WO2013108822A1 - 脱ラムノシルアクテオシド含有オリーブ抽出物 - Google Patents

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佳子 小野
前田　満
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Definitions

  • the present invention relates to an olive extract containing derhamnosylacteoside (hereinafter referred to as “DRA”), a blood antioxidant, and a method for producing the same. Specifically, the present invention relates to an olive extract containing DRA and having blood antioxidant activity, a blood antioxidant containing DRA as an active ingredient, and a method for producing the same.
  • DRA derhamnosylacteoside
  • Olive ( Olea europaea ) is a plant belonging to the genus Oleaceae and is widely cultivated in the Mediterranean region. The fruit is widely used all over the world for olive oil extraction and edible, and the food experience is very rich.
  • the olive fruit contains polyphenols such as oleuropein, hydroxytyrosol, and acteoside (Non-patent Documents 1 and 2), and the olive extract and their polyphenol components have an arteriosclerotic effect (Non-patent Document 3), It has been reported that it has an antihypertensive effect (Patent Document 1), an inhibitory effect on bone weight loss (Non-Patent Document 4), and the like. In addition, it has been reported that olive extract has antioxidant, whitening, skin anti-aging and anti-tumor effects (Patent Document 2).
  • Acteoside is one of the typical polyphenol components contained in olives and is known to have antioxidant activity (Non-patent Document 2).
  • DRA has a structure in which the rhamnose unit is removed from acteoside, and has been isolated as calceolarioside A from the cedar plant ( Calceolaria hypericina ) (Non-patent Document 5). Existence is reported, but there is no report in olive. In addition, regarding antioxidant activity in vitro, it has been reported that acteoside is more active than DRA (Non-patent Document 6).
  • Non-patent Document 7 when time-dependent changes in absorption and excretion of polyphenols and blood antioxidants when human ingestion of olive fruits were examined, it was reported that both were cleared in a short time (Non-patent Document 7). ). Furthermore, it is also reported that acteoside, which is known to have an antioxidant action, has a problem in its absorbability when taken orally (Non-patent Document 8).
  • the fruit of olive contains acteoside, which is an antioxidant polyphenol, but acteoside has a problem in absorption in the body, and the effect when taken orally is not sufficient. Moreover, the antioxidant action is temporary after ingestion, and when used as a supplement or the like, it is desired that the effect be sustained for a longer time.
  • An object of the present invention is to provide a food, a quasi-drug, and a medicine that can exhibit their efficacy efficiently in a living body and exhibit a blood antioxidant effect for a long time.
  • DRA exhibits a higher antioxidant effect than acteoside in vivo, unlike the results in vitro. .
  • the antioxidant action showed an action over a long time by the difference in digestibility of DRA and acteoside.
  • DRA has higher absorption in the body than Acteoside, and it has also been clarified that various physiological activities possessed by the metabolites hydroxytyrosol and caffeic acid are efficiently exhibited.
  • DRA can be prepared by treating acteoside with a glycoside hydrolase, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following inventions.
  • An olive extract containing DRA (hereinafter referred to as “DRA-containing olive extract”).
  • DRA-containing olive extract (2) The olive extract according to (1), comprising DRA in an amount of 0.1% by weight or more.
  • a composition comprising any one of (1) to (3).
  • the composition according to (4), wherein the composition is a food or drink.
  • the food or drink according to (6) comprising an olive extract.
  • a blood antioxidant containing DRA A blood antioxidant containing DRA.
  • the blood antioxidant according to (8) comprising DRA in an amount of 0.1% by weight or more.
  • a composition comprising the blood antioxidant of (8) or (9).
  • the composition according to (10), wherein the composition is a food or drink.
  • a method for producing a DRA-containing composition comprising the step of treating an acteoside-containing composition with a glycoside hydrolase having derhamnose activity.
  • the production method according to (12), wherein the acteoside-containing composition is an olive extract.
  • the production method according to (12) or (13), wherein the glycoside hydrolase is naringinase.
  • the DRA-containing olive extract and blood antioxidant of the present invention exhibit a high antioxidant effect for a long time in vivo. Therefore, it is useful as a food and drink, a quasi drug, and a medicine.
  • FIG. 1 is a graph showing the change over time of the amount of DRA produced by an enzymatic reaction using the HPLC peak area as an index.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time with the decrease in acteoside due to the enzyme reaction as an index of HPLC peak area.
  • FIG. 3 shows changes over time in blood FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) activity when DRA or acteoside is administered as a CMC suspension.
  • FIG. 4 shows changes in blood FRAP activity over time when DRA is administered as an olive oil solution.
  • FIG. 5 shows changes over time in blood ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) activity when DRA or acteoside is administered as a CMC suspension.
  • FIG. 6 shows changes in blood ORAC activity over time when DRA is administered as an olive oil solution.
  • FIG. 7 is a graph showing changes with time in the concentrations of acteoside, DRA, hydroxytyrosol, and caffeic acid in the blood of rats when 0.5% CMC turbid suspension was administered.
  • FIG. 8 is a graph showing changes over time in the concentrations of Acteoside, DRA, hydroxytyrosol, and caffeic acid in the blood of rats when Acteoside 500 mg / 0.5% CMC turbid suspension was administered.
  • FIG. 9 is a graph showing changes over time in the concentrations of hydroxytyrosol and caffeic acid in the blood of rats when DRA 423 mg / 0.5% CMC turbid suspension is administered.
  • FIG. 10 is a diagram showing that the amount of DRA absorbed in the body (AUC) is larger than that of acteoside.
  • FIG. 11 shows changes over time in blood FRAP activity when a DRA-containing extract is administered once as an olive oil solution.
  • FIG. 12 shows time-dependent changes in blood FRAP activity when a single DRA-containing olive extract or enzyme-untreated olive extract is administered as an olive oil suspension.
  • FIG. 13 shows blood FRAP activity 9 hours after the final administration when DRA-containing olive extract or enzyme-untreated olive extract was continuously administered as an olive oil suspension.
  • the present invention relates to an olive extract containing DRA and having a high antioxidant action in vivo for a long time, a food and drink containing DRA, a blood antioxidant, and a method for producing the same.
  • the DRA-containing olive extract of the present invention contains DRA.
  • the structural formula of DRA is shown below.
  • DRA was isolated as calceolarioside A from Calceolaria hypericina in 1986 for the first time, and its presence in various plants was subsequently reported, but not in olives.
  • the DRA-containing olive extract of the present invention may contain a very small amount of DRA, but it is contained in an amount of 0.1% by weight or more, preferably 1% by weight or more, more preferably 5% by weight or more.
  • DRA may be obtained by enzymatic treatment of the following acteoside or may be obtained by other methods.
  • an olive extract containing DRA can be obtained by reacting an acteoside-containing olive extract with an enzyme capable of removing the rhamnose portion of acteoside under appropriate conditions. It can also be obtained by extracting DRA from a plant material containing DRA and adding it to the olive extract.
  • the DRA-containing olive extract of the present invention only needs to contain DRA, and the other components are not particularly limited.
  • examples of other components include acteoside and hydroxytyrosol, which are olive-derived components.
  • the content of other components and the quantitative ratio between DRA and other components can be set arbitrarily.
  • Olive is a plant belonging to the genus Oleaceae, and can be used as a raw material for preparing an extract of any variety.
  • varieties such as Manzanillo, Lucca, Nevadillo Blanco, Mission, Picual, Arbequina, Ohibranca, Cornicabra, Gordal, Moloioro, Frantoio, Colatina, Retcino and the like can be preferably used.
  • any part of olive fruit, seeds, leaves, stems and the like may be used, but it is preferable to use a part having a high acteoside content, for example, a fruit.
  • Olive fruit may be used as it is, or may be dried by freeze-drying or the like.
  • the residue after squeezing oil from olive fruit can be used as it is or in a dried state.
  • Preparation of an olive extract is an extract obtained by solvent extraction using any of the above as a raw material.
  • the solvent used for solvent extraction may be a polar solvent or a nonpolar solvent. Examples include water, alcohols such as methanol or ethanol, polyhydric alcohols such as ethylene glycol or propylene glycol, and ketones.
  • hot water at 60 ° C. to 90 ° C. is used.
  • DRA-containing olive extract of the present invention contains DRA, it has various effects. For example, DRA has a higher absorbed amount in the body than Acteoside, and various physiological activities possessed by the metabolites hydroxytyrosol and caffeic acid are more efficiently exhibited. It also exhibits blood antioxidant activity for a long time after ingestion. *
  • the absorbed amount in the body such as DRA can be evaluated by, for example, administering a test solution to a laboratory animal, collecting blood after a certain time, and measuring the concentration.
  • a test solution to a laboratory animal
  • collecting blood after a certain time and measuring the concentration.
  • an overnight fasted rat is orally administered with a DRA olive oil suspension (0.8 mM) at a dose of 5 ml / kg using a sonde.
  • blood is collected from a tail vein into a heparin blood collection tube at regular intervals after administration, a plasma sample is obtained by centrifugation, and evaluation is performed by concentration analysis.
  • hydroxytyrosol which is a metabolite of DRA, and caffeic acid is shown below.
  • Hydroxytyrosol is known to have a very strong antioxidant action and to prevent the worse cholesterol LDL from becoming a further deteriorated oxidized LDL.
  • Caffeic acid is a type of polyphenol contained in coffee and is known as a scent component. This caffeic acid has been reported to have an effect of suppressing metastasis and proliferation of cancer cells.
  • the DRA-containing olive extract of the present invention can be used as it is as a food or drink, or can be blended in a food or drink or a medicine.
  • DRA When used as it is as a food or drink, it does not impair the effects of DRA, that is, unless it causes an undesirable interaction with DRA, other physiologically active ingredients such as minerals; vitamin E, vitamin C, vitamin Vitamins such as A; nutritional ingredients; fragrances; other additives such as pigments can be mixed. Any of these additives commonly used for food and drink can be used. *
  • DRA-containing olive extract is blended into functional foods (including health supplements, functional nutritional foods, special-purpose foods, health foods such as special health foods, and supplements for animals), animal feeds, etc. be able to.
  • functional foods including health supplements, functional nutritional foods, special-purpose foods, health foods such as special health foods, and supplements for animals
  • animal feeds, etc. be able to.
  • the present invention relates to a food or drink containing DRA in an amount of 0.1% by weight or more. Preferably, it contains an olive extract.
  • DRA may be obtained by enzymatic treatment of acteoside or may be obtained by other methods.
  • a DRA-containing product can be obtained by reacting an acteoside-containing product with an enzyme capable of removing the rhamnose portion of acteoside under appropriate conditions.
  • an enzyme capable of removing the rhamnose portion of acteoside under appropriate conditions.
  • what was obtained by extracting DRA from the plant raw material etc. containing DRA may be used.
  • the form of food and drink can be in the form of health foods such as tablets, capsules, powders, granules, drinks (including solutions and suspensions), soft drinks, tea drinks, yogurts, It may be in the form of dairy products such as lactic acid bacteria beverages, seasonings, processed foods, desserts, confectionery (for example, gum, candy, jelly) and the like.
  • the food and drink of the present invention may contain excipients, binders, coating agents, disintegrants, additives and the like that are acceptable as food.
  • the food / beverage products of the present invention are effective in preventing or improving disorders / diseases associated with active oxygen by having antioxidant activity.
  • the present invention also relates to blood antioxidants including DRA.
  • the DRA-containing blood antioxidant of the present invention is a sustained-release blood antioxidant. Having antioxidant activity is effective in preventing, improving or treating disorders / diseases involving active oxygen.
  • Blood antioxidant activity can be evaluated using, for example, FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) or ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity).
  • FRAP Frric Reducing Ability of Plasma
  • ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity
  • the DRA content in the blood antioxidant of the present invention is not particularly limited, but is 0.1% by weight or more, preferably 1% by weight or more, more preferably 2% by weight or more, and further preferably 5% from the viewpoint of effectiveness. % By weight or more.
  • DRA may be obtained by enzymatic treatment of acteoside or may be obtained by other methods.
  • a DRA-containing product can be obtained by reacting an acteoside-containing product with an enzyme capable of removing the rhamnose portion of acteoside under appropriate conditions.
  • what was obtained by extracting DRA from the plant raw material etc. containing DRA may be used.
  • the blood antioxidant of the present invention may be, for example, an oral administration agent such as a tablet, capsule, granule, powder, syrup or the like, or a parenteral administration agent such as an injection. Then, a pharmaceutically acceptable excipient, binder, extender, dispersant, preservative, or the like can be added to the blood antioxidant of the present invention.
  • the blood antioxidant of the present invention can be used as it is, and can also be blended in foods and drinks, pharmaceuticals and the like.
  • a DRA-containing composition is prepared from an acteoside-containing composition. Specifically, a composition containing DRA can be easily prepared by removing the rhamnose portion of acteoside by glycoside hydrolase treatment.
  • the acteoside-containing composition used as a raw material is not limited as long as it contains acteoside, and may be a purified acteoside, or a mixture of acteoside and other polyphenol compounds such as oleuropein and hydroxytyrosol. Also good.
  • a plant extract containing acteoside can also be used.
  • the concentration of acteoside in the raw material can be appropriately determined in consideration of the DRA content in the target product. As described above, olives contain a relatively large amount of acteoside, and an olive extract containing acteoside at a desired ratio can be obtained by appropriately using a known method. Therefore, in the production method of the present invention, Is a preferred raw material. From this point, olive fruit is preferable, and a commercially available extract solution of olive fruit extract can also be used. *
  • the glycoside hydrolase used can be used without limitation as long as it has rhamnosidase activity for removing rhamnose from acteoside.
  • the enzyme having rhamnosidase activity include naringinase and hesperinase.
  • the enzyme treatment conditions can be appropriately determined in consideration of the optimum reaction temperature and pH of the enzyme used. For example, when naringinase is used, the pH is adjusted to a range of 3.5 to 5 using an appropriate reagent, and the reaction is performed at a temperature in the range of 30 to 60 ° C., preferably 35 to 45 ° C.
  • the enzyme is deactivated using a known appropriate method, for example, adjusting the pH of the solution to 3 and heating at 80 ° C. or higher for 10 minutes.
  • the DRA concentration in the produced DRA-containing composition can be obtained at a desired concentration by appropriately setting the acteoside concentration, enzyme addition amount, reaction time, etc. in the raw material.
  • the concentration of DRA and the concentration of residual acteoside in the DRA-containing composition obtained by the enzyme reaction can be measured by methods known to those skilled in the art, for example, HPLC analysis.
  • DRA can be separated and purified from the obtained DRA-containing composition.
  • DRA separation and purification can be appropriately carried out by methods known to those skilled in the art, such as solvent extraction and chromatographic separation.
  • Preparation Example 1 Preparation of olive extract 8 kg of oil-depressed olive fruit was extracted twice with 32 L of hot water at 80 ° C. for 30 minutes each. After filtration with a nylon mesh (trade name: NRS-500, manufactured by Nihon Riken Kikai Co., Ltd.), it is squeezed by suction filtration using # 131 ( ⁇ 330 mm) filter paper + 200 g Hyflo Supercell (Nacalai Tesque) The residue was removed and an extract was obtained.
  • a nylon mesh trade name: NRS-500, manufactured by Nihon Riken Kikai Co., Ltd.
  • the total amount of the dried product was dissolved in 200 ml of 70% ethanol aqueous solution, further diluted 10-fold with water, and then equilibrated with water.
  • 1 L of MCI GEL CHP-20P Mitsubishi Chemical Corporation, 75-150 ⁇ m .
  • 10 L of 10% ethanol aqueous solution 1 L each in 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5%, 30%, 35% ethanol aqueous solution
  • 2 more Elution was sequentially performed with 40% ethanol aqueous solution of L (all ethanol concentrations were V / V%).
  • the eluate from 12.5% to 27.5% was collected in 4 fractions of 250 ml each.
  • Example 1 Manufacture of DRA-1 Naringinase (derived from Penicillium decumbens , 300 units / g, Sigma) 0.37 mg was suspended in 1.68 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) to prepare 0.22 mg / ml enzyme solution (abbreviation: 1/10) . This 1/10 enzyme solution was diluted with 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) to prepare enzyme solutions of 3-fold, 10-fold, and 30-fold dilution (respective abbreviations: 1/30, 1/100). , 1/300).
  • Centrifugation was performed (10000 rpm, 10 minutes, 5 ° C., micro high-speed cooled centrifuge MX-100, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.). 4 ⁇ l of the obtained centrifugation supernatant was subjected to HPLC analysis under the following analysis conditions. The 5th and 24th hours of the enzyme-free group were treated in the same manner to check the stability of acteoside (abbreviation: Ez (-)). Moreover, it was confirmed by LC / MS analysis that the reaction product was DRA.
  • Example 2 Manufacture of DRA-2 4 g of the purified acteoside obtained in Preparation Example 2 was dissolved in 100 ml of 50% aqueous ethanol. The total amount of this lysate was added to 2 L of 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) and kept at 40 ° C., and 400 mg of naringinase (from Penicillium decumbens, 300 units / g, manufactured by Sigma) was added. After stirring at 40 ° C.
  • reaction solution was immediately loaded onto 700 ml of MCI GEL CHP-20P (Mitsubishi Chemical Corporation, 75-150 ⁇ m) equilibrated with water. After washing with 2 L of water, 2 L of 15% ethanol aqueous solution and 1200 ml of 20% ethanol aqueous solution were allowed to flow. Subsequently, elution was performed with 750 ml each of 22.5%, 25%, and 27.5% aqueous ethanol solutions, and 250 ml each was fractionated into three fractions. Furthermore, elution was performed with 1250 ml of 30% ethanol aqueous solution, and 250 ml was divided into 5 fractions.
  • MCI GEL CHP-20P Mitsubishi Chemical Corporation, 75-150 ⁇ m
  • Example 4 Production of DRA-containing olive extract-2 ⁇ Extraction> 2 kg of olive oil squeezed residue was extracted with 16 L of hot water at 80 ° C. for 2 hours. After filtration with a nylon mesh (product name: NRS-500, manufactured by Nihon Riken Kikai Co., Ltd.), squeezed by suction filtration using # 131 ( ⁇ 330 mm) filter paper + 400 g Hyflo Supercell (Nacalai Co., Ltd.) The extract was obtained. ⁇ Derhamnosyl reaction> The extract was cooled to 40 ° C. and 32 ml of acetic acid was added to lower the pH to 3.93. While maintaining at 40 ° C.
  • naringinase derived from Penicilliumdecumben , 540 units / g, manufactured by Sigma
  • naringinase derived from Penicilliumdecumben , 540 units / g, manufactured by Sigma
  • 35 ml of 6N sulfuric acid was added to adjust the pH to 3.0, and the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was cooled to 40 ° C. or lower in a water bath, and 52.5 ml of an equivalent 4 N NaOH aqueous solution was added.
  • Embodiment 5 DRA blood antioxidant activity ⁇ Measurement method> The effect of DRA on blood antioxidant activity was evaluated using rats. FRAP and ORAC were used for evaluation of blood antioxidant activity. Further, DRA and acteoside were prepared in the same manner as in Example 2 and Preparation Example 2, respectively.
  • heparin was collected from the tail vein before administration, 0.5, 1, 3, 6, 9, 24 hours after administration, and in groups 4-5, before administration, 1, 3, 6, 9, 24 hours after administration.
  • Blood was collected in a blood vessel and a plasma sample was obtained by centrifugation (8,000 rpm, 10 min). At a later date, plasma FRAP activity and acetone-deproteinized supernatant ORAC activity were measured.
  • Example 6 Of the plasma samples collected for measurement of blood antioxidant activity in Example 5 in vivo absorption , 1 group (0.5% CMC solution administration group), 2 groups (DRA 0.5% CMC suspension administration group), 3 groups Using a part of plasma of (acteoside 0.5% CMC suspension administration group), the blood concentration at the time of administration of each sample was measured.
  • ⁇ Measurement method Equal volume of 3 plasma from each group was mixed and homogenized, and then added 90 ⁇ l of snail-derived ⁇ -glucuronidase / allylsulfatase / acetate buffer (pH 5.0) to 90 ⁇ l of plasma and incubated at 37 ° C. for 1 hour. went. The reaction was terminated by adding 900 ⁇ l of acetonitrile, and subsequently 10 ⁇ l of 1% ascorbic acid aqueous solution and 10 ⁇ l of internal standard solution were added and mixed, and the supernatant after centrifugation (15,000 rpm, 10 min) was collected.
  • the collected supernatant was concentrated under reduced pressure, redissolved in 50% methanol, filtered and subjected to LC-MS / MS to determine acteoside, DRA, hydroxytyrosol, and caffeic acid.
  • the amount of acteoside, DRA, hydroxytyrosol, and caffeic acid was determined by the ratio of the peak area to the peak area of hesperidin (Wako) used as an internal standard.
  • LC-MS / MS analysis conditions are shown below.
  • the maximum blood concentration (Cmax) of acteoside was less than 1 ⁇ M, but hydroxytyrosol and caffeic acid were detected as metabolites.
  • the maximum blood concentration (Cmax) of hydroxytyrosol was 11.7 ⁇ M, and the maximum blood concentration (Cmax) of caffeic acid was 0.7 ⁇ M.
  • the maximum blood concentration (Cmax) of DRA when DRA was administered was still less than 1 ⁇ M, but high concentrations of hydroxytyrosol and caffeic acid were detected as metabolites.
  • the maximum blood concentration (Cmax) of hydroxytyrosol was 32.8 ⁇ M, and the maximum blood concentration (Cmax) of caffeic acid was 7.3 ⁇ M.
  • Example 7 Content-dependent evaluation of blood antioxidant activity The blood antioxidant activity of olive extracts containing various concentrations of DRA was compared. ⁇ Measurement method> SD (IGS) male rats (6 weeks old) purchased from Charles River Japan, acclimatized in the test environment for 1 week, then fasten the animals that showed good growth overnight and consist of 4 animals in each group Divided into 5 groups. A DRA-containing olive extract was prepared using DRA produced by the same method as in Example 2 and the olive extract obtained in Preparation Example 1.
  • This DRA-containing olive extract was dissolved in olive oil to prepare an administration solution containing 0, 0.5, 1, 2, 5% of DRA, and orally administered using a sonde at a dose of 5 ml / kg.
  • blood was collected from the tail vein into a heparin blood collection tube, and a plasma sample was obtained by centrifugation (8,000 rpm, 10 min). The plasma FRAP activity was measured at a later date.
  • FIG. The results are shown in FIG. The blood antioxidant activity increased depending on the content of DRA, and a clear increase in blood antioxidant activity was observed at a concentration of 2% or more.
  • Example 8 FIG. Antioxidant activity in blood The antioxidant activity in blood with or without derhamnosyl reaction was compared by FRAP activity. ⁇ Measurement method> As for the sample, the DRA-containing olive extract prepared in Example 4 (DRA content: 8.9%) and the process of Example 4 were not subjected to only the derhamnosyl reaction, and the other processes were similarly treated with the enzyme-untreated. Olive extract (acteoside content 9.1%) was used.
  • Example 9 DRA sustained-release test animals and administration solutions were prepared in the same manner as in Example 8. For administration, 500 mg / 5 ml / kg is administered continuously for 24 days at 24-hour intervals, blood is collected in a heparin blood collection tube 9 hours after the final administration, and a plasma sample is obtained by centrifugation (8,000 rpm, 10 min) Got. The plasma FRAP activity was measured at a later date.
  • Formulation Example 2 Granules (mixed amount per stick) DRA-containing olive extract (DRA content 8.9%) 150 mg Corn starch 400 mg Maltitol 1000 mg After uniformly mixing the above components, 100 ml of 10% hydroxypropylcellulose / ethanol solution was added, kneaded as usual, extruded, and dried to obtain granules. Take 1.5g / stick per day.
  • Formulation Example 3 The recommended dosage is 2 capsules per day.
  • the composition shown below was filled in the soft capsule skin made of the above components by a conventional method to obtain a soft capsule of 300 mg per capsule.
  • the recommended intake is 2 soft capsules per day.
  • foods and drinks, quasi-drugs and medicines that exhibit a high antioxidant effect for a long time in vivo are provided.

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Abstract

　生体内で高い抗酸化作用を長時間発揮する飲食品、医薬部外品及び医薬を提供すること。　オリーブ抽出物に、脱ラムノシルアクテオシドを含有させることにより、高い抗酸化活性を付与することができる。また、アクテオシド含有組成物を配糖体加水分解酵素処理することにより脱ラムノシルアクテオシド含有組成物を調製することができる。

Description

脱ラムノシルアクテオシド含有オリーブ抽出物
　本発明は、脱ラムノシルアクテオシド（以下、「ＤＲＡ」という。）を含有するオリーブ抽出物、血中抗酸化剤、およびその製造方法に関する。具体的には、ＤＲＡを含有し血中抗酸化作用を有するオリーブ抽出物、ＤＲＡを有効成分として含有する血中抗酸化剤、およびその製造方法に関する。
　オリーブ（Olea europaea）は、モクセイ科オリーブ属に属する植物で、地中海地域をはじめとして広く栽培されている。その果実は、オリーブ油の抽出や食用として全世界で幅広く利用されており、食経験は非常に豊富である。　
　オリーブの果実には、オレウロペイン、ヒドロキシチロソール、アクテオシド等のポリフェノールが含まれており（非特許文献１、２）、オリーブ抽出物やそれらのポリフェノール成分は、動脈硬化作用（非特許文献３）、高血圧抑制作用（特許文献１）、骨重量減少抑制作用（非特許文献４）等を有することが報告されている。また、オリーブ抽出物は抗酸化、美白、皮膚の抗老化、抗腫瘍効果を有すること（特許文献２）が報告されている。
　アクテオシドは、オリーブに含まれる代表的なポリフェノール成分の一つであり、抗酸化活性を有することが知られている（非特許文献２）。
　一方、ＤＲＡは、アクテオシドからラムノース単位が外れた構造を有しており、ゴマノハグサ科植物（Calceolaria hypericina）よりcalceolarioside Aとして単離されたのを始めとして（非特許文献５）、種々の植物での存在が報告されているが、オリーブでの報告はない。また、抗酸化活性について、in vitroでの抗酸化活性の比較では、ＤＲＡよりもアクテオシドの方が活性が高いことが報告されている（非特許文献６）。
　しかし、オリーブの実をヒトが摂取したときのポリフェノール類の吸収と排出、血中抗酸化の経時変化を調べたところ、ともに短時間でクリアされてしまうことが報告されている（非特許文献７）。さらに、抗酸化作用を有することが知られているアクテオシドは、経口摂取ではその吸収性に問題があることも報告されている（非特許文献８）。
特開2005-334022号公報 特開2002-186453号公報
J. Agric Food Chem, vol.52， pp479-484， 2004 J Agric Food Chem, vol.53, pp8963-8969, 2005、 Atherosclerosis， vol.188， No.1, pp35-42， 2006 Clin Nutr, vol.25, No.5, 859-868, 2006 Gazzetta Chimica Italiana, 116, P431-433, 1986 Planta Medica, 70(1), 50-53, 2004 Phytomedicine, vol.14, pp659-667, 2007 J. Chromatogr. B, 844(1), pp89-95, 2006
　上述のように、オリーブの果実には抗酸化ポリフェノールであるアクテオシドが含まれているが、アクテオシドは体内吸収性に問題があり、経口摂取した場合の効果は十分ではない。また、その抗酸化作用は摂取後一時的であり、サプリメントなどとして利用する場合には、より長時間の効果の持続が望まれる。
　本発明は、生体内で効率よく効能を発揮させることができ、長時間血中抗酸化作用を示す食品、医薬部外品及び医薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、in vitroでの結果とは異なり、生体内ではＤＲＡがアクテオシドよりも高い抗酸化作用を示すことを見出した。また、その抗酸化作用は、ＤＲＡとアクテオシドとの消化性の違いにより長時間にわたり作用を示すことを見出した。さらに、ＤＲＡはアクテオシドに比べて体内吸収性が高く、代謝物であるヒドロキシチロソールおよびカフェ酸の有する様々な生理活性が効率的に発揮されることも明らかとなった。また、ＤＲＡはアクテオシドを配糖体加水分解酵素にて処理することにより調製することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下に限定されるものではないが、次の発明を包含する。
（１）　ＤＲＡを含むオリーブ抽出物（以下、「ＤＲＡ含有オリーブ抽出物」という。）。
（２）　ＤＲＡを０．１重量％以上含む、（１）記載のオリーブ抽出物。
（３）　ＤＲＡを１重量％以上含む、（２）記載のオリーブ抽出物。
（４）　（１）～（３）のいずれかを配合した組成物。
（５）　組成物が飲食品である、（４）記載の組成物。
（６）　ＤＲＡを０．１重量％以上含む、飲食品。
（７）　オリーブ抽出物を含む、（６）記載の飲食品。
（８）　ＤＲＡを含む血中抗酸化剤。
（９）　ＤＲＡを０．１重量％以上含む、（８）記載の血中抗酸化剤。
（１０）　（８）又は（９）の血中抗酸化剤を配合した組成物。
（１１）　組成物が飲食品である、（１０）記載の組成物。
（１２）　ＤＲＡ含有組成物の製造方法であって、アクテオシド含有組成物を脱ラムノース活性を有する配糖体加水分解酵素で処理する工程を含む、前記製造方法。　
（１３）　アクテオシド含有組成物がオリーブ抽出物である、（１２）記載の製造方法。
（１４）　配糖体加水分解酵素がナリンギナーゼである、（１２）または（１３）記載の製造方法。
　本発明のＤＲＡ含有オリーブ抽出物および血中抗酸化剤は、生体内で高い抗酸化作用を長時間発揮する。そのため、飲食品、医薬部外品及び医薬として有用である。
図１は、酵素反応により生成されたＤＲＡ量のＨＰＬＣピーク面積を指標とした経時的変化を示すグラフである。 図２は、酵素反応によるアクテオシドの減少をＨＰＬＣピーク面積を指標とした経時的変化を示すグラフである。 図３は、ＤＲＡまたはアクテオシドをCMC懸濁液として投与した場合の、血中FRAP（Ferric Reducing Ability of Plasma）活性の経時的変化を示す。 図４は、ＤＲＡをオリーブオイル溶液として投与した場合の、血中FRAP活性の経時的変化を示す。 図５は、ＤＲＡまたはアクテオシドをCMC懸濁液として投与した場合の、血中ORAC（Oxygen Radical Absorbance Capacity）活性の経時的変化を示す。 図６は、ＤＲＡをオリーブオイル溶液として投与した場合の、血中ORAC活性の経時的変化を示す。 図７は、0.5% CMC濁懸水を投与した場合のラットの血中のアクテオシド、ＤＲＡ、ヒドロキシチロソール、カフェ酸濃度の経時変化を示す図である。 図８は、アクテオシド500 mg/0.5% CMC濁懸水を投与した場合のラットの血中のアクテオシド、ＤＲＡ、ヒドロキシチロソール、カフェ酸濃度の経時変化を示す図である。 図９は、ＤＲＡ423 mg/0.5% CMC濁懸水を投与した場合のラットの血中の、ヒドロキシチロソール、カフェ酸濃度の経時変化を示す図である。 図１０は、アクテオシドに比べて、ＤＲＡの体内吸収量（AUC）が多いことを示す図である。 図１１は、ＤＲＡ含有抽出物をオリーブオイル溶解液として単回投与した場合の、血中FRAP活性の経時的変化を示す。 図１２は、ＤＲＡ含有オリーブ抽出物または酵素未処理のオリーブ抽出物をオリーブオイル懸濁液として単回投与した場合の、血中FRAP活性の経時的変化を示す。 図１３は、ＤＲＡ含有オリーブ抽出物または酵素未処理のオリーブ抽出物をオリーブオイル懸濁液として連続投与した場合の、最終投与9時間後の血中FRAP活性を示す。
　本発明は、ＤＲＡを含有し生体内で高い抗酸化作用を長時間有するオリーブ抽出物、ＤＲＡを含有する飲食品、血中抗酸化剤、およびその製造方法に関する。
　以下、本発明の実施の態様についてさらに詳しく説明する。
＜ＤＲＡ含有オリーブ抽出物＞
　本発明のＤＲＡ含有オリーブ抽出物は、ＤＲＡを含有する。
下にＤＲＡの構造式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　前述の通り、ＤＲＡは１９８６年に初めてゴマノハグサ科植物（Calceolaria hypericina）よりcalceolarioside Aとして単離され、その後種々の植物での存在が報告されたが、オリーブでは報告されていない。それに対し、本発明のＤＲＡ含有オリーブ抽出物におけるＤＲＡ含量は極微量であってもよいが、０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上、さらに好ましくは５重量％以上含まれる。
　ＤＲＡは、下記のアクテオシドを酵素処理することにより得られたものであっても、その他の方法によって得られたものでもよい。例えば、アクテオシド含有オリーブ抽出物に対し、アクテオシドのラムノース部分を除去することのできる酵素を用い、適切な条件下にて反応させることにより、ＤＲＡを含有するオリーブ抽出物が得られる。また、ＤＲＡを含む植物原料等からＤＲＡを抽出し、オリーブ抽出物に添加することによっても得ることができる。
　下にアクテオシドの構造式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　本発明のＤＲＡ含有オリーブ抽出物には、ＤＲＡが含まれていればよく、その他の含有成分は特に制限はない。他の含有成分としては、例えばオリーブ由来成分であるアクテオシド、ヒドロキシチロソールが挙げられる。他の成分の含有量やＤＲＡと他の含有成分との量比は、任意に設定することができる。
　オリーブはモクセイ科オリーブ属に属する植物であり、いずれの品種であっても抽出物調製の原料として使用することができる。例示すれば、マンザニロ、ルッカ、ネバディロ・ブランコ、ミッション、ピクアル、アルベキナ、オヒブランカ、コルニカブラ、ゴルダル、モロイオロ、フラントイオ、コラティーナ、レッチーノ等の品種を好適に使用することができる。
　オリーブ抽出物の調製には、オリーブの果実、種子、葉、茎等のいずれの部位を用いてもよいが、アクテオシド含有量が多い部分、例えば果実を用いるのが好ましい。オリーブ果実は生のままで用いてもよいし、凍結乾燥等によって乾燥したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から油を搾った後の残滓も、そのまま、あるいは乾燥した状態で用いることができる。オリーブ抽出物の調製は、上記のいずれかを原料として溶剤抽出して得られる抽出物である。溶剤抽出に用いる溶剤は、極性溶媒であっても非極性溶媒であってもよい。例示すれば、水、メタノールまたはエタノールなどのアルコール類、エチレングリコールまたはプロピレングリコール等の多価アルコール類、ケトン類などである。好ましくは、６０℃～９０℃の熱水である。
　本発明のＤＲＡ含有オリーブ抽出物は、ＤＲＡを含有することから種々の効能を有する。例えば、ＤＲＡはアクテオシドに比べて体内吸収量が高く、代謝物であるヒドロキシチロソールおよびカフェ酸の有する様々な生理活性がより効率的に発揮される。また、摂取した後の長時間に渡り血中抗酸化活性を示す。　
　ＤＲＡなどの体内吸収量は、例えば実験動物に試験溶液を投与し、一定時間後に血液を採取して濃度を測定することにより評価することができる。一例を示せば、一晩絶食させたラットにＤＲＡのオリーブオイル懸濁液（0.8 mM）を5 ml/kgの用量でゾンデを用いて経口投与する。そして投与後一定間隔で尾静脈よりヘパリン採血管に血液を採取し、遠心分離操作により血漿サンプルを得、濃度分析を行うことにより評価する。
　ＤＲＡの代謝物であるヒドロキシチロソールとカフェ酸の構造式を下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　　　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　ヒドロキシチロソールは、非常に強い抗酸化作用を有するとともに、悪玉コレステロールであるLDLからさらに悪化した酸化LDLになるのを防ぐ働きのあることが知られている。
　カフェ酸はコーヒーに含まれるポリフェノールの一種で、香り成分として知られている。このカフェ酸は、がん細胞の転移や増殖を抑制する効果を有することが報告されている。
　オリーブ抽出物は食用として全世界で幅広く利用されており、食経験は非常に豊富である。したがって、本発明のＤＲＡ含有オリーブ抽出物は、そのまま飲食品等として用いることができ、また飲食品や医薬品等に配合することもできる。
　そのまま飲食品等として用いる場合は、ＤＲＡの効果を損なわない、すなわちＤＲＡと好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、他の生理活性成分、例えば、ミネラル；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；栄養成分；香料；色素などの他の添加物を混合することができる。これらの添加物はいずれも飲食品に一般的に用いられるものが使用できる。　
　また、ＤＲＡ含有オリーブ抽出物を配合して、機能性食品（健康補助食品、栄養機能食品、特別用途食品、特定保健用食品等の健康食品、動物用サプリメントを含む）、動物用飼料等とすることができる。
＜飲食品＞　
　本発明は、ＤＲＡを０．１重量％以上含む飲食品に関する。好ましくは、オリーブ抽出物を含む。　
　ＤＲＡは、アクテオシドを酵素処理することにより得られたものであっても、その他の方法によって得られたものでもよい。例えば、アクテオシド含有物に対し、アクテオシドのラムノース部分を除去することのできる酵素を用い、適切な条件下にて反応させることにより、ＤＲＡ含有物が得られる。また、ＤＲＡを含む植物原料等からＤＲＡを抽出して得られたものでもよい。
　飲食品の形態は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、ドリンク剤（溶液剤及び懸濁液剤が含まれる）等の健康食品の形態とすることができ、清涼飲料、茶飲料、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子（例えば、ガム、キャンディ、ゼリー）等の形態とすることもできる。本発明の飲食品には、食品として許容される、賦形剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、添加剤等を含んでもよい。
　本発明の飲食品は抗酸化活性を有することにより、活性酸素が関与する障害／疾患等の予防または改善に有効である。
＜血中抗酸化剤＞
　本発明は、ＤＲＡを含む血中抗酸化剤にも関する。　
　前述のように、これまでの報告とは異なり、アクテオシド投与では血中の抗酸化活性の上昇はほとんど認められないのに対し、ＤＲＡ投与では投与後に血中抗酸化活性が顕著に上昇することを明らかにした。さらに、その効果は長時間におよぶことから、本発明のＤＲＡ含有血中抗酸化剤は徐放性血中抗酸化剤である。抗酸化活性を有することにより、活性酸素が関与する障害／疾患等の予防、改善または治療に有効である。
　血中抗酸化活性は、例えばFRAP（Ferric Reducing Ability of Plasma）、ORAC（Oxygen Radical Absorbance Capacity）を用いて評価することができる。
　本発明の血中抗酸化剤におけるＤＲＡの含有量は、特に制限はないが、効果面から０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上、より好ましくは２重量％以上、さらに好ましくは５重量％以上である。ＤＲＡは、アクテオシドを酵素処理することにより得られたものであっても、その他の方法によって得られたものでもよい。例えば、アクテオシド含有物に対し、アクテオシドのラムノース部分を除去することのできる酵素を用い、適切な条件下にて反応させることにより、ＤＲＡ含有物が得られる。また、ＤＲＡを含む植物原料等からＤＲＡを抽出して得られたものでもよい。
　本発明の血中抗酸化剤は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与剤として、または注射剤等の非経口投与剤の形態であってもよい。そして、本発明の血中抗酸化剤には、製剤的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、分散剤、または保存剤等を添加することができる。
　本発明の血中抗酸化剤は、そのまま用いることができ、また飲食品や医薬品等に配合することもできる。
　そのまま飲食品等として用いる場合は、ＤＲＡの効果を損なわない、すなわちＤＲＡと好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、他の生理活性成分、例えば、ミネラル；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；栄養成分；香料；色素などの他の添加物を混合することができる。これらの添加物はいずれも飲食品に一般的に用いられるものが使用できる。
＜ＤＲＡ含有組成物の製造方法＞
　本発明の製造方法では、ＤＲＡ含有組成物をアクテオシド含有組成物から調製する。具体的には、アクテオシドのラムノース部分を配糖体加水分解酵素処理によって除去することにより、簡便にＤＲＡを含む組成物を調製することができる。
　原料として用いるアクテオシド含有組成物は、アクテオシドを含有するものであればよく、精製されたアクテオシドであってもよいし、アクテオシドとオレウロペイン、ヒドロキシチロソールなどの他のポリフェノール化合物などとの混合物であってもよい。また、アクテオシドを含有している植物抽出物を用いることもできる。原料中のアクテオシドの濃度は、目的とする生成物中のＤＲＡ含量を考慮して、適宜決定することができる。前述のように、オリーブにはアクテオシドが比較的多く含まれており、公知の方法を適宜用いて、所望の割合でアクテオシドを含有するオリーブ抽出物を得ることができるため、本発明の製造方法においては好ましい原料である。この点から、オリーブ果実が好ましく、市販のオリーブ果実の抽出エキス末の溶解液を用いることもできる。　
　用いる配糖体加水分解酵素は、アクテオシドからラムノースを除去するラムノシダーゼ活性を有するものであれば制限なく用いることができる。ラムノシダーゼ活性を有する酵素としては、例えば、ナリンギナーゼやヘスペリナーゼが挙げられる。酵素処理条件は、用いる酵素の至適反応温度やｐＨなどを考慮して適宜決定することができる。例えば、ナリンギナーゼを用いる場合は、適切な試薬類を用いてｐＨを３．５～５の範囲に調整し、３０～６０℃、好ましくは３５～４５℃の範囲の温度で反応を行う。酵素処理後は、例えば溶液のｐＨを３に調整し８０℃以上で１０分間加熱するなど、公知の適切な手法を用いて酵素を失活させる。
生成されるＤＲＡ含有組成物中のＤＲＡ濃度は、原料におけるアクテオシド濃度、酵素添加量、反応時間等を適宜設定することにより、所望の濃度のものを得ることができる。
　酵素反応によって得られるＤＲＡ含有組成物中のＤＲＡの濃度、および残存アクテオシドの濃度は、当業者に知られた方法、例えばＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
　得られたＤＲＡ含有組成物から、ＤＲＡを分離精製して利用することもできる。ＤＲＡの分離精製方法は、溶媒抽出・クロマト分離などの当業者に知られた方法で適宜実施することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
調製例１．オリーブ抽出物の調製
　オリーブ果実のオイル搾りカス8 kgを、80℃の熱水32  Lで30分間ずつ2回抽出した。ナイロンメッシュ（日本理化学器械株式会社製、商品名:NRS-500）でろ過をした後、＃131（φ330 mm）ろ紙2枚＋200 gハイフロスーパーセル（ナカライテスク株式会社）を用いた吸引ろ過により搾りカスを除き、抽出液を得た。50％アセトンにて洗浄し水で平衡化したアンバーライトXAD7-HP樹脂（ローム・アンド・ハース・ジャパン（株））5 L（カラムサイズφ14×32 cm）に、この抽出液を全量負荷した。5 Lの水で洗浄後、20 Lの水、35 Lの15%エタノール水溶液、20 Lの60%エタノール水溶液で順次溶出した。15%溶出画分と60%溶出画分を各々減圧濃縮した後、凍結乾燥し、それぞれ37.2 gと66.0 gの分画物を得た。このうち、60%溶出画分から得られた分画物をオリーブ抽出物（アクテオシド含量9.1%）として後の動物実験に用いた。
調製例２．アクテオシドの調製
　オリーブ果肉の抽出エキス末（インデナ社製のオレアセレクト（商標）（Batch No.10219））100 gをメチルエチルケトン1200 mlと蒸留水600 mlに溶かし、3 L容の分液漏斗でよく振って、有機層を回収した。水層にメチルエチルケトン1200 mlを加えよく振って、有機層を回収し、更に同様の操作を繰返した。計3回分の有機層を合併し、濃縮、凍結乾燥を行い、52.5 gの乾燥物を得た。
　この乾燥物全量を200 mlの70%エタノール水溶液に溶解させ、更に水で10倍に希釈した後、水で平衡化した1 LのMCI GEL CHP-20P(三菱化学株式会社製、75-150 μm)に負荷した。10 Lの10％エタノール水溶液を流した後、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％、35％のエタノール水溶液で各1 Lずつ、さらに、2 Lの40％エタノール水溶液で順次溶出を行った（エタノール濃度はすべてV/V％）。12.5％から27.5%までの溶出液は250 mlずつ4フラクションに分画回収し、このうち20%溶出液の第4フラクションから25％溶出液の第3フラクションまでを合わせて濃縮して5.98  gの精製アクテオシドを得た。
実施例１．ＤＲＡの製造－１
　ナリンギナーゼ（Penicillium decumbens由来、300 units/g、シグマ社製）0.37 mgを0.1 M酢酸緩衝液（ pH 4.0） 1.68  mlに懸濁し、0.22 mg /mlの酵素液を調製した（略称：1/10）。この1/10酵素液を、0.1 M酢酸緩衝液（ pH 4.0）を用いて希釈し、3倍、10倍、30倍希釈の酵素液を調製した（それぞれの略称：1/30、1/100、1/300）。ねじ口ガラス試験管にそれぞれの酵素液を0.9 ml採取し、調製例２で得られた精製アクテオシドの50%エタノール水溶液（20 mg/ml）0.1 mlを添加し、40℃にて振とうした（100-130回/分、Water Bath Shaker MM-10型、大洋科学工業（株）（現在タイテック（株））製）。反応開始1、2、3、4、5、24時間後に0.1 ml採取し、除タンパクを目的にして、等量の氷冷したアセトニトリルを添加撹拌し、10分氷冷下に静置したのち、遠心分離をおこなった（10000回転、10分、5℃、微量高速冷却遠心分離機　MX-100型、（株）トミー精工製）。得られた遠心分離上清4μｌを下記の分析条件でのHPLC分析に供した。酵素無添加群の5、24時間目を同様に処理し、アクテオシドの安定性をチェックした（略称：Ez(-)）。また反応生成物がＤＲＡであることは、LC/MS分析によって確認した。
＜HPLC分析条件＞
システム：Waters　2690/2695　セパレーションモジュール、996　フォトダイオードアレイ検出器
カラム：Develosil（商標） RPAQUEOUS-AR-5 (3*150 mm)
移動相：Ａ：0.1% ギ酸-15%アセトニトリル／蒸留水、Ｂ：0.1% ギ酸-50%アセトニトリル／蒸留水
プログラム：0分（0% B）、30分（100％ B）
流速：0.43 ml/分
注入量：4 μｌ
検出波長：280 nm
　上記分析条件で、ＤＲＡは8.958±0.008分(n=24)、アクテオシドは9.348±0.009分(n=18)に溶出した。HPLCのピーク面積を指標にした経時的変化の結果を図１および図２に示す。アクテオシドの減少に伴い、ＤＲＡが生成することが確認された。
実施例２．ＤＲＡの製造－２
　調製例２で得られた精製アクテオシド4 gを100 mlの50%エタノール水溶液に溶解した。この溶解液全量を2 Lの0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.0）に加えて40℃に保ち、ナリンギナーゼ（Penicilliumdecumbens由来、300 units/g、シグマ社製）400 mgを添加した。40℃で3時間撹拌した後、ただちに反応液全量を、水で平衡化した700 mlのMCI GEL CHP-20P(三菱化学株式会社製、75-150 μm)に負荷した。2 Lの水で洗浄した後、2 Lの15％エタノール水溶液、1200 mlの20％エタノール水溶液を流した。続けて、22.5％、25％、27.5％のエタノール水溶液各750 mlで溶出し、それぞれ250 mlずつ3画分に分画した。さらに、 1250 mlの30％エタノール水溶液で溶出し、250 mlずつ5画分に分けた。このうち、27.5%溶出液の第1および第2画分を合せたもの、27.5%溶出液の第3画分から30%溶出液の第3画分までを合せたものを別々に濃縮し、それぞれ438 mgと1.562 gの乾燥物を得た。27.5%溶出液の第3画分から30%溶出液の第3画分の乾燥物を用いてMSおよびNMR解析を行い、ＤＲＡであることを確認した。
実施例３．ＤＲＡ含有オリーブ抽出物の製造－１
　蒸留水160 mlを40℃にインキュベートし、オリーブ果肉の抽出エキス末（インデナ社製　オレアセレクト（商標）（Batch No.10219））4 gの50％エタノール水溶液20 mlを添加して撹拌し（このときのpH 4.7）、氷酢酸を用いてpH 4.0に調整した。次に、ナリンギナーゼ（Penicilliumdecumbens由来、300 units/g、シグマ社製）40 mgの蒸留水懸濁液20 mlを加え、反応を開始した。0.5分、2分から30分まで2分間隔、60分から210分まで30分間隔に100 μl採取し、除タンパクを目的にして、等量の氷冷したアセトニトリル100 μlを添加して撹拌後、遠心分離をおこなった（10000回転、10分、5℃、微量高速冷却遠心分離機　MX-100型、（株）トミー精工製）。加温210分後の反応液のpHは4.1であった。また、酵素液の代わりに蒸留水を添加して同様に処理した試料を対照とした。得られた遠心分離上清4 μｌをHPLC分析に供し、ＤＲＡとアクテオシドのピーク面積を求めた。また、ＤＲＡとアクテオシドを用いて、50％アセトニトリルによる段階希釈液を調製し、同一条件で分析し、検量線を作成した（ＤＲＡ検量線のR2=0.9999、アクテオシド検量線のR2=1）。検量線の作成に用いたＤＲＡおよびアクテオシドの標品は、それぞれ実施例２、調製例２で得られたものを使用した。ピーク面積値と検量線から濃度を算出し、下記の算出式により元の試料中(分析時10 mg/ml相当）のＤＲＡおよびアクテオシド含量を求めた。結果を表１に示す。
＜HPLC分析条件＞
システム：Waters　2690/2695　セパレーションモジュール、996　フォトダイオードアレイ検出器
カラム：Develosil（商標）  RPAQUEOUS-AR-5 (3*150 mm)
移動相：Ａ：0.1% ギ酸-15%アセトニトリル／蒸留水、Ｂ：0.1% ギ酸-60%アセトニトリル／蒸留水
プログラム：0分（0% B）、30分（100％ B）
流速：0.43 ml/分
注入量：4 μｌ
検出波長：280 nm
＜算出式＞
　反応時の試料濃度は20 mg/ml、さらにアセトニトリルで２倍希釈しているので試料濃度は分析時10 mg/ml相当量であることから、含量（％）＝100*濃度（μg/ml）/10000（μg/ml）
表１は、ＤＲＡおよびアクテオシド含量の経時的変化を示すものである。アクテオシドの減少に伴い、ＤＲＡが生成することが確認された。
実施例４．ＤＲＡ含有オリーブ抽出物の製造－２
＜抽出＞
　オリーブ果実のオイル搾りカス2 kgを、80℃の熱水16 Lで2時間抽出した。ナイロンメッシュ（日本理化学器械株式会社製、商品名:NRS-500）でろ過をした後、＃131（φ330 mm）ろ紙2枚＋400 gハイフロスーパーセル（ナカライ株式会社）を用いた吸引ろ過により搾りカスを除き、抽出液を得た。
＜脱ラムノシル反応＞
　抽出液を40℃まで冷やし、酢酸32 mlを添加しpHを3.93まで下げた。水浴中で40℃に保ちながら、ナリンギナーゼ（Penicilliumdecumben由来、540 units/g、シグマ社製）130 mgを添加し、3.5時間反応した。反応を終了させるため、6 N硫酸35 mlを添加してpHを3.0に調整し、80℃で10分間加熱することにより酵素を失活させた。その後水浴にて40℃以下に冷却し、当量の4 N NaOH水溶液52.5 mlを添加した。
＜精製＞
　50％アセトンにて洗浄し水で平衡化したアンバーライトXAD7-HP樹脂（ローム・アンド・ハース・ジャパン（株））1 L（カラムサイズφ8×20 cm）に、上記の反応液を全量負荷した。2 Lの水で洗浄後、6 Lの15%エタノール水溶液、4 Lの60%エタノール水溶液で順次溶出した。この15%溶出画分と60%溶出画分を各々減圧濃縮した後、凍結乾燥し、それぞれ8.73 gと16.8 gの分画物を得た。このうち、60%溶出画分から得られた分画物を、ＤＲＡ含有オリーブ抽出物（ＤＲＡ含量8.9％）として後の動物実験に用いた。
実施例５．ＤＲＡの血中抗酸化活性
＜測定方法＞
　ＤＲＡの血中抗酸化活性におよぼす影響をラットを用いて評価した。血中抗酸化活性の評価にはFRAP、ORACを用いた。また、ＤＲＡおよびアクテオシドは、それぞれ実施例２および調製例２と同様の方法で調製したものを用いた。
　SD（IGS）系雄性ラット（6週齢）を日本チャールスリバー社より購入し、1週間試験環境で馴化させた後、順調な発育を示した動物を試験に供した。一晩絶食させたラットを各群3匹からなる5群に分けた。1群には0.5％ CMC溶液を、2群にはＤＲＡの0.5％ CMC懸濁液（0.8 mM）を、3群には精製アクテオシドの0.5％ CMC懸濁液（0.8 mM）を、4群にはオリーブオイル溶液（ナカライテスクcode.073-26）を、5群にはＤＲＡのオリーブオイル懸濁液（0.8 mM）を、それぞれ5 ml/kgの用量でゾンデを用いて経口投与した。1-3群は投与前、投与後0.5、1、3、6、9、24時間後に、4-5群は投与前、投与後1、3、6、9、24時間後に尾静脈よりヘパリン採血管に血液を採取し、遠心分離操作（8,000 rpm、10 min）により血漿サンプルを得た。後日血漿FRAP活性およびアセトン除タンパク処理後上清のORAC活性を測定した。
　結果を図３～図６に示す。アクテオシド投与群では血中の抗酸化活性の上昇はほとんど認められなかったが、ＤＲＡ投与群では投与後に血中抗酸化活性の明らかな上昇が認められた。特にFRAP活性で見ると、投与初期（1-3時間後）と9時間目に2相性の抗酸化活性のピークを認めたことから、ＤＲＡが徐放的な作用を有することが確認できた。
実施例６．体内吸収
　実施例５で血中抗酸化活性の測定用に採取した血漿サンプルのうち、1群（0.5％ CMC溶液投与群）、2群（ＤＲＡの0.5％ CMC懸濁液投与群）、3群（アクテオシドの0.5％ CMC懸濁液投与群）の血漿の一部を使用して、各サンプル投与時の血中濃度の測定を行った。
＜測定方法＞
　各群3匹の血漿を等量混合し均一にした後、血漿90 μlにカタツムリ由来のβ-グルクロニダーゼ/アリルスルファターゼ/酢酸緩衝液（pH 5.0） 90 μlを添加し、37℃で1時間インキュベーションを行った。アセトニトリル900 μlを添加し反応を終了、続いて1%アスコルビン酸水溶液10 μl、内部標準容液10 μlを添加し混合し、遠心分離操作（15,000 rpm、10 min）後の上清を回収した。回収した上清を減圧濃縮後、50% メタノールに再溶解しフィルターろ過してLC-MS/MSに付してアクテオシド、ＤＲＡおよびヒドロキシチロソール、カフェ酸の定量を行った。アクテオシド、ＤＲＡ、ヒドロキシチロソール、カフェ酸量は、ピーク面積と、内部標準として用いたヘスペリジン（Wako）のピーク面積との比により決定した。LC-MS/MS分析条件を以下に示す。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
　カラム：ACQUITY BEH18 （1.7 μm、2.1Φ×100 mm、日本ウォーターズ）
　移動相：A；0.1% ギ酸水溶液、B；アセトニトリル
　流速：0.30 ml/min
　グラジエント：Ｂ液が5％で5分間、その後5分間でＢ液が5％から10％、2分間Ｂ液が10％を維持、その後7分間でＢ液が10％から24％、さらに4分間でＢ液が24％から80％のリニアグラジエント
＜ＭＳ/ＭＳ分析条件＞
　測定モード：選択反応モニタリング
　検出
　：アクテオシド（保持時間約17.4分）；前駆イオンm/z=623（[M-H]-）、生成イオンm/z=161　
　：ＤＲＡ（保持時間約17.0分）；前駆イオンm/z=477（[M-H]-）、生成イオンm/z=161
　：ヒドロキシチロソール（保持時間約3.1分）；前駆イオンm/z=153([M-H]-)、生成イオンm/z=123
　：カフェ酸（保持時間約8.1分）；前駆イオンm/z=179([M-H]-)、生成イオンm/z=135
　：ヘスペリジン（保持時間約18.7分）；前駆イオンm/z=609([M-H]-)、生成イオンm/z=301
　イオン化法：ESI法
　結果を図７、図８、図９に示す。アクテオシドを投与した際のアクテオシドの最大血中濃度（Cmax）は1 μMにも満たなかったが、代謝物としてヒドロキシチロソールおよびカフェ酸が検出された。ヒドロキシチロソールの最大血中濃度（Cmax）は11.7 μM、カフェ酸の最大血中濃度（Cmax）は0.7 μMであった。これに対してＤＲＡを投与した際のＤＲＡの最大血中濃度（Cmax）はやはり1 μMにも満たなかったが、代謝物としてヒドロキシチロソールおよびカフェ酸が高濃度検出された。ヒドロキシチロソールの最大血中濃度（Cmax）は32.8 μM、カフェ酸の最大血中濃度（Cmax）は7.3 μMであった。
　アクテオシド、ＤＲＡどちらもそのままの形で吸収、血中移行しておらず、代謝物であるヒドロキシチロソールやカフェ酸として体内に存在していたため、ヒドロキシチロソールおよびカフェ酸のAUCを用いて体内吸収量を比較した結果を図１０に示す。ＤＲＡの体内吸収量は、ヒドロキシチロソールのAUCで比較するとアクテオシドの約3倍、カフェ酸のAUCで比較すると約13倍上昇した。
　以上の結果より、ＤＲＡはアクテオシドに比べて、体内吸収量が増加し、代謝物であるヒドロキシチロソールおよびカフェ酸のもつさまざまな生理活性が高いことが示唆された。
実施例７．血中抗酸化作用の含量依存性評価
　ＤＲＡを様々な濃度で含有するオリーブ抽出物の血中抗酸化作用を比較した。
＜測定方法＞
　SD（IGS）系雄性ラット（6週齢）を日本チャールスリバー社より購入し、1週間試験環境で馴化させた後、順調な発育を示した動物を一晩絶食させ、各群4匹からなる5群に分けた。実施例２と同様の方法で製造したＤＲＡと、調製例１で得られたオリーブ抽出物を用いて、ＤＲＡ含有オリーブ抽出物を調製した。このＤＲＡ含有オリーブ抽出物をオリーブオイルに溶解させて、ＤＲＡを0、0.5、1、2、5%含有する投与液を作成し、5 ml/kgの用量でゾンデを用いて経口投与した。投与前、投与後1、3、6、9、24時間後に尾静脈よりヘパリン採血管に血液を採取し、遠心分離操作（8,000 rpm、10 min）により血漿サンプルを得た。後日血漿FRAP活性を測定した。
　結果を図１１に示す。ＤＲＡの含量依存的に血中抗酸化活性は上昇し、2％以上の濃度で明らかな血中抗酸化活性の上昇作用を認めた。
実施例８．血中抗酸化活性
　オリーブ抽出物の脱ラムノシル反応有無による血中抗酸化活性をFRAP活性により比較した。
＜測定方法＞
　サンプルは、実施例４で調製したＤＲＡ含有オリーブ抽出物（ＤＲＡ含量8.9％）と、実施例４の工程のうち、脱ラムノシル反応のみを行わず、他の工程は同様に処理した酵素未処理のオリーブ抽出物（アクテオシド含量9.1％）を用いた。
　SD（IGS）系雄性ラット（6週齢）を日本チャールスリバー社より購入し、1週間試験環境で馴化させた後、順調な発育を示した動物を試験に供した。一晩絶食させたラットを各群4匹からなる3群に分け、1群にはオリーブオイル溶液、2群にはＤＲＡ含有オリーブ抽出物のオリーブオイル懸濁液、3群には酵素未処理オリーブ抽出物のオリーブオイル懸濁液をそれぞれ500 mg/5 ml/kgの用量でゾンデを用いて経口投与した。投与前、投与後1、3、6、9、24時間後に尾静脈よりヘパリン採血管に血液を採取し、遠心分離操作（8,000 rpm、10 min）により血漿サンプルを得た。後日血漿FRAP活性を測定した。
　結果を図１２に示す。酵素処理によりＤＲＡ含量を高めることで抗酸化活性を上昇させることが確認できた。
実施例９．ＤＲＡの徐放性
　試験動物および投与液は実施例８と同様の方法にて準備した。投与は、500 mg/5 ml/kgの用量を24時間間隔で5日間連続投与し、最終投与9時間後にヘパリン採血管に血液を採取し、遠心分離操作（8,000 rpm、10 min）により血漿サンプルを得た。後日血漿FRAP活性を測定した。
　結果を図１３に示す。ＤＲＡ含有オリーブ抽出物投与群で酵素処理をしないオリーブ抽出物投与群と比較して、最終投与9時間後の血中抗酸化活性の有意な上昇が認められ、ＤＲＡの徐放性が確認された。　
製剤例１．錠剤
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1粒あたり配合量）
ＤＲＡ含有オリーブ抽出物（ＤＲＡ含量8.9％）　　　　25 mg 
無水ケイ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5 mg
微結晶セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　　 120 mg
マルチトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 150 mg
上記各成分を均一に混合し、単発式打錠機にて打錠し、径10 mm、1粒300 mgの錠剤を製造した。1日あたり4粒を推奨摂取量とする。

製剤例２．顆粒剤
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（スティック1本あたり配合量）
ＤＲＡ含有オリーブ抽出物（ＤＲＡ含量8.9％）　　　　　150 mg
トウモロコシデンプン　　　　　　　　　　　　　　　　　400 mg
マルチトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000　mg
上記各成分を均一に混合した後に10％ハイドロキシプロピルセルロース・エタノール溶液100 mlを加え、常法通り練和し、押し出し、乾燥して顆粒剤を得た。このスティック1.5g/本を1日あたり1本摂取する。

製剤例３．ソフトカプセル剤
　一粒あたり配合量　1日２粒を推奨摂取量とする。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（重量％）
ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　70.0
グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　29.7
カラメル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.3
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100
上記成分からなるソフトカプセル剤皮の中に、以下に示す組成物を常法により充填し、1粒300 mgのソフトカプセルを得た。このソフトカプセル1日２粒を推奨摂取量とする。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（一粒あたり配合量）
ＤＲＡ含有オリーブ抽出物（ＤＲＡ含量8.9％）　　　50 mg
ビーワックス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.02　ml
オリーブオイル　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.1 ml

製剤例４.ドリンク剤
呈味：ＤＬ－酒石酸ナトリウム　　　　　　　　　0.1 g
コハク酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.009 g
甘味：液糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　800 g
ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　10 g
ＤＲＡ含有オリーブ抽出物（ＤＲＡ含量8.9％） 　1 g
ビタミンＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　　30 g
シクロデキストリン　　　　　　　　　　　　　 　5 g
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 ml
塩化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　 　1 g
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　 0.5 g
上記成分を配合し、水を加えて10 Lとした。このドリンク剤は、1回あたり約100 mlを飲用する。
　本発明によれば、生体内で高い抗酸化作用を長時間発揮する飲食品、医薬部外品及び医薬が提供される。

Claims (14)

  1. 　脱ラムノシルアクテオシドを含むオリーブ抽出物。
  2. 　脱ラムノシルアクテオシドを０．１重量％以上含む、請求項１記載のオリーブ抽出物。
  3. 　脱ラムノシルアクテオシドを１重量％以上含む、請求項２記載のオリーブ抽出物。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項記載のオリーブ抽出物を配合した組成物。
  5. 　組成物が飲食品である、請求項４記載の組成物。
  6. 　脱ラムノシルアクテオシドを０．１重量％以上含む、飲食品。
  7. 　オリーブ抽出物を含む、請求項６記載の飲食品。
  8. 　脱ラムノシルアクテオシドを含む血中抗酸化剤。
  9. 　脱ラムノシルアクテオシドを０．１重量％以上含む、請求項８記載の血中抗酸化剤。
  10. 　請求項８又は９記載の血中抗酸化剤を配合した組成物。
  11. 　組成物が飲食品である、請求項１０記載の組成物。
  12. 　脱ラムノシルアクテオシド含有組成物の製造方法であって、
    　アクテオシド含有組成物を脱ラムノース活性を有する配糖体加水分解酵素で処理する工程、
    　を含む、前記製造方法。　
  13. 　アクテオシド含有組成物がオリーブ抽出物である、請求項１２記載の製造方法。
  14. 　配糖体加水分解酵素がナリンギナーゼである、請求項１２または１３記載の製造方法。
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