で検出対象となるアナライトを含んだ試料溶液を貫通穴２０内に供給し、センサ構造体２２を撹拌する。
ここでリガンド固定領域１６へのリガンドの固定は、蛍光検出を行う前から予め行っておくことが蛍光検出に要する時間を少なくする上で好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、蛍光検出の直前に行っても良いものである。
さらに貫通穴２０内を洗浄した後、検体（アナライト）に捕捉される蛍光物質を含んだ溶液を貫通穴２０内に供給し撹拌した後、再度貫通穴２０内を洗浄する。これにより蛍光物質で標識されたアナライトがリガンドに捕捉された状態となる。
この状態で、光源２６より金属薄膜１４に励起光２４を照射し、この励起光２４が特定の角度（共鳴角（電場増強時に励起光２４と金属薄膜１４の垂線とから成る角度）θａ）で金属薄膜１４に入射することで、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
なお、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２４と金属薄膜１４中の電子振動とがカップリングし、反射光２８のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段３０で受光される反射光２８のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θａを得ることができる。
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光３２の光量が増大し、この蛍光３２を集光部材３６および波長選択機能部材３８を介して光検出手段３４で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
なお、センサ構造体２２の金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１４に好適である。
また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５～５００ｎｍ、銀：５～５００ｎｍ、アルミニウム：５～５００ｎｍ、銅：５～５００ｎｍ、白金：５～５００ｎｍ、およびそれらの合金：５～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０～７０ｎｍ、銀：２０～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０～７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
さらに、アナライト検出時に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
さらに蛍光物質としては、所定の励起光２４を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光３２を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光３２とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
また、誘電体部材１２としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
さらにウェル部材１８としては、合成樹脂，金属，セラミックスなど種々の材料を用いることができ、例えば機械加工で貫通穴２０を設けることができる。
また、センサ部材１０上にウェル部材１８を固定する際には、誘電体部材１２と同じ光屈折率を有する接着剤,マッチングオイル，透明粘着シートなどを用いることが好ましい。
また、センサ部材１０上にウェル部材１８を固定する際には、誘電体部材１２と同じ光屈折率を有する接着剤,マッチングオイル，透明粘着シートなどを用いることが好ましい。
さらにウェル部材１８の貫通穴２０の大きさとしては、例えば８０～１００μｌの容量となるように設定することが好ましい。
また、このようなＳＰＦＳ装置１は、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θａ）を調整するため、角度可変部（図示せず）や、光検出手段３４に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。
また、このようなＳＰＦＳ装置１は、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θａ）を調整するため、角度可変部（図示せず）や、光検出手段３４に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。
ここで、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段３０と光源２６とを同期し、４５～８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。
このような構成を有する本発明のＳＰＦＳ装置１では、図３および図４に示したように、リガンド固定領域１６で生ずる蛍光３２を励起させる際において、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４の照射位置Ｂを、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから所定距離Ｈだけ離間した位置に、励起光２４の光軸中心が位置するよう、励起光２４の照射位置が設定されている。なお、図中符号ｒは貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離である。
ここで励起光２４の照射位置を移動させる際には、先に説明した位置調整手段４０を用いて光源２６を移動させることが好ましいが、センサ構造体２２自体を移動させるよう構成しても良く、光源２６とセンサ構造体２２とを相対的に移動させることができれば特に限定されないものである。
上記した本発明のＳＰＦＳ装置１では、リガンド固定領域１６で固定されたリガンドに検体（アナライト）が確実に捕捉されるよう、ウェル部材１８の貫通穴２０内に検体を含んだ試料溶液を供給した後、センサ構造体２２を撹拌するようにしている。
ここでの撹拌方法は円運動による撹拌が好ましく、例えば専用の撹拌装置（図示せず）を用いて行うことができる。
なおセンサ構造体２２を円運動で撹拌すると、ウェル部材１８の貫通穴２０内で試料溶液が円を描くように移動される。この時、リガンド固定領域１６におけるリガンドとアナライトとの反応量がどのように分布するか、撹拌後のリガンド固定領域１６に金コロイドで染色して調べたところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点にして、ドーナッツ状に反応量の高い箇所が分布していることが確認された。
なおセンサ構造体２２を円運動で撹拌すると、ウェル部材１８の貫通穴２０内で試料溶液が円を描くように移動される。この時、リガンド固定領域１６におけるリガンドとアナライトとの反応量がどのように分布するか、撹拌後のリガンド固定領域１６に金コロイドで染色して調べたところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点にして、ドーナッツ状に反応量の高い箇所が分布していることが確認された。
この反応量の分布をグラフ化すると、図５に示したようにウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから所定距離移動した位置Ｂで最も反応量の値が高くなっていることが分かる。
したがって本発明者は、励起光２４の照射位置Ｂを、反応量の値が最も高くなった位置に合わせて設定すれば、蛍光３２の検出効率を効果的に高めることができることを見出した。
また貫通穴２０の大きさやリガンドの種類などの測定条件が異なれば反応量の分布も異なると考えられるが、本発明者は貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％とした際、重心位置Ａから１～７５％の範囲の位置であれば、概ね反応量の値が高くなることを見出した。
このため、予めこの範囲内に励起光２４の照射位置を設定するようにすれば、蛍光３２の検出効率を効果的に高めることができる。ただし、励起光２４の照射位置の移動範囲は、励起光２４の光軸の直径が、貫通穴２０内に収まる範囲内である。
このように本発明のＳＰＦＳ装置１では、センサ構造体２２の撹拌後の反応量の分布を調べておき、反応量の値が最も高くなった位置に励起光２４の照射位置を設定することで、蛍光３２の検出効率を効果的に高めることができる。
さらに本発明のＳＰＦＳ装置１で用いられるセンサ構造体２２はウェル部材１８を用いたものであるため、図１４に示したような流路型のセンサ構造体３００のようにポンプなどの送液手段を用意する必要がなく、装置を簡素化して製造コストを抑えることができる。
なお、上記説明したＳＰＦＳ装置１におけるセンサ構造体２２では、ウェル部材１８の貫通穴２０はストレートであるが、図６に示したように貫通穴２０の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパー４４が付されていても良いものである。
理由としては、蛍光物質から生ずる蛍光３２が放射状に拡散され、拡散された蛍光３２を光検出手段３４で効率良く集光するためである。
逆テーパー４４の傾斜角度θｂとしては、集光効率を高める上で０°より大きく４５°以下の範囲内であることが好ましい。
逆テーパー４４の傾斜角度θｂとしては、集光効率を高める上で０°より大きく４５°以下の範囲内であることが好ましい。
また、貫通穴２０の形状としては本実施例のように円形に限定されるものではなく、楕円形や三角形などであっても良いものであるが、図７（ａ）に示した四角形、図７（ｂ）に示した六角形のように点対称な形状であれば、撹拌を行った際に反応分布が顕著に現れるので好ましい。
このような円形以外の形状を有する貫通穴２０の場合にも、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％として励起光２４の照射位置を規定するようにすれば良い。
さらに、図８に示したように、リガンド固定領域１６に固定されるリガンド１６ａ～１６ｄの種類は一箇所の貫通穴２０に対して、複数であっても良い。
また、図９に示したように、複数の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いても良く、この場合には貫通穴２０毎に異なるリガンド１６ｅ～１６ｈを固定化するようにしても良いものである。
また、図９に示したように、複数の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いても良く、この場合には貫通穴２０毎に異なるリガンド１６ｅ～１６ｈを固定化するようにしても良いものである。
なお、１つの貫通穴２０に対して複数種類のリガンドを固定した場合や、複数の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いた場合には、例えば光源２６に対してセンサ構造体２２が回転移動するような移動手段（図示せず）を別途設けておけば、蛍光検出をスムーズに行うことができる。
さらに、上記したセンサ構造体２２では、金属薄膜１４上にウェル部材１８が固定されているが、図１０に示したように、センサ構造体２２上にパターニングなどの方法で部分的に金属薄膜１４を成膜しておき、さらに金属薄膜１４上にリガンド固定領域１６を形成し、リガンド固定領域１６および金属薄膜１４を囲うようにウェル部材１８を誘電体部材１２上に設置した形態でも構わないものである。
以上、本発明のＳＰＦＳ装置１およびこれを用いた蛍光検出方法について説明したが、本発明は上記の形態に限定されるものではなく、例えば上記実施形態で説明した装置本体の構成を更に簡略化することも可能であり、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
［実施例１］
誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４上に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定してリガンド固定領域１６を形成した。
誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４上に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定してリガンド固定領域１６を形成した。
直径φ５ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用意し、これを金属薄膜１４上にマッチングオイルを介して固定し、センサ構造体２２とした。
次いでセンサ構造体２２の貫通穴２０内に検体（アナライト）を含有した試料溶液を注入し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
次いでセンサ構造体２２の貫通穴２０内に検体（アナライト）を含有した試料溶液を注入し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体（アナライト）を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化した。グラフのＸ軸は、ウェル部材１８の貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％とした場合、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａからの移動距離を示しており、Ｙ軸は反応量であり、反応量の最大値を１００％とした時の割合を表したものである。
グラフから明らかなように、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％とした際に、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから８％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。
［実施例２］
直径φ６．５ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
直径φ６．５ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから１５％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。
［実施例３］
直径φ１２ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
直径φ１２ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから５０％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。
［実施例４］
直径φ１８ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
直径φ１８ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから６１％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。
なお、実施例１～４の貫通穴２０の大きさは、概ね市販されているウェル部材１８の貫通穴２０の最小サイズから最大サイズである。したがって実施例１～４の結果から、ウェル部材１８の貫通穴２０の大きさが変わっても、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａからの移動距離が１～７５％の範囲内の位置に励起光２４の照射位置を設定すれば、概ね良好な反応が生ずることが確認できた。
１・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１０・・・センサ部材
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・リガンド固定領域
１６ａ～１６ｈ・・リガンド
１８・・・ウェル部材
２０・・・貫通穴
２０ａ～２０ｄ・・貫通穴
２２・・・センサ構造体
２４・・・励起光
２６・・・光源
２８・・・反射光
３０・・・受光手段
３２・・・蛍光
３４・・・光検出手段
３６・・・集光部材
３８・・・波長選択機能部材
４０・・・位置調整手段
４２・・・位置調整手段
４４・・・逆テーパー
θａ・・・共鳴角
θｂ・・・逆テーパーの傾斜角度
Ａ・・・ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置
Ｂ・・・光源から金属薄膜に照射される励起光の照射位置
Ｈ・・・離間距離（所定距離）
ｒ・・・貫通穴の底面領域の重心位置から貫通穴の外形端までの最短距離
１００・・・表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・リガンド固定領域
１０８・・・リガンド含有層
１１０・・・センサ構造体
１１２・・・励起光
１１４・・・光源
１１６・・・反射光
１１８・・・受光手段
θ１・・・共鳴角
θ２・・・共鳴角
２００・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
２０２・・・誘電体部材
２０４・・・金属薄膜
２０６・・・リガンド固定領域
２０８・・・リガンド含有層
２１０・・・センサ構造体
２１２・・・励起光
２１４・・・光源
２１６・・・反射光
２１８・・・受光手段
２２０・・・蛍光
２２２・・・光検出手段
２２４・・・集光部材
２２６・・・波長選択機能部材
３００・・・センサ構造体
３０２・・・誘電体部材
３０４・・・金属薄膜
３０６・・・リガンド固定領域
３０８・・・横形流路
３１０・・・試料溶液
４００・・・センサ構造体
４０２・・・誘電体部材
４０４・・・金属薄膜
４０６・・・リガンド固定領域
４０８・・・ウェル部材
４１０・・・貫通穴
４１２・・・試料溶液
１０・・・センサ部材
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・リガンド固定領域
１６ａ～１６ｈ・・リガンド
１８・・・ウェル部材
２０・・・貫通穴
２０ａ～２０ｄ・・貫通穴
２２・・・センサ構造体
２４・・・励起光
２６・・・光源
２８・・・反射光
３０・・・受光手段
３２・・・蛍光
３４・・・光検出手段
３６・・・集光部材
３８・・・波長選択機能部材
４０・・・位置調整手段
４２・・・位置調整手段
４４・・・逆テーパー
θａ・・・共鳴角
θｂ・・・逆テーパーの傾斜角度
Ａ・・・ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置
Ｂ・・・光源から金属薄膜に照射される励起光の照射位置
Ｈ・・・離間距離（所定距離）
ｒ・・・貫通穴の底面領域の重心位置から貫通穴の外形端までの最短距離
１００・・・表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・リガンド固定領域
１０８・・・リガンド含有層
１１０・・・センサ構造体
１１２・・・励起光
１１４・・・光源
１１６・・・反射光
１１８・・・受光手段
θ１・・・共鳴角
θ２・・・共鳴角
２００・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
２０２・・・誘電体部材
２０４・・・金属薄膜
２０６・・・リガンド固定領域
２０８・・・リガンド含有層
２１０・・・センサ構造体
２１２・・・励起光
２１４・・・光源
２１６・・・反射光
２１８・・・受光手段
２２０・・・蛍光
２２２・・・光検出手段
２２４・・・集光部材
２２６・・・波長選択機能部材
３００・・・センサ構造体
３０２・・・誘電体部材
３０４・・・金属薄膜
３０６・・・リガンド固定領域
３０８・・・横形流路
３１０・・・試料溶液
４００・・・センサ構造体
４０２・・・誘電体部材
４０４・・・金属薄膜
４０６・・・リガンド固定領域
４０８・・・ウェル部材
４１０・・・貫通穴
４１２・・・試料溶液
Claims (14)
- 誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、
前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、
を備え、
前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されていることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。 - 前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１～７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。 - 前記センサ構造体は、撹拌されて使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記ウェル部材の前記貫通穴には、前記貫通穴の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパーが付されていることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記ウェル部材の前記貫通穴の形状が、点対称な形状であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが１種類であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが複数種類であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記ウェル部材には、前記貫通穴が１つ設けられていることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記ウェル部材には、前記貫通穴が複数設けられていることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記センサ構造体と前記光源とを、相対的に移動させて調整する位置調整手段を有することを特徴とする請求項１～９のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 前記ウェル部材の前記貫通穴の内壁面に、非特異吸着防止用の表面処理が施されていることを特徴とする請求項１～１０のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
- 誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体の前記リガンド固定領域に固定されたリガンドにアナライトを捕捉させ、さらに前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記アナライトを蛍光物質で標識した状態で、前記センサ構造体の金属薄膜に前記誘電体部材側から励起光を照射して、前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光が照射されることを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１～７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光検出方法。 - 前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記センサ構造体は、撹拌されることを特徴とする請求項１２または１３に記載の蛍光検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14/118,341 US9551662B2 (en) | 2011-05-19 | 2012-04-23 | Surface plasmon-field enhanced fluorescence measurement device and fluorescence detection method using the same |
| JP2013515054A JP5971240B2 (ja) | 2011-05-19 | 2012-04-23 | 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法 |
| EP12785616.9A EP2711689B1 (en) | 2011-05-19 | 2012-04-23 | Surface plasmon-field enhanced fluorescence measurement device and fluorescence detection method using same |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011-112365 | 2011-05-19 | ||
| JP2011112365 | 2011-05-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2012157403A1 true WO2012157403A1 (ja) | 2012-11-22 |
Family
ID=47176739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2012/060814 Ceased WO2012157403A1 (ja) | 2011-05-19 | 2012-04-23 | 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9551662B2 (ja) |
| EP (1) | EP2711689B1 (ja) |
| JP (1) | JP5971240B2 (ja) |
| WO (1) | WO2012157403A1 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014097877A1 (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | コニカミノルタ株式会社 | センサーチップおよびこれを用いたｓｐｆｓ免疫蛍光測定システム |
| WO2016170967A1 (ja) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | コニカミノルタ株式会社 | 検出チップの製造方法および検出チップ |
| WO2018021238A1 (ja) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | コニカミノルタ株式会社 | 検出チップ、検出システムおよび検出方法 |
| WO2018150944A1 (ja) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | コニカミノルタ株式会社 | 検査チップ及び検査システム |
| WO2018150943A1 (ja) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | コニカミノルタ株式会社 | 送液システム、検査システム及び送液方法 |
| US10060851B2 (en) | 2013-03-05 | 2018-08-28 | Plexense, Inc. | Surface plasmon detection apparatuses and methods |
| US10359362B2 (en) | 2013-04-15 | 2019-07-23 | Plexense, Inc. | Method for manufacturing nanoparticle array, surface plasmon resonance-based sensor and method for analyzing using same |
| KR20190096984A (ko) * | 2016-12-05 | 2019-08-20 | 아카데미아 시니카 | 광대역 메타-광학 장치 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3153845B1 (en) * | 2014-05-29 | 2020-05-27 | Konica Minolta, Inc. | Surface-plasmon enhanced fluorescence measurement method and surface-plasmon enhanced fluorescence measurement device |
| JP6673336B2 (ja) * | 2015-03-17 | 2020-03-25 | コニカミノルタ株式会社 | 検出装置 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003004629A (ja) * | 2001-06-19 | 2003-01-08 | Ricoh Opt Ind Co Ltd | 発光測定用のマイクロプレートおよび発光測定方法 |
| JP3743541B2 (ja) | 1997-06-09 | 2006-02-08 | 富士写真フイルム株式会社 | サンプルプレート |
| JP2006208069A (ja) * | 2005-01-26 | 2006-08-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | プラズモン共鳴蛍光を用いた生体分子相互作用検出装置及び検出方法 |
| JP2007003357A (ja) * | 2005-06-23 | 2007-01-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖鎖あるいは複合糖質の解析装置 |
| JP2009222484A (ja) * | 2008-03-14 | 2009-10-01 | Fujifilm Corp | 被検体検出方法および被検体検出装置 |
| WO2011043202A1 (ja) * | 2009-10-05 | 2011-04-14 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 表面プラズモン増強蛍光測定装置 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19856041A1 (de) | 1998-12-04 | 2000-07-13 | Inst Chemo Biosensorik | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen Fluoreszenz markierten Affinitätstests |
| JP3783826B2 (ja) * | 2000-01-17 | 2006-06-07 | 横河電機株式会社 | バイオチップ読み取り装置 |
| WO2003010289A2 (en) | 2001-07-25 | 2003-02-06 | The Trustees Of Princeton University | Nanochannel arrays and their preparation and use for high throughput macromolecular analysis |
| EP1451558A1 (de) * | 2001-11-28 | 2004-09-01 | Graffinity Pharmaceuticals Aktiengesellschaft | Spr-sensorflächenträger |
| US8119995B2 (en) * | 2005-07-21 | 2012-02-21 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Device for detection of excitation using a multiple spot arrangement |
| US8376013B2 (en) * | 2008-03-11 | 2013-02-19 | Duke University | Plasmonic assisted systems and methods for interior energy-activation from an exterior source |
| JP5222599B2 (ja) * | 2007-07-20 | 2013-06-26 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置 |
| US8159676B2 (en) * | 2008-01-21 | 2012-04-17 | University Of North Texas, Health Science Center At Fort Worth | Ratiometric surface plasmon coupled emission detector |
| JP5190945B2 (ja) * | 2008-07-14 | 2013-04-24 | 富士フイルム株式会社 | 検出方法、検出装置、検出用試料セルおよび検出用キット |
| JPWO2010134470A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2012-11-12 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサ |
| US20140170024A1 (en) * | 2011-07-15 | 2014-06-19 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Target substance detection chip, target substance detection plate, target substance detection device and target substance detection method |
| EP2799843B1 (en) * | 2011-12-26 | 2019-08-21 | Konica Minolta, Inc. | Spfs measurement method employing spfs measurement sensor chip, and spfs measurement device comprising spfs measurement sensor chip |
-
2012
- 2012-04-23 EP EP12785616.9A patent/EP2711689B1/en active Active
- 2012-04-23 WO PCT/JP2012/060814 patent/WO2012157403A1/ja not_active Ceased
- 2012-04-23 JP JP2013515054A patent/JP5971240B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-04-23 US US14/118,341 patent/US9551662B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3743541B2 (ja) | 1997-06-09 | 2006-02-08 | 富士写真フイルム株式会社 | サンプルプレート |
| JP2003004629A (ja) * | 2001-06-19 | 2003-01-08 | Ricoh Opt Ind Co Ltd | 発光測定用のマイクロプレートおよび発光測定方法 |
| JP2006208069A (ja) * | 2005-01-26 | 2006-08-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | プラズモン共鳴蛍光を用いた生体分子相互作用検出装置及び検出方法 |
| JP2007003357A (ja) * | 2005-06-23 | 2007-01-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖鎖あるいは複合糖質の解析装置 |
| JP2009222484A (ja) * | 2008-03-14 | 2009-10-01 | Fujifilm Corp | 被検体検出方法および被検体検出装置 |
| WO2011043202A1 (ja) * | 2009-10-05 | 2011-04-14 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 表面プラズモン増強蛍光測定装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See also references of EP2711689A4 |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2014097877A1 (ja) * | 2012-12-19 | 2017-01-12 | コニカミノルタ株式会社 | センサーチップおよびこれを用いたｓｐｆｓ免疫蛍光測定システム |
| JP2019020406A (ja) * | 2012-12-19 | 2019-02-07 | コニカミノルタ株式会社 | センサーチップおよびこれを用いたｓｐｆｓ免疫蛍光測定システム |
| WO2014097877A1 (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | コニカミノルタ株式会社 | センサーチップおよびこれを用いたｓｐｆｓ免疫蛍光測定システム |
| US10060851B2 (en) | 2013-03-05 | 2018-08-28 | Plexense, Inc. | Surface plasmon detection apparatuses and methods |
| US10359362B2 (en) | 2013-04-15 | 2019-07-23 | Plexense, Inc. | Method for manufacturing nanoparticle array, surface plasmon resonance-based sensor and method for analyzing using same |
| JPWO2016170967A1 (ja) * | 2015-04-22 | 2018-02-15 | コニカミノルタ株式会社 | 検出チップの製造方法および検出チップ |
| WO2016170967A1 (ja) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | コニカミノルタ株式会社 | 検出チップの製造方法および検出チップ |
| US10677731B2 (en) | 2015-04-22 | 2020-06-09 | Konica Minolta, Inc. | Method of manufacturing sensing chip and sensing chip |
| WO2018021238A1 (ja) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | コニカミノルタ株式会社 | 検出チップ、検出システムおよび検出方法 |
| JPWO2018021238A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2019-05-16 | コニカミノルタ株式会社 | 検出チップ、検出システムおよび検出方法 |
| JP6991972B2 (ja) | 2016-07-28 | 2022-01-13 | 大塚製薬株式会社 | 検出チップ、検出システムおよび検出方法 |
| US11408817B2 (en) | 2016-07-28 | 2022-08-09 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Detection chip, detection system, and detection method |
| KR20190096984A (ko) * | 2016-12-05 | 2019-08-20 | 아카데미아 시니카 | 광대역 메타-광학 장치 |
| KR102209458B1 (ko) | 2016-12-05 | 2021-01-29 | 아카데미아 시니카 | 광대역 메타-광학 장치 |
| WO2018150943A1 (ja) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | コニカミノルタ株式会社 | 送液システム、検査システム及び送液方法 |
| WO2018150944A1 (ja) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | コニカミノルタ株式会社 | 検査チップ及び検査システム |
| US11224879B2 (en) | 2017-02-15 | 2022-01-18 | Konica Minolta, Inc. | Inspection chip and inspection system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9551662B2 (en) | 2017-01-24 |
| EP2711689A4 (en) | 2015-01-07 |
| JPWO2012157403A1 (ja) | 2014-07-31 |
| JP5971240B2 (ja) | 2016-08-17 |
| EP2711689A1 (en) | 2014-03-26 |
| EP2711689B1 (en) | 2020-01-01 |
| US20140061506A1 (en) | 2014-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5971240B2 (ja) | 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法 | |
| JP5573843B2 (ja) | 表面プラズモン増強蛍光測定装置 | |
| JP5640980B2 (ja) | マイクロチップ送液システム、検体検出装置、及びマイクロチップ送液システムの送液方法 | |
| JP2010145272A (ja) | プラズモン励起センサを用いたアッセイ法 | |
| JP2013238611A (ja) | 表面プラズモン増強蛍光センサおよび表面プラズモン増強蛍光センサに用いられる集光部材 | |
| JP6485356B2 (ja) | サンドイッチ−イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法 | |
| JPWO2010134470A1 (ja) | 表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサ | |
| JP6098523B2 (ja) | Ｓｐｆｓ測定用センサーチップ、およびｓｐｆｓ測定用センサーチップを用いたｓｐｆｓ測定方法、ならびにｓｐｆｓ測定用センサーチップを備えたｓｐｆｓ測定装置 | |
| JP2011257216A (ja) | 表面プラズモン増強蛍光センサおよび表面プラズモン増強蛍光センサに用いられるチップ構造体ユニット | |
| JP5831230B2 (ja) | 表面プラズモン増強蛍光測定装置 | |
| JP6003645B2 (ja) | 蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法 | |
| JPWO2014017433A1 (ja) | 光学式検体検出装置 | |
| JP5891990B2 (ja) | 光学式検体検出装置 | |
| JP5663905B2 (ja) | チップ構造体 | |
| JP2012511718A (ja) | 流体中のターゲット成分を検出する検出装置 | |
| WO2019221040A1 (ja) | 検体検出チップ及びこれを用いた検体検出装置 | |
| WO2014007134A1 (ja) | センサーチップ | |
| JP2013250282A (ja) | チップ構造体 | |
| JP5983786B2 (ja) | 表面プラズモン測定装置に用いられるセンサーチップおよびセンサーチップを用いた表面プラズモン測定装置 | |
| JP2012251863A (ja) | 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体 | |
| JP2012220256A (ja) | 表面プラズモン測定装置に用いられるセンサーチップおよびセンサーチップを用いた表面プラズモン測定装置 | |
| JP5387131B2 (ja) | 表面プラズモン増強蛍光センサおよび表面プラズモン増強蛍光センサに用いられるチップ構造体ならびに表面プラズモン増強蛍光センサを用いた検体検出方法 | |
| JP5786985B2 (ja) | 表面プラズモン増強蛍光センサおよび表面プラズモン増強蛍光センサに用いられるチップ構造体ユニット | |
| JP5803933B2 (ja) | 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材 | |
| JP2014025951A (ja) | 測定方法及び表面プラズモン増強蛍光測定装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 12785616 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2013515054 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 14118341 Country of ref document: US |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2012785616 Country of ref document: EP |