WO2013094307A1 - エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置 - Google Patents

エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2013094307A1
WO2013094307A1 PCT/JP2012/077621 JP2012077621W WO2013094307A1 WO 2013094307 A1 WO2013094307 A1 WO 2013094307A1 JP 2012077621 W JP2012077621 W JP 2012077621W WO 2013094307 A1 WO2013094307 A1 WO 2013094307A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
exosome
antigen
analysis
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/077621
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
孝広 落谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to US14/367,651 priority Critical patent/US11391741B2/en
Priority to JP2013550169A priority patent/JP6029112B2/ja
Priority to CA2860144A priority patent/CA2860144C/en
Priority to EP12860743.9A priority patent/EP2801822B1/en
Publication of WO2013094307A1 publication Critical patent/WO2013094307A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/830,991 priority patent/US12013399B2/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • the present invention relates to an exosome analysis method, an exosome analysis reagent, and an exosome analysis apparatus.
  • tumor-related antigens that are characteristically expressed in cancer cells are used for cancer diagnosis.
  • an analysis method using an antibody that specifically binds to the tumor marker is used.
  • Non-patent Document 1 the amount of exosomes in blood increases as cancer progresses.
  • Non-Patent Document 1 The analysis of exosomes in blood in Non-Patent Document 1 is based on the analysis of specific microRNA (miRNA) expressed in exosomes, and the analysis of miRNA requires complicated operations.
  • miRNA microRNA
  • an object of the present invention is to provide an exosome analysis method, a reagent for exosome analysis, and an exosome analyzer that can easily analyze exosomes in a sample.
  • the exosome analysis method of the present invention is an exosome analysis method for analyzing exosomes in a sample, In the sample, An addition step of adding a first antibody that specifically binds to the first antigen of the exosome, and a second antibody that specifically binds to the second antigen of the exosome; Reacting the first antigen and the first antibody and reacting the second antigen and the second antibody; And a detection step of detecting a reaction between the first antigen and the first antibody and a reaction between the second antigen and the second antibody.
  • the reagent for exosome analysis of the present invention is a reagent used for analysis of exosomes in a sample, A first antibody that specifically binds to a first antigen of the exosome; A second antibody that specifically binds to a second antigen of the exosome, It is used for the analysis method of the present invention.
  • the exosome analyzer of the present invention is an apparatus for analyzing exosomes in a sample, In the sample, An adding means for adding a first antibody that specifically binds to the first antigen of the exosome, and a second antibody that specifically binds to the second antigen of the exosome; Reaction means for reacting the first antigen and the first antibody and reacting the second antigen and the second antibody; Detecting means for detecting a reaction between the first antigen and the first antibody and a reaction between the second antigen and the second antibody; It is used for the analysis method of the present invention.
  • exosomes in a sample can be easily analyzed.
  • the analysis method of the present invention is extremely useful for the diagnosis of cancer such as the presence or absence of onset of cancer, the presence or absence of cancer recurrence, and the like, and is expected to be applied to clinical tests.
  • the analysis method of the present invention can be performed efficiently.
  • FIG. 1A is a schematic diagram illustrating an example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram for explaining another example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 1C is a schematic diagram for explaining still another example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 2A is a graph showing the results of confirming that the antibody is biotinylated in the examples of the present invention.
  • FIG. 2B is a graph showing the results of confirming that the antibody was bound to AlphaLISA acceptor beads (Acceptor Beads) in the examples of the present invention.
  • FIG. 2C is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD63, acceptor beads (Acceptor Beads) binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD63) used for quantitative exosome analysis in the examples of the present invention.
  • FIG. 2D is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD9, acceptor beads (Acceptor Beads) -binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD9) used for exosome quantitative analysis in the examples of the present invention. .
  • FIG. 2D is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD9, acceptor beads (Acceptor Beads) -binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD9) used for exosome quantitative analysis in the examples of the present invention. .
  • FIG. 2E is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD81, acceptor beads (Acceptor Beads) binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD81) used for quantitative analysis of exosomes in the examples of the present invention.
  • FIG. 2F is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD63, acceptor beads (Acceptor Beads) binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD9) used for exosome quantitative analysis in the examples of the present invention. .
  • FIG. 2G is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD9, acceptor beads (Acceptor Beads) binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD81) used for quantitative exosome analysis in the examples of the present invention.
  • FIG. 2H is a calibration curve (biotinylated antibody: Purified Mouse Anti-Human CD81, acceptor beads (Acceptor Beads) binding antibody: Purified Mouse Anti-Human CD63) used for quantitative analysis of exosomes in the examples of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of exosomes in the sera of prostate cancer patients and the sera of healthy individuals in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the analysis results of exosomes in the serum immediately after excision surgery of a liver cancer patient and in the serum at the time of recurrence in Example 2 of the present invention.
  • the exosome analysis method of the present invention is an exosome analysis method for analyzing exosomes in a sample, wherein the first antibody specifically binds to the first antigen of the exosome, And an addition step of adding a second antibody that specifically binds to a second antigen of the exosome, and a reaction of reacting the first antigen and the first antibody to react the second antigen and the second antibody And a detection step of detecting a reaction of the first antigen and the first antibody and a reaction of the second antigen and the second antibody.
  • the sample is not particularly limited, and examples thereof include biological samples.
  • the biological sample is not particularly limited, and examples thereof include blood, urine, sweat, saliva, breast milk, semen, lymph, cerebrospinal fluid, and tears.
  • Examples of the blood sample include whole blood, serum, plasma and the like, and among these, serum is particularly preferable.
  • the sample is preferably a liquid sample (liquid sample) because it is easy to handle, for example.
  • a liquid sample liquid sample
  • an undiluted liquid may be used as a liquid specimen as it is, or a diluted liquid suspended, dispersed or dissolved in a solvent may be used as a liquid specimen.
  • a diluted solution suspended, dispersed or dissolved in the solvent may be used as the liquid sample.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water and a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known buffer solutions.
  • the sample may be prepared, for example, by preparing exosomes from the blood or the like by ultracentrifugation or the like and adding the solvent or the like thereto.
  • the amount of the sample used is not particularly limited and is, for example, in the range of 1 to 15 ⁇ L.
  • exosomes can be analyzed with a small amount of sample.
  • the amount of the sample used is preferably in the range of 1 to 10 ⁇ L, more preferably in the range of 1 to 5 ⁇ L.
  • the exosome is a membrane vesicle covered with a lipid bilayer having a diameter of 30 to 100 nm and secreted from animal cells, and has an antigen.
  • exosomes in a sample are analyzed using two antigens (the first antigen and the second antigen) of the exosome. For this reason, the exosome in a sample can be analyzed easily.
  • the analysis may be, for example, a qualitative analysis, a quantitative analysis, or a semi-quantitative analysis.
  • the first antigen and the second antigen possessed by the exosome are, for example, an antigen that is specifically expressed in the exosome (hereinafter sometimes referred to as “exosome-specific antigen”) or a cell that secretes the exosome.
  • specific antigens hereinafter sometimes referred to as “cell type-specific antigens”.
  • combinations of the first antigen and the second antigen include the following three (1) to (3). (1) first antigen: exosome-specific antigen, second antigen: exosome-specific antigen (2) first antigen: exosome-specific antigen, second antigen: cell type-specific antigen (3) first antigen: cell type Specific antigen, second antigen: exosome-specific antigen
  • exosome-specific antigen examples include CD63, CD9, CD81, CD37, CD53, CD82, CD13, CD11, CD86, ICAM-1, Rab5, Annexin V, LAMP1, and the like.
  • the cell type-specific antigen can be appropriately determined depending on, for example, the type of cell to be analyzed for exosomes.
  • the cell type-specific antigen can be referred to as a cancer cell-specific antigen, for example, Caveolin-1, EpCAM, FasL, TRAIL, Galectine3, CD151, Tetraspanin 8 , EGFR, HER2, RPN2, CD44, TGF- ⁇ and the like.
  • the cells are not limited to the cancer cells, and examples thereof include cells associated with diseases involving exosomes. Specific examples include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, diseases associated with immunodeficiency, infertility. And cells related to mental diseases such as depression and autism, refractory diseases such as Parkinson's disease, autoimmune diseases, rheumatic allergic diseases and the like.
  • the cell type-specific antigen is not limited to the cancer cell-specific antigen, and may be, for example, an antigen that is specifically expressed in a cell related to a disease involving the aforementioned exosome.
  • the first antibody is an antibody that specifically binds to the first antigen
  • the second antibody is an antibody that specifically binds to the second antigen.
  • the first antibody and the second antibody include immunoglobulin (Ig), antibody fragments, chimeric antibodies, and the like.
  • immunoglobulin include IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD.
  • the antibody fragment include Fab, Fab ', F (ab') 2, and the like.
  • the chimeric antibody include a humanized antibody.
  • the antibody may be derived from mammals such as mice, rabbits, cows, pigs, horses, sheep and goats, birds such as chickens, and animal species such as humans, and is not particularly limited.
  • the antibody may be prepared, for example, from serum derived from the animal species by a conventionally known method, or a commercially available antibody may be used.
  • the antibody may be, for example, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is preferably a monoclonal antibody.
  • the first antibody is preferably an antibody that can bind to an excitation label excited by excitation light.
  • the second antibody is a signal that emits a signal due to singlet oxygen generated by excitation of the excitation label.
  • the antibody is conjugated to a developmental label.
  • the excitation label is a label that can bind to the first antibody and is excited by excitation light.
  • the excitation label is preferably an excitation carrier, and specific examples include excitation carriers (so-called “donor beads”) manufactured by PerkinElmer.
  • the wavelength of the excitation light that excites the excitation label is not particularly limited, and can be set as appropriate according to the type of the excitation label.
  • the method for binding the first antibody and the excitation label is not particularly limited.
  • the first antibody may be a biotinylated antibody
  • the excitation label may be a streptavidin-coated label
  • both may be bound.
  • the biotinylation of the first antibody can be performed by a conventionally known method, specifically, for example, by the method described in Examples described later.
  • streptavidin-coated label for example, “AlphaScreen streptavidin donor beads (Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)” manufactured by PerkinElmer can be used.
  • the signal generating label emits a signal by singlet oxygen generated by excitation of the excitation label.
  • the signal generating label is preferably a signal generating carrier.
  • the signal is preferably a fluorescent signal.
  • Specific examples of such a signal generation label include “AlphaLISA Acceptor Beads” (so-called “acceptor beads”) manufactured by PerkinElmer.
  • the method for binding the second antibody and the signal generating label is not particularly limited, and can be performed, for example, by the method described in the Examples below.
  • the exosome analysis is preferably performed in a reaction solution that does not contain a surfactant.
  • the surfactant include Triton X-100. This is because, for example, the analysis accuracy of exosomes may be reduced by including the surfactant in the reaction solution.
  • the analysis method of Embodiment 1 is an embodiment in which antibodies that bind to exosome-specific antigens are used as the first antibody and the second antibody.
  • the analysis method of Embodiment 2 is an embodiment in which an antibody that binds to an exosome-specific antigen is used as the first antibody, and an antibody that binds to a cell type-specific antigen is used as the second antibody.
  • the analysis method of Embodiment 3 is an embodiment in which an antibody that binds to a cell type-specific antigen is used as the first antibody, and an antibody that binds to an exosome-specific antigen is used as the second antibody.
  • the first antibody is an antibody that can bind to the excitation label
  • the second antibody is an antibody that binds to the signal generation label
  • Label is added and serum is used as the sample.
  • Embodiment 1 First, the analysis method of Embodiment 1 is demonstrated.
  • an antibody that binds to an exosome-specific antigen is used as the first antibody and the second antibody, and the addition step, the reaction step, and the detection step are performed.
  • the first antibody, the second antibody, and the excitation label are added to the serum sample.
  • the order of addition of the respective compositions is not particularly limited, and for example, it is preferable to add the first antibody and the second antibody first, incubate, and then add the excitation label.
  • exosome-specific antigens 12 and 13 are expressed in exosome 11.
  • the first antibody 14 and the second antibody 15 bind to exosome-specific antigens 12 and 13 of the exosome 11 in the serum sample.
  • the excitation label 16 is bound to the first antibody 14.
  • the excitation label 16 is excited by the excitation light 18, singlet oxygen is generated.
  • the excitation label 16 and the signal generation label 17 are in close proximity. For this reason, a signal is emitted from the signal generating label 17 by the singlet oxygen. In the detection step, this signal is detected.
  • Embodiment 2 uses an antibody that binds to an exosome-specific antigen as the first antibody, and uses an antibody that binds to a cell type-specific antigen as the second antibody.
  • the addition step, the reaction step, and the detection step are performed.
  • the first antibody, the second antibody, and the excitation label are added to the serum sample.
  • the order of addition of the respective compositions is not particularly limited, and for example, it is preferable to add the first antibody and the second antibody first, incubate, and then add the excitation label.
  • exosome-specific antigen 12 and cell type-specific antigen 23 are expressed in exosome 11.
  • the first antibody 14 binds to the exosome-specific antigen 12 contained in the exosome 11 in the blood sample.
  • the second antibody 25 binds to the cell type specific antigen 23 contained in the exosome 11.
  • the excitation label 16 is bound to the first antibody 14.
  • the excitation label 16 is excited by the excitation light 18, singlet oxygen is generated.
  • the excitation label 16 and the signal generation label 17 are brought close to each other. is there. For this reason, a signal is emitted from the signal generating label 17 by the singlet oxygen. In the detection step, this signal is detected.
  • Embodiment 3 uses an antibody that binds to a cell type-specific antigen as the first antibody, and uses an antibody that binds to an exosome-specific antigen as the second antibody. An addition step, the reaction step, and the detection step are performed.
  • the first antibody, the second antibody, and the excitation label are added to the serum sample.
  • the order of addition of the respective compositions is not particularly limited, and for example, it is preferable to add the first antibody and the second antibody first, incubate, and then add the excitation label.
  • exosome-specific antigen 13 and cell type-specific antigen 22 are expressed in exosome 11.
  • the first antibody 24 binds to the cell type-specific antigen 22 contained in the exosome 11 in the blood sample.
  • the second antibody 15 binds to an exosome-specific antigen 13 contained in the exosome 11.
  • the excitation carrier 16 is bound to the first antibody 24.
  • the excitation carrier 16 is excited by the excitation light 18, singlet oxygen is generated. Since the first antibody 24 is bound to the cell type-specific antigen 22 and the second antibody 15 is bound to the exosome-specific antigen 13, the excitation label 16 and the signal generation label 17 are in close proximity. For this reason, a signal is emitted from the signal generating label 17 by the singlet oxygen. In the detection step, this signal is analyzed.
  • the analysis method of the present invention may further include, for example, a correction step of correcting the detection value in the detection step.
  • the detection value can be corrected based on the correlation between the detection value and the exosome concentration in the sample.
  • the correlation is obtained by, for example, detecting a standard sample with a known exosome concentration in the same manner as the present invention and plotting the detected value of the sample and the detected value of the standard sample.
  • the standard sample is preferably an exosome dilution series. By performing correction in this way, detection with higher reliability becomes possible.
  • the exosomes contained in the sample and the standard sample are preferably exosomes secreted from the same type of cells (for example, the same type of cancer cells).
  • the exosome analysis reagent of the present invention is a reagent used for analysis of exosomes in a sample, and the exosome has a first antibody that specifically binds to the first antigen of the exosome.
  • a second antibody that specifically binds to a second antigen is used in the analysis method of the present invention.
  • the description of the exosome analysis method of the present invention can be cited for the exosome analysis reagent of the present invention.
  • the exosome analyzer of the present invention is an apparatus for analyzing exosomes in a sample, the adding means for adding the first antibody and the second antibody to the sample, the first antigen and A reaction means for reacting the first antibody to react the second antigen and the second antibody; a reaction of the first antigen and the first antibody; and a reaction of the second antigen and the second antibody. And detecting means for detecting, and used in the analysis method of the present invention.
  • the description of the exosome analysis method of the present invention can be cited.
  • the adding means controls, for example, the suction and discharge means for sucking and discharging the first antibody and the second antibody, and the suction amount and / or the discharge amount of each composition, which are arranged inside or outside the analyzer.
  • Control means for example, the suction and discharge means for sucking and discharging the first antibody and the second antibody, and the suction amount and / or the discharge amount of each composition, which are arranged inside or outside the analyzer.
  • Control means controls, for example, the suction and discharge means for sucking and discharging the first antibody and the second antibody, and the suction amount and / or the discharge amount of each composition, which are arranged inside or outside the analyzer.
  • Control means controls, for example, the suction and discharge means for sucking and discharging the first antibody and the second antibody, and the suction amount and / or the discharge amount of each composition, which are arranged inside or outside the analyzer.
  • Examples of the intake / exhaust means include a pump.
  • Examples of the control means include a valve.
  • reaction means examples include means for stirring, sucking and discharging, shaking, and ultrasonic treatment of the reaction solution.
  • the detection means include an optical analysis instrument and the like, and specific examples include a fluorescence measuring apparatus and the like.
  • the detection means may include, for example, excitation light irradiation means for irradiating the reaction liquid with excitation light.
  • the above-described analysis method of the present invention can be executed.
  • the method of using the analyzer of the present invention will be exemplified by using the excitation label and the signal generation label as an example, but the present invention is not limited to this.
  • the blood sample, the first antibody, and the second antibody are arranged inside or outside the analyzer.
  • the first antibody, the second antibody, and the excitation label are added to the sample by the adding means.
  • the order of addition is not particularly limited, and for example, it is preferable to add the excitation label after the first antibody and the second antibody are added to the sample first and incubated.
  • the analyzer of the present invention preferably includes an incubator.
  • the reaction solution is irradiated with excitation light from the excitation light irradiation means, and the signal emitted from the signal generating label is detected by the detection means.
  • the above-described analysis method of the present invention can be performed automatically, for example.
  • Antibodies that bind to exosome-specific antigen The following antibodies (1) to (3) were prepared as antibodies that bind to the exosome-specific antigen.
  • the antibody was biotinylated based on the following procedures (1) to (7) to prepare a biotinylated antibody.
  • the buffer of the prepared antibody was replaced using Zeba Spin Desalting columns 7K MWCO (Thermo).
  • the column was set in a 1.5 mL tube and centrifuged at 1500 ⁇ g (14700 m / s 2 ) for 1 minute.
  • 300 ⁇ L of PBS was added to the column and centrifuged at 1500 ⁇ g (14700 m / s 2 ) for 1 minute. This PBS addition and centrifugation were repeated three times.
  • AlphaLISA Immunoassay Buffer consists of 25 mM HEPES, 0.1% casein, 0.5% Triton X-100, 1 mg / mL dextran-500, 0.05% proclin-300 (proclin-300) as also shown in FIG. 2A.
  • the biotinylation of the antibody was confirmed by assaying using the following procedures (1) to (5) using Anti-mouse IgG AlphaLISA Acceptor Beads (PerkinElmer).
  • the biotinylated antibody was diluted to 1.5, 5, 15, 50 nM (nmol / L) using AlphaLISA Immunoassay Buffer (PerkinElmer).
  • 5 mg / mL Anti-mouse IgG AlphaLISA Acceptor Beads was diluted 100 times with AlphaLISA Immunoassay Buffer (concentration 50 ⁇ g / mL).
  • Antibodies that bind to the exosome-specific antigen include Purified Mouse Anti-Human CD63 (BD Biosciences, Clone: H5C6), Purified Mouse Anti-Human CD9 (BD Biosciences, Clone: M-L13), Purified Mouse Anti-Human There are three types of CD81. For each of these three types, the biotinylated antibody concentration was 1.5, 5, 15, 50 nM (nmol / L), and the signal was analyzed using EnSpire, and the antibody was biotinylated. It was confirmed.
  • the analysis was performed by setting Measure Technology: AlphaScreen (excitation wavelength: 680 nm, detection wavelength: 520 to 620 nm) (hereinafter the same). As a result, as shown in FIG. 2A, the biotinylated antibody bound to AlphaLISA Acceptor Beads and the biotinylated antibody bound to AlphaScreen Streptavidin Donor Beads bind to each other. It was confirmed that
  • an antibody conjugated to AlphaLISA Acceptor Beads (hereinafter sometimes referred to as “Acceptor Beads-binding antibody”) was prepared (final concentration 5 mg / mL). (9) The suspension was lightly spun down after vortexing, and sonicated 20 times per second using a sonicator. This was stored at 4 ° C. under light shielding conditions.
  • Antibodies that bind to the exosome-specific antigen include Purified Mouse Anti-Human CD63 (BD Biosciences, Clone: H5C6), Purified Mouse Anti-Human CD9 (BD Biosciences, Clone: M-L13), Purified Mouse Anti-Human There are three types of CD81.
  • Exosome quantification Exosome preparation
  • Exosomes were prepared from the culture supernatant of cancer cells by ultracentrifugation based on the following procedures (1) to (7).
  • a prostate cancer cell line PC3 obtained from ATCC was seeded in a 15 cm dish and cultured.
  • the cancer cells were washed once with PBS, the medium was changed to Advanced PRMI1640 (Invitrogen) without serum, and cultured for 2 days.
  • the culture supernatant was recovered and centrifuged at 2000 ⁇ g (19600 m / s 2 ) for 10 minutes to recover the supernatant.
  • the supernatant was filtered with a filter (pore size: 0.22 ⁇ m). (5) The filtrate was ultracentrifuged at 100000 ⁇ g (980000 m / s 2 ) at 4 ° C. for 70 minutes. (6) After the ultracentrifugation, the supernatant was removed, PBS was added to the precipitate, and ultracentrifugation was further performed at 100000 ⁇ g (980000 m / s 2 ) at 4 ° C. for 70 minutes. (7) After the ultracentrifugation, the supernatant was removed, PBS was added to the precipitate, left overnight at 4 ° C., and vortexed the next day to collect exosomes.
  • FIG. 2C ((1) above), 1 nM Biotinylated AntiCD63 Antibody and 10 ⁇ g / mL Anti-CD63-conjugated AlphaLISA in AlphaLisa Universal Buffer consisting of 0.1% BSA and 0.05% proclin-300 (proclin-300) in PBS solution. Acceptor beads were added, and the total amount was 50 ⁇ L.
  • Biotinylated AntiCD63 Antibody bound to AlphaScreen Streptavidin-coated Alpha Donor Bead and Biotinylated AntiCD63 Antibody bound to Anti-CD63-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) are respectively PC3 exosomes.
  • FIG. 2E (above (3)), 1 nM Biotinylated AntiCD81 Antibody and 10 ⁇ g / mL Anti-CD81-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) were added to the AlphaLisa Universal Buffer, and the total volume was measured to 50 ⁇ L. did.
  • Biotinylated AntiCD81 Antibody bound to AlphaScreen Streptavidin-coated Alpha Donor Bead and Biotinylated AntiCD81 Antibody bound to Anti-CD81-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) are respectively PC3 exosomes. It shows how it binds to the antigen CD81.
  • FIG. 2F (above (4)), 1 nM Biotinylated AntiCD63 Antibody and 10 ⁇ g / mL Anti-CD9-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) are added to the AlphaLisa Universal Buffer, and the total amount is 50 ⁇ L. did.
  • Biotinylated AntiCD63 Antibody bound to AlphaScreen Streptavidin-coated Alpha Donor Bead and Biotinylated AntiCD63 Antibody bound to Anti-CD9-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) are respectively PC3 exosomes. It showed a state of binding to the antigen CD63 and antigen CD9.
  • FIG. 2G ((5) above), 1 nM Biotinylated AntiCD9 Antibody and 10 ⁇ g / mL Anti-CD81-conjugated AlphaLISA acceptor beads (Acceptor Beads) were added to the AlphaLisa Universal Buffer, and the total volume was measured to 50 ⁇ L. did.
  • Biotinylated AntiCD9 Antibody bound to AlphaScreen Streptavidin-coated Alpha Donor Bead and Biotinylated AntiCD81 Antibody bound to Anti-CD81-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) are respectively PC3 exosomes. It was shown that it was bound to antigen CD9 and antigen CD81.
  • FIG. 2H (above (6)), 1 nM Biotinylated AntiCD81 Antibody and 10 ⁇ g / mL Anti-CD63-conjugated AlphaLISA acceptor beads (Acceptor Bead) were added to the AlphaLisa Universal Buffer, and the total volume was measured to 50 ⁇ L. did.
  • Biotinylated AntiCD81 Antibody bound to AlphaScreen Streptavidin-coated Alpha Donor Bead and Biotinylated AntiCD63 Antibody bound to Anti-CD63-conjugated AlphaLISA Acceptor Bead (Acceptor Bead) are respectively PC3 exosomes. It showed a state of binding to the antigen CD81 and antigen CD63.
  • Example 1 In this example, the serum of prostate cancer patients and the serum of healthy subjects were used to analyze exosomes in the serum, and the difference in the amount of exosomes in the serum of prostate cancer patients and the serum of healthy subjects was confirmed.
  • the graph of FIG. 3 shows the analysis results of exosomes in both sera.
  • the serum of prostate cancer patients contained significantly more exosomes than the serum of healthy individuals. From this result, it was confirmed that by analyzing exosomes in serum, it is possible to distinguish whether the analysis object is a cancer patient or a healthy person. Therefore, according to the present invention, exosomes in blood can be easily analyzed, and for example, it can be said that whether a blood sample provider is a healthy person or a cancer patient can be diagnosed.
  • Example 2 In this example, sera immediately after resection of cancer and sera immediately after resection of the cancer were analyzed using the serum immediately after resection of the cancer of the liver cancer patient and the serum of the same patient after relapse. The difference in the amount of exosomes in was confirmed.
  • FIG. 4 shows the analysis of exosomes in both sera. As shown in FIG. 4, it was confirmed that the sera of the patient after recurrence contained more exosomes than the serum of the liver cancer patient immediately after cancer resection. From these results, it was confirmed that by analyzing exosomes in serum, it was possible to determine whether cancer had recurred after excision surgery in patients who had undergone cancer excision surgery. Therefore, according to the present invention, for example, it can be said that the presence or absence of recurrence after cancer resection surgery in cancer patients can be diagnosed by analyzing exosomes in blood.
  • exosomes in a sample can be easily analyzed.
  • the exosome analysis method of the present invention is extremely useful for the diagnosis of cancer such as the presence or absence of onset of cancer, the presence or absence of cancer recurrence, etc., and is expected to be applied to clinical tests. .
  • Exosome 12 13 Exosome-specific antigen 14, 24 First antibody 15, 25 Second antibody 16 Excitation label 17 Signal generation label 18 Excitation light 22, 23 Cell type-specific antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Registering, Tensioning, Guiding Webs, And Rollers Therefor (AREA)
  • Controlling Rewinding, Feeding, Winding, Or Abnormalities Of Webs (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

　試料中のエクソソームを簡易に分析可能なエクソソームの分析方法を提供する。　本発明のエクソソームの分析方法は、試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、前記試料に、前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体を添加する添加工程と、前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程とを含むことを特徴とする。

Description

エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置
　本発明は、エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置に関する。
　臨床において、がんの診断には、例えば、がん細胞に特徴的に発現する腫瘍関連抗原（いわゆる、腫瘍マーカー）が使用されている。このような腫瘍マーカーの分析には、腫瘍マーカーに特異的に結合する抗体による分析方法が使用されている。
　一方、卵巣がん患者において、がんの進行に伴い、血液中のエクソソーム量が増大することが報告されている（非特許文献１）。
Taylor　et　al.,　Gynecologic　Oncol,　100(2008)　pp13-21
　前記非特許文献１における血液中のエクソソームの分析は、エクソソームにおいて発現している特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の分析によるものであり、ｍｉＲＮＡの分析には、煩雑な操作が必要である。
　そこで、本発明は、試料中のエクソソームを簡易に分析可能なエクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置を提供することを目的とする。
　本発明のエクソソームの分析方法は、試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、
前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
を添加する添加工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程とを
含むことを特徴とする。
　本発明のエクソソーム分析用試薬は、試料中のエクソソームの分析に使用する試薬であって、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体と
を含み、
前記本発明の分析方法に使用する
ことを特徴とする。
　本発明のエクソソーム分析装置は、試料中のエクソソームを分析する装置であって、
前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
を添加する添加手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段と
を含み、
前記本発明の分析方法に使用する
ことを特徴とする。
　本発明によれば、試料中のエクソソームを簡易に分析できる。このため、例えば、本発明の分析方法は、がんの発症の有無、がんの再発の有無等のがんの診断等に極めて有用であり、臨床検査への適用が大いに期待される。また、本発明のエクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置によれば、本発明の分析方法を、効率的に行える。
図１Ａは、本発明の分析方法の一例を説明する模式図である。 図１Ｂは、本発明の分析方法のその他の例を説明する模式図である。 図１Ｃは、本発明の分析方法のさらにその他の例を説明する模式図である。 図２Ａは、本発明の実施例において、抗体がビオチン化されていることを確認した結果を示すグラフである。 図２Ｂは、本発明の実施例において、抗体がAlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Beads)に結合していることを確認した結果を示すグラフである。 図２Ｃは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63、アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63）である。 図２Ｄは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9、アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9）である。 図２Ｅは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81、アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81）である。 図２Ｆは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63、アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9）である。 図２Ｇは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9、アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81）である。 図２Ｈは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81、アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63）である。 図３は、本発明の実施例１における、前立腺がん患者の血清および健常者の血清中のエクソソームの分析結果を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例２における、肝がん患者のがんの切除手術直後の血清および再発時の血清中のエクソソームの分析結果を示すグラフである。
［エクソソームの分析方法］
　本発明のエクソソームの分析方法は、前述のように、試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、前記試料に、前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体を添加する添加工程と、前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程とを含むことを特徴とする。
　前記試料は、特に制限されず、例えば、生体由来の試料等があげられる。前記生体由来の試料は、特に制限されず、例えば、血液、尿、汗、唾液、母乳、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙液等があげられる。前記血液試料は、例えば、全血、血清、血漿等があげられ、これらの中でも、血清が特に好ましい。
　前記試料は、例えば、取り扱いが容易であることから、液状の検体（液体検体）が好ましい。前記試料は、例えば、未希釈液をそのまま液体検体として使用してもよいし、溶媒に、懸濁、分散または溶解した希釈液を液体検体として使用してもよい。前記検体が固体の場合、例えば、前記溶媒に懸濁、分散または溶解した希釈液を液体検体として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、従来公知の緩衝液があげられる。また、前記試料は、例えば、前記血液等から、超遠心法等によりエクソソームを調製し、これに、前記溶媒等を添加して調製してもよい。
　前記試料の使用量は、特に制限されず、例えば、１～１５μＬの範囲である。このように、本発明によれば、例えば、少量の試料で、エクソソームを分析できる。前記試料の使用量は、１～１０μＬの範囲であることが好ましく、より好ましくは１～５μＬの範囲である。
　前記エクソソームは、動物細胞から分泌される直径３０～１００ｎｍの脂質二重膜で覆われた膜小胞であり、抗原を有する。本発明によれば、前記エクソソームが有する二つの抗原（前記第１抗原および前記第２抗原）を利用して、試料中のエクソソームを分析する。このため、試料中のエクソソームを簡易に分析できる。前記分析は、例えば、定性分析でもよいし、定量分析でもよいし、半定量分析でもよい。
　前記エクソソームが有する第１抗原および第２抗原は、例えば、前記エクソソームに特異的に発現している抗原（以下、「エクソソーム特異的抗原」ということがある。）、または前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原（以下、「細胞種特異的抗原」ということがある。）があげられる。前記第１抗原および前記第２抗原の組み合わせは、例えば、下記（１）～（３）の３通りが例示できる。
（１）第１抗原：エクソソーム特異的抗原、第２抗原：エクソソーム特異的抗原
（２）第１抗原：エクソソーム特異的抗原、第２抗原：細胞種特異的抗原
（３）第１抗原：細胞種特異的抗原、　　　第２抗原：エクソソーム特異的抗原
　前記エクソソーム特異的抗原は、例えば、CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、Annexin　V、LAMP1等があげられる。前記細胞種特異的抗原は、例えば、エクソソームの分析対象とする細胞の種類により適宜決定できる。前記細胞が、がん細胞である場合、前記細胞種特異的抗原は、例えば、がん細胞特異的抗原ということができ、例えば、Caveolin-1、EpCAM、FasL、TRAIL、Galectine3、CD151、Tetraspanin　8、EGFR、HER2、RPN2、CD44、TGF-β等があげられる。前記細胞は、前記がん細胞に限定されず、例えば、エクソソームが関与する疾患に関連する細胞があげられ、具体的には、例えば、アルツハイマー等の神経変性疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、リウマチアレルギー性疾患等に関連する細胞があげられる。前記細胞種特異的抗原は、前記がん細胞特異的抗原に限定されず、例えば、前述のエクソソームが関与する疾患に関連する細胞に特異的に発現している抗原でもよい。
　前述のように、前記第１抗体は、前記第１抗原に特異的に結合する抗体であり、前記第２抗体は、前記第２抗原に特異的に結合する抗体である。前記第１抗体および前記第２抗体は、例えば、免疫グロブリン(Ｉｇ)、抗体フラグメント、キメラ抗体等があげられる。前記免疫グロブリンは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等があげられる。前記抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等があげられる。前記キメラ抗体は、例えば、ヒト化抗体等があげられる。前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。前記抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗体が好ましい。
　前記第１抗体は、励起光により励起される励起標識に結合可能な抗体であることが好ましく、この場合、前記第２抗体は、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であることが好ましい。前記励起標識は、前記第１抗体に結合可能であり、励起光により励起される標識である。前記励起標識は、励起担体であることが好ましく、具体的には、例えば、PerkinElmer社製の励起担体（いわゆる、「ドナービーズ」）があげられる。前記励起標識を励起する励起光の波長は、特に制限されず、前記励起標識の種類等に応じて、適宜設定できる。前記第１抗体と前記励起標識との結合の方式は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体をビオチン化された抗体とし、前記励起標識をストレプトアビジン被覆標識とし、両者を結合する方式があげられる。前記第１抗体のビオチン化は、従来公知の方法により行え、具体的には、例えば、後述の実施例に記載の方法より行える。前記ストレプトアビジン被覆標識は、例えば、PerkinElmer社製の「AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)」を使用できる。
　前記シグナル発生標識は、前記励起標識の励起により発生された一重項酸素によりシグナルを発する。前記シグナル発生標識は、シグナル発生担体であることが好ましい。前記シグナルは、蛍光シグナルが好ましい。このようなシグナル発生標識は、具体的には、例えば、PerkinElmer社製の「AlphaLISA　Acceptor　Beads」（いわゆる、「アクセプタービーズ」）があげられる。前記第２抗体と前記シグナル発生標識との結合方法は、特に制限されず、例えば、後述の実施例に記載の方法により行える。
　本発明の分析方法において、エクソソームの分析を妨げない範囲で、反応液には、従来公知の添加剤が含まれていてもよい。ただし、本発明の分析方法においては、エクソソーム分析を、界面活性剤が含まれていない反応液中で行うことが好ましい。前記界面活性剤は、例えば、Triton　X-100等があげられる。前記反応液に、前記界面活性剤が含まれていることで、例えば、エクソソームの分析精度が低下する場合があるためである。前記反応液に、前記界面活性剤を含まないようにするために、前記試料、前記第１抗体および前記第２抗体の調製において、前記界面活性剤を使用しないことが好ましい。
　以下に、本発明の分析方法について、実施形態１～３の３通りの分析方法を例示する。ただし、本発明は、以下の実施形態には限定されない。実施形態１の分析方法は、前記第１抗体および前記第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用する実施形態である。実施形態２の分析方法は、第１抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、第２抗体として、細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用する実施形態である。実施形態３の分析方法は、第１抗体として、細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用し、第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用する実施形態である。実施形態１～３の分析方法において、前記第１抗体は、前記励起標識に結合可能な抗体であり、前記第２抗体は、前記シグナル発生標識に結合した抗体であり、前記添加工程において前記励起標識を添加し、前記試料として血清を使用する。
（実施形態１）
　まず、実施形態１の分析方法について、説明する。実施形態１の分析方法は、前述のように、前記第１抗体および前記第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記添加工程、前記反応工程および前記検出工程を行う。
　まず、前記血清試料に、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を添加する。前記各組成の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を先に添加し、インキュベートした後に、前記励起標識を添加するのが好ましい。
　つぎに、前記反応工程および前記検出工程を、図１Ａの模式図を参照して説明する。
　図１Ａに示すように、エクソソーム１１には、エクソソーム特異的抗原１２および１３が発現している。反応液において、第１抗体１４および第２抗体１５は、前記血清試料中のエクソソーム１１が有するエクソソーム特異的抗原１２および１３に結合する。さらに、第１抗体１４に励起標識１６が結合する。励起標識１６が励起光１８により励起されると、一重項酸素が発生する。ここで、第１抗体１４および第２抗体１５がエクソソーム特異的抗原１２および１３に結合しているため、励起標識１６とシグナル発生標識１７とは、接近した状態にある。このため、前記一重項酸素により、シグナル発生標識１７からシグナルが発せられる。前記検出工程では、このシグナルを検出する。
（実施形態２）
　つぎに、実施形態２の分析方法について、説明する。実施形態２の分析方法は、前述のように、前記第１抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記第２抗体として、細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記添加工程、前記反応工程および前記検出工程を行う。
　まず、前記血清試料に、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を添加する。前記各組成の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を先に添加し、インキュベートした後に、前記励起標識を添加するのが好ましい。
　つぎに、前記反応工程および前記検出工程を、図１Ｂの模式図を参照して説明する。
　図１Ｂに示すように、エクソソーム１１には、エクソソーム特異的抗原１２と細胞種特異的抗原２３とが発現している。反応液において、第１抗体１４は、前記血液試料中のエクソソーム１１に含まれるエクソソーム特異的抗原１２に結合する。第２抗体２５は、エクソソーム１１に含まれる細胞種特異的抗原２３に結合する。さらに、第１抗体１４に励起標識１６が結合する。励起光１８により励起標識１６が励起されると、一重項酸素が発生する。ここで、第１抗体１４がエクソソーム特異的抗原１２に結合し、第２抗体２５が細胞種特異的抗原２３に結合しているため、励起標識１６とシグナル発生標識１７とは、接近した状態にある。このため、前記一重項酸素により、シグナル発生標識１７からシグナルが発せられる。前記検出工程では、このシグナルを検出する。
（実施形態３）
　つぎに、実施形態３の分析方法について、説明する。実施形態３の分析方法は、前述のように、前記第１抗体として細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記添加工程、前記反応工程および前記検出工程を行う。
　まず、前記血清試料に、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を添加する。前記各組成の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を先に添加し、インキュベートした後に、前記励起標識を添加するのが好ましい。
　つぎに、前記反応工程および前記検出工程を、図１Ｃの模式図を参照して説明する。
　図１Ｃに示すように、エクソソーム１１には、エクソソーム特異的抗原１３と細胞種特異的抗原２２とが発現している。反応液において、第１抗体２４は、前記血液試料中のエクソソーム１１に含まれる細胞種特異的抗原２２に結合する。第２抗体１５は、エクソソーム１１に含まれるエクソソーム特異的抗原１３に結合する。さらに、第１抗体２４に励起担体１６が結合する。励起光１８により励起担体１６が励起されると、一重項酸素が発生する。第１抗体２４が細胞種特異的抗原２２に結合し、第２抗体１５がエクソソーム特異的抗原１３に結合しているため、励起標識１６と、シグナル発生標識１７とは、接近した状態にある。このため、前記一重項酸素により、シグナル発生標識１７からシグナルが発せられる。前記検出工程では、このシグナルを分析する。
　本発明の分析方法は、例えば、さらに、前記検出工程における検出値を補正する補正工程を含んでもよい。前記補正工程は、例えば、前記検出値を、検出値と試料中のエクソソーム濃度との相関関係により、補正できる。前記相関関係は、例えば、エクソソーム濃度が既知である標準試料について、本発明と同様に検出し、前記試料の検出値と、前記標準試料の検出値とをプロットすることにより求められる。前記標準試料は、エクソソームの希釈系列が好ましい。このように補正を行うことで、より信頼性の高い検出が可能となる。前記試料と前記標準試料とに含まれるエクソソームは、同一種の細胞（例えば、同一種のがん細胞）から分泌されたエクソソームであることが好ましい。
［エクソソーム分析用試薬］
　本発明のエクソソーム分析用試薬は、前述のように、試料中のエクソソームの分析に使用する試薬であって、前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体とを含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明のエクソソーム分析用試薬は、前記本発明のエクソソーム分析方法の記載を引用できる。
［エクソソーム分析装置］
　本発明のエクソソーム分析装置は、前述のように、試料中のエクソソームを分析する装置であって、前記試料に、前記第１抗体および前記第２抗体を添加する添加手段と、前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段とを含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明のエクソソーム分析装置は、前記本発明のエクソソーム分析方法の記載を引用できる。
　前記添加手段は、例えば、分析装置の内部または外部に配置された、前記第１抗体、前記第２抗体を吸引および排出する吸排手段、ならびに、前記各組成の吸引量および／または排出量を制御する制御手段を有する。前記吸排手段は、例えば、ポンプ等があげられる。前記制御手段は、例えば、バルブ等があげられる。前記添加手段により、前記試料に、前記第１抗体および前記第２抗体が添加され、反応液が調製される。
　前記反応手段は、例えば、前記反応液を、攪拌、吸排、振とう、超音波処理等する手段があげられる。
　前記検出手段は、例えば、光学分析機器等があげられ、具体例として、例えば、蛍光測定装置等があげられる。前記検出手段は、例えば、反応液に励起光を照射する励起光照射手段を有してもよい。
　本発明の分析装置によれば、前述の本発明の分析方法を実行できる。以下に、前記励起標識および前記シグナル発生標識を使用する場合を例にとり、本発明の分析装置の使用方法を例示するが、これには制限されない。
　前記分析装置の内部または外部に、前記血液試料、前記第１抗体、前記第２抗体を配置する。
　まず、前記添加手段により、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を、前記試料に添加する。前記添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を前記試料に先に添加し、インキュベートした後に、さらに、前記励起標識を添加することが好ましい。この場合、本発明の分析装置は、インキュベーターを備えることが好ましい。つぎに、前記励起光照射手段から、前記反応液に励起光を照射し、前記検出手段により、前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出する。このように、本発明の分析装置によれば、前述の本発明の分析方法を、例えば、自動で行える。
　つぎに、本発明の実施例について、説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
１．エクソソーム特異的抗原に結合する抗体
　前記エクソソーム特異的抗原に結合する抗体として、下記（１）～（３）の抗体を準備した。
（１）Purified　Mouse　Anti-Human　CD63（BD　Biosciences社、Clone：H5C6）
（２）Purified　Mouse　Anti-Human　CD9（BD　Biosciences社、Clone：M-L13）
（３）Purified　Mouse　Anti-Human　CD81（BD　Biosciences社、Clone：JS-81）
２．抗体のビオチン化
　前記抗体を、下記（１）～（７）の手順に基づいてビオチン化し、ビオチン化抗体を調製した。
（１）準備した抗体を、Zeba　Spin　Desalting　columns　7K　MWCO（Thermo社）を使用して、バッファーを置換した。1.5mLチューブにカラムをセットし、1500×g（14700m/s2）で１分間遠心した。
（２）前記遠心後、前記カラムに、PBS　300μLを添加し、1500×g（14700m/s2）で１分間遠心した。このPBS添加および遠心を、３回繰り返した。
（３）前記カラムを、新しい1.5mLチューブに移し、前記抗体を添加し、1500×g（14700m/s2）で２分間遠心した。
（４）1mg/mL　抗体溶液（PBS）　100μLに、2mg/mL　ChromaLink　Biotin　354S（solulink社）　7.62μLを添加し、さらに、PBS　92.38μLを添加し、全量を200μLとした。
（５）この溶液を、23℃の恒温水槽で、２時間インキュベートして、前記抗体をビオチン化した。
（６）前記（１）および（２）を行った、新しいZeba　Spin　Desalting　columnsを準備し、前記ビオチン化した抗体　100μLを、前記カラムに添加し、1500×g（14700m/s2）で２分間遠心した。
（７）得られたビオチン化抗体を、濃度とラベル比を算出し、PBS中で終濃度500mM（500mmol/L）に調整した。
３．抗体のビオチン化の確認
　図２Ａに示すように、AlphaLisa　ImmunoAssay　BufferにAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)10μg/mLを加え、総量を50μLになるようにして測定した。AlphaLISA　Immunoassay　Bufferの組成は、図２Ａにも示したとおり、25mM　HEPES、0.1%　カゼイン、0.5%　トリトンX-100、1mg/mL　デキストラン-500、0.05%プロクリン-300(proclin-300)からなる。前記抗体のビオチン化は、Anti-mouse　IgG　AlphaLISA　Acceptor　Beads（PerkinElmer社）を使用し、下記（１）～（５）の手順でアッセイして確認した。
（１）AlphaLISA　Immunoassay　Buffer（PerkinElmer社）を使用して、ビオチン化抗体を、1.5、5、15、50nM（nmol/L）に希釈した。同様に、5mg/mL　Anti-mouse　IgG　AlphaLISA　Acceptor　Beadsを、AlphaLISA　Immunoassay　Bufferで、１００倍に希釈した（濃度50μg/mL）。
（２）９６ウェルホワイトプレート（PerkinElmer社、1/2　AreaPlate-96）の各ウェルに、AlphaLISA　Immunoassay　Buffer　5μLを添加し、さらに、前記（１）で希釈したビオチン化抗体　10μLを添加した。前記ビオチン化抗体の終濃度は、0.3、1、3、10nM（nmol/L）となる。また、コントロールとして、前記希釈したビオチン化抗体に代えて、PBS　10μLを添加した（ビオチン化抗体の終濃度：0nM（nmol/L））。
（３）さらに、前記（１）で希釈したAnti-mouse　IgG　AlphaLISA　Acceptor　Beads（50μg/mL）　10μLを添加し、室温・遮光条件下において、１時間インキュベートした。
（４）5mg/mL　AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)（PerkinElmer社）を、AlphaLISA　Immunoassay　Bufferで、62.5倍に希釈した（濃度80μg/mL）。この希釈したAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)　25μLを、前記インキュベート後の各ウェルに添加し、TopSeal-A（PerkinElmer社）を前記プレートに貼り、室温・遮光条件下において、３０分間インキュベートした。
（５）前記インキュベート後、EnSpire（PerkinElmer社）による分析を行った。前記エクソソーム特異的抗原に結合する抗体は、Purified　Mouse　Anti-Human　CD63（BD　Biosciences社、Clone：H5C6）、Purified　Mouse　Anti-Human　CD9（BD　Biosciences社、Clone：M-L13）、Purified　Mouse　Anti-Human　CD81の3種類である。これら3種類のそれぞれについて、前記ビオチン化抗体の濃度が1.5、5、15、50nM(nmol/L)であるサンプルに対してそれぞれEnSpireを用いてシグナルを分析し、前記抗体がビオチン化されていることを確認した。前記分析は、Measure　Technology：AlphaScreenに設定（励起波長：６８０ｎｍ、検出波長：５２０～６２０ｎｍ）して行った（以下、同様）。この結果、図２Ａに示すように、AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)に結合した前記ビオチン化抗体及びAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合した前記ビオチン化抗体同士が結合していることが確認された。
４．AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)への抗体の結合
　図２Ｂに示すように、AlphaLisa　ImmunoAssay　Bufferに1nM　のBiotinylated　AntiMouse　IgG　Anitibodyを加え、総量を50μLになるようにして測定した。AlphaLISA　Immunoassay　Bufferの組成は、図２Ｂに示したとおりであり、すなわち、前記「3.抗体のビオチン化の確認」(図２Ａ)で用いたものと同じである。前記抗体を、下記（１）～（９）の手順に基づいてAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)に結合させた。
（１）前記「２．抗体のビオチン化」における前記（１）～（３）を行った。
（２）Anti-mouse　IgG　AlphaLISA　Acceptor　Beads　50μLを、前記カラムをセットした1.5mLチューブに移し、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心した。前記遠心後、上清を除去した。
（３）前記遠心後の沈殿したAlphaLISA　Acceptor　Beadsに、PBS　50μLを添加し、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心した。前記遠心後、上清を除去した。
（４）前記遠心後の沈殿したAlphaLISA　Acceptor　Beadsに、PBS　88.75μLを添加し、ボルテックスして再懸濁させた。
（５）前記懸濁液に、1mg/mL　抗体溶液（PBS）　100μLを添加し、さらに、10%　Tween-20　1.25μLおよび25mg/mL　NaBH3CN溶液　10μLを添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。
（６）前記インキュベート後の懸濁液に、65mg/mL　カルボキシメチルアミン溶液（0.8M（mol/L）　NaOH溶液）　10μLを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（７）前記インキュベート後の懸濁液を、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心した。前記遠心後、上清を除去し、沈殿に、0.1M（mol/L）　Tris-HCl（pH8.0）　200μLを添加して懸濁させた。そして前記と同様に遠心した。この操作を２回繰り返して洗浄した。
（８）前記洗浄後の懸濁液を、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心し、上清を除去した。沈殿に、0.05%　Proclin-300を含むPBS　200μLを添加して、再懸濁させた。このようにして、AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)に結合させた抗体（以下、「アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体」ということがある。）を調製した（終濃度5mg/mL）。
（９）前記懸濁液を、ボルテックス後軽くスピンダウンし、ソニケーターを使用して、１秒２０回のソニケーションを行った。これを、４℃・遮光条件下において保存した。
５．抗体とアクセプタービーズ(Acceptor　Beads)の結合との確認　前記抗体のAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)への結合は、Biotin-SP-conjugated　AffiniPure　Goat　Anti-Mouse　IgG　(H+L)（JacksonImmunoResearch社）を使用し、下記（１）～（５）の手順でアッセイして確認した。
（１）AlphaLISA　Immunoassay　Bufferを使用して、前記アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体を、10、50μg/mLに希釈した。同様に、AlphaLISA　Immunoassay　Bufferを使用して、前記ビオチン化抗体を、5nM（nmol/L）に希釈した。
（２）前記９６ウェルホワイトプレートの各ウェルに、AlphaLISA　Immunoassay　Buffer　5μLを添加し、さらに、前記（１）で希釈したビオチン化抗体　10μLを添加した。
（３）さらに、前記（１）で希釈したアクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体　10μLを添加し、室温・遮光条件下において、１時間インキュベートした。コントロールとして、前記希釈したアクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体に代えて、PBS　10μLを添加した。
（４）5mg/mL　AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)を、AlphaLISA　Immunoassay　Bufferで、62.5倍に希釈した（濃度80μg/mL）。この希釈したAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)　25μLを、前記インキュベート後の各ウェルに添加し、TopSeal-Aを前記プレートに貼り、室温・遮光条件下において、３０分間インキュベートした。
（５）前記インキュベート後、EnSpireによる分析を行った。前記エクソソーム特異的抗原に結合する抗体は、Purified　Mouse　Anti-Human　CD63（BD　Biosciences社、Clone：H5C6）、Purified　Mouse　Anti-Human　CD9（BD　Biosciences社、Clone：M-L13）、Purified　Mouse　Anti-Human　CD81の3種類である。これら3種類のそれぞれに対して前記AlphaLISA　Acceptor　Beads抗体濃度が0、2、10μg/mLであるサンプルを用意し、EnSpireでシグナルを分析した。この分析により、前記抗体がAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)に結合していることを確認した。前記分析は、Measure　Technology：AlphaScreenに設定して行った。この結果、図２Ｂに示すように、AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA　Acceptor　Beads)に結合した前記ビオチン化抗体（Biotinylated　Anti-Mouse　IgG　Antibody）及びAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合した前記ビオチン抗体（Biotinylated　Anti-Mouse　IgG　Antibody）同士が結合していることが確認された。なお、前記AlphaLISA　Acceptor　Beads抗体濃度が0μg/mLであるサンプルには、いずれにおいてもシグナルは、観測されなかった。
６．エクソソームの定量
（エクソソームの調製）
　がん細胞の培養上清から、超遠心法により、下記（１）～（７）の手順に基づいてエクソソームを調製した。
（１）前立腺がん細胞株PC3（入手元：ATCC）を、15cmディッシュに播種し、培養した。
（２）前記播種の翌日、前記がん細胞をPBSで一度洗浄し、血清が含まれていないAdvanced　PRMI1640（Invitrogen社）に培地を交換し、２日間培養した。
（３）前記培養後、培養上清を回収し、2000×g（19600m/s2）で１０分間遠心し、上清を回収した。
（４）前記上清を、フィルター（孔径：0.22μm）でろ過した。
（５）前記ろ液を、100000×g（980000m/s2）で、４℃・７０分間超遠心した。
（６）前記超遠心後、上清を除去し、沈殿にPBSを添加し、さらに、100000×g（980000m/s2）で、４℃・７０分間超遠心した。
（７）前記超遠心後、上清を除去し、沈殿にPBSを添加し、４℃で一晩置き、翌日にボルテックスして、エクソソームを回収した。
（検量線作成）
　前記ビオチン化抗体、前記アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体により、下記（１）～（５）の手順に基づいて前記回収したエクソソームの定量分析を行い、エクソソームの検量線を作成した。下記（１）～（４）において、AlphaLISA　Universal　Buffer（PerkinElmer社）は、0.1%　BSAおよび0.05%　Proclin-300を含むPBSを使用した。
（１）ビオチン化抗体およびアクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体を、AlphaLISA　Universal　Buffer（PerkinElmer社）を使用して、それぞれ、5nM（nmol/L）および50μg/mLに希釈した。
（２）前記回収したエクソソームを、AlphaLISA　Universal　Bufferを使用して希釈し、所定濃度の希釈系列を作成した。
（３）前記９６ウェルホワイトプレートの各ウェルに、前記希釈したエクソソーム　5μLを添加した。コントロールとして、AlphaLISA　Universal　Buffer　5μLを添加し、さらに、5nM（nmol/L）　ビオチン化抗体　10μLおよび50μg/mL　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体　10μLを添加し、室温・遮光条件下において、１時間インキュベートした。
（４）5mg/mL　AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)を、AlphaLISA　Immunoassay　Bufferで、62.5倍に希釈した（濃度80μg/mL）。この希釈したAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)　25μLを、前記インキュベート後の各ウェルに添加し、TopSeal-Aを前記プレートに貼り、室温・遮光条件下において、３０分間インキュベートした。なお、インキュベート時間は、特に制限されず、例えば、温度条件等の変更に応じて、１時間～終夜の範囲とすることもできる。
（５）前記インキュベート後、EnSpireを使用して、シグナルを分析し、エクソソームを分析した。前記分析は、Measure　Technology：AlphaScreenに設定して行った。そして、エクソソームの希釈系列から検量線を作成した。
（検量線作成結果）
　下記（１）～（６）のビオチン化抗体およびアクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体の組み合わせについて、検量線を作成した。下記（１）～（６）の抗体の組み合わせおよびその検量線を、それぞれ、図２Ｃ～図２Ｈに示す。
（１）ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63
　　　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63
　　　ｙ＝０．００１７ｘ（Ｒ２＝０．９８９１）
（２）ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9
　　　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9
　　　ｙ＝０．０２０１ｘ（Ｒ２＝０．９８２６）
（３）ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81
　　　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81
　　　ｙ＝０．０１８６ｘ（Ｒ２＝０．９９８５）
（４）ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63
　　　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9
　　　ｙ＝０．０１４１ｘ（Ｒ２＝０．９９６）
（５）ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD9
　　　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81
　　　ｙ＝０．００３７ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）
（６）ビオチン化抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD81
　　　アクセプタービーズ(Acceptor　Beads)結合抗体：Purified　Mouse　Anti-Human　CD63
　　　ｙ＝０．００３１ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）
　図２Ｃ（前記（１））では、PBS溶液中、0.1％BSAと0.05%プロクリン‐300(proclin-300)からなるAlphaLisa　Universal　Bufferに1nMのBiotinylated　AntiCD63　Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD63-conjugated　AlphaLISA　アクセプタービーズ(Acceptor　Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｃでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD63　Antibody及びAnti-CD63-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD63　Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD63に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．００１７ｘ（Ｒ２＝０．９８９１）という式を得た。
　図２Ｄ(前記（２）)では、前記　AlphaLisa　Universal　Bufferに1nM　のBiotinylated　AntiCD9　Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD9-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｄでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD9　Antibody及びAnti-CD9-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD9　Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD9に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．０２０１ｘ（Ｒ２＝０．９８２６）という式を得た。
　図２Ｅ（前記（３））では、前記　AlphaLisa　Universal　Bufferに1nMのBiotinylated　AntiCD81　Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD81-conjugated　AlphaLISA　アクセプタービーズ(Acceptor　Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｅでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD81　Antibody及びAnti-CD81-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD81　Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD81に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．０１８６ｘ（Ｒ２＝０．９９８５）という式を得た。
　図２Ｆ（前記（４））では、前記AlphaLisa　Universal　Bufferに1nMのBiotinylated　AntiCD63　Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD9-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｆでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD63　Antibody及びAnti-CD9-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD63　Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD63及び抗原CD9に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．０１４１ｘ（Ｒ２＝０．９９６）という式を得た。
　図２Ｇ（前記（５））では、前記AlphaLisa　Universal　Bufferに1nMのBiotinylated　AntiCD9　Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD81-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｇでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD9　Antibody及びAnti-CD81-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD81　Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD9及び抗原CD81に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．００３７ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）という式を得た。
　図２Ｈ（前記（６））では、前記AlphaLisa　Universal　Bufferに1nMのBiotinylated　AntiCD81　Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD63-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｈでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated　Alpha　Donor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD81　Antibody及びAnti-CD63-conjugated　AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor　Bead)に結合したBiotinylated　AntiCD63　Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD81及び抗原CD63に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．００３１ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）という式を得た。
［実施例１］
　本実施例では、前立腺がん患者の血清および健常者の血清を使用して、血清中のエクソソームを分析し、前立腺がん患者の血清および健常者の血清中のエクソソーム量の差を確認した。
（１）血清の準備
　前立腺がん患者（ステージ４、ｎ＝４）および健常者（ｎ＝４）から全血を採取し、前記全血から血清を調製した。下記エクソソーム分析に使用する血清量は、4μLとした。
（２）エクソソーム分析
　下記表１に示す組成の反応液となるように、前記「６．エクソソームの定量」における「検量線作成」の前記（１）～（４）と同様の操作を行い、前記（５）と同様にして、シグナルを分析し、得られたシグナル値を血清に含まれるエクソソーム量として分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図３のグラフに、前記両血清中のエクソソームの分析結果を示す。図３に示すように、前立腺がん患者の血清中には、健常者の血清中よりも、有意に多くのエクソソームが含まれることが確認された。この結果から、血清中のエクソソームを分析することで、分析対象が、がん患者であるか、健常者であるかを区別できることが確認された。したがって、本発明によれば、血液中のエクソソームを簡易に分析でき、例えば、血液試料提供者が、健常者であるか、がん患者であるかを診断できるといえる。
［実施例２］
　本実施例では、肝がん患者のがんの切除手術直後の血清および再発後の同患者の血清を使用して、血清中のエクソソームを分析し、がんの切除手術直後および再発後の血清中のエクソソーム量の差を確認した。
（１）血清の準備
　がんの切除手術直後の肝がん患者の全血、および再発後の同患者の全血を採取し、前記全血から血清を調製した（ｎ＝１２）。下記エクソソーム分析に使用する血清量は、4μLとした。
（２）エクソソーム分析
　前記（１）で調製した血清を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、がんの切除手術直後の肝がん患者の血清、および再発後の同患者の血清に含まれるエクソソーム量を分析した。
　図４のグラフに、前記両血清中のエクソソームの分析を示す。図４に示すように、がんの切除手術直後の肝がん患者の血清中よりも、再発後の同患者の血清の方が、多くのエクソソームが含まれることが確認された。この結果から、血清中のエクソソームを分析することで、がんの切除手術を行った患者について、切除手術後にがんが再発しているかを判別できることが確認された。したがって、本発明によれば、例えば、血液中のエクソソームを分析することで、がん患者におけるがん切除手術後の再発の有無を診断できるといえる。
　以上のように、本発明によれば、試料中のエクソソームを簡易に分析できる。このため、例えば、本発明のエクソソームの分析方法は、がんの発症の有無、がんの再発の有無等のがんの診断等に極めて有用であり、臨床検査への適用が大いに期待される。
１１　　エクソソーム
１２、１３　　エクソソーム特異的抗原
１４、２４　　第１抗体
１５、２５　　第２抗体
１６　　励起標識
１７　　シグナル発生標識
１８　　励起光
２２、２３　　細胞種特異的抗原

Claims (10)

  1. 試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、
    前記試料に、
    前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
    前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
    を添加する添加工程と、
    前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、
    前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程と
    を含むことを特徴とするエクソソームの分析方法。
  2. 前記第１抗原および前記第２抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
  3. 前記第１抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であり、
    前記第２抗原が、前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
  4. 前記第１抗原が、前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原であり、
    前記第２抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
  5. 前記第１抗体が、励起光により励起される励起標識に結合可能な抗体であり、
    前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
    前記添加工程において、
    さらに、前記励起標識を添加し、
    前記反応工程において、
    前記第１抗原に前記第１抗体が結合され、前記第２抗原に前記第２抗体が結合され、
    前記検出工程において、
    前記第１抗体に前記励起標識が結合され、励起光により前記励起標識が励起され、前記励起標識の励起による一重項酸素により前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
  6. 前記エクソソーム分析を、界面活性剤を含まない反応液中で行うことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
  7. 前記試料が、血清であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
  8. 前記試料が、１～１５μＬの範囲であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
  9. 試料中のエクソソームの分析に使用する試薬であって、
    前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、
    前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体と
    を含み、
    請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法に使用する
    ことを特徴とするエクソソーム分析用試薬。
  10. 試料中のエクソソームを分析する装置であって、
    前記試料に、
    前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
    前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
    を添加する添加手段と、
    前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、
    前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段と
    を含み、
    請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法に使用することを特徴とするエクソソーム分析装置。
PCT/JP2012/077621 2011-12-22 2012-10-25 エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置 Ceased WO2013094307A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/367,651 US11391741B2 (en) 2011-12-22 2012-10-25 Method of exosome analysis, reagent for exosome analysis, and analyzer for exosome
JP2013550169A JP6029112B2 (ja) 2011-12-22 2012-10-25 エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置
CA2860144A CA2860144C (en) 2011-12-22 2012-10-25 Method of exosome analysis, reagent for exosome analysis, and analyzer for exosome
EP12860743.9A EP2801822B1 (en) 2011-12-22 2012-10-25 Exosome analysis method, reagent for use in analysis of exosome, and exosome analysis apparatus
US17/830,991 US12013399B2 (en) 2011-12-22 2022-06-02 Method of exosome analysis, reagent for exosome analysis, and analyzer for exosome

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-281618 2011-12-22
JP2011281618 2011-12-22

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/367,651 A-371-Of-International US11391741B2 (en) 2011-12-22 2012-10-25 Method of exosome analysis, reagent for exosome analysis, and analyzer for exosome
US17/830,991 Continuation US12013399B2 (en) 2011-12-22 2022-06-02 Method of exosome analysis, reagent for exosome analysis, and analyzer for exosome

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013094307A1 true WO2013094307A1 (ja) 2013-06-27

Family

ID=48668208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/077621 Ceased WO2013094307A1 (ja) 2011-12-22 2012-10-25 エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11391741B2 (ja)
EP (1) EP2801822B1 (ja)
JP (1) JP6029112B2 (ja)
CA (1) CA2860144C (ja)
WO (1) WO2013094307A1 (ja)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017154868A1 (ja) * 2016-03-08 2017-09-14 国立研究開発法人国立がん研究センター 抗ｔｍｅｍ－１８０抗体、抗がん剤、及びがんの検査方法
WO2018030511A1 (ja) * 2016-08-12 2018-02-15 公立大学法人和歌山県立医科大学 エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法
WO2018131192A1 (ja) 2017-01-12 2018-07-19 国立研究開発法人国立がん研究センター 被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法
WO2018221271A1 (ja) 2017-05-29 2018-12-06 国立大学法人神戸大学 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法
JP2019007984A (ja) * 2018-10-09 2019-01-17 凸版印刷株式会社 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ
WO2019159944A1 (ja) * 2018-02-14 2019-08-22 協和メデックス株式会社 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット
JP2020144147A (ja) * 2013-10-24 2020-09-10 ナノソミックス・インコーポレイテッドＮａｎｏＳｏｍｉＸ， Ｉｎｃ． アルツハイマー病および他の神経変性障害のためのバイオマーカーおよび診断方法
JP2021012200A (ja) * 2014-12-05 2021-02-04 富士フイルム和光純薬株式会社 Ｔｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法、除去方法、検出方法並びに当該担体を含むキット
WO2021132213A1 (ja) * 2019-12-23 2021-07-01 富士レビオ株式会社 細胞外小胞の回収方法、および採血管
WO2021166713A1 (ja) * 2020-02-17 2021-08-26 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
WO2021166715A1 (ja) * 2020-02-17 2021-08-26 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
WO2022065043A1 (ja) * 2020-09-24 2022-03-31 株式会社Ｊｖｃケンウッド 細胞の状態の評価方法、及び評価キット
JP2022524327A (ja) * 2019-03-08 2022-05-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞外小胞の膜結合タンパク質を検出及び定量化するための方法
JP2023153781A (ja) * 2017-05-24 2023-10-18 ナノソミックス・インコーポレイテッド 疾病および障害の診断および予後判定のための小胞上のバイオマーカーの検出

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170252379A1 (en) 2014-10-09 2017-09-07 Anthrogenesis Corporation Placenta-derived adherent cell exosomes and uses thereof
EP4047214B1 (en) * 2015-12-14 2026-01-28 Hunter Fan Company Ceiling fan
US11243215B2 (en) 2016-01-14 2022-02-08 The Regents Of The University Of California 3D-exoquant method for the analysis of surface molecules and quantification of tissue-specific exosomes in biological fluids
US10914748B2 (en) 2016-09-08 2021-02-09 UNIVERSITé LAVAL Erythrocyte-derived extracellular vesicles as a biomarker for clinically assessing Parkinson's disease
CN111566484A (zh) * 2017-11-09 2020-08-21 宾夕法尼亚大学董事会 细胞外囊泡蛋白及其在癌症诊断、预测对疗法的反应和治疗中的用途
CN113866407A (zh) * 2021-12-01 2021-12-31 上海思路迪医学检验所有限公司 一种外泌体her2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒
CN116165376A (zh) * 2023-02-22 2023-05-26 海南医学院 微球-外泌体-肉毒素复合物及其制备方法和检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056337A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2344567A1 (en) * 1998-09-18 2000-03-30 Cellomics, Inc. A system for cell-based screening
US8617806B2 (en) 2008-01-25 2013-12-31 Hansabiomed Ou Method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids
WO2012048372A1 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Medsaic Pty Ltd Assay for disease detection

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056337A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELIZABETH CAUCHON ET AL.: "Development of a homogeneous immunoassay for the detection of angiotensin I in plasma using AlphaLISA acceptor beads technology", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 388, no. 1, May 2009 (2009-05-01), pages 134 - 139, XP026081397 *
See also references of EP2801822A4
TAYLOR ET AL., GYNECOLOGIC ONCOL, vol. 100, 2008, pages 13 - 21

Cited By (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7210036B2 (ja) 2013-10-24 2023-01-23 ナノソミックス・インコーポレイテッド アルツハイマー病および他の神経変性障害のためのバイオマーカーおよび診断方法
JP2020144147A (ja) * 2013-10-24 2020-09-10 ナノソミックス・インコーポレイテッドＮａｎｏＳｏｍｉＸ， Ｉｎｃ． アルツハイマー病および他の神経変性障害のためのバイオマーカーおよび診断方法
JP2021012200A (ja) * 2014-12-05 2021-02-04 富士フイルム和光純薬株式会社 Ｔｉｍタンパク質結合担体、当該担体を用いた細胞外膜小胞及びウイルスの取得方法、除去方法、検出方法並びに当該担体を含むキット
JPWO2017154868A1 (ja) * 2016-03-08 2019-01-17 国立研究開発法人国立がん研究センター 抗ｔｍｅｍ−１８０抗体、抗がん剤、及びがんの検査方法
US11633499B2 (en) 2016-03-08 2023-04-25 National Cancer Center Japan Anti-TMEM-180 antibody, anticancer drug and cancer testing method
EP3434765A4 (en) * 2016-03-08 2019-11-20 National Cancer Center Japan ANTI-TMEM-180 ANTIBODIES, ANTI-STEM AND TREATMENT FOR CANCER
TWI790992B (zh) * 2016-03-08 2023-02-01 國立研究開發法人國立癌症研究中心 抗ｔｍｅｍ-１８０抗體、抗癌劑、及癌之檢查方法
EP4549574A3 (en) * 2016-03-08 2025-07-30 National Cancer Center Japan Anti-tmem-180 antibody, anticancer drug and cancer testing method
WO2017154868A1 (ja) * 2016-03-08 2017-09-14 国立研究開発法人国立がん研究センター 抗ｔｍｅｍ－１８０抗体、抗がん剤、及びがんの検査方法
WO2018030511A1 (ja) * 2016-08-12 2018-02-15 公立大学法人和歌山県立医科大学 エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法
WO2018131192A1 (ja) 2017-01-12 2018-07-19 国立研究開発法人国立がん研究センター 被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法
US11965887B2 (en) 2017-01-12 2024-04-23 Theoria Science Inc. Method of examining possibility of subject having pancreatic cancer
JP2023153781A (ja) * 2017-05-24 2023-10-18 ナノソミックス・インコーポレイテッド 疾病および障害の診断および予後判定のための小胞上のバイオマーカーの検出
JP7649566B2 (ja) 2017-05-24 2025-03-21 ナノソミックス・インコーポレイテッド 疾病および障害の診断および予後判定のための小胞上のバイオマーカーの検出
WO2018221271A1 (ja) 2017-05-29 2018-12-06 国立大学法人神戸大学 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法
US12105085B2 (en) 2017-05-29 2024-10-01 National University Corporation Kobe University Base material for manufacturing sensor for analyzing detection target, sensor for analyzing detection target, method for analyzing detection target
JPWO2019159944A1 (ja) * 2018-02-14 2021-03-04 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット
JP7281092B2 (ja) 2018-02-14 2023-05-25 ミナリスメディカル株式会社 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット
WO2019159944A1 (ja) * 2018-02-14 2019-08-22 協和メデックス株式会社 試料中のエクソソームの測定方法、測定試薬及び測定キット
JP2019007984A (ja) * 2018-10-09 2019-01-17 凸版印刷株式会社 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ
JP7402247B2 (ja) 2019-03-08 2023-12-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞外小胞の膜結合タンパク質を検出及び定量化するための方法
JP2022524327A (ja) * 2019-03-08 2022-05-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞外小胞の膜結合タンパク質を検出及び定量化するための方法
JP2023182682A (ja) * 2019-03-08 2023-12-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞外小胞の膜結合タンパク質を検出及び定量化するための方法
JP2025090689A (ja) * 2019-03-08 2025-06-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞外小胞の膜結合タンパク質を検出及び定量化するための方法
JPWO2021132213A1 (ja) * 2019-12-23 2021-07-01
JP7687963B2 (ja) 2019-12-23 2025-06-03 富士レビオ株式会社 細胞外小胞の回収方法、および採血管
WO2021132213A1 (ja) * 2019-12-23 2021-07-01 富士レビオ株式会社 細胞外小胞の回収方法、および採血管
JP2021128128A (ja) * 2020-02-17 2021-09-02 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
JP2021128129A (ja) * 2020-02-17 2021-09-02 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
JP7425403B2 (ja) 2020-02-17 2024-01-31 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
WO2021166715A1 (ja) * 2020-02-17 2021-08-26 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
WO2021166713A1 (ja) * 2020-02-17 2021-08-26 株式会社Ｊｖｃケンウッド 生体試料分析方法
WO2022065043A1 (ja) * 2020-09-24 2022-03-31 株式会社Ｊｖｃケンウッド 細胞の状態の評価方法、及び評価キット

Also Published As

Publication number Publication date
CA2860144A1 (en) 2013-06-27
US11391741B2 (en) 2022-07-19
JP6029112B2 (ja) 2016-11-24
CA2860144C (en) 2020-01-21
EP2801822B1 (en) 2017-08-30
EP2801822A4 (en) 2015-07-01
US12013399B2 (en) 2024-06-18
US20150017660A1 (en) 2015-01-15
EP2801822A1 (en) 2014-11-12
US20220299517A1 (en) 2022-09-22
JPWO2013094307A1 (ja) 2015-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12013399B2 (en) Method of exosome analysis, reagent for exosome analysis, and analyzer for exosome
Iaccino et al. Monitoring multiple myeloma by idiotype-specific peptide binders of tumor-derived exosomes
US20190112356A1 (en) High-affinity immunopolymers
JP6494670B2 (ja) ビタミンｄに関連する組成物
JP2017520770A (ja) ビタミンｄエピマーのためのエッセイ
EP3919509B1 (en) Method for immunological analysis of free aim in biological sample
US20190359722A1 (en) Anti-epha2 antibody and immunological detection of epha2 using same
WO2013191146A1 (ja) 悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キット
US20200363416A1 (en) Methods and kits for analysis of hmgb1 isoforms
JP2017526630A (ja) ビタミンｄエピマーに特異的な結合パートナー
EP3879270B1 (en) Method for distinguishing viral liver cancer from viral hepatitis or viral liver cirrhosis
JP5221825B1 (ja) 肺扁平上皮癌の検出方法
JP5397932B2 (ja) Ｎｕｆ２蛋白質抗体とその製造方法、抗原、検知方法
EP4317172A1 (en) Immunological analysis method for type-i collagen c-terminal telopeptide
WO2025009486A1 (ja) 細胞外小胞の検出方法
JP2024043214A (ja) イヌｈｅｒ２の検出方法
JP2024070581A (ja) Ａｌｓ検査用バイオマーカー及び検査方法
KR20240051109A (ko) 검정 신호 증폭을 위한 방법, 조성물 및 키트
CN121991218A (zh) 一种检测β-淀粉样蛋白的抗体及其应用
CN121991217A (zh) 检测胶质纤维酸性蛋白的抗体及抗体对、试剂和方法
Sommerschuh et al. Immunochemical methods for the detection of midkine in samples of human origin
JP2013234156A (ja) リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を特異的に認識するモノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12860743

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013550169

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2860144

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14367651

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2012860743

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012860743

Country of ref document: EP