WO2013080941A1 - 核酸増幅用基材及び核酸増幅方法 - Google Patents

核酸増幅用基材及び核酸増幅方法 Download PDF

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gel
acid amplification
primer
substrate
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宏之 大島
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Mitsubishi Rayon Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification base material, a method for producing the same, a nucleic acid amplification method using the base material, and the like.
  • the target nucleic acid sequence to be analyzed is often amplified.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LAMP Loop-Mediated Isolation Amplification
  • nucleic acid amplification methods methods and devices for independently and comprehensively amplifying unspecified sequences have been proposed for application to large-scale sequences, gene screening, and the like.
  • methods and devices for independently amplifying a plurality of types of specific sequences have been proposed in order to improve the efficiency of inspection and diagnosis.
  • Patent Document 1 a method of performing PCR inside a well formed by a capillary penetrating the front and back of a microplate.
  • Patent Document 1 a method of performing PCR inside a well formed by a capillary penetrating the front and back of a microplate.
  • a microplate on which a large number of capillary-shaped wells are formed is immersed in a PCR solution and reacted so that the target nucleic acid contained in each well becomes one molecule, whereby one well is obtained in each well.
  • Two target nucleic acids can be amplified independently.
  • Patent Document 2 A method that does not use a microplate has also been proposed (Patent Document 2). This method is characterized in that a large number of microdroplet gels containing a PCR solution containing a single molecule of a target nucleic acid are subjected to a PCR amplification reaction prepared as an emulsion in a hydrophobic solvent such as oil. It is a method.
  • an example of the latter is a multiplex PCR method.
  • the target base sequence is amplified using one kind of primer set in one reaction solution
  • a plurality of primer sets to be amplified are set in one reaction container. Is used to amplify a plurality of types of target base sequences.
  • Patent Document 3 a method in which a plurality of types of primer pairs are arranged in independent fine spaces, and PCR is performed individually in the fine spaces.
  • a substrate in which a large number of capillaries are arranged and a plurality of types of primer pairs are dropped and dried is prepared, and the primer pair is redissolved by contacting and aspirating the PCR solution excluding the primer pair on the substrate. It is possible to perform PCR using different types of primers independently in each capillary.
  • Non-patent Document 1 a method of amplifying a large number of target nucleic acid sequences at once after a plurality of types of primer pairs are fixed on the substrate and arrayed has been devised.
  • a primer set in which an arbitrary common adapter sequence is added to the 5 ′ end of a primer specific to a target sequence is immobilized on a substrate, and the common adapter sequence is added as a primer in a liquid phase. This makes it possible to amplify and detect even those that were originally difficult to amplify only with the primers immobilized on the substrate.
  • Non-Patent Document 1 amplification efficiency is improved as compared with PCR using a carrier on which a primer is immobilized.
  • the initial reaction of PCR is performed only in a solid phase, it is compared with PCR in an aqueous phase.
  • the amplification efficiency is low, and more time is required for the reaction.
  • a common primer is used in the liquid phase, many common primers are used to amplify the target nucleic acid sequence that is originally present in the sample, and it may not be possible to detect the target nucleic acid sequence with a small amount of the original. is there. That is, depending on the quantitative ratio, there may be a target nucleic acid sequence that is not amplified.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid amplification substrate capable of accurately and efficiently amplifying and detecting a plurality of target nucleic acid sequences to be detected, a nucleic acid amplification method using the substrate, and the like. There is to do.
  • the present inventors have formed an array in which different types of nucleic acid amplification primer pairs and polymerase and buffer components are retained via a hydrophilic gel that dissolves by heating.
  • the present inventors have found that a plurality of target nucleic acid sequences to be detected can be accurately and efficiently amplified and detected by using a substrate having a plurality of fractions, and the present invention has been completed. It was.
  • the present invention is as follows.
  • a base material for nucleic acid amplification is retained in the fractions.
  • the substrate described in (I) above may have a primer concentration in each fraction of, for example, 1 to 1000 fmol / ⁇ L.
  • the buffer component may contain at least one selected from the group consisting of, for example, KCl, Tris-HCl, MgCl 2 , gelatin, and Triton X-100.
  • the hydrophilic gel (hydrophilic gel that can be dissolved by heating) is a gel prepared by using as a monomer component at least one selected from the group consisting of agarose, alginic acid, dextran, vinyl alcohol and ethylene glycol. In particular, an agarose gel is preferable.
  • the concentration of the hydrophilic gel may be, for example, 0.5 to 2% by mass.
  • each fraction in the base material described in (I) above may be, for example, the maximum width of the shape of the fraction is 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a nucleic acid amplification kit comprising the nucleic acid amplification substrate according to (I) above and a template supply substrate.
  • a nucleic acid amplification method comprising a step of supplying a template to each fraction of the nucleic acid amplification base material described in (I) above and a step of heating the base material after the supply.
  • nucleic acid amplification reaction it is possible to carry out a nucleic acid amplification reaction using a plurality of types of primer pairs without mixing primer pairs having different target nucleic acid sequences.
  • the primer since the primer is not immobilized on the solid phase, the primer is released when the gel is liquefied by heating, and it can be carried out at the same speed as the nucleic acid amplification reaction in the liquid phase. Due to the water-holding power of the gel, drying is difficult to proceed even with a small volume, and the stability of PCR is increased.
  • Nucleic acid amplification base material having a plurality of arrayed fractions A material (raw material) of a nucleic acid amplification base material (hereinafter also referred to as “base material”) used in the present invention is a reaction vessel for performing a heat treatment.
  • base material a material used in the present invention is a reaction vessel for performing a heat treatment.
  • the shape can be maintained even at a temperature of 100 ° C. or higher, and more preferably the shape can be maintained even at a temperature of 110 ° C. or higher.
  • Examples of such a material include glass, silicon, and resin.
  • the resin an epoxy resin, a polypropylene resin, a polystyrene resin, a polyurethane resin, or the like can be used.
  • the shape of the substrate is not particularly limited.
  • a cube, a rectangular parallelepiped for example, plate shape as illustrated in FIG. 1
  • a polygonal column, a triangular column, a cylinder, an elliptical column, and the like can be given.
  • a cube or a rectangular parallelepiped is preferable from the viewpoint of handling property, reaction, and compatibility with commercially available equipment at the time of detection.
  • the size of the base material there is no particular limitation on the size of the base material.
  • a heating device such as a commercially available thermal cycler
  • the thickness of the base material is not particularly limited, and is preferably a thickness that can be used in a heating device such as a commercially available thermal cycler.
  • a heating device such as a commercially available thermal cycler.
  • 1 ⁇ m to 5000 ⁇ m is preferable, 10 ⁇ m to 2000 ⁇ m is more preferable, 100 ⁇ m to 500 ⁇ m is further preferable, and in some cases, 100 ⁇ m to 250 ⁇ m is also preferable.
  • the base material of the present invention has a plurality of fractions.
  • the shape of the fraction is not particularly limited, and examples thereof include a cube, a rectangular parallelepiped, a cylinder, an elliptical column, a triangular pyramid, a quadrangular pyramid, and a hemisphere.
  • a cube, a rectangular parallelepiped, a cylinder, and the like are preferable from the viewpoints of good workability and ease of manufacture.
  • the size of the fraction is not limited, and can be appropriately selected according to the size of the base material, the number of fractions provided on the base material, and the like.
  • the shape of the fraction has a maximum width (specifically, an inner diameter in the case of a cylinder, a length of one side in the case of a cube, and a length of a long side in the case of a rectangular parallelepiped) of 10 ⁇ m to
  • the thickness is preferably about 1000 ⁇ m, more preferably about 90 ⁇ m to 500 ⁇ m, and further preferably 150 ⁇ m to 180 ⁇ m.
  • the depth of the fraction is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the thickness of the substrate. For example, 1 ⁇ m to 5000 ⁇ m is preferable, 10 ⁇ m to 2000 ⁇ m is more preferable, 100 ⁇ m to 500 ⁇ m is further preferable, and in some cases, 100 ⁇ m to 250 ⁇ m is also preferable.
  • the fraction may or may not penetrate the base material as illustrated in the cross-sectional view of FIG. If the fraction penetrates the substrate, the depth of the fraction is equal to the thickness of the substrate. On the other hand, if the fraction does not penetrate the substrate, the depth of the fraction is smaller than the thickness of the substrate.
  • the substrate In order to amplify a large number of target nucleic acid sequences at one time on a single substrate, it is preferable that as many fractions as possible be placed on the substrate. Preferably it is 50 or more, More preferably, it is 100 or more, More preferably, it is 200 or more.
  • the plurality of fractions possessed by the substrate are arrayed. Arraying means, for example, that it is clear which kind of primer pair is contained in which fraction (disposed).
  • the substrate surface can be subjected to various treatments as long as the nucleic acid amplification reaction can be performed.
  • the surface of the base material may be coated with a water-repellent resin for water-repellent treatment, may be hydrophilized by plasma treatment, or may be sterilized by gamma irradiation or the like.
  • hydrophilic gel The type of gel retained in the fraction of the substrate of the present invention is not limited as long as a nucleic acid amplification reaction can be performed. Since it is necessary to perform an enzymatic reaction, it is preferable to use a hydrophilic gel.
  • hydrophilic gels those that can be dissolved by heating are preferable, and specifically, they exist as gels around room temperature (preferably 25 ° C. or lower, more preferably 30 ° C. or lower, more preferably 35 ° C. or lower). In the temperature at which the nucleic acid amplification reaction is carried out (for example, preferably at 60 ° C. or higher, preferably 50 ° C. or higher, more preferably 40 ° C.
  • a liquid phase (solution state) is preferable. This is because the reaction proceeds efficiently in solution (in a hydrophilic gel dissolved by heating) at the time of nucleic acid amplification reaction, and it is easy to handle by forming a gel at other times.
  • hydrophilic gels gels prepared using agarose, alginic acid, dextran, vinyl alcohol, ethylene glycol or the like as monomer components are preferable. These monomer components can be used alone or in combination of two or more.
  • the gel itself is a material that does not inhibit the reaction of the nucleic acid amplification reaction.
  • an agarose gel such as Agarose LO3 manufactured by Takara Bio Inc. is particularly preferable.
  • the concentration of the gel used in the present invention is preferably 0.5 to 2% by mass, more preferably 0.7 to 1.8% by mass, and further preferably 0.9 to 1.6% by mass.
  • the reason why the content is 0.5% by mass or more is to avoid a significant decrease in gel strength.
  • the reason why it is 2% by mass or less is that the gel can be easily redissolved when the temperature is raised.
  • the hydrophilic gel is held in each fraction together with a nucleic acid amplification reaction solution containing a nucleic acid amplification primer described later. That is, the hydrophilic gel in each fraction after the retention is in a state in which the nucleic acid amplification reaction solution is contained.
  • the primer itself may be an oligonucleotide composed of DNA, and RNA, PNA, LNA, etc. may be used as long as the specificity and reactivity are not affected.
  • primer pairs are adjusted so that the GC content and sequence length are adjusted to the extent that the specificity necessary for amplification of the target nucleic acid sequence can be ensured, so that the reaction conditions of the nucleic acid amplification reaction are equivalent between the primers. It is desirable that it is designed. For example, if the annealing temperature and the length of the amplification product as the target sequence are significantly different, the appropriate reaction temperature and time are different in each fraction, and it may be difficult to react simultaneously. Because. Such a primer design can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • the set of primer pairs may be included in only one fraction or may be included in a plurality of fractions. It is possible to verify reproducibility by mounting the same primer pair in multiple fractions, and quantitate target nucleic acids based on the number of fractions with and without amplification. It is also possible to do.
  • the primer may be modified such as amination, biotinylation, fluorescent labeling, etc. as long as it can be used for nucleic acid amplification reaction.
  • two or more types of primer pairs may be contained in one fraction.
  • the concentration of the primer contained in each fraction is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of target nucleic acid, the type of enzyme used in the amplification reaction, and the like. For example, it is preferably 1 to 1000 fmol / ⁇ L, more preferably 10 to 100 fmol / ⁇ L, and still more preferably 20 to 50 fmol / ⁇ L. By setting it to 1 fmol / ⁇ L or more, the target nucleic acid sequence can be efficiently amplified. Moreover, nonspecific amplification and primer dimer formation can be suppressed by setting it as 1000 fmol / microliter or less.
  • the nucleic acid amplification reaction solution held together with the hydrophilic gel in the fraction can contain in advance various components other than the above-described primers, such as dNTP, buffer component, DNA polymerase, and the like.
  • SYBR A double-stranded nucleic acid-specific intercalator such as Green I, EtBr, or PicoGreen can be included in advance.
  • Glycerol may be included to increase the water retention of the gel. Unless multiple types of samples are handled, it is possible to introduce a template solution in advance.
  • the buffer component is not limited, but for example, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4 to 9.0, 25 ° C.), 1.5 mM MgCl 2 , 0.01% gelatin or 0.01 Preferred is a mixture of% Triton X-100.
  • the DNA polymerase is not limited, but for example, a pol I type heat resistant DNA polymerase such as Taq polymerase or Tth polymerase, or an ⁇ type heat resistant polymerase such as Pfu polymerase or KOD polymerase is preferably mentioned.
  • the nucleic acid amplification reaction substrate of the present invention can form a fraction after the substrate is produced, or can be produced using a hollow tube or fiber. .
  • it can be manufactured at low cost and in large quantities by a method including the following steps.
  • Step of producing a hollow fiber bundle by arranging a plurality of hollow fibers in a three-dimensional manner so that the fiber axes of the hollow fibers are in the same direction, and fixing the arrangement with a resin
  • Primer A step of introducing a gel precursor solution containing a pair into a hollow portion of each hollow fiber bundle that has been heated in advance (3) reacting the gel precursor solution introduced into the hollow portion of the hollow fiber bundle, (4) A step of cutting a hollow fiber bundle in a hydrophobic liquid in a direction intersecting with the longitudinal direction of the fiber to make a thin piece.
  • fibers that can be used in this method include synthetic fibers, semi-synthetic fibers, regenerated fibers, and natural fibers.
  • synthetic fibers include various fibers such as nylon 6, nylon 66 and aromatic polyamide, various polyester fibers such as polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polylactic acid, polyglycolic acid and polycarbonate, and acrylic such as polyacrylonitrile.
  • Fibers such as polyethylene and polypropylene, polyvinyl alcohol fibers, polyvinylidene chloride fibers, polyvinyl chloride fibers, polyurethane fibers, phenol fibers, polyvinylidene fluoride And fluorine-based fibers made of polytetrafluoroethylene, polyalkylene paraoxybenzoate-based fibers, and the like.
  • semi-synthetic fibers include various cellulose-based regenerated fibers (rayon, cupra, polynosic, etc.) and the like made from diacetate, triacetate, chitin, chitosan and the like.
  • Representative examples of natural fibers include plant fibers such as cotton and flax, animal fibers such as wool and silk, and mineral fibers such as asbestos.
  • a known hollow fiber can be used as a fiber form.
  • the diameter of the fiber is preferably 1 mm or less and several tens of microns or more.
  • the inner wall of the fraction thus produced can be prevented from adsorbing polymerase or the like by covering it with a substance having a protein adsorption inhibiting action such as BSA. Sterilization by radiation treatment or the like, and hydrophilicity by plasma treatment or the like are also possible.
  • Holding a biological substance via a gel means that, for example, if the fiber is a hollow fiber, it is held in the hollow part, and the gel is held using chemical or physical interaction. A state in which a substance is held using chemical or physical interaction.
  • the gel that can be used in this method is not particularly limited, and for example, agarose, alginic acid, dextran, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, and the like can be used.
  • the fibers are regularly arranged using an arrangement jig described in WO 00/53736.
  • the number of fibers constituting the array can be 10 to 1,000,000 per 1 cm 2 .
  • the number of the fibers can be appropriately selected according to the number of fractions of the base material of the present invention.
  • an embedding agent is uniformly injected between the arranged fibers and cured.
  • Examples of the type of embedding agent include embedding agents composed of crosslinkable prepolymers, embedding agents composed of polymerized oligomers and catalysts, and thermoplastic polymers.
  • the embedding agent composed of the crosslinkable prepolymer is a polyurethane resin.
  • the polyurethane resin can be prepared by adding a curing agent to the polyisocyanate of the crosslinkable prepolymer which is the main component.
  • the curing agent include alcohols, ketones, amides, esters, castor oil-based polyols, and the like. Among these, those having a boiling point of 60 ° C. or more are particularly preferred, and specific examples include glycerol, polyethylene glycol, methyl ethyl ketone, acetamide, N, N-dimethylformamide, ethyl acetate and the like.
  • an epoxy resin, a silicon resin, or the like can be used.
  • an acrylic type containing a (meth) acrylic ester [A] and a (meth) acrylic polymer or copolymer [B] soluble in the [A] component is syrup.
  • component [A] examples include acrylic acid esters such as methyl acrylate, ethyl acrylate, n-butyl acrylate, t-butyl acrylate and 2-ethylhexyl acrylate; methyl methacrylate, methacrylic acid Ethyl, n-butyl methacrylate, i-butyl methacrylate, t-butyl methacrylate, lauryl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, tridecyl methacrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, benzyl methacrylate, methacrylic acid Such as 2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl methacrylate, dimethylaminoethyl methacrylate, diethylaminoethyl methacrylate, glycidyl methacrylate, tetrahydrofurfuryl methacrylate,
  • the (meth) acrylic polymer used as the above [B] component needs to be soluble in the [A] component.
  • the term “soluble” includes a dispersed state.
  • Specific examples of the component (B) include, for example, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, n-butyl methacrylate, i-butyl methacrylate, t-butyl methacrylate, lauryl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, Examples thereof include homopolymers or copolymers of monomers selected from methyl acrylate, ethyl acrylate, n-butyl acrylate, t-butyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate, and the like.
  • the proportion of the [A] component and the [B] component used is such that when the acrylic syrup composed of the [A] component and the [B] component is 100 parts by mass, the [A] component is in the range of 40 to 80 parts by mass, The component is in the range of 20 to 60 parts by mass, preferably the component [A] is in the range of 40 to 70 parts by mass, and the component [B] is in the range of 30 to 60 parts by mass.
  • a urethane oligomer, a urethane polymer or other rubber components to the acrylic syrup composed of the [A] component and the [B] component in the thinning.
  • initiators such as azo, peroxide and redox which can be dissolved in the solvent to be used can be used. Examples include 2,2'-azobisisobutyronitrile, 2,2'-azobis (2-methylbutyronitrile) isobutyronitrile, benzoyl peroxide, or benzoyl peroxide-dimethylaniline. .
  • embedding agents that are thermoplastic polymers include polyethylene, polypropylene, polystyrene, ABS resin, methacrylic resin, polyvinyl chloride, polyamide, polycarbonate, polyacetal, PBT resin, polyphenylene sulfide, polyarylate polysulfone, polyethersulfone, polyether Examples include ether ketone, polymethylpentene, and polyetherimide.
  • the embedded material embedded with the embedding agent When the embedded material embedded with the embedding agent is used as a base material for nucleic acid amplification reaction, low fluorescence intensity may be required for detection of biologically relevant substances. In such a case, it is preferable to add carbon black or a quencher to the embedding agent. Moreover, it is preferable to select the embedding agent in consideration of the adhesion between the fiber and the embedding agent according to the type of fiber used. For example, an embedding agent made of acrylate syrup is preferable for polymethyl methacrylate hollow fibers.
  • the curing temperature of the embedding agent is preferably not higher than the glass transition temperature of the fiber material. More preferably, it is 100 ° C. or lower.
  • the surface of the flakes is smooth by having a hardness of 70 to 95 (measured according to JIS K 7215) and crossing the fibers in a crossing direction. It is possible to obtain a fiber array flake in which a bio-related substance without fibers falling off is retained.
  • the hardness of the embedding agent is measured according to JIS K 7215 and refers to the hardness measured 5 seconds after the pressing surface is in close contact with the embedding material.
  • the gel precursor solution When the gel is held on a substrate having a fraction using the hollow fiber, the gel precursor solution is filled in the previously heated hollow fiber bundle and then gelled and held in the hollow fiber bundle.
  • the gel precursor solution refers to a non-gelled solution containing a primer pair.
  • the temperature at which the hollow fiber bundle is preheated can be appropriately set depending on the type of the gel precursor solution to be filled and the like, and is not limited, but is preferably 50 to 90 ° C., for example. More preferably, it is 60 to 80 ° C, and further preferably 70 to 75 ° C.
  • the hollow fiber bundle holding the gel-like material is cut in a hydrophobic liquid in a direction crossing the longitudinal direction of the fiber to make a thin piece (that is, with respect to the orientation direction of the through hole of the hollow fiber bundle,
  • the substrate for nucleic acid amplification reaction in which the gel is held can be obtained.
  • the hydrophobic liquid is not limited, but preferred examples include mineral oil and liquid paraffin.
  • the method of filling the gel precursor solution into the hollow fiber bundle can be introduced, for example, by sucking the solution into a syringe having a fine needle and inserting the needle into the hollow part of each hollow fiber.
  • the gel precursor solution is introduced into the hollow fiber by the following method.
  • This solution can be introduced into the hollow portion of the hollow fiber from the end immersed in the solution of the hollow fiber by immersing in the water and bringing the inside of the desiccator into a reduced pressure state and then returning to the normal pressure.
  • the gel precursor solution introduced into the hollow part of the hollow fiber is gelled to hold the primer pair in the hollow part of the hollow fiber.
  • the gelation conditions are not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of gel precursor used. For example, in the case of agarose, gelation is possible by heating the gel precursor solution that has been preliminarily heated and cooling the gel precursor solution to a gelling temperature or lower.
  • the embedded material is cut in a direction intersecting the fiber axis of the embedded material.
  • the angle for cutting is not limited and can be appropriately selected according to the purpose of the experiment.
  • the angle is 45 to 90 ° with respect to the fiber axis, preferably 60 to 90 °, and more preferably orthogonal (90 ° to the fiber axis).
  • the blade edge angle of the blade used for cutting is preferably 20 ° or less, and more preferably 15 ° or less.
  • Examples of the material for the blade include carbon steel, SUS, and cemented carbide.
  • the flakes thus prepared can be used as a base material for nucleic acid amplification reaction for amplifying a large number of target nucleic acid sequences.
  • the method for amplifying and detecting a nucleic acid using the substrate for nucleic acid amplification reaction of the present invention is a method using a primer, so long as it is a PCR method in which a thermal cycle is applied.
  • the LAMP method may be used.
  • Those skilled in the art can appropriately set nucleic acid amplification reaction conditions, primer design, and the like. However, the temperature during the reaction needs to be equal to or higher than the melting point of the gel in the nucleic acid amplification anti-base material.
  • the following methods are possible.
  • a nucleic acid containing a target base sequence as a sample (hereinafter referred to as “template”) is supplied to each fraction in the substrate of the present invention.
  • the template can be supplied as a solid such as a powder, or can be supplied as a solution.
  • any nucleic acid can be used as long as it is a template used as a template for a normal nucleic acid amplification reaction.
  • natural products are used to check the contained nucleic acids, but it is possible to use nucleic acids purified from them, and depending on the application, use cell or tissue disruption fluid or its supernatant. It is also possible. It is also possible to use an artificially synthesized nucleic acid as a template. It is also possible to use a reverse transcript from mRNA as a template.
  • the template can also be supplied to each fraction as a solution using a dispensing instrument such as a pipette. In this way, it is possible to prevent release and mixing of the primer dispensed into each fraction. It is also possible to supply each fraction of the substrate using an apparatus such as an arrayer or a manipulator.
  • the shape of the template may be a plate shape, a sheet shape, or a film shape.
  • the template supply material When the template supply material is applied to the base material of the present invention for the reaction, the template supply material must also be heat resistant to the extent that it is used in the nucleic acid amplification reaction, and the amplification product can be directly In order to detect, it is desirable that the material does not hinder the applied detection method. Moreover, it is desirable that the template supply material can be pressure-bonded to the substrate surface other than the gel for easy use.
  • template supply materials include polyolefin films. It is also possible to use a film used for sealing wells in real-time PCR or the like.
  • a liquid handling device such as a pipette may be used, or a method of applying a sample solution adsorbed on a film with a cotton swab, brush, paper point or the like may be used.
  • a sample solution adsorbed on a film with a cotton swab, brush, paper point or the like may be used.
  • coat uniformly it is also possible to apply
  • the template supply material including the template can be brought into contact with the surface in contact with the fraction.
  • the template supply material including the template can be brought into contact with both surfaces of the base material. It is also possible to bring the template supply material including the template into contact with the other surface and contact the material not including the template with the other surface (FIG. 3).
  • the template supply material may be subjected to various surface treatments as necessary. For example, by covering (treating) with a blocking agent such as salmon sperm DNA, it is possible to prevent nucleic acid serving as a template from sticking to the surface of the template supply substrate. Sterilization by radiation treatment or the like, or hydrophilization by plasma treatment or the like is also possible.
  • a blocking agent such as salmon sperm DNA
  • the nucleic acid amplification reaction can be carried out by sandwiching one or both surfaces of the base material with a heat source. In this case, it is necessary to seal the end of the fraction so that the gel in the fraction and the lysate of the gel do not leak.
  • the base material for nucleic acid amplification reaction is embedded (immersed) in a hydrophobic liquid that does not leak gel contents such as mineral oil, and then the nucleic acid amplification reaction is performed. It is also possible to implement. Since mineral oil forms a boundary with the gel solution, it is not necessary to seal the ends of the fractions. In this case, it is also possible to use the nucleic acid amplification reaction after removing the film used for contacting the template.
  • the presence or absence of amplification can be easily confirmed using a commercially available fluorescence detector or fluorescence microscope.
  • the gel inside can be taken out by centrifugation with mineral oil. It is also possible to dissolve the taken-out gel and obtain the amplified nucleic acid inside. By sealing the fraction other than the acquisition purpose in advance, it becomes possible to acquire only the target gel.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed by heating the base material after the heating template is supplied.
  • the reaction conditions (heating conditions) for amplifying the nucleic acid are not limited and can be appropriately selected according to the enzyme (polymerase or the like) to be used, template or the like. For example, when PCR is performed, thermal cycles are performed at 98 ° C. for 10 seconds to dissociate double-stranded nucleic acids, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, and nucleic acid extension reaction at 72 ° C. for 1 minute. For example, the heating step is repeated about 30 cycles. Those skilled in the art can appropriately select the temperature, time, and cycle number of each step. Further, when performing the LAMP method, for example, isothermal heating at 50 to 70 ° C. can be exemplified, and the heating time can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Kit The substrate of the present invention can also be used as a kit for nucleic acid amplification.
  • the kit preferably includes the substrate of the present invention and a template supply substrate.
  • a polycarbonate hollow fiber colored by carbon black (Mitsubishi Rayon Co., Ltd., outer diameter 0.28 mm, inner diameter 0.18 mm, length 500 mm) is allowed to pass through all the holes of the plate, and these two fibers are allowed to pass.
  • the perforated plates were separated by 50 mm, and between the separated perforated plates, a polyurethane resin colored by carbon black (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd., Nippon Run 4276 and Coronate 4403) was filled, and the corners were 50 mm long and 7 ⁇ 12 mm square A resin block having portions that are not fixed with resin at both ends of the columnar shape was obtained.
  • PCR solution Three types of primer pairs with different detection targets, that is, a total of six types of primers (A1 (SEQ ID NO: 1), A2 (SEQ ID NO: 2), B1 (SEQ ID NO: 3) and B2 (SEQ ID NO: 4) described below ), C1 (SEQ ID NO: 5), C2 (SEQ ID NO: 6)) are prepared so as to have a concentration of 10 pmol / ⁇ L, and a PCR premix (Takara Bio Inc. PremixTaq) containing dNTP, buffer, and DNA polymerase is prepared. ), Agarose (Takara Bio Inc. LO3), SYBR Green I (Life Technologies), Streptavidin-Cy5 (GE Healthcare), and ultrapure water were used to prepare three types of nucleic acid amplification reaction solutions according to primer pairs. (See Table 1 below).
  • Primer A1 caggcagacggaagagttcg (SEQ ID NO: 1)
  • Primer A2 ttatcacgtccttcttcgcc (SEQ ID NO: 2)
  • Primer B1 cagatatttgacataactagggaag (SEQ ID NO: 3)
  • Primer B2 ctttcgcttgaccatattattgtcc (SEQ ID NO: 4)
  • Primer C1 gaaactatatagtagaacaaacaag (SEQ ID NO: 5)
  • Primer C2 atcggctcttactacctaggc (SEQ ID NO: 6)
  • nucleic Acid Amplification Reaction Solution Three types of prepared nucleic acid amplification reaction solutions were heated with a heat block at 80 ° C. for 5 minutes to dissolve agarose. In the nucleic acid amplification reaction solution in which agarose is dissolved, five hollow fibers protruding from the end of the resin block that has been heated to 65 ° C. are soaked, and the gel solution is sucked from the opposite end of the hollow fiber. Then, a nucleic acid amplification reaction solution was introduced into the resin block. The resin block was cooled to room temperature, and the internal nucleic acid amplification reaction solution was gelled.
  • Obtaining a substrate for nucleic acid amplification reaction by slicing A resin block filled with a nucleic acid amplification reaction solution containing the three types of primer pairs obtained above was cut into a thickness of 250 ⁇ m using a microtome, and the length was 12 X A base material for nucleic acid amplification reaction in which a total of 228 holes in a total of 19 sides were regularly arranged was obtained. For dry spinning, both sides of the obtained nucleic acid amplification reaction substrate were sealed with cellophane tape.
  • DNA comprising a target nucleic acid sequence A (SEQ ID NO: 7) that can be amplified only by the combination of primers A1 and A2 was prepared at a concentration of 1 amol / ⁇ L.
  • Target nucleic acid sequence A caggcagacggaagagttcgctatagctcagttggttagagcgctacactgataatgtagaggtcggcagttcaactctgggcgaagaaggacgtgataa (SEQ ID NO: 7).
  • the cellophane tape on one side of the base material for nucleic acid amplification reaction and the contacted nucleic acid amplification reaction substrate of the template-coated sheet was peeled off, and the sheet coated with the template solution was pressure-bonded to the same surface. Thereafter, the cellophane tape on the opposite side was peeled off and immersed in a sample tube containing 50 ⁇ L of mineral oil (QIAGEN).
  • the fluorescence of the SYBRGreen I specifically intercalated with the double-stranded nucleic acid was detected with a mirror unit (Olympus WIB-UMWIB3), and after imaging with a CCD camera The intensity of fluorescence in each hole was quantified using image processing software (Media Cybernetics, ImagePro) (FIG. 5). Since no PCR reaction was performed, no double-stranded nucleic acid was generated, and the signal obtained here can be regarded as background.
  • a resin block and a nucleic acid amplification reaction solution were prepared in the same manner as described in Example 1. However, the nucleic acid amplification reaction solution was composed of a single solution without including a primer in this example.
  • the prepared nucleic acid amplification reaction solution was heated with a heat block at 80 ° C. for 5 minutes to dissolve agarose. Put all heat blocks, resin blocks, etc. in a constant temperature device of 70 ° C. environment and immerse 19 hollow fibers protruding from the end of the resin block into the nucleic acid amplification reaction solution in which agarose is dissolved under the temperature conditions, The sucking of the gel solution from the opposite end of the hollow fiber was repeated 12 times to introduce the nucleic acid amplification reaction solution into the resin block. The resin block was cooled to room temperature, and the internal nucleic acid amplification reaction solution was gelled.
  • the resin block filled with the gel made of the nucleic acid amplification reaction solution obtained above was coated with mineral oil (QIAGEN) on the surface of the resin block and the slice blade (specifically Specifically, under the condition that the resin block is immersed in mineral oil), nucleic acid amplification in which a microtome is used to cut out to a thickness of 500 ⁇ m and a total of 228 holes of 12 ⁇ 19 in length are regularly arranged 15 reaction substrates were obtained.
  • QIAGEN mineral oil
  • a stable quality base material for nucleic acid amplification reaction can be obtained by slicing a resin block filled with the gel in a hydrophobic liquid such as mineral oil. Became clear.
  • the amplification efficiency or detection efficiency of a biological substance to be detected can be significantly improved.
  • Sequence number 1 Primer sequence number 2: Primer sequence number 3: Primer sequence number 4: Primer sequence number 5: Primer sequence number 6: Primer sequence number 7: Template

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Abstract

　本発明は、検出対象となる複数の標的核酸配列を正確かつ効率的に増幅し、検出することができる核酸増幅用基材を提供する。本発明の核酸増幅用基材は、アレイ化された複数の画分を有し、当該画分中に核酸を増幅するための異なる種類のプライマー等を含む親水性ゲルが保持された基材である。

Description

核酸増幅用基材及び核酸増幅方法
　本発明は、核酸増幅用基材及びその製造方法、並びに当該基材を用いた核酸増幅方法等に関する。
　ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の核酸配列解析が精力的に進められ、近年では大規模シーケンスや遺伝子スクリーニング等の遺伝子解析技術も急速に高度化している。また、疾病や薬理に関連する遺伝子マーカーも多数同定され、これらを利用した新しい診断、検査手法の実用化が始まっている。
　これらの遺伝子解析や診断・検査では、解析対象となる標的核酸配列を増幅することが多く、増幅の方法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）法やＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が一般的に用いられている。
　これらの核酸増幅方法については、大規模シーケンスや遺伝子スクリーニング等に応用するために、不特定配列を独立かつ網羅的に増幅するための方法やデバイスが提案されている。また、検査及び診断等の効率化のため、複数種類の特定配列を独立に増幅するための方法やデバイスも提案されている。
　前者の例として、マイクロプレートの表裏を貫通したキャピラリーにより形成されたウェル内部でＰＣＲを実施する方法が考案されている（特許文献１）。本方法によれば、キャピラリー状のウェルが多数形成されたマイクロプレートをＰＣＲ溶液に浸漬し、各ウェル中に含まれる標的核酸が一分子となるようにして反応させることにより、それぞれのウェルで一つの標的核酸を独立に増幅することができる。
　また、マイクロプレートを使用しない方法も提案されている（特許文献２）。この方法は、標的核酸が一分子含まれるようにした、ＰＣＲ溶液を含む多数の微小液滴ゲルを、オイル等の疎水性溶媒中でエマルジョンとして調製した状態で、ＰＣＲ増幅反応に供することを特徴とする方法である。
　一方、後者の例としてはマルチプレックスＰＣＲ法が挙げられる。通常のＰＣＲ法では、１つの反応溶液に１種類のプライマーセットを用いて標的塩基配列の増幅を行うのに対して、マルチプレックスＰＣＲ法では、１つの反応容器に増幅対象の異なる複数のプライマーセットを用いて、複数種類の標的塩基配列の増幅を行う。
　これとは逆に、複数種類のプライマー対をそれぞれ独立の微細空間に配置し、当該微細空間中で個別にＰＣＲを行う方法も提案されている（特許文献３）。本方法によれば、多数のキャピラリーが配列され、複数種類のプライマー対を滴下・乾燥させた基板を用意し、その基板にプライマー対を除くＰＣＲ溶液を接触及び吸引させることによりプライマー対を再溶解させ、各キャピラリー中で独立に異なる種類のプライマーを用いたＰＣＲ行うことが可能である。
　さらに、複数種類のプライマー対を基板上に末端固定し、アレイ化した上で、一度に多数の標的核酸配列の増幅を行う方法も考案されている（非特許文献１）。この方法によれば、標的配列に特異的なプライマーの５’末端側に任意の共通アダプター配列を付加したプライマーセットを基板上に固定化し、さらに液相中で当該共通アダプター配列をプライマーとして添加することにより、本来、基板上に固定化されたプライマーだけでは増幅が困難であったものでも増幅及び検出が可能となる。
特開２００２－３３５９６０号公報 特開２００８－２４５６１２号公報 特開２００８－１５４４９０号公報
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２　ｅ１１
　しかしながら、これら従来の技術では、複数種類の標的配列を混合させること無く、且つ、ハイスループットに増幅させることは困難である。
　例えば、特許文献１に記載の技術では、一つの反応溶液中で複数種類のプライマーを用いることができないため、複数種類の特定配列を増幅することは困難である。また、キャピラリー中にＰＣＲ溶液を吸い上げたものを使用するが、もともと微量の体積のキャピラリーではすぐに乾燥してしまい、結果の再現性が高くないと考えられる。
　特許文献２に記載の技術では、増幅されうる断片数はきわめて多量であるものの、特許文献１に記載の技術と同様に、一つの反応溶液中（一つの微小液滴ゲル中）で複数のプライマー対を使用できない。また、増幅反応後の検出に際しては、エマルジョン中の微小液滴ゲルの慎重な取り扱いが必要になることのほか、各々の微小液滴ゲル中に含まれる増幅産物の種類が不明であるため別途シークエンシングによる同定が必要となることから、高度な技術や高額な装置が必要となるため、実用化は困難である。
　特許文献３に記載の技術では、複数種類のプライマー対を用いて個別にＰＣＲを実施することは可能であるが、プライマー自体は単に各画分中に乾燥固着されているだけなので、ＰＣＲ溶液接触時にキャピラリーの開放部が水系の溶液を介して連結され、溶解されたプライマー対が混合し、意図しない増幅産物が発生する可能性が高い。また、増幅産物の検出時に、キャピラリー中からＰＣＲ溶液を回収する必要がある。回収する必要がない実験系においては、検出時にＰＣＲ溶液をキャピラリーから漏洩させることなく、かつ乾燥させない工夫が必要となる等、操作が煩雑である。
　非特許文献１に記載の技術では、プライマーを固定化した担体を用いたＰＣＲに比較すれば増幅効率は向上するが、ＰＣＲ初期の反応は固相のみで行われるため、水相におけるＰＣＲに比較すると、増幅効率が低く反応により多くの時間を要する。また、液相中で共通プライマーを使用することから、サンプル中にもともと多く存在する標的核酸配列の増幅に多くの共通プライマーが使用され、元の量の少ない標的核酸配列については検出できない可能性がある。つまり、量比によっては、増幅されなくなる標的核酸配列が存在する可能性がある。
　そこで、本発明の目的は、検出対象となる複数の標的核酸配列を正確かつ効率的に増幅し、検出することができる核酸増幅用基材、及び当該基材を用いた核酸増幅方法等を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、加熱によって溶解する親水性ゲルを介して異なる種類の核酸増幅用プライマー対とポリメラーゼ及びバッファー成分とを保持した、アレイ化された複数の画分を有する基材を用いれば、検出対象となる複数の標的核酸配列を正確かつ効率的に増幅し、検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（Ｉ）アレイ化された複数の画分を有し、当該画分中に、核酸を増幅するための異なる種類のプライマー対、ポリメラーゼ及びバッファー成分を含む加熱により溶解し得る親水性ゲルが保持された、核酸増幅用基材。
　上記(I)に記載の基材は、各画分中のプライマーの濃度が、例えば、１～１０００ｆｍｏｌ／μＬであってもよい。
　また、バッファー成分が、例えば、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ゼラチン及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むものであってもよい。
　また、親水性ゲル（加熱により溶解し得る親水性ゲル）が、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ビニルアルコール及びエチレングリコールからなる群より選ばれる少なくとも１種をモノマー成分として用いて調製されたゲルであってもよく、特に、アガロースゲルが好ましい。ここで、親水性ゲルの濃度は、例えば、０．５～２質量％であってもよい。
　上記(I)に記載の基材における各画分の大きさは、例えば、該画分の形状の最大幅が１０μｍ～１０００μｍであってもよい。
（ＩＩ）下記工程を含む、上記(I)に記載の核酸増幅用基材の製造方法。
　（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
　（２）プライマーを含むゲル前駆体溶液を、予め加温した中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程
　（３）中空繊維束の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、プライマーを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程
　（４）疎水性の液体中で、中空繊維束を繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化する工程
（ＩＩＩ）上記(I)に記載の核酸増幅用基材とテンプレート供給用基材とを含む、核酸増幅用キット。
（ＩＶ）上記(I)に記載の核酸増幅用基材の各画分にテンプレートを供給する工程、及び、当該供給後の基材を加熱する工程を含む、核酸増幅方法。
　本発明により、標的核酸配列を異にするプライマー対が互いに混合することなく、複数種類のプライマー対を用いた核酸増幅反応を実施することが可能となる。
　また、プライマーが固相に固定化されていないため、加熱によりゲルを液化した際にプライマーが遊離し、液相での核酸増幅反応と同等の速さで実施することが可能である。ゲルの持つ保水力のため、少ない体積であっても乾燥が進みにくく、ＰＣＲの安定性が高くなる。
　さらに、標的核酸配列に共通のプライマーを使用することもないため、増幅反応の対象となる標的核酸配列間でのプライマーの奪い合いがおきず、元の標的核酸の量比が増幅結果に影響を与えることもない。
核酸増幅用基材の概略図の一例である。 核酸増幅用基材の一例を示す断面図である。 核酸増幅用基材の両端をシートで封止した状態を例示する断面図である。 核酸増幅用基材を用いた核酸増幅反応時の一形態を例示した図である。 核酸増幅用基材を用いたＰＣＲにより検出されたＳｙｂｒＧｒｅｅｎ　Ｉのシグナル強度を示す図である。 本願実施例２における実験結果、具体的には、スライスして得られた核酸増幅反応用基材の各画分に担持されたアガロースゲルの割合（残存割合）を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2011-263730号明細書等（2011年12月1日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．アレイ化された複数の画分を有する核酸増幅用基材
　本発明に用いる核酸増幅用基材（以下、「基材」ということがある。）の素材（原料）は、加熱処理を行う反応容器として用いるため、例えば１００℃以上の温度下でも形状を維持できるものであることが好ましく、より好ましくは１１０℃以上の温度下でも形状を維持できるものである。このような素材としては、例えば、ガラス、シリコン、樹脂等が挙げられる。樹脂としては、エポキシ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリウレタン樹脂等を使用することができる。
　基材の形状は特に限定されない。例えば、立方体、直方体（例えば、図１に例示するような板状）、多角柱、三角柱、円柱、楕円柱等が挙げられる。取り扱い性や反応、検出時における市販機器との適合性の観点から立方体又は直方体が好ましい。
　基材の大きさについても特に限定はされない。例えば、ハイスループット性の面から、市販のサーマルサイクラー等の加熱機器を用いた場合に、当該機器内に２４枚以上設置できることが好ましく、９６枚以上設置可能な大きさであることがより好ましい。従って、正方形または長方形の板状構造とするのであれば、一辺（長方形の場合は長い方の辺）が４～１４ｍｍの矩形が好ましく、一片が６～１２ｍｍの矩形がより好ましい。
　基材の厚さに関しても特には限定されず、市販のサーマルサイクラー等の加熱機器において使用可能な厚さであることが好ましい。例えば、１μｍ～５０００μｍが好ましく、１０μｍ～２０００μｍがより好ましく、１００μｍ～５００μｍがさらに好ましく、場合により１００μｍ～２５０μｍであることも好ましい。
　本発明の基材は、複数の画分を有する。画分の形状は特には限定されず、例えば、立方体、直方体、円柱、楕円柱、三角錐、四角錐、半球等の形状が挙げられる。これらの中でも、作業性の良さ、製造し易さ等の観点から、立方体、直方体、円柱等が好ましい。
　画分の大きさも限定されず、例えば、基材の大きさや基材に設ける画分数等に応じて適宜選択することができる。例えば、画分の形状は、該形状の最大幅（具体的には、円柱の場合は内径、立方体の場合は一辺の長さ、直方体の場合は長辺の長さ）が、それぞれ、１０μｍ～１０００μｍ程度であることが好ましく、９０μｍ～５００μｍ程度がより好ましく、１５０μｍ～１８０μｍがさらに好ましい。
　画分の深さも特に限定はされず、基材の厚さ等に応じて適宜選択することができる。例えば、１μｍ～５０００μｍが好ましく、１０μｍ～２０００μｍがより好ましく、１００μｍ～５００μｍがさらに好ましく、場合により１００μｍ～２５０μｍであることも好ましい。
　本発明の基材において、画分は図２に断面図を例示するように基材を貫通していてもよく、貫通していなくてもよい。画分が基材を貫通する場合は、画分の深さは基材の厚さと等しくなる。一方、画分が基材を貫通しない場合、画分の深さは、基材の厚さよりも小さくなる。
　一つの基材で一度に多くの標的核酸配列を増幅するために、基材には可能な限り多数の画分が設置されることが好ましい。好ましくは５０以上、より好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上である。
　本発明において、基材が有する複数の画分は、アレイ化されたものである。アレイ化とは、例えば、どのような種類のプライマー対が、どの画分に含まれているか（配置されているか）が明確となっていることを含む意味である。
　基材表面は、核酸増幅反応が実施可能な範囲で各種処理を行うことが可能である。例えば、基材の平面上に撥水性樹脂をコーティングすることにより撥水加工を施してもよいし、プラズマ処理により親水化してもよいし、ガンマ線照射等で滅菌処理してもよい。
２．親水性ゲル
　本発明の基材の画分中に保持するゲルの種類は、核酸増幅反応を行うことができる限り限定されない。酵素反応を行う必要があるので、親水性ゲルを使用するのが好ましい。親水性ゲルの中でも、加熱により溶解し得るものが好ましく、具体的には、室温付近（好ましくは２５℃以下、より好ましくは３０℃以下、さらに好ましくは３５℃以下）においてはゲルとして存在し、核酸増幅反応を実施する温度（例えば、好ましくは６０℃以上、好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは４０℃以上の加熱条件下）においては液相（溶液状）であるものが好ましい。核酸増幅反応時には溶液中（加熱により溶解した親水性ゲル中）で当該反応が効率良く進み、その他の時にはゲルを形成することにより、取り扱いやすいからである。
　このような親水性ゲルの中でも、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ビニルアルコール、エチレングリコール等をモノマー成分として使用して調製されたゲル好ましい。これらのモノマー成分は単独で使用することもできるし、２種以上組み合わせて使用することもできる。
　また、ゲルそのものが核酸増幅反応の反応を阻害しない素材であることが好ましい。このような観点から、例えば、タカラバイオ（社）製のＡｇａｒｏｓｅ　ＬＯ３を初めとするアガロースゲルが特に好ましい。
　本発明で使用するゲルの濃度は、０．５～２質量％が好ましく、０．７～１．８質量％がより好ましく、０．９～１．６質量％がさらに好ましい。０．５質量％以上とするのは、ゲル強度が著しく低下するのを避けるためである。２質量％以下とするのは、温度を上昇させたときにゲルを容易に再溶解できるからである。
　本発明の基材においては、上記親水性ゲルは、後述する核酸増幅用プライマー等を含む核酸増幅反応溶液とともに、各画分中に保持される。すなわち、当該保持後の各画分中における親水性ゲルには、核酸増幅反応溶液が含まれている状態となる。
３．核酸を増幅するためのプライマー等
　複数種類の標的核酸配列を増幅するためには、アレイ化された複数の画分に、画分ごとに異なる種類のプライマー対が搭載されている必要がある。プライマー自体は、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよいし、特異性及び反応性に影響の無い範囲において、ＲＮＡやＰＮＡ、ＬＮＡ等を用いることも可能である。
　これら異なる種類のプライマー対は、標的核酸配列の増幅に必要な特異性が確保可能な範囲で、それぞれ、ＧＣ含量や配列長を調整し、核酸増幅反応の反応条件がプライマー間で同等となるように設計されたものであることが望ましい。例えば、アニーリングの温度や標的配列である増幅産物の長さが著しく異なる場合、それぞれの画分において、適切な反応温度や時間が異なり、同時に反応させることが困難となる可能性があると考えられるためである。このようなプライマーの設計は、当業者において適宜実施することが可能である。
　一組のプライマー対は、一箇所の画分のみに含まれていてもよいし、複数の画分に含まれていてもよい。同一のプライマー対を複数の画分に搭載することによって、再現性を検証することも可能であるし、増幅の認められた画分と認められなかった画分の個数から、標的核酸の定量をすることも可能である。
　プライマーは、核酸増幅反応に使用できる限りにおいて、アミノ化、ビオチン化、蛍光標識等の修飾がなされていてもかまわない。また、目的によっては、１つの画分中に２種類以上のプライマー対が含まれていてもかまわない。
　各画分に含まれるプライマーの濃度は特には限定されず、標的核酸の種類や増幅反応に使用する酵素の種類等によって適宜選択することができる。例えば、１～１０００ｆｍｏｌ／μＬであることが好ましく、１０～１００ｆｍｏｌ／μＬであることがより好ましく、２０～５０ｆｍｏｌ／μＬであることがさらに好ましい。１ｆｍｏｌ／μＬ以上とすることにより、効率的に標的核酸配列が増幅させることができる。また、１０００ｆｍｏｌ／μＬ以下とすることにより、非特異的な増幅やプライマーダイマーの形成を抑制することができる。
　なお、画分中に前記親水性ゲルとともに保持される核酸増幅反応溶液には、上記プライマー以外の各種成分、例えばｄＮＴＰや、バッファー成分、ＤＮＡポリメラーゼ等を予め含有させることができ、場合によってはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩやＥｔＢｒ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等の二本鎖核酸特異的なインターカレータを予め含有させることも可能である。ゲルの保水性を高めるために、グリセロールを含んでいてもよい。複数種類のサンプルを扱う場合でなければ、テンプレート溶液を予め導入しておくことも可能である。
　ここで、バッファー成分としては、限定はされないが、例えば、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．４～９．０、２５℃）、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％　ゼラチンまたは０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００の混合物等が好ましく挙げられる。
　また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定はされないが、例えば、ｐｏｌＩ型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼやＴｔｈポリメラーゼ、もしくはα型の耐熱性ポリメラーゼ、例えばＰｆｕポリメラーゼやＫＯＤポリメラーゼ等が好ましく挙げられる。
４．本発明の基材の製造
　本発明の核酸増幅反応用基材は、基材を作製した後に画分を形成することもできるし、中空の管や繊維を用いて基材を製造することもできる。例えば、以下の工程を含む方法により安価かつ大量に製造することが可能である。
（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
（２）プライマー対を含むゲル前駆体溶液を、予め加温した中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程
（３）中空繊維束の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、プライマー対を含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程
（４）疎水性の液体中で、中空繊維束を繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化する工程。
　本方法に使用できる繊維としては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、天然繊維等が挙げられる。合成繊維の代表例としては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等から成るフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維等が挙げられる。半合成繊維の例としては、ジアセテート、トリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）等が挙げられる。天然繊維の代表例としては、綿、亜麻等の植物繊維、羊毛、絹等の動物繊維、石綿等の鉱物繊維等が挙げられる。
　繊維の形態としては、公知の中空繊維を使用することができる。繊維の直径は、１ｍｍ以下、数十ミクロン以上が好ましい。また、このようにして作られた画分の内壁は、ＢＳＡ等のタンパク質吸着阻害作用を有する物質で覆うことで、ポリメラーゼ等が吸着することを防止することも可能である。放射線処理等での滅菌や、プラズマ処理等での親水化も可能である。
　ゲルを介して生体関連物質を保持するとは、例えば、繊維が中空繊維の場合は中空部に、ゲルが化学的又は物理的な相互作用を利用して保持され、保持されているゲルに生体関連物質が化学的又は物理的な相互作用を利用して保持されている状態をいう。本方法に用いることができるゲルは、特に制限されないが、例えば、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。
　次に複数の繊維が包埋された中空繊維束について説明する。
複数の繊維を各繊維軸が略同一となるように整然と配列するには、例えば、ＷＯ００／５３７３６号記載の配列治具を用いて規則正しく配列させる。配列を構成する繊維の本数は、１ｃｍ２あたり１０～１，０００，０００本で配列させることができる。当該繊維の本数は、本発明の基材の画分数に応じて適宜選択することができる。
　前記配列した繊維を固定するために、配列状態の繊維間に包埋剤を均一に注入して硬化させる。包埋剤の種類は、架橋性プレポリマーから成る包埋剤、重合オリゴマーと触媒から成る包埋剤及び熱可塑性ポリマー等が挙げられる。
　架橋性プレポリマーから成る包埋剤としては、ポリウレタン樹脂が挙げられる。ポリウレタン樹脂は、主剤である架橋性プレポリマーのポリイソシアネートに硬化剤を加えて作ることが出来る。硬化剤の例としては、アルコール類やケトン類、アミド類、エステル類、ヒマシ油系ポリオール等が挙げられる。これらの中でも沸点が６０℃以上のものが特に好ましく、具体例としてはグリセロール、ポリエチレングリコール、メチルエチルケトン、アセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、酢酸エチル等を挙げることができる。また、ポリウレタン樹脂以外に、エポキシ樹脂、シリコン樹脂等を利用することもできる。
　重合性オリゴマーと触媒から成る包埋剤としては、（メタ）アクリル酸エステル〔Ａ〕と〔Ａ〕成分に可溶な（メタ）アクリル系重合体または共重合体〔Ｂ〕を含有するアクリル系シラップが例として挙げられる。
　上記〔Ａ〕成分の具体例としては、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸ｔ－ブチル、アクリル酸２－エチルヘキシル等のアクリル酸エステル；メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸ｉ－ブチル、メタクリル酸ｔ－ブチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸２－エチルへキシル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸２－ヒドロキシエチル、メタクリル酸２－ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸ジエチルアミノエチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリル、メタクリル酸アリル等のメタクリル酸エステルが挙げられ、これらは、１種または２種以上を混合して使用することができる。
　〔Ａ〕成分として上述のいずれかのモノマーを単独で（一種類だけで）硬化させて得られる樹脂のガラス転移温度（硬い状態から軟らかい状態に変わる温度）が低い場合には、柔らかくなる傾向にあり、ガラス転移温度が高いと得られる硬化物は硬くなる傾向にある。そこで、所望する包埋剤硬度を発現させるには、この〔Ａ〕成分のホモポリマーとしてのガラス転移温度をもとに、〔Ａ〕成分を適宜選択して使用することが好ましい。
　上記〔Ｂ〕成分として用いられる（メタ）アクリル系重合体は、〔Ａ〕成分に可溶である必要がある。なお、「可溶」とは、分散状態も含む。〔Ｂ〕成分の具体例としては、例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸ｉ－ブチル、メタクリル酸ｔ－ブチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸２－エチルへキシル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸ｔ－ブチル、アクリル酸２－エチルヘキシル等から選ばれる単量体の単独重合体もしくは共重合体が挙げられる。これらは、１種または２種以上を混合して使用することができる。〔Ａ〕成分と〔Ｂ〕成分の使用割合は、〔Ａ〕成分と〔Ｂ〕成分から成るアクリル系シラップを１００質量部としたとき〔Ａ〕成分は４０～８０質量部の範囲、〔Ｂ〕成分は２０～６０質量部の範囲であり、好ましくは、〔Ａ〕成分は４０～７０質量部の範囲、〔Ｂ〕成分は３０～６０質量部の範囲である。
　また、薄片化を行う上で、〔Ａ〕成分と〔Ｂ〕成分から成るアクリル系シラップに、ウレタンオリゴマー、ウレタンポリマー又はその他のゴム成分を適宜添加することが好ましい。アクリル系シラップの重合開始剤としては、使用する溶剤に溶解可能なアゾ系、過酸化物系、レドックス系等の開始剤を使用することができる。例として、２，２′－アゾビスイソブチロニトリル、２，２′－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）イソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、又は過酸化ベンゾイル－ジメチルアニリン系等が挙げられる。
　熱可塑性ポリマーである包埋剤としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、メタクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアセタール、ＰＢＴ樹脂、ポリフェニレンサルファイド、ポリアリレートポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリメチルペンテン、ポリエーテルイミド等が挙げられる。
　前記包埋剤により包埋した包埋物は、核酸増幅反応用基材として利用する場合、生体関連物質の検出において低蛍光強度が要求されることがある。そのような場合には、前記包埋剤にカーボンブラックや消光剤等を添加することが好ましい。また、使用する繊維の種類に応じて、繊維と包埋剤との密着性を考慮し包埋剤を選択することが好ましい。例えば、ポリメタクリル酸メチル中空繊維には、アクリレート系シラップから成る包埋剤が好ましい。
　前記包埋剤の硬化温度は、繊維材料のガラス転移温度以下であることが好ましい。１００℃以下であることがさらに好ましい。このように複数の繊維が包埋された包埋物を、硬度が７０～９５（ＪＩＳ　Ｋ　７２１５により測定）で、繊維を交差する方向で薄片化することにより、薄片の表面が平滑で、且つ繊維の脱落のない生体関連物質が保持された繊維配列体薄片を得ることができる。包埋剤の硬度とは、ＪＩＳ　Ｋ　７２１５により測定されるものであり、加圧面が包埋物に密着してから５秒後に測定した硬度をいう。
　ゲルを前記の中空繊維を使用した画分を有する基材に保持させる場合は、予め加温した前記中空繊維束にゲル前駆体溶液を充填させた後、中空繊維束内でゲル化させて保持させることができる。ここで、ゲル前駆体溶液とは、プライマー対を含むゲル化していない溶液をいう。また、上記中空繊維束を予め加温しておく温度は、充填するゲル前駆体溶液の種類等により適宜設定することができ、限定はされないが、例えば、５０～９０℃であることが好ましく、より好ましくは６０～８０℃、さらに好ましくは７０～７５℃である。予め中空繊維束を加温しておくことにより、中空繊維束内へのゲル前駆体溶液の導入が極めてスムーズに行われる等の効果が得られる。その後、ゲル状物を保持した中空繊維束を、疎水性の液体中で、繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化する（すなわち、中空糸束の貫通孔の配向方向に対し、垂直な方向に薄片化する）ことで、ゲルを保持させた核酸増幅反応用基材を得ることができる。ここで、疎水性の液体とは、限定はされないが、例えば、ミネラルオイル及び流動パラフィン等が好ましく例示できる。上記薄片化を、疎水性の液体中で行うことにより、薄片化後においてもゲル状物が中空糸内に十分に保持されたままの品質の高い基材が得られる。
　ゲル前駆体溶液を中空繊維束内に充填する方法は、例えば、微細な針を有するシリンジに前記溶液を吸引し、各中空繊維の中空部に針を差し込むことにより導入することができる。
　また、中空繊維を樹脂で固めて製造する中空繊維束を用いる場合において、中空繊維束の一方の端部が固定されていない場合は、次の方法によりゲル前駆体溶液を中空繊維内へ導入することもできる。まず中空繊維束の固定されている端部の中空部を封止し、もう一方の固定されていない端部の中空部を開放しておく。次にプライマー対を含むゲル前駆体溶液を調製し、該ゲル前駆体溶液及び前記中空繊維束をデシゲーター内に設置し、次いで中空繊維束の中空繊維が固定されていない端部を、この溶液中に浸し、デシゲーター内を減圧状態にした後、常圧に戻すことにより、中空繊維の溶液に浸した端部より、この溶液を中空繊維中空部へ導入することができる。
　中空繊維の中空部に導入されたゲル前駆体溶液をゲル化することにより、プライマー対を中空繊維の中空部に保持させる。ゲル化条件は特には限定されず、使用したゲル前駆体の種類等により適宜選択することができる。例えば、アガロースであればあらかじめ加熱し、液体としておいたゲル前駆体溶液を、ゲル化温度以下まで冷却することでゲル化が可能である。
　次に繊維を配列させた包埋物の薄片化について説明する。
薄片化する際は、包埋物を、該包埋物の繊維軸に対して交差する方向に切断する。切断する角度は限定されず実験等の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、繊維軸に対して４５～９０°、好ましくは６０～９０°、さらに好ましくは直交する方向（繊維軸に対して９０°）である。
　切断に用いる刃物の刃先角度は２０°以下であることが好ましく、１５°以下であることがさらに好ましい。刃物の材質としては、例えば、カーボン鋼、ＳＵＳ、超硬合金等が例示できる。また、装置としては市販のミクロトームを使用して薄片化を実施することも可能である。薄片の厚さは、上述したとおりである。
　このように作成された薄片は、多数の標的核酸配列を増幅するための、核酸増幅反応用基材として使用できる。
５．本発明の基材の使用
　本発明の核酸増幅反応用基材を用いて核酸を増幅及び検出する方法は、プライマーを用いる方法であれば、熱サイクルをかけるＰＣＲ法であっても、等温反応のＬＡＭＰ法であってもよい。これらの手法は当業者であれば核酸増幅反応の条件設定、プライマー設計等は適宜実施できる。ただし、反応時の温度が核酸増幅反基材におけるゲルの融点以上であることが必要である。
　核酸増幅用基材を核酸増幅反応に使用する方法として、以下に示す方法が可能である。
　テンプレートの供給
　まず反応開始前に、本発明の基材中の各画分に、サンプルとなる標的塩基配列を含む核酸（以下、「テンプレート」という。）を供給する。当該テンプレートは、例えば、粉末状などの固体で供給することもできるし、溶液として供給することもできる。
　テンプレートは通常の核酸増幅反応で用いられる鋳型となる核酸であれば、どのようなものでも使用可能である。通常は含有される核酸を調べるために天然物由来のものが使われるが、そこから精製された核酸を用いることも可能であるし、用途によっては細胞や組織の破砕液やその上清を用いることも可能である。また、人工的に合成された核酸をテンプレートとして用いることも可能である。ｍＲＮＡからの逆転写産物をテンプレートとすることも可能である。
　テンプレートは、溶液としてピペットのような分注器具を用いて各画分に供給することもできる。このようにして、各画分に分注したプライマーの遊離と混合を防ぐことが可能である。アレイヤーやマニピュレータ等の装置を用いて基材の各画分に供給することも可能である。
　一方、テンプレート溶液を、滴下し乾燥させることでテンプレート供給用材料に塗布したものを、基材表面に貼り付けることで、各画分に一度にテンプレートを供給することも可能である。この場合、テンプレートの形状は板状であってもよいし、シート状又はフィルム状であってもよい。
　テンプレート供給用材料を本発明の基材に貼り付けたまま反応に供する場合は、テンプレート供給用材料についても核酸増幅反応で使用される程度の耐熱性があることが必要であり、増幅産物を直接検出するために、適用した検出方法を阻害しない材質であることが望ましい。また、テンプレート供給用材料は、その使用の簡便のため、ゲル以外の基盤表面に圧着可能であることが望ましい。
　このようなテンプレート供給用材料としては、ポリオレフィン製のフィルム等が挙げられる。また、リアルタイムＰＣＲ等におけるウェルの封止に用いられるようなフィルムを使用することも可能である。
　テンプレート供給用材料にテンプレートを塗布する方法としては、ピペット等の液体取り扱い器具を用いてもよいし、綿棒や筆、ペーパーポイント等でサンプル溶液を吸着したものを、フィルム上に塗りつける方法でもよい。均一に塗布するために、フィルムに滴下したテンプレート溶液を中心部分で回転させることで塗布することも可能である。
　テンプレート溶液を供給するとき、画分が基材を貫通しないものである場合、画分と接触する面上にテンプレートを含むテンプレート供給用材料を接触させることができる。また、図２に断面図を例示するように、画分が基材を貫通するものである場合は、テンプレートを含むテンプレート供給用材料を基材の両面に接触させることもできるし、どちらか一方の面にテンプレートを含むテンプレート供給用材料を接触させ、もう片方の面はテンプレートを含まない材料を接触させることも可能である（図３）。
　テンプレート供給用材料は、必要に応じて各種表面処理を実施してもよい。例えば、サケ精子ＤＮＡ等のブロッキング剤で覆う（処理する）ことで、テンプレートとなる核酸がテンプレート供給用基材表面に固着することを防止することも可能である。放射線処理等で滅菌することや、プラズマ処理等で親水化することも可能である。
　上記のようにテンプレートを接触させた核酸増幅反応用基材については、基材の片面、もしくは両面を熱源にて挟み込むことで核酸増幅反応を実施することが可能である。この場合、画分内のゲルや、ゲルの溶解物が漏洩しないよう、画分の末端を封止することが必要である。
　また、例えば、核酸増幅反応用基材を、図４に例示するように、ミネラルオイル等ゲル内容物が漏洩しないような疎水性の液体に包埋（浸漬）させた上で、核酸増幅反応を実施することも可能である。ミネラルオイルはゲル溶液との間で境界を形成するため、画分の末端を封止する必要が無い。またこの場合、テンプレートを接触させるために用いたフィルムをはがしてから核酸増幅反応に供することも可能である。
　反応時に、核酸の二本鎖特異的に蛍光を発するインターカレータを入れることで、増幅の有無を市販の蛍光検出器や蛍光顕微鏡等を用いて簡便に確認することも可能である。
　さらに、増幅後、ミネラルオイルと共に遠心することで、内部のゲルを取り出すことも可能である。取り出したゲルを溶解し、内部の増幅核酸を取得することも可能である。予め、取得目的以外の画分を封止しておくことにより、目的となるゲルのみを取得することも可能となる。
　基材の加熱
　テンプレート供給後の基材を加熱することにより、核酸増幅反応を行う。核酸を増幅させる際の反応条件（加熱条件）は限定されず、使用する酵素（ポリメラーゼ等）、テンプレート等に応じて適宜選択することができる。例えば、ＰＣＲ法を行う場合は、熱サイクルとして、二本鎖核酸を乖離させるために９８℃で１０秒間、アニーリングのために５５℃で３０秒間、核酸の伸長反応のために７２℃で１分間加熱する工程を３０サイクル程度繰り返すことなどが例示できる。各工程の温度や時間及びサイクル数については、当業者であれば宜選択することが可能である。また、ＬＡＭＰ法を行う場合は、例えば５０～７０℃で等温加熱することが例示でき、加熱時間は当業者であれば宜選択することができる。
６．キット
　本発明の基材は、核酸増幅用キットとして使用することも可能である。キットには、本発明の基材と、テンプレート供給用基材とを含むことが好ましい。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　樹脂ブロックの作製
　板の中央部に直径０．３２ｍｍの孔が０．４２ｍｍ間隔で、格子状に１９×１２、２２８個配列された、厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を用い、その多孔板の全ての孔に、カーボンブラックで着色したポリカーボネート製中空繊維（三菱レイヨン株式会社製、外径０．２８ｍｍ、内径０．１８ｍｍ、長さ５００ｍｍ）を通過させ、この２枚の繊維を通過させた多孔板を５０ｍｍ離間させ、離間した多孔板間に、カーボンブラックで着色したポリウレタン樹脂（日本ポリウレタン工業株式会社製、ニッポラン４２７６及びコロネート４４０３）を充填し、長さ５０ｍｍ、７×１２ｍｍ角の角柱状の両端に樹脂で固定化されない部分を有する樹脂ブロックを得た。
　ＰＣＲ溶液の調製
　検出対象の異なる３種類のプライマー対、すなわち、計６種類のプライマー（下記のＡ１（配列番号１），Ａ２（配列番号２），Ｂ１（配列番号３），Ｂ２（配列番号４），Ｃ１（配列番号５），Ｃ２（配列番号６））を、各１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度となるように準備し、ｄＮＴＰ、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲプレミックス（タカラバイオ（株）ＰｒｅｍｉｘＴａｑ）、アガロース（タカラバイオ（株）ＬＯ３）、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｃｙ５（ＧＥヘルスケア社）、超純水を用いてプライマー対に応じた３種類の核酸増幅反応溶液を調製した（下表１参照）。
プライマーＡ１：caggcagacggaagagttcg（配列番号１）
プライマーＡ２：ttatcacgtccttcttcgcc（配列番号２）
プライマーＢ１：cagatatttgacataactagggaag（配列番号３）
プライマーＢ２：ctttcgcttgaccatattattgtcc（配列番号４）
プライマーＣ１：gaaactatatagtagaacaaacaag（配列番号５）
プライマーＣ２：atcggctcttactacctaggc（配列番号６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　核酸増幅反応溶液の樹脂ブロックへの導入
　調製した３種類の核酸増幅反応溶液をヒートブロックで８０℃、５分加熱し、アガロースを溶解させた。アガロースの溶解した核酸増幅反応溶液中に、予め６５℃に加熱しておいた樹脂ブロックの、末端からはみ出した中空繊維を５本ずつ浸漬し、当該中空繊維の逆端からゲル溶液を吸うことで、樹脂ブロック内へ核酸増幅反応溶液を導入した。
樹脂ブロックを室温まで冷却し、内部の核酸増幅反応溶液をゲル化した。
　スライスによる、核酸増幅反応用基材の取得
　上記で得た３種類のプライマー対を含む核酸増幅反応溶液からなるゲルが充填された樹脂ブロックを、ミクロトームを用いて２５０μｍの厚さに切り出し、縦１２×横１９の計２２８本の孔が規則的に配列された、核酸増幅反応用基材を得た。乾燥紡糸のため、得られた核酸増幅反応用基材の両面をセロハンテープで封止した。
　テンプレート溶液のシートへの塗布
　テンプレート溶液として、プライマーＡ１及びＡ２の組み合わせでのみ増幅が可能な標的核酸配列Ａ（配列番号７）からなるＤＮＡを１ａｍｏｌ／μＬの濃度にて用意した。
　標的核酸配列Ａ：
caggcagacggaagagttcgctatagctcagttggttagagcgctacactgataatgtagaggtcggcagttcaactctgggcgaagaaggacgtgataa（配列番号７）。
　テンプレート溶液１０μＬを、１ｃｍ角に切り出した圧着用シート（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社　Ｍｉｃｒｏ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ａｄｈｅｎｓｉｖｅ　ｆｉｌｍ）に滴下し、ピペットの先でシート上に塗布し、室温で静置して乾燥させた。
　核酸増幅反応用基材と、テンプレート塗布済みシートの接触
　核酸増幅反応用基材の片面のセロハンテープを剥がし、同じ面にテンプレート溶液を塗布したシートを圧着した。その後、逆側のセロハンテープを剥がし、５０μＬのミネラルオイル（ＱＩＡＧＥＮ社）が入ったサンプルチューブに浸漬した。
　ＰＣＲ実施前の検出
　ＰＣＲ実施前に、蛍光顕微鏡を用い、ミラーユニット（オリンパス　ＷＩＢ－ＵＭＷＩＢ３）にて二本鎖核酸に特異的にインターカレートしたＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩの蛍光を検出、ＣＣＤカメラにて撮像の後、各孔における蛍光の強度を画像処理ソフト（Ｍｅｄｉａ　Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社　ＩｍａｇｅＰｒｏ）にて数値化した（図５）。ＰＣＲ反応を実施していないため二本鎖核酸は生成されておらず、ここで得られたシグナルはバックグラウンドとみなすことが可能である。
　ＰＣＲの実施
　核酸増幅反応用基材を浸漬したエッペンチューブを、サーマルサイクラーにセットし、９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返した。
　増幅産物の検出
　蛍光顕微鏡を用い、ミラーユニット（オリンパス　ＷＩＢ－ＵＭＷＩＢ３）にて二本鎖核酸に特異的にインターカレートしたＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩの蛍光を検出、ＣＣＤカメラにて撮像の後、各孔における蛍光の強度を画像処理ソフト（Ｍｅｄｉａ　Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社　ＩｍａｇｅＰｒｏ）にて数値化したところ、３種類のプライマーセットのうち、プライマー対Ａを導入した画分でのみ、シグナル強度の有意な増強が確認された。
　従って、使用した核酸増幅用基材に保持された３種類のプライマー対の内、プライマー対Ａを保持したゲルでのみ特異的な増幅が行われたことがわかった（図５）。
　実施例１に記載の方法と同様の方法にて樹脂ブロック及び核酸増幅反応溶液を調製した。ただし、核酸増幅反応溶液については、本実施例ではプライマーを含めず、該溶液単一の組成とした。
　核酸増幅反応溶液の樹脂ブロックへの導入
　調製した核酸増幅反応溶液をヒートブロックで８０℃、５分加熱し、アガロースを溶解させた。ヒートブロック及び樹脂ブロック等を全て７０℃環境の恒温装置に入れ、当該温度条件下において、アガロースの溶解した核酸増幅反応溶液に対して樹脂ブロックの末端からはみ出した中空繊維を１９本ずつ浸漬し、当該中空繊維の逆端からゲル溶液を吸うことを１２回繰り繰り返し、樹脂ブロック内へ核酸増幅反応溶液を導入した。
　樹脂ブロックを室温まで冷却し、内部の核酸増幅反応溶液をゲル化した。
　スライスによる、核酸増幅反応用基材の取得
　上記で得た核酸増幅反応溶液からなるゲルが充填された樹脂ブロックを、ミネラルオイル（ＱＩＡＧＥＮ社）で樹脂ブロック表面及びスライス刃を被覆した条件下（具体的には、樹脂ブロックをミネラルオイル中に浸漬させた状況下）において、ミクロトームを用いて５００μｍの厚さに切り出し、縦１２×横１９の計２２８本の孔が規則的に配列された核酸増幅反応用基材を１５枚得た。
　また、同一の樹脂ブロックを用い、ミネラルオイルを使用しない条件下において、ミクロトームを用いて５００μｍの厚さに切り出し、同様の核酸増幅反応用基材を１５枚得た。
　スライスして得られた核酸増幅反応用基材について、それぞれを光学顕微鏡にて観察し、樹脂ブロック中の中空糸内に担持されたアガロースゲルの割合（残存割合）を調べたところ、図６に示す結果となった。
　すなわち、アガロースゲルをスポットに用いる際には、ゲルが充填された樹脂ブロックをミネラルオイル等の疎水性液体中にてスライスすることで、安定した品質の核酸増幅反応用基材を得ることができることが明らかとなった。
　本発明の基材及び方法を用いることにより、検出対象となる生体関連物質の増幅効率又は検出効率を有意に向上させることができる。
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：テンプレート

Claims (10)

  1. 　アレイ化された複数の画分を有し、当該画分中に、核酸を増幅するための異なる種類のプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファー成分を含む加熱により溶解し得る親水性ゲルが保持された、核酸増幅用基材。
  2. 　各画分中のプライマーの濃度が、１～１０００ｆｍｏｌ／μＬである請求項１に記載の基材。
  3. 　バッファー成分が、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ゼラチン及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載の基材。
  4. 　親水性ゲルが、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ビニルアルコール及びエチレングリコールからなる群より選ばれる少なくとも１種をモノマー成分として用いて調製されたゲルである、請求項１～３のいずれか１項に記載の基材。
  5. 　親水性ゲルがアガロースゲルである、請求項１～３のいずれか１項に記載の基材。
  6. 　親水性ゲルの濃度が０．５～２質量％である、請求項１～５のいずれか１項に記載の基材。
  7. 　各画分の大きさは、該画分の形状の最大幅が１０μｍ～１０００μｍである、請求項１～６のいずれか１項に記載の基材。
  8. 　下記工程を含む、請求項１に記載の核酸増幅用基材の製造方法。
    （１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
    （２）プライマーを含むゲル前駆体溶液を、予め加温した中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程
    （３）中空繊維束の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、プライマーを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程
    （４）疎水性の液体中で、中空繊維束を繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化する工程
  9. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の基材とテンプレート供給用基材とを含む、核酸増幅用キット。
  10. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の基材の各画分にテンプレートを供給する工程、及び、当該供給後の基材を加熱する工程を含む、核酸増幅方法。
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