WO2012159548A1

WO2012159548A1 - 拮抗血管新生诱导因子的融合蛋白及其用途

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Publication number: WO2012159548A1
Application number: PCT/CN2012/075700
Authority: WO
Inventors: 房健民; 李栋
Original assignee: YANTAI RC BIOTECHNOLOGIES Ltd
Current assignee: YANTAI RC BIOTECHNOLOGIES Ltd
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2012-11-29
Anticipated expiration: 2013-11-20
Also published as: CN102219859B; US20130190235A1; JP2014513940A; CA2831161A1; BR112013022279B1; KR20130125809A; KR20160011240A; CN102219859A; RU2013140472A; BR112013022279A2; US9522949B2; AU2012261410B2; JP6328164B2; EP2711377A4; EP2711377B1; AU2012261410A1; RU2560589C2; CA2831161C; JP2016106128A; KR101682496B1

Abstract

本发明公开了一类抑制血管新生的融合蛋白及其用途，进一步公开了VEGF受体和FGF受体的融合蛋白及其在治疗与血管新生调控相关的疾病中的应用。

Description

拮¾01管新生诱导因子的融^ "白及其用途技术

[01] 本发明涉及拮 ¾k管新生诱导因子的融合蛋白及其用途。具体地，本发明涉及抑制多种血管新生因子的融合蛋白及其用途。更具体地，本发明涉及 VEGF受体和 FGF受体的融合蛋白及其在治疗与血管新生相关的疾病中的用途。

背景技术

[02] 血管新生（Angiogenesis )是导致恶性肿瘤生长和转移的基本要素之一 [1]。血管新生过程受多种因子的调节，有些因子促进血管新生，有些因子抑制血管新生，因而，血管新生的调控是一个十分复杂的动态平衡过程 [2]。抗血管新生治疗旨在通过阻断血管新生刺激因子或者用血管新生抑制因子 pHoh肿瘤中血管的新生，从而 ii i控制肿瘤生长的目的。目前已经知道相当数目的血管新生刺激因子，例如血管内皮细胞生长因子 ( Vascular endothelial growth factor, VEGF )、成纤维细胞生长因子 ( Fibroblast growth factor, FGF )、肝细胞生长因子（ Hepatocyte growth factor, HGF )、 DDR1、 EphAl、 EphA2、 EphA8、 EphBl、、 EphB4、 EGFR、 HER-2、 ErbB3、 MET, RON, CSF1R、 KIT, PDGFR-A, PDGFR-B, TEK：、 Tie-1等，这些因子能刺激血管内皮细胞的分裂、分化和血管的形态发生。其中， VEGF是目前所知对血管新生最特异、最有效的生长因子

[3, 4]。

[03] 在肿瘤组织内的缺氧环境中，肿瘤细胞分泌大量的 VEGF,诱导血管内皮细胞的分裂和迁移，最终建立肿瘤血管网络。众多动物试 mi明，抑制 VEGF能阻止血管新生，进而抑制肿瘤的生长。正因为此， VEGF及其受体是抗血管新生药物最重要的靶标，目前在临床试验中取得显著疗效的抗血管新生药物有贝伐单抗（Bevacizumab, 商品名 Avastin ), 它能够直接阻断 VEGF,抑制肿瘤血管的新生，于 2004年被美国 FDA批准上市作为结直肠癌的一线用药，是第一个被批准上市的通过抑制血管新生发挥抗癌作用的新药。 Avastin是一种人源化的抗 VEGF的单克隆抗体，由美国著名生物技 ^ 司 Genentech生产。在大三期临床试验中， Avastin 与化疗联合用药可以显著延长多种肿瘤病人的生存时间，包括直肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌等 [5, 6]。 Avastin在临床上的成功具有划时代的意义，它证明以肿瘤血管系统为靶标的抗血管新生治疗是一个在临床上有效的治疗手段，为多种肿瘤的治疗开辟了一个全新的途径。在西方国家， Avastin 已在肿瘤治疗上得到广泛应用，是目前全球销售额最大的药物之

[04] 除了 Avastin, 还有若干个抗 VEGF信号的药物正处于人体临床试验的后期，有望在将来几年进入临床应用。其中，美国生物技术公司 Regeneron和 Sanofi-Aventis 的 Aflibercept (或称 VEGF-Trap )目前正在进行大^ L¾第三期临床试验 [7]。 Imclone公司的抗 VEGF 受体 II ( VEGFR2 )单克隆抗体药物 IMC-1121B也在第三期临床试验 [8]。亳无疑问，这些新药将为癌症的治疗提供新的选择，给病人带来新的希望。

[05] 抗 VEGF药物在肿瘤的临床治疗上取得了重大的进展，但是，临床试验也显示抗 VEGF治疗也存在相当大的局限。从肿瘤的治疗效果看， Avastin对直肠结肠癌病人能延长半数生存时间约 3-4个月 [9, 10] , 对乳腺癌病人能延长半数生存时间约为 7-8个月 [11]，因此， Avastin并不能长期有效地抑制肿瘤血管的生长。因此，如何进一步提高抗血管新生的临床治疗效果是肿瘤研究者需要解决的问题，也是研究开发下一代抗血管新生药物的重点。

[06] 导致抗 VEGF治疗失败或产生抗性的的根本原因可能在于肿瘤血管新生是受到多种因子控制的，尽管 VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一的血管新生刺激因子。同时，由于肿瘤细胞的非均质性和肿瘤微环境的复杂性以及机体的代偿性反应机制，当 VEGF的活性被长时间抑制，其它血管新生刺激因子便会被表达 [12]，从而使肿瘤血管的生长不再依赖于 VEGF信号途径。 Hanahan的小组研究了胰岛肿瘤在接受抗 VEGFR2治疗过程中肿瘤表达血管生长因子的变化，发现在抗 VEGF的治疗过程中有若干基因的表 iiJL生了变化，其中最为突出的是 FGF-2的表达显著增加，研究表明对抗 VEGF治疗出现耐受的肿瘤中 FGF，尤其是 FGF-2的表达显著增加，从而再次激活血管新生，而阻断 FGF信号途径后肿瘤再生则被抑制 [13]。由此可见 FGF-2的过度表达与肿瘤获得逃逸抗 VEGF治疗的能力有^ "密切的关系。因此，同时抑制 VEGF和 FGF-2 将可以更有效地治疗肿瘤等血管增生性疾病。

[07] 目前小分子药物在双重或多重靶标拮抗方面已经取得了一定的进展，证明同时拮抗 VEGF和 FGF-2的抗肿瘤效果要优于单一靶向抗肿瘤治疗 [14]。但是小分子多标拮抗剂由于缺乏特异性，往往造成难以预测的副作用，这种副作用有时要在临床试验后期才显现，因此具有艮大的风险。而大分子蛋白药物，尤其是 Fc融合蛋白和单克隆抗体，具有特异性强、体内半衰期长等优点，是药物研发的重点领域，具有小分子药物不具有的优点。

[08] 成纤维细胞生长因子（FGF )是结合肝素的生长因子家族，在哺乳动物中其具有 22个家族成员（FGF 1-14, 16-23)。 FGF在多种生物学功能上具有重要作用，例如细胞增殖、分化、迁移、血管新生和肿瘤发生。其通过结合并活化细胞表面 FGF受体 ( FGFR )发挥其多种生物学功能。（参见，例如 Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev. 16: 139-149, 2005)。成纤维细胞生长因子受体 ( fibroblast growth factor receptor, FGFR )是与成纤维细胞生长因子家族成员相结合的受体。成纤维细胞生长因子受体中的一部分参与疾病过程。哺乳动物中有四个 FGFR基因： fgfRl-fgfR4。成纤维细胞生长因子受体由胞外区、跨膜结构域和胞内结构域组成。 FGFR家族成员中，其配体结合性质和激酶结构域各有不同，但是都具有相似的胞外区。它们的胞外区包含三个免疫球蛋白样（Ig样）结构域：第一 Ig样结构域、第二 Ig样结构域和第三 Ig样结构域，在第一和第二 Ig样结构域之间还包含一段序列，在本文中，我们将所述第一

Ig样结构域和第二 Ig样结构域之间的序列称为 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区。所述中间功能性序列区包含一个酸性氨基酸区段，称为酸性盒 ( acidic box, AB )„

[09] 鉴于 VEGF和 FGF (尤其是 FGF-2 )在肿瘤血管新生中的重要作用，我们认为双重拮抗 VEGF和 FGF (尤其是 FGF-2 )的大分子蛋白药物将能够更好地抑制肿瘤血管的新生，在临床上得到更好的治疗效果。但到目前为止，尚未有成功构建对 VEGF和 FGF具有双重阻断作用的大分子融合蛋白的报道。因此，本研究旨在探索构建一种能同时拮抗 VEGF和 FGF (尤其是 FGF-2 )的 Fc融合蛋白，该融 ^^白利用受体的特异性和高亲和力，将能同时阻断 VEGF和 FGF信号。；^究的 VEGF和 FGF双重拮抗融合蛋白质将釆用全人源的蛋白质序列，结合 Fc融合蛋白优良的药物动力学特性，将具有良好的成药条件和临床应用的潜力。另一方面，在双靶标融合蛋白中，融合蛋白对各靶标的亲和力有赖于正确的蛋白质构型，受体片《 ^融^ ^白中往往失去与配体结合能力，因此，构建高效、特异的双重拮抗 VEGF和 FGF (例如 FGF-2 )的融合蛋白药物具有一定的难度。在本研究的前期工作中，我们构建了二十几个包含不同的 VEGFR 片段、 FGFR片段和 IgGl Fc的融^ ^白，获得了对 VEGF和 FGF (尤其是 FGF-2 )具有高度亲和力的融^ ^白。

[10] 已有报道多种抑制血管新生的融合蛋白，例如基于 FGFR的融合蛋白（ WO/2008/065543 )、基于 Notch3 的融合蛋白（ WO/2010/021729 )、基于 VEGFR 的融合蛋白（ WO/2010/105573 )、基于 LK8 的融合蛋白 ( WO/2008/075833 ), 等等，但是这些融合蛋白都是针对单一的靶标将来自单个血管新生抑制剂的部分与免疫球蛋白的 Fc片段融合来实现抑制血管新生。现有技术中尚未有报道能够成功地将两个血管抑制单元融合在一起通过抑制双重靶标实现抑制血管新生功能的融合蛋白。本发明人首次成功地将衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元融合在一起，形成了抑制双重靶标进而抑制血管新生的融^ ^白，出人意料地获得了特别好的效果。因此，本发明为抑制血管新生的药物的开发，提供了新的思路。

发明内容

[11] 在一个方面中，本发明涉及一种融合蛋白，其包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元。在一个实施方案中，所述融合蛋白抑制血管新生。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在体内和 /或在体外结合 FGF和 VEGF。

[12] 在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，所述至少两种血管新生抑制剂选自： VEGFR例如 VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3,和 FGFR例如 FGFR1、 FGFR2、 FGFR4。优选地，本发明的融合蛋白包含衍生自 VEGFR1、 VEGFR2和 FGFR1的至少两个血管新生抑制单元。更优选地，本发明的融合蛋白包含衍生自 VEGFR1、 VEGFR2和 FGFR1的两个血管新生抑制单元，其中一个血管新生抑制单元衍生自 VEGFR1和 VEGFR2, 另一个衍生自 FGFR1₀

[13] 在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，所述至少两种血管新生抑制剂是抑制血管新生的可溶性受体片段，所述可溶性受体片段例如可以选自： DDR1、 EphAl、 EphA2、 EphA8、 EphBl、 EphB4、 EGFR、 HER-2、 ErbB3、 FGFR1、 FGFR2、 FGFR4、 MET、 RON, CSF1R、 KIT, PDGFR-A、 PDGFR-B、 TEK：、 Tie-1、 HGF、 VEGFRl, VEGFR2、 VEGFR3及其等位基因变体。在一个具体实施方案中，所述血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体 VEGFR和 FGFR。

[14] 在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种（优选两种或三种）血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，所述至少两个血管新生抑制单元包括至少一个衍生自 VEGFR胞外区的血管新生抑制单元和至少一个衍生自 FGFR胞外区的血管新生抑制单元，优选地所述 VEGFR胞外区是 VEGFRl、 VEGFR2和 /或 VEGFR3胞外区，所述 FGFR 胞夕卜区是 FGFR1和 /或 FGFR2胞夕卜区。

[15] 在另一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含衍生自至少两种（优选两种或三种）血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元，其中所述至少两个血管新生抑制单元包括一个衍生自 VEGFRl和 /或 VEGFR2胞外区的血管新生抑制单元和一个衍生自 FGFR1胞外区的血管新生抑制单元。

[16] 在又一些实施方案中，所述衍生自 VEGFR (如 VEGFRl 和 /或 VEGFR2 )胞外区的部分包含选自下列的一项或多项或者由其组成： VEGFR (如 VEGFRl或 VEGFR2 )的第一 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR(如 VEGFRl或 VEGFR2 )第二 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR (如 VEGFRl或 VEGFR2 )第三 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR (如 VEGFRl或 VEGFR2 )第四 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR(如 VEGFRl 或 VEGFR2 )第五 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR (如 VEGFRl或 VEGFR2 ) 第六 Ig样结构域或其一部分和 VEGFR (如 VEGFRl 或 VEGFR2 )第七 Ig样结构域或其一部分。

[17] 在又一些实施方案中，所述衍生自 FGFR (如 FGFR1 )胞外区的部分包含选自下列的一项或多项或者由其组成： FGFR (如 FGFR1 )第一 Ig样结构域或其一部分、源自 FGFR (如 FGFRl ) Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR (如 FGFR1 )第二 Ig样结构域或其一部分和 FGFR (如 FGFR1 )第三 Ig样结构域或其一部分。特别地，本发明的融合蛋白所包含的结构域和 /或区段等之间可以直接连接和 /或通过接头连接。在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白包含所述源自 FGFR (如 FGFRl ) Ig样结构域中间功能性序列区的部分；优选地，所述源自 FGFR (如 FGFRl ) Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性 acidic box, AB )。在一个具体实施方案中 . 所述源自中间功能性序列区的部分具有选自以下的序列：与 SEQ ID ΝΟ:1第 134至 162位、 145至 162位或 151至 162位对应的處基酸序列。

[18] 在一个实施方案中，所述衍生自 VEGFR胞外区的部分包含： VEGFR1或 VEGFR2的第二 Ig样结构域和 VEGFR1或 VEGFR2的第三 Ig样结构域；所述衍生自 FGFR (如 FGFR1 )胞外区的部分包含：源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域和 FGFR第三 Ig样结构域。优选地，所述源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。特别地，所述 FGFR例如是 FGFR1或 FGFR2。

[19] 在另一个实施方案中，所述衍生自 VEGFR胞外区的部分包含： VEGFR1的第二 Ig样结构域和 VEGFR2的第三 Ig样结构域；所述衍生自 FGFR胞外区的部分包含：源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域和 FGFR第三 Ig样结构域。优选地，所述源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。特别地，所述 FGFR例如是 FGFR1或 FGFR2。

[20] 在又一个实施方案中，所述衍生自 VEGFR胞外区的部分从 N端到 C 端依次包含： VEGFR1的第二 Ig样结构域和 VEGFR2的第三 Ig样结构域；所述衍生自 FGFR胞外区的部分从 N端到 C端依次包含：源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域和 FGFR 第三 Ig样结构域。优选地，所述源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。特别地，所述 FGFR例如是 FGFR1或 FGFR2。

[21] 在一些具体实施方案中，所述衍生自 VEGFR胞外区的部分还包含 VEGFR1第一 Ig样结构域。例如，所述 VEGFR1第一 Ig样结构域是在 VEGFR1第二 Ig样结构域之前。优选地， VEGFR1第一 Ig样结构域具有：与 SEQ ID NO:2第 32至 123位相对应的氨基酸序列，或者与 SEQ ID NO:2第 32至 123位的氨基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列。

[22] 在另一些实施方案中，所述衍生自 FGFR (如 FGFR1 )胞外区的部分还包含 FGFR第一 Ig样结构域或其一部分。优选地， FGFR第一 Ig样结构域或其一部分具有：与 SEQ ID ΝΟ:1第 40至 118位相对应的氨基酸序列，或者与 SEQ ID ΝΟ:1第 40至 118位的序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列；或者 _£ [23] 与 SEQ ID NO:l第 77至 118位相对应的處基酸序列，或者与 SEQ ID ΝΟ:1第 77至 118位的氨基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列。

[24] 在本发明的一些优选实施方案中， VEGFR1第二 Ig样结构域具有：与 SEQ ID NO:2第 151至 214位相对应的處基酸序列，或者与 SEQ ID NO:2第 151至 214位的處基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列。

[25] 在本发明的另一些优选实施方案中， VEGFR2第三 Ig样结构域具有：与 SEQ ID NO:3第 224至 320位相对应的氨基酸序列，或者与 SEQ ID NO:3第 224至 320位的處基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列。

[26] 在本发明的又一些优选实施方案中， FGFR1第二 Ig样结构域具有：与 SEQ ID ΝΟ:1第 163至 247位相对应的處基酸序列，或者与 SEQ ID ΝΟ:1第 163至 247位的處基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列。

[27] 在本发明的再一些优选实施方案中， FGFR1第三 Ig样结构域具有：与 SEQ ID ΝΟ:1第 270至 359位相对应的處基酸序列，或者与 SEQ ID ΝΟ:1第 270至 359位的氨基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列。

[28] 优选地，本发明的融 ^^白还包含融合伴侣，例如免疫球蛋白 Fc区，优选人 IgG Fc区，更优选地是人 IgGl Fc区，再优选地其具有：

[29] 与 SEQ ID NO: 7相对应的 ^ 列，或者与 SEQ ID NO: 7的氨基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列；或者

[30] 与 SEQ ID NO: 8相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与 SEQ ID NO: 8的核苷酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

[31] 在又一些实施方案中，本发明的融合蛋白还包含分泌信号肽区，例如 VEGFR1信号肽区，优选地所述分泌信号肽区具有 SEQ ID NO: 2第 1至 26位的氨基酸序列或者 SEQ ID NO: 25的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。 [32] 在又一个方面，本发明提供了 Fc融合蛋白，所述蛋白包含：

[33] ( 1 )由与 SEQ ID NO: 9-24任一项所示處基酸序列有至少 70%同一性的 _t基酸序列，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性；

[34] ( 2 ) 由与 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷^^列有至少 70%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性；或者

[35] ( 3 ) SEQ ID NO: 9-24任一项所示列，或由 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。

[36] 在本发明的一些实施方案中， VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白中所包含的各部分和 /或各个结构域从 N端到 C端的顺序可以是任意的，或者也可以是图 1所示的顺序。

[37] 在一些实施方案中，本发明的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白还包含信号肽（ signal peptide, SP )，优选分泌信号肽，例如 VEGFR1的信号肽，其具有 SEQ ID NO: 2第 1至 26位的氨基酸序列或者 SEQ ID NO: 25的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。优选地，信号肽在所述融合蛋白的 N

[38] 优选地，本发明的融^ ^白从 Ν端到 C端依次包含：衍生自 VEGFR 胞外区的部分和衍生自 FGFR胞外区的部分。

[39] 优选地，在本发明的融 ^"白中，所述免疫球蛋白 Fc区是人 IgG Fc 区，例如人 IgGl Fc区，更优选地其具有：

[40] 与 SEQ ID NO: 7相对应的氨基酸序列，或者与 SEQ ID NO: 7的氨基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的處基酸序列；或者

[41] 与 SEQ ID NO: 8相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与 SEQ ID NO: 8的核苷酸序列有至少 70%同一性，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

[42] 在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白 Fc区位于融合蛋白的

C

[43] 在本发明的一些实施方案中， VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白中所包含的各区域和 /或各个结构域从 N端到 C端的顺序可以是任意的。在另一些实施方案中，所 |顷序可以是图 1所示的顺序。在一些具体实施方案中，从 N端向 C端， VEGFR部分和 FGFR部分可以分别位于对方的上游或下游。此外，所述 Fc区可以位于血管新生抑制单元的上游或下游；例如所述 Fc区位于融合蛋白的 C端区。

[44] 在一些实施方案中，本发明的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白还包含一个或多个链内二硫键，优 Ig样结构域中包含一个或多个链内^ <键。

[45] 在本发明的一个方面中， VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白可通 i½原核细胞或真核细胞例如细菌、真菌（如酵母）或哺乳动物细胞系中表达本发明的融合蛋白来产生。特别地，所述哺乳动物细胞系可以是 CHO细胞系。在重组蛋白质表达方面， CHO细胞是经常使用的细胞系。而且，还基于大^^表达中多方面的需要 ^ti 了原始 CHO细胞，从而得到了一系列针对特定表达目的的用于重组蛋白生产的衍生 CHO细胞系，例如用于无血清培养等。这些都是在重组蛋白质表达领域的。

[46] 在又一个方面，本发明的融合蛋白所包含的结构域和 /或区域之间直接连接和 /或通过接头连接，例如衍生自 VEGFR胞外区的部分、衍生自 FGFR胞外区的部分和衍生自免疫球蛋白 Fc区的部过或不通过接头融合。在一个实施方案中，衍生自 VEGFR胞外区的部分、衍生自 FGFR 胞外区的区域和免疫球蛋白 Fc区直接连接。在另一个实施方案中，衍生自 VEGFR胞外区的部分、衍生自 FGFR胞外区的区域和免疫球蛋白 Fc 区通过接头连接，例如通过 (G4S)₃接头相连。

[47] 另一方面，本发明涉及编码所述融 ^^白的分离的核酸分子。优选地，所述核酸分子包含 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷酸序列。

[48] 又一方面，本发明提供了包含所述核酸分子的载体。还提供了用所述载体转化 /转染的细胞，优选 CHO细胞。

[49] 再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白、核酸分子、载体或细胞，以及可药用载体。

[50] 本发明还涉及一种生产抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通过在原核细胞或真核细胞例如细菌、真菌（如酵母）或哺乳动物细胞系中表达本发明的融^ ^白来进行。优选地，所述哺乳动物细胞系是 CHO细胞系。

[51] 在另一个方面中，本发明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的对象施用抑制血管新生有^量的本发明融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或药物组合物。优选地，所述方法在哺乳动物中进行。

[52] 在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防肿瘤的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的本发明融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或药物组合物，优选地所述肿瘤是实体瘤。

[53] 在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防眼科血管新生相关疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的本发明融合蛋白、核酸分子、载体、细胞或药物组合物，优选地所述眼科血管新生相关疾病选自年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。

[54] 在另一方面，本发明提供了一种在体外或在体内结合 FGF 和 /或 VEGF的方法，其包括使 FGF和 VEGF与本发明的融合蛋白相接触。

[55] 本发明还涉 ^发明的融合蛋白、编码其的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、用所述载体转化 /转染的细胞或者包含它们的药物组合物在制备用于抑制血管新生的药物中的用途。另外，本发明还涉发明的融合蛋白、编码其的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、用所述载体转化 /转染的细胞或者包含它们的药物组合物在制备用于治疗或预防血管新生相关疾病的药物中的用途，优选地所述血管新生相关疾病是肿瘤或者眼中血管新生相关疾病。

[56] 考虑到不同国家的专利制度对保护主题有不同规定，开内容还提供与以上方法相对应的制药用途以及用于预定用途的药物。这些各种制药用途和药物也在本发明保护范围内，就像它们已经具体记载在^开内容中一样。

[57] 开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在;^开内容中具体记载一样。

[58] 将结合附图以及以下进一步的详细说明来举例说明本发明。需旨出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

附图说明 [59] 图 1是 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白结构示意图，其中 VEGFR1、 VEGFR2, FGFR1蛋白分别列出。 Fc融合蛋白以实线表示，缺失的酸以虚线表示；抗体样结构域用环型表示；不同的抗体样结构域以字母 + 数字表示，其中 VEGFR1的结构域以 al-a7表示， VEGFR2的结构域以 bl-b7表示， FGFR1的结构域以 cl-c3表示；二硫键以 s s表示；人 IgGl Fc用灰色框表示； SP表示信号肽；（G4S)3连接序列以三个黑色菱形框表示；酸性盒序列以带 AB字母的方框表示。

[60] 图 2是不同 Fc融合蛋白结合 VEGF和 FGF-2 比较图，其中通过 ELISA法检测各 Fc融^^白（ 20ng/mL )与包被的 VEGF165和 /或 FGF-2 (含 100ng/mL Heparin )的结合情况。

[61] 图 3显示了融合蛋白的 SDS-PAGE图。

[62] 图 4显示了融合蛋白梯度与 VEGF ( A )和 FGF-2 ( B )的结合。

[63] 图 5显示了融合蛋白与 VEGF ( A )和 FGF-2 ( B )的亲和力。

[64] 图 6显示了融合蛋白对 VEGF或 FGF-2诱导的 HUVEC细胞分裂的影响及其相对抑制率。其中图 A为融合蛋白对 VEGF诱导的 HUVEC细胞增殖的影响，图 B为融合蛋白对 VEGF诱导的 HUVEC细胞增殖的相对抑制率，图 C为融合蛋白对 FGF2诱导的 HUVEC细胞增殖的影响，图 D为融合蛋白对 FGF2诱导的 HUVEC细胞增殖的相对抑制率。

具体实施方式

定义

[65] 除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考 Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel )。處基酸残基的缩写是本领域中所用的指代 20个常用酸之一的标准 3字母和 /或 1字母代码。

[66] 尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的 "1至 10"的范围应认为包含最小值 1和最大值 10之间（包含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值 1或更大起始的子范围，例如 1至 6.1，以及以最大值 10或更小终止的子范围，例如 5.5至 10。另外，任何称为 "并入本文"的参考文献应理解为以其整体并入。

[67] 另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语"或，，可与术语"和 / 或，，互换使用，除非上下文另有清楚指明。

[68] 本文使用的术语 "Fc"、 "Fc区"、 "Fc片段" 或 "免疫球蛋白 Fc区" 等表示免疫球蛋白的可结晶片段，在本发明中，所述 Fc 区优选人 IgGl 的 Fc区。

[69] 术语 "Fc 融合蛋白" 指将异源蛋白质的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相结合的抗体样分子。从结构上来说， Fc融合蛋白包含具有所需结合特异性的處基酸序列以及免疫球蛋白恒定结构域序列。 Fc 融合蛋白分子通常包含受体或配体的结合位点。所述免疫球蛋白恒定结构域序列可以获得自任何免疫球蛋白，例如 IgG-1, IgG-2, IgG-3或 IgG-4亚型， IgA (包括 IgA-1和 IgA-2), IgE, IgD或 IgM。

[70] 本文使用的术语 "可溶性" 蛋白是指在生物学相关的温度、 pH水平和渗透压下可溶于水溶液的蛋白。本文使用的 "可溶性融合蛋白"表示该融合蛋白不包含跨膜区和胞内区。

[71] 如本文所用，术语 "分离的" 是指以下物质和 /或实体，（1)与起初产生时（在天然环境中和 /或在试验设置中）和其相关联的至少一些组分相分离和 /或 (2)通 it 工生产、制备和 /或制造。分离的物质和 /或实体可与至少约 10%、约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%、约 95%、约 98%、约 99%、基本 100%或 100%的其初始相关联的其他组分相分离。

[72] 术语"部分"和"片段"可互换的指代多肽、核酸或其它分子构建物的一部分。

[73] 本文使用的术语" VEGFR"是指血管内皮生长因子受体，其可以是 VEGFR1、 VEGFR2和 /或 VEGFR3„ 优选地，本发明中的 VEGFR是 VEGFR1和 /或 VEGFR2, 优选人的 VEGFR。

[74] 本文使用的术语" FGFR"是指成纤维细胞生长因子受体，其可以是 FGFR1、 FGFR2、 FGFR3和 /或 FGFR4。优选地，本发明中的 FGFR是 FGFR1 , 更优选人 FGFR1。

[75] 本文使用的术语 "Ig样结构域" 表示免疫球蛋白样结构域，其可见于多种蛋白质家族，参与多种生物学功能，包括细胞 -细胞识别、细胞表面受体、免疫功能等等。

[76] 本文使用的术语 "VEGFR第一 Ig样结构域" 表示 VEGFR蛋白中自 N端起第一个 Ig样结构域，优选 VEGFR1蛋白自 N端起第一个 Ig样结构域（本文称为 VEGFR1第一 Ig样结构域）或 VEGFR2蛋白自 N端起第一个 Ig样结构域（本文称为 VEGFR2第一 Ig样结构域），具有例如 SEQ ID NO: 2第 32至 123或 SEQ ID NO: 3第 46至 110位的處基酸序列。类似地， VEGFR第二 Ig样结构域具有例如 SEQ ID NO: 2第 151至 214 位或 SEQ ID NO: 3第 141至 207位的氨基酸序列， VEGFR第三 Ig样结构域具有例如 SEQ ID NO: 2第 230至 327位或 SEQ ID NO: 3第 224至 320位的處基酸序列， VEGFR第四 Ig样结构域具有例如 SEQ ID NO: 2 第 335至 421位或 SEQ ID NO: 3第 328至 414位的處基酸序列， VEGFR 第五 Ig样结构域例如具有 SEQ ID NO: 2第 428至 553位或 SEQ ID NO: 3第 421至 548位的氨基酸序列， VEGFR第六 Ig样结构域具有例如 SEQ ID NO: 2第 556至 654位或 SEQ ID NO: 3第 551至 660位的處基酸序列， VEGFR第七 Ig样结构域具有例如 SEQ ID NO: 2第 661至 747位或 SEQ ID NO: 3第 667至 753位的氨基酸序列。优选地，所述 VEGFR可以是 VEGFR1或 VEGFR2₀

[77] 本文使用的术语 "FGFR第一 Ig样结构域" 或 "FGFR1第一 Ig样结构域" 表示 FGFR或 FGFR1蛋白中自 N端起第一个 Ig样结构域，其具有例如 SEQ ID NO: 1第 40至 118位的氨基酸序列。类似地，术语" FGFR 第二 Ig样结构域" 或 "第二 Ig样结构域" 表示 FGFR蛋白中自 N端起第二个 Ig样结构域，其具有例如 SEQ ID NO: 1第 163至 247位的氨基酸序列；术语 "FGFR第三 Ig样结构域"或 "第三 Ig样结构域"表示 FGFR 蛋白中自 N端起第一个 Ig样结构域，其具有例如 SEQ ID NO: 1第 270 至 359位的處基酸序列。优选地，所述 FGFR是 FGFRl, FGFR第一 Ig 样结构域是 FGFR1第一 Ig样结构域， FGFR第二 Ig样结构域是 FGFR1 第二 Ig样结构域， FGFR第三 Ig样结构域是 FGFR1第三 Ig样结构域。

[78] 本文使用的术语 "FGFR Ig样结构域中间功能性序列区" 或 "中间功能性序列区"表示 FGFR蛋白中第一 Ig样结构域和第二 Ig样结构域之间的序列，优选地， IFS序列具有对应于 SEQ ID NO: 1第 118至 162位的處基酸序列。本发明人出乎意料地发现，所述中间功能性序列区对于 Ig样结构域的功能具有显著的影响。所述 FGFR蛋白优选 FGFRl ( SEQ ID NO: 1), 特别是人 FGFR1蛋白。人 FGFR1蛋白的氨基 ^^列参见 SEQ ID NO: 1, 其 cDNA序列参见 SEQ ID NO: 4。

[79] 下面给出 hFGFRl的部分序列，阴影部分依次表示各个 Ig样结构域，可参见 http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/protein/AAH15035.l

SSEEKETDNTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHA¥PAA TVKF CPSS GTPNPTLRWLKNGKEF PDHRIGGY VRYATWSHMDSWPSDKG

TDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSA LTVLEALE ER

[81] FGFR1的氨基酸序列参见 SEQ ID NO: 1，其编码核苷酸序列参见 SEQIDNO:4。

[82] 下面给出 hVEGFRl的部分序列，阴影部分依次表示各个 Ig样结构域，各结构域之间为天然连接序列，可参见

[83] http://www.uniprot.org/uniprot/P17948：

G ^SYRLSM VKAFPSPEVVWLKDGLPATEKSARYLTRGYSLIIKD 藤 KVGTVG画 S讓， DVPNGmWLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFL

DEGVYHCKATNQKGSVESSAYtTVQGTSDKSNLE

[85] VEGFR1的氨基酸序列参见 SEQIDNO:2，其编码核苷酸序列参见 SEQ ID NO: 5。

[86] 下面给出 hVEGFR2的部分序列，阴影部分依次表示各个 Ig样结构域，各结构域之间为天然连接序列，可参见

[87] http://www.uniprot.org/uniprot/P35968

QEKTNLE

[89] ¥£0 112的氨基酸序列参见8£0101\0:3，其编码核苷酸序列参见 SEQ ID NO: 6。 [90] 本文使用的术语 "血管新生抑制单元"是指具有血管新生抑制功能的多肽区段、部分、基序、结构域等。血管新生抑制单元可以指本发明融合蛋白中的任何一段氨基酸序列，只要其具有血管新生抑制能力。例如，本发明的血管新生抑制单元可包括衍生自 VEGFR胞外区的部分、衍生自 FGFR胞外区的部分等。

[91] 本文所用的术语 "筒并变体"表示所述筒并变体包含氨基酸密码子第三位的筒并变化使得所述筒并变体编码相同氨基酸，例如在三联体密码的摆动位置（ wobble position ) 包含一个或多个改变的变体，也称为同义变体。

[92] 本文所用的术语 "等位基因变体"表示出现在染色体特定位置的两个或多个基因。

[93] 本文所使用的术语"对象，，是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物（如狗、猫等），家畜（如牛、羊、猪、马等）或实验动物（如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等）。

[94] 本文使用的术语"一致性"、 "百分比一致性"、 "同源性"或"同一性" 指两个氨基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可以通过比对两个序列来确定百分比一致性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基（即氨基酸或核苷酸）的数量。可使用本领域的标准算法（例如 Smith 和 Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482; Needleman和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson和 Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci . , USA, 85:2444 )或者通过这些算法的计算机化版本 ( Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI )进行序列比对和比较，所述计算机化版开可用为 BLAST和 FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院（ Bethesda MD )可用的 ENTREZ可用于序列比较。当^ J¾ BLAST和缺口 BLAST 程序时，可使用各个程序（例如 BLASTN, 在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用）的缺省参数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为 1的 GCG来确定两个序列的百分比同一性，使 ^个酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单處基酸不匹配。或者，可俄 J¾ ALIGN程序（2.0版），其是 GCG ( Accelrys, San Diego, CA )序列比对软件包的一部分。

[95] 本文使用的术语 "杂交 "指两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定双链多核苷酸的过程。术语"杂交"还可以指三链杂交。所产生的（通常是) 双链的多核苷酸为"杂交体 "或"双链体"。 "杂交条件"一般包括低于约 1M、更通常低于约 500 mM和低于约 200 mM的盐浓度。杂交温度可以低至 5°C，但通常高于约 22°C，更通常高于约 30°C，优选高于约 37°C。杂交通常在严格条件 (即探针会与其靶序列杂交的条件 )下进行。严格杂交条件取决于序列，并在不同的情况下存在差异。较长的片段可能需要较高的杂交温度来进行特异性杂交。由于其他因素（包括互 4 的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和 ½错配程度）可能影响杂交的严格度，因此^ Ht 的组合比任何一个单独参数的绝对值更为重要。一般而言，将严格选择成比确定的离子强度和 pH下该特定序列的 Tm低约 5'C。示例性严格包括 pH7.0至 8.3下至少 0.01 M至不高于 1M的 Na离子浓度（或其他盐）和至少 25°C的温度。对于严格条件，参阅如 Sambrook^ Fritsche 和 Maniatis. "Molecular Cloning A laboratory Manual" 第二版 Cold Spring Harbor Press (1989)以及 Anderson "Nucleic Acid Hybridization" 第一版， BIOS Scientific Publishers Limited (1999)，它们对于所有上述目的均通过参考并入本文。

[96] 本文使用的术语 "接头"、 "肽接头"、 "连接序列"或 "接头序列"表示将本发明融合蛋白所包含的^ "结构域和 /或区域相连接的短

列，其一般为 0-20个氨基酸长，优选 2- 10个氨基酸。

[97] 本文使用的术语融 ^^白或部分或结构域 "与 SEQ ID NO: N对应的列" 表示，所述融 ^^白或部分或结构域具有上如 SEQ ID NO: N所示的處基酸序列，优选地其中含有不超过 1、 2、 3、 4、 5、 10 或 20个氨基酸替换、添加或缺失，又优选地所述融合蛋白或部分或结构域具有与 SEQ ID NO: N所示處基酸序列至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%的同一性，更优选地，所述融合蛋白或部分或结构域具有 SEQ ID NO: N所示列。

[98] 本文使用的术语" VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白，，表示包含衍生自 VEGFR胞外区的部分、衍生自 FGFR胞外区的部分和免疫球蛋白 Fc区的融合蛋白。在一些实施方案中，衍生自 VEGFR胞外区和衍生自 FGFR 胞外区的部分可： ( 1 )具有 SEQ ID NO: 9的 1-443位、 SEQ ID NO: 10 的 1-364位、 SEQ ID NO: 11的 1-379位、 SEQ ID NO: 12的 1-531位、 SEQ ID NO: 13的 1-611位、 SEQ ID NO: 14的 1-531位、 SEQ ID NO: 15 的 1-312位、 SEQ ID NO: 16的 1-611位、 SEQ ID NO: 17的 1-207位、 SEQ ID NO: 18的 1-665位、 SEQ ID NO: 19的 1-610位、 SEQ ID NO: 20 的 1-611位、 SEQ ID NO: 21的 1-580位、 SEQ ID NO: 22的 1-540位、 SEQ ID NO: 23的 1-542位和 SEQ ID NO: 24的 1-435位中任一项所示氨基^ ^列，或由 SEQ ID NO: 26的 1-1326位、 SEQ ID NO: 27的 1-1092 位、 SEQ ID NO: 28的 1-1137位、 SEQ ID NO: 29的 1-1593位、 SEQ ID NO: 30的 1-1833位、 SEQ ID NO: 31的 1-1593位、 SEQ ID NO: 32的 1-936 位、 SEQ ID NO: 33的 1-1833位、 SEQ ID NO: 34的 1-621位、 SEQ ID NO: 35的 1-1995位、 SEQ ID NO: 36的 1-1830位、 SEQ ID NO: 37的 1-1833 位、 SEQ ID NO: 38的 1-1740位、 SEQ ID NO: 39的 1-1620位、 SEQ ID NO: 40的 1-1626位和 SEQ ID NO: 41的 1-1305位中任一项所示核苷酸序列编码； ( 2 )包含与 SEQ ID NO: 9的 1-443位、 SEQ ID NO: 10的 1-364 位、 SEQ ID NO: 11的 1-379位、 SEQ ID NO: 12的 1-531位、 SEQ ID NO: 13的 1-611位、 SEQ ID NO: 14的 1-531位、 SEQ ID NO: 15的 1-312位、 SEQ ID NO: 16的 1-611位、 SEQ ID NO: 17的 1-207位、 SEQ ID NO: 18 的 1-665位、 SEQ ID NO: 19的 1-610位、 SEQ ID NO: 20的 1-611位、 SEQ ID NO: 21的 1-580位、 SEQ ID NO: 22的 1-540位、 SEQ ID NO: 23 的 1-542位和 SEQ ID NO: 24的 1-435位中任一项所示氨基酸序列有至少 70%同一性的氨基酸序列或由其组成，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性；或者（3 )包含由与 SEQ ID NO: 26的 1-1326位、 SEQ ID NO: 27的 1-1092位、 SEQ ID NO: 28的 1-1137位、 SEQ ID NO: 29的 1-1593位、 SEQ ID NO: 30的 1-1833位、 SEQ ID NO: 31的 1-1593位、 SEQ ID NO: 32的 1-936位、 SEQ ID NO: 33的 1-1833 位、 SEQ ID NO: 34的 1-621位、 SEQ ID NO: 35的 1-1995位、 SEQ ID NO: 36的 1-1830位、 SEQ ID NO: 37的 1-1833位、 SEQ ID NO: 38的 1-1740 位、 SEQ ID NO: 39的 1-1620位、 SEQ ID NO: 40的 1-1626位和 SEQ ID NO: 41的 1-1305位中任一项所示核苷酸序列有至少 70%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性。

[99] 在本发明的一些优选实施方案中， VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可：（ 1 ) 具有 SEQ ID NO: 9-24任一项所示處基酸序列，或由 SEQ ID NO: 26-41 任一项所示核苷酸序列编码； ( 2 )包含与 SEQ ID NO: 9-24任一项所示氨基酸序列有至少 70%同一性的氨基酸序列或由其组成，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性；或者（3 )包含由与 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷酸序列有至少 70%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列或由其组成，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性。

[100] 在一些优选实施方案中，所述 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可由核酸编码，所述核酸包含其互补物在严格杂交条件下与 SEQ ID NO: 26-41任一项所示的核苷酸序列杂交的序列，或者包含 SEQ ID NO: 26-41任一项所示的核苷酸序列的筒并变体。在一些优选实施方案中，所述 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白中衍生自免疫球蛋白 Fc区的部分可由核酸编码，所述核酸包含其互补物在严格杂交条件下与 SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列杂交的序列，或者包含 SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列的筒并变体。

[101] 在又一些优选实施方案中，所述 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白包括 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白变体，其包括在对应于 SEQ ID NO: 26-41任一项所示的處基酸序列中含有不超过 2、 3、 4、 5、 10、 20、 30或 50个氨基酸替换、添加或缺失的变体，所述变体优选保持抑制血管新生的能力。在一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于衍生自 VEGFR胞外区的部分。在另一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于衍生自 FGFR 胞外区的部分。在另一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于衍生自免疫球蛋白 Fc区的部分。在又一个实施方案中，所述替换、添加或缺失位于接头或连接部分。

[102] VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白还可包含除了衍生自 FGFR胞外区的部分中以及衍生自免疫球蛋白 Fc区的部分中天然存在的之外的翻译后修饰。这样的修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。结果，经修饰的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可包含非氨基酸组分，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖以及磷酸。这样的非氨基酸组分对 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白功能的作用可如本文针对其它 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白变体所述的那样进行测试。当 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白在细胞中产生时，翻译后加工对于正确折叠和 /或蛋白质功能可能也是重要的。不同的细胞（例如 CHO、 HeLa、 MDCK：、 293、 WI38、 NIH-3T3或 HEK293 )拥有针对这些翻译后活性的特定细胞机器和特有机制，并且可以选择不同的细胞以确保 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白的正确修饰和加工。

[103] 本文所述的融合蛋白可通过任何本领域已知的方法产生。例如化学合成或从核酸表达来产生。可根据本领域已知的完善的标准液体或优选固相肽合成方法容易地制备用于本发明的肽（参见，例如 J. M. Stewart和 J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984) , in M. Bodanzsky和 A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984) )。可中的多肽序列内的半胱氨酸间形成」个或 ^多个分子内交联（参见例如美国专利 No. 5478925 )。另外，本文所述蛋白质可以通过在所述蛋白质的 C端或 N端添加半胱氨酸或生物素进行常规修饰。

[104] 本文使用的"治疗有效量"或"有效量，，是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方（例如对剂量的决定等）最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

[105] 在一个方面，本发明提供了抑制血管新生的融合蛋白，其包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的血管新生抑制单元。优选地，所述至少两种血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体，所述受体例如可以选自： DDR1、 EphAl、 EphA2、 EphA8、 EphBl、 EphB4、 EGFR、 HER-2、 ErbB3、 FGFR1、 FGFR2、 FGFR4、 MET、 RON, CSF1R、 KIT、 PDGFR-A、 PDGFR-B、 TEK：、 Tie-1、 HGF、 VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3, Notch 受体、 LK8、血管抑制素（ angiostatin )、血管内皮抑制素（ endostatin )、纤溶酶原 ( plasminogen ), XVIII及其等位基因变体。在一个具体实施方案中，所述血管新生抑制剂是抑制血管新生的受体 VEGFR和 FGFR。

[106] 特别地，本发明 ¾建了一系列 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，其可以高亲和力结合 VEGF和 FGF，并有效地抑制 VEGF和 FGF诱导的细胞分裂。

[107] 在一些实施方案中，本发明 AJ£出人意料地发现，从 N端到 C端依次包含衍生自 VEGFR胞外区的部分和衍生自 FGFR胞外区的部分的融合蛋白具有特别好的结合 VEGF和 FGF性质，优选地所述衍生自 VEGFR 胞外区的部分包含 VEGFR1第一 Ig样结构域、 VEGFR1第二 Ig样结构域和 VEGFR2第三 Ig样结构域，更优选地所述衍生自 FGFR胞外区的部分包含源自 FGFR1 Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR1第二 Ig样结构域、 FGFR1第三 Ig样结构域。更优选地，所述源自 FGFRl Ig 样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒，更优选地，其具有与 SEQ ID ΝΟ:1第 134至 162位、 145至 162位或 151至 162位对应的處基列。

[108] 在一些实施方案中，本发明包括下列项在制备用于治疗血管新生所介导或与其相关之疾病的组合物或药物中的用途，所述项即：（i ) VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白；或者（ii )编码此融合蛋白的多核苷酸。例如，在一个实施方案中，本发明包括下列项在制备用作血管新生抑制剂的药物中的用途，所述项即：（i ) VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白；或者（ii ) 编码此融合蛋白的多核苷酸。

[109] 在一些实施方案中，本发明 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可通 i½哺乳动物细胞系中表达 SEQ ID NO: 26-41任一项的核酸来产生。特别地，所述哺乳动物细胞系是 CHO细胞系。

[110] 另外，本发明还提供了如下所述的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，其中衍生自 VEGFR胞外区的部分、衍生自 FGFR胞外区的部分和衍生自免疫球蛋白 Fc区的部分通过或不通过接头相连。

[111] 在另一些实施方案中，本发明包括编码 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白的分离的核酸分子，本发明还包括这些分子在制备药物中的用途。所述核酸可以是重组、合成或通过本领域任何可用的方法产生的，所述方法包括使用标准技术的克隆。

[112] 在又一些实施方案中，本发明包括含有本发明的分离核酸分子的载体。所述载体可以是表达载体，所述核酸有效连接到能够提供所述核酸在宿主细胞中表达的控制序列。可使用多种载体。例如，合适载体可包括病毒（例如痘病毒、腺病毒、杆状病毒等）；酵母载体、噬菌体、染色体、人工染色体、质粒、粘粒。

[113] 在一些实施方案中，本发明还包括转染了这些载体的细胞，使得表达 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白。适用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。它们包括细菌，例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可使用的哺乳动物细胞系包括但不限于中国仓鼠卵巢（CHO ) 细胞、幼仓鼠肾细胞、 NS0小鼠骨髓瘤细胞、猴和人细胞系以及其衍生细胞系，等等。

[114] 在另一个方面中，本发明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的对用本发明的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。优选地，所述方法在哺乳动物中进行。

[115] 在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防肿瘤的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白，优选地其中所述肿瘤是实体瘤

[116] 在又一个方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防眼中血管新生相关疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白，优选地所述眼中血管新生相关疾病是年龄相关黄斑变性和糖尿病性视网膜病变。

[117】本发明还涉及 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白在制备用于抑制血管新生的药物中的用途。另外，本发明还涉及 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白在制备用于治疗或预防血管新生相关疾病的药物中的用途，优选地所述血管新生相关疾病是肿瘤或者眼科血管新生相关疾病。

[118] 本发明中所述血管新生相关疾病包括但不限于血管新生依赖性癌症，其包括例如实体瘤、血源性肿瘤（例如白血病）和肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤 ( acoustic neuroma )、神经维瘤 ( neurofibroma )、沙眼 ( trachoma )和化脓性肉芽胂 ( pyogenic granuloma ); 类风湿性关节炎；银屑病；红变（ rubeosis ); 斯勒 -韦伯综合征（ Osier-Webber Syndrome ); ' 9 Lik管新生 ( myocardial angiogenesis ); 动脉粥样斑块新血管形成 ( plaque neovascularization ); 毛细血管扩张 ( telangiectasia ); 血友病性关节 ( hemophiliac joint )和血管维瘤 ( angiofibroma )„

[119] 在所述方法的一些实施方案中，可一起（同时）或在不同时间（依次地）施用一种或多种 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。另外，所述融 ^^白可与另一类治疗癌症或抑制血管新生的药物一起施用。

[120] 在一些实施方案中，本公开的主题方法可单独使用。或者，可将所述主题方法与其它用于治疗或预防增殖性疾病（例如肿瘤）的常规抗癌治疗法组合使用。例如，这些方法可用于预防癌症、预防癌症复发和手术后转移，以及作为其它癌症治疗的辅助手段。本公开表明，可通过使用目标多肽治疗剂来增强常规癌症治疗（例如，化疗、放疗、光疗、免疫疗法和手术）的有效性。

[121] 在眼中，血管新生与例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病 ( retinopathy of prematurity ),年龄相关黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性^"光眼和晶状体后纤维增生症（retrolental fibroplasia )有关。本文公开的 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白可在眼内施用或通过其它途径施用。与眼中血管新生有关的其它疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎 ( epidemic keratoconjunctivitis )、维生素 A 缺乏症 ( Vitamin A deficiency )、隐形眼镜 contact lens overwear )、特应性角膜炎 ( atopic keratitis ), 上边缘角膜炎（ superior limbic keratitis )、干燥性翼状箭肉角膜炎 ( pterygium keratitis sicca )、舍^ ^病 ( Sjogren )、政瑰痤疾 ( acne rosacea )、小水病、梅毒 ( syphilis )、分支杆菌感染 ( Mycobacteria infection )、脂质变性 ( lipid degeneration )、化学烧伤 ( chemical bum )、细菌性溃疡 ( bacterial ulcer )、真菌性溃疡 ( fungal ulcer )、单纯渗感染 ( Herpes simplex infection )、带状渗感染 ( Herpes zoster infection )、原生动物感染 ( protozoan infection )、卡波西肉瘤 ( Kaposi sarcoma )、莫伦清疡 ( Mooren ulcer )、 Terrie 角膜边缘性变性 ( Terrien's marginal degeneration 边缘性角质分离 ( mariginal keratolysis )、类风湿性关节炎、系统性狼 systemic lupus )、多动脉炎 ( polyarteritis )、创伤 ( trauma )、韦格纳结节病（Wegeners sarcoidosis ), 巩膜炎（ Scleritis )、史 -约病 ( Steven's Johnson disease )、类天疾放射状角膜切开术 ( periphigoid radial keratotomy )和角膜移植排斥 ( corneal graph rejection )、嫌状细胞贫血 ( sickle cell anemia )、结节病( sarcoid )、彈性假黄瘤 ( pseudoxanthoma elasticum )、佩吉特病 ( Pagets disease )、静脉阻塞 ( vein occlusion )、动脉阻塞 ( artery occlusion )、颈动脉阻塞性疾病 ( carotid obstructive disease )、慢性葡萄膜炎 /玻璃体炎（ chronic uveitis/vitritis )、分支杆菌感染 ( mycobacterial infections )、莱姆病 ( Lyme's disease )、系统性红斑狼 ( systemic lupus erythematosis 早产儿视网膜病 ( retinopathy of prematurity 伊尔斯病 ( Eales disease 白塞病 ( Bechets disease 导致视网膜炎（retinitis )或脉络膜炎（choroiditis )的感染、假定的 B 且织胞浆菌病 ( presumed ocular histoplasmosis )、贝斯特病 ( Bests disease )、近视 ( myopia )、视凹 ( optic pit )、斯 ^ ^特病 ( Stargarts disease )、睃状体平坦部炎（ pars planitis ) , '1曼性视网膜脱落（ chronic retinal detachment ) > 高粘滞综合征 ( hyperviscosity syndromes 弓形体病 ( toxoplasmosis 创伤 ( trauma ) 和激光手术后并发症 ( post-laser complication )。其它疾病包括但不限于与红变（角新生血管 ( neovasculariation of the angle ) ) 有关的疾病以及由维血管 ( fibrovascular )或纤维组织（fibrous tissue )异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃 ¾网膜病（ vitreoretinopathy )。

施用

22] 本发明中的融合蛋白可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用，其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体。融合蛋白可以通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计量将取决于多个因素，包括该融合蛋白精确的性质。

[123] 一些合适的使用方式包括（但不限于）口服、直肠、鼻部、局部（包括口腔和舌下）、皮下、阴道或胃肠外的（包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内和硬脑膜外）施用。

[124] 对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形式，其不含热源并具有合适的 pH值、等张性和稳定性。

[125] 本领域中相关技术人员可使用适当的溶剂或制剂配制融合蛋白，例如: 等张赋形剂如氯化钠注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根据要求，可以加入防腐剂、稳定剂、緩冲剂、抗氧化剂和 /或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶嚢、粉剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

[126] 以上所提到的技术和方案的例子以及其它一些根据本发明所使用的技术和方案可以在 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. (ed) , 1980.中找到。

融合蛋白质的克隆和表达质粒构建

[127] VEGF受体和 FGF受体片段通过 PCR 目应受体的 cDNA模板扩增获得， IgGl Fc片段通过 PCR方法源 IgGl的 cDNA扩增获得。在设计 PCR引物时，在不同的片段间引入连接序列，使不同片段最后可以通过重叠 PCR相连接，形成不同融合蛋白的阅读框，同时在 cDNA的两端分别加上 BspE I、 Pst I内切酶的位点。不同融合蛋白的 cDNA经过 BspE I、 Pst I酶切后可以克隆到表达质粒。克隆后的质粒经过内切酶消化、电泳鉴定，最后经过 DNA测序确定。

[128] 在本发明中构建 2#、 4#、 7#、 9#、 10#、 11#、 12#、 14#、 15#、 16#、 20#、 21#、 24#、 25#、 27#、 28#重组表 ^ ^粒：

[129] 其中 2#、 4#、 7#融合蛋白包含 VEGFR1部分胞外结构域、 FGFR1 部分胞外结构域和 IgGl Fc; 9#、 10#、 16#、 20#、 21#、 24#、 25#、 28# 由 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分包含胞外结构域、 FGFR1 部分胞外结构域和 IgGl Fc, 以上 11个重组表达质粒使用相同的 FGFR1 胞外结构域下游引物（ 2#-FGFRl 下游引物： GTTTTGTCCTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC )、 IgGl Fc的上游引物 ( CTGTACCTGGAGGACAAAACTCACACATGC )和 IgGl Fc下游引物（ GATATCTGCAGTCATTTACCCGGAGACAGG )₀

[130] 其余使用的引物如下：

[131] 2#融合蛋白：

[132] 2#- VEGFRl上游引物：

ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG

[133] 2# -VEGFRl下游引物：

CCTGTGATGCGGGTGCGATTTTTTTCATCAGGGTAACTCC

[134] 2# -FGFRl上游引物：

CTGATGAAAAAAATCGCACCCGCATCACAG

[135] 4#融合蛋白：

[136] 4# VEGFRl上游引物同 2#: 2#- VEGFRl上游引物

[137] 4#- VEGFRl下游引物：

TTTTTCATCAGGGTAACTCCAGGTCATTTG

[138] 4# FGFRl上游引物：

GGAGTTACCCTGATGAAAAACCAGAAAAGATGGAAAAGAAAT

[139] 4# FGFR1下游引物同 2#: 2#-FGFRl下游引物

[140] 7#融合蛋白：

[141] 7# VEGFRl上游引物同 2#: 2#- VEGFRl上游引物

[142] 7# VEGFRl下游引物：

ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCACCACCTTTTTCAT CAGGGTAACTCCAG

[143] 7#FGFR1上游引物：

[144] AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCCCCAGAAAAG ATGGAAAAGAAATTG

[145] 7# FGFR1下游引物同 2#: 2#-FGFRl下游引物

[146] 9#融合蛋白： 9#融合蛋白包含 VEGFR1D1、 VEGFR1D2、 VEGFR2D3, FGFR、 Fc五段。

[147] 以 pBLAST45-hFLTls7cDNA扩增 VEGFRIDI, 引物：

[148] 9#- VEGFRIDI上游引物：

TAGTTCCGGAAGCAAATTAAAAGATCCTGAACTGAG

[149] 9#- VEGFRIDI下游引物：

ATCTCTACGAAAGGTCTACCTGTATCACTAATAAATATATAG

[150] 以 pBLAST45-hFLTls7cDNA扩增 VEGFR1D2, 引物：

[151] 9#-VEGFRlD2R2D3上游引物： GGTAGACCTTTCGTAGAGATGT

[152] 9#-VEGFRlD2下游引物：

CATGAGACGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGTTTG

[153] 以 pBLAST45-hFLKls7为模板扩增 VEGFR2D3, 引物：

[154] 9#-VEGFR2D3上游引物：

CAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG

[155] 9#-VEGFRlD2R2D3下游引物： AGGTTTTTCATGGACCCTGAC

[156] 9#FGFR1上游引物：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTG

C

[157] 10#融合蛋白：

[158] 10#VEGFR1段结构列 PCR引物同 9#

[159] 10#-FGFR1上游引物：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTAAAAATCGCACCCGCATCACAGG

[160] 16#融合蛋白：

[161] 16#VEGFR1D1上游引物同 9#- VEGFRIDI上游引物

[162] 16# VR1D2R2D3R下游引物同 9#- VR1D2R2D3R游引物

[163] 16#FGFR1上游引物：

GTCAGGGTCCATGAAAAACCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTG

[164] 20#融合蛋白：

[165] 20#- VEGFRIDI上游引物同 9#- VEGFRIDI上游引物 [166] 20#-VRlD2R2D3R下游引物同 9#- VR1D2R2D3R游引物

[167] 20#-FGFRl上游引物：

CCTGTGATGCGGGTGCGATTAGGTTTTTCATGGACCCTGAC

[168] 21#融合蛋白：

[169] 21#以 10#为模板，使用如下引物将 10#FGFRlDlh中的一个 ½，使 Cys变成 Ser:

[170] 21#-mutF:

CTCCGGCCTCTATGCTTCCGTAACCAGCAGCCCCTC

[171] 21#-mutR:

GAGGGGCTGCTGGTTACGGAAGCATAGAGGCCGGAG

[172] 24#融合蛋白：

[173] 24#VEGFR1D1上游引物同 9#-VEGFRlDl上游引物

[174] 24# VR1D2R2D3R下游引物同 9#- VR1D2R2D3R游引物

[175] 24#FGFR1上游引物：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTTCGGGCAGTGACACCACCTAC

[176] 25#融合蛋白：

[177] 25#VEGFR1D1上游引物同 9#-VEGFRlDl上游引物

[178] 25# VR1D2R2D3R下游引物同 9#- VR1D2R2D3R游引物

[179] 25#FGFR1上游引物：

TCAGGGTCCATGAAAAACCTAACCCCGTAGCTCCATATTGG

[180] 28#融合蛋白：

[181] 28#以 25#为模板上游引物使用 2#-VEGFRl上游引物和 IgGl Fc下游引物进行 PCR。

[182] 11#、 14#、 27#包含 FGFR1部分胞外结构域、 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分胞外结构域和 IgGl Fc。以上 3个重组表达质粒使用相同的 IgGl Fc的上游引物和 IgGl Fc下游引物。

[183] 其余使用的引物如下：

[184] 11#融合蛋白：

[185] 11#-FGFR1上游引物：，， CTAGCTCCGGACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGC

[186] 11#-FGFR1下游引物：

TCAGGATCTTTTAATTTTGACTCCAGGTACAGGGGCGAGGTC

[187] 11#-VEGFR1D1上游引物： TCAAAATTAAAAGATCCTGAACTG

[188] 11#-VEGFR1D1下游引物：同 9#-VEGFRlDl下游引物：

[189] 11#VEGFR1D2R2D3上游引物同 9#-VRlD2R2D3上游引物

[190] 11#VEGFR1D2D3下游引物：

TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGTTTTTCATGGACCCTGAC

[191] 14#融合蛋白：

[192] 14#-FGFR1上游引物：

TAGTTCCGGAAAAAATCGCACCCGCATCACAG

[193] 14#FGFR1下游引物同 11#-VEGFR1D1下游引物

[194] 14#VEGFR1D1上游引物同 11#-VEGFR1D1上游引物

[195] 14#VEGFR1D1下游引物同 9#-VEGFRlDl下游引物

[196] 14#VEGFR1D2R2D3上游引物同 9#-VEGFRlD2R2D3上游引物

[197] 14#VEGFR1D2R2D3下游引物同 11#-VEGFR1D2R2D3下游引物

[198] 27#融合蛋白：

[199] 27#以 14#为模板上游引物使用 27#-FGFRl 上游引物 ( TAGTTCCGGAAAACCTAACCCCGTAGCTCCAT )和 IgGl Fc下游引物进行 PCR:

[200] 12#融合蛋白包含 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分胞外结构域和 IgGl Fc。使用引物如下：

[201] 12#上游引物同 9#-FGFRl上游引物

[202] 12#VEGFR2下游引物同 11#VEGFR1D2D3下游引物

[203] Fc上游引物 1: FcForl: GACAAAACTCACACATGCCCACC

[204] Fc下游引物: 同上述 IgGl Fc下游引物。

[205] 15#融合蛋白包含 VEGFR1部分胞外结构域和 IgGl Fc。使用引物如下： [206] 15#上游引物同 2#-VEGFRl上游引物：

ATAGTTCCGGAGGTAGACCATTCGTAGAGATG

[207] 15#VEGFR2下游引物同 11#VEGFR1D2D3下游引物

[208] Fc上游引物 1: FcForl: GACAAAACTCACACATGCCCACC

Fc下游引物：同上述 IgGl Fc下游引物。

融合蛋白质的表达与纯化

[209] 本发明的融合蛋白可通领域常用的技术表达和纯化。用 Qiagen 的质粒提纯试剂盒（MAX )提纯相应融合蛋白质粒的 DNA，用紫外分光光度法确定质粒 DNA的浓度，用 FUGENE 6脂质体（ Roche )将质粒转染 CHO细胞。转染的具体方法按照产品说明。根据蛋白表达量的要求不同，究釆用两种表达方法进行蛋白表达：第一种是瞬时表达法，通常在转染 48-72小时后含有融 ^^白的培养、^ J清，用人 IgG ELISA确定融合蛋白的相对含量，从而快速有效得到融^ ^白；第二种方法是建立稳定细胞系，釆用重组蛋白药物表达生产常用的 DHFR缺陷型 CHO细胞表达系统，基本过程包括细胞的转染、稳转细胞选择、克隆筛选、加压扩增、培养基和工艺优化等，最终实现 CHO工程细胞株在无血清培养基中大悬浮培养。收集培养产物，用 Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白。用十二烷^ <酸钠-聚丙烯^ ^^法 ( SDS-PAGE )分析纯化的蛋白质，然后合并含有所需表达产物的洗脱物，用孔径 0.22 μιη滤膜过滤后，用 Lowry法等多种方法进行蛋白定量。本研究的 CHO细胞培养体积将达到 10升生物反应器规，纯化获得的融合蛋白能够满足动物试验的蛋白需要，也为将来进一步工艺放大打下基础。

在蛋白水平融^^白对 VEGF和 FGF的中和作用

[210] 在获得 CHO表达的融 ^^白质后，究将在蛋白水平上对融^ ^ 白与 VEGF和 FGF的结合能力进估。本研究使用结合实验和亲和力实验进行验证，结合实验的步驟包括：先在 96孔 ELISA板上分别包被 VEGF和 FGF-2后，用 BSA封闭包被孔，加入相同浓度的各种融合蛋白，洗涤后再加入抗人 IgG Fc-HRP二抗，显色、终止后于酶标板上读取 450nm 波长的吸光度，才艮据信号的强弱，筛选与 VEGF和 FGF-2具有结合能力的融合蛋白。亲和力实验是为了确定融合蛋白在溶液体系中与 VEGF或 FGF-2的亲和力，首先在 96孔 ELISA板上分别包被 VEGF或 FGF-2捕获抗体，用 BSA封闭包被孔，然后加入事先配制好且孵育过的融合蛋白与 VEGF或 FGF-2的混合液和梯度稀释的标准品，孵育后再加入 HRP 标记的检测抗体 (利用能特异性地检测游离 VEGF或 FGF-2抗体 2 )，显色、终止后于酶标板上读取 450nm波长的吸光度，从而检测出融合蛋白与 VEGF或 FGF-2的混合液中游离的 VEGF或 FGF-2的相对浓度确定。通过以上实验，筛选得到对 VEGF和 FGF-2具有双重阻断作用的融合蛋白。

在细胞水平融^ "白对 VEGF和 FGF的中和作用

[211] 在蛋白水平确定融^ ^白对 VEGF和 FGF-2的结合能力后，究将从细胞水平进一步验证其对血管新生的抑制作用。本研究用人脐静脉白抑制血管内皮细胞分裂、迁移的能力。 HUVEC细胞分裂试验能检验融合蛋白抑制 HUVEC细胞分裂的能力，实验时，首先在中每孔接种 3000个 HUVEC细胞于 37°C， 5% C02培养箱中培养，分别加入 VEGF 或 FGF-2, 以及不同浓度的融合蛋白和 VEGF或 FGF-2的混合液，继续培养 3 ~ 4天后，加入 10% CCK-8继续培养 2小时后于酶标板上读取 450nm波长的吸光度。可根据吸光度的差异评估其抑制 VEGF或 FGF-2 诱导的血管内皮细胞分裂的能力，并可得出融合蛋白对 VEGF或 FGF-2 抑制的半数有效浓度。 HUVEC 细胞迁移试验能检验融合蛋白抑制 HUVEC细胞迁移的能力，实验时，首先在上室接种 50000个 HUVEC细胞和不同浓度的融^ "白，在下室加入 600 μΐ,含有 VEGF或 FGF-2的培养液，于 37°C， 5% C02培养箱中培养 20 ~ 24小时后，擦除上室膜正面细胞，固定、染色膜背面细胞， PBS洗涤后于倒置显微镜观察并计数，通过计数位于膜背面的 HUVEC细胞数即可知 HUVEC细胞受 VEGF或 FGF-2刺激而迁移的情况，而在培养、^ 入不同浓度的融合蛋白即可检验融合蛋白抑制血管内皮细胞迁移的能力。通过以上实验，可 «£ ^究构建的新型融合蛋白抑制 VEGF和 FGF-2诱导的血管内皮细胞分裂和迁移的能力，同时为进一步的动物试验打下基础。

肿瘤模型验证融合蛋白抑制肿瘤生长的能力

[212] 当蛋白水平和细胞水平的试 ¾^明^究的新型融合蛋白对 VEGF 和 FGF-2信号具有阻断作用后，本研究将在动物肿瘤模型上检验其抗肿瘤能力。本研究将釆用血管新生和肿瘤药物研究中常用的模型验证融合蛋白抗血管新生和抗肿瘤效果，例如 LLC小鼠肺癌、 U87胶质细胞瘤、 B16 黑色素瘤等。在动物试验中，除了當规的对照组外，还包括同类药物对照，如 VEGF-Trap、 FP-1039, 以期得到抗肿瘤能力的比较性数据。实验时， 100 μ 适当数量的肿瘤细胞皮下注入 C57小鼠的背部后方一侧，每周两次用游标卡尺测量肿瘤的体积，肿瘤长到约 200立方亳米时，皮下注射不同浓度的融合蛋白， 2 ~ 3 周后处死小鼠，用游标卡尺测量肿瘤的体积，根据肿瘤的大小验证融合蛋白的抗肿瘤效果。此外，使用免疫组化等方法分析各种肿瘤组织，探讨血管新生的调控机理。

实施例

实施例 1: 双靶标融合蛋白重组表达质粒的构建

[213] 使用商业化的 cDNA ( PCR Ready First Strand cDNA, 来源于成年人结肠癌组织， BioChain公司）作为 FGFR1片段的模板。使用商业化质粒 pBLAST45-hFLTls7cDNA( InvivoGen公司）作为 VEGFR1段的模板，使用商业化质粒 pBLAST45-hFLKls7 ( InvivoGen公司）作为 VEGFR2 段的模板。個 J6L RNA抽提试剂盒（ QIAGEN )从健康 J&L液中抽提总 RNA。按逆转录试剂盒（Promega公司）的使用说明，用 M-MLV逆转录 IK Promega公司）进行 RT-PCR,将 RNA逆转录为 cDNA作为 IgGl Fc 片段的模板。 RT-PCR根据逆转录试剂盒的使用说明进行，具体步驟为：将 Oligo dT、 dNTP、总 RNA以及 DEPC H₂0混匀，于 70 反应 10 分钟后置水上 5分钟，再加入 RNA酶抑制剂、 M-MLV逆转录酶和反应緩冲液， 42 反应 1小时，然后于 70 反应 15分钟，获得 cDNA可作为模板使用

[214] 以成年人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR扩增各个不同的 FGFR1 片段（引物见下表 1 )，以商业化质粒为模板扩增不同的 VEGFR1 和 VEGFR2片段（引物参见下表 1 )，以 cDNA为模板通过 PCR扩增 IgGl Fc片段（引物见下表 1和 2 )。在设计 PCR引物时，在 VEGFR1片段、 VEGFR2片段、 FGFR1片段和 IgGl Fc片段间引入 20个或以上的互补½序列作为连接序列，使各个片段可以通过重叠 PCR相连接，形成不同融合蛋白的阅读框，同时在 PCR产物两端分别加上 BspE I和 Pst I P艮制性内切酶的位点。

[215] ¾^，进行重叠 PCR，扩增得到^ ^ FGFRl-Fc融合蛋白片段。 PCR 的反应条件是： 98 预变性 5分钟， 98 变性 30秒，然后于退火 45 秒，并于 72 延伸 2分钟，共进行 30次循环，最后再延伸 10分钟。在设计 PCR引物时，在不同的片断间引入连接序列，使不同片断最后可以通过重叠 PCR相连接，重叠 PCR的反应分为两轮，第一轮含有需连接的片段而不含有引物，条件为： 98 预变性 5分钟， 98 变性 30秒，然后于退火 45秒，并于 72 延伸 5分钟，共进行 6次循环，最后再于 72 延伸 10分钟后加入两端引物进行第二轮 PCR，反应^ 为： 98 预变性 5分钟， 98 变性 30秒，然后于退火 45秒，并于 72 延伸 2 分钟，共进行 30次循环，最后再于 72 延伸 10分钟，从而拼接形成不同融合蛋白的阅读框，同时在 cDNA的两端分别加上 BspE I和 Pst I内切酶的位点。

[216] 扩增完成后，使用 QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN公司）纯化 PCR扩增的片段，不同融合蛋白的 cDNA和真核表 ^ ^粒 pSV2-dhfr ( ATCC )分别用 BspE I、 Pst I酶切，经 90V电压、 1%琼脂糖凝胶电泳，使用 QIAquick胶提取试剂盒（ QIAGEN公司）回收目的片使用连接 IK NEB公司）于 16 连接 1小时，将连接反应混合物转化大肠杆菌 ToplO 感受态细菌，转化条件为 42 反应 90秒后再置水上 3分钟，加入无菌无抗的 LB培养液于 37Γ、 250转 /分钟摇床中培养 1小时后涂布于含有氨苄霉素的 LB平板中，于 37 恒温培养箱中培养过夜，单菌落于含有氨苄霉素的 LB培养液于 37V、 250转 /分钟摇床中培养过夜后使用碱裂解法抽取质粒后使用 Ρ艮制性内切酶酶切后经 90V电压、 1%琼脂糖^电 ' 定，取酶切鉴定正确的重组质粒经 DNA测序确定。才艮据以上步驟，分别构建了 2#、 4#、 7#、 9#、 10#、 11#、 12#、 14#、 15#、 16#、 20#、 21#、 24#、 25#、 27#、 28#重组表 ^ ^粒。

[217] 其中 2#、 4#、 7#融合蛋白包含 VEGFR1部分胞外结构域、 FGFR1 部分胞外结构域和 IgGl Fc，以 pBLAST45-hFLTls7cDNA为模板通过 PCR扩增 VEGFR1部分胞外结构域，以人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR扩增 FGFR1部分胞外结构域，以人血 cDNA为模板扩增人 IgGl Fc 区。然后，通过重叠 PCR得到三个片段相连的 PCR产物，经过酶切、连接引 *达载体。所用引物见表 1。

[218] 9#、 10#、 16#、 20#、 21#、 24#、 25#、 28#包含 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分胞外结构域、 FGFR1部分胞外结构域和 IgGl Fc。首先，构建 9#构建体，以 pBLAST45-hFLTls7cDNA为模板通过 PCR扩增 VEGFR1D1片段和 VEGFR1D2片段，以 pBLAST45-hFLKls7为模板通过 PCR扩增 VEGFR2D3片段，以人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR 扩增 FGFR1部分胞外结构域，以 AJ6L cDNA为模板扩增人 IgGl Fc区。然后，通过重叠 PCR得到五个片段相连的 PCR产物，经过酶切、连接引达载体。然后，以 9#构建体为模板，通过 PCR扩增 VEGFR片段，以人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR扩增 FGFR1部分胞外结构域，以 cDNA为模板扩增人 IgGl Fc区。然后，通过重叠 PCR得到三个片段相连的 PCR产物，经过酶切、连接引达载体，获得 10#、 16#、 20#、 24#、 25#构建体。然后，以 10#为模板，通过 PCR使用表 1所示引物突变 10#FGFRlDlh 中的一个碱基，按照定点突变试剂盒 ( QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit, STRATAGEN公司）的操作说明，使 Cys变成 Ser，得到 21#构建体，具体构建过程为：在 PCR 管中加入去离子水、 10#质粒、 dNTP、表 1所示突变引物、反应緩冲液、 Pfu酶进行 PCR， PCR的反应^ ^是： 95 预变性 2分钟， 95 变性 50 秒，然后于退火 50秒，并于延伸 8分钟，共进行 18次循环，最后再延伸 10分钟， PCR结束后加入 ΙμΙ, Dpn I ( NEB公司）于反应 1小时，取反应产物转化大肠杆菌 ToplO感受态细菌，转化条件为 42 反应 90秒后再置水上 3分钟，加入无菌无抗的 LB培养液于 37Γ、 250转 /分钟摇床中培养 1小时后涂布于含有氨苄霉素的 LB平板中，于 37

确定。以 25#为模板，通过使用 2#-VEGFRl上游引物和 IgGl Fc下游引物进行 PCR，获得 28#构建体。所用引物见表 1。

[219] 11#、 14#、 27#包含 FGFR1部分胞外结构域、 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分胞外结构域和 IgGl Fc。以人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR扩增 FGFR1部分胞外结构域，以 9#构建体为模板，通过 PCR 扩增 VEGFR片段，以 cDNA为模板扩增人 IgGl Fc区。然后，通过重叠 PCR得到三个片目连的 PCR产物，经过酶切、连接引达载体，从而构建得到 11#和 14#构建物。然后以 14#构建物为模板，通过 PCR扩增得到 27#构建物。所用引物见表 1。

[220] 12#融合蛋白包含 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分胞外结构域和 IgGl Fc。以 9#构建体为模板，以及 9#-VEGFRlDl上游引物， 11#VEGFR1D2D3下游引物，以 Ajk cDNA为模板扩增人 IgGl Fc区。然后，通过重叠 PCR得到两个片段相连的 PCR产物，经过酶切、连接引达载体，从而构建得到 12#。

[221] 15#融合蛋白包含 VEGFR1部分胞外结构域、 VEGFR2部分胞外结构域和 IgGl Fc。以 9#构建体为模板，以及 2#-VEGFRl 上游引物， 11#VEGFR1D2D3下游引物，以 Ajk cDNA为模板扩增人 IgGl Fc区。然后，通过重叠 PCR得到两个片段相连的 PCR产物，经过酶切、连接引达载体，从而构建得到 15#₀

[222] 26#融合蛋白包含 FGFR1部分胞外结构域和 IgGl Fc。以人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR扩增 FGFR1部分胞外结构域，使用 SEQ ID NO: 73为上游引物， SEQ ID NO: 74为下游引物，以人血 cDNA为模板扩增人 IgGl Fc区。然后，通过重叠 PCR得到两个片段相连的 PCR产物，经过酶切、连接引达载体，从而构建得到 26#。

[223] 各个融合蛋白中 VEGFR-FGFR-Fc的蛋白质序列和编码其的核苷酸序列在表 2中显示。融合蛋白的结构示意图见图 1。

表 1: 构建载体过程中扩增 VEGFR和 FGFR片段所用的引物

融合蛋白片段名上游引物下游引物

2# 2#VEGFR1 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46

2#FGFR1 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44

4# 4#VEGFR1 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 48

4#FGFR1 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44

7# 7#VEGFR1 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 50

7#FGFR1 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44

9# 9#-VEGFRlDl SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53

9#-VEGFRlD2 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 75

9#-VEGFR2D3 SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 55

9#FGFR1 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44

10# 10#-VEGFR1D1 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53

10#-VEGFR1D2R2D3 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55 10#FGFR1 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44# 11#FGFR1 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65

11#-VEGFR1D1 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 53

11#-VEGFR1D2R2D3 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 67

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44# 12#VEGFR SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 67

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44# 14#FGFR1 SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 53

14#-VEGFR1D1 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 53

14#-VEGFR1D2R2D3 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 67

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44# 15#VEGFR SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 67

Fc SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 44# 16#-VEGFR1D1 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53

16#-VEGFR1D2R2D3 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55

16#FGFR1 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44# 20#-VEGFRlDl SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53

20#-VEGFRlD2R2D3 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55

20#FGFR1 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44# 21# SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61# 24#VEGFR SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 55

24#FGFR1 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 25# 25#VEGFR SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 55

25#FGFR1 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 42

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44

26# 26#FGFR1 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74

Fc SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44

27# 27#VEGFR-FGFR1-Fc SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 44

28# 28#VEGFR-FGFR1-Fc SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 44

表 2: 本发明融合蛋白的蛋白质序列和核苷列

融合蛋白氨基酸序列核苷酸序列

2# SEQIDNO: 9 SEQ ID NO: 26

4# SEQIDNO: 10 SEQ ID NO: 27

7# SEQIDNO: 11 SEQ ID NO: 28

9# SEQIDNO: 12 SEQ ID NO: 29

10# SEQIDNO: 13 SEQ ID NO: 30

11# SEQIDNO: 14 SEQ ID NO: 31

12# SEQIDNO: 15 SEQ ID NO: 32

14# SEQIDNO: 16 SEQ ID NO: 33

15# SEQIDNO: 17 SEQ ID NO: 34

16# SEQIDNO: 18 SEQ ID NO: 35

20# SEQIDNO: 19 SEQ ID NO: 36

21# SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 37

24# SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 38

25# SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 39

26# SEQIDNO: 71 SEQ ID NO: 72 27# SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 40

28# SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 41

实施例 2: 融合蛋白的瞬时表定量

[224] 用 MAX质粒提纯试剂盒 ( Qiagen公司）提纯相应融 ^^白质粒的 DNA, 用紫外分光光度法确定质粒 DNA的浓度，将重组质粒 l g和 6 L 脂质体（FuGENE 6 Transfection Reagent, Roche公司）于 ΙΟΟμΙ新鲜 IMDM培养液 ( GIBCO公司）中混匀，静置 15分钟后加入按细胞密度 3xl0 /mL接种于 6 1 过夜培养的 CHO细胞（ ATCC )中，细胞完全培养液含 88%IMDM、 10%的 FBS、 1%HT和 1%谷氨酰胺 (均为 GIBCO 公司产品），于 37°C， 5%C0₂培养箱中培养 48小时后收集上清，用人 IgG ELISA蛋白定量试剂盒（BETHYL公司）确定 CHO分泌表达融合蛋白的相对含量。具体步驟为：将 ΙΟΟμΙ^亲和纯化的浓度为 lO g/mL抗人 IgG-Fc蛋白于 96孔 ELISA板（IMMULON公司）上包被过^，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后，用 200μΙ新鲜配制的封闭工作液（KPL公司） (封闭存储液液： PBS=1:19 )封闭各包被孔，于温育 lh，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后每孔加入 ΙΟΟμΙ,梯度稀释（起点为 200ng/mL，用 PBS 2倍比稀释 )的 IgG作为标准以及 100 μ L梯度稀释的各种融合蛋白的细胞培养上清（起点为各培养上清，用 PBS 5倍比稀释），于 37 温育 2h，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后再加入 100 μ L用 PBS 1:10000 稀释的抗人 IgG Fc-HRP二抗（BETHYL公司），于 37 温育 lh，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后加入 100 μ L显色液（ KPL公司）显色、最后加入 100 μ L终止液（ KPL公司）终止显示后于将 ELISA板置于酶标仪上读取 450nm波长的吸光度，根据标准曲线从而可知不同融合蛋白的浓度。实施例 3: 融合蛋白的结合实验

[225] 使用 ELISA方法检测以上构建的融合蛋白与 VEGF和 FGF-2的结合能力。先在 96孔 ELISA板（ IMMULON公司）上分别包被 ΙΟΟμΙ含有 20ng/mL VEGF ( R&D Systems公司）和 50ng/mL FGF-2 ( R&D Systems 公司）（含 lOOng/mL肝 ( Sigma公司））的溶液，然后 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次，用 200μΙ新鲜配制的封闭工作液（KPL公司）（封闭存储液： PBS=1:19 )封闭包被孔，于温育 lh，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后加入 ΙΟΟμΙ,浓度均为 20ng/mL的各种融 ^^白（溶于 PBS, pH=7.2 )，于 37 温育 2h，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后再加入 100μ 用 PBS 1:10000稀释的抗人 IgG Fc-HRP二抗（BETHYL公司），于 37 温育 lh，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后加入 ΙΟΟμΙ显色液（ KPL 公司）显色、最后加入 ΙΟΟμΙ终止液（KPL公司）终止显示后于将 ELISA 板置于酶标仪上读取 450nm波长的吸光度，融合蛋白结合 VEGF或 FGF2 的能力越强则吸光度越高、信号越强， 4艮据信号的强弱，确定 25号、 28 号融合蛋白具有同时高效结合 VEGF和 FGF-2的能力。融合蛋白的结合 VEGF和 FGF-2的比较见图 2。

实施例 4: 融合蛋白的稳定表达与纯化

26] 将具有高效结合能力的 25号融合蛋白以及作为对照的 12号、 15号融合蛋白的重组表粒经脂质体 ( Roche公司）转染 DHFR缺陷型 CHO 细胞（ ATCC )。具体地，将重组质粒 5 g和 30μΙ脂质体（FuGENE 6 Transfection Reagent, Roche公司）于 100 μ L新鲜 IMDM培养液（ GIBCO 公司）中混匀，静置 15分钟后加入按细胞密度 3xl0⁵/mL接种于 10cm细胞培^ JUL ( Corning公司）过夜培养的 DHFR缺陷型 CHO细胞（ ATCC ) 中，细胞完全培养液为含有 10%的 FBS、 1%HT和 1%谷氨酰胺的 IMDM 培养基（均来自 GIBCO公司），于 37°C， 5%C0₂培养箱中培养 2~3 ，用胰酶 ( GIBCO公司）消化细胞，按照 3xl0 /mL接种至含 30mL无血清 302培养基（SAFC公司）摇瓶中，于 100转 /分钟， 37°C , 5%C0₂培养箱中筛选培养至细胞密度为 10⁶/mL，然后接种 3000个细胞于每个 10cm

( Corning公司）中（培养液为含有 10%的 FBS、 1%谷氨酰胺 IMDM培养基），于 37°C， 5%C0₂培养箱中培养至形成单克隆，挑选单克隆于 96孔细胞培养板（Corning公司）中培养，使用人 IgG ELISA蛋白定量试剂盒（BETHYL公司）确定各单克隆分泌表达融合蛋白的相对含量，具体^ 和步驟同实施例 2中测定融合蛋白的相对含量所述，筛选出表达量最高的克隆至 6 1 进行培养至细胞汇合度达到 70%左右，用肢酶消化细胞转移至 10cm培 ^中培养，加入甲氨蝶呤（methotrexate, MTX ) ( Sigma公司）进行逐步加压扩增（ MTX浓度分别为 10nM, 20nM, 50ηΜ, ΙΟΟηΜ, 200nM, 500nM )。加压扩增结束后，用胰酶消化细胞按 3xl0 /mL上摇瓶培养，测出单细 Jf& 达量，从而获得表达特定融合蛋白的 CHO工程细 Jf&^，最^ CHO工程细 Jf&^，在 pH 7.0无血清 302培养基（SAFC公司）中于 37°C， 5%C0₂， 40%溶氧， 80转 /分钟， ^ 悬浮培养，培养体积达到 10L。离心收集培养产物，取上清液用 0.45μιη 滤膜（Millipore公司）过滤后，按照 Protein A亲和层析柱（GE公司）的使用手册进行亲和层析，首先個 PBS緩冲液（ρΗ:7·0 )平衡 Protein A亲和层析柱，然后将上清过柱，再用 PBS緩冲液平衡，最后用柠檬酸緩冲液（pH: 3.0 )进行洗脱，收集洗脱液用孔径 0·45μιη滤膜过滤，加入 S/D ( 0.3%磷酸三丁酯 /1%吐温 80 )于 24 放置 6小时灭活病毒后，再使用分子筛层析进一步纯化目的蛋白，首先将经 Protein A亲和层析的洗脱、 ^¾AJt:析袋 ( Millipore公司）中于 PBS緩冲液中透析，再置于 10KD 超滤杯（Millipore公司）中雜蛋白；使用 PBS緩冲液平衡分子筛层析柱 Superdex 200( GE公司），然后将超滤杯浓缩后的液体上样后再用 PBS 緩冲液洗脱，收集洗脱峰。用十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶法 ( SDS-PAGE )分析纯化的蛋白（见图 3 )，然后合并含有所需表达产物的洗脱物，用孔径 0.22μιη滤膜（Millipore公司 )过滤后，用 Lowry法等多种方法进行蛋白定量。

实施例 5: 融合蛋白的梯度结合实验

27] 与实施例 3类似地，使用 ELISA方法检测以上构建的融合蛋白与 VEGF和 FGF-2的结合能力。先在 96孔 ELISA板上分别包被 ΙΟΟμΙ 20ng/mL VEGF和 50ng/mL FGF-2( R&D Systems公司）后，然后用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后，用 200μΙ新鲜配制的封闭工作液（KPL公司） (封闭存储液： PBS=1:19 )封闭各包被孔，于温育 lh，用 300μΙ PBST 洗涤液洗涤五次后加入 ΙΟΟμΙ含不同蛋白量的各种融 ^^白（蛋白起始量为 ΙΟΟΟΟΟΟρΜ, 以 5倍梯度稀幹），于温育 2h，用 300μΙ PBST 洗涤液洗涤五次后再加入 ΙΟΟμΙ用 PBS 1:10000稀释的抗人 IgG Fc-HRP 二抗（BETHYL公司），于 37 温育 2h，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后加入 ΙΟΟμΙ显色液（KPL公司）显色，最后加入 ΙΟΟμΙ终止液（KPL 公司）终止显示后将 ELISA板置于酶标仪上读取 450nm波长的吸光度，才艮据信号的强弱，确定融合蛋白梯度结合 VEGF和 FGF-2的能力。 12号、 15号、 25号融合蛋白梯度结合 VEGF和 FGF-2的比^ JL图 4。并且，将 25号与一种 FGFR-Fc融合蛋白（记为 26号）进行比较，见图 4。其中 26号 FGFR-Fc融合蛋白包含 FGFR第二 Ig样结构域、 FGFR第三 Ig样结构域和 Fc区，其氨基酸序列显示于 SEQ ID NO: 71，编码核苷酸序列显示于 SEQ ID NO: 72。所述 26号融 ^^白通过如下步驟获得：与实施例 1类似地，以成年人结肠癌组织 cDNA为模板通过 PCR扩增 FGFR1 片段（引物为 SEQ ID NO: 73和 SEQ ID NO: 74 )，以 jk cDNA为模板通过 PCR扩增 IgGl Fc片段（引物为 SEQ ID NO: 43和 SEQ ID NO: 44 )，然后通过重叠 PCR相连，克隆到表达载体。本实施例表明，随着本发明 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白摩尔浓度的增加，其结合 VEGF和 FGF-2的能力越强，表现为在 450nm波长下的信号越强，而随着融合蛋白摩尔浓度的梯度稀幹，其结合 VEGF和 FGF-2的能力也相应减弱。

实施例 6: 融合蛋白的亲和力实验

28] 使用亲和力实验确定融合蛋白在溶液体系中与 VEGF或 FGF-2的亲和力，首先在 96孔 ELISA板上分别包被 ΙΟΟμΙ浓度为 l.O g/mL VEGF 或 ΙΟΟμΙ浓度为 2.(^g/mL FGF-2捕获抗体 ( R&D Systems公司），用 30(^L PBST洗涤液洗涤五次后，用封闭工作液（KPL公司）封闭各包被孔（参见实施例 3 )，于 37 温育 lh，用 30(^L PBST洗涤液洗涤五次后加入事先配制好且孵育过的融合蛋白与 FGF-2的混合液和梯度稀释的标准品，具体配制方法如下： 12#、 15#、 25# Fc融合蛋白分别以 800000pM 为起点（溶于 PBS )， 10倍梯度稀幹，分别与 20pM VEGF溶液 1: 1混合，即^^白起点终浓度为 400000pM， VEGF终浓度为 ΙΟρΜ; 25#、 26# Fc融合蛋白分别以 200pM为起点（溶于 PBS ), 2倍梯度稀释，分别与 20pM FGF-2溶液 1: 1混合，即^^白起点终浓度为 200pM， FGF-2终浓度为 10ρΜ。温育 2h，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后加入 ΙΟΟμΙ, 浓度为 100ng/mL VEGF或 ΙΟΟμΙ浓度为 250ng/mL FGF-2检测抗体

( R&D Systems公司）（能特异性 Α½测游离的 VEGF或 FGF-2抗体）， 37 温育 2h，用 30(^L PBST洗涤液洗涤五次后加入 HRP标记的链霉亲和素（ R&D Systems公司 X用 PBS按 1:200稀释），温育 2h，用 300μΙ PBST洗涤液洗涤五次后加入 ΙΟΟμΙ,显色液（ KPL公司）显色适当时间

(约 15~30分钟），最后加入 100μ 终止液（ KPL公司）终止显示后于将 ELISA板置于酶标仪上读取 450nm波长的吸光度，从而检测出融合蛋白与 VEGF或 FGF-2的混合液中游离的 VEGF或 FGF-2的相对浓度确定。 12号、 15号、 25号融合蛋白在溶液体系中与 VEGF或 FGF-2的亲和力比^ JL图 5。并且，将 25号与一种 FGFR-Fc融合蛋白（记为 26号）进行比较，见图 5。其中 26号 FGFR-Fc融^^白包含 FGFR第二 Ig样结构域、 FGFR第三 Ig样结构域和 Fc 区。本实施例表明本发明构建的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白（例如 12#、 15#和 25# )在溶液体系中对 VEGF 和 FGF-2具有高亲和力，且亲和力随着浓度的增加而增加，表现为游离的 VEGF 和 FGF-2 的量随着融合蛋白浓度的增加而减少。本发明的 VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白 12#、 15#和 25#在溶液体系中与 VEGF或 FGF-2的亲和力图见图 5。本实施例表明本发明构建的 VEGFR-FGFR融合蛋白在溶液体系中对 VEGF和 FGF-2具有亲和力，且亲和力随着浓度的增加而增加，表现为游离的 VEGF和 FGF-2的量越少。

实施例 7: 人脾带静脉血管内皮细胞分裂抑制试验

[229] 使用人脐带静脉血管内皮细胞（HUVEC )分裂试验检验融合蛋白抑制血管内皮细胞的分裂能力。 HUVEC完全培养基（AllCdls公司）于 37°C， 5% C0₂培养箱中培养 HUVEC细胞（ AllCdls公司）至细胞对数生长期。用胰酶消化计数 HUVEC细胞，按每孔 3000个 HUVEC细胞接种在 96 1 中于含 1%FBS的 HUVEC 培养基 ( AllCells公司）， 37°C , 5% C0₂培养箱中培养过夜，分别加入 ΙΟΟμΙ,用含 1%FBS 的 HUVEC基础培养基稀释的终浓度为 20ng/mL 的 VEGF 或终浓度为 5ng/mL的 FGF-2( R&D Systems公司），以及不同量的融^ ^白和 FGF-2 的混合液各 100μΙ^，分别 ^有融合蛋白的终浓度为 40pM,用含 1%FBS 的 HUVEC基础培养基 10倍比稀释， FGF-2的终浓度均为 5 ng/mL, 继续培养 3 ~ 4天后，吸取培养基，加入含有 10% CCK-8试剂（ DOJINDO 公司）的培养基继续培养 2小时后，将 ELISA板置于酶标仪上读取 450nm 波长的吸光度。根据吸光度的差异确定融合蛋白抑制 VEGF或 FGF-2诱导的血管内皮细胞分裂的能力。融合蛋白对 VEGF 或 FGF-2 诱导的 HUVEC细胞分裂的影响及其相对抑制率见图 6。本实施例表明本发明构建的 VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白（例如 12#、 15#和 25# )在细胞水平具有生物学活性和功能，可以抑制 VEGF或 FGF-2诱导的 HUVEC细胞分裂的能力，具有结合 VEGF和 FGF-2的能力，且这种结合能力随着融合蛋白的摩尔浓度的增加而增加，表现为 VEGF或 FGF-2诱导的 HUVEC 细胞分裂受抑制。

[230] 本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处的名斗技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。

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Claims

1.抑制血管新生的融合蛋白，其包含衍生自至少两种血管新生抑制剂的至少两个血管新生抑制单元。

2.权利要求 1的融合蛋白，其包含衍生自两种或两种以上血管新生抑制剂的两个血管新生抑制单元。

3.权利要求 1或 2的融^ "白，其中所管新生抑制剂是抑制血管新生的受体，所述受体例如可以选自： DDR1、 EphAl、 EphA2、 EphA8、 EphBl、 EphB4、 EGFR、 HER-2、 ErbB3、 FGFR1、 FGFR2、 FGFR4、 MET, RON, CSF1R、 KIT, PDGFR-A, PDGFR-B, TEK：、 Tie-1、 HGF、 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3.

4. 前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述至少两个血管新生抑制单元包括至少一个衍生自 VEGFR胞外区的部分和至少一个衍生自 FGFR胞外区的部分，优选地所述 VEGFR胞外区是 VEGFR1、 VEGFR2 和 /或 VEGFR3胞外区，所述 FGFR胞外区是 FGFR1和 /或 FGFR2胞外区。

5. 前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述至少两个血管新生抑制单元包括一个衍生自 VEGFR1和 /或 VEGFR2胞外区的部分和一个衍生自 FGFR1和 /或 FGFR2胞外区的部分。

6.权利要求 4或 5的融合蛋白，所述衍生自 VEGFR1和 /或 VEGFR2 胞外区的部分包含选自下列的一项或多项： VEGFR1或 VEGFR2的第一 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR1或 VEGFR2第二 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR1或 VEGFR2第三 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR1或 VEGFR2第四 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR1或 VEGFR2第五 Ig样结构域或其一部分、 VEGFR1或 VEGFR2第六 Ig样结构域或其一部分、和 VEGFR1或 VEGFR2第七 Ig样结构域或其一部分。

7.权利要求 4或 5的融合蛋白，所述衍生自 FGFR胞外区的部分包含选自下列的一项或多项： FGFR第一 Ig样结构域或其一部分、源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域或其一部分和 FGFR第三 Ig样结构域或其一部分。

8.权利要求 4或 5的融合蛋白，其中所述衍生自 VEGFR胞外区的部分包含： VEGFR1 或 VEGFR2 的第二 Ig样结构域和 VEGFR1 或 VEGFR2的第三 Ig样结构域；所述衍生自 FGFR胞外区的部分包含：源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域和 FGFR第三 Ig样结构域。

9.权利要求 4-8任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白从 N端到 C 端依次包含：衍生自 VEGFR胞外区的部分和衍生自 FGFR胞外区的部分。

10.权利要求 9的融合蛋白，其中所述衍生自 VEGFR胞外区的部分从 N端到 C端依次包含： VEGFR1或 VEGFR2的第二 Ig样结构域和 VEGFR1或 VEGFR2的第三 Ig样结构域；所述衍生自 FGFR胞外区的部分从 N端到 C端依次包含：源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域和 FGFR第三 Ig样结构域。

11.权利要求 9或 10的融合蛋白，其中所述衍生自 VEGFR胞外区的部分还包含 VEGFR1或 VEGFR2的第一 Ig样结构域；优选地，所述衍生自 VEGFR胞外区的部分从 N端到 C端依次包含： VEGFR1 或 VEGFR2的第一 Ig样结构域、 VEGFR1或 VEGFR2的第二 Ig样结构域和 VEGFR1或 VEGFR2的第三 Ig样结构域；所述衍生自 FGFR胞外区的部分从 N端到 C端依次包含：源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、 FGFR第二 Ig样结构域和 FGFR第三 Ig样结构域。

12.权利要求 9-11任一项的融合蛋白，其中所述衍生自 FGFR胞外区的部分还包含 FGFR第一 Ig样结构域或其一部分。

13.权利要求 9或 10的融合蛋白，其中：

所述 VEGFR1第二 Ig样结构域具有：与 SEQ ID NO:2第 151至 214 位相对应的處基酸序列，

所述 VEGFR2第三 Ig样结构域具有：与 SEQ ID NO:3第 224至 320 位相对应的處基酸序列，

所述 FGFR1第二 Ig样结构域具有：与 SEQ ID ΝΟ:1第 163至 247 位相对应的氨基酸序列，和

所述 FGFR1第三 Ig样结构域具有：与 SEQ ID ΝΟ:1第 270至 359 位相对应的處基酸序列。

14.权利要求 11的融合蛋白，其中：

VEGFR1第一 Ig样结构域具有：与 SEQ ID NO:2第 32至 123位相对应的處基酸序列。

15.权利要求 12的融合蛋白，其中 FGFR第一 Ig样结构域或其一部分具有：

与 SEQ ID ΝΟ:1第 40至 118位相对应的氨基酸序列，或者

与 SEQ ID ΝΟ:1第 77至 118位相对应的處基酸序列。

16.权利要求 4-15中任一项的融合蛋白，其中所述衍生自 FGFR胞外区的部分包含源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分，优选所述源自 FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。

17.前述任一项权利要求的融合蛋白，其还包含融合伴侣，例如免疫球蛋白 Fc区，优选地是人 IgG Fc区，例如人 IgGl Fc区，更优选地其具有:

与 SEQ ID NO: 7相对应的氨基酸序列，或者

与 SEQ ID NO: 8相对应的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

18.前述任一项权利要求的融合蛋白，所述蛋白包含：

( 1 ) SEQ ID NO: 9-24任一项所示處基酸序列，或由 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；

( 2 )与 SEQ ID NO: 9-24任一项所示處基酸序列有至少 70%同一性的處基酸序列，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99% 同一性；或者

( 3 ) 由与 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷^^列有至少 70%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，优选地至少 80%、 90%、 93%、 95%、 97%、 98%或 99%同一性。

19.前述任一项权利要求的融合蛋白，其还包含分泌信号肽区，例如 VEGFR1信号肽区，优选地所述分泌信号肽区具有 SEQ ID NO: 2第 1至 26位的氨基酸序列或者由 SEQ ID NO: 25所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。

20.编码前述任一项权利要求的融 ^^白的分离的核酸分子。

21.权利要求 20的核酸分子，其包含 SEQ ID NO: 26-41任一项所示核苷酸序列。

22. 包含权利要求 20或 21的核酸分子的载体。

23.用权利要求 22的载体转染的细胞，优选 CHO细胞。

24.—种药物组合物，其包含权利要求 1-19任一项的融合蛋白、权利要求 20或 21的核酸分子、权利要求 22的载体或权利要求 23的细胞，以及可药用载体。

25.一种生产抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通 i½原核细胞或真核细胞例如细菌、酵母或哺乳动物细胞系中表达权利要求 1-19任一项的融合蛋白来进行。

26. 权利要求 25的方法，其中所述哺乳动物细胞系是 CHO细胞系。

27. 权利要求 1-19任一项的融^ ^白、权利要求 20或 21的核酸分子、权利要求 22的载体、权利要求 23的细胞或权利要求 24的药物组合物在制备用于在哺乳动物中抑制血管新生的药物中的用途。

28.权利要求 1-19任一项的融合蛋白、权利要求 20或 21的核酸分子、权利要求 22的载体、权利要求 23的细胞或权利要求 24的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤和 /或眼科血管新生性疾病的药物中的用途，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。