WO2013127146A1

WO2013127146A1 - 一种能够缓解铅毒性的植物乳杆菌及其用途

Info

Publication number: WO2013127146A1
Application number: PCT/CN2012/078799
Authority: WO
Inventors: 田丰伟; 陈卫; 翟齐啸; 张灏; 赵建新; 王刚; 宋元达; 张秋香; 刘小鸣; 郭敏; 范大明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2013-09-06
Anticipated expiration: 2014-08-28
Also published as: US9320766B2; US20140369981A1; EP2708599A1; EP2708599B1; CN102586148B; CN102586148A; EP2708599A4

Description

说明书

一种能够緩解铅毒性的植物乳杆菌及其用途本发明要求申请日为 2012年 02月 28日、申请号为 CN 2012100463235 的中国发明专利申请为优先权。

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种能够緩解铅毒性的植物乳杆菌，本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途。

【背景技术】

铅是一种对人体健康极其有害的重金属。其具有的独特理化性质使其获得广泛的应用，在工业上是一种重要的化学材料，从而进入了人类生活的方方面面；但是，它又是一种对多个脏器具有毒性的金属元素，在人体内无任何生理作用，理想血铅浓度应为零。随着工业、农业、交通、油漆、印刷及电子产业的迅速发展，空气、土壤、水及食物都不同程度地受到了铅污染。长期铅暴露使人们对铅的接触和吸收在逐渐增加，导致体内铅蓄积。铅能够作用于全身各个系统和器官，它的毒性与其化合物的形态和溶解度有关，但主要涉及造血、心血管、消化、泌尿、免疫等系统，直接危害人体的健康，其中对神经系统、肾脏、造血系统和血管等的损害最为显著。铅中毒患者会出现腹痛、腹泻、呕吐、头痛、头晕、昏迷等症状，并造成血管痉挛，肝肾损伤等生理病症。

对于由铅蓄积和铅中毒引起的各种生理病症，传统的疗法主要采用依地酸二钠钙、二巯基丁二酸钠等螯合剂进行注射治疗，以达到排铅的目的，例如中国药典第二版（ 2000年）记载了依地酸二钠钙作为铅和镉等重金属中毒的解毒剂。然而，这些药物都存在着一定的毒副作用。依地酸二钠钙是一种广谱性络合剂，具有较强的肾毒性，且用药时会经尿排出大量人体不可缺少的微量元素，例如锌、铜、锰、铁等，而这些元素与很多酶的活性有关，因此大量使用依地酸二钠钙会危及人的身体健康。二巯基丁二酸钠可能导致消化系统功能紊乱，并造成头痛、恶心、四肢酸痛等症状。

鉴于传统治疗方法存在的多种问题，针对铅蓄积和铅中毒寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、保护肝脏并增强肝脏的解毒等功能。因此探索乳酸菌在緩解铅毒性效应中的效果就可以进一步地挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策略緩解铅中毒效应开辟出新的途径和解决方案。

目前，一些专利文献涉及排铅保健食品及其制备方法，例如 CN 101933937A公开了一种具有自然螯合功能，而可以将动物体内的铅离子排出体外的低分子柑桔果胶； CN101011432 涉及蕨菜黄酮提取物在作为排铅和緩解铅中毒药物中的应用； CN1506070提供了一种含水苏糖的排铅保健品。但是，目前涉及具有緩解铅中毒效应的乳酸菌专利申请文件不多，例如 CN101134945A公开了一种肺炎克雷伯氏菌 Z-KAE15 , 它对铅具有高耐受性、高吸附性，它应用于环境工程技术领域中。另夕卜， CN101252943A 公开了一些植物乳杆菌，它用于促进哺乳动物吸收铁、锌、钙、镁离子。

因此，筛选出一种具有緩解铅毒性功能的乳酸菌，并且证明它们在动物模型中具有良好的緩解铅中毒作用，同时研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。

本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题】

本发明的目的是提供一种植物乳杆菌（ Lactobacillus plantarum ) CCFM8661。本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌 CCFM8661的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种乳酸菌，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌（ Lactobacillus plantarum ) CCFM8661 , 该菌菌株已于 2011年 11月 29日在北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.5494。

所述的植物乳杆菌 CCFM8661具有下述性质：

(1)具有耐酸性，在 pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在 pH2.5环境下存活良好；

(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力；

(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；

(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与緩解铅暴露小鼠铅毒性的作用。本发明还涉及所述的植物乳杆菌 CCFM8661在制备緩解铅中毒的药物组合物与发酵食品中的用途。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌 CCFM8661菌剂与在药学上可接受的载体组成的。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌 CCFM8661 菌剂是将含有所述植物乳杆菌 CCFM8661的菌液通过常规冷冻干燥工艺或其它工艺制备所得到的粉剂，它含有 10⁶ CFU/g以上的活性植物乳杆菌 CCFM866L

根据本发明的另一种优选实施方式，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶嚢剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌 CCFM8661菌种的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：

A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计 87.7%水将 10%酶水解脱脂乳、 0.5%葡萄糖、 1.5%胰蛋白胨与 0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其 pH为 6.8 , 这样得到所述的培养基；

B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料混合制备得到含有 100 g/ L 脱脂奶粉、 30 mL/ L甘油、 100 g/ L麦芽糊精、 150 g/ L海藻糖、 10 g/ L L- 谷氨酸钠的保护剂；

C、将植物乳杆菌 CCFM8661菌种按照以所述培养基的重量计 2-4% 接种量接种到在温度 110-120°C下灭菌 8-12 min的所述培养基中，在温度 37 °C的条件下培养 18 h, 用 pH7.2磷酸盐緩沖液清洗 2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度 10^1Q CFU/ml; 接着，让该悬浮液在温度 37 的条件下预培养 60 min, 再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种植物乳杆菌（ Lactobacillus plantarum ) CCFM8661 , 该菌菌株已于 2011年 11月 29日在北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No. 5494。

本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌、 Lactobacillus plantarum ) CCFM8661具有下述性质：

(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有较好的耐受能力； (3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；

(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与緩解铅暴露小鼠铅毒性的作用。下面将详细描述这些实验与分析认证结果。

1、具有耐酸性，在 pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在 pH2.5环境下存活良好

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌 CCFM8661接种于 MRS培养基 (例如青岛海博生物技术有限公司的产品）中，在温度 37 °C的条件下培养 24 h,再经 MRS培养液传代培养 2 ~ 3次后，取 1 mL植物乳杆菌 CCFM8661 培养液，分别接种于 19 mL 不同 pH值（3.0-9.0 )的 MRS液体培养基中，在温度 37 °C的条件下培养 24 h, 测定初始和培养结束后的 OD₆。。值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的生长情况。

OD₆。。值是采用分光光度法在波长 600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。这些试验结果证明，植物乳杆菌 CCFM8661在 pH3.0-9.0的环境中生长良好，因此得以进行后续实验。

采用与前面所述的同样培养方式培养得到植物乳杆菌 CCFM8661培养物。其菌体用 1.0 mL pH7.2 PBS (磷酸盐緩沖液)清洗两次，再用 1.0 mL pH7.2磷酸盐緩沖液重悬，其重悬液与 9.0 mL pH 2.5人工胃液混合，然后在温度 37°C的条件下进行培养，分别在开始 (Oh)和 3h时取样，用 MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在第 3h时的活菌数对数值与在第 Oh时活菌数对数值之比，以％表示。本发明筛选存活率在 80%以上的菌株进行后续研究。

实验结果表明，植物乳杆菌 CCFM8661在 pH2.5的人工胃液环境中的存活率在 90%以上。由此可见，植物乳杆菌 CCFM8661具有耐酸性，在 pH2.5的环境下存活良好。

2、在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力

通过乳杆菌在不同铅含量培养基中的生长曲线可以研究其在体外对铅离子的耐受能力。在无菌条件下，向 1L水中加入 0.20g氯化铅，即得到浓度为 150mg/L的铅离子水溶液。使用这种铅离子水溶液溶解 MRS固体培养基干粉得到含 150mg/L铅离子的 MRS液体培养基。同样地，分别配制 50mg/L、 500mg/L铅离子浓度的 MRS液体培养基。按照以含铅离子的 MRS液体培养基重量计 2%接种量将进入稳定期的植物乳杆菌 CCFM8661菌液接种于所述含铅离子的 MRS液体培养基中。在其培养过程中，分别在 0h、 2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 16h、 20h、 24h时进行标准平板计数，从而得到如附图 1所示的植物乳杆菌 CCFM8661生长曲线。

附图 1的结果表明，本发明植物乳杆菌 CCFM8661对铅离子的具有良好的耐受能力。

3、在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力

在无菌条件下，按照耐酸性（在 pH3.0能够生长）的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出 7株乳酸菌。这 7株乳酸菌及作为对照菌株的 1株大肠杆菌、 1株枯草芽孢杆菌进行了纯化和活化培养。将上述菌株转移至 150mg/L铅溶液中，使菌体最终浓度达到 lg/L。将含有上述菌株的样品在 37°C下培养 1 h, 使用 Beckman离心机以 6000 r/min 离心 20min, 再用无菌水洗涤、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解 20min, 得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪（ Spectr AA 220, Varian, USA ), 按照 Yeager等人所述方法 ( Yeager D. W., Cholak J., Henderson E. W. Determination of lead in biological and related materials by atomic absorption spectrometry. Environmental Science and Technology 1971； 5： 1020-1022. )测定铅离子含量，以确定各菌株对铅离子的吸附能力。这些测定结果列于附图 2中。

附图 2清楚地表明，与其它试验菌株和对照菌株相比，本发明植物乳杆菌 CCFM8661对铅离子的吸附量最大，因此，对铅离子具有良好的吸附能力。

4、对铅暴露小鼠具有緩解铅毒性的效应

取 20-25g健康雄性昆明小鼠 40只，随机分为 4组：阴性对照组，醋 S史铅模型对照组，植物乳杆菌 CCFM8661治疗组与依地酸二钠钙阳性治疗对照组。阴性对照组进水为普通饮用水；其余 3组的进水为 lg/L醋酸铅溶液，在造成铅暴露染毒模型后，植物乳杆菌 CCFM8661治疗组每日灌喂本说明书实施例 3制备的浓度 2.0xl0⁹cfu/mLCCFM8661脱脂乳悬液，阳性对照治疗组每日腹腔注射 5g/L依地酸二钠钙药剂。实验结束后取血并处死小鼠，分别取肝、胃、肾，在按照与前面所述的相同消化处理后，采用上述 Yeager等人描述的原子吸收分光光度法测定铅含量。这些测定结果列于附图 3中。

通过对铅暴露染毒模型组及共同喂食铅及植物乳杆菌 CCFM8661组小鼠体内血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，以及机体抗氧化指标（SOD, MDA ) 的比较，发现本发明植物乳杆菌 CCFM8661能够降低小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，并显著改善小鼠机体的抗氧化指标。

环境中的铅通常经食物和呼吸途径进入人体，对消化、神经、呼吸和免疫系统造成急性或慢性毒性影响，往往导致肠绞痛、贫血和肌肉瘫痪等病症，严重时可发生脑病，甚至导致死亡。因此，通常根据职业性慢性铅中毒诊断标准 GBZ37-2002确定人体是否铅中毒。

在本发明中，术语 "緩解铅毒性" 应该理解是能够使机体内的铅中毒现象减轻或消失的过程。依据卫生部在 2003年颁布的《保健食品检验和评价技术规范》，通过实验研究证明，使用含有本发明植物乳杆菌 CCFM8661菌剂的药物组合物能够降低铅中毒小鼠的血、肝脏、肾组织中的铅含量，緩解机体氧化应激减轻铅中毒小鼠的病理症状，提高小鼠体内谷胱甘肽含量，降低丙二醛含量，具有促进排铅的保健功能。

研究结果表明，本发明的植物乳杆菌 CCFM8661具有下述性能：

(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力；

(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；

(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与緩解铅暴露小鼠铅毒性的作用。本发明的植物乳杆菌 CCFM8661具有下述生物学特性：菌体特征：呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约 0.5-1.0μηι宽， 2-4μηι 长，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。

菌落特征：在 MRS培养基上形成明显的菌落，直径在 0.3-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。

生长特性：该菌株的最低生长温度为 20°C , 最高生长温度为 40 °C , 在温度 30-37 °C下生长最佳，最高和最低初始生长 pH为 9.0和 2.5 , 最适生长初始 pH为 6.0; 本发明植物乳杆菌 CCFM8661菌株的延迟期相对较短， 4 h左右开始进入对数生长期， 12 h就达到稳定期。

本发明植物乳杆菌保存方法：

所述植物乳杆菌 CCFM8661原始菌种在温度 - 75°C下以 30 %重量百分数的甘油悬液形式保存，或者在温度 4 °C下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。

本发明植物乳杆菌 CCFM8661培养方法与培养条件：在 MRS培养基中在兼性厌氧条件与温度 37°C的条件下培养 18-36 h即可使用。

本发明还涉及所述的植物乳杆菌 CCFM8661在制备緩解铅毒性的药物组合物与发酵食品中的用途。

所述的药物组合物是植物乳杆菌 CCFM8661菌剂与在药学上可接受的载体组成的。

根据本发明，所述的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂是采用通常的冷冻干燥制备技术将含有所述的植物乳杆菌的菌液制成的冻干粉剂，或是采用其它方法如喷雾干燥法制备得到的粉剂。

所述的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂含有 10⁶ CFU/mL以上的活性植物乳杆菌 CCFM8661。

植物乳杆菌 CCFM8661含量测定方法是本技术领域的技术人员熟知的 MRS平板菌落计数法。

在所述的药物组合物中，所述植物乳杆菌 CCFM8661菌剂的量是所述药物组合物重量的 15-35% , 优选地是 18-32% , 更优选地是 20 - 30%。

根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，例如是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。

根据本发明，所述的填充剂应该理解是用来增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂；或者应该理解是用以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。

所述的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、酸钙或微晶纤维素。

优选地，所述的填充剂选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素。

更优选地，所述的填充剂选自淀粉或微晶纤维素。

根据本发明，所述的润湿剂应该理解是药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。

所述的润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。

优选地，所述的润湿剂选自水、乙醇或淀粉。

本发明使用润湿剂的量是以所述药物组合物总重量计 0. 1 -3. 0%。根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当原料药物本身无粘性或粘性不足时，需加入粘性物质以便于制粒，这种粘性物质称为粘合剂。

所述的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。优选地，所述的粘合剂选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。更优选地，所述的粘合剂选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

本发明使用粘合剂的量是以所述药物组合物总重量计 0. 5 -5. 0%。根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。人们知道，片剂经过压缩后的硬度大，如果其中不含有可以促进崩解作用的辅料，它在胃肠道中崩解很慢, 影响疗效。

所述的崩解剂选自羧曱基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧曱基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。

优选地，所述的崩解剂选自羧曱基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧曱基纤维素、琼脂或碳酸氢钠。

更优选地，所述的崩解剂选自羧曱基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧曱基纤维素或碳酸氢钠。

本发明使用崩解剂的量是以所述药物组合物总重量计

5. 0 - 15. 0%。

根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，防止片剂材料粘附在制片机模子上，有利于片剂脱模的化学物质。

所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。

优选地，所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。更优选地，所述的润滑剂选自滑石粉或硬脂酸钙。

本发明使用润滑剂的量是以所述药物组合物总重量计 0. 5-3. 0%。根据本发明，所述的矫味剂应该理解是在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物强烈苦味或其它异味，例如辛辣、刺激等的药用辅料。

所述的矫味剂例如选自单糖浆、蔗糖、卵磚脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、曱基纤维素或羧曱基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

优选地，所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶或羧曱基纤维素钠的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

更优选地，所述的矫味剂选自蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬油芳香剂；海藻酸钠或阿拉伯胶的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

本发明使用矫味剂的量是以所述药物组合物总重量计 0. 5%- 2. 0%。本发明的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶嚢剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂及其用量对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。

在本发明中，采用制药技术领域的普通技术人员熟知的普遍使用的方法和设备制备本发明药物颗粒剂、胶嚢剂、片剂、丸剂或口服液。

所述的 "剂型" 一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂。

在本发明中，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌 CCFM8661菌种的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。。

所述发酵剂的制备方法如下：

A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计 87.7%水将 10%酶水解脱脂乳、 0.5%葡萄糖、 1.5%胰蛋白胨与 0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其 pH为 6.8, 这样得到所述的培养基；

B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料制备得到含有 100 g/ L脱脂奶粉、 30 mL/ L甘油、 100 g/ L麦芽糊精、 150 g/ L海藻糖、 10 g/ L L-谷氨酸钠的保护剂；

C、将植物乳杆菌 CCFM8661按照以所述培养基的重量计 2-4%接种量接种到在温度 110-120°C下灭菌 8-12 min的所述培养基中，然后在温度 37 °C的条件下培养 18 h, 用 pH7.2磷酸盐緩沖液清洗 2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度 10^1GCFU/ml; 接着，让该悬浮液在温度 37 的条件下预培养 60 min, 再采用冻干法制成所述的发酵剂。

所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。

在本发明中，所述的牛奶应该理解是牛乳、马乳或还原乳。所述的还原乳是用以还原乳总重量计 10-15%奶粉与 85-90%软化水配制的。所述的奶粉是目前市场上广泛销售的产品。所述的酸奶油是稀奶油经乳酸菌发酵制成的奶油。酸奶油比甜奶油有更多的优越性，香味更浓郁，奶油产量也更高；另外由于乳酸菌抑制了有害微生物，所以消毒杀菌后再次污染微生物的风险也较低。

所述的干酪是由牛奶经发酵制成的一种营养价值很高的食品。

所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱。它们都是我国的传统食品或调味口口。

所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

在生产乳制品、豆制品与果蔬制品时，按照下述方法使用本发明的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂发酵剂：

通常，在生产乳制品、豆制品和果蔬制品的常规生产过程中，把本发明的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂发酵剂按照常规使用量接种到待处理的原料中，在能够使所述植物乳杆菌 CCFM8661繁殖的温度、压力下进行发酵或存活，其代谢产物使发酵制品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时使产品延长了保藏时间，改善了产品营养价值和消化性。

[有益效果】

本发明的植物乳杆菌 CCFM8661具有耐酸性，在体外对铅离子有良好的耐受能力，能够耐受起始浓度为 150mg/L的铅离子溶液。并且对铅离子有较强的吸附作用，可降低小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，显著改善小鼠机体的抗氧化指标，緩解铅中毒小鼠的病理症状。所述的植物乳杆菌 CCFM8661用于制备緩解铅中毒的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

【附图说明】

图 1是植物乳杆菌 CCFM8661于含起始浓度为 50mg/L, 150mg/L, 500mg/L的铅离子培养基中的生长曲线；

图 2是乳酸菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌对铅离子的吸附情况。

其中： CCFM8661、 14、 ST-3为植物乳杆菌； 2-2 为加氏乳杆菌； 2-3 为鼠李糖乳杆菌 LGG; 22 为两歧双歧乳杆菌； 2-3为德氏乳杆菌。

7/ n //7/ 枯草芽孢杆菌、 E.coli、大肠杆菌）作为实验对照菌株。图 3 是植物乳杆菌 CCFM8661对铅暴露小鼠血液，肝脏，肾脏，胃中铅水平的降低作用；

a, b, c, d表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异（P<0.05 )。

【具体实施方式】

实施例 1: 植物乳杆菌 CCFM8661对铅离子的耐受能力实验

在无菌条件下，向 1L水中加入 0.20g氯化铅，得到 150mg/L的铅离子水溶液。使用这种铅离子水溶液溶解 MRS培养基固体配料，得到含 150mg/L铅离子的 MRS液体培养基。 MRS培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温 80、硫酸镁、硫酸锰， pH 6.2 ~ 6.4。

以与前面描述的同样方式配制含有 50mg/L与 500mg/L铅离子浓度的 MRS液体培养基。将进入稳定期的植物乳杆菌 CCFM8661按照以含铅的 MRS液体培养基重量计 2%接种量接种于所述的含铅 MRS液体培养基中，在温度 37°C的条件下进行培养，分别在 0h、 2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 16h, 20h、 24h时取样，进行标准平板计数，得到如附图 1所示的植物乳杆菌 CCFM8661生长曲线。另夕卜，将 1 mL所述的菌液接入不含铅的 MRS液体培养基中，在同样条件下进行培养并计数，其结果作为空白对照结果，这些试验结果也列于附图 1中。

由附图 1可以看出，在 150mg/L铅离子浓度下，植物乳杆菌 CCFM8661 虽然在开始时生长受到抑制，但随后其生长量迅速增加，在 24h时生长量甚至超过了空白对照组，因此，其结果表明植物乳杆菌 CCFM8661对铅离子具有良好的耐受能力。实施例 2: 植物乳杆菌 CCFM8661对铅离子的吸附能力实验

按照耐酸性（在 pH3.0环境中能够生长）的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出 7株乳酸菌，将这 7株乳酸菌与作为对照菌株的 1株大肠杆菌和 1株枯草芽孢杆菌在无菌条件下进行纯化和活化，纯化和活化时乳酸菌使用 MRS培养基，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌使用 LB培养基。 LB培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、 NaCl、琼脂， pH7.0。另外，所述的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌还需置于摇床中在温度 37 °C的条件下分别进行好氧培养 12h和 16h。将这些活化菌液振荡均匀，以转速 6000 r/min进行离心 15min。得到的菌体转移到装有 150mg/L铅离子浓度溶液的容器中，而空白组则转移到去离子水中。根据菌体质量确定蓝盖瓶中液体的体积，使菌体的最终浓度达到 lg/L。将以上样品于温度 37°C下培养 1 h。使用 Beckman离心机以转速 6000 r/min离心 20min, 再用无菌水洗涤、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解 20min, 得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪（ Spectr AA 220, Varian, USA )按照 Yeager 等人所述方法 ( Yeager D. W., Cholak J., Henderson E. W. Determination of lead in biological and related materials by atomic absorption spectrometry. Environmental Science and Technology 1971； 5： 1020-1022. ) 测定铅离子含量，以确定不同菌株吸附铅离子的能力。

其试验结果如附图 2所示。由附图 2可以看出，不同的菌种对铅离子的吸附能力差异较大。其中植物乳杆菌 CCFM8661的吸附能力最强，可吸附 4955.1 g/g铅离子，而大肠杆菌对铅离子的吸附能力较差，只能吸附 398 g/g的铅离子，其吸附能力远低于本发明的植物乳杆菌 CCFM8661。实施例 3: 植物乳杆菌 CCFM8661灌喂小鼠的耐受剂量实验

将植物乳杆菌 CCFM8661冻干菌粉重悬于脱脂乳粉中，制成浓度为 2.0x l0⁹cf /mL的悬液。取约 20g健康雄性昆明小鼠 10只，每日给予该浓度悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。这些试验结果列于表 1中。

表 1 : 喂食浓度 2.0x l0⁹cfu/mL的植物乳杆菌 CCFM8661

对小鼠体重的变化情况

时间（天） 1 2 3 4 5 6 7 体重（g ) 21.2±1.5 21.9±2.1 22.5±2.2 23.5±2.1 24.2±1.9 24.9±1.9 25.7±1.8 死亡情况 - - - - - - 注： - ：小鼠无死亡

表 1 中的这些结果表明，喂食浓度 2.0x l0⁹cfu/mL的植物乳杆菌 CCFM8661未对小鼠造成明显影响，体重明显上升，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。

实施例 4:植物乳杆菌 CCFM8661对铅暴露小鼠体内铅水平的降低作用

取 20-25g健康雄性昆明小鼠 40只，随机分为 4组：阴性对照组，醋 S史铅模型对照组，植物乳杆菌 CCFM8661治疗组与依地酸二钠钙阳性治疗对照组。阴性对照组进水为普通饮用水；其余 3组的进水为 lg/L醋酸铅溶液。在造成铅暴露染毒模型后，植物乳杆菌 CCFM8661治疗组小鼠每日灌喂实施例 3制备的浓度 2.0x l0⁹cf /mLCCFM8661脱脂乳悬液，阳性对照治疗组小鼠每日腹腔注射 5g/L依地酸二钠钙药剂。实验结束后取血并处死小鼠，分别取肝、胃、肾，采用实施例 1描述的消化方法进行消化后，按照实施例 2采用的原子吸收分光光度法测定其铅含量。

这些试验结果如附图 3所示。由附图 3可以看出，本发明的植物乳杆菌 CCFM8661治疗组和依地酸二钠钙阳性治疗对照组中小鼠血液、肝脏、胃、肾脏中的铅含量均比阴性对照组高，但均低于铅模型对照组。本发明植物乳杆菌 CCFM8661治疗组相对于铅模型对照组，其血液及各器官中的铅含量明显低，均具有显著性（ P < 0.05 ), 这也说明植物乳杆菌 CCFM8661 干预确实具有降低铅暴露小鼠体内铅含量的作用。实施例 5:植物乳杆菌 CCFM8661对铅暴露导致氧化损伤的恢复作用取 20-25g的健康雄性昆明小鼠 40只，随机分为 4组：阴性对照组，醋酸铅模型对照组，本发明植物乳杆菌 CCFM8661治疗组与依地酸二钠钙盐（EDTANa₂Ca ) 阳性治疗对照组。阴性对照组进水为普通饮用水；其余 3组的进水为 lg/L醋酸铅溶液，在造成铅染毒模型后，本发明植物乳杆菌 CCFM8661治疗组每日灌喂实施例 3制备的浓度 2.0x l0⁹cf /mL的 CCFM8661脱脂乳悬液，阳性对照治疗组每日腹腔注射 5g/L依地酸二钠钙盐药剂。实 3 结束后取血并处死小鼠，取肝，采用 Ellmam的方法（ Ellmam G.C. Tissue sulfhydryl groups. Archives of biochemistry and biophysics 82(1): 70-77. ) 及南京建成生物工程研究所生产的丙二醛试剂盒测定谷胱甘肽 ( GSH )和丙二醛（MDA ) 的水平。

这些试验结果列于下表 2中。

表 2: 本发明植物乳杆菌 CCFM8661对铅中毒

导致氧化损伤的恢复作用

组 (肝） GSH (mg/g蛋白） MDA (nmol/mg蛋白) 对照 2.69士 0.40 0·11±0·04

仅铅 1.63士 0.75^a 0.18±0.03^a

铅 + CCFM8661 2.46士 0.71^b 0.16±0.04^b

铅 +EDTANa₂Ca 2.15±0.50^c 0.15±0.03^e

注： ^a: 与空白对照组比较 P<0.05; ^b: 与铅模型组比较 PO.05; ^c: 与铅模型组比较 PO.05

由表 2的结果可以看出，本发明植物乳杆菌 CCFM8661干预组的小鼠肝样品中， GSH含量高于铅模型对照组，但低于空白对照组； MDA含量与铅模型对照组相比有所降低，但高于空白对照组。其中与铅模型对照组相比，本发明植物乳杆菌 CCFM8661治疗组的 GSH及 MDA含量都具有显著性差异（P < 0.05 )。谷胱甘肽（GSH )是一种生物体内的重要的抗氧化剂，丙二醛（ MDA )是一种生物体内的自由基与脂质发生过氧化反应的终产物，是生物体内氧化应激损伤的一种标志物。如表 2所示，相比于空白对照组，铅模型组的谷胱甘肽（GSH ) 浓度出现明显降低，丙二醛 ( MDA ) 浓度显著升高，这些结果充分说明，铅暴露确实造成了小鼠体内的氧化应激反应。而相比于铅模型组，本发明植物乳杆菌 CCFM8661 治疗组中的谷胱甘肽含量显著升高，丙二醛含量显著下降，这些结果清楚地说明本发明植物乳杆菌 CCFM8661的治疗确实緩解了铅毒性造成的氧化损伤。

以上这些动物实验表明，本发明植物乳杆菌 CCFM8661能够显著降低铅暴露小鼠血液和各器官中的铅含量，改善小鼠的抗氧化指标，从而有效緩解铅毒性效应。应用实施例 1: 制备含有植物乳杆菌 CCFM8661的牛乳

将原料乳脱脂奶在 95°C热杀菌 20min, 然后冷却至 4°C , 再加入在本发明书描述的植物乳杆菌 CCFM8661发酵剂，使其浓度达到 10⁶ CFU/ml 以上，在 4°C下冷藏保存，于是得到含有植物乳杆菌 CCFM8661活菌的牛乳。应用实施例 2: 制备含有植物乳杆菌 CCFM8661的豆奶

采用软水浸泡大豆，在温度 80°C下浸泡 2 h, 再去除大豆皮。接着，沥去浸泡水，再加沸水磨浆，并在高于 80°C的温度条件下保温 12min。得到的浆料用 150目筛网过滤，接着进行离心分离，得到的离心液即为粗豆奶，再将它加热到温度 140-150°C , 然后将热粗豆奶迅速导入真空冷却室进行抽真空，所述粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出。经过真空脱气后，将其温度降至约 37°C , 再接入本发明的植物乳杆菌 CCFM8661工作发酵剂，使其浓度达到 10⁶ CFU/ml以上，在温度 4°C下冷藏保存，于是得到含有植物乳杆菌 CCFM8661活菌的豆奶。应用实施例 3: 制备含有植物乳杆菌 CCFM8661制造的果蔬饮料选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度 140°C下高温热杀菌 2秒后，立即降温到温度约 37°C ,再接入本发明制备的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂发酵剂，使其浓度达到 10⁶ CFU/mL以上，在温度 4°C 下冷藏保存，于是得到含有植物乳杆菌 CCFM8661活菌的果蔬饮料。应用实施例 4: 制备含有植物乳杆菌 CCFM8661的胶嚢制品将本发明的植物乳杆菌 CCFM8661在 MRS培养基中培养 24 h, 在温度 4°C与 4000 r/min的条件下离心 20 min, 用 pH7.2磷酸盐緩沖液沖洗两次，其菌体用灭菌脱脂乳重悬，使最终菌体浓度达到 lxl0^1G ~ 3xl0^1G cf /mL。将菌悬液加入到以重量计 3%海藻酸钠溶液中，充分搅拌，使得细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到以重量计 2% 氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化 30min, 过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥 48h, 得到含有植物乳杆菌 CCFM8661的粉剂，把这种粉剂装入到在目前市场上销售的药用胶嚢中，得到所述的胶嚢制品。应用实施例 5:使用本发明植物乳杆菌 CCFM8661制备用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂

将植物乳杆菌 CCFM8661按照以所述培养基重量计 3%接种量接种于在 115°C温度下灭菌 lO min的培养基中，该培养基由以该培养基总重量计 10%酶水解脱脂孔、 0.5%葡萄糖、 1.5%胰蛋白胨、 0.3%酵母浸膏和余量水组成， pH6.8。然后，让接种植物乳杆菌 CCFM8661的培养基在温度 37 °C 的条件下培养 18 h, 用 pH7.2磷酸盐緩沖液清洗两次，再用保护剂重悬达到浓度 10^1GCFU/ml。所述的保护剂含有 100 g/ L脱脂奶粉、 30 mL/ L甘油、 100 g/ L麦芽糊精、 150 g/ L海藻糖与 10 g/ L L-谷氨酸钠。

接着，让该悬浮液在温度 37 的条件下预培养 60 min, 再进行冷冻干燥，得到所述的乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂。应用实施例 6: 利用本发明植物乳杆菌 CCFM8661制备发酵乳鲜奶加糖溶解后，在温度 65°C与 20 MPa条件下进行均质，然后在温度 95°C下保温杀菌 5 min, 再将温度降到 35°C , 加入由本发明植物乳杆菌 CCFM8661发酵剂、商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌组成的混合菌，它们的质量比例为 1:1:1 , 所述混合菌的接种量为鲜奶重量的 0.03 % , 混勾，在温度 35°C下保温发酵，凝乳后，在温度 4°C 下冷藏 24 h, 得到所述的发酵乳。应用实施例 7: 利用本发明植物乳杆菌 CCFM8661制备片剂

分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明植物乳杆菌 CCFM8661菌粉制剂 25.7重量份、淀粉 55.0重量份、纤维素衍生物 4.5重量份、羧曱基淀粉钠 12.0重量份、滑石粉 0.8重量份、蔗糖 1.0重量份与水 1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用例如中南制药机械厂生产的压片机进行压片，然后使用例如青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物干燥机中进行干燥，再包装得到本发明的片剂。应用实施例 8: 利用本发明植物乳杆菌 CCFM8661制备丸剂

分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明植物乳杆菌 CCFM8661菌粉制剂 32.2重量份、微晶纤维素 48.0重量份、聚乙烯吡咯烷酮 4.5重量份，碳酸钙 10.0重量份、硬脂酸镁 2.8重量份、卵磷脂 1.3重量份与乙醇 1.2 重量份，混合均匀，再加入常规量的炼蜜制成本发明的丸剂。

Claims

权利要求书

1、一种植物乳 4干菌 Lactobacillus plantarum、 MA , 该菌株已于 2011年 11月 29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为 CGMCC 5494。

2、根据权利要求 1所述的植物乳杆菌 CCFM8661 , 其特征在于它具有下述性质：

(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力；

(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；

(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与緩解铅暴露小鼠铅毒性的作用。

3、根据权利要求 1所述的植物乳杆菌 CCFM8661在制备緩解铅毒性的药物组合物与发酵食品中的用途。

4、根据权利要求 3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是由植物乳杆菌 CCFM8661菌剂与在药学上可接受的载体组成的。

5、根据权利要求 4所述的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂是将含有所述植物乳杆菌 CCFM8661的菌液通过常规冷冻干燥工艺或其它工艺制备所得到的粉剂，它含有 10⁶ CFU/g以上的活性植物乳杆菌 CCFM8661。

6、根据权利要求 4所述的用途，其特征在于在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂，润滑剂或矫味剂的载体。

7、根据权利要求 3或 4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是颗粒剂、胶嚢剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

8、根据权利要求 2所述的用途，其特征在于所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌 CCFM8661菌种的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制口口。

9、根据权利要求 8所述的用途，其特征在于所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：

A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计 87.7%的水将 10%酶水解脱脂乳、 0.5%葡萄糖、 1.5%胰蛋白胨与 0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其 pH为 6.8, 这样得到所述的培养基；

C、将植物乳杆菌 CCFM8661菌种按照以所述培养基的重量计 2-4% 接种量接种到在温度 110-120°C下灭菌 8-12 min的所述培养基中，然后在温度 37 °C的条件下培养 18 h, 用 pH7.2磷酸盐緩沖液清洗 2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度 10^1GCFU/ml; 接着，让该悬浮液在温度 37 °〇的条件下预培养 60 min, 再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。

10、根据权利要求 8所述的用途，其特征在于所述的乳制品是牛奶、 S史奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。