WO2012161143A1 - 生物材料用透明化試薬、及びその利用 - Google Patents

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reagent
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urea
clarification
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宮脇　敦史
裕 濱
朝子 阪上
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    • G01N2001/302—Stain compositions

Definitions

  • the present invention relates to a clearing reagent for biological materials and use thereof.
  • a pretreatment (clearing treatment) using a clearing reagent is performed.
  • a tissue-clearing-method is known as a typical one. All of these are used for the purpose of observing fluorescent substances present in the tissue by making the tissue transparent.
  • an organic solvent is indispensable as an active ingredient for the clarification treatment, so that it is difficult to use it in a living tissue, and there is a problem that the application target is limited to an immobilized sample. In addition, there is a problem that the biological material to be transparentized can be contracted.
  • urea is a component with excellent biocompatibility
  • the above problem can be solved by using urea or a urea derivative as an effective component for the clarification treatment.
  • the inventors of the present application have further started the problem of developing a transparent treatment method that can further reduce the risk of tissue deformation or the like even with a weak tissue using urea or a urea derivative.
  • the present invention has been made in order to solve the above-described problems, and an object thereof is to provide a novel biomaterial clarification reagent using urea or a urea derivative as an active ingredient, and use thereof.
  • the inventors of the present application have conducted intensive studies. As a result, by allowing glycerol having a predetermined concentration or more to coexist in a solution containing urea or a urea derivative as an active ingredient for the clarification treatment, it becomes possible to more reliably suppress tissue deformation and the like even for fragile tissue. I found out. As a result, the present invention has been conceived.
  • the biological material clarification reagent according to the present invention contains at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives within the range of 1 M or more and 8.5 M or less. It is characterized by being a solution containing a concentration and containing glycerol at a concentration in the range of 25 (w / v)% to 35 (w / v)%.
  • the clearing reagent for biological material according to the present invention is a solution containing urea as the above compound on the premise of the above configuration.
  • the biological material clearing reagent according to the present invention is an aqueous solution on the premise of the above configuration.
  • the clearing reagent for biological material according to the present invention contains a surfactant on the premise of any one of the above structures.
  • the surfactant is a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant is at least selected from the group consisting of TritonX (registered trademark), Tween (registered trademark), and NP-40 (trade name). It is a kind.
  • the biological material clearing reagent according to the present invention further includes a water-soluble polymer compound on the premise of any of the above-described configurations.
  • the water-soluble polymer compound is at least one selected from the group consisting of Percoll (registered trademark), Ficoll (registered trademark), polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone. .
  • the clarification reagent for biological material according to the present invention contains glycerol at a concentration in the range of 27 (w / v)% to 33 (w / v)% on the premise of any one of the above structures.
  • the clearing reagent for biological material according to the present invention is based on any one of the above-described configurations, and urea is a concentration within the range of 3 M or more and 5 M or less, and the surfactant is 0.025 (w / v)% or more. And at a concentration within the range of 5 (w / v)% or less.
  • the clearing reagent for biological material clears a multicellular animal other than a tissue or organ derived from a multicellular animal, or a human, on the premise of any of the above-described configurations.
  • a biological material clarification treatment system comprises any one of the above-described clarification reagents for biological materials and an isolated biological material, and the biological material is transparent.
  • the biomaterial clearing reagent is infiltrated into the inside of the biomaterial in order to convert the biomaterial.
  • the biological material clarification method according to the present invention infiltrates any one of the above-described biological material clarification reagents into the isolated biological material, thereby transparentizing the biological material.
  • the process characterized by including.
  • the biological material clarification treatment kit according to the present invention includes any one of the above-described clarification reagents for biological material.
  • the present invention can provide a biomaterial clarification reagent using urea or a urea derivative as an active ingredient, which can more reliably suppress tissue deformation due to a clarification treatment, and use thereof. There is an effect.
  • the “clearing reagent for biological material” is a solution containing “urea” as an essential active ingredient for clarifying biological material.
  • the “biological material clearing reagent” is a solution containing “urea derivative” as an essential active ingredient for clearing the biological material.
  • the type of the urea derivative is not particularly limited, but specifically, for example, various ureins or compounds represented by the following general formula (1).
  • a part of uraine is contained in the compound shown in General formula (1).
  • the biological material clearing reagent according to the present invention may contain at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives as an active ingredient, and it is more preferable that urea is contained among them. .
  • R1, R2, R3, and R4 are each independently a hydrogen atom (however, when all of R1 to R4 are hydrogen atoms, they are excluded because they correspond to urea itself), halogen An atom or a hydrocarbon group, and when there are a plurality of carbon atoms constituting the hydrocarbon group, a part of the carbon atom may be substituted with a heteroatom such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom. Good.
  • the hydrocarbon group include a chain hydrocarbon group and a cyclic hydrocarbon group.
  • Examples of the chain hydrocarbon group include a chain alkyl group, a chain alkenyl group, and a chain alkynyl group.
  • the number of carbon atoms constituting the chain hydrocarbon group is not particularly limited, and examples thereof include a straight chain or branched chain having 6 or less, preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the chain hydrocarbon group may have a substituent such as a halogen atom, for example.
  • Examples of chain alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, hexyl, octyl and the like.
  • Examples of the cyclic hydrocarbon group include a cycloalkyl group and a cycloalkenyl group.
  • the cyclic hydrocarbon group may have a substituent such as a halogen atom.
  • Examples of the cycloalkyl group include those having 3 or more carbon atoms, preferably 6 or less, such as a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • Examples of the cycloalkenyl group include those having 3 or more carbon atoms, preferably 6 or less, such as a cyclohexenyl group.
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • urea derivative represented by the general formula (1) are as shown in the following 1) to 2).
  • Any three groups selected from R1 to R4 are hydrogen atoms, and the remaining one group is a halogen atom or a chain hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. More preferably, the remaining one group is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or 1 to 2 carbon atoms.
  • Any two groups selected from R1 to R4 are hydrogen atoms, and the remaining two groups are each independently a halogen atom or a chain hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. More preferably, the remaining two groups are each an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or 1 to 2 carbon atoms.
  • it is more preferable that one of the two groups to be a hydrogen atom is selected from any of R1 and R2, and the other is selected from any of R3 and R4.
  • the “clearing reagent for biological material” contains at least one kind of the above compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives at a concentration in the range of 1 M to 8.5 M.
  • the concentration of the compound is preferably 3M or more and 5M or less, more preferably 3.5M or more and 4.5M or less, and further preferably 3.7M or more and 4.3M or less. Within range.
  • Urea is a component derived from a living body having extremely low toxicity. Therefore, the “clearing reagent for biological material” according to the present invention can be used not only for 1) immobilized biological material, but also for clarification of non-immobilized (live) biological material. 2) Urea has relatively little damage to the fluorescent protein and disappearance of the fluorescence, and it can be applied to observation of biological materials using the fluorescent protein. 3) Urea is extremely inexpensive and easily available, and is excellent in handleability, so that it can be transparentized at a very low cost and with a simple procedure.
  • the white matter layer which has been a barrier for deep observation until now, can be made transparent, and the region located deeper than the white matter layer (for example, the corpus callosum) can be observed.
  • the clearing treatment with the reagent of the present invention is reversible. Specifically, it is possible to return to the state before the clearing treatment only by immersing the biological material after the clearing treatment in the balanced salt solution. Since the antigenicity of the protein and the like is preserved before and after the clearing treatment, analysis using a normal tissue staining and immunostaining technique is possible.
  • the “clearing reagent for biological material” contains “glycerol” as an essential component.
  • the “clearing reagent for biological material” contains glycerol at a concentration in the range of 25 (w / v)% to 35 (w / v)%.
  • Glycerol is usually used as a drying inhibiting component, and in that case, a sufficient effect is exhibited at a concentration of 20 (w / v)% or less.
  • glycerol at a concentration of 25 (w / v)% or more, it is possible to more reliably suppress the deformation or the like of the biological material subjected to the clearing treatment.
  • the concentration of glycerol is set within a range of 35 (w / v)% or less.
  • the concentration of glycerol is preferably in the range of 25 (w / v)% to 33 (w / v)%, more preferably 27 (w / v)% to 33 (w / v)%. Is within the range.
  • the “clearing reagent for biological material” preferably has a concentration of at least one compound selected from the group consisting of urea and urea derivatives of 3 M or more and 5 M or less. Within a range, more preferably within a range of 3.5M or more and 4.5M or less, and further preferably within a range of 3.7M or more and 4.3M or less.
  • concentration of glycerol and the concentration of urea or the like are within the above ranges, particularly, the speed of the clearing treatment and the effect of suppressing deformation of the biological material are compatible.
  • glycerol has a relatively low rejection due to an immune response, and traps by the reticulated system are relatively unlikely to occur, and the possibility of accumulation in the liver, kidney, etc. is relatively low. Therefore, there exists an advantage that the said "clearing reagent for biological materials" is easy to apply to the biological body as a biological material. Furthermore, glycerol has the advantage of being relatively inexpensive.
  • the “clearing reagent for biological material” may contain a surfactant as necessary.
  • a nonionic surfactant is preferable because it gradually improves the penetration of the reagent into a biological tissue.
  • Nonionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, and polyoxyethylene sorbitan monooleate; fatty acid systems such as polyvinyl alcohol Higher alcohol type; alkylphenol type surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether.
  • TritonX® series such as TritonX-100 and TritonX-140
  • Tween® series such as Tween-20, Tween-40, Tween-60, and Tween-80
  • NP -40 trade name
  • two or more kinds of surfactants can be mixed and used as necessary.
  • the “clearing reagent for biological material” preferably contains a surfactant.
  • the said surfactant can improve the permeability
  • the “clearing reagent for biological material” according to the present invention may further contain a water-soluble polymer compound as necessary.
  • the polymer compound has a molecular weight of, for example, about 50,000 to 60,000 or more and does not substantially enter the cell.
  • the polymer compound is preferably one that does not cause denaturation of biological materials.
  • Specific examples of water-soluble polymer compounds include, for example, cross-linked sucrose polymer materials, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, or percoll (trade name: polymer material obtained by coating colloidal silica with a polyvinyl pyrrolidone film). Is mentioned.
  • cross-linked sucrose polymer substance specifically, a polymer substance having a weight average molecular weight of about 70,000 obtained by cross-linking (copolymerizing) sucrose with epichlorohydrin, such as Ficoll PM70 (trade name). Etc.
  • water-soluble polymer compounds unlike urea and urea derivatives, do not enter the cells and are water-soluble, and thus are thought to contribute to the adjustment of the osmotic pressure difference inside and outside the cells. Therefore, it contributes to the maintenance of the prototype of the biological material to be transparentized, and in particular to the prevention of the expansion of the biological material.
  • the reagent preferably contains these water-soluble polymer compounds.
  • the “clearing reagent for biological material” contains, as necessary, at least one compound selected from carboxyvinyl polymer, hydroxypropylmethylcellulose, propylene glycol, and macrogol as a “drying inhibiting component”. Can do.
  • the drying inhibitory component prevents the drying of the biological material to be subjected to the clearing treatment.
  • the reagent of the present invention contains the above-mentioned drying inhibiting component. It is preferable to contain.
  • the “clearing reagent for biological material” contains a predetermined concentration of glycerol as an essential component, but glycerol also has a drying inhibiting action. Therefore, the biomaterial clarification reagent has an appropriate drying suppression effect even if the drying suppression component is not included separately.
  • the “clearing reagent for biological material” includes, for example, a pH adjuster, In addition, additives such as an osmotic pressure adjusting agent may be included as necessary.
  • the “clearing reagent for biological material” is a solution containing a solvent in which urea is soluble.
  • the type of the solvent is not particularly limited as long as urea is soluble, but it is preferable to use water as the main solvent, and it is particularly preferable to use only water as the solvent.
  • “use water as the main solvent” means that the proportion of the volume of water in the total solvent used is the largest compared to other solvents, and preferably the total solvent used. The amount of water used is more than 50% and not more than 100% of the total volume.
  • a “biological material clearing reagent” prepared using water as a main solvent is referred to as a “biological material clearing reagent” as an aqueous solution.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • water for example, dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • effects such as improvement of the permeability of the reagent to the biological material and promotion of the clearing treatment of the tissue having a keratinous surface are expected.
  • Main advantages of using water as a solvent are as follows. 1) Since urea, which is an active ingredient of the “clearing reagent for biological material” according to the present invention, is excellent in solubility in water, the preparation of the clearing reagent for biological material is easy and inexpensive. 2) Compared with the case where an organic solvent is used as the main solvent, the biological material to be treated is not dehydrated during the clarification treatment. Therefore, the problem that the biological material contracts can be suppressed. 3) Compared with the case where an organic solvent is used as the main solvent, the possibility of damaging the fluorescent protein is significantly reduced. Therefore, the biological material that has undergone the clearing treatment can be observed using the fluorescent protein. 4) It is not limited to the fixed material, but can be applied to the transparent treatment of the raw material. 5) As will be described later, the clearing treatment becomes reversible, and the biological sample after the clearing treatment can be returned to the state before the clearing treatment as necessary. 6) The handling safety is higher than when an organic solvent is used as the main solvent.
  • the “clearing reagent for biological material” according to the present invention may be a buffer solution capable of maintaining a pH suitable for the biological material to be subjected to the clearing treatment. Furthermore, the “clearing reagent for biological material” according to the present invention further suppresses the deformation of the biological material to be transparentized, and the osmotic pressure is such that urea sufficiently penetrates into the biological material. It may be adjusted.
  • the content of “urea” in the “clearing reagent for biological material” according to the present invention is not particularly limited as long as it is within the range of 1 M or more and 8.5 M or less.
  • the upper limit of the content of “urea” is determined by the solubility of urea in the solvent used.
  • the treatment time is lengthened, and the urea content is relatively high. The required transparency can be performed by shortening the processing time.
  • the “surfactant” when used, its content is not particularly limited, but it is preferably contained at a concentration in the range of 0.025 (w / v)% to 5 (w / v)%. , 0.05 (w / v)% or more and 0.5 (w / v)% or less, and more preferably 0.05 (w / v)% or more and 0.2 (w / V) It is particularly preferred to contain at a concentration within the range of% or less.
  • the unit (w / v)% is a percentage of the weight (w (gram)) of the surfactant to be used with respect to the volume (v (milliliter)) of the “clearing reagent for biological material”.
  • the “water-soluble polymer compound” when used, its content is not particularly limited, but it is contained at a concentration in the range of 2.5 (w / v)% to 40 (w / v)%. It is preferable.
  • the content is a concentration in the range of 5 (w / v)% to 25 (w / v)%. More preferably, it is contained at a concentration in the range of 10 (w / v)% or more and 20 (w / v)% or less, more preferably 10 (w / v)% or more and 15 (w / v).
  • the unit (w / v)% is a percentage of the weight (w (gram)) of the “water-soluble polymer compound” to be used with respect to the volume (v (milliliter)) of the “clearing reagent for biological material”. It is.
  • the content thereof is not particularly limited, but it is preferably included at a concentration in the range of more than 0 (w / v)% to 10 (w / v)%, More preferably, it is contained at a concentration in the range of 1 (w / v)% to 7 (w / v)%, and more preferably in the range of 2.5 (w / v)% to 5 (w / v)%. It is particularly preferred to contain at a concentration within the range.
  • the unit (w / v)% is a percentage of the weight (w (gram)) of the “drying suppression component” to be used with respect to the volume (v (milliliter)) of the “clearing reagent for biological material”.
  • the type of biological material to be subjected to the clearing treatment using the “clearing reagent for biological material” of the present invention is not particularly limited, but plant-derived materials or animal-derived materials are preferable, and fish, amphibians, reptiles, birds Or materials derived from animals such as mammals (mammals) are more preferred, and materials derived from mammals are particularly preferred.
  • the type of mammal is not particularly limited, but laboratory animals such as primates excluding mice, rats, rabbits, guinea pigs and humans; pets such as dogs and cats (pets); domestic animals such as cows and horses; humans; Is mentioned.
  • the biological material may be an individual itself (excluding a living human individual itself) or an organ, tissue, or cell obtained from an individual of a multicellular organism. Since the “clearing reagent for biological material” of the present invention has an excellent clearing ability, the biological material is a tissue or organ derived from a multicellular animal (for example, the whole brain or a part thereof), or a human body. The clearing treatment can be applied even to a cell animal individual (for example, an embryo or the like) itself.
  • the “biological material clearing reagent” of the present invention is particularly suitable for clearing fragile biological materials because it has an extremely large effect of suppressing deformation of biological materials.
  • fragile biological materials include cells excluding plant cells, animal embryos in the early stages of development, stem cells, primary cultured cells, and cells that have been grown three-dimensionally in a special culture environment (spheroid, neurosphere, cell aggregates etc.).
  • the biological material may be a material that has been fixed for microscopic observation, or may be a material that has not been fixed.
  • an immobilized material it is preferable to perform a treatment that is sufficiently immersed in a 20 (v / w)% sucrose-PBS solution (for example, 24 hours or more) after the immobilization treatment.
  • the material is preferably embedded in OCT compund, frozen in liquid nitrogen, thawed in PBS, and fixed again with 4 (v / w)% PFA (paraformaldehyde) -PBS solution.
  • the biological material is, for example, a biological tissue injected with a fluorescent chemical substance, a biological tissue stained with a fluorescent chemical substance, a biological tissue transplanted with cells expressing a fluorescent protein, or a fluorescent protein expressed It may be a living tissue of a genetically modified animal.
  • compositions of the “clearing reagent for biological material” are as follows. These clearing reagents are particularly suitable for the purpose of clearing embryos in the early stages of development in mammals such as mice.
  • Clearing reagent for biological materials (1): An aqueous solution in which urea is dissolved in water at a concentration in the range of 3M to 5M and glycerol is contained in a concentration in the range of 25 (w / v)% to 35 (w / v)%. .
  • ⁇ Clearing reagent for biological materials (2) In water, the concentration of urea is 3M or more and 5M or less, and nonionic surfactant (for example, TritonX-100) is 0.05 (w / v)% or more and 0.2 (w / v). ) An aqueous solution comprising a concentration of glycerol within a range of not more than 25% and further containing glycerol at a concentration of not less than 25 (w / v)% and not more than 35 (w / v)%.
  • nonionic surfactant for example, TritonX-100
  • An aqueous solution comprising a concentration of glycerol within a range of not more than 25% and further containing glycerol at a concentration of not less than 25 (w / v)% and not more than 35 (w / v)%.
  • ⁇ Clearing reagent for biological materials (3) In water, the concentration of urea is 3M or more and 5M or less, and nonionic surfactant (for example, TritonX-100) is 0.05 (w / v)% or more and 0.2 (w / v). ) At a concentration in the range of not more than 25%, glycerol in a concentration not less than 25 (w / v)% and not more than 35 (w / v)%, An aqueous solution comprising a concentration of 2.5 (w / v)% to 5 (w / v)%.
  • nonionic surfactant for example, TritonX-100
  • ⁇ Clearing reagent for biological materials (4) In water, the concentration of urea is 3 M or more and 5 M or less, and a nonionic surfactant (for example, Triton X-100) is 0.05 (w / v)% or more to 0.2 (w / v). ) Dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration within the range of 8% or less and glycerol at a concentration within the range of 12 (w / v)% or less and 25 (w / v)% or more An aqueous solution comprising a concentration within the range of 35 (w / v)% or less.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • glycerol Dimethyl sulfoxide
  • An aqueous solution comprising a concentration within the range of 35 (w / v)% or less.
  • the concentration of glycerol is preferably in the range of 25 (w / v)% to 33 (w / v)%, Preferably, it is in the range of 27 (w / v)% or more and 33 (w / v)% or less.
  • the concentration of urea is preferably in the range of 3.5 M or more and 4.5 M or less, more preferably 3.7 M or more. It is within the range of 4.3M or less.
  • the biological material clarification reagent (1) to (4) is used by using the urea derivative or the like at the same concentration as the above urea. ) May be prepared.
  • the preparation method of “clearing reagent for biological material” according to the present invention includes “urea and / or urea derivative”, “glycerol”, and “surfactant”, “water-soluble polymer compound” used as necessary. ”,“ Drying inhibiting component ”and the like are prepared by dissolving in a solvent.
  • the procedure for dissolving or mixing in the solvent is not particularly limited.
  • the biological material clearing treatment method using the “biological material clearing reagent” includes a step of infiltrating the “biological material clearing reagent” into the above “biological material” (clearing treatment step). ). More specifically, the “biological material clearing reagent” is infiltrated into the above “biological material” in the container for the clearing treatment.
  • the order of storing the “biological material clearing reagent” and the “biological material” in the clearing treatment container is not particularly limited, but first, the “biological material clearing reagent” It is preferred to store and then store the “biological material” (ie, put the biological material into the clearing reagent for biological material).
  • the treatment temperature at which the above-described transparent treatment step is performed is not particularly limited, but is preferably in the range of 15 ° C. or higher and 45 ° C. or lower.
  • the treatment time for performing the clearing treatment is not particularly limited, but is preferably within a range of 2 hours or longer and within 6 months, and more preferably within a range of 72 hours or longer and within 21 days.
  • the pressure which performs a transparency process is not specifically limited.
  • the processing container storing the biological material subjected to the transparent processing used in the above-described transparent processing step may be stored, for example, at room temperature or in a low temperature environment until it is subjected to an observation step described later (transparentization). Sample storage step).
  • observation process of transparent biological material The biological material that has been subjected to the clearing treatment is then subjected to an observation step using an optical microscope, for example. If necessary, the biological material to be subjected to the observation process may be subjected to a visualization process such as staining or marking before the transparentization process or after the transparentization process and before the observation process. .
  • the fluorescent protein gene is introduced into a living biological material before the transparentization processing step to express the fluorescent protein.
  • a visualization process step when the injection of a fluorescent chemical substance (excluding fluorescent protein) into a biological material or the staining of a biological material using a fluorescent chemical substance, the above transparentization process step is performed in advance. Although it is preferable to carry out, it can also carry out after the said transparentization process process. Furthermore, as a visualization process step, staining using a chemical substance other than the fluorescent chemical substance can be performed.
  • the observation process can be performed using any kind of optical microscope.
  • the observation step can be performed by applying a three-dimensional super-resolution microscope technique (for example, STED, 3D PALM, FPALM, 3D STROM, and SIM).
  • the observation step is preferably performed by applying a multiphoton excitation type (generally, a two-photon excitation type) optical microscope technique.
  • transparency means that the biological material before treatment and the biological material after treatment are compared, and the light transmittance (particularly visible light) is improved after treatment. This is one index.
  • the clearing treatment using the “biological material clearing reagent” according to the present invention is reversible. Therefore, the biological material subjected to the clearing treatment can be returned to the state before the clearing treatment by removing the components of the biological material clearing reagent by, for example, immersing in a balanced salt solution.
  • the balanced salt solution specifically refers to, for example, a balanced salt solution buffered with a phosphate such as PBS or HBSS; a balanced salt solution (TBS) buffered with Tris hydrochloride; an artificial cerebrospinal fluid. (ACSF); basal media for cell culture such as MEM, DMEM, and Ham's F-12;
  • the protein contained in the biological material is denatured. do not do. Therefore, the antigenicity of proteins and the like contained in biological materials is preserved without change. Therefore, for example, after making a biological material transparent and observing it with an optical microscope, the biological material is returned to the state before the transparent treatment and a detailed analysis using a general tissue staining or immunostaining technique is performed. It can also be done.
  • another aspect of the present invention is to clarify the biological material by infiltrating an equilibrium salt solution with respect to the biological material that has been clarified by the clarification treatment using the above-described “clearing reagent for biological material”.
  • a method for restoring a biological material comprising a step of returning to a previous state.
  • the “clearing treatment kit for biological material” includes the above-described “clearing reagent for biological material”.
  • the “clearing treatment kit for biological material” further includes a “processing container”, a “biological material gripping device (tweezers, etc.)” used in the above-described transparentizing process, and a biological material after the transparentizing treatment before the transparentizing treatment. You may provide at least one selected from the "balance salt solution” which returns to a state, and the "instruction manual of a kit.”
  • the instruction manual of the kit describes, for example, the procedure of the clearing treatment method as described in the above column (an example of the clearing treatment method using the biological material clearing reagent). .
  • the biological material clarification treatment system comprises the “clarification reagent for biological material” according to the present invention and the isolated “biological material”, and clarifies the “biological material”. Therefore, the “biological material clearing reagent” has infiltrated into the “biological material”. That is, the said processing system is a concept including the processing system containing the biological material in the middle stage of a transparentization process, or the processing system containing the biological material which the transparentization process was completed for example.
  • Example 1 Observation of brain section
  • Six-week old wild type (non-genetically modified) normal C57BL6 male mice were perfused with ice-cold PBS from the left ventricle using a peristaltic pump, and then ice-cold fixative (4% paraformaldehyde-PBS, pH 7. 4) was perfused to completely fix the whole body of the mouse.
  • mice skull was then removed and the entire brain was carefully removed.
  • the removed brain was immersed in an ice-cold fixative (4% paraformaldehyde-PBS, pH 7.4) overnight at 4 ° C.
  • the brain was then transferred into a 20% sucrose-PBS solution and gently shaken in an environment of 4 ° C. for 24 hours.
  • the brain was completely replaced with 20% sucrose-PBS solution, embedded in OCT-compound, and frozen with liquid nitrogen. Then, the frozen brain was transferred into PBS and thawed at room temperature. The thawed brain was again fixed again in 4% paraformaldehyde-PBS for 1 hour.
  • coronal slices (thickness 3 mm) containing the hippocampus were prepared from the refixed brain.
  • the coronal slice was cut into a right hemisphere slice and a left hemisphere slice at the center line.
  • One hemispherical slice was immersed in SCALE-A2 reagent for 48 hours and shaken at room temperature for clearing treatment.
  • the other hemispherical slice was immersed in the biological material clearing reagent U for 48 hours, and shaken at room temperature for clearing treatment.
  • a coronal slice having a thickness of 1.5 mm including the hippocampus was cut out from these coronal slices. The coronal slice obtained in this way was subjected to an observation process.
  • the SCALE-A2 reagent is an aqueous solution obtained by dissolving 4M urea, 0.1% (w / v) Triton X-100, 10% (w / v) glycerol in pure water.
  • the biological material clearing reagent U is an aqueous solution in which 4M urea, 0.1% (w / v) concentration Triton X-100, and 30% (w / v) concentration glycerol are dissolved in pure water.
  • a transmission spectrum of light in the wavelength range of 300 nm to 920 nm of the above-mentioned coronal slice having a thickness of 1.5 mm was measured using a spectrophotometer (manufactured by Hitachi, product name: U-3310 Spectrophotometer).
  • a coronal slice (thickness 3 mm) containing the hippocampus was prepared from the refixed brain. Next, the coronal slice was cut into a right hemisphere slice and a left hemisphere slice at the center line. One hemispherical slice was immersed in PBS for 48 hours and shaken at room temperature, and a 1.5 mm thick coronal slice containing hippocampus was prepared.
  • SCALE-A2 reagent biological material clearing reagent U, PBS, and water have almost the same transmission spectrum of light in the wavelength range of 300 nm to 920 nm.
  • Example 2 Clearing treatment of mouse fetus
  • Transgenic mice expressing Fucci-S-Green (Fucci-S / G 2 / M) and Fucci-G 1 -RED (Fucci-G 1 ) (RIKEN Brain Science Institute, Cell Function Search Technology) 13.
  • a mouse produced by the development team was able to self-breed, [Reference: Sakaue-Sawano et al., Cell, 132 (3): 487-98, 2008.] embryonic day 11.5, and 13.
  • the fetuses on the 5th day were fixed with 4 (v / w)% PFA-PBS for 2 days, then immersed in a 20 (v / w)% sucrose-PBS solution, and once frozen, thawed and then thawed again.
  • the mice were fixed with 4 (v / w)% PFA-PBS for 1 hour, and the transgenic mice expressed Fucci-S / G 2 / M expressing line # 504 and Fucci-G 1 Is obtained by crossing the line # 596
  • the cells green fluorescence in S / G 2 / M phase of the cell in the G 1 phase emits red fluorescence.
  • the line ⁇ 504 and line ⁇ 596, are those described in the above references Available to third parties.
  • the SCALE-A2 reagent contains urea as an active ingredient for the clarification treatment, like the biological material reagent U used in Examples 1 and 2.
  • Rabbit-derived anti-GFAP polyclonal antibody (Sigma) that recognizes intermediate filament GFAP (glial fibrillary acidic protein) was used as a primary antibody, reacted at 24C for 24 hours, and then rinsed with PBS.
  • anti-PSA-NCAM monoclonal antibody is an anti-mouse IgM antibody (Invitrogen, Molecular Probes) labeled with Alexa Fluor 546
  • GFAP polyclonal antibody is an anti-rabbit IgG antibody labeled with Alexa Fluor 633.
  • Immunohistochemical staining was performed by reacting at room temperature for 3 hours as Invitrogen (Molecular Probes). Since the fluorescence of these slices was not attenuated during this period, a triple fluorescence image including the fluorescence of GFP or YFP was obtained. The observation was performed with an 20 ⁇ objective lens (UplanApo20, Olympus) using an inverted confocal laser microscope (FV500, Olympus).
  • the pre-SCALE-A2 treatment (Before SCALE in the figure) and after treatment (After Recovery in the figure) were treated with an anti-PSA-NCAM monoclonal antibody and the juvenile present in the hippocampal dentate gyrus. Nerve cells and mossy fibers extending from the cells to the CA3 region were stained without substantial problems. Similarly, astroglia was stained without any problem with the anti-GFAP polyclonal antibody.
  • Example 3 Clearing treatment of mouse fetus
  • the embryo of day 14.5 of the same kind of transgenic mouse used in Example 2 is immersed in PBS, biomaterial clearing reagent U, and SCALE-A2 reagent, and shaken at room temperature for 7 days. Incubated.
  • the biological material clearing reagent U and SCALE-A2 reagent have the same composition as that used in Example 1.
  • FIG. A in FIG. 4 is a diagram comparing fetuses incubated with each solution by shaking at room temperature for 7 days.
  • the fetus When treated with PBS, the fetus was not almost transparent.
  • the clarification of the background other than the liver progressed and the background pattern was transmitted, and there was almost no difference in volume compared to the case of treatment with PBS.
  • SCALE-A2 reagent the clarification was slightly advanced, but it was swollen as compared with the treatment with PBS and the clarification reagent U for biological material.
  • B in FIG. 4 is a graph quantifying the degree of fetal swelling.
  • To measure the volume of the fetus add a fixed amount of solution to a container of the same shape and size, and immerse the fetus as a specimen one by one in the container. The fetal volume was measured using a micropipette. This was initial (measured by immersing each fetus in PBS in PBS), and immediately after the first volume measurement, immersed in fresh PBS, biological material clearing reagent U or SCALE-A2 reagent, 3 days later, 7 days later At each time point, the fetus was immersed after being replaced with a constant amount of a new solution, and the volume increased by the above method was measured. Each value was expressed as an average value of two fetuses used in each solution, with the volume at the time of Initial (0 day) as 100% and the volume at each time point relative to that value was calculated as a relative value.
  • the volume at the 7th day after the start of immersion in each solution was 98.0% of the initial for PBS, 125.3% of the initial for SCALE-A2 reagent, and cleared for biological materials.
  • Reagent U it changed to 106.1% of Initial. That is, it was confirmed that the volume change rate of the mouse embryo on day 14.5 of the embryo was smaller than that of the SCALE-A2 reagent by using the biological material clearing reagent U, and the clearing was also progressing. confirmed.
  • Example 4 Clarification treatment of cerebral slice of mouse
  • a slice containing a hippocampal region with a thickness of 3 mm was prepared using an acrylic brain slicer (Muromachi Kikai).
  • an acrylic brain slicer Moromachi Kikai
  • the position of 3 mm toward the front of the cerebrum was cut across both hemispheres with the last part of the left and right center lines as the reference position.
  • the four cerebral slices obtained from substantially the same position including the hippocampal region of the four individuals were divided almost equally to the left and right with respect to the center line to obtain eight slices.
  • the biological material clearing reagent U1 is an aqueous solution in which 4M urea, 0.1% (w / v) Triton X-100, and 25% (w / v) glycerol are dissolved in pure water. .
  • a result is shown to (a) in FIG.
  • it is expressed as an image in which the direction of both hemispheres is aligned by inverting the direction of the right hemisphere image on the left side of the image after shooting. did.
  • the clarification reagent U2 for biological material is an aqueous solution in which 6M urea, 0.1% (w / v) Triton X-100, and 25% (w / v) glycerol are dissolved in pure water.
  • the clarification reagent U3 for biological material is an aqueous solution in which 6M urea, 0.1% (w / v) Triton X-100, and 15% (w / v) glycerol are dissolved in pure water. The results are shown in the upper part of (b) in FIG.
  • the clarification reagent U4 for biological material is an aqueous solution in which 8M urea, 0.1% (w / v) Triton X-100, and 25% (w / v) glycerol are dissolved in pure water.
  • the clarification reagent U5 for biological material is an aqueous solution in which 8 M concentration urea, 0.1% (w / v) concentration Triton X-100, and 15% (w / v) concentration glycerol are dissolved in pure water. The results are shown in the lower part of (b) in FIG.
  • the present invention can provide a novel biomaterial clarification reagent using a component having higher bioaffinity as an active ingredient, and use thereof.

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Abstract

　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、かつ、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む、溶液である。

Description

生物材料用透明化試薬、及びその利用
　本発明は、生物材料用の透明化試薬、及びその利用に関する。
　光学顕微鏡を用いて不透明な組織内部を観察する際には、透明化試薬を用いた前処理（透明化処理）が行われる。
　透明化試薬及び前処理方法としては、例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載のAnn-Shyn ChiangによるFocus Clear（商品名）溶液、或いは非特許文献２に記載のHans-Ulrich Dodtらのtissue clearing methodが代表的なものとして知られている。これらは何れも、組織を透明化することで、組織中に存在する蛍光物質を観察する目的で使用される。
米国特許第６４７２２１６号公報（特許日２００２年１０月２９日）
Ann-Shyn Chiang et al.: Insect NMDA receptors mediate juvenile hormone biosynthesis. PNAS 99(1), 37-42 (2002). Hans-Ulrich Dodt et al.: Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 4 (4), 331-336 (2007).
　上記の方法は何れも、透明化処理の有効成分等として有機溶剤が必須であるため、生組織に用いることは難しく、適用対象が専ら固定化サンプルに限定されるという問題がある。また、透明化処理の対象となる生物材料の収縮を引き起こしうるという問題がある。
　本発明に先立ち、本願発明者らは、尿素を用いれば、生物材料を透明化することが出来ることを見出している。尿素は、生物親和性に優れた成分であるため、透明化処理の有効成分として尿素又は尿素誘導体を用いれば、上記の問題を解決しうる。
　本願発明者らは、さらに、尿素又は尿素誘導体を用いて、脆弱な組織に対しても組織の変形等の虞をより低減しうる透明化処理方法の開発という課題に着手した。
　本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、有効成分として尿素又は尿素誘導体を用いた新規な生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、透明化処理の有効成分として尿素又は尿素誘導体を含む溶液に、所定の濃度以上のグリセロールを共存させることによって、脆弱な組織に対しても組織の変形等がより確実に抑制可能となることを見出した。これにより、本願発明を想到するに至った。
　すなわち、本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記の課題を解決するために、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、かつ、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む、溶液であることを特徴としている。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記構成を前提として、上記化合物として尿素を含む、溶液である。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記構成を前提として、水溶液である。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記何れかの構成を前提として、界面活性剤を含んでいる。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤である。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種である。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記何れかの構成を前提として、水溶性の高分子化合物をさらに含む。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、水溶性の上記高分子化合物が、パーコール（登録商標）、フィコール（登録商標）、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種である。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記何れかの構成を前提として、グリセロールを２７（ｗ／ｖ）％以上で３３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記何れかの構成を前提として、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、上記界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含む。
　本発明に係る生物材料用透明化試薬は、上記何れかの構成を前提として、多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものである。
　本発明に係る生物材料透明化処理システムは、上記の課題を解決するために、上記何れかの生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤していることを特徴としている。
　本発明に係る生物材料の透明化方法は、上記の課題を解決するために、上記何れかの生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴としている。
　本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、上記何れかの生物材料用透明化試薬を含むことを特徴としている。
　本発明は、有効成分として尿素又は尿素誘導体を用いた生物材料用透明化試薬であって、透明化処理による組織の変形等をより確実に抑制可能なもの、及びその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
本発明の一実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの脳スライスを透明化処理した後に、当該脳スライスの光の透過率を測定した結果を示す図である。 本発明の他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの胎仔を処理した結果を示す図である。 本発明の参考例に関し、尿素を主成分として含む生物材料用透明化試薬で透明化処理をする前の生物材料と、透明化処理後に処理前の状態に回復させた生物材料とに対して行った免疫染色の結果を示す図である。 本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの胎仔を処理した結果を示す図である。 本発明のさらに他の実施例に関し、本発明に係る生物材料用透明化試薬でマウスの大脳のスライスを処理した結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　（生物材料用透明化試薬の有効成分）
　本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」とは、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素」を含む、溶液である。
　本発明にかかる他の態様における「生物材料用透明化試薬」は、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素誘導体」を含む、溶液である。
　上記尿素誘導体の種類は特に限定されないが具体的には例えば、各種のウレイン、又は、下記の一般式（１）に示す化合物である。なお、一般式（１）に示す化合物には一部のウレインが含まれる。本発明にかかる生物材料用透明化試薬は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含んでいればよいが、これらの中で尿素を含むことがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一般式（１）に示す尿素誘導体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立に水素原子（但し、Ｒ１～Ｒ４の全てが水素原子の場合は尿素自体に相当するので除かれる）、ハロゲン原子、又は炭化水素基であり、炭化水素基を構成する炭素原子が複数個ある場合には当該炭素原子の一部が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子により置換されていてもよい。炭化水素基としては、鎖状炭化水素基、及び環状炭化水素基が含まれる。
　上記鎖状炭化水素基として、例えば、鎖状アルキル基、鎖状アルケニル基、及び鎖状アルキニル基等が例示される。鎖状炭化水素基を構成する炭素数は特に限定されないが、例えば、６以下の直鎖状又は分岐状のものが挙げられ、好ましくは炭素数が１～３のアルキル基である。鎖状炭化水素基は、例えば、ハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。鎖状アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｉｓｏ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。
　上記環状炭化水素基として、例えば、シクロアルキル基、及びシクロアルケニル基等が例示される。環状炭化水素基は、例えばハロゲン原子等の置換基を有していてもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。シクロアルケニル基の例としては、シクロヘキセニル基等の、炭素数が３以上で、好ましくは６以下のものが挙げられる。
　上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　また、一般式（１）に示す尿素誘導体のより好ましい具体例は、以下の１）～２）に示す通りである。
１）Ｒ１～Ｒ４より選択される任意の３つの基が水素原子であり、残りの１つの基がハロゲン原子、又は炭素数１～６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの１つの基が、炭素数１～３、又は炭素数が１～２のアルキル基である。
２）Ｒ１～Ｒ４より選択される任意の２つの基が水素原子であり、残りの２つの基が互いに独立にハロゲン原子、又は炭素数１～６以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの２つの基が何れも、炭素数１～３、又は炭素数が１～２のアルキル基である。なお、水素原子となる２つの基の一方はＲ１、Ｒ２の何れかから選ばれ、他方はＲ３、Ｒ４の何れかから選ばれることがより好ましい。
　本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の上記化合物を１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含む。当該化合物の濃度は、好ましくは３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内であり、より好ましくは３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。
　（有効成分として尿素等を用いる利点）
　尿素は、毒性が極めて低い生体由来の成分である。そのため、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、１）固定化された生物材料はもとより、固定化されていない（生きた）生物材料の透明化にも用いうるものとなる。２）また、尿素は、蛍光タンパク質へのダメージ、及びその蛍光の消失が比較的少なく、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適用しうるものとなる。３）尿素は、極めて安価で入手容易でもあり、かつ取扱い性に優れるため、極めて低コストかつ簡単な手順で透明化処理を行いうるものとなる。
　また、上記の利点に加えて、４）従来の生物材料用透明化試薬と比較して、光散乱性が高い不透明な生物材料の透明性を格段に向上させることができ、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。５）特に脳組織では、これまで深部観察のバリアーであった白質層を透明化することが可能となり、白質層より深部に位置する領域（例えば脳梁）の観察が可能となる。６）本発明の試薬による透明化処理は可逆的である。具体的には、透明化処理後の生物材料を平衡塩類溶液に浸漬するのみで、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。透明化処理の前後においてタンパク質等の抗原性も変化せずに保存されるため、通常の組織染色、及び免疫染色の手法を用いた分析が可能である。
　なお、尿素に代えて上記した尿素誘導体を用いることによっても、同様の利点が得られうる。
　（グリセロール）
　本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」は、必須の成分として「グリセロール」を含む。「生物材料用透明化試薬」は、グリセロールを、２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む。グリセロールは通常は乾燥抑制成分として用いられ、その場合には２０（ｗ／ｖ）％以下の濃度で充分な効果を示す。しかし、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上の濃度で含むことにより、透明化処理を受ける生物材料の変形等がより確実に抑制可能となる。その結果、生物材料が極めて脆弱な組織であったとしてもその損傷及び変形を抑制しつつ透明化処理を行いうる。また、透明化処理を迅速に行う観点では、グリセロールの濃度を３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内とする。グリセロールの濃度は好ましくは、２５（ｗ／ｖ）％以上で３３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内であり、より好ましくは２７（ｗ／ｖ）％以上で３３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内である。グリセロールがこれらの濃度範囲の場合、本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」は、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の上記化合物の濃度は好ましくは３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内であり、より好ましくは３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、さらに好ましくは３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。グリセロールの濃度と、尿素等の濃度とがいずれも上記範囲内にある場合は、特に、透明化処理のスピードと生物材料の変形抑制の効果とが両立する。
　また、グリセロールは免疫応答による拒絶が比較的低く、かつ網内系によるトラップが比較的生じ難く肝臓並びに腎臓等に蓄積する虞が比較的低い。そのため、生物材料としての生体に上記「生物材料用透明化試薬」を適用し易いという利点がある。さらに、グリセロールは比較的安価であるという利点もある。
　（界面活性剤）
　本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、生物組織への本試薬の侵入を緩やかに向上させるという理由から、非イオン性の界面活性剤が好ましい。非イオン性の界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の脂肪酸系；ポリビニルアルコール等の高級アルコール系；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系の界面活性剤が挙げられる。具体的には、例えば、TritonX－100、及びTritonX-140等のTritonX（登録商標）シリーズ；Ｔween－20、Tween-40、Tween-60、及びTween-80等のＴween（登録商標）シリーズ；NP-40（商品名）；からなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。界面活性剤は、必要に応じて、二種以上を混合して使用することもできる。
　これら界面活性剤は、尿素の、生物材料に対する浸透性を高め、透明化処理の効率を向上させうる。特に、脳組織の白質層等、のように、透明化処理が比較的困難な生物材料の透明化を行う場合には、「生物材料用透明化試薬」は界面活性剤を含むことが好ましい。
　なお、上記界面活性剤は、尿素に対するのと同様に、生物材料に対する尿素誘導体の浸透性を高めうる。
　（水溶性の高分子化合物）
　本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて水溶性の高分子化合物をさらに含んでいてもよい。ここで、高分子化合物とは、分子量が例えば５万～６万程度以上の大きさであって、細胞内に実質的に侵入しないものである。また、高分子化合物は、生物材料の変性等を引き起こさないものが好ましい。水溶性の高分子化合物として、具体的には、例えば、架橋型シュークロース高分子物質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はパーコール（商品名。コロイド状シリカをポリビニルピロリドン皮膜で被覆した高分子物質）等が挙げられる。架橋型シュークロース高分子物質として、具体的には例えば、フィコール（Ficoll）ＰＭ７０（商品名））のような、シュークロースをエピクロルヒドリンで架橋（共重合）した重量平均分子量約７万の高分子物質等が挙げられる。
　これら水溶性の高分子化合物は、尿素及び尿素誘導体とは異なり細胞内に浸入することがなく、また水溶性であるから、細胞内外の浸透圧差の調整に寄与すると考えられる。そのため、透明化処理の対象となる生物材料の原型維持に寄与し、とりわけ、生物材料の膨張の防止に寄与する。特に限定されないが、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の浸透圧が比較的高い場合には、当該試薬はこれら水溶性の高分子化合物を含むことが好ましい。
　（その他の成分）
　本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、ならびにマクロゴールから選択される少なくとも一種の化合物を「乾燥抑制成分」として含むことができる。乾燥抑制成分は、透明化処理の対象となる生物材料の乾燥を防止する。とりわけ、透明化処理後に光学顕微鏡による観察に供されるまでの時間が比較的長い場合、或いは、光学顕微鏡による長時間観察に供される場合には、本発明の試薬は、上記の乾燥抑制成分を含むことが好ましい。なお、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、所定濃度のグリセロールを必須の成分として含むが、グリセロールは乾燥抑制作用も有する。したがって、当該生物材料用透明化試薬は、上記乾燥抑制成分を別途含まなくとも相応以上の乾燥抑制効果を有している。
　また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、上述した「尿素及び／又は尿素誘導体」、「界面活性剤」及び「水溶性の高分子化合物」以外に、例えば、ｐＨ調整剤、及び浸透圧調整剤等の添加剤を必要に応じて含んでいてもよい。
　（溶媒）
　本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、尿素が可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、尿素が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された「生物材料用透明化試薬」を、水溶液としての「生物材料用透明化試薬」と称する。
　なお、水を主溶媒として用いた場合には、例えば、固定化した標本にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を水と混合し用いてもよい。例えば固定化した標本にＤＭＳＯを混合して用いれば、生物材料に対する試薬の浸透性の向上、及び角質表面を有する組織の透明化処理促進等の効果が期待される。
　溶媒として水を用いる主な利点は、以下の通りである。１）本発明に係る「生物材料用透明化試薬」の有効成分である尿素は水への溶解性に優れているため、生物材料用透明化試薬の調製が容易かつ低コストとなる。２）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる。３）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる。４）固定化された材料に限定されず、生材料の透明化処理に適用可能となる。５）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる。６）有機溶剤を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
　また、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液であってもよい。さらに、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」は、透明化処理の対象となる生物材料の変形をさらに抑制し、かつ生物材料内に尿素が充分に浸透する程度に、その浸透圧が調整されていてもよい。
　なお、尿素誘導体に関しても、尿素と同様の上記溶媒を用いることができる。
　（組成物の量的関係）
　本発明に係る「生物材料用透明化試薬」における「尿素」の含有量は、１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内であれば特に限定されない。なお、「尿素」の含有量の上限は、使用する溶媒に対する尿素の溶解度により決定される。対象とする生物材料の種類にも依存するが、例えば、「生物材料用透明化試薬」における尿素の含有量が比較的少ない場合には処理時間を長くし、尿素の含有量が比較的多い場合には処理時間を短くすることで必要な透明化処理を行うことができる。
　また、「界面活性剤」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する界面活性剤の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　また、「水溶性の高分子化合物」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、２．５(ｗ／ｖ)％以上で４０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。また、生物材料の膨張抑制効果と透明化処理後の屈折率とのバランスという観点では、上記含有量は、５（ｗ／ｖ）％以上で２５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０（ｗ／ｖ）％以上で２０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、１０（ｗ／ｖ）％以上で１５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「水溶性の高分子化合物」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　また、上記「乾燥抑制成分」を使用する場合、その含有量は特に限定されないが、０（ｗ／ｖ）％を超え１０（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが好ましく、１（ｗ／ｖ）％以上で７（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことがより好ましく、２．５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことが特に好ましい。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「生物材料用透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「乾燥抑制成分」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
　（対象となる生物材料）
　本発明の「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料又は動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類（哺乳動物）等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
　また、生物材料は、個体そのものであってもよく（生きているヒト個体そのものは除く）、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、或いは細胞であってもよい。本発明の「生物材料用透明化試薬」は優れた透明化処理能力を有するので、生物材料が、多細胞動物由来の組織又は器官（例えば、脳全体又はその一部）、或いはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても透明化処理を適用可能である。本発明の「生物材料透明化試薬」は、生物材料の変形を抑制する効果が極めて大きいため、脆弱な生物材料の透明化に特に好適である。ここで脆弱な生物材料とは、植物細胞を除く細胞、発生初期段階の動物胚、幹細胞や初代培養細胞、株化細胞を特殊な培養環境で３次元的に生育させた塊(spheroid, neurosphere, cell aggregatesなど) 等が挙げられる。
　また、上記の生物材料は、顕微鏡観察用に固定化（fixed）処理された材料であってもよく、固定化されていない材料であってもよい。なお、固定化された材料を用いる場合には、固定化処理後に、例えば２０（ｖ／ｗ）％ショ糖－ＰＢＳ溶液に、充分に（例えば、２４時間以上）浸漬する処理を行うことが好ましい。さらに、当該材料をOCT　compundに包埋して液体窒素で凍結後、ＰＢＳ中で解凍し、４（ｖ／ｗ）％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）－ＰＢＳ液で再度固定する処理を行うことが好ましい。
　上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
　（生物材料用透明化試薬の特に好適な組成の一例）
　本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」の特に好適な組成の例示は以下の通りである。これらの透明化試薬は、特に、マウス等の哺乳動物の発生初期段階の胚を透明化処理する目的で、極めて好適である。
・生物材料用透明化試薬（１）：
　水に、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で溶解し、かつ、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。
・生物材料用透明化試薬（２）：
　水に、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、さらにグリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。
・生物材料用透明化試薬（３）：
　水に、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、TritonX-100）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、さらに「水溶性の高分子化合物（例えば、Ficoll）」を２．５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。
・生物材料用透明化試薬（４）：
　水に、尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤（例えば、ＴritonＸ－１００）を０．０５（ｗ／ｖ）％以上で０．２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を８（ｗ／ｖ）％以上で１２（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含んでなる水溶液。
　上記何れの生物材料用透明化試薬（１）～（４）においても、グリセロールの濃度は好ましくは、２５（ｗ／ｖ）％以上で３３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内であり、より好ましくは２７（ｗ／ｖ）％以上で３３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内である。また、上記何れの生物材料用透明化試薬（１）～（４）においても、尿素の濃度は好ましくは３．５Ｍ以上で４．５Ｍ以下の範囲内であり、より好ましくは３．７Ｍ以上で４．３Ｍ以下の範囲内である。
　なお、尿素に代えて尿素誘導体（又は尿素と尿素誘導体との混合物）を用いる場合には、上記した尿素と同じ濃度で尿素誘導体等を用いて、生物材料用透明化試薬（１）～（４）を調製すればよい。
　（生物材料用透明化試薬の調製）
　本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」の調製方法は、「尿素及び／又は尿素誘導体」、「グリセロール」、並びに、必要に応じて用いる「界面活性剤」、「水溶性の高分子化合物」、及び「乾燥抑制成分」等を、溶媒中に溶解することで調製される。溶媒中に溶解、又は混合する手順は特に限定されない。
　（生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理法の一例）
　本発明にかかる「生物材料用透明化試薬」を用いた生物材料の透明化処理方法は、上記の「生物材料」に対して「生物材料用透明化試薬」を浸潤させる工程（透明化処理工程）を含む方法である。より具体的には、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
　上記の透明化処理工程において、透明化処理用の容器内に「生物材料用透明化試薬」と「生物材料」とを格納する順序は特に限定されないが、まず「生物材料用透明化試薬」を格納し、次いで「生物材料」を格納する（すなわち、生物材料用透明化試薬に生物材料を投入する）ことが好ましい。
　上記の透明化処理工程を行う処理温度は特に限定されないが、１５℃以上で４５℃以下の範囲内であることが好ましい。また、透明化処理を行う処理時間は、特に限定されないが、２時間以上で６ヶ月以内の範囲内であることが好ましく、７２時間以上で２１日以内の範囲内であることがより好ましい。また、透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
　上記の透明化処理工程で用いた、透明化処理された生物材料を格納した処理容器は、後述する観察工程に供されるまで、例えば、室温又は低温環境下で保存してもよい（透明化試料保存工程）。
　（透明化処理された生物材料の観察工程）
　透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、上記透明化処理工程の事前に、又は透明化処理工程後で観察工程前に、染色或いはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
　例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化処理工程の事前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。
　また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、又は蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、上記透明化処理工程の事前に行うことが好ましいが、上記透明化処理工程後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。
　観察工程は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、観察工程は、３次元超分解顕微鏡技術（例えば、ＳＴＥＤ、３Ｄ　ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ　ＳＴＯＲＭ、及びＳＩＭ）を適用して行うこともできる。また、観察工程は、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して行うことが好ましい。
　なお、本発明において、透明化（処理）とは、処理前の生物材料と処理後の生物材料とを比較して、処理後の方が光（特に可視光）の透過度が向上することを一つの指標とするものである。
　（その他の応用）
　本発明に係る「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、生物材料透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。ここで、平衡塩類溶液とは、具体的には例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液(TBS)；人工脳脊髄液(ACSF)；MEM, DMEM, 及びHam’s F-12などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。
　上記「生物材料用透明化試薬」を用いた場合、透明化処理の前後において、或いは、透明化処理後に透明化処理前の状態に戻す場合において、生物材料に含まれるタンパク質等の変性等を招来しない。そのため、生物材料に含まれるタンパク質等の抗原性も変化せずに保存される。そのため、例えば、生物材料を透明化処理して光学顕微鏡による観察を行った後に、当該生物材料を透明化処理前の状態に戻して汎用の組織染色、又は免疫染色の手法を用いた詳細分析を行うことなども可能となる。
　すなわち、本発明の他の観点は、上記「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理により透明化した生物材料に対して、平衡塩類溶液を浸潤することにより上記生物材料を透明化処理前の状態に戻す工程、を含む生物材料の復元方法である。
　（生物材料用透明化処理キット）
　本発明にかかる「生物材料用透明化処理キット」は、上記の「生物材料用透明化試薬」を備える。「生物材料用透明化処理キット」は、さらに、上記の透明化処理工程で用いる「処理容器」、「生物材料把持器具（ピンセット等）」、透明化処理後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す「平衡塩類溶液」、及び「キットの取扱説明書」から選択される少なくとも一つを備えていてもよい。なお、キットの取扱説明書には、例えは、上記（生物材料用透明化試薬を用いた透明化処理法の一例）欄に記載したような、透明化処理方法の手順等が記載されている。
　（生物材料透明化処理システム）
　本発明に係る生物材料透明化処理システムは、本発明に係る「生物材料用透明化試薬」と、単離された上記「生物材料」とを含んでなり、この「生物材料」を透明化するために当該「生物材料」の内部に「生物材料用透明化試薬」が浸潤したものである。すなわち、当該処理システムとは、例えば、透明化処理の途中段階にある生物材料を含む処理システム、又は、透明化処理が完了した生物材料を含む処理システムを包含する概念である。
　本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
　〔実施例１：脳切片の観察〕
　（全身固定工程）
　生後６週齢の野生型（非遺伝子改変）の正常C57BL6系統雄マウスを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷ＰＢＳを灌流した後、氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ,　ｐＨ７．４）を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
　（生物材料の摘出及び固定工程）
　次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、脳全体を注意深く摘出した。そして、摘出した脳を氷冷固定液（４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ,　ｐＨ７．４）に一晩、４℃の環境下で浸漬した。その後、この脳を、２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液中に移し２４時間、４℃の環境下で緩やかに振盪した。
　次いで、上記脳を２０％　シュークロース－ＰＢＳ溶液で完全に置換した後、ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。そして、凍結後の脳を、ＰＢＳ中に移し室温で解凍した。解凍後の脳は、再び、４％　パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ中で１時間再固定した。
　（生物材料の透明化処理及び観察工程）
　最後に、再固定した脳から海馬を含む冠状断スライス（厚さ３ｍｍ）を作成した。次いで、この冠状断スライスを、中央線で右半球側スライスと左半球側スライスとに切断した。そして一方の半球側スライスをＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で４８時間、浸漬し、室温で振盪して透明化処理を行なった。また、他方の半球側スライスを生物材料用透明化試薬Ｕで４８時間、浸漬し、室温で振盪して透明化処理を行なった。次いで、これらの冠状断スライスから、海馬を含む厚さ１．５ｍｍの冠状断スライスを切り出した。このようにして得た冠状断スライスを観察工程に供した。
　なお、上記ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬は、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。上記生物材料用透明化試薬Ｕは、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、３０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。
　観察工程は、分光光度計（日立製：製品名U-3310 Spectrophotometer）を用いて、１．５ｍｍ厚の上記冠状断スライスの、３００ｎｍ～９２０ｎｍの波長域の光の透過スペクトルを測定した。
　なお、参考例として、再固定した脳から海馬を含む冠状断スライス（厚さ３ｍｍ）を作成した。次いで、この冠状断スライスを、中央線で右半球側スライスと左半球側スライスとに切断した。そして一方の半球側スライスをＰＢＳで４８時間、浸漬し、室温で振盪した後に得た、海馬を含む厚さ１．５ｍｍの冠状断スライスを準備した。
　観察の結果は、図１に示す。同図中の「Ｕ」は、生物材料用透明化試薬Ｕで処理した実施例の結果であり、「ＳＣＡＬＥ－Ａ２」はＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬で処理した結果であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳで処理した参考例の結果である。同図に示すように、波長による相違は見られるものの、「Ｕ」及び「ＳＣＡＬＥ－Ａ２」は、参考例と比較して透明化されていることが確認された。
　なお、データは示さないが、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬、生物材料用透明化試薬Ｕ、ＰＢＳ、及び水は、３００ｎｍ～９２０ｎｍの波長域の光の透過スペクトルがほぼ等しい。
　〔実施例２：マウス胎仔の透明化処理〕
　Ｆｕｃｃｉ－Ｓ－Ｇｒｅｅｎ（Ｆｕｃｃｉ－Ｓ／Ｇ２／Ｍ）とＦｕｃｃｉ－Ｇ1－ＲＥＤ（Ｆｕｃｃｉ－Ｇ1）とを発現するトランスジェニックマウス（理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。[参考文献: Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.]の胎生１１．５日目、及び１３．５日目の胎仔を、４（ｖ／ｗ）％ ＰＦＡ－ＰＢＳで２日固定後に２０（ｖ／ｗ）％ショ糖-PBS溶液に浸漬し、一旦凍結後に解凍を行った。この後、再び４（ｖ／ｗ）％ＰＦＡ－ＰＢＳで1時間固定を行った。上記トランスジェニックマウスは、Ｆｕｃｃｉ－Ｓ／Ｇ２／Ｍを発現しているライン♯５０４と、Ｆｕｃｃｉ－Ｇ1を発現しているライン♯５９６とを交配して得たものであり、細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期にある細胞が緑色蛍光を、Ｇ1期にある細胞が赤色蛍光を発する。なお、ライン♯５０４とライン♯５９６とは、上記参考文献に記載されたものであり、第三者が入手可能である。
　その後、実施例１と同じ生物材料用透明化試薬Ｕに、これら胎仔を３ヶ月間浸漬することで透明化処理を行った。
　次いで、アガロースゲル（濃度０．５％（ｗ／ｖ）以下）中に上記胎仔を封入し、共焦点三次元蛍光顕微鏡（macro zoom LSCM(AZ-C1)：Nikon社製）で、所定の励起光を当てて観察を行った。なお、撮像に用いた対物レンズ（AZ-Plan Flour, N.A.＝0.2, W.D＝45mm）の倍率は２倍である。
　観察の結果は、図２に示す。同図に示すように、本実施例に係る生物材料用透明化試薬で透明化処理を行うことでマウス胎仔の全身が顕著に透明になった。その結果、胎仔の各部位を構成する細胞について細胞周期の状態を検出可能となり、全身の３次元的な細胞周期マップを作成することが可能となった。また、透明化処理の工程において、マウス胎仔の体積変化（膨潤）が実質的に起こらなかった。
　〔参考例１：透明化処理後の組織の回復〕
　ＧＦＰトランスジェニックマウスおよびＹＦＰトランスジェニックマウス(GFP-M lineおよびYFP-H line, 米国ハーバード大学Josh Sanes教授より供与されたもの)の海馬より2.5 ｍｍ厚のスライスを作製し、一旦ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬（実施例１参照）による透明化処理を５日間行って透明化した後、ＰＢＳで３回リンスして不透明状態の組織に戻した際の免疫染色性を、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬による透明化処理前のものと比較した。
　なお、上記ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬は、実施例１～２で用いた生物材料用試薬Ｕと同様に、透明化処理の活性成分として尿素を含んでいる。
　免疫染色には幼若な神経細胞の表面に存在するPSA-NCAMのポリシアル酸を認識するマウス由来抗PSA-NCAM（polysialilated neural cell adhesion molecule）モノクローナル抗体(Millipore社)と、アストログリアに特異的な中間径フィラメントGFAP（glial fibrillary acidic protein）を認識するウサギ由来抗GFAPポリクローナル抗体(Sigma社)とを１次抗体として用い、２４時間４℃で反応させた後にＰＢＳでリンスした。その後、抗PSA-NCAMモノクローナル抗体は、Alexa Fluor 546で標識された抗マウスIgM抗体（Invitrogen, Molecular Probes社）を、GFAPポリクローナル抗体はAlexa Fluor 633で標識された抗ウサギIgG抗体を２次抗体（Invitrogen, Molecular Probes社）として室温で３時間反応させることで免疫組織染色を行った。これらのスライスの蛍光はこの間減衰することはなかったため、ＧＦＰあるいはＹＦＰの蛍光を含めた３重蛍光像が得られた。観察は倒立型共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus社)を用いて２０倍の対物レンズ(UplanApo20, Olympus社)により行った。
　図３に示すように、ＳＣＡＬＥ－Ａ２の処理前（図中でBefore SCALE）、処理後（図中でAfter Recovery）ともに、抗PSA-NCAMモノクローナル抗体によって、海馬歯状回に存在する幼若な神経細胞とその細胞からCA3領域へと伸長した苔状線維とが実質的な問題なく染色された。また同様に、抗GFAPポリクローナル抗体によって、アストログリアも問題なく染色された。
　〔実施例３：マウス胎仔の透明化処理〕
　実施例２で用いたものと同種のトランスジェニックマウスの胎生１４．５日目の胎仔を、ＰＢＳ、生物材料用透明化試薬Ｕ、及びＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬中に浸漬し、室温で７日間振盪することでインキュベーションした。なお、生物材料用透明化試薬Ｕ、及びＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬は、実施例１で用いたものと同一組成である。
　インキュベーションした結果を図４に示す。図４中のＡは、それぞれの溶液で室温で７日間振盪してインキュベーションした胎仔を比較した図である。ＰＢＳで処理した場合は胎仔がほぼ透明化していなかった。生物材料用透明化試薬Ｕの場合は肝臓以外の透明化が進み背景のパターンが透過しており、かつＰＢＳで処理した場合と比較してほぼ体積に差がなかった。これに対して、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬の場合はやや透明化が進んでいるが、ＰＢＳおよび生物材料用透明化試薬Ｕの処理と比較すると膨潤していた。
　図４中のＢは、胎仔の膨潤の程度を数値化したグラフである。胎仔の体積の測定はすべて同様な形状かつ同様なサイズの容器に一定量の溶液を加えておき、そこに検体である胎仔を一つずつ浸漬し、増加した分の液量をその時点での胎仔の体積としてマイクロピペットを用いて計量することで行った。これをInitial(０day, それぞれの胎仔をＰＢＳに浸漬して測定)、最初の体積測定後にすぐに新しいＰＢＳ、生物材料用透明化試薬ＵあるいはＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬に浸漬し３日後、７日後の各時点でその都度一定量の新たな溶液に入れ換えた後に胎仔を浸漬し、上記方法によって増加した体積を測定した。それぞれの値はInitial(０day)の時点の体積を１００％としてその値に対する各時点の体積を相対値として計算し、各溶液に用いた２匹の胎仔の平均値として表した。
　各溶液に浸漬を開始して７日目の時点での体積は、それぞれ、ＰＢＳの場合はInitialの９８．０％、ＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬の場合はInitialの１２５．３％、生物材料用透明化試薬Ｕの場合はInitialの１０６．１％と変化した。すなわち、生物材料用透明化試薬Ｕを用いることで胎生１４．５日目のマウス胎仔の体積変化率はＳＣＡＬＥ－Ａ２試薬の場合よりも小さいことが確認され、透明化も進行していることが確認された。
　〔実施例４：マウスの大脳スライスの透明化処理〕
　まず、８週齢の野生型C57BL6/J系統マウス（日本エスエルシーより購入）４匹を用いて、アクリル製のbrain slicer（室町機械製）により、厚さ３ｍｍの海馬領域を含むスライスを作製した。この際、左右の中心線の最後部を基準位置として大脳の前方向に向かって３mmの位置を両半球にわたって切断した。次いで、この４つの個体の海馬領域を含むほぼ同位置から得られた４枚の大脳スライスを中心線を基準に左右にほぼ均等に分断して８つのスライスとした。
　次いで、上記８つのスライスのうち３つのスライスを、氷冷固定液、上記生物材料用透明化試薬Ｕ、及び生物材料用透明化試薬Ｕ１に浸漬し、室温で６日間振盪することでインキュベーションした。なお、これら３つのスライスは、浸漬処理前の大きさがほぼ同じであった。上記の氷冷固定液は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）－ＰＢＳである。また、生物材料用透明化試薬Ｕ１は、４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。結果を図５中の（ａ）に示す。なお、比較を容易にするために、左右に分断したスライスの画像のうち、撮影後の画像で向かって左側にあった右半球の画像の方向を反転し両半球の向きを揃えた画像として表現した。
　また、上記８つのスライスのうち２つのスライスを、生物材料用透明化試薬Ｕ２及びＵ３（参考例）に浸漬し、室温で６日間振盪することでインキュベーションした。なお、これら２つのスライスは、１枚の大脳のスライスを左右にほぼ均等に分断したものであって浸漬処理前の大きさはほぼ同じであった。生物材料用透明化試薬Ｕ２は、６Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。生物材料用透明化試薬Ｕ３は、６Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１５％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。結果を図５中の（ｂ）の上段に示す。
　さらに、上記８つのスライスのうち２つのスライスを、生物材料用透明化試薬Ｕ４及びＵ５（参考例）に浸漬し、室温で６日間振盪することでインキュベーションした。なお、これら２つのスライスは、１枚の大脳のスライスを左右にほぼ均等に分断したものであって浸漬処理前の大きさはほぼ同じであった。生物材料用透明化試薬Ｕ４は、８Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。生物材料用透明化試薬Ｕ５は、８Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１５％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。結果を図５中の（ｂ）の下段に示す。
　生物材料用透明化試薬Ｕ、Ｕ１、Ｕ２、及びＵ４に浸漬したスライスは何れも透明化が起こっていた。なお、スライスの場合、皮膚に覆われた胎仔マウス全身のように水分の侵入が徐々に起こる場合とは異なり、切断面から一時期に多くの水分の侵入が生じる。従って胎仔マウス全身の場合に比べて膨潤の程度が大きい。こうした条件であることを理解した上で、生物材料用透明化試薬Ｕ２とＵ３、Ｕ４とＵ５とを夫々比較すると、生物材料用透明化試薬Ｕ２及びＵ４の方が、生物材料用透明化試薬Ｕ３及びＵ５よりもスライスの膨潤が顕著に抑制されていた。
　本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明は、有効成分として生物親和性のより高い成分を用いた新規な生物材料用透明化試薬、及びその利用を提供することが出来る。

Claims (14)

  1. 　尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を１Ｍ以上で８．５Ｍ以下の範囲内の濃度で含み、かつ、グリセロールを２５（ｗ／ｖ）％以上で３５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含む、溶液であることを特徴とする生物材料用透明化試薬。
  2. 　上記化合物として尿素を含む、溶液であることを特徴とする請求項１に記載の生物材料用透明化試薬。
  3. 　水溶液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生物材料用透明化試薬。
  4. 　界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
  5. 　上記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤であることを特徴とする請求項４に記載の生物材料用透明化試薬。
  6. 　上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX（登録商標）、Tween（登録商標）、及びNP-40（商品名）からなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項５に記載の生物材料用透明化試薬。
  7. 　水溶性の高分子化合物をさらに含むことを特徴とする請求項３から６の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
  8. 　水溶性の上記高分子化合物が、パーコール（登録商標）、フィコール（登録商標）、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項７に記載の生物材料用透明化試薬。
  9. 　グリセロールを２７（ｗ／ｖ）％以上で３３（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度で含むことを特徴とする請求項１から８の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
  10. 　尿素を３Ｍ以上で５Ｍ以下の範囲内の濃度で、上記界面活性剤を０．０２５（ｗ／ｖ）％以上で５（ｗ／ｖ）％以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことを特徴とする請求項４から９の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
  11. 　多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものであることを特徴とする請求項１から１０の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬。
  12. 　請求項１から１０の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬と、単離された生物材料とを含んでなり、当該生物材料を透明化するために生物材料の内部に生物材料用透明化試薬が浸潤していることを特徴とする生物材料透明化処理システム。
  13. 　請求項１から１０の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を、単離された生物材料中に浸潤して、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴とする生物材料の透明化方法。
  14. 　請求項１から１０の何れか一項に記載の生物材料用透明化試薬を含むことを特徴とする生物材料用透明化処理キット。
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