WO2013105653A1 - 化学品の製造方法 - Google Patents

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fermentation
culture
pentose
separation membrane
membrane
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PCT/JP2013/050438
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志緒美 渡邊
小林　宏治
健司 澤井
景洙 羅
紳吾 平松
山田　勝成
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Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chemical product by continuous fermentation using a fermentation raw material containing hexose and pentose.
  • Biomass-derived chemicals such as biodegradable polymer raw materials such as lactic acid and biofuels such as ethanol have become sustainable (sustainable) as well as carbon dioxide emissions into the atmosphere and the emergence of energy problems. It is attracting a great deal of attention as a life cycle assessment (LCA) compatible product.
  • LCA life cycle assessment
  • As a method for producing these biodegradable polymer materials and biofuels glucose, which is a hexose refined from edible biomass such as corn, is generally used as a fermentation material for microorganisms, and is obtained as a fermentation product. If edible biomass is used, the price will rise due to competition with food, and there is a risk that other raw materials cannot be procured. Therefore, attempts have been made to use sugar derived from non-edible biomass such as rice straw as a fermentation raw material for microorganisms (see Patent Document 1).
  • sugars derived from non-edible biomass are used as fermentation raw materials
  • cellulose, hemicellulose, etc. contained in non-edible biomass are decomposed into sugars by saccharifying enzymes.
  • saccharifying enzymes not only hexose sugars such as glucose are decomposed.
  • Pentoses such as xylose can be obtained at the same time.
  • sugars derived from non-edible biomass are used as fermentation raw materials for microorganisms, mixed sugars of hexose and pentose sugars are used as fermentation raw materials (patents) Reference 1).
  • Continuous fermentation can be adopted as a fermentation method using sugar derived from non-edible biomass, which is a mixed sugar of hexose sugar and pentose sugar, as a fermentation raw material for microorganisms. It has not been confirmed (see Patent Document 2). On the other hand, when a microorganism having a pentose isomerase is continuously fermented using a mixed sugar of hexose and pentose as a fermentation raw material, it is also known that the fermentation yield is lower than batch fermentation (non-patent) Reference 2).
  • the present invention has an object to improve the fermentation yield when continuously fermenting a mixed sugar of hexose and pentose as a fermentation raw material for a microorganism having a pathway for metabolizing pentose isomerase using pentose isomerase. It is.
  • the present inventor has produced a chemical product that is continuously fermented as a fermentation raw material for microorganisms having a pathway for metabolizing pentose isomerase using a mixed sugar of hexose and pentose using pentose isomerase.
  • the said subject was solved by performing continuous fermentation using a separation membrane, and came to this invention.
  • the present invention is as follows (1) to (6).
  • (1) Filtering the microorganism culture solution with a separation membrane, holding or refluxing the unfiltered solution in the culture solution, adding fermentation raw materials to the culture solution, and recovering the product in the filtrate
  • a method for producing a chemical by continuous fermentation wherein the fermentation raw material contains pentose and hexose, and the microorganism has a pathway for metabolizing pentose using pentose isomerase.
  • Method (2) The method for producing a chemical product according to (1), wherein continuous fermentation is performed under a condition where the oxygen transfer capacity coefficient (Kla) is 150 h ⁇ 1 or less.
  • Kla oxygen transfer capacity coefficient
  • a mixed sugar of hexose and pentose is used as a fermentation raw material for a microorganism having a pathway for metabolizing pentose isomerase using pentose isomerase, a chemical product is obtained in high yield. be able to.
  • the present invention relates to a method for producing a chemical product in which a microorganism is cultured with a fermentation raw material to produce a chemical product by fermentation.
  • the culture solution is filtered through a separation membrane, and the unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution.
  • the pentose has five carbons constituting the sugar, and is also called pentose.
  • aldopentose include xylose, arabinose, ribose, and lyxose.
  • ketopentose include ribulose and xylulose.
  • the pentose used in the present invention may be any pentose as long as it can assimilate microorganisms, but is preferably xylose or arabinose, more preferably from the viewpoint of the natural ratio or availability. Is xylose.
  • the hexose has 6 carbons constituting the sugar, and is also called hexose.
  • aldose include glucose, mannose, galactose, allose, growth, and talose.
  • ketose include fructose, psicose, and sorbose.
  • the hexose used in the present invention may be any as long as it can assimilate microorganisms, but from the viewpoint of the natural ratio, availability, etc., preferably glucose, mannose, galactose, More preferred is glucose.
  • the mixed sugar used in the present invention is not particularly limited, but a cellulose-containing biomass-derived sugar solution known to contain both hexose and pentose is preferably used.
  • the cellulose-containing biomass include plant biomass such as bagasse, switchgrass, corn stover, rice straw, and straw, and woody biomass such as trees and waste building materials.
  • Cellulose-containing biomass contains cellulose or hemicellulose, which is a polysaccharide obtained by dehydrating and condensing sugar, and a sugar solution that can be used as a fermentation raw material is produced by hydrolyzing such a polysaccharide. Any method may be used for preparing the cellulose-containing biomass-derived sugar solution.
  • a method for producing a sugar solution by acid hydrolysis of biomass using concentrated sulfuric acid discloses a method for producing a sugar solution by hydrolyzing biomass with dilute sulfuric acid and further treating with an enzyme such as cellulase (A).
  • Aden et al. “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Optimized Co-Current Dirty Acid Prehydrology and Enzymatic Physiology Hydrology. ver "NREL Technical Report (2002)).
  • a method not using an acid a method of hydrolyzing biomass using subcritical water at about 250 to 500 ° C.
  • the weight ratio of the pentose and hexose contained in the mixed sugar is not particularly limited, but the weight ratio of the pentose and hexose in the mixed sugar is expressed as (pentose): (hexose). And 1: 9 to 9: 1 are preferred. This is a sugar ratio when a cellulose-containing biomass-derived sugar solution is assumed as a mixed sugar.
  • the total sugar concentration contained in the fermentation raw material used in the present invention is not particularly limited and is preferably as high as possible as long as it does not inhibit the production of microbial chemicals.
  • the concentration of the carbon source in the medium is preferably 15 to 500 g / l, more preferably 20 to 300 g / l.
  • the total sugar concentration is 15 g / l or less, the effect of improving the yield from pentose may be reduced.
  • the total sugar concentration is low, the production efficiency of chemicals also decreases.
  • the concentration of hexose contained in the fermentation raw material used in the present invention is not particularly limited in the range of the total sugar concentration and the ratio of pentose and hexose, but if the method for producing a chemical product of the present invention is used. A good yield can be obtained even in a mixed sugar solution containing hexose at a concentration of 5 g / L or more.
  • the fermentation raw material used in the present invention is preferably a normal liquid medium appropriately containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins.
  • nitrogen source used in the present invention examples include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other auxiliary organic nitrogen sources such as oil cakes, soybean hydrolysate, casein decomposition products, and others.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added and used.
  • the nutrient is added as a preparation or a natural product containing it.
  • An antifoaming agent is also used as necessary.
  • the culture solution refers to a solution obtained as a result of the growth of microorganisms on the fermentation raw material. You may change suitably the composition of the fermentation raw material to add from the fermentation raw material composition at the time of a culture
  • microorganisms that can be used in the present invention for the chemical production method will be described.
  • the present invention is characterized by using a microorganism having a pathway for metabolizing pentose using pentose isomerase.
  • Pentose isomerase is defined as an enzyme that catalyzes the isomerization of aldopentose and ketopentose, which are structural isomers of pentose.
  • the pentose isomerase used in the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of catalyzing the direct isomerization of pentose. For example, xylose isomerase (EC 5.3.1.5) and arabinose isomerase (EC 5. 3.1.3).
  • xylose isomerase is an enzyme that catalyzes the direct isomerization of D-xylose (aldopentose) to D-xylulose (ketopentose) and / or vice versa, and is also known as D-xylose ketoisomerase.
  • Direct isomerization refers to isomerization in one step catalyzed by pentose isomerase, as opposed to two-step conversion via sugar alcohol intermediates catalyzed by pentose reductase and pentol dehydrogenase.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having a pathway for metabolizing pentose isomerase using pentose isomerase.
  • a microorganism originally having pentose isomerase may be used, and a pentose isomerase may be used as a suitable host.
  • the microorganisms used may be those isolated from the natural environment, or those whose properties are partially modified by mutation or gene recombination.
  • microorganisms having a pathway for metabolizing pentose isomerase using pentose isomerase include, for example, the genus Clostridium, the genus Enterobacter, the genus Escherichia, the genus Klebsiella, and the genus Bacteroides.
  • Intestinal bacteria such as Erwinia, Lactobacillus such as Lactobacillus, Actinoplanes, Arthrobacter, Streptomyces Actinomycetes, fungi such as Pyromyces and Cylamyces Or Bacillus, Paenibacillus, Aerobacter, Ampullariella, Staphylococcus, Thermoanaerobacter More specifically, microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Paenibacillus, and more specifically, Escherichia coli, Bacillus coagulans, Paenibacilis polymyxa (Paenibacils) polymyxa) can be used. That.
  • the pentose isomerase activity can be confirmed by performing an enzymatic reaction in the presence of pentose and measuring isomerized pentol using HPLC or the like.
  • the xylose isomerase activity can be measured by the method disclosed in JP2008-79564. A similar method can be adopted for arabinose isomerase.
  • Examples of microorganisms in which a pentose isomerase gene is introduced into an appropriate host to cause the pentose isomerase to function include examples disclosed in JP-T-2006-525029.
  • the pentose isomerase gene to be introduced is not particularly limited and may be genomic DNA, cDNA, or the like. Further, it may be derived from any organism such as animals, plants, fungi (yeasts, molds, etc.) and bacteria. Information on such genes can be easily obtained by searching a database published on the web such as NCBI.
  • the porous membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of separating and filtering a culture solution obtained by culturing using a microbial stirring type incubator or a stirring type bioreactor from microorganisms.
  • Ceramic ceramic membranes, porous glass membranes, porous organic polymer membranes, metal fiber woven fabrics, nonwoven fabrics, and the like can be used. Among these, a porous organic polymer film or a ceramic film is particularly preferable.
  • the configuration of a porous membrane used as a separation membrane in the present invention will be described.
  • the porous membrane used in the present invention preferably has separation performance and water permeability according to the quality of water to be treated and the application.
  • the porous membrane is preferably a porous membrane including a porous resin layer from the viewpoint of blocking performance, water permeability performance and separation performance, for example, stain resistance.
  • the porous membrane including the porous resin layer preferably has a porous resin layer that acts as a separation functional layer on the surface of the porous substrate.
  • the porous substrate supports the porous resin layer and gives strength to the separation membrane.
  • the porous substrate used in the present invention has a porous resin layer on the surface of the porous substrate, the porous substrate is porous even if the porous resin layer penetrates the porous substrate. It does not matter if the porous resin layer does not penetrate, and it is selected according to the application.
  • the average thickness of the porous substrate is preferably 50 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less.
  • the material of the porous substrate is made of an organic material and / or an inorganic material, and an organic fiber is preferably used.
  • the preferred porous substrate is a woven or non-woven fabric made of organic fibers such as cellulose fiber, cellulose triacetate fiber, polyester fiber, polypropylene fiber and polyethylene fiber. More preferably, the density control is relatively easy and the production is easy. Inexpensive nonwoven fabric is used.
  • An organic polymer film can be suitably used for the porous resin layer.
  • the material of the organic polymer film include polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyacrylonitrile resin, cellulose resin, and the like. Examples thereof include cellulose triacetate resins.
  • the organic polymer film may be a mixture of resins mainly composed of these resins.
  • the main component means that the component is contained in an amount of 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more.
  • the organic polymer film is made of a polyvinyl chloride resin, a polyvinylidene fluoride resin, a polysulfone resin, a polyethersulfone resin, which is easy to form a film with a solution and has excellent physical durability and chemical resistance.
  • Polyacrylonitrile-based resins are preferable, and polyvinylidene fluoride-based resins or resins containing them as the main components are most preferably used.
  • polyvinylidene fluoride-based resin a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used.
  • polyvinylidene fluoride resin a copolymer of a vinyl monomer copolymerizable with vinylidene fluoride is also preferably used.
  • vinyl monomers copolymerizable with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and ethylene trichloride fluoride.
  • the porous membrane used as a separation membrane in the present invention is not particularly limited, and may be any microorganism as long as it does not pass through microorganisms used for fermentation. It is desirable that the clogging is less likely to occur and the filtration performance is within a range that continues stably for a long period of time. Therefore, the average pore diameter of the porous separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and less than 5 ⁇ m. More preferably, when the average pore diameter of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, it is possible to achieve both a high exclusion rate at which microorganisms do not leak and a high water permeability. Holding for a long time can be carried out with higher accuracy and reproducibility.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably less than 1 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably not too large compared to the size of the microorganism in order to prevent the occurrence of a problem that the microorganism leaks out, that is, the rejection rate decreases.
  • the average pore diameter is preferably 0.4 ⁇ m or less, and more preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • microorganisms produce substances other than chemicals that are desired products, for example, substances that easily aggregate, such as proteins and polysaccharides.
  • substances that easily aggregate such as proteins and polysaccharides.
  • a part of the microorganisms in the fermentation broth may die. Cell debris may be generated, and in order to avoid clogging of the porous membrane by these substances, the average pore diameter is more preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the average pore size of the porous membrane in the present invention is preferably 0.01 ⁇ m. It is above, More preferably, it is 0.02 micrometer or more, More preferably, it is 0.04 micrometer or more.
  • the average pore diameter can be obtained by measuring and averaging the diameters of all pores that can be observed within a range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m in a scanning electron microscope observation at a magnification of 10,000 times. it can.
  • the average pore diameter can be obtained by taking a photograph of the surface of the membrane at a magnification of 10,000 using a scanning electron microscope and randomly selecting 10 or more, preferably 20 or more pores. It can also be obtained by measuring and number average.
  • a circle having an area equal to the area of the pores (equivalent circle) can be obtained by an image processing apparatus or the like, and the equivalent circle diameter can be obtained by the method of setting the diameter of the pores.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter of the porous membrane used in the present invention is preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter is N as the number of pores that can be observed within the above-mentioned range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m, the measured diameter is X k, and the average pore diameter is X (ave ) And the following (Equation 1).
  • the permeability of the fermentation broth is one of the important performances.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane before use can be used as an index of the permeability of the porous membrane.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m when calculated by measuring the water permeability at a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane.
  • a pure water permeability coefficient is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / s / pa or more 6 ⁇ 10 ⁇ 7 m 3 / m 2 / s. If it is / pa or less, a practically sufficient amount of permeated water can be obtained.
  • the surface roughness is the average value of the height in the direction perpendicular to the surface.
  • the membrane surface roughness is one of the factors for facilitating separation of microorganisms adhering to the separation membrane surface by the membrane surface cleaning effect by the liquid flow by stirring or a circulation pump.
  • the surface roughness of the porous membrane is not particularly limited as long as it is within a range in which microorganisms attached to the membrane and other solid substances are peeled off, but is preferably 0.1 ⁇ m or less. When the surface roughness is 0.1 ⁇ m or less, microorganisms adhering to the film and other solid substances are easily peeled off.
  • the membrane surface roughness of the porous membrane is 0.1 ⁇ m or less, the average pore diameter is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, and the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / It has been found that by using a porous membrane of m 2 / s / pa or more, an operation that does not require excessive power required for membrane surface cleaning can be performed more easily.
  • the surface roughness of the porous membrane to 0.1 ⁇ m or less, in the filtration of microorganisms, the shearing force generated on the membrane surface can be reduced, the destruction of microorganisms is suppressed, and the porous membrane is clogged.
  • the surface roughness of the porous membrane is preferably as small as possible.
  • the film surface roughness of the porous film is measured under the following conditions using the following atomic force microscope (AFM).
  • FAM atomic force microscope
  • Device Atomic force microscope device (“Nanoscope IIIa” manufactured by Digital Instruments)
  • Condition probe SiN cantilever manufactured by Digital Instruments
  • Scan mode Contact mode in-air measurement
  • Underwater tapping mode underwater measurement
  • Scanning range 10 ⁇ m, 25 ⁇ m square (measurement in air) 5 ⁇ m
  • 10 ⁇ m square underwater measurement
  • Scanning resolution 512 ⁇ 512 -Sample preparation The membrane sample was immersed in ethanol at room temperature for 15 minutes, then immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried.
  • the RO water refers to water that has been filtered using a reverse osmosis membrane (RO membrane), which is a type of filtration membrane, to exclude impurities such as ions and salts.
  • RO membrane reverse osmosis membrane
  • the pore size of the RO membrane is approximately 2 nm or less.
  • the film surface roughness d rough is calculated by the following (Equation 2) from the height of each point in the Z-axis direction by the above-described atomic force microscope (AFM).
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a flat membrane.
  • the average thickness is selected according to the application.
  • the average thickness when the shape of the porous membrane is a flat membrane is preferably 20 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and more preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a hollow fiber membrane.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 200 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and the film thickness is preferably 20 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • a woven fabric or a knitted fabric in which organic fibers or inorganic fibers are formed in a cylindrical shape may be included in the hollow fiber.
  • the above-mentioned porous membrane can be manufactured by the manufacturing method described in WO2007 / 097260, for example.
  • the separation membrane in the present invention can be a membrane containing at least ceramics.
  • the ceramics in the present invention refers to those containing a metal oxide and baked and hardened by heat treatment at a high temperature.
  • the metal oxide include alumina, magnesia, titania, zirconia and the like.
  • the separation membrane may be formed of only a metal oxide, and may include silica, silicon carbide, mullite, cordierite, or the like, which is a compound of silica and a metal oxide.
  • Components other than the ceramics forming the separation membrane are not particularly limited as long as they can form a porous body as a separation membrane.
  • the shape is not particularly limited, and any of monolithic membrane, flat membrane, tubular membrane and the like can be used. From the viewpoint of filling efficiency into the container, a columnar structure and a structure having a through hole in the longitudinal direction is preferable. A monolith film is preferred from the viewpoint of increasing the filling efficiency.
  • the separation membrane When a separation membrane having a columnar structure is housed in a module container and used as a separation membrane module, the separation membrane can be modularized and filtered by selecting a suitable mode from an external pressure type and an internal pressure type.
  • the side where the separation membrane is in contact with the fermentation broth is referred to as the primary side
  • the side where the filtrate containing the chemical product is obtained by filtration is referred to as the secondary side.
  • the output of the circulation pump can be saved when cross-flow filtration is performed because the flow path on the primary side is narrow. Furthermore, the action of discharging turbidity deposited on the surface of the separation membrane to the outside of the module becomes stronger, which is preferable because the surface of the separation membrane is easily kept clean.
  • the internal pressure type separation membrane has an inlet and an outlet for the fermentation broth. In this case, it is preferable that the inlet and the outlet are in a state of through holes arranged in a straight line, since the liquid flow resistance becomes small. Further, since the separation membrane has a columnar structure and the through-holes are vacant in the longitudinal direction, the container for accommodating the separation membrane can be made thinner. When the separation membrane module is thin, it can be preferably used from the viewpoint of production and handling.
  • the porosity of the separation membrane is not particularly limited, but if it is too low, the filtration efficiency will deteriorate, and if it is too high, the strength will decrease. In order to achieve both the filtration efficiency and the strength of the separation membrane and to have resistance to repeated steam sterilization, it is preferably 20% or more and 60% or less.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less. If the membrane has an average pore diameter in this range, the separation membrane is less likely to block and the filtration efficiency is excellent. In addition, if the average pore size is in the range of 0.02 ⁇ m or more and 0.2 ⁇ m or less, fermentation by-products by microorganisms and cultured cells exemplified by proteins and polysaccharides, and microorganisms / cultured cells in the culture solution This is particularly preferable because clogging of a substance that easily clogs the separation membrane, such as a crushed cell produced by death, is less likely to occur.
  • the separation membrane having a columnar structure having a through hole has a secondary surface on the secondary side, it is preferable to provide a module container for collecting filtrate and use the module as a module in which the separation container is filled.
  • One or more separation membranes are filled in one module.
  • the module container is preferably made of a material that can withstand repeated steam sterilization.
  • Examples of the steam sterilization treatment include stainless steel and ceramics having a low average porosity.
  • Such a ceramic membrane module can be manufactured by, for example, a manufacturing method described in WO2012 / 086763, but a commercially available one can also be used. Specific examples of commercially available products include MEMBLAROX microfiltration membranes (Pall), ceramic membrane filter cefilt MF membranes (NGK), and the like.
  • the culture solution of microorganisms is filtered through a separation membrane, the unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution, and the fermentation raw material is added to the culture solution to recover the product from the filtrate. It is characterized by fermentation.
  • the culture of microorganisms may be carried out at a pH and temperature suitable for the microorganism to be used, and is not particularly limited as long as the microorganisms are grown. However, the cultivation is usually performed at a pH of 4 to 8 and a temperature of 20 to 75 ° C. Is called.
  • the pH of the culture solution is usually adjusted to a predetermined value within a pH range of 4 to 8 with an inorganic or organic acid, an alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, or the like.
  • the nutrients necessary for cell growth may be added to the medium so that the cell growth is continuously performed.
  • the concentration of microorganisms in the culture solution may be a concentration that is preferable for efficiently producing a chemical product. For example, good production efficiency can be obtained by maintaining the concentration of microorganisms in the culture solution as a dry weight of 5 g / L or more.
  • the oxygen condition for culture in the present invention is preferably such that the oxygen transfer capacity coefficient Kla (h ⁇ 1 ) (hereinafter simply referred to as Kla) is 150 h ⁇ 1 or less.
  • C dissolved oxygen concentration DO (ppm) in the culture solution
  • C * dissolved oxygen concentration DO (ppm) in equilibrium with the gas phase when oxygen is not consumed by microorganisms
  • Kla is a numerical value measured by a gas replacement method (dynamic method).
  • gas displacement method dynamic method
  • water or a medium to be used is placed in an aeration and agitation culture apparatus with a dissolved oxygen concentration electrode inserted, and oxygen in these liquids is replaced with nitrogen gas to lower the oxygen concentration of the liquid.
  • the nitrogen gas is switched to compressed air, and Kla is calculated by measuring the rising process of dissolved oxygen under a predetermined aeration rate, stirring rate, and temperature.
  • Kla can be appropriately set by combining aeration conditions and agitation conditions for aeration and agitation culture.
  • aeration may or may not be performed, and the gas to be aerated can be changed depending on the culture conditions.
  • a method such as sealing the container to make it non-vented, venting an inert gas such as nitrogen gas, or venting an inert gas containing carbon dioxide gas. it can.
  • a method such as adding oxygen to air to keep the oxygen concentration at 21% or more, or pressurizing the culture solution can be used.
  • V Ventilation rate (vvm), a, b: constants.
  • a microorganism having a pathway for metabolizing pentose isomerase using pentose isomerase that can be used in the present invention does not require a coenzyme such as NADH in the isomerization reaction from pentose sugar to pentol.
  • Sugar metabolism is not affected by oxygen conditions. Therefore, even under anaerobic conditions that do not use oxygen, chemicals can be produced without stagnation of pentose metabolism.
  • Kla employed in the fermentation culture of the present invention is not particularly limited, specifically, it is preferable that Kla is 150h -1 or less, more preferably 100h -1 or less, more preferably 60h -1 or less, most Preferably it is 30 h ⁇ 1 or less.
  • the transmembrane pressure difference during filtration is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered.
  • the organic polymer membrane is filtered at a transmembrane pressure higher than 150 kPa in order to filter the fermentation broth, the structure of the organic polymer membrane is likely to be destroyed and a chemical product is produced. Capability may be reduced.
  • the transmembrane pressure is lower than 0.1 kPa, the permeated water amount of the fermentation broth may not be obtained sufficiently, and the productivity when producing a chemical product tends to decrease.
  • the permeated water amount of the fermentation broth is increased by setting the transmembrane differential pressure, which is the filtration pressure, preferably in the range of 0.1 kPa to 150 kPa. Further, since there is no decrease in chemical production capacity due to destruction of the film structure, it is possible to maintain a high ability to produce chemical products.
  • the transmembrane pressure is preferably in the range of 0.1 kPa to 50 kPa, more preferably in the range of 0.1 kPa to 20 kPa, in the organic polymer film.
  • the transmembrane pressure difference during filtration is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered, but is preferably 500 kPa or less.
  • the operation is performed at 500 kPa or more, clogging of the membrane occurs, which may cause a problem in the continuous fermentation operation.
  • a transmembrane differential pressure can be generated in the separation membrane by a siphon using a liquid level difference (water head difference) of the fermented liquid and the porous membrane treated water or a cross flow circulation pump.
  • a suction pump may be installed on the secondary side of the separation membrane as a driving force for filtration.
  • the transmembrane pressure difference can be controlled by the suction pressure.
  • the transmembrane pressure difference can be controlled also by the pressure of the gas or liquid that introduces the pressure on the fermentation broth side.
  • batch culture or fed-batch culture is performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration, and then continuous culture (filtration of the culture solution) may be started.
  • continuous culture filtration of the culture solution
  • a high concentration of bacterial cells may be seeded and continuous culture may be performed at the start of culture.
  • the sugar concentration in the total filtrate in continuous fermentation is desirably 5 g / L or less from the viewpoint of productivity.
  • the sugar concentration in the filtrate can be adjusted by the supply rate of the medium, the filtration rate of the culture medium, or the sugar concentration in the medium.
  • microorganisms in the culture tank are obtained by removing a part of the culture solution containing the microorganisms from the fermenter and diluting with a medium as necessary during the continuous fermentation.
  • the density may be adjusted. For example, if the concentration of microorganisms in the fermenter becomes too high, the separation membrane is likely to be clogged. Therefore, by removing a part of the culture solution containing microorganisms and diluting with a culture medium, clogging of the separation membrane can be achieved. It can be easily avoided.
  • the production performance of chemicals may change depending on the concentration of microorganisms in the fermenter, and the production performance can be maintained by extracting microorganisms using the production performance as an index.
  • the continuous culture apparatus used in the present invention filters the fermentation broth of microorganisms through a separation membrane, collects the product from the filtrate, holds or refluxs the unfiltrated liquid in the fermentation broth, and supplies the fermentation raw material.
  • a separation membrane collects the product from the filtrate in addition to the fermentation broth, but when using an organic polymer membrane, a specific example is given.
  • the apparatus described in WO2007 / 097260 can be used.
  • the apparatus described in WO2012 / 086763 can be used.
  • the chemical product produced by the present invention is not limited as long as it is a substance produced by the microorganism in the fermentation broth, and includes substances that are mass-produced in the fermentation industry, such as alcohols, organic acids, amino acids, and nucleic acids. Can do.
  • alcohol organic substances such as ethanol, 1,3-propanediol, 1,3-butanediol, 2,3-butanediol 1,4-butanediol, glycerol, butanol, isobutanol, 2-butanol, isopropanol, etc.
  • acids include acetic acid, lactic acid, adipic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, citric acid, and nucleic acids, nucleosides such as inosine and guanosine, nucleotides such as inosinic acid and guanylic acid, and cataverine Among them, organic acids and alcohols are preferable, and lactic acid, ethanol, and 2,3-butanediol are more preferable.
  • the present invention can also be applied to the production of substances such as enzymes, antibiotics, and recombinant proteins. These chemicals can be recovered from the filtrate by known methods (membrane separation, concentration, distillation, crystallization, extraction, etc.).
  • Escherichia coli KO11 strain was planted in 5 mL of a preculture medium (glucose 20 g / L yeast extract 10 g / L, tryptone 5 g / L, NaCl 5 g / L) with platinum ears. The cells were cultured and cultured overnight at 30 ° C. (preculture). On the next day, the preculture was inoculated into a 500 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of ethanol fermentation medium (mixed sugar) shown in Table 2, and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The collected culture was washed twice with 200 mM maleate buffer (pH 5.5).
  • a preculture medium glucose 20 g / L yeast extract 10 g / L, tryptone 5 g / L, NaCl 5 g / L
  • the cells were cultured and cultured overnight at 30 ° C. (preculture). On the next day, the preculture was inoculated into a 500 mL
  • the cells were resuspended with 200 mM maleate buffer (pH 5.5), disrupted with a bead-type homogenizer (bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times), and then centrifuged to obtain a supernatant.
  • 100 ⁇ L of the cell extract was added to 900 ⁇ L of 200 mM maleic acid buffer (pH 5.5) containing 20 mM MgSO 4 , 1 mM CoCl 2 , 1 mM MnCl 2 , 10 mM xylose, and reacted at 35 ° C. for 2 hours.
  • the xylose peak decreased and the xylulose peak increased compared to before the reaction, and the xylose isomerase activity could be confirmed.
  • Escherichia coli KO11 strain was cultured in a test tube with 2 mL of preculture medium (glucose 20 g / L yeast extract 10 g / L, tryptone 5 g). / L, NaCl 5 g / L) at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (preculture).
  • the preculture was inoculated into 1 L of an ethanol fermentation medium (glucose) having the composition shown in Table 3, and batch fermentation was performed for 16 hours under the following operating conditions while adjusting temperature and pH to produce ethanol (Table 4).
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Sterilization: All fermenters and culture media are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Comparative Example 2 Production of Ethanol by Batch Fermentation of Escherichia coli Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material
  • An ethanol fermentation medium (mixed sugar) having the composition shown in Table 2 was used as a medium under the same conditions as in Comparative Example 1. Time batch fermentation was performed to produce ethanol (Table 4).
  • Pre-culture medium was inoculated into a continuous culture device (excluding the separation membrane element from the device shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260) containing an ethanol fermentation medium (mixed sugar) having the composition shown in Table 2 to adjust the temperature. And while adjusting the pH, batch fermentation was performed for 33 hours under the following operating conditions (pre-culture). Immediately after completion of the preculture, continuous culture was started to produce ethanol. To supply the ethanol fermentation medium (mixed sugar) with the composition shown in Table 2 and to extract the culture solution containing microorganisms, use Perista Biominipump AC-2120 (ATTO) and supply the medium directly into the culture tank. The culture solution containing microorganisms was directly extracted from the culture tank.
  • a continuous culture device excluding the separation membrane element from the device shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260
  • ethanol fermentation medium mixed sugar having the composition shown in Table 2
  • batch fermentation was performed for 33 hours under the following operating conditions (pre-culture).
  • continuous culture was started to
  • Ethanol production was carried out for 300 hours while controlling the medium supply rate so that the extraction rate of the culture solution containing microorganisms was constant and the amount of the culture solution in the culture tank was 1.5 L (Table 4).
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 2 L / day Sterilization: All fermenters and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 1 Production 1 of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Escherichia coli using mixed sugar as a fermentation raw material 1 Continuous fermentation using a separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material was performed.
  • Escherichia coli KO11 strain was cultured overnight at 30 ° C. in 2 mL of a preculture medium (glucose 20 g / L yeast extract 10 g / L, tryptone 5 g / L, NaCl 5 g / L) in a test tube.
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (pre-culture).
  • the culture broth was inoculated in a continuous fermentation apparatus (the apparatus shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260) having the following conditions with a membrane-integrated medium containing an ethanol fermentation medium (mixed sugar) having the composition shown in Table 2. While performing temperature adjustment and pH adjustment, batch fermentation was performed for 24 hours under the following operating conditions (pre-culture). Immediately after completion of the preculture, continuous culture was started to produce ethanol. Perista Biominipump AC-2120 (ATTO) was used for supplying the ethanol fermentation medium (mixed sugar) having the composition shown in Table 2 and filtering the culture solution. The medium was supplied directly into the culture tank, and the culture solution was filtered through an element having a separation membrane fixed thereto.
  • a membrane-integrated medium containing an ethanol fermentation medium (mixed sugar) having the composition shown in Table 2.
  • the transmembrane pressure difference during filtration ranges from 0.1 to 19.8 kPa.
  • the ethanol was produced by continuous fermentation for 290 hours (Table 4).
  • Fermenter capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane separation element Effective filtration area: 120 cm 2 Pure water permeability coefficient of separation membrane: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / Pa Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore diameter: ⁇ 0.035 ⁇ m Separation membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 2 L / day Sterilization: All fermenters and separation media including separation membrane elements are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 2 Production 2 of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Escherichia coli using mixed sugar as a fermentation raw material 2 Continuous fermentation using a separation membrane using Escherichia coli KO11 strain was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 300 hours under the same conditions as in Example 1 except that Kla was 0 (Table 4).
  • Example 3 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Escherichia coli using mixed sugar as a fermentation raw material 3 Continuous fermentation using a separation membrane using Escherichia coli KO11 strain was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 280 hours under the same conditions as in Example 1 except that Kla was 60 (Table 4).
  • Example 4 Ethanol Production by Continuous Fermentation Using Escherichia coli Separation Membrane Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material 4 Continuous fermentation using a separation membrane using Escherichia coli KO11 strain was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 290 hours under the same conditions as in Example 1 except that Kla was set to 100 (Table 4).
  • Example 5 Production of ethanol by continuous fermentation using Escherichia coli separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material 5 Continuous fermentation using a separation membrane using Escherichia coli KO11 strain was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 270 hours under the same conditions as in Example 1 except that Kla was 150 (Table 4).
  • the collected culture was washed twice with 200 mM maleate buffer (pH 5.5).
  • the cells were resuspended with 200 mM maleate buffer (pH 5.5), disrupted with a bead-type homogenizer (bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times), and then centrifuged to obtain a supernatant.
  • a bead-type homogenizer bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times
  • the preculture is inoculated into 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium (glucose) having the composition shown in Table 6, and batch fermentation is performed for 27 hours under the following operating conditions while adjusting the temperature and pH. , 3-butanediol was prepared (Table 8).
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: Adjusted to pH 6.5 with 5N Ca (OH) 2 Sterilization: All fermenters and medium used are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • the culture medium was directly supplied to the culture medium, and the culture solution containing the microorganisms was directly extracted from the culture tank. Production of 2,3-butanediol was carried out for 280 hours while controlling the medium supply rate so that the culture solution drawing speed including microorganisms was kept constant and the amount of the culture solution in the culture tank was 1.5 L (Table 8).
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6.5 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 1 L / day Sterilization: All fermenters and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 6 Production of 2,3-butanediol by continuous fermentation using a separation membrane of Paenibacillus polymixa using mixed sugar as a fermentation raw material 1 Continuous fermentation using a separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material was performed.
  • Paenibacillus polymyxa ATCC12321 strain was cultured overnight at 30 ° C. in a 2 mL preculture medium (glucose 5 g / L, peptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L) in a test tube. culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated in a continuous culture apparatus (the apparatus shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260) containing 2,3-butanediol fermentation medium 1 (mixed sugar) having the composition shown in Table 5 to adjust the temperature and pH. While adjusting, batch fermentation was performed for 30 hours under the following operating conditions (pre-culture). Immediately after completion of the preculture, continuous culture was started to produce 2,3-butanediol.
  • Perista Biominipump AC-2120 was used for supplying 2,3-butanediol fermentation medium 2 (mixed sugar) having the composition shown in Table 7 and filtering the culture solution.
  • the medium was supplied directly into the culture tank, and the culture solution was filtered through an element having a separation membrane fixed thereto. While controlling the culture medium supply rate so that the culture fluid filtration rate is constant and the culture fluid volume in the culture tank is 1.5 L, the transmembrane pressure difference during filtration ranges from 0.1 to 19.4 kPa. As a result, 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 280 hours (Table 8).
  • Fermenter capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane separation element Effective filtration area: 120 cm 2 Pure water permeability coefficient of separation membrane: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / Pa Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ 0.035 ⁇ m Separation membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6.5 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 1 L / day Sterilization: All fermenters and separation media including separation membrane elements are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 7 Production of 2,3-butanediol by continuous fermentation using a separation membrane of Paenibacillus polymixa using mixed sugar as a fermentation raw material 2 Continuous fermentation using a separation membrane using Paenibacillus polymyxa ATCC12321 was performed. Except for setting Kla to 0, the reaction was carried out under the same conditions as in Example 1, and 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 300 hours (Table 8).
  • Example 8 Production of 2,3-butanediol by continuous fermentation using a separation membrane of Paenibacillus polymixa using mixed sugar as a fermentation raw material 3 Continuous fermentation using a separation membrane using Paenibacillus polymyxa ATCC12321 was performed. Except that Kla was set to 60, 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 270 hours under the same conditions as in Example 1 (Table 8).
  • Example 9 Production of 2,3-butanediol by continuous fermentation using a separation membrane of Paenibacillus polymyxa using mixed sugar as a fermentation raw material 4 Continuous fermentation using a separation membrane using Paenibacillus polymyxa ATCC12321 was performed. Except that Kla was set to 100, 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 280 hours under the same conditions as in Example 1 (Table 8).
  • Example 10 Production of 2,3-butanediol by continuous fermentation using a separation membrane of Paenibacillus polymixa using mixed sugar as a fermentation raw material 5 Continuous fermentation using a separation membrane using Paenibacillus polymyxa ATCC12321 was performed. 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 270 hours under the same conditions as in Example 1 except that the Kla was 150 (Table 8).
  • the collected culture was washed twice with 200 mM maleate buffer (pH 5.5).
  • the cells were resuspended with 200 mM maleate buffer (pH 5.5), disrupted with a bead-type homogenizer (bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times), and then centrifuged to obtain a supernatant.
  • a bead-type homogenizer bead ⁇ 0.5 0.6 g, 4000 rpm, 1 minute ⁇ 5 times
  • the preculture is inoculated into 1 L of L-lactic acid fermentation medium (glucose) having the composition shown in Table 10, and subjected to batch fermentation for 96 hours under the operating conditions shown below while adjusting the temperature and pH.
  • Produced (Table 13).
  • Example 11 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using Bacillus coagulans separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material 1 Continuous fermentation using a separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material was performed. Cultivate Bacillus coagulans NBRC12714 strain in a test tube overnight at 50 ° C. in 2 mL of preculture medium (polypeptone 10 g / L, yeast extract 2 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 1 g / L, calcium carbonate 30 g / L) (Previously cultured). The obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (pre-culture).
  • the transmembrane pressure difference during filtration ranges from 0.1 to 19.7 kPa.
  • L-lactic acid was produced by continuous fermentation for 290 hours (Table 13).
  • Fermenter capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane separation element Effective filtration area: 120 cm 2 Pure water permeability coefficient of separation membrane: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / Pa Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ 0.035 ⁇ m Separation membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Temperature adjustment: 50 (°C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 7 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 3 L / day Sterilization: All fermenters and separation media including separation membrane elements are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 12 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using Bacillus coagulans separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material 2 Continuous fermentation using a separation membrane using Bacillus coagulans NBRC12714 was performed. L-lactic acid was produced by continuous fermentation for 280 hours under the same conditions as in Example 11 except that Kla was 0 (Table 13).
  • Example 13 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using a separation membrane of Bacillus coagulans using mixed sugar as a fermentation raw material 3 Continuous fermentation using a separation membrane using Bacillus coagulans NBRC12714 was performed. L-lactic acid was produced by continuous fermentation for 270 hours under the same conditions as in Example 11 except that Kla was 60 (Table 13).
  • Example 14 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using Bacillus coagulans separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material 4 Continuous fermentation using a separation membrane using Bacillus coagulans NBRC12714 was performed. L-lactic acid was produced by continuous fermentation for 300 hours under the same conditions as in Example 1 except that Kla was set to 100 (Table 13).
  • Example 15 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using Bacillus coagulans separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material 5 Continuous fermentation using a separation membrane using Bacillus coagulans NBRC12714 was performed. L-lactic acid was produced by continuous fermentation for 290 hours under the same conditions as in Example 11 except that Kla was 150 (Table 13).
  • Example 16 Continuous culture of Bacillus coagulans using a mixed sugar as a fermentation raw material using a separation membrane 6 Using a lactic acid fermentation medium (mixed sugar) 2 shown in Table 11, continuous culture using a separation membrane for 305 hours was performed under the same conditions as in Example 12 to produce L-lactic acid (Table 13).
  • Example 17 Continuous culture of Bacillus coagulans using a mixed sugar as a fermentation raw material using a separation membrane 6 Using the lactic acid fermentation mixed sugar medium 3 shown in Table 12, continuous culture using a separation membrane was performed for 300 hours under the same conditions as in Example 12 to produce L-lactic acid (Table 13).
  • Example 18 Manufacture of ethanol by continuous fermentation using Escherichia coli separation membrane using biomass-derived sugar liquid as fermentation raw material Continuous fermentation using a separation membrane using biomass-derived sugar liquid as fermentation raw material was performed.
  • the pre-culture medium is the same as in Comparative Example 17 and the ethanol fermentation medium (sugar solution) 1 shown in Table 14 is used.
  • the continuous culture medium is the same as Comparative Example 17 in the ethanol fermentation medium (sugar solution) 2 shown in Table 15 as shown in Table 15.
  • ethanol was produced by continuous fermentation for 290 hours under the same conditions as in Example 1 except that 4N KOH was used for pH adjustment (Table 17).
  • Example 19 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using Bacillus coagulans separation membrane using biomass-derived sugar liquid as fermentation raw material Continuous fermentation using separation membrane using biomass-derived sugar liquid as fermentation raw material It was.
  • the fermentation medium the medium shown in Table 16 was used as in Comparative Example 12.
  • L-lactic acid was produced by continuous fermentation for 260 hours under the same conditions as in Example 11 except that 4N KOH was used for pH adjustment and Kla was 0 (h ⁇ 1 ) (Table 17).
  • Example 20 Production of 2,3-butanediol by continuous fermentation using a ceramic separation membrane of Paenibacillus polymixa using mixed sugar as a fermentation raw material 6 Continuous fermentation using a ceramic separation membrane was performed using Paenibacillus polymyxa ATCC12321 strain. Paenibacillus polymyxa ATCC12321 strain was cultured overnight at 30 ° C. in a 2 mL preculture medium (glucose 5 g / L, peptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L) in a test tube. culture).
  • a 2 mL preculture medium glucose 5 g / L, peptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated in a continuous culture apparatus (the apparatus shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260) containing 2,3-butanediol fermentation medium 1 (mixed sugar) having the composition shown in Table 5 to adjust the temperature and pH. While adjusting, batch fermentation was performed for 30 hours under the following operating conditions (pre-culture). After completion of the preculture, continuous culture was started immediately using 2,3-butanediol fermentation medium 2 (mixed sugar) having the composition shown in Table 7 to produce 2,3-butanediol.
  • 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 260 hours while adjusting the transmembrane pressure difference during filtration to 500 kPa or less (Table 17).
  • Fermenter capacity 2 (L) Separation membrane used: Celfit microfiltration membrane monolith ⁇ 4-19 (NGK) Membrane separation element length: 500mm Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6.5 with 5N Ca (OH) 2 Extraction rate of fermentation broth: 0.7 L / day
  • the efficiency of fermentation production of various chemicals using fermentation raw materials containing pentose and hexose can be greatly improved.

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Abstract

［課題］六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料とした、高収率の化学品の製造方法を提供すること。 ［解決手段］微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、およびろ過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記発酵原料が五炭糖および六炭糖を含み、前記微生物がペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する、化学品の製造方法を提供した。

Description

化学品の製造方法
　本発明は、六炭糖および五炭糖を含む発酵原料を使用した連続発酵による化学品の製造方法に関する。
　乳酸などの生分解性ポリマー原料やエタノールなどのバイオ燃料に代表されるバイオマス由来の化学品は、大気中への二酸化炭素の排出問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びている。これら生分解性ポリマー原料やバイオ燃料の製造方法としては、とうもろこしなどの可食性バイオマスから精製した六炭糖であるグルコースを微生物の発酵原料に使用し、発酵産物として得るのが一般的であるが、可食性バイオマスを使用すると、食料と競合することから価格高騰が引き起こされ、安定し他原料の調達ができなくなる恐れがある。そこで、稲わらなどの非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する試みが行われている（特許文献１参照。）。
　非可食性バイオマス由来の糖を発酵原料に使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られ、非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する場合、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として使用することになる（特許文献１参照。）。
　六炭糖と五炭糖の混合糖を使用する場合は、六炭糖の代謝経路に加えて五炭糖の代謝経路を有する微生物を使用する必要がある。五炭糖を代謝する経路はいくつか知られているが、五炭糖を代謝する経路の初段で五炭糖にペントースレダクターゼが作用してペントールが生成する経路では、ペントールが後段の代謝経路に流れにくいため培養液中に蓄積してしまう（非特許文献１参照。）。一方、五炭糖を代謝する経路の初段で五炭糖にペントースイソメラーゼが作用する経路ではペントールは生成しないため、ペントースレダクターゼが作用する経路に比べて発酵収率が高いことが知られている（非特許文献１参照。）。
　六炭糖と五炭糖の混合糖である非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料とした発酵方法としては連続発酵が採用されうるが、実際に連続発酵した場合の発酵収率については確認されていない（特許文献２参照。）。一方で、ペントースイソメラーゼを有する微生物を、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として連続発酵する場合、バッチ発酵よりも発酵収率が低下してしまうことも知られている（非特許文献２参照。）。したがって、六炭糖と五炭糖の混合糖をペントースイソメラーゼを有する微生物の発酵原料とした連続発酵によって発酵収率を向上させようとする場合、副産物の生合成経路を遮断するなど遺伝子改変による微生物の改良を行う必要があると考えるのがこれまでの技術常識であった。
ＷＯ２０１０／０６７７８５
Ｋａｉｓａ　Ｋａｒｈｕｍａａ，　Ｒｏｓａ　Ｇａｒｃｉａ　Ｓａｎｃｈｅｚ，　Ｂａｒｂｅｌ　Ｈａｈｎ－Ｈａｇｅｒｄａｌ，　　Ｍａｒｉｅ－Ｆ　Ｇｏｒｗａ－Ｇｒａｕｓｌｕｎｄ，　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｘｙｌｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－ｘｙｌｉｔｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｘｙｌｏｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｆｏｒ　ｘｙｌｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，　６：５，　（２００７） Ｄｏ　Ｙｕｎ　Ｋｉｍ，Ｓｅｏｎｇ　Ｃｈｕｎ　Ｙｉｍ，Ｐｙｕｎｇ　Ｃｈｅｏｎ　Ｌｅｅ，Ｗｏｏ　Ｇｉ　Ｌｅｅ，Ｓａｎｇ　Ｙｕｐ　Ｌｅｅ，Ｈｏ　Ｎａｍ　Ｃｈａｎｇ，Ｂａｔｃｈ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　ｗｏｏｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｂｙ　Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ　ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ　ＭＢＥＬ５５Ｅ，Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５，（２００４），６４８－６５３．
　生分解性ポリマー原料やバイオ燃料の発酵生産において、六炭糖と五炭糖の混合糖をペントースイソメラーゼを有する微生物の発酵原料として連続発酵をした場合には、発酵収率が低下してしまうことが知られている。そこで本発明は、六炭糖と五炭糖の混合糖をペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物の発酵原料として連続発酵する場合の発酵収率の向上を課題とするものである。
　本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、六炭糖と五炭糖の混合糖をペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物の発酵原料として連続発酵する化学品の製造方法において、分離膜を用いた連続発酵を行なうことで上記課題を解決することを見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（６）の通りである。
（１）微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、およびろ過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記発酵原料が五炭糖および六炭糖を含み、前記微生物がペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する、化学品の製造方法。
（２）酸素移動容量係数（Ｋｌａ）が１５０ｈ－１以下の条件で連続発酵を行う、（１）に記載の化学品の製造方法。
（３）前記発酵原料中に含まれる六炭糖と五炭糖の重量比率が１：９～９：１である、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
（４）前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
（５）ペントースイソメラーゼがキシロースイソメラーゼである、（１）～（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
（６）五炭糖がキシロースである、（１）～（５）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
　本発明によれば、六炭糖と五炭糖の混合糖をペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物の発酵原料とするにもかかわらず、化学品を高収率で得ることができる。
　本発明は、微生物を発酵原料で培養して化学品を発酵生産する化学品の製造方法において、培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵する化学品の製造方法であって、ペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物を用い、かつ、発酵原料が六炭糖および五炭糖を含むことを特徴とする。
　五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
　六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
　本発明で使用される混合糖に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことが知られているセルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法は、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１－５０６９３４号公報、特開２００５－２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ　ｔｏ　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｃｏ－Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｄｉｌｕｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｒｎ　Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０～５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３－２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１－９５５９７号公報）、バイオマスを２４０～２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
　混合糖に含まれる五炭糖と六炭糖の重量比率は特に制限はないが、混合糖中の五炭糖と六炭糖の重量比率として（五炭糖）：（六炭糖）と表すと、１：９～９：１が好ましい。これは、混合糖としてセルロース含有バイオマス由来糖液を想定した場合の糖比率である。
　本発明に使用する発酵原料に含まれる総糖濃度は特に制限されず、微生物の化学品の生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。具体的には、培地中の炭素源の濃度は、１５～５００ｇ／ｌが好ましく、２０～３００ｇ／ｌがより好ましい。総糖濃度が１５ｇ／ｌ以下であると、五炭糖からの収率向上の効果が低下してしまうことがある。また、総糖濃度が低いと化学品の生産効率も低下してしまう。
　本発明に使用する発酵原料に含まれる六炭糖濃度は、上記の総糖濃度、五炭糖と六炭糖の割合の範囲において特に限定されないが、本発明の化学品の製造方法を用いれば、六炭糖を濃度５ｇ／Ｌ以上含む混合糖液においても良好な収率を得ることができる。
　本発明で使用する発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。
　本発明で使用する窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
　次に、本発明に化学品の製造方法に用いることができる微生物について説明する。
　本発明は、ペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物を用いることを特徴とする。ペントースイソメラーゼは、五炭糖（ペントース）のうち構造異性体であるアルドペントースとケトペントースの異性化を触媒する酵素として定義される。本発明に用いられるペントースイソメラーゼは五炭糖の直接的な異性化を触媒する活性を持っていれば特に限定されないが、例えば、キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）やアラビノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．３）が挙げられる。この中で、例えばキシロースイソメラーゼはＤ－キシロース（アルドペントース）のＤ－キシルロース（ケトペントース）への、かつ／またはその逆の直接的な異性化を触媒する酵素であり、Ｄ－キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。直接的な異性化とは、ペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼにより触媒される、糖アルコール中間体を経た２段階転化とは異なり、ペントースイソメラーゼにより触媒される１段階での異性化のことを指す。
　本発明に用いる微生物は、ペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物であれば特に制限はなく、元来ペントースイソメラーゼを有する微生物を用いてもよいし、適当な宿主にペントースイソメラーゼ遺伝子を導入してペントースイソメラーゼを機能させるようにした微生物を用いてもよい。さらに、使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。また、ケトペントースのリン酸化を触媒する活性を有する酵素を強化した微生物を用いてもよい。ケトペントースのリン酸化を触媒する活性を有する酵素としては、例えば、キシルロキナーゼ（ＥＣ　２．７．１．１７）やリブロキナーゼ（ＥＣ　２．７．１．１６）が挙げられる。
　ペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物としては、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属などの腸内細菌類や、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの乳酸菌類、またアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）やシラマイセス属（ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ）などの真菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アンプラリエラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物を用いることができ、具体的にはエシェリシア属、バチルス属、パエニバチルス属に属する微生物であり、さらに具体的にはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、パエニバチルス・ポリミクサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ）を用いることができる。これらがペントースイソメラーゼを有することは、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）やＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。また、データベースに情報がない微生物であっても、以下に示す酵素活性測定によって知ることができる。
　ペントースイソメラーゼ活性は、ペントース存在下で酵素反応を行い、異性化されたペントールをＨＰＬＣなどを用いて測定することで確認することができる。例えばキシロースイソメラーゼ活性は、特開２００８－７９５６４に開示される方法で測定できる。またアラビノースイソメラーゼに関しても同様の方法が採用されうる。
　適当な宿主にペントースイソメラーゼ遺伝子を導入してペントースイソメラーゼを機能させるようにした微生物としては、特表２００６－５２５０２９に開示される例を挙げることができる。導入するペントースイソメラーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。
　次に、本発明において分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。
　本発明に用いる多孔質膜については特に制限はなく、微生物の撹拌型培養器あるいは撹拌型バイオリアクターによる培養で得られた培養液を微生物から分離濾過する機能を有するものであればよく、例えば多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
　本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
　多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
　多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
　本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
　多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
　多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
　多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
　ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
　本発明で分離膜として使用される多孔性膜は、特に制限はなく、発酵に使用される微生物が通過できなければよいが、発酵に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりを起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、多孔性分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが好ましい。また、さらに好ましくは、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
　微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は１μｍ未満であることが好ましい。多孔性膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。
　また、微生物が所望の生産物である化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による多孔性膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
　平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
　ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求めることができる。
　本発明で用いられる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０－７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
　本発明で用いられる多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
　さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、多孔性膜の純水透過係数が２×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の多孔性膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。多孔性膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
　ここで、多孔性膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置　　原子間力顕微鏡装置（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（株）製“Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ　ＩＩＩａ”）
・条件　　探針　　　　ＳｉＮカンチレバー（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（株）製）
　　　　　走査モード　コンタクトモード（気中測定）
　　　　　　　　　　　水中タッピングモード（水中測定）
　　　　　走査範囲　　１０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
　　　　　　　　　　　５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
　　　　　走査解像度　５１２×５１２
・試料調製　測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
　膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
　また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
　なお、前述の多孔性膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０に記載される製造方法により製造することができる。
　また、別の好ましい形態として、本発明における分離膜は、少なくともセラミックスを含む膜であり得る。本発明におけるセラミックスとは金属酸化物を含有し、高温での熱処理により焼き固められたものをさす。金属酸化物としては、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニアなどが例示できる。分離膜は金属酸化物のみから形成されてもよく、シリカや炭化珪素、シリカと金属酸化物の化合物であるムライトやコージェライトなどを含んでもよい。
　分離膜を形成するセラミックス以外の成分は、分離膜としての多孔質体をなすことができるものであれば特に限定されない。
　分離膜がセラミックスを含む場合もその形状には特に制限はなく、モノリス膜、平膜、管状膜などいずれも用いることができる。容器内への充填効率の観点から柱状構造であり、長手方向に貫通孔を有する構造のものが好ましい。充填効率が上げられる点から、好ましくはモノリス膜である。
　長手方向に貫通孔を有することが好ましい理由は以下のとおりである。柱状構造を有する分離膜をモジュール容器に収めて分離膜モジュールとして用いる場合は、分離膜は外圧式および内圧式のうちから好適な態様を選択してモジュール化、濾過することが可能となる。本発明においては、これ以降、分離膜が発酵培養液と接する側を１次側、濾過により化学品を含む濾液が得られる側を２次側とそれぞれ呼ぶこととする。
　内圧式モジュールを用いると、１次側の流路が狭いため、クロスフロー濾過を行う場合に循環ポンプの出力が節約できる。さらに、分離膜表面に堆積した濁質をモジュール外に排出する作用が強くなり、分離膜表面が清浄に保たれやすいため好ましい。ただし、この効果を得るためには、内圧式の分離膜が発酵培養液の入り口および出口を有していることが前提となる。このときの入り口および出口は一直線に配された貫通孔の状態であると、通液抵抗が小さくなるため好ましい。さらに分離膜が柱状構造で、貫通孔が長手方向に空いていることによって、分離膜を収める容器を細くすることが可能となる。分離膜モジュールが細いと、製造や取り扱いの観点から好ましく用いることが出来る。
　分離膜の気孔率は特に限定されないが、低すぎると濾過効率が悪くなり、高すぎると強度が低下してしまう。濾過効率と分離膜の強度を両立させ、繰り返し蒸気滅菌への耐性も持たせるためには、２０％以上６０％以下であることが好ましい。
　なお気孔率は、以下の式より決定される。
気孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]－乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）。
　分離膜の平均気孔径は０．０１μｍ以上１μｍ以下であれば好ましく、この範囲の平均気孔径を有する膜であれば分離膜が閉塞しにくく、かつ濾過効率にも優れる。また、平均気孔径が０．０２μｍ以上０．２μｍ以下の範囲であれば、タンパク質、多糖類などに例示される微生物や培養細胞による発酵の副生成物や、培養液中の微生物/培養細胞が死滅して生じる細胞破砕物といった、分離膜を閉塞させやすい物質の閉塞が起きにくくなるため特に好ましい。
　貫通孔を有する柱状構造の分離膜は、外表面が２次側となるため、濾過液を集めるためにモジュール容器を設け、モジュール容器内に分離膜を充填したモジュールとして用いることが好ましい。１本のモジュールに充填される分離膜は１本以上である。
　モジュール容器は、繰り返しの蒸気滅菌処理に耐えうる原料からなることが好ましい。蒸気滅菌処理は、たとえばステンレス鋼や、平均気孔率の低いセラミックスなどが例示される。
　このようなセラミック膜モジュールは、例えばＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される製造方法により製造することができるが、市販のものを利用することもできる。市販のものとして具体的に例示すると、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ精密ろ過膜（Ｐａｌｌ）、セラミック膜フィルターセフィルトＭＦ膜（日本ガイシ）などが挙げられる。
　次に、連続発酵について説明する。
　本発明での連続発酵は、微生物の培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して濾過液中から生産物を回収する連続発酵であることを特徴とする。
　微生物の培養は、用いる微生物に適したｐＨおよび温度を設定すればよく、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、通常、ｐＨが４～８で温度が２０～７５℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４～８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
　培地には、菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物の濃度は、化学品を効率よく製造するのに好ましい濃度であればよい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
　本発明における培養の酸素条件は、酸素移動容量係数Ｋｌａ（ｈ－１）（以下、単にＫｌａと略す。）が１５０ｈ－１以下であることが好ましい。
　Ｋｌａとは、通気攪拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（３）で定義される。（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
ｄＣ／ｄｔ＝Ｋｌａ×（Ｃ＊－Ｃ）・・・（式３）。
　ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｋｌａ：酸素移動容量係数（ｈｒ－１）である。上記式（３）より、下記式（４）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊－Ｃの対数をプロットすることで、Ｋｌａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊－Ｃ）＝－Ｋｌａ×ｔ・・・（式４）。
　また、本発明におけるＫｌａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気攪拌培養装置に水あるいは使用する培地を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、攪拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりＫｌａを計算する方法である。
　Ｋｌａは通気条件と攪拌条件とを組み合わせて通気攪拌培養することで適宜設定できる。その場合通気は行っても行わなくてもよく、通気する気体も培養条件によって変えることが可能である。例えば、溶存酸素濃度を低く保つには、容器を密閉して無通気状態にする、窒素ガス等の不活性ガスを通気する、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。一方溶存酸素濃度を高く保つには、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養液を加圧する等の方法を用いることができる。
　本発明で規定されるＫｌａの範囲において、攪拌速度一定下では以下の式（５）に示すようにＫｌａが通気速度に比例することが知られている。よって本発明での培養に採用される所定のＫｌａは、例えば攪拌速度一定下で通気速度を適当に変化させてＫｌａ測定を行い、得られたＫｌａを通気速度に対してプロットし式（５）に当てはまる定数ａおよびｂを求めることで設定することができる。
Ｋｌａ＝ａ×Ｖ＋ｂ・・・（式５）。
ここで、Ｖ：通気速度（ｖｖｍ）、ａ，ｂ：定数である。
　本発明で使用することができる、ペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する微生物は、五炭糖からペントールへの異性化反応においてＮＡＤＨなどの補酵素を必要としないため、五炭糖の代謝が酸素条件によって影響されることはない。したがって酸素を利用しない嫌気的条件下であっても五炭糖の代謝が滞ることなく化学品を製造することができる。本発明の発酵培養において採用されるＫｌａは特に制限されないが、具体的には、Ｋｌａが１５０ｈ－１以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｈ－１以下、さらに好ましくは６０ｈ－１以下、最も好ましくは３０ｈ－１以下である。本酸素条件でペントースイソメラーゼを有する微生物を培養することにより、目的とする化学品の生産性が顕著に向上する。
　本発明の化学品の製造方法においては、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよい。しかし、発酵培養液を濾過するために、有機高分子膜においては１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、化学品を生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、発酵培養液の透過水量が十分得られない場合があり、化学品を製造するときの生産性が低下する傾向がある。したがって、本発明の化学品の製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１ｋＰａから１５０ｋＰａの範囲とすることにより、発酵培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０．１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲である。
　セラミック膜を用いる場合においても、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよいが、５００ｋＰａ以下が好ましい。５００ｋＰａ以上で運転すると、膜の目詰まりが発生し、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
　濾過の駆動力としては、発酵液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホン、またはクロスフロー循環ポンプにより分離膜に膜間差圧を発生させることができる。また、濾過の駆動力として分離膜２次側に吸引ポンプを設置してもよい。また、クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。更に、発酵液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
　本発明では、培養初期にバッチ培養またはフェドバッチ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続培養（培養液のろ過）を開始しても良い。また、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から、培地供給および培養液の濾過を行うことが可能である。培地供給と培養物の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、培地供給と培養物の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
　また、連続発酵における総濾過液中の糖濃度は、生産性の観点から５ｇ／Ｌ以下とすることが望ましい。濾過液中の糖濃度は、培地の供給速度や培養液の濾過速度、あるいは培地中の糖濃度によって調節できる。
　本発明の化学品の製造方法では、連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、培地で希釈することによって、培養槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、培地で希釈することで、分離膜の閉塞を容易に回避することができる。また、発酵槽内の微生物濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
　本発明の化学品の製造方法に従って連続発酵を行った場合、従来の培養と比較して、高い収率が得られ、極めて効率のよい連続発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における収率は、次の式（７）で計算される。
収率（ｇ／ｇ）＝生産物量（ｇ）÷｛投入糖（ｇ）－未利用糖（ｇ）｝・・・（式７）。
　本発明で用いられる連続培養装置は、微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵による化学品の製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、有機高分子膜を使用する際は、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載される装置が使用できる。また、セラミック膜を使用する際は、ＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される装置が使用できる。
　本発明により製造される化学品としては、上記微生物が発酵培養液中に生産する物質であれば制限はなく、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３－プロパンジオール、１，３－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール１，４－ブタンジオール、グリセロール、ブタノール、イソブタノール、２－ブタノール、イソプロパノールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、アジピン酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、また、カタベリンなどのジアミン化合物を挙げることができるが、中でも有機酸やアルコールが好ましく、さらに好ましくは乳酸、エタノール、２，３－ブタンジオールである。また、本発明は、酵素、抗生物質、組み換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。これら化学品は周知の方法（膜分離、濃縮、蒸留、晶析、抽出等）により濾過液より回収することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（参考例１）グルコース、キシロース、キシルロース、エタノール、２，３－ブタンジオールの分析方法
　発酵液中のグルコース、キシロース、キシルロース、エタノールおよび２，３－ブタンジオールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１（株式会社昭和電工製）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　（参考例２）乳酸の分析方法
　発酵液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ　ビストリス、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
　（参考例３）Ｋｌａ測定
　培養槽に溶存酸素電極（メトラートレド製）を挿入して各通気攪拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりＫｌａを求めた。まず、培養槽に水１．５Ｌを張り、水温を３０℃あるいは５０℃に調整しながら一定の速度で攪拌して窒素ガスを十分に水中に吹き込み、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行った。そののち通気ガスを窒素ガスから所定の通気速度の空気あるいは窒素ガスに切り替えてからの溶存酸素濃度の経時変化を測定してＫｌａを求めた。得られた各通気攪拌条件に対するＫｌａを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１より、攪拌速度８００ｒｐｍで空気を通気したときの、通気速度とＫｌａの関係をプロットして得られる式（５）の定数（ａ，ｂ）は３０℃および５０℃でそれぞれ（２８４，０．４９）および（２５７，－０．４７）であった。
　（参考例４）エシェリシア・コリのキシロースイソメラーゼ活性測定
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を５ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩培養をおこなった（前培養）。翌日、表２に示す５０ｍＬのエタノール発酵培地（混合糖）入りの５００ｍＬの三角フラスコに前培養液を植え継ぎ、３０℃で２４時間培養を行った。回収した培養液を２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて２回洗浄した。２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で菌体を再懸濁し、ビーズ式ホモジナイザー（ビーズφ０．５を０．６ｇ、４０００ｒｐｍ、１分間×５回）にて破砕した後、遠心分離によって上清を回収してこれを菌体抽出液とした。その後２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１ｍＭ　ＣｏＣｌ２、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ　キシロースを含む２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）９００μＬに菌体抽出液１００μＬを添加し、３５℃で２時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣで分析した。その結果、反応前と比較してキシロースのピークが減少し、キシルロースのピークが増大しており、キシロースイソメラーゼ活性を確認することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（比較例１）六炭糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を表３に示す組成のエタノール発酵培地（グルコース）１Ｌに植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１６時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（比較例２）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
　培地として表２に示す組成のエタノール発酵培地（混合糖）を用いて、比較例１と同様の条件で３３時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。
　（比較例３）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの連続発酵によるエタノールの製造
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用しない連続発酵を行った。エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表２に示す組成のエタノール発酵培地（混合糖）の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置より分離膜エレメントを除いたもの）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて３３時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、エタノールの製造を行った。表２に示す組成のエタノール発酵培地（混合糖）の供給と微生物を含む培養液の引き抜きにはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いて、培養槽内に直接培地供給を行い、培養槽内から直接微生物を含む培養液の引き抜きを行った。微生物を含む培養液の引き抜き速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しながら３００時間エタノール製造を行った（表４）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
発酵液の抜き速度：２Ｌ／ｄａｙ
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例１）　混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造１
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用した連続発酵を行った。エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を、表２に示す組成のエタノール発酵培地（混合糖）の入った膜一体型の以下の条件を具備した連続発酵装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて２４時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、エタノールの製造を行った。表２に示す組成のエタノール発酵培地（混合糖）の供給と培養液の濾過にはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いた。培地供給は培養槽内に直接行い、培養液の濾過は分離膜を固定したエレメントを通して行った。培養液の濾過速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ、濾過時の膜間差圧は０．１～１９．８ｋＰａの範囲を推移させることで、２９０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデンろ過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
分離膜の純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／Ｐａ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：±０．０３５μｍ
分離膜の表面粗さ：０．０６μｍ
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
発酵液の抜き速度：２Ｌ／ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例２）　混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造２
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを０とする以外は実施例１と同様の条件で行い、３００時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
　（実施例３）　混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造３
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを６０とする以外は実施例１と同様の条件で行い、２８０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
　（実施例４）　混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造４
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを１００とする以外は実施例１と同様の条件で行い、２９０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
　（実施例５）　混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造５
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを１５０とする以外は実施例１と同様の条件で行い、２７０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（参考例５）パエニバチラス・ポリミクサのキシロースイソメラーゼ活性測定
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を５ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩培養をおこなった（前培養）。翌日、表５に示す５０ｍＬの２，３－ブタンジオール発酵培地１（混合糖）入りの５００ｍＬの三角フラスコに前培養液を植え継ぎ、３０℃で２４時間培養を行った。回収した培養液を２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて２回洗浄した。２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で菌体を再懸濁し、ビーズ式ホモジナイザー（ビーズφ０．５を０．６ｇ、４０００ｒｐｍ、１分間×５回）にて破砕した後、遠心分離によって上清を回収してこれを菌体抽出液とした。その後２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１ｍＭ　ＣｏＣｌ２、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ　キシロースを含む２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）９００μＬに菌体抽出液１００μＬを添加し、３５℃で２時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣで分析した。その結果、反応前と比較してキシロースのピークが減少し、キシルロースのピークが増大しており、キシロースイソメラーゼ活性を確認することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（比較例４）六炭糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサのバッチ発酵による２，３－ブタンジオールの製造
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を表６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地（グルコース）１Ｌに植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて２７時間バッチ発酵を行い、２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６．５に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（比較例５）混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサのバッチ発酵による２，３－ブタンジオールの製造
　培地として表５に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１（混合糖）を用いて、比較例４と同様の条件で５０時間バッチ発酵を行い、２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
　（比較例６）混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサの連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用しない連続発酵を行った。パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表５に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１（混合糖）の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置より分離膜エレメントを除いたもの）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて３０時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、２，３－ブタンジオールの製造を行った。表７に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地２（混合糖）の供給と微生物を含む培養液の引き抜きにはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いて、培養槽内に直接培地供給を行い、培養槽内から直接微生物を含む培養液の引き抜きを行った。微生物を含む培養液引き抜き速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御ながら２８０時間２，３－ブタンジオール製造を行った（表８）
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６．５に調整
発酵液の抜き速度：１Ｌ／ｄａｙ
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（実施例６）　混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサの分離膜利用連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造１
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用した連続発酵を行った。パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表５に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１（混合糖）の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて３０時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、２，３－ブタンジオールの製造を行った。表７に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地２（混合糖）の供給と培養液の濾過にはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いた。培地供給は培養槽内に直接行い、培養液の濾過は分離膜を固定したエレメントを通して行った。培養液の濾過速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ、濾過時の膜間差圧は０．１～１９．４ｋＰａの範囲を推移させることで、２８０時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデンろ過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
分離膜の純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／Ｐａ
分離膜の平均細孔径：０．１±０．０３５μｍ
分離膜の表面粗さ：０．０６μｍ
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６．５に調整
発酵液の抜き速度：１Ｌ／ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例７）混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサの分離膜利用連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造２
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを０とする以外は実施例１と同様の条件で行い、３００時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
　（実施例８）　混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサの分離膜利用連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造３
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを６０とする以外は実施例１と同様の条件で行い、２７０時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
　（実施例９）　混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサの分離膜利用連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造４
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを１００とする以外は実施例１と同様の条件で行い、２８０時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
　（実施例１０）　混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサの分離膜利用連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造５
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを１５０とする以外は実施例１と同様の条件で行い、２７０時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（参考例６）バチルス・コアギュランスのキシロースイソメラーゼ活性測定
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を５ｍＬの前培養培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ）に白金耳にて植菌し、５０℃で一晩培養をおこなった（前培養）。翌日、３０ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含む、表９に示す５０ｍＬのＬ－乳酸発酵培地（混合糖）入りの５００ｍＬの三角フラスコに前培養液を植え継ぎ、５０℃で２４時間培養を行った。回収した培養液を２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて２回洗浄した。２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で菌体を再懸濁し、ビーズ式ホモジナイザー（ビーズφ０．５を０．６ｇ、４０００ｒｐｍ、１分間×５回）にて破砕した後、遠心分離によって上清を回収してこれを菌体抽出液とした。その後２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１ｍＭ　ＣｏＣｌ２、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ　キシロースを含む２００ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）９００μＬに菌体抽出液１００μＬを添加し、３５℃で２時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣで分析した。その結果、反応前と比較してキシロースのピークが減少し、キシルロースのピークが増大しており、キシロースイソメラーゼ活性を確認することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（比較例７）六炭糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ発酵によるＬ－乳酸の製造
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を試験管で２ｍＬの前培養培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ）にて５０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を表１０に示す組成のＬ－乳酸発酵培地（グルコース）１Ｌに植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて９６時間バッチ発酵を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１３）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：５０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　（比較例８）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ発酵によるＬ－乳酸の製造
　培地として表９に示す組成のＬ－乳酸発酵培地（混合糖）を用いて、比較例７と同様の条件で１２８時間バッチ発酵を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１３）。
　（比較例９）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの連続発酵によるＬ－乳酸の製造
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用しない連続発酵を行った。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を試験管で２ｍＬの前培養培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ）にて５０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表９に示す組成のＬ－乳酸発酵培地（混合糖）の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置より分離膜エレメントを除いたもの）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１２４時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、Ｌ－乳酸の製造を行った。表９に示す組成のＬ－乳酸発酵培地（混合糖）の供給と微生物を含む培養液の引き抜きにはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いて、培養槽内に直接培地供給を行い、培養槽内から直接微生物を含む培養液の引き抜きを行った。微生物を含む培養液引き抜き速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御ながら３００時間Ｌ－乳酸製造を行った（表１３）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：５０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
発酵液の抜き速度：３Ｌ／ｄａｙ
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例１１）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続発酵によるＬ－乳酸の製造１
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用した連続発酵を行った。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を試験管で２ｍＬの前培養培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ）にて５０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表９に示す組成のＬ－乳酸発酵培地（混合糖）の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１２６時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、Ｌ－乳酸の製造を行った。表９に示す組成のＬ－乳酸発酵培地（混合糖）１の供給と培養液の濾過にはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いた。培地供給は培養槽内に直接行い、培養液の濾過は分離膜を固定したエレメントを通して行った。培養液の濾過速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ、濾過時の膜間差圧は０．１～１９．７ｋＰａの範囲を推移させることで、２９０時間の連続発酵によりＬ－乳酸を製造した（表１３）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデンろ過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
分離膜の純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／Ｐａ
分離膜の平均細孔径：０．１±０．０３５μｍ
分離膜の表面粗さ：０．０６μｍ
温度調整：５０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
発酵液の抜き速度：３Ｌ／ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例１２）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続発酵によるＬ－乳酸の製造２
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを０とする以外は実施例１１と同様の条件で行い、２８０時間の連続発酵によりＬ－乳酸を製造した（表１３）。
　（実施例１３）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続発酵によるＬ－乳酸の製造３
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを６０とする以外は実施例１１と同様の条件で行い、２７０時間の連続発酵によりＬ－乳酸を製造した（表１３）。
　（実施例１４）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続発酵によるＬ－乳酸の製造４
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを１００とする以外は実施例１と同様の条件で行い、３００時間の連続発酵によりＬ－乳酸を製造した（表１３）。
　（実施例１５）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続発酵によるＬ－乳酸の製造５
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。Ｋｌａを１５０とする以外は実施例１１と同様の条件で行い、２９０時間の連続発酵によりＬ－乳酸を製造した（表１３）。
　（実施例１６）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養６
　表１１に示す乳酸発酵培地（混合糖）２を用い、実施例１２と同様の条件で３０５時間の分離膜利用連続培養を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（実施例１７）混合糖を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養６
　表１２に示す乳酸発酵混合糖培地３を用い、実施例１２と同様の条件で３００時間の分離膜利用連続培養を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（比較例１０）バイオマス由来糖液を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
　発酵原料としてバイオマス由来の糖液を使用した発酵を行った。発酵培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に開示されたナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を利用し、適宜試薬により発酵培地の組成を表１４に示すとおり調製した。ｐＨ調製に４Ｎ　ＫＯＨを用いた他は比較例２と同様の条件で２４時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　（比較例１１）バイオマス由来糖液を発酵原料にしたエシェリシア・コリの連続発酵によるエタノールの製造
　発酵原料としてバイオマス由来の糖液を使用した、分離膜を利用しない連続発酵を行った。発酵培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に開示されたナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を利用し、適宜試薬により前培養培地として表１４に示すエタノール発酵培地（糖液）１を、また連続培養中の培地として表１５に示すエタノール発酵培地（糖液）２を調製した。ｐＨ調製に４Ｎ　ＫＯＨを用いた他は比較例３と同様の条件で２８０時間連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　（実施例１８）バイオマス由来糖液を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造
　発酵原料としてバイオマス由来の糖液を使用した、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養培地は比較例１７と同様にとして表１４に示すエタノール発酵培地（糖液）１を、また連続培養中の培地として比較例１７と同様に表１５に示すエタノール発酵培地（糖液）２を用い、ｐＨ調製に４Ｎ　ＫＯＨを用いた他は実施例１と同様の条件で２９０時間連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１７）。
　（比較例１２）バイオマス由来糖液を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ発酵によるＬ－乳酸の製造
　発酵原料としてバイオマス由来の糖液を使用した発酵を行った。発酵培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に開示されたナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を利用し、適宜試薬により発酵培地の組成を表１６に示すとおり調製した。ｐＨ調製に４Ｎ　ＫＯＨを用い、Ｋｌａを０（ｈ－１）とした他は比較例８と同様の条件で７０時間バッチ発酵を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　（比較例１３）バイオマス由来糖液を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの連続発酵によるＬ－乳酸の製造
　発酵原料としてバイオマス由来の糖液を使用した、分離膜を利用しない連続発酵を行った。発酵培地は、比較例１２と同様に表１６記載の培地を用いた。ｐＨ調製に４Ｎ　ＫＯＨを用い、Ｋｌａを０（ｈ－１）とした他は比較例９と同様の条件で２５０時間連続発酵を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１７）。
　（実施例１９）バイオマス由来糖液を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続発酵によるＬ－乳酸の製造
　発酵原料としてバイオマス由来の糖液を使用した、分離膜を利用した連続発酵を行った。発酵培地は、比較例１２と同様に表１６記載の培地を用いた。ｐＨ調製に４Ｎ　ＫＯＨを用い、Ｋｌａを０（ｈ－１）とした他は実施例１１と同様の条件で２６０時間連続発酵を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１７）。
　（実施例２０）混合糖を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミクサのセラミック製分離膜を利用した連続発酵による２，３－ブタンジオールの製造６
　パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を用い、セラミック製分離膜を利用した連続発酵を行った。パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表５に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１（混合糖）の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて３０時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、表７に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地２（混合糖）を用いて直ちに連続培養を開始し、２，３－ブタンジオールの製造を行った。濾過時の膜間差圧は５００ｋＰａ以下となるよう調整しながら、２６０時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：Ｃｅｌｆｉｔ精密ろ過膜　モノリス　φ４－１９（日本ガイシ）
膜分離エレメント長さ：５００ｍｍ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６．５に調整
発酵液の抜き速度：０．７Ｌ／ｄａｙ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　以上の結果から、五炭糖と六炭糖の混合糖から化学品を高収率で製造できた。
　本発明によって、五炭糖および六炭糖を含む発酵原料を用いた種々の化学品の発酵生産の効率を大幅に向上させることができる。

Claims (6)

  1. 　微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、およびろ過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記発酵原料が五炭糖および六炭糖を含み、前記微生物がペントースイソメラーゼを用いて五炭糖を代謝する経路を有する、化学品の製造方法。
  2. 　酸素移動容量係数（Ｋｌａ）が１５０ｈ－１以下の条件で連続発酵を行う、請求項１に記載の化学品の製造方法。
  3. 　前記発酵原料中に含まれる六炭糖と五炭糖の重量比率が１：９～９：１である、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
  4. 　前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
  5. 　ペントースイソメラーゼがキシロースイソメラーゼである、請求項１～４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
  6. 　五炭糖がキシロースである、請求項１～５のいずれかに記載の化学品の製造方法。
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