WO2013105652A1 - 化学品の製造方法 - Google Patents

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WO2013105652A1
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pentose
culture
membrane
producing
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志緒美 渡邊
小林　宏治
匡平 磯部
健司 澤井
景洙 羅
紳吾 平松
山田　勝成
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Toray Industries Inc
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chemical product by continuous fermentation using a fermentation raw material containing hexose and pentose.
  • Biomass-derived chemicals such as biodegradable polymer raw materials such as lactic acid and biofuels such as ethanol have become sustainable (sustainable) as well as carbon dioxide emissions into the atmosphere and the emergence of energy problems. It is attracting a great deal of attention as a life cycle assessment (LCA) compatible product.
  • LCA life cycle assessment
  • As a method for producing these biodegradable polymer materials and biofuels glucose, which is a hexose refined from edible biomass such as corn, is generally used as a fermentation material for microorganisms, and is obtained as a fermentation product. If edible biomass is used, competition with food causes price increases, which may prevent stable procurement of raw materials. Therefore, attempts have been made to use sugar derived from non-edible biomass such as rice straw as a fermentation raw material for microorganisms (see Patent Document 1).
  • sugars derived from non-edible biomass are used as fermentation raw materials
  • cellulose, hemicellulose, etc. contained in non-edible biomass are decomposed into sugars by saccharifying enzymes.
  • saccharifying enzymes not only hexose sugars such as glucose are decomposed.
  • Pentoses such as xylose can be obtained at the same time.
  • sugars derived from non-edible biomass are used as fermentation raw materials for microorganisms, mixed sugars of hexose and pentose sugars are used as fermentation raw materials (patents) Reference 1).
  • pentose reductase and pentol dehydrogenase The metabolic pathway of pentose reductase and pentol dehydrogenase is known as the metabolic pathway of pentose.
  • the pentose reductase acts on the pentose to produce pentol as the first step, and pentol on pentol as the second step. It is known that dehydrogenase acts.
  • the pentol produced in the first stage accumulates in the culture solution without flowing through the metabolic pathways after the second stage, so that there is a problem that the production yield does not increase.
  • Continuous fermentation can be adopted as a fermentation method using sugar derived from non-edible biomass, which is a mixed sugar of hexose sugar and pentose sugar, as a fermentation raw material for microorganisms. It has not been confirmed (see Patent Document 1). On the other hand, when continuous fermentation is performed using a mixed sugar of hexose sugar and pentose sugar as a fermentation raw material, it is also known that the fermentation yield is significantly lower than batch fermentation (see Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to improve the fermentation yield when fermenting a mixed sugar of hexose and pentose as a fermentation raw material for a microorganism having a pentose reductase and pentol dehydrogenase. .
  • the present inventors perform continuous fermentation using a separation membrane with a fermentation raw material containing hexose and pentose when using a microorganism having pentose reductase and pentose dehydrogenase.
  • the present invention is as follows (1) to (7).
  • (1) Filtering the microorganism culture solution with a separation membrane, holding or refluxing the unfiltered solution in the culture solution, adding fermentation raw materials to the culture solution, and recovering the product in the filtrate
  • a method for producing a chemical product by continuous fermentation wherein the fermentation raw material contains pentose and hexose, and the microorganism has a pathway for metabolizing pentose using pentose reductase and pentol dehydrogenase
  • (2) The method for producing a chemical product according to (1), wherein continuous fermentation is performed under a condition of an oxygen transfer capacity coefficient (KLa) of 5 to 300 h ⁇ 1 .
  • KLa oxygen transfer capacity coefficient
  • the efficiency yield of fermentation production of various chemicals of microorganisms having pentose reductase and pentose dehydrogenase using fermentation raw materials containing pentose and hexose can be greatly improved.
  • a microorganism having pentose reductase and pentose dehydrogenase is cultured using a fermentation raw material containing a mixed sugar of pentose and hexose, and the culture solution is filtered through a separation membrane. The unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution, and the fermentation raw material is added to the culture solution to recover the product in the filtrate.
  • the pentose has five carbons constituting the sugar, and is also called pentose.
  • aldopentose include xylose, arabinose, ribose, and lyxose.
  • ketopentose include ribulose and xylulose.
  • the pentose used in the present invention may be any pentose as long as it can assimilate microorganisms, but is preferably xylose or arabinose, more preferably from the viewpoint of the natural ratio or availability. Is xylose.
  • the hexose has 6 carbons constituting the sugar, and is also called hexose.
  • aldose include glucose, mannose, galactose, allose, growth, and talose.
  • ketose include fructose, psicose, and sorbose.
  • the hexose used in the present invention may be any as long as it can assimilate microorganisms, but from the viewpoint of the natural ratio, availability, etc., preferably glucose, mannose, galactose, More preferred is glucose.
  • the mixed sugar used in the present invention is not particularly limited, but a cellulose-containing biomass-derived sugar solution is preferably used because it contains both hexose sugar and pentose sugar.
  • the cellulose-containing biomass include plant biomass such as bagasse, switchgrass, corn stover, rice straw, and straw, and woody biomass such as trees and waste building materials.
  • Cellulose-containing biomass contains cellulose or hemicellulose, which is a polysaccharide obtained by dehydrating and condensing sugar, and a sugar solution that can be used as a fermentation raw material is produced by hydrolyzing such a polysaccharide. Any method may be used for preparing the cellulose-containing biomass-derived sugar solution.
  • a method for producing a sugar solution by acid hydrolysis of biomass using concentrated sulfuric acid discloses a method for producing a sugar solution by hydrolyzing biomass with dilute sulfuric acid and further treating with an enzyme such as cellulase (A).
  • Aden et al. “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Optimized Co-Current Dirty Acid Prehydrology and Enzymatic Physiology Hydrology. ver "NREL Technical Report (2002)).
  • a method not using an acid a method of hydrolyzing biomass using subcritical water at about 250 to 500 ° C.
  • the weight ratio of the pentose and hexose contained in the mixed sugar may be any ratio, but the weight ratio of the pentose and hexose in the mixed sugar (pentose) : (Hexose sugar) is preferably 1: 9 to 9: 1. This is a sugar ratio when a cellulose-containing biomass-derived sugar solution is assumed as a mixed sugar.
  • the total sugar concentration of the mixed sugar is preferably as high as possible so that the microorganism is not subject to substrate inhibition.
  • 20 g / L or more is preferable.
  • a preferable range of the total sugar concentration is 20 to 500 g / L.
  • the pentose concentration is preferably 5 g / L or more
  • the hexose concentration is preferably 5 g / L or more.
  • the nitrogen source contained in the fermentation raw material includes ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other organic nitrogen sources used as supplements, such as oil cakes, soybean hydrolysate, casein decomposition products Other amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof are used.
  • organic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added and used.
  • the nutrient is added as a preparation or a natural product containing it.
  • An antifoaming agent is also used as necessary.
  • the culture solution refers to a solution obtained as a result of the growth of microorganisms on the fermentation raw material. You may change suitably the composition of the fermentation raw material to add from the fermentation raw material composition at the time of a culture
  • microorganisms that can be used in the method for producing a chemical product of the present invention will be described.
  • the microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having pentose reductase and pentose dehydrogenase.
  • the microorganisms used may be those isolated from the natural environment, or those whose properties are partially modified by mutation or gene recombination.
  • the pentose reductase is one of the reductases and means an enzyme having an activity of converting aldopentose into a sugar alcohol using NADH or NADPH as a coenzyme.
  • xylose reductase corresponds to, for example, EC 1.1.1.307 and EC 1.1.1.21, and is an enzyme that converts xylose into xylitol.
  • the arabinose reductase corresponds to EC1.1.1.21, for example, and is an enzyme that converts arabinose into arabitol.
  • it is not the enzyme classified by said EC number if it is an enzyme which has the said activity, it will be contained in the pentose reductase in this invention.
  • Pentol dehydrogenase is one of dehydrogenases and is an enzyme that converts pentol into ketopentose using NAD + as a coenzyme.
  • xylitol dehydrogenase corresponds to, for example, EC 1.1.1.9 or EC 1.1.1.10, and is an enzyme that converts xylitol into xylulose.
  • the arabitol dehydrogenase corresponds to, for example, EC 1.1.1.11 or EC 1.1.1.12. It is an enzyme that converts arabitol into ribose.
  • Even an enzyme that is different from pentol dehydrogenase in terms of classification is included in the pentol dehydrogenase in the present invention as long as it has the above activity.
  • a microorganism capable of metabolizing pentose is known as a microorganism having pentose reductase and pentose dehydrogenase.
  • pentose reductase and pentose dehydrogenase For example, Pichia genus, Candida genus, Pachisolen genus, Kluyveromyces genus, Hansenula genus Torulopsis genus, Debariomys genus Debarymosy genus ), Brettanomyces, Lindnera, Wickerhamomyces and the like.
  • Pichia stipitis Pichia mexicana, Candida shehatae, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida tropicalis Candida tenuis, Candida boyidini, Candida sonorensis, Candida dididienia, Candida intermedi candy (Candida parapsilosis), Candida methanosorbosa, Candida wickerhami (Candida wiskeris lym cerium cerium, cerium cerium, cerium cerium, cerium cerium, cerevisiae, cerium, cerium, cerium, cerium, cerium, cerium, etc.
  • microorganisms for which no information is available in the database can be known by measuring enzyme activity as shown in [1] and [2] below.
  • microorganisms that originally have no pentose reductase and pentose dehydrogenase activities such as bacteria and baker's yeast
  • microorganisms having no pentose reductase and pentose dehydrogenase activities are Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, and Corynebacterium glutacum.
  • Corynebacterium glutamicum Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Sporolactobacillus palaceus, Laevolacticus s polymixa), Zymomonas mobilis (Zymomonas mobilis), Zymobacter palmae (Zymobacter palmae) and the like.
  • a method for producing a microorganism in which the enzyme is expressed by gene recombination is disclosed in JP2009-112289A.
  • the fermentation ability of the microorganism having the enzyme may be enhanced by mutagenesis or genetic recombination, or a foreign substance may be introduced to produce a substance that is not originally produced.
  • xylose isomerase is introduced in addition to xylose reductase and xylitol dehydrogenase, xylulose kinase acting on xylulose, a metabolite of xylitol, is highly expressed, or D-lactic acid dehydration is performed on microorganisms that do not produce D-lactic acid.
  • Introducing elementary enzymes is introduced in addition to xylose reductase and xylitol dehydrogenase, xylulose kinase acting on xylulose, a metabolite of xylitol.
  • the porous membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of separating and filtering a culture solution obtained by culturing using a microbial stirring type incubator or a stirring type bioreactor from microorganisms.
  • Ceramic ceramic membranes, porous glass membranes, porous organic polymer membranes, metal fiber woven fabrics, nonwoven fabrics, and the like can be used. Among these, a porous organic polymer film or a ceramic film is particularly preferable.
  • the configuration of a porous membrane used as a separation membrane in the present invention will be described.
  • the porous membrane used in the present invention preferably has separation performance and water permeability according to the quality of water to be treated and the application.
  • the porous membrane is preferably a porous membrane including a porous resin layer from the viewpoint of blocking performance, water permeability performance and separation performance, for example, stain resistance.
  • the porous membrane including the porous resin layer preferably has a porous resin layer that acts as a separation functional layer on the surface of the porous substrate.
  • the porous substrate supports the porous resin layer and gives strength to the separation membrane.
  • the porous substrate used in the present invention has a porous resin layer on the surface of the porous substrate, the porous substrate is porous even if the porous resin layer penetrates the porous substrate. It does not matter if the porous resin layer does not penetrate, and it is selected according to the application.
  • the average thickness of the porous substrate is preferably 50 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less.
  • the material of the porous substrate is made of an organic material and / or an inorganic material, and an organic fiber is preferably used.
  • the preferred porous substrate is a woven or non-woven fabric made of organic fibers such as cellulose fiber, cellulose triacetate fiber, polyester fiber, polypropylene fiber and polyethylene fiber. More preferably, the density control is relatively easy and the production is easy. Inexpensive nonwoven fabric is used.
  • An organic polymer film can be suitably used for the porous resin layer.
  • the material of the organic polymer film include polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyacrylonitrile resin, cellulose resin, and the like. Examples thereof include cellulose triacetate resins.
  • the organic polymer film may be a mixture of resins mainly composed of these resins.
  • the main component means that the component is contained in an amount of 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more.
  • the organic polymer film is made of a polyvinyl chloride resin, a polyvinylidene fluoride resin, a polysulfone resin, a polyethersulfone resin, which is easy to form a film with a solution and has excellent physical durability and chemical resistance.
  • Polyacrylonitrile-based resins are preferable, and polyvinylidene fluoride-based resins or resins containing them as the main components are most preferably used.
  • polyvinylidene fluoride-based resin a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used.
  • polyvinylidene fluoride resin a copolymer of a vinyl monomer copolymerizable with vinylidene fluoride is also preferably used.
  • vinyl monomers copolymerizable with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and ethylene trichloride fluoride.
  • the porous membrane used as a separation membrane in the present invention is not particularly limited, and it is sufficient that microorganisms used for fermentation cannot pass through, but clogging due to secretions of microorganisms used for fermentation and fine particles in fermentation raw materials. It is desirable that the filtration performance is within a range that continues stably for a long period of time. Therefore, the average pore diameter of the porous separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and less than 5 ⁇ m. More preferably, when the average pore diameter of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, it is possible to achieve both a high exclusion rate at which microorganisms do not leak and a high water permeability. Holding for a long time can be carried out with higher accuracy and reproducibility.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably less than 1 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably not too large compared to the size of the microorganism in order to prevent the occurrence of a problem that the microorganism leaks out, that is, the rejection rate decreases.
  • the average pore diameter is preferably 0.4 ⁇ m or less, and more preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • substances other than chemicals in which microorganisms are desired products may be produced, for example, substances that easily aggregate, such as proteins and polysaccharides.
  • the average pore diameter is more preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the average pore size of the porous membrane in the present invention is preferably 0.01 ⁇ m. It is above, More preferably, it is 0.02 micrometer or more, More preferably, it is 0.04 micrometer or more.
  • the average pore diameter can be obtained by measuring and averaging the diameters of all pores that can be observed within a range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m in a scanning electron microscope observation at a magnification of 10,000 times. it can.
  • the average pore diameter can be obtained by taking a photograph of the surface of the membrane at a magnification of 10,000 using a scanning electron microscope and randomly selecting 10 or more, preferably 20 or more pores. It can also be obtained by measuring and number average.
  • a circle having an area equal to the area of the pores (equivalent circle) is obtained by an image processing device or the like, and the equivalent circle diameter is obtained by the method of setting the diameter of the pores.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter of the porous membrane used in the present invention is preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter is N as the number of pores that can be observed within the above-mentioned range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m, the measured diameter is X k, and the average pore diameter is X (ave ) And the following equation (1).
  • the permeability of the fermentation broth is one of the important performances.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane before use can be used as an index of the permeability of the porous membrane.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m when calculated by measuring the water permeability at a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane.
  • a pure water permeability coefficient is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / s / pa or more 6 ⁇ 10 ⁇ 7 m 3 / m 2 / s. If it is / pa or less, a practically sufficient amount of permeated water can be obtained.
  • the surface roughness is the average value of the height in the direction perpendicular to the surface.
  • the membrane surface roughness is one of the factors for facilitating separation of microorganisms adhering to the separation membrane surface by the membrane surface cleaning effect by the liquid flow by stirring or a circulation pump.
  • the surface roughness of the porous membrane is not particularly limited as long as it is within a range in which microorganisms attached to the membrane and other solid substances are peeled off, but is preferably 0.1 ⁇ m or less. When the surface roughness is 0.1 ⁇ m or less, microorganisms adhering to the film and other solid substances are easily peeled off.
  • the membrane surface roughness of the porous membrane is 0.1 ⁇ m or less
  • the average pore diameter is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 /
  • the surface roughness of the porous membrane is preferably as small as possible.
  • the film surface roughness of the porous film is measured under the following conditions using the following atomic force microscope (AFM).
  • FAM atomic force microscope
  • Device Atomic force microscope device (“Nanoscope IIIa” manufactured by Digital Instruments)
  • Condition probe SiN cantilever manufactured by Digital Instruments
  • Scan mode Contact mode in-air measurement
  • Underwater tapping mode underwater measurement
  • Scanning range 10 ⁇ m, 25 ⁇ m square (measurement in air) 5 ⁇ m
  • 10 ⁇ m square underwater measurement
  • Scanning resolution 512 ⁇ 512 -Sample preparation The membrane sample was immersed in ethanol at room temperature for 15 minutes, then immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried.
  • the RO water refers to water that has been filtered using a reverse osmosis membrane (RO membrane), which is a type of filtration membrane, to exclude impurities such as ions and salts.
  • RO membrane reverse osmosis membrane
  • the pore size of the RO membrane is approximately 2 nm or less.
  • the film surface roughness d rough was calculated from the height in the Z-axis direction at each point by the above-described atomic force microscope (AFM) by the following formula (2).
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a flat membrane.
  • the average thickness is selected according to the application.
  • the average thickness when the shape of the porous membrane is a flat membrane is preferably 20 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and more preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a hollow fiber membrane.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 200 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less
  • the film thickness is preferably 20 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • a woven fabric or a knitted fabric in which organic fibers or inorganic fibers are formed in a cylindrical shape may be included in the hollow fiber.
  • the above-mentioned porous membrane can be manufactured by the manufacturing method described in WO2007 / 097260, for example.
  • the separation membrane in the present invention can be a membrane containing at least ceramics.
  • the ceramics in the present invention refers to those containing a metal oxide and baked and hardened by heat treatment at a high temperature.
  • the metal oxide include alumina, magnesia, titania, zirconia and the like.
  • the separation membrane may be formed of only a metal oxide, and may include silica, silicon carbide, mullite, cordierite, or the like, which is a compound of silica and a metal oxide.
  • Components other than the ceramics forming the separation membrane are not particularly limited as long as they can form a porous body as a separation membrane.
  • the shape is not particularly limited, and any of monolithic membrane, flat membrane, tubular membrane and the like can be used. From the viewpoint of filling efficiency into the container, a columnar structure and a structure having a through hole in the longitudinal direction is preferable. A monolith film is preferred from the viewpoint of increasing the filling efficiency.
  • the separation membrane When a separation membrane having a columnar structure is housed in a module container and used as a separation membrane module, the separation membrane can be modularized and filtered by selecting a suitable mode from an external pressure type and an internal pressure type.
  • the side where the separation membrane is in contact with the fermentation broth is referred to as the primary side
  • the side where the filtrate containing the chemical product is obtained by filtration is referred to as the secondary side.
  • the output of the circulation pump can be saved when cross-flow filtration is performed because the flow path on the primary side is narrow. Furthermore, the action of discharging turbidity deposited on the surface of the separation membrane to the outside of the module becomes stronger, which is preferable because the surface of the separation membrane is easily kept clean.
  • the internal pressure type separation membrane has an inlet and an outlet for the fermentation broth. In this case, it is preferable that the inlet and the outlet are in a state of through holes arranged in a straight line, since the liquid flow resistance becomes small. Further, since the separation membrane has a columnar structure and the through-holes are vacant in the longitudinal direction, the container for accommodating the separation membrane can be made thinner. When the separation membrane module is thin, it can be preferably used from the viewpoint of production and handling.
  • the porosity of the separation membrane is not particularly limited, but if it is too low, the filtration efficiency will deteriorate, and if it is too high, the strength will decrease. In order to achieve both the filtration efficiency and the strength of the separation membrane and to have resistance to repeated steam sterilization, it is preferably 20% or more and 60% or less.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less. If the membrane has an average pore diameter in this range, the separation membrane is less likely to block and the filtration efficiency is excellent. In addition, if the average pore size is in the range of 0.02 ⁇ m or more and 0.2 ⁇ m or less, fermentation by-products by microorganisms and cultured cells exemplified by proteins and polysaccharides, and microorganisms / cultured cells in the culture solution This is particularly preferable because clogging of a substance that easily clogs the separation membrane, such as a crushed cell produced by death, is less likely to occur.
  • the separation membrane having a columnar structure having a through hole has a secondary surface on the secondary side, it is preferable to provide a module container for collecting filtrate and use the module as a module in which the separation container is filled.
  • One or more separation membranes are filled in one module.
  • the module container is preferably made of a material that can withstand repeated steam sterilization.
  • raw materials that can withstand steam sterilization include stainless steel and ceramics having a low average porosity.
  • Such a ceramic membrane module can be manufactured by, for example, a manufacturing method described in WO2012 / 086763, but a commercially available one can also be used. Specific examples of commercially available products include MEMBLAROX microfiltration membranes (Pall), ceramic membrane filter cefilt MF membranes (NGK), and the like.
  • the culture solution of microorganisms is filtered through a separation membrane, the unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution, and the fermentation raw material is added to the culture solution to recover the product from the filtrate. It is characterized by fermentation.
  • the culture of microorganisms may be carried out at a pH and temperature suitable for the microorganism to be used, and is not particularly limited as long as the microorganisms are grown. However, the cultivation is usually performed at a pH of 4 to 8 and a temperature of 20 to 75 ° C. Is called.
  • the pH of the culture solution is usually adjusted to a predetermined value within a pH range of 4 to 8 with an inorganic or organic acid, an alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, or the like.
  • the sugar concentration in the culture solution in continuous fermentation is desirably maintained at 5 g / L or less from the viewpoint of productivity. It can be controlled by the supply rate of the continuous fermentation medium, the filtration rate of the culture solution, or the sugar concentration in the supply medium. Another means is to adjust the oxygen supply amount.
  • Microorganisms having a pentose reductase and a pentose dehydrogenase used in the present invention are more advantageous for pentose metabolism as the oxygen concentration is higher.
  • ethanol fermentation using glucose is efficiently performed under anaerobic conditions not using oxygen.
  • aerobic conditions are more advantageous in pentose metabolism.
  • pentose reductase uses NADH as a coenzyme, but there is an imbalance in the redox balance of the pentose metabolic pathway, and due to this imbalance, the pathway using oxygen is excessively used. It is thought that.
  • Some microorganisms have a dual enzyme pentose reductase that can utilize both NADH and NADPH.
  • the oxygen condition of the culture in the present invention is preferably an oxygen transfer capacity coefficient KLa (hr ⁇ 1 ) (hereinafter simply abbreviated as KLa), preferably 5 to 300 hr ⁇ 1 , more preferably 10 to 250 hr ⁇ 1 , even more preferably.
  • KLa oxygen transfer capacity coefficient
  • KLa is 5 hr ⁇ 1 or less, the sugar consumption rate decreases, and the production efficiency may not increase. Further, when KLa is 300 hr ⁇ 1 or more, foaming becomes active, which may hinder continuous fermentation.
  • KLa indicates the ability to move oxygen from the gas phase to the liquid phase in a unit time to generate dissolved oxygen at the time of aeration and stirring, and is defined by the following formula (3) (Biotechnology Experiments, (See Japan Biotechnology Society, Bafukan, p. 310 (1992)).
  • dC / dt KLa ⁇ (C * ⁇ C) (3).
  • C dissolved oxygen concentration DO (ppm) in the culture solution
  • C * dissolved oxygen concentration DO (ppm) in equilibrium with the gas phase when oxygen is not consumed by microorganisms
  • KLa in the present invention is a numerical value measured by a gas substitution method (dynamic method).
  • gas displacement method dynamic method
  • water or a medium to be used is placed in an aeration and agitation culture apparatus with a dissolved oxygen concentration electrode inserted, and oxygen in these liquids is replaced with nitrogen gas to lower the oxygen concentration of the liquid.
  • nitrogen gas is switched to compressed air, and the KLa is calculated by measuring the rising process of dissolved oxygen under a predetermined aeration rate, stirring rate and temperature.
  • KLa can be set as appropriate by combining aeration conditions and agitation conditions for culture with aeration and agitation.
  • the aeration gas can be changed depending on the culture conditions.
  • means such as adding oxygen to the air to keep the oxygen concentration at 21% or higher, pressurizing the culture solution, increasing the stirring speed, or increasing the aeration speed can be used. .
  • the transmembrane pressure difference during filtration is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered.
  • the organic polymer membrane is filtered at a transmembrane pressure higher than 150 kPa, there is a high possibility that the structure of the organic polymer membrane is destroyed, and the ability to produce chemical products may be reduced.
  • the transmembrane pressure is lower than 0.1 kPa, the permeated water amount of the fermentation broth may not be obtained sufficiently, and the productivity when producing a chemical product tends to decrease.
  • the amount of permeated water of the fermentation broth is increased by setting the transmembrane differential pressure, which is a filtration pressure, preferably in the range of 0.1 kPa to 150 kPa. Therefore, the ability to produce chemical products can be maintained at a high level.
  • the transmembrane pressure is preferably in the range of 0.1 kPa to 50 kPa, more preferably in the range of 0.1 kPa to 20 kPa, in the organic polymer film.
  • the transmembrane pressure difference during filtration is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered, but is preferably 500 kPa or less.
  • the operation is performed at 500 kPa or more, clogging of the membrane occurs, which may cause a problem in the continuous fermentation operation.
  • a transmembrane differential pressure can be generated in the separation membrane by a siphon using a liquid level difference (water head difference) of the fermented liquid and the porous membrane treated water or a cross flow circulation pump.
  • a suction pump may be installed on the secondary side of the separation membrane as a driving force for filtration.
  • the transmembrane pressure difference can be controlled by the suction pressure.
  • the transmembrane pressure difference can be controlled also by the pressure of the gas or liquid that introduces the pressure on the fermentation broth side.
  • continuous fermentation filtration of the culture solution
  • continuous fermentation may be started after batch culture or fed-batch culture is performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration.
  • the start timing of the medium supply and the filtration of the culture solution is not necessarily the same. Further, the medium supply and the filtration of the culture solution may be continuous or intermittent.
  • the nutrients necessary for cell growth may be added to the medium so that the cell growth is continuously performed.
  • the concentration of microorganisms in the culture solution may be a concentration that is preferable for efficiently producing a chemical product. For example, good production efficiency can be obtained by maintaining the concentration of microorganisms in the culture solution as a dry weight of 5 g / L or more.
  • microorganisms in the culture tank are obtained by removing a part of the culture solution containing the microorganisms from the fermenter and diluting with a medium as necessary during the continuous fermentation.
  • the density may be adjusted. For example, if the concentration of microorganisms in the fermenter becomes too high, the separation membrane is likely to be clogged. Therefore, by removing a part of the culture solution containing microorganisms and diluting with a culture medium, clogging of the separation membrane can be achieved. It can be easily avoided.
  • the production performance of chemicals may change depending on the concentration of microorganisms in the fermenter. Using the production performance as an indicator, remove a part of the culture solution containing microorganisms and dilute it in the medium to maintain the production performance. It is also possible.
  • the continuous fermentation apparatus used in the present invention filters the fermentation broth of microorganisms through a separation membrane, collects the product from the filtrate, holds or refluxs the unfiltrated liquid in the fermentation broth, and supplies the fermentation raw material.
  • a separation membrane collects the product from the filtrate in addition to the fermentation broth, but when using an organic polymer membrane, a specific example is given.
  • the apparatus described in WO2007 / 097260 can be used.
  • the apparatus described in WO2012 / 086763 can be used.
  • the chemical product produced by the method for producing a chemical product of the present invention is not limited as long as it is a substance produced by the microorganism in the culture solution.
  • Examples of the chemical product produced by the method for producing a chemical product of the present invention include substances that are mass-produced in the fermentation industry, such as alcohols, organic acids, amino acids, and nucleic acids.
  • alcohols include ethanol, isobutanol, isopropanol, n-butanol, 1,3-propanediol, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, glycerol, etc.
  • organic acids include acetic acid, lactic acid
  • nucleic acids include pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, citric acid, and adipic acid.
  • Nucleosides such as inosine and guanosine, nucleotides such as inosinic acid and guanylic acid, and diamine compounds such as cataverine and putrescine. be able to.
  • the present invention can also be applied to the production of substances such as enzymes, antibiotics, and recombinant proteins. These chemicals can be recovered from the filtrate by known methods (membrane separation, concentration, distillation, crystallization, extraction, etc.).
  • the collected culture solution was washed twice with 50 mM phosphate buffer.
  • the cells were resuspended in 50 mM phosphate buffer and disrupted with a bead-type homogenizer (bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times), and the supernatant was recovered by centrifugation.
  • a bead-type homogenizer bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times
  • the bacterial cell extract was added to 200 mM xylose and 50 mM phosphate buffer (900 ⁇ L) containing 100 ⁇ L of 1.5 mM NAD (P) H, and the absorbance at 340 nm was continuously measured when reacted at 30 ° C. Monitored.
  • the collected culture was washed twice with 50 mM Tris-HCl buffer.
  • the cells were resuspended with 50 mM Tris-HCl buffer and crushed with a bead type homogenizer (bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times), and the supernatant was recovered by centrifugation. This was used as a bacterial cell extract.
  • the bacterial cell extract was added to 900 ⁇ L of 50 mM Tris-HCl buffer containing 50 mM MgCl 2 , 300 mM xylitol and 100 ⁇ L 10 mM NAD (P) +, and the absorbance at 340 nm was continuously measured when reacted at 35 ° C. Monitored.
  • KLa measurement The dissolved oxygen electrode (made by METTLER TOLEDO) was inserted in the culture tank, the dissolved oxygen concentration with respect to each aeration stirring condition was measured, and KLa was calculated
  • 1.5 L of water is added to the culture tank, and the water temperature is adjusted to 30 ° C. while stirring at a constant speed. Nitrogen gas is sufficiently blown into the water.
  • the electrode value reaches the minimum value
  • the change in dissolved oxygen concentration with time after switching the aeration gas from nitrogen gas to air of a predetermined aeration rate was measured to obtain KLa.
  • Table 1 shows KLa for each aeration stirring condition obtained when aeration of compressed air was performed at a stirring speed of 800 rpm and a temperature of 30 ° C.
  • Equation (5) The relationship between the air flow rate and KLa was plotted at 0.01 to 0.6 vvm in Table 1, and the constant (a, b) of Equation (5) was calculated to be (284, 0.49). Since the value of 1.5 vvm deviated from the linear relationship of the plot, the calculation was performed without calculating the constant.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain Ethanol production by batch culture of Candida tropicalis using hexose as a fermentation raw material
  • YPD medium yeast extract 1%, bacto
  • Peptone 2%, glucose 7% were used as the medium.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured with shaking in 2 mL of YPD medium in a test tube at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into a 500 mL pleated Erlenmeyer flask containing 50 mL of YPD medium and cultured overnight with shaking (preculture).
  • the preculture is inoculated into 1.5 L of YPD medium, the culture tank is stirred at 800 rpm with the attached stirrer, the aeration rate of the culture tank is adjusted, the temperature is adjusted, and batch culture is performed for 16 hours under the following conditions: To produce ethanol (Table 3).
  • Culture tank volume 2L Culture tank effective volume: 1.5L Temperature adjustment: 30 ° C Culture tank aeration rate: 0.1 vvm compressed air culture tank agitation speed: 800 rpm pH adjustment: None Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • Comparative Example 2 Ethanol production by batch culture of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material YPDX medium having the composition shown in Table 2 was used as the culture medium for 23 hours under the same conditions as in Comparative Example 1 To produce ethanol (Table 3).
  • Example 1 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 1
  • Continuous fermentation using a separation membrane using a YPDX medium having the composition shown in Table 2 as a medium was performed.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured in a test tube with shaking in 2 mL of YPD medium at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into a 500 mL pleated Erlenmeyer flask containing 50 mL of YPD medium and cultured overnight with shaking (pre-culture).
  • the culture broth was inoculated in a continuous fermentation apparatus (the apparatus shown in FIG.
  • the transmembrane pressure difference during filtration is in the range of 0.1 to 20.0 kPa.
  • ethanol was produced by continuous fermentation for 370 hours (Table 3).
  • Culture tank volume 2L Culture tank effective volume: 1.5L Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 120 cm 2 Pure water permeability coefficient of separation membrane: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / Pa Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore diameter: 0.035 ⁇ m Separation membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Temperature adjustment: 30 ° C Culture tank aeration rate: 0.01 vvm compressed air culture tank agitation speed: 800 rpm pH adjustment: None Culture medium filtration rate: 0.05 L / hr Sterilization: The culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes and autoclaved.
  • Example 2 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 2 Continuous fermentation using a separation membrane using Candida tropicalis NBRC0199 was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 369 hours under the same conditions as in Example 1 except that the culture tank aeration rate was 0.1 vvm compressed air (Table 3).
  • Example 3 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 3 Continuous fermentation using a separation membrane using Candida tropicalis NBRC0199 was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 370 hours under the same conditions as in Example 1 except that the culture tank aeration rate was 1.5 vvm compressed air (Table 3).
  • Example 4 Production of Ethanol by Continuous Fermentation Using Pichia Stippitis Separation Membrane Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material 1 As a microorganism, Pichia stipitis NBRC1687 strain was used, and continuous fermentation using a separation membrane was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 370 hours under the same conditions as in Example 1 except that the preculture was performed for 48 hours and the transmembrane pressure difference was adjusted to 0.1 to 19.8 kPa (Table 4).
  • Example 5 Production of Ethanol by Continuous Fermentation Using Pichia Stippitis Separation Membrane Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material 2 As a microorganism, Pichia stipitis NBRC1687 strain was used, and continuous fermentation using a separation membrane was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 369 hours under the same conditions as in Example 2 except that the preculture was performed for 40 hours and the transmembrane pressure was 0.1 to 19.8 kPa (Table 4).
  • Example 6 Ethanol Production by Continuous Fermentation Using Pichia Stippitis Separation Membrane Using Mixed Sugar as Fermentation Material 3 As a microorganism, Pichia stipitis NBRC1687 strain was used, and continuous fermentation using a separation membrane was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 370 hours under the same conditions as in Example 3 except that the pre-culture was 36 hours and the transmembrane pressure difference was 0.1 to 19.8 kPa (Table 4).
  • Example 7 Production of D-lactic acid by continuous fermentation using a separation membrane of Candida utilis using mixed sugar as a fermentation raw material 1 Using Candida utilis CuLpLDH strain as a microorganism, continuous fermentation using a separation membrane was performed. D-lactic acid was produced by continuous fermentation for 370 hours under the same conditions as in Example 1 except that the pre-culture was performed for 50 hours and the pH was adjusted to 6.0 with 1N calcium hydroxide (Table 5).
  • Example 8 Production of D-lactic acid by continuous fermentation using a separation membrane of Candida utilis using mixed sugar as a fermentation raw material 2 Using Candida utilis CuLpLDH strain as a microorganism, continuous fermentation using a separation membrane was performed. D-lactic acid was produced by continuous fermentation for 369 hours under the same conditions as in Example 1 except that the preculture was carried out for 40 hours and the pH was adjusted to 6.0 with 1N calcium hydroxide (Table 5).
  • Example 9 Production of D-lactic acid by continuous fermentation using a separation membrane of Candida utilis using mixed sugar as a fermentation raw material 3 Using Candida utilis CuLpLDH strain as a microorganism, continuous fermentation using a separation membrane was performed. D-lactic acid was produced by continuous fermentation for 370 hours under the same conditions as in Example 1 except that the pre-culture was performed for 30 hours and the pH was adjusted to 6.0 with 1N calcium hydroxide (Table 5).
  • Comparative Example 10 Production of ethanol by batch fermentation of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 2 Batch fermentation was performed using Candida tropicalis NBRC0199 strain.
  • the fermentation medium used was a YPDX medium, but the sugar concentration was changed from the composition shown in Table 2 and prepared with 1% glucose and 9% xylose.
  • Other operating conditions were the same as in Comparative Example 2, and ethanol was produced by batch fermentation for 42 hours (Table 6).
  • Example 10 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 4
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was used for continuous fermentation using a separation membrane.
  • the fermentation medium used was a YPDX medium, but the sugar concentration was changed from the composition shown in Table 2 and prepared with 1% glucose and 9% xylose.
  • Other operating conditions were the same as in Example 1, and ethanol was produced by continuous fermentation for 420 hours (Table 6).
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was used for continuous fermentation using a ceramic separation membrane.
  • the fermentation medium used was a YPDX medium, but the sugar concentration was changed from the composition shown in Table 2 and prepared with 1% glucose and 9% xylose.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured in a test tube with shaking in 2 mL of YPD medium at 30 ° C. overnight (pre-culture). The obtained culture broth was inoculated into a 500 mL pleated Erlenmeyer flask containing 50 mL of YPD medium and cultured overnight with shaking (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated into a membrane-separated continuous fermentation apparatus (apparatus shown in FIG. 12 of WO2012 / 086763) containing 1.5 L of YPDX medium, and the culture tank was stirred at 800 rpm with an attached stirrer. Then, the aeration rate of the culture tank and the temperature were adjusted, and the culture was performed for 36 hours (preculture). Immediately after completion of the preculture, continuous fermentation was started. Ethanol was produced by continuous fermentation for 400 hours while adjusting the transmembrane pressure difference during filtration to 500 kPa or less (Table 6).
  • Culture tank volume 2L Culture tank effective volume: 1.5L Separation membrane used: Celfit microfiltration membrane monolith ⁇ 4-19 (NGK) Membrane separation element length: 500mm Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Temperature adjustment: 30 ° C Culture tank aeration rate: 0.01 vvm compressed air culture tank agitation speed: 800 rpm pH adjustment: None.
  • Comparative Example 12 Production of Ethanol by Batch Culture of Candida tropicalis Using Mixed Sugar as Fermentation Material 3
  • Batch fermentation was performed using Candida tropicalis NBRC0199 strain.
  • a cellulose saccharified solution prepared by the preparation method using a nanofiltration membrane disclosed in Example 2 of WO2010 / 067785 was used, and the composition of the fermentation medium was appropriately prepared as shown in Table 7 using reagents.
  • Other operating conditions were the same as in Comparative Example 3, and ethanol was produced by batch fermentation for 72 hours (Table 8).
  • Example 12 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 6
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was used for continuous fermentation using a separation membrane.
  • the fermentation medium the medium shown in Table 7 was used as in Comparative Example 12.
  • Other operating conditions were the same as in Example 1, and ethanol was produced by continuous fermentation for 456 hours (Table 8).
  • the efficiency of fermentation production of various chemicals using fermentation raw materials containing pentose and hexose can be greatly improved.

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Abstract

［課題］六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料とした高収率の化学品の製造方法を提供すること。 ［解決手段］微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記発酵原料が五炭糖および六炭糖を含み、前記微生物がペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物である、化学品の製造方法を提供した。

Description

化学品の製造方法
　本発明は、六炭糖および五炭糖を含む発酵原料を使用した連続発酵による化学品の製造方法に関する。
　乳酸などの生分解性ポリマー原料やエタノールなどのバイオ燃料に代表されるバイオマス由来の化学品は、大気中への二酸化炭素の排出問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びている。これら生分解性ポリマー原料やバイオ燃料の製造方法としては、とうもろこしなどの可食性バイオマスから精製した六炭糖であるグルコースを微生物の発酵原料に使用し、発酵産物として得るのが一般的であるが、可食性バイオマスを使用すると、食料と競合することから価格高騰が引き起こされ、安定した原料の調達ができなくなる恐れがある。そこで、稲わらなどの非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する試みが行われている（特許文献１参照。）。
　非可食性バイオマス由来の糖を発酵原料に使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られ、非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する場合、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として使用することになる（特許文献１参照。）。六炭糖と五炭糖の混合糖を使用する場合は、六炭糖の代謝経路に加えて五炭糖の代謝経路を有する微生物を使用する必要がある。五炭糖の代謝経路として、ペントースレダクターゼとペントールデヒドロゲナーゼによる代謝経路が知られており、第一段階として五炭糖にペントースレダクターゼが作用してペントールを生成し、第二段階としてペントールにペントールデヒドロゲナーゼが作用することが知られている。しかしながら、実際は第一段階で生成するペントールが第二段階以降の代謝経路に流れずに培養液中に蓄積してしまうため、生産収率が上がらないという課題がある。
　六炭糖と五炭糖の混合糖である非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料とした発酵方法としては連続発酵が採用されうるが、実際に連続発酵した場合の発酵収率については確認されていない（特許文献１参照。）。一方で、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として連続発酵する場合、バッチ発酵よりも発酵収率が著しく低下してしまうことも知られている（非特許文献１参照。）。
　したがって、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料としたペントースレダクターゼとペントールデヒドロゲナーゼによる五炭糖の代謝経路を有する微生物の発酵において発酵収率を向上させようとする場合、変異導入や遺伝子導入によるキシロース代謝経路の改良を行う必要があると考えるのがこれまでの技術常識であった。
ＷＯ２０１０／０６７７８５
Ｓｕｓａｎ　Ｔ．Ｔｏｏｎら，Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　Ｘｙｌｏｓｅ　ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｙｅａｓｔ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　ｂａｔｃｈ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｍｏｄｅｓ． ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，（１９９７），６３－６５，２４３－２５５．
　本発明は、六炭糖と五炭糖の混合糖をペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼによる五炭糖代謝経路を有する微生物の発酵原料として発酵する場合の発酵収率の向上を課題とするものである。
　本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、ペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼを有する微生物を使用する場合に、六炭糖および五炭糖を含む発酵原料で分離膜を用いた連続発酵を行うことで上記課題を解決し、六炭糖と五炭糖の混合糖からの収率向上を実現し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は以下（１）～（７）の通りである。
（１）微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記発酵原料が五炭糖および六炭糖を含み、前記微生物がペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物である、化学品の製造方法。
（２）酸素移動容量係数（ＫＬａ）が５～３００ｈ－１の条件で連続発酵を行う、（１）記載の化学品の製造方法。
（３）前記発酵原料中に含まれる五炭糖と六炭糖の比率が１：９～９：１である、（１）または（２）記載の化学品の製造方法。
（４）前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、（１）または（２）記載の化学品の製造方法。
（５）五炭糖がキシロースである、（１）～（４）のいずれか記載の化学品の製造方法。
（６）ペントースレダクターゼがキシロースレダクターゼである、（１）～（５）のいずれか記載の化学品の製造方法。
（７）ペントールデヒドロゲナーゼがキシリトールデヒドロゲナーゼである、（１）～（６）のいずれか記載の化学品の製造方法。
　本発明によって、五炭糖および六炭糖を含む発酵原料を用いたペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼを有する微生物の種々の化学品の発酵生産の効率収率を大幅に向上させることができる。
　本発明の化学品の製造方法は、発酵原料に五炭糖および六炭糖の混合糖を含むものを使用してペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼを有する微生物を培養し、その培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵であることを特徴とする。
　五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
　六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
　本発明で使用される混合糖に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことから、セルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法は、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１－５０６９３４号公報、特開２００５－２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ　ｔｏ　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｃｏ－Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｄｉｌｕｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｒｎ　Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０～５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３－２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１－９５５９７号公報）、バイオマスを２４０～２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
　混合糖に含まれる五炭糖と六炭糖の重量比率としては、どのような比率であってもかまわないが、混合糖中の五炭糖と六炭糖の重量比率として（五炭糖）：（六炭糖）と表すと、１：９～９：１が好ましい。これは、混合糖としてセルロース含有バイオマス由来糖液を想定した場合の糖比率である。
　混合糖の総糖濃度としては、微生物が基質阻害を受けない程度に高濃度であることが好ましい。糖濃度が低すぎると生産効率が悪いため、２０ｇ／Ｌ以上が好ましい。好ましい総糖濃度の範囲としては、２０～５００ｇ／Ｌである。上記を鑑みると、五炭糖の濃度は、５ｇ／Ｌ以上、六炭糖の濃度は、５ｇ／Ｌ以上が好ましい。
　また、発酵原料に含まれる窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
　次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物について説明する。本発明の微生物については、ペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼを有する微生物であれば特に制限はない。さらに、使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。
　ペントースレダクターゼとは、還元酵素のひとつであり、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素としてアルドペントースを糖アルコールに変換する活性を有する酵素を意味する。例えば、キシロースレダクターゼは例えばＥＣ１．１．１．３０７やＥＣ１．１．１．２１が該当し、キシロースをキシリトールに変換する酵素である。アラビノースレダクターゼは例えばＥＣ１．１．１．２１が該当し、アラビノースをアラビトールに変換する酵素である。また、前記ＥＣ番号で分類される酵素でなくとも、上記活性を有する酵素であれば、本発明中におけるペントースレダクターゼに含まれる。
　ペントールデヒドロゲナーゼとは、脱水素酵素のひとつであり、ＮＡＤ＋を補酵素としてペントールをケトペントースに変換する酵素である。例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼは例えばＥＣ１．１．１．９やＥＣ１．１．１．１０が該当し、キシリトールをキシルロースに変換する酵素である。アラビトールデヒドロゲナーゼは例えばＥＣ１．１．１．１１やＥＣ１．１．１．１２が該当し、アラビトールをリボースに変換する酵素である。分類上ペントールデヒドロゲナーゼと異なる酵素であっても、上記活性を有する酵素であれば、本発明中におけるペントールデヒドロゲナーゼに含まれるとする。
　ペントースを代謝できる微生物は、ペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼを有する微生物として知られている。例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、イッサチェンキア属（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、リンドネラ属（Ｌｉｎｄｎｅｒａ）、ウィッカーハモミセス属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）などである。具体的には、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・メキシカーナ（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｘｃａｎａ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｈｅｈａｔａｅ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・テヌイス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｅｎｕｉｓ）、キャンディダ・ボイディーニ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・ディッデンシ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ）、キャンディダ・インターミディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、キャンディダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、キャンディダ・ウィッカーハミイ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、クリベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、イッサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、デバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、トルロプシス・ボンビコーラ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、ブレタノミセス・ナアルデネンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ）、リンドネラ・ロダネンシス（Ｌｉｎｄｎｅｒａ　ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ）、ウィッカーハモミセス・ラバウレンシス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ　ｒａｂａｕｌｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。これらがペントースレダクターゼおよびペントースデヒドロゲナーゼを有することは、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）やＧｅｎＢａｎｋ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。
　また、データベースに情報がない微生物であっても、以下の［１］、［２］に示す酵素活性測定によって知ることができる。
　［１］ペントースレダクターゼ活性測定
　２００ｍＭのキシロース（またはアラビノースなどのペントース）、および１００μＬの１．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む５０ｍＭのリン酸バッファー（９００μＬ）に培養微生物の菌体抽出液を添加し、反応によって生成されるＮＡＤ（Ｐ）＋の特異的な３４０ｎｍの吸光度の減少を３０℃でモニターすることで、ペントースレダクターゼ活性を測定できる。
　［２］ペントールデヒドロゲナーゼ活性測定
　５０ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのキシリトール（またはアラビノースなどのペントース）および１００μＬの１０ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー９００μＬに培養微生物の菌体抽出液を添加し、反応によって生成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの特異的な３４０ｎｍの吸光度の増加を３５℃でモニターすることで、ペントールデヒドロゲナーゼ活性を測定できる。
　さらに、バクテリアやパン酵母など、元来ペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼ活性を有さない微生物であっても、遺伝子組換えによって該酵素を発現させてあれば本発明に含まれる。元来ペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼ活性を有さない微生物として知られているのは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｉｘａ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）、ザイモバクター・パルマエ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅ）などが挙げられる。遺伝子組換えによって該酵素を発現させた微生物を作出する方法としては、特開２００９－１１２２８９などに開示されている。
　さらに、該酵素を有する微生物を、変異導入や遺伝子組換えによって発酵能を強化したり、外来の遺伝子を導入して元来作らない物質を生産させたりしてもよい。具体的には、キシロースレダクターゼとキシリトールデヒドロゲナーゼに加えてキシロースイソメラーゼを導入する、キシリトールの代謝物であるキシルロースに作用するキシルロースキナーゼを高発現させる、またはＤ－乳酸を生産しない微生物にＤ－乳酸脱水素酵素を導入する、などである。
　次に、本発明において分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。
　本発明に用いる多孔質膜については特に制限はなく、微生物の撹拌型培養器あるいは撹拌型バイオリアクターによる培養で得られた培養液を微生物から分離濾過する機能を有するものであればよく、例えば多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
　本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
　多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
　多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
　本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
　多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
　多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
　多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
　ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
　本発明で分離膜として使用される多孔性膜は特に制限はなく、発酵に使用される微生物が通過できなければよいが、発酵に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりを起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、多孔性分離膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが好ましい。また、さらに好ましくは、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
　微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は１μｍ未満であることが好ましい。多孔性膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。
　また、微生物が所望の生産物である化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、培養液中の微生物の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による多孔性膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
　平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
　ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
　本発明で用いられる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の式（１）により算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０－７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
　本発明で用いられる多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
　さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、多孔性膜の純水透過係数が２×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の多孔性膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転がより容易に可能であることがわかった。多孔性膜の表面粗さを０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、多孔性膜の表面粗さを０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。多孔性膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
　ここで、多孔性膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置　　原子間力顕微鏡装置（Digital Instruments（株）製“Nanoscope IIIa”）
・条件　　探針　　　　ＳｉＮカンチレバー（Digital Instruments（株）製）
　　　　　走査モード　コンタクトモード（気中測定）
　　　　　　　　　　　水中タッピングモード（水中測定）
　　　　　走査範囲　　１０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
　　　　　　　　　　　５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
　　　　　走査解像度　５１２×５１２
・試料調製　測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
　膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の式（２）により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
　なお、前述の多孔性膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０に記載される製造方法により製造することができる。
　また、別の好ましい形態として、本発明における分離膜は、少なくともセラミックスを含む膜であり得る。本発明におけるセラミックスとは金属酸化物を含有し、高温での熱処理により焼き固められたものをさす。金属酸化物としては、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニアなどが例示できる。分離膜は金属酸化物のみから形成されてもよく、シリカや炭化珪素、シリカと金属酸化物の化合物であるムライトやコージェライトなどを含んでもよい。
　分離膜を形成するセラミックス以外の成分は、分離膜としての多孔質体をなすことができるものであれば特に限定されない。
　分離膜がセラミックスを含む場合もその形状には特に制限はなく、モノリス膜、平膜、管状膜などいずれも用いることができる。容器内への充填効率の観点から柱状構造であり、長手方向に貫通孔を有する構造のものが好ましい。充填効率が上げられる点から、好ましくはモノリス膜である。
　長手方向に貫通孔を有することが好ましい理由は以下のとおりである。柱状構造を有する分離膜をモジュール容器に収めて分離膜モジュールとして用いる場合は、分離膜は外圧式および内圧式のうちから好適な態様を選択してモジュール化、濾過することが可能となる。本発明においては、これ以降、分離膜が発酵培養液と接する側を１次側、濾過により化学品を含む濾液が得られる側を２次側とそれぞれ呼ぶこととする。
　内圧式モジュールを用いると、１次側の流路が狭いため、クロスフロー濾過を行う場合に循環ポンプの出力が節約できる。さらに、分離膜表面に堆積した濁質をモジュール外に排出する作用が強くなり、分離膜表面が清浄に保たれやすいため好ましい。ただし、この効果を得るためには、内圧式の分離膜が発酵培養液の入り口および出口を有していることが前提となる。このときの入り口および出口は一直線に配された貫通孔の状態であると、通液抵抗が小さくなるため好ましい。さらに分離膜が柱状構造で、貫通孔が長手方向に空いていることによって、分離膜を収める容器を細くすることが可能となる。分離膜モジュールが細いと、製造や取り扱いの観点から好ましく用いることが出来る。
　分離膜の気孔率は特に限定されないが、低すぎると濾過効率が悪くなり、高すぎると強度が低下してしまう。濾過効率と分離膜の強度を両立させ、繰り返し蒸気滅菌への耐性も持たせるためには、２０％以上６０％以下であることが好ましい。
　なお気孔率は、以下の式より決定される。
気孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]－乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）。
　分離膜の平均気孔径は０．０１μｍ以上１μｍ以下であれば好ましく、この範囲の平均気孔径を有する膜であれば分離膜が閉塞しにくく、かつ濾過効率にも優れる。また、平均気孔径が０．０２μｍ以上０．２μｍ以下の範囲であれば、タンパク質、多糖類などに例示される微生物や培養細胞による発酵の副生成物や、培養液中の微生物/培養細胞が死滅して生じる細胞破砕物といった、分離膜を閉塞させやすい物質の閉塞が起きにくくなるため特に好ましい。
　貫通孔を有する柱状構造の分離膜は、外表面が２次側となるため、濾過液を集めるためにモジュール容器を設け、モジュール容器内に分離膜を充填したモジュールとして用いることが好ましい。１本のモジュールに充填される分離膜は１本以上である。
　モジュール容器は、繰り返しの蒸気滅菌処理に耐えうる原料からなることが好ましい。蒸気滅菌処理に耐えうる原料としては、たとえばステンレス鋼や、平均気孔率の低いセラミックスなどが例示される。
　このようなセラミック膜モジュールは、例えばＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される製造方法により製造することができるが、市販のものを利用することもできる。市販のものとして具体的に例示すると、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ精密ろ過膜（Ｐａｌｌ）、セラミック膜フィルターセフィルトＭＦ膜（日本ガイシ）などが挙げられる。
　次に、連続発酵について説明する。
　本発明での連続発酵は、微生物の培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して濾過液中から生産物を回収する連続発酵であることを特徴とする。
　微生物の培養は、用いる微生物に適したｐＨおよび温度を設定すればよく、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、通常、ｐＨが４～８で温度が２０～７５℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４～８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
　また、連続発酵における、培養液中の糖濃度は、生産性の観点から５ｇ／Ｌ以下を保つことが望ましい。連続発酵の培地の供給速度や培養液の濾過速度、あるいは供給培地中の糖濃度によって調節できる。また別の手段としては、酸素供給量を調節することが挙げられる。
　本発明で用いるペントースレダクターゼとペントースデヒドロゲナーゼを有する微生物は、酸素濃度が高いほどペントースの代謝が有利であることが多い。通常、グルコースを利用したエタノール発酵などは、酸素を利用しない嫌気的条件下で効率よく行われることが知られている。しかし、ペントースの代謝においては、好気的条件の方が有利である。というのは、ペントースレダクターゼは補酵素として多くがＮＡＤＨを利用するが、ペントース代謝経路の酸化還元バランスのアンバランスが生じており、このアンバランスのために、酸素を利用する経路を過剰に利用しているものと考えられる。一部の微生物では、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの両方を利用できるデュアル酵素のペントースレダクターゼを有する。このような酵素は、酸素が制限された状況下ではＮＡＤ／ＮＡＤＨ酸化還元システムのアンバランスを防ぐことができる（代謝工学‐原理と方法論‐、グレゴリ・Ｎ・ステファノポーラスら、東京電機大学出版、ｐ１７４（２００２））。そのため、用いる微生物によって適宜酸素供給量を設定することが必要であるが、上記のようなデュアル酵素であってもＮＡＤＰＨよりＮＡＤＨの方が利用されやすいことがあり、その場合は好気的条件においても代謝可能である。したがって、本発明における培養の酸素条件は、酸素移動容量係数ＫＬａ（ｈｒ－１）（以下、単にＫＬａと略す。）が好ましくは５～３００ｈｒ－１、より好ましくは１０～２５０ｈｒ－１、さらに好ましくは２０～２００ｈｒ－１である。ＫＬａが５ｈｒ－１以下であると、糖消費速度が低下するために生産効率があがらないことがある。また、ＫＬａが３００ｈｒ－１以上であると、発泡が盛んになるため連続発酵に支障をきたすことがある。
　ＫＬａとは、通気撹拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（３）で定義される（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２）参照。）。
ｄＣ／ｄｔ＝ＫＬａ×（Ｃ＊－Ｃ）・・・（３）。
　ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、ＫＬａ：酸素移動容量係数（ｈｒ－１）である。上記式（３）より、下記式（４）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊－Ｃの対数をプロットすることで、ＫＬａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊－Ｃ）＝－ＫＬａ×ｔ・・・（４）。
　また、本発明におけるＫＬａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気撹拌培養装置に水あるいは使用する培地を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、撹拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりＫＬａを計算する方法である。
　ＫＬａは通気条件と撹拌条件とを組み合わせて通気撹拌培養することで適宜設定できる。その場合通気は、通気する気体も培養条件によって変えることが可能である。例えば、溶存酸素濃度を高く保つには、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養液を加圧する、撹拌速度を上げる、通気速度を上げるなどの手段を用いることができる。
　本発明におけるＫＬａは、上記手段によって直接測定して求めればよいが、ＫＬａが低い範囲においては、撹拌速度一定下では以下の式（５）に示すようにＫＬａが通気速度に比例することが知られているため、計算によって求めても良い。具体的には、撹拌速度一定下で通気速度を適当に変化させてＫＬａ測定を行い、得られたＫＬａを通気速度に対してプロットし、式（５）に当てはまる定数ａおよびｂを求めることで設定することができる。
ＫＬａ＝ａ×Ｖ＋ｂ・・・（５）。
ここで、Ｖ：通気速度（ｖｖｍ）、ａ，ｂ：定数である。
ＫＬａが高くなり、式（５）から外れる場合は、直接測定を行ってＫＬａを求める。
　本発明の化学品の製造方法においては、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよい。しかし、有機高分子膜においては、１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、化学品を生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、発酵培養液の透過水量が十分得られない場合があり、化学品を製造するときの生産性が低下する傾向がある。本発明の化学品の製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１ｋＰａから１５０ｋＰａの範囲とすることにより、発酵培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０．１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲である。
　セラミック膜を用いる場合においても、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよいが、５００ｋＰａ以下が好ましい。５００ｋＰａ以上で運転すると、膜の目詰まりが発生し、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
　濾過の駆動力としては、発酵液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホン、またはクロスフロー循環ポンプにより分離膜に膜間差圧を発生させることができる。また、濾過の駆動力として分離膜２次側に吸引ポンプを設置してもよい。また、クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。更に、発酵液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
　また、本発明の化学品の製造方法では、培養初期にバッチ培養またはフェドバッチ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続発酵（培養液の濾過）を開始しても良い。また、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から、培地供給および培養液の濾過を行うことが可能である。培地供給と培養液の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、培地供給と培養液の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
　培地には、菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物の濃度は、化学品を効率よく生産するのに好ましい濃度であればよい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
　本発明の化学品の製造方法では、連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、培地で希釈することによって、培養槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、培地で希釈することで、分離膜の閉塞を容易に回避することができる。また、発酵槽内の微生物濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として、微生物を含んだ培養液の一部を取り除いて培地で希釈することで生産性能を維持させることも可能である。
　本発明の化学品の製造方法に従って連続発酵を行った場合、従来の培養と比較して、極めて発酵収率のよい連続発酵が可能となる。ここで、連続発酵における発酵収率は、次の式（６）で計算される。
収率（ｇ／ｇ）＝生成物量（ｇ）÷｛投入糖（ｇ）－未利用糖（ｇ）｝・・・（６）。
　本発明で用いられる連続発酵装置は、微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵による化学品の製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、有機高分子膜を使用する際は、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載される装置が使用できる。また、セラミック膜を使用する際は、ＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される装置が使用できる。
　本発明の化学品の製造方法で製造される化学品としては、上記微生物が培養液中に生産する物質であれば制限はない。本発明の化学品の製造方法で製造される化学品は、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、イソブタノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、１，３－プロパンジオール、１,４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、アジピン酸など、核酸としては、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、また、カタベリン、プトレシンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。これら化学品は周知の方法（膜分離、濃縮、蒸留、晶析、抽出等）により濾過液より回収することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（参考例１）グルコース、キシロース、エタノールの分析方法
　培養液中のグルコース、キシロースおよびエタノールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　（参考例２）乳酸の分析方法
　培養液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
　（参考例３）ペントースレダクターゼ活性の測定
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株、ＷＯ２０１０／１４０６０２に記載のキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を、それぞれ５ｍＬのＹＰＸ培地（酵母エキス１％、バクトペプトン２％、キシロース２％）に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩振とう培養をおこなった（前培養）。翌日、５０ｍＬのＹＰＸ培地入りの５００ｍＬのひだ付三角フラスコに前培養液を植え継ぎ、３０℃で２４時間振とう培養を行った。回収した培養液を５０ｍＭのリン酸バッファーにて２回洗浄した。５０ｍＭのリン酸バッファーで菌体を再懸濁し、ビーズ式ホモジナイザー（ビーズφ０．５を０．６ｇ、４０００ｒｐｍ、１分間×５回）にて破砕した後、遠心分離によって上清を回収してこれを菌体抽出液とした。２００ｍＭのキシロース、および１００μＬの１．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む５０ｍＭのリン酸バッファー（９００μＬ）に菌体抽出液を添加し、３０℃で反応させたときの３４０ｎｍの吸光度を連続的にモニターした。キシロース添加なしのものをブランクとし、ブランクと比較して吸光度の減少が大きい場合をペントースレダクターゼ活性ありと判断したところ、３株ともすべてペントースレダクターゼ活性を有することが確認できた。
　（参考例４）ペントールデヒドロゲナーゼ活性の測定
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株、ＷＯ２０１０／１４０６０２に記載のキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を、それぞれ５ｍＬのＹＰＸ培地（酵母エキス１％、バクトペプトン２％、キシロース２％）に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩振とう培養をおこなった（前培養）。翌日、５０ｍＬのＹＰＸ培地入りの５００ｍＬのひだ付三角フラスコに前培養液を植え継ぎ、３０℃で２４時間振とう培養を行った。回収した培養液を５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーにて２回洗浄した。５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーで菌体を再懸濁し、ビーズ式ホモジナイザー（ビーズφ０．５を０．６ｇ、４０００ｒｐｍ、１分間×５回）にて破砕した後、遠心分離によって上清を回収してこれを菌体抽出液とした。５０ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのキシリトールおよび１００μＬの１０ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー９００μＬに菌体抽出液を添加し、３５℃で反応させたときの３４０ｎｍの吸光度を連続的にモニターした。キシリトール添加なしのものをブランクとし、ブランクと比較して吸光度の増加が大きい場合をペントールデヒドロゲナーゼ活性ありと判断したところ、３株ともすべてペントールデヒドロゲナーゼ活性を有することが確認できた。
　（参考例５）ＫＬａ測定
　培養槽に溶存酸素電極（メトラートレド製）を挿入して各通気撹拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりＫＬａを求めた。まず、培養槽に水１．５Ｌを張り、水温を３０℃に調整しながら一定の速度で撹拌して窒素ガスを十分に水中に吹き込み、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行った。そののち通気ガスを窒素ガスから所定の通気速度の空気に切り替えてからの溶存酸素濃度の経時変化を測定してＫＬａを求めた。撹拌速度８００ｒｐｍ、温度３０℃で圧縮空気を通気したときに得られた各通気撹拌条件に対するＫＬａを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１の０．０１～０．６ｖｖｍにおいて、通気速度とＫＬａの関係をプロットし、式（５）の定数（ａ，ｂ）を算出したところ、（２８４，０．４９）であった。１．５ｖｖｍの値は、プロットの直線関係から外れたため、定数の算出においては除いて計算した。
　（比較例１）六炭糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造
　微生物として、キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、培地としてはＹＰＤ培地（酵母エキス１％、バクトペプトン２％、グルコース７％）を用いた。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を５０ｍＬのＹＰＤ培地の入った５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに植菌し、一晩振とう培養した（前培養）。前培養液を、１．５ＬのＹＰＤ培地に植菌し、培養槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、培養槽の通気速度の調整、温度調整を行い、以下の条件で１６時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表３）。
培養槽容積：２Ｌ
培養槽有効容積：１．５Ｌ
温度調整：３０℃
培養槽通気速度：０．１ｖｖｍ圧縮空気
培養槽撹拌速度：８００ｒｐｍ
ｐＨ調整：なし
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（比較例２）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造
　培地として表２に示す組成のＹＰＤＸ培地を用いて、比較例１と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（比較例３）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続発酵によるエタノールの製造
　培地として表２に示す組成のＹＰＤＸ培地を用いた分離膜を利用しない連続発酵を行った。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を５０ｍＬのＹＰＤ培地の入った５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに植菌し、一晩振とう培養した（前々培養）。１．５ＬのＹＰＤＸ培地の入った連続発酵装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置より分離膜エレメントを除いたもの）に前々培養液を植菌し、培養槽の撹拌速度、通気速度、温度を比較例１と同じ条件に調整して、１６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続発酵を開始し、３６０時間の連続発酵によりエタノールを製造した。培地の供給と微生物を含む培養液の引き抜きにはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いて、培養槽内に直接培地供給を行い、培養槽内から直接微生物を含む培養液の引き抜きを行った。微生物を含む培養液の引き抜き速度を０．０５Ｌ／ｈｒに設定し、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ運転した（表３）。
　（実施例１）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造１
　培地として表２に示す組成のＹＰＤＸ培地を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液をＹＰＤ培地５０ｍＬの入った５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに植菌し、一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．５ＬのＹＰＤＸ培地の入った膜一体型の以下の条件を具備した連続発酵装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、培養槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、培養槽の通気速度の調整、温度調整を行い、３６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続発酵を開始し、エタノールの製造を行った。培地供給と培養液の濾過にはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いた。培地供給は培養槽内に直接行い、培養液の濾過は分離膜を固定したエレメントを通した濾液の引き抜きとして行った。培養液濾過速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ、濾過時の膜間差圧は０．１～２０．０ｋＰａの範囲を推移させることで、３７０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表３）。
培養槽容積：２Ｌ
培養槽有効容積：１．５Ｌ
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
分離膜の純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／Ｐａ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
分離膜の表面粗さ：０．０６μｍ
温度調整：３０℃
培養槽通気速度：０．０１ｖｖｍ圧縮空気
培養槽撹拌速度：８００ｒｐｍ
ｐＨ調整：なし
培養液濾過速度：０．０５Ｌ／ｈｒ
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例２）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造２
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。培養槽通気速度を０．１ｖｖｍ圧縮空気とする以外は実施例１と同様の条件で行い、３６９時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表３）。
　（実施例３）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造３
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。培養槽通気速度を１．５ｖｖｍ圧縮空気とする以外は実施例１と同様の条件で行い、３７０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（比較例４）六炭糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスのバッチ培養によるエタノールの製造
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、比較例１と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表４）。
　（比較例５）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスのバッチ培養によるエタノールの製造
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、比較例２と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表４）。
　（比較例６）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの連続発酵によるエタノールの製造
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、混合糖原料にて分離膜を利用しない連続発酵を行った。前培養時間を４０時間とする以外は比較例３と同様の条件で行い、３６８時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
　（実施例４）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造１
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を４８時間とし、膜間差圧を０．１～１９．８ｋＰａとした以外は実施例１と同様の条件で行い、３７０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
　（実施例５）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造２
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を４０時間とし、膜間差圧を０．１～１９．８ｋＰａとした以外は実施例２と同様の条件で行い、３６９時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
　（実施例６）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造３
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を３６時間とし、膜間差圧を０．１～１９．８ｋＰａとした以外は実施例３と同様の条件で行い、３７０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（比較例７）六炭糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスのバッチ培養によるＤ－乳酸の製造
　微生物として、ＷＯ２０１０／１４０６０２に開示された方法によって作製したキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用いた。ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は、比較例１と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、Ｄ－乳酸を製造した（表５）。
　（比較例８）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスのバッチ培養によるＤ－乳酸の製造
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は、比較例２と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、Ｄ－乳酸を製造した（表５）。
　（比較例９）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの連続発酵によるＤ－乳酸の製造
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用しない連続発酵を行った。前培養を４０時間とし、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は比較例３と同様の条件で行い、３６８時間の連続発酵によりＤ－乳酸を製造した（表５）。
　（実施例７）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの分離膜を利用した連続発酵によるＤ－乳酸の製造１
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を５０時間とし、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は実施例１と同様の条件で行い、３７０時間の連続発酵によりＤ－乳酸を製造した（表５）。
　（実施例８）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの分離膜を利用した連続発酵によるＤ－乳酸の製造２
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を４０時間とし、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は実施例１と同様の条件で行い、３６９時間の連続発酵によりＤ－乳酸を製造した（表５）。
　（実施例９）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの分離膜を利用した連続発酵によるＤ－乳酸の製造３
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を３０時間とし、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は実施例１と同様の条件で行い、３７０時間の連続発酵によりＤ－乳酸を製造した（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（比較例１０）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ発酵によるエタノールの製造２
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、バッチ発酵を行った。発酵培地はＹＰＤＸ培地を用いたが、表２に示す組成から糖濃度を変更し、グルコース１％、キシロース９％で調製した。他運転条件等は比較例２と同様に行い、４２時間のバッチ発酵によりエタノールを製造した（表６）。
　（比較例１１）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続発酵によるエタノールの製造２
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、分離膜を利用しない連続発酵を行った。発酵培地はＹＰＤＸ培地を用いたが、表２に示す組成から糖濃度を変更し、グルコース１％、キシロース９％で調製した。他運転条件等は比較例３と同様に行い、４００時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表６）。
　（実施例１０）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造４
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。発酵培地はＹＰＤＸ培地を用いたが、表２に示す組成から糖濃度を変更し、グルコース１％、キシロース９％で調製した。他運転条件等は実施例１と同様に行い、４２０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表６）。
　（実施例１１）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのセラミック製分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造５
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、セラミック製分離膜を利用した連続発酵を行った。発酵培地はＹＰＤＸ培地を用いたが、表２に示す組成から糖濃度を変更し、グルコース１％、キシロース９％で調製した。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液をＹＰＤ培地５０ｍＬの入った５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに植菌し、一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．５ＬのＹＰＤＸ培地の入った膜分離型の連続発酵装置（ＷＯ２０１２／０８６７６３の図１２に示す装置）に植菌し、培養槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、培養槽の通気速度の調整、温度調整を行い、３６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続発酵を開始した。濾過時の膜間差圧は５００ｋＰａ以下となるよう調整しながら、４００時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表６）。
培養槽容積：２Ｌ
培養槽有効容積：１．５Ｌ
使用分離膜：Ｃｅｌｆｉｔ精密ろ過膜　モノリス　φ４－１９（日本ガイシ）
膜分離エレメント長さ：５００ｍｍ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
温度調整：３０℃
培養槽通気速度：０．０１ｖｖｍ圧縮空気
培養槽撹拌速度：８００ｒｐｍ
ｐＨ調整：なし。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（比較例１２）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造３
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、バッチ発酵を行った。発酵原料には、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に開示されたナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を利用し、適宜試薬により発酵培地の組成を表７に示すとおり調製した。他運転条件等は比較例３と同様に行い、７２時間のバッチ発酵によりエタノールを製造した（表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（比較例１３）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続発酵によるエタノールの製造３
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、分離膜を利用しない連続発酵を行った。発酵培地は、比較例１２と同様に表７記載の培地を用いた。他運転条件等は比較例３と同様に行い、４００時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表８）。
　（実施例１２）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造６
キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。発酵培地は、比較例１２と同様に表７記載の培地を用いた。他運転条件等は実施例１と同様に行い、４５６時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　以上の結果から、五炭糖と六炭糖の混合糖から化学品を高収率で製造できた。
　本発明によって、五炭糖および六炭糖を含む発酵原料を用いた種々の化学品の発酵生産の効率を大幅に向上させることができる。

Claims (7)

  1. 　微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記発酵原料が五炭糖および六炭糖を含み、前記微生物がペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物である、化学品の製造方法。
  2. 　酸素移動容量係数（ＫＬａ）が５～３００ｈ－１の条件で連続発酵を行う、請求項１記載の化学品の製造方法。
  3. 　前記発酵原料中に含まれる五炭糖と六炭糖の比率が１：９～９：１である、請求項１または２記載の化学品の製造方法。
  4. 　前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、請求項１または２記載の化学品の製造方法。
  5. 　五炭糖がキシロースである、請求項１～４のいずれか記載の化学品の製造方法。
  6. 　ペントースレダクターゼがキシロースレダクターゼである、請求項１～５のいずれか記載の化学品の製造方法。
  7. 　ペントールデヒドロゲナーゼがキシリトールデヒドロゲナーゼである、請求項１～６のいずれか記載の化学品の製造方法。
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