WO2013131816A1 - Formalinfreie fixierungsmittel für histologische färbungen von gewebeproben - Google Patents

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fixing agent
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Roberto Gerigk
Michael Gudo
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the invention relates to a development of a fixative solution which brings about a clear improvement of the known histological and immunological staining techniques as well as the staining techniques used in pathology.
  • the present invention improves the quality and staining of tissue samples that have not been fixed with formalin.
  • the present invention for sensitive, difficult to cut at Formalinfix ist tissue that can be cut not only in better quality without artifacts, but also have higher brilliance and color stability in the dyeing.
  • Organism usually taken irish, or whole organs or whole animals /
  • fixation serves to fix the state of the tissue at the time of removal in order to examine and / or stain this state directly at a later time directly microscopically and then to differentiate the stained cell or tissue parts microscopically on the basis of their chemical properties and thus to investigate or make diagnoses.
  • tissue fixation the tissue piece or organ or the whole organism is impregnated via its vascular system with the fixing solution, it is called Perfussions- or
  • the tissue sample may be embedded in paraffin, for example
  • the sample is usually in an alcohol series with ascending
  • a paraffin block can be stored practically indefinitely at room temperature conditions or slightly cooled, that is, for example, individual sections can be created, the block can then be stored again and stored for later further processing.
  • Such thin sections are usually grown on glass slides and then gem. stained with special instructions (so-called histological staining protocols or staining protocols). Only by staining it becomes possible to differentiate differences in tissue structure microscopically, to differentiate pathological from healthy tissue and diagnostic
  • the dyes used bind specifically to certain structures or chemical components of the tissue structures, and thus specific, i. E. Colorize depending on their chemistry.
  • Cell nuclei clearly differentiate from the cytoplasm, different cell types are stained differently, as are fibers and other tissue components. The overall picture of a staining then allows a diagnostic assessment of the examined tissues.
  • fixatives In addition to formalin, many other fixatives based on methanol, ethanol, acetic acid, chloroform, chlorohydrate, picric acid, mercury dichloride, potassium dichromate, chromic acid, osmium tetroxide and various salt solutions and salt mixtures have been and still are used in histology. However, all these fixatives are not universal, but only in each case specifically for certain types of tissue, certain issues and further processing suitable. There is a direct correlation between fixation (fixative), tissue preservation and the result of the staining, which can finally be evaluated in the microscope.
  • Polymerization added to the commercial formalin solution may adversely affect the results of histological staining, as they are dehydrating, similar to ethanol, and interfere with some dye-tissue compounds.
  • Formalin plays a central role. Here it will be i.d.R. but not used as “4% formalin” but as a “paraformaldehyde solution”.
  • Paraformaldehyde (PFA) is the polymerized form of formalin, which is commercially available as a powder and can be completely dissolved in hot, alkaline solution.
  • Formalin the aqueous solution of formaldehyde gas
  • Formalin has the property of forming in aqueous solution chains of paraformaldehyde, which can precipitate. Furthermore, it decomposes
  • Formaldehyde under the action of light, heat and / or oxygen to give formic acid.
  • aqueous Formalinlosung permanent degradation and polymerization reactions take place, which as a result, the formaldehyde is continuously degraded. Since there are also regression reactions (depolymerization of the PFA chains, as well as equilibrium reactions), the percentage of formaldehyde in an aqueous solution can never be accurately named.
  • Form formaldehyde concentration of 35-37%, sometimes 37-38%.
  • Formol is available in different qualities: technical, stabilized and buffered. Hereby these become saturated Formaldehyde solution is added to additives: it is stabilized with methanol (to prevent PFA formation), buffered with calcium carbonate, borax or a phosphate mixture (against lowering the pH upon decomposition to formic acid). Subsequently, a 4% strength formalin solution is prepared from this stock solution by dilution (about 1 + 9), which is therefore not exactly 4%, but rather 3.5-3.9% pure. Some manufacturers offer 4% formalin as "true” 4% formalin, which means that the stock solution is not diluted 1 + 9, but by actual mass percentages.
  • a further disadvantage of formalin-fixed pieces of fabric is that they tend to harden on long storage, which negatively affects the cuttability and the dyeability of the fabrics.
  • some tissues that have been fixed in formalin are brittle and cracked and difficult or difficult to cut (eg liver, kidney, spleen, musculature, nerve tissue, brain).
  • Formalin fixings normal. This leads to tissue cracks and also to one or the other misinterpretation of the extent and size of certain structures.
  • Frozen section Here, the fixation of the state by immediate freezing after sampling takes place. However, there is no cross-linking of the proteins with each other. The sample is only stable for as long as it is kept at a correspondingly low temperature. In addition, the freezing must be abruptly at very low temperatures (i.d.R. ⁇ -78 ° C), otherwise the formation of water crystals could destroy fine structures of the tissue.
  • the "frozen section" is the so-called quick cut and is produced i.d.R only for special applications, for example, where there is no time to wait for the chemical fixation reaction (e.g.
  • the fixation of a tissue sample is a necessary step to ensure a permanent and longer-term preservation.
  • the invention provides a formalin-free solution which is suitable for fixing tissue samples of all kinds and for improving the dyeability of the samples.
  • the solution according to the invention is characterized by the fact that a total aldehyde concentration of at least 0.5 mol / l, but if necessary also significantly more, can be released by the present acid in the composition according to the invention.
  • At least one polyamine selected from the group consisting of urotropin, triazines, mono-, di-, tri-, tetra-, penta- or hexamethylolmelamine, dimethylol-dihydroxyethylenurea, tetramethylol-acetylenediurea, dimethylol-propylenurea, acetoguanamine or 5.5- Dimethylhydantoin and mixtures thereof, and
  • At least one acidifying agent selected from the group of the free di- or polybasic acid consisting of oxalic acid, fumaric acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, hydrochloric acid, acetic acid, propionic acid, formic acid, mono-, di-, tri-, chloroacetic acid, boric acid,
  • Phosphoric acid or mixtures thereof characterized in that the polyamine reacts with the protons released by the acid and thereby forms aldehydes.
  • the molar ratio between the concentration of the maximum releasable aldehydes in moles and the concentration of the maximum releasable protons in moles in the solution according to the invention is 1: 0.7 to 1: 1.5, preferably 1: 0.7 to 1: 0 , 9, more preferably 1: 0.8 to 1: 1, more preferably 1: 0.9 to 1: 1, 2, further preferably 1: 1 to 1: 1.4 and / or more preferably 1: 1.2 to 1: 1, 5 and is thus chosen so that a ratio of at least 0.5 and a maximum of 2 is established between 'total releasable aldehyde' and 'total of the acid-releasable protons',
  • the solution according to the invention is characterized in that the solution comprises at least one further polymn Dictionaryelles aldehyde selected from the group consisting of citral, 3,7-dimethylocta-2,6 ⁇ dienal, geranial, (E) -3,7- Dimethyl octa-2,6-dienal, propanal, butanal,
  • chemical functional groups may be selected from the following: aryl group, whether phenyl, naphthyl, thienyl, indolyl, etc, linear or amylated akyl, alkenyl or alkyne groups as well as corresponding halogenated groups; - oxygenated groups hydroxil, carbonyl, aldehyde, haloformyl, carbonate ester, carboxilate, carboxy, ester, hydroxiperoxy, hydroxy, ether; Groups with nitrogen, e.g.
  • multifunctional aldehydes because they can bind to one another by their aldehyde function at various points of the sample via various chemical mechanisms and offer via their other bound and supported chemical functions docking sites for the dyes used, which are used for staining the sample.
  • polyfunctional aldehydes therefore, additional chemical functional groups are bound to the tissue sample during the tissue fixation step.
  • the chemical functions of the multifunctional aldehydes are chosen so that certain types of dyes are better bound than others or even chosen such that certain Types of dyes interfere with the binding to the sample or attenuated.
  • a spatial differentiation of the dyeability of the sample is achieved.
  • control mechanism achieved in this way is an advantage of the invention with which the color contrast of the sample is additionally controlled by the addition of the multifunctional aldehydes, because by binding these functional groups to the tissue sample additional docking sites and reaction sites for the molecules of the dyes are provided, so that an optimal Coloring is not only achievable in a shorter time, but in particular a higher color intensity, brilliance and / or contrast can be achieved.
  • Composition is carried out in the examples.
  • the molar concentration of the total available aldehyde in the solution according to the invention, which is formed from the polyamine together with the acid, or which is produced by the polyfunctional aldehyde, in the solution according to the invention is preferably at least 0.5 mol / l , preferably 0.6-0.69 mol / l, more preferably 0.7-0.79 mol / l, more preferably 0.8-0.89 mol / l, further preferably 0.9-0.99 mol / 1, more preferably 0.99 to 1, 2 mol / 1 set.
  • a surfactant which is selected from the group containing ethoxylated nonionic surfactants with high and / or low HLB value, polysorbates especially polysorbate 20, 40, 60 or 80, saponins, alkali metal salts of Dccilsulphate, Decilsulphonate, Dodecilsulfate , Dodecyl sulphonates, dodecylbenzenesulphonates, oleates, stearates, caprates, caprilates and betaines.
  • organic or inorganic salts selected from the group of lithium, sodium, potassium, calcium, strontium / chlorides, sulphates, acetates, citrates, nitrates, succinates and / or formates.
  • organic or inorganic thickeners selected from the group consisting of carbomers, starch and modified starch, agarose, dextrose, methyl, ethyl or propyl zeolite, acrylic acid and PVA.
  • the notified solution is in aqueous form.
  • the components of the notified solution are provided as an anhydrous mixture of crystalline and / or anhydrous components, which are provided in the form of soluble powder or as a soluble, compressed tablet.
  • This powder or tablet is dissolved by the addition of water or other suitable solvent or mixture thereof to provide a ready-to-use fixing solution.
  • An advantage of the solution according to the invention is also its pH stability.
  • the solution according to the invention is stable in pH ranges of pH 3-8, preferably pH 3-6. This stability is achieved by adjusting the molar ratio of the amine group to the acid groups in one
  • This pH stability is based on the strong buffering capacity of the polyamines, which usually react slightly alkaline.
  • the polyamine e.g. Urotropin with the proton of the acid (e.g., citric acid) forms an aldehyde and the corresponding ammonium salt.
  • This establishes an equilibrium, which is influenced by the dissociation constant of the acid and the hydrolysis constant of the polyamine and thereby regulates the pH to a certain level - at about pH 4 to pH 8.
  • 1 mole of urotropin can consume 6 moles of protons, thus even small amounts of urotropin or polyamines buffer large amounts of acid and thus maintain the pH of the solution at a constant level.
  • a further advantage of the solution according to the invention is the color brilliance and color intensity of the samples fixed with the solution according to the invention.
  • exemplary embodiments 4-5 show a marked improvement in the morphological preservation and cuttability of the fixed samples for the fixations carried out by way of example.
  • the stains performed namely hematoxylin & eosin, Masson Goidner trichrome, MSB-Lendrum and azan according to Geidies, described in Examples 4 and 5, show that by using the fixative solution according to the invention a marked improvement in dyeability in general and in particular in color saturation and the color brilliance is achieved.
  • many difficult-to-manipulate tissues, such as brain, skin and testicles are much better to cut and stain with the new fixation.
  • HOPE fixation Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic Solvent Protection Effect
  • this fixation can be carried out only in a complex equipment and with a complex processing procedure, so that they are difficult for the daily Routine is suitable.
  • the solution according to the invention fulfills these requirements and for the first time allows the fixation and staining of tissue samples fixed in formalin-free form and even marked improvement in color saturation, color brilliance and color intensity in the following enumerated procedures: a) hematoxylin & eosin staining, using different
  • Hematoxylin solutions (according to Mayer, Gill, Harris, Weigert, Verhoff, Hansen, etc.) and eosin solutions (in aqueous, alcoholic or methanolic form with various concentrations and additions of acetic acid or other pH-lowering additives).
  • eosin solutions in aqueous, alcoholic or methanolic form with various concentrations and additions of acetic acid or other pH-lowering additives.
  • trichrome staining such as Masson, Masson-Goldner, Azan,
  • Cell nuclei plasma components and chemical properties, such as elastica Dyeings, proofs of aldehydes, iron certificates, other metal detections,
  • the invention improves the plastic properties of the fixed material, so that in the
  • a weathering advantage of the inventive solution is the fact that tissue samples fixed with this solution have excellent cutting properties, and those tissues which, when fixed with formaldehyde-containing solutions, are difficult to cut (eg, brain tissue), it comes to significant improvements in cutting properties.
  • tissue preservation is advantageous. Shrinkage hardly occurs, and if so, to a much lesser extent than with formalin fixations. Cell nuclei retain their round shape and can be dyed very well with common nuclear dyes. Up into the finest structures is to observe an excellent preservation, which even equals the preservation of fixations with sublimate and picric acid-containing fixatives.
  • the fixing times correspond to those of formalin. Longer fixations are unproblematic, or even advantageous. In no case, however, is an undesired over-fixation of the tissue observed during treatment with the solution according to the invention. Furthermore, the notified solution is safe from hazardous substances and hazardous to the eyes and can also be handled during disposal, such as harmless chemical waste.
  • the invention also relates to the use of the solution as a preservative for macroscopic preparations, with below whole carcasses or corpses, as used in the anatomy teaching. In addition, it is also used for the fixation and permanent conservation of biological specimens in natural history museums, zoological or botanical collections, research collections and educational collections.
  • the invention also relates to the use of the fixative for
  • Figure 1 shows a comparison of staining results of AZAN staining on a tissue sample, namely cerebellum rat, wherein the sample used for Figure 1 A with formalin 4%, was fixed according to standard methods and the sample used for Figure 1B in
  • Figure 1 B has fewer cracks, shows better preservation of the preparation and the neurons and assumes a stronger coloration.
  • Figure 2 shows a comparison of staining results of a HEMATOXYLIN & EOSIN (H & E) staining on a tissue sample, namely testes rat, wherein the sample used for Figure 2A with formalin 4%, was fixed according to standard procedures and the sample used for Figure 2B in the identical procedure but was fixed with the inventive solution. It can clearly be seen that FIG. 2B has clearer structures, fine structures are better preserved, and that the sample assumes a stronger coloration.
  • Figure 3 shows a comparison of staining results of a MSB LENDRUM staining on a tissue sample, namely testes rat, wherein the sample used for Figure 3A with formalin 4%, was fixed according to standard procedures and the sample used for Figure 3B in
  • Figure 4 shows a comparison of staining results of a MOVAT staining on a tissue sample, namely lung rat, wherein the sample used for Figure 4A with formalin 4%, was fixed according to standard procedures and the sample used for Figure 4B in the identical method, however, with the inventive solution was fixed. It can clearly be seen that FIG. 4B has clearly delimited structures, fine structures (bronchi and aviols) are better preserved, and that the sample assumes a stronger coloration.
  • Figure 5 shows a comparison of staining results of a MASSON TRICHROM staining on a tissue sample, namely tongue rat, wherein the sample used for Figure 5A with
  • FIG. 5B has a sharper differentiation of the fine structures, the coloration leads to stronger colored cell nuclei and the sample as a whole assumes a stronger coloration.
  • Example 1 Composition and Components of a Fixative
  • Citric acid calculates the molar ratio as follows:
  • Urotropin releases up to 6 moles of formaldehyde from 1 mole of urotropin.
  • Citric acid releases up to 3 moles of protons for 1 mole of citric acid.
  • a solution containing 4% urotropin and 5.5% citric acid (as suggested in this Example 1) thus achieves a molar urotropin concentration of 0.28 M and can form up to a maximum of 1.71 M formaldehyde. Furthermore, the molar concentration of citric acid is 0.28 M and can form a maximum of 0.85 M protons.
  • a known solution containing 1% hexamethylenetetramine (HMTA) and 1% citric acid has, after appropriate calculation as in Example 1.1.
  • the molar concentration of citric acid is here at 0.052M and can form a maximum of 0.15 ⁇ M protons.
  • Example 2 Composition and components of another preferred embodiment
  • HMM H-methylolmelamine
  • HMM 1 mole of HMM contains 6 moles of aldehyde or 180 g
  • the present composition has a ratio of total releasable aldehyde / total releasable protons of about 1: 1.
  • any combination of the substances indicated under position 1 with the substances from position 2 can be displayed.
  • the substances from position 5 are combined, e.g. to adjust the proportion of total-releasable aldehyde.
  • a solution composed by these combinations must have at least 0.5 mol / 1 of total releasable aldehyde.
  • Substance alternatives of positions 3 and 4 as well as 6 and 7 are optional and can be combined as required.
  • Formic acid mono-, di-, tri-, chloroacetic, uric, citric, boric, phosphoric, or mixtures thereof
  • TWEEN 80 polysorbates 20, 40, 60 or 80, alkalines, lauryl sulfates;
  • High HLB ionic and nonionic surfactants hydrophobic-lipophilic-balance describes the hydrophilic and lipophilic content of mainly non-ionic surfactants in chemistry and was proposed by WC Griffin in 1954. Surfactants with a high HLB value cause a good wetting of hydrophilic surfaces) or mixtures thereof
  • Example 4 Method for preparation of histological samples for microscopic examination.
  • the tissue sample should be as fresh as possible in the fixative solution e.g. the solution according to Example 1, are brought. It is generally customary that the amount of the fixing solution corresponds to twenty times the sample volume and the fixing time is dependent on the sample size. Depending on their size, the samples will last from 12 to 36 hours, larger samples will remain in the fixative solution for 72 hours or longer. You go from one
  • the sample is taken out of the fixing solution, washed in running water and dipped in ascending concentration in a number of alcohols.
  • the steps between the concentration steps are here eg 30-50 ⁇ 60-70-80-90-96-100.
  • alcohols usually ethanol or isopropanol are used.
  • the sample is immersed in a suitable organic solvent which is miscible with both alcohol and the embedding medium, followed by infiltration with the actual embedding medium (paraffin) in several stages, for several hours each (depending on the sample size).
  • the sample is poured into a suitable mold with a small amount of paraffin. After the block is solidified, the block is removed from the mold and can then be cut.
  • a suitable Microtome sections are made in the thickness of 4-6 ⁇ and this mounted on glass slides.
  • the glass slides with the paraffin sections can be stored for a long time. l.d.R. however, there is a direct further processing, i. Coloring.
  • the paraffin must first be removed again and the tissue section itself should be watered.
  • the procedure described above is applied in reverse order, i. Dissolve the paraffin with xylene, then alcohol 96%, 90%, 80%, 70%, o. ⁇ . a similar sequence, down to the water. Only then does the staining begin, whereby in the case of dyes which are present in alcoholic solution, the steps until complete washing can be dispensed with and the slides are dipped directly into the alcoholic staining solution.
  • Example 5 Assessment of the morphological conservation, cutting and dyeability of
  • a diagnostic evaluation of cut samples could be carried out.
  • the sections were made from tissues previously fixed in either the solution of Example 1 or in 4% formalin.
  • the qualitative evaluation was carried out on four exemplarily selected stains (1) hematoxylin & eosin (HE), (2) azan according to Geidies, (3) Masson Goldner Trich.ro m and (4) MSB Lendrum.
  • the histological diagnostic evaluation records the parameters Morphological Conservation and
  • HEMATOXYLIN & EOSIN The classic H & E staining uses the hematoxylin dyes in the Mayer and Eosin composition. Both dyes are offered in aqueous solution (eosin possibly also as alcoholic solution) with a defined pH or a defined acid addition and provide a characteristic staining image. Cell nuclei usually stain blue-violet here.
  • the dye hematoxylin which is offered as an alum complex, reacts with the chromatin of the cell nuclei. In order to obtain a stable, water- and alcohol-insoluble paint this compound is then immersed in tap water or in a mixed with monovalent metal ions salt solution.
  • the eosin solution is adjusted to a pH of about 4.0 in aqueous form resulting in a characteristically bright orange color image leads. Eosin binds with varying intensity to different tissue and cell structures and thus allows a good differentiation of the histological section.
  • MASSON GOLDNER TRICHROM The Masson Goldner trichrome and the Crossmon stain are also classical histological stains that work as a trichrome stain with three (or four) stains.
  • the nuclei are also stained with hematoxylin, but not with an alum complex, but via an iron complex. This does not lead to a blue-violet-colored nucleus, but to a brown-black nucleus, which can be differentiated very clearly against blue-colored tissue components.
  • a second dye a mixture of acid fuchsin, poneeau and azophloxin is used, which binds in different ways to different tissue areas and allows cytoplasm and others
  • the fourth dye is alternatively aniline blue or
  • MSB-LENDRU The MSB-Lendrum staining is a coloration related to the Masson Goldner trichrome, but instead of the acid fuchsin-azophloxin-ponceau and instead of orange G the dyes Martiusgelb and Kristallponceau are offered.
  • the result is a comparable, but still more differentiated picture to observe, with the significance of MSB staining is particularly valuable for vascular structures, because here muscle strands, fiber arrangement and vessel walls are better differentiated than in the aforementioned
  • AZAN AFTER GEIDIES The AZAN coloring also belongs to the series of the classical ones
  • the result of the staining is so similar that the classical AZAN staining can be largely replaced.
  • the results are essentially similar to those of K asson-Goldner and MSB-Lendrum.
  • Nuclei are stained strongly red by the seed red powder offered in aluminum sulphate solution and stand out well against the continuous blue background.
  • Aniline blue and organ G produce the counter- or background staining (blue) and a well differentiated staining of the erythrocytes (orange) and the muscle piasm (also strong orange).
  • creatine, keratinized epithelia also turn to orange. Ground substance and fibers get different shades of blue due to the aniline blue. Overall, the result of aniline blue staining is strongly influenced by the pickling time.
  • the following parameters can be used to assess the morphological conservation on the light microscopic level, (A) fragmentation of the tissue (cracking) and (B) the representation of the nuclei (nuclei) and (C) of the cell bodies (Somata).
  • the fragmentation of the tissue by the formation of individual cracks or spread nets results from a poor fixation and manifests itself in the stretching of the tissue section on the hot water bath or the heating plate and during the dyeing process.
  • the heat-related stretching of the paraffin and thus also of the paraffin-permeated and enveloped tissue section, there is a physical load on the paraffin / tissue dressing, which may result in lack of fixation in the rupture of the tissue.
  • the tensile or tension forces occurring during dewaxing and staining of the tissue section are particularly pronounced on, stretched or completely ruptured tissue during stretching.
  • the tendency to crack is proportional to the adhesive property of the slide used.
  • a tissue can be fixed by fixation e.g. brittle and brittle (no cuttability, 4) or supple and resistant (high cuttability, 1). Different tissue properties of different tissue types must be considered in the assessment.
  • Histological staining of tissue sections often allows manifold distinctions between individual cells as well as tissue types.
  • This histological differential diagnosis which is used in human and veterinary diagnostics but also in medical, zoological and botanical research, is based on the differentiation of cell nucleus types, but in particular also on the differentiation of color precipitates on cells or tissues.
  • the highest possible color saturation, uniform color precipitation, good contrast (between nucleus and cell body) and a high level of color saturation Color brilliance are therefore not only desirable, but also urgently required requirements for coloring.
  • Various fixatives may, depending on the incubation time, improve or even reduce the dyeability of a tissue section.
  • the following criteria are used: 1. Color saturation, 2. Uniform color precipitation, 3. Contrast between cell nucleus and cell body and 4. Color brilliance.
  • the individual dyeings must be evaluated separately, since dyeings or their components react differently to the influence of fixing agents.

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Description

Formalinfreie Fixierungsmitte! für histologische Färbungen von Gewebeproben
(1) Die Erfindung betrifft eine Entwicklung einer Fixierlösung, die eine eindeutige Verbesserung der bekannten histologischen und immunologischen Färbetechniken sowie der in der Pathologie eingesetzten Färbetechniken bewirkt. Insbesondere verbessert die vorliegende Erfindung die Qualität und Färbung von Gewebeproben bzw. Gewebeschnitten, die nicht mit Formalin fixiert wurden. Besonders vorteilhaft erweist sich die vorliegende Erfindung, für empfindliche, bei Formalinfixierung schwierig schneidbare Gewebe, die sich nicht nur in besserer Qualität ohne Artefakte schneiden lassen, sondern in der Färbung auch höhere Brillanz und Farbstabilität aufweisen.
(2) Für histologische Untersuchungen in Biologie und Medizin werden Gewebeproben, einem
Organismus üblicherweise irisch entnommen, oder auch ganze Organe oder ganze Tiere /
Tierkörper/Pflanzen bzw. Organismen in speziellen, so genannten Fixierlösungen eingelegt (Infiltration), bzw. mit der Fixierlösung über eine Perfussions- oder Instillationseinrichtung durchtränkt. Die Fixierung dient dazu den Zustand des Gewebes zum Zeitpunkt der Entnahme zu fixieren (= festlegen), um eben diesen Zustand zu einem späteren Zeitpunkt direkt mikroskopisch zu untersuchen und/oder anzufärben und dann die angefärbten Zell- oder Gewebeteile anhand ihrer chemischen Eigenschaften mikroskopisch zu differenzieren und somit zu untersuchen bzw. Diagnosen zu stellen.
(3) Wird eine Gewebeprobe in die Fixierlösung eingelegt, so spricht man von einer
„Immersionsfixierung", wird das Gewebestück bzw. Organ oder der ganze Organismus über sein Gefäßsystem mit der Fixierlösung durchtränkt, spricht man von Perfussions- oder
Instillationsfixierung. Der Fixiervorgang ist eine chemische Reaktion des eigentlichen
Fixierungsmittels mit den Proteinen des Gewebes. Auf diese Weise wird eine Probe haltbar gemacht, d.h. es werden Zersetzungsvorgänge durch Enzyme, Bakterien oder Pilze verhindert. Zudem wird das Gewebe gehärtet und damit überhaupt erst in einen Zustand versetzt, dass man es mit einem Mikrotom in dünne, wenige pn dicke Scheiben schneiden kann.
(4) Im Anschluss an die Fixierung kann die Gewebeprobe beispielsweise in Paraffin eingebettet
werden. Hierzu wird üblicherweise die Probe in einer Alkoholreihe mit aufsteigenden
Konzentrationen zunächst entwässert. Anschließend wird über ein so genanntes Intermedium der Alkohol entfernt, die Probe dann über Xylo! oder einen Xylolersatzstoff in mehreren Schritten mit Paraffin durchtränkt und schließlich mittels einer Form in Paraffin eingegossen. Nach dem Erstarren des Paraffins, wird der so gewonnene Paraffinblock an einem Mikrotom zu
Dünnschnitten verarbeitet (i.d.R. zwischen 2 und 5 μηι Dicke).
Ein Paraffinblock kann praktisch unbegrenzt bei Raumtemperaturbedingungen bzw. leicht gekühlt gelagert werden d.h., dass beispielsweise einzelne Schnitte erstellt werden können, der Block dann wieder eingelagert und für spätere Weiterverarbeitung aufbewahrt werden kann.
(5) Anstatt Paraffin können auch andere Polymere für die Einbettung von Proben zum Einsatz
kommen wie Celloidin, hochmolekulares PEG, Acrylate und andere.
(6) Solche Dünnschnitte werden üblicherweise auf Glasobjektträger aufgezogen und anschließend gem. spezieller Anweisungen (so genannter histologischer Färbeprotokolle oder Färbevorschriften) gefärbt. Erst durch die Färbung wird es möglich, Unterschiede im Gewebeaufbau mikroskopisch zu differenzieren, krankhaftes von gesundem Gewebe zu unterscheiden und diagnostische
Beurteilungen durchzuführen, da die verwendeten Farbstoffe spezifisch an bestimmte Strukturen oder chemische Komponenten der Gewebestrukturen binden, und diese somit spezifisch, d.h. abhängig von ihrem Chemismus einfärben. So lassen sich z.B. Zellkerne deutlich vom Zellplasma differenzieren, es werden verschiedene Zelltypen unterschiedlich angefärbt, ebenso Fasern und andere Gewebebestandteile. Das Gesamtbild einer Färbung erlaubt dann eine diagnostische Beurteilung der untersuchten Gewebe.
(7) Das gängigste Fixiermittel in der Histologie ist Formalm. Es wurde von Isaak und Ferdinand Blum am Forschungsinstitut Senckenberg in Frankfurt am Main in den frühen 1890er Jahren als Fixierungsmittel für Gewebeproben erstmals eingesetzt und erwies sich von Anfang an als wesentlich besser geeignet, als z.B. Spiritus (Ethanol), Terpentin und andere Substanzen (vgl. I. Blum: 1893). Sehr schnell nahm Formalin seinen Siegeszug durch die Medizin und hat sich schließlich als das ultimative Fixiermittel weltweit durchgesetzt, weil es leicht zu beschaffen und leicht zu handhaben war, und die Ergebnisse über ein breites Anwendungsgebiet hinweg miteinander vergleichbar sind.
(8) Neben dem Formalin wurden und werden in der Histologie auch noch viele weitere Fixiermittel verwendet, die auf der Basis von Methanol, Ethanol, Essigsäure, Chloroform, Chioralhydrat, Pikrinsäure, Quecksiiberdichlorid, Kaiiumdichromat, Chromsäure, Osmiumtetroxid und verschiedenen Salzlösungen und Salzgemischen beruhen. All diese Fixiermittel sind jedoch nicht universell, sondern nur jeweils spezifisch für bestimmte Gewebetypen, bestimmte Fragestellungen und Weiterverarbeitungen geeignet. Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen Fixierung (Fixiermittel), Gewebeerhaltung und Ergebnis der Färbung, die schließlich im Mikroskop ausgewertet werden kann. Da die Fixierung in den allermeisten Fällen eine chemische Reaktion darstellt (siehe hierzu„Histological Techniques, Laboratoiy Manual Columbia University", 1975), welche die chemischen Eigenschaften der Gewebe beeinflusst ist schon lange bekannt, dass bestimmte Farbstoffe bzw. bestimmte Farbstofflösungen nur mit bestimmten Fixiermitteln bzw. Fixierverfahren kompatibel bzw. inkompatibel sind. Wenn z.B. mit Ethanol oder mit Ethanol- Essigsäuregemischen fixiert wurde, lassen sich Gewebedifferenzierungen grundsätzlich nur noch sehr schwer durchführen, sowohl weil Zellen und Gewebe bei Ethanolfixierung stark dehydriert werden und schrumpfen, als auch, weil z.B. Beizenfarbstoffe keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefern. Andererseits sind Färbungen z.B. bei Verwendung von Pikrinsäure wesentlich brillanter und kräftiger in ihrer Ausprägung, als bei Verwendung von Formalin als Fixiermittel, so dass in manchen Färbeprotokollen auch Vorbehandlungen der Schnitte mit Pikrinsäure empfohlen werden.
(9) Obwohl Formalin sich anfangs als hervorragendes Fixiermittel auszeichnete, zeigte sich mit der Zeit, dass bei zahlreichen Färbetechniken in der Histologie und Pathologie einige Probleme auftraten. Da Formaldehyd in Lösung und in Kontakt mir der Luft zu Ameisensäure oxidiert, bilden sich in blutreichen Proben die so genanten „Formalin Pigmente". Diese hoch refringenten Kristalle bilden sich aus der Reaktion von Ameisensäure und Blut und werden in der Histologie und Pathologie als störende Artefakte wahrgenommen. Auch Stabilisatoren gegen die
Polymerisierung, die der kommerziellen Formalinlosung zugegeben werden, wie Methanol und Butanol, können die Ergebnisse histologischen Färbung negativ beeinflussen, da sie - ähnlich wie Ethanol - dehydrierend wirken und manche Farbstoff-Gewebe- Verbindungen stören.
(10) Auch in einem speziellen Zweig der Histologie, der so genannten Immunhistochemie spielt
Formalin eine zentrale Rolle. Hier wird es i.d.R. aber nicht als„Formalin 4%ig", sondern als „Paraformaldehyd-Lösung" verwendet. Paraformaldehyd (PFA) ist die polymerisierte Form des Formalin, die als Pulver im Handel erhältlich ist und in heißer, alkalischer Lösung vollständig gelöst werden kann.
Formalin (die wässrige Lösung des Formaldehyd-Gases) hat die Eigenschaft in wässriger Lösung Ketten von Paraformaldehyd zu bilden, die ausfällen können. Des Weiteren zersetzt sich
Formaldehyd unter Licht-, Wärme- und/oder Sauerstoffeinwirkung zu Ameisensäure. In einer wässrigen Formalinlosung finden ständige Abbau- und Polymerisierungsreaktionen statt, denen zur Folge das Formaldehyd kontinuierlich abgebaut wird. Da es auch Rückbildungsreaktionen gibt (Depolymerisierung der PFA-Ketten, sowie Gleichgewichtsreaktionen) kann der prozentuale Anteil des Formaldehyds in einer wässrigen Lösung niemals genau benannt werden.
Die„Stammlösung", die unter dem Handelsnamen„Formol" bekannt ist, hat eine Formaldehyd Konzentration von 35 - 37 %, teilweise auch 37 - 38 %. Formol wird in verschiedenen Qualitäten angeboten: technisch, stabilisiert und gepuffert. Hierbei werden dieser gesättigten Formaldehydlösung Zusätze beigemengt: stabilisiert wird mit Methanol (zur Verhinderung der PFA-Bildung), gepuffert wird mit Calciumkarbonat, Borax oder einem Phosphat-Gemisch (gegen die Absenkung des pH-Wertes bei Zersetzung zu Ameisensäure). Anschließend wird aus dieser Stammlösung eine 4%ige Formalinlösung durch Verdünnung (etwa 1 + 9) hergestellt, die demzufolge eben nicht exakt 4%ig, sondern eher 3,5 - 3,9 %ig ist. Manche Hersteller bieten 4%iges Formalin als„echtes" 4%iges Formalin an, d.h. es wird die Stammlösung nicht 1 + 9, sondern nach tatsächlichen Massenprozenten verdünnt.
(1 1) Nichtsdestotrotz ist das Ergebnis weiterhin eine Lösung, in der der Gehalt an Formalin schwankt und sukzessive absinkt. Für„normale" histologische Fragestellungen ist dies weitgehend unproblematisch, für immunhistochemische Fragestellungen jedoch, kann diese schwankende Zusammensetzung, die zudem durch die Bildung von Ameisensäure auf einen schwankenden pH- Wert: haben kann, unvorteilhaft. Auch einige histologische Färbungen werden von einem zu niedrigen pH-Wert des Formalins negativ beeinflusst (z.B. die Differenzierung oxidativer und glycolytischer Muskelfasern). Daher wird für IHC-Fragestellungen eine Fixierlösung aus
Paraformaldehyd mit exakten Konzentrationen von 4%, 6% oder 8 % hergestellt, die über einen Puffer auf einen exakten pH-Wert justiert wird (z.B. 7,0, 7,2 oder 7,4, was dem einem üblichen pH-Wert tierischer / menschlicher Gewebe entspricht). Allerdings sind solche gepufferten PFA- Lösungen nur kurze Zeit haltbar, d.h. sie müssen innerhalb weniger Tage verbraucht werden, weil ansonsten eben die gleichen Zersetzungs- und Gleichgewichtsreaktionen ablaufen wie bei der normalen Formalinlösung. Für IHC-Fragestellungen, bei denen der Vernetzungsgrad der Proteine untereinander eine wichtige Rolle spielt, wird deshalb gepuffertes PFA verwendet, weil hierbei gleichmäßigere und nachvollziehbarere Fixier- und Reaktionsbedingungen erzielt werden.
(12) Die Nachteile und Unzulänglichkeiten des Formalin (ebenso des PFA) sind lange bekannt und liegen nicht nur in seinem stechend beißenden Geruch, der als störend und unangenehm auffällt, sondern stellen nach neueren Erkenntnissen auch eine signifikante Gesundheitsgefahr dar. In der EU wird in Rahmen der REACH Verordnung (EG Verordnung 1 07/2006, mit Änderungen in EG Nr 1354/2007 und 1272/2008, umgesetzt in deutsches Recht im Chemikaliengesetz vom 2. Juli 2008) eine Liste der gefährlichen Chemikalien geführt und aktualisiert, VHCC (very high concern chemicals), sowie Auflagen erlassen, wann und wie solche VHCC zukünftig zu vermeiden bzw. ihr Einsatz einzuschränken oder zu ersetzen ist.
(13) Weiterhin ist als Nachteil von formalinfixierten Gewebestücken aufzuführen, dass solche bei langer Lagerung hinaus neigen zu verhärten, was sich negativ auf die Schneidbarkeit und die Färbbarkeit der Gewebe auswirkt. Generell sind manche Gewebe, die in Formalin fixiert wurden, spröde und rissig und lassen sich kaum oder nur schwer schneiden (z.B. Leber, Niere, Milz, Muskulatur, Nervengewebe, Gehirn).
(14) Ein weiterer negativer Effekt des Formalm ist die Schrumpfung und die Herauslösung von Fetten und Glykogen. Eine Schrumpfung von bis zu 10% des Gewebevolumens ist bei
Formalinfixierungen normal. Dies führt zu Rissen im Gewebe und auch zu der einen oder anderen Fehldeutung hinsichtlich der Ausdehnung und Größe bestimmter Strukturen.
(15) Insgesamt betrachtet ist Formalin ebenso wie gepuffertes PFA im Gesamtblick auf die bekannten Fixiermittei nicht dasjenige Fixiermittel, welches die besten Ergebnisse liefert, sondern vielmehr dasjenige, welches wegen der langjährigen Erfahrung vergleichbare Ergebnisse liefert und kostengünstig zu verwenden und zu beschaffen war.
(16) Eine andere Variante, Gewebe in möglichst frischem Zustand zu untersuchen, ist der
Gefrierschnitt. Hier erfolgt die Fixierung des Zustandes durch sofortiges Einfrieren nach der Probennahme. Dabei erfolgt jedoch keine Vernetzung der Proteine untereinander. Die Probe ist nur so lange haltbar, wie sie auf entsprechend niedriger Temperatur gehalten wird. Zudem muss das Einfrieren schlagartig auf sehr niedrige Temperaturen erfolgen (i.d.R. < -78 °C), weil ansonsten die Bildung von Wasserkristallen Feinstrukturen des Gewebes zerstören könnte. Der „Gefrierschnitt" ist der so genannte Schnellschnitt und wird i.d.R, nur für spezielle Anwendungen hergestellt, bei denen z.B. die Zeit fehlt, die chemische Fixierreaktion abzuwarten (z.B.
Schnelldiagnostik während einer Operation), oder wenn von vorneherein die Färbung bzw. ein immunhistochemischer Nachweis durch die Fixierung selbst gestört würde. Unter diesen
Umständen, kann mit den Nachteilen des Gefrierschnittes eine diagnostische Entscheidung getroffen werden.
(17) Generell besteht allerdings die Erfahrung, dass Färbungen am frischen Gewebe oft intensiver und kräftiger sind und dass Färbezeiten reduziert werden müssen. Dies liegt womöglich daran dass die Bindung der Farbstoffe oft nicht an den chemischen Veränderungen durch die Fixierung gekoppelt ist, sondern weil die Farbstoffe an den Gewebekomponenten selbst binden. Die chemische Fixierreaktion kann hier also in weiten Bereichen als störend für eine gut
differenzierende Färbung bezeichnet werden.
(18) Folglich wäre der Gefrierschnitt, wenn er nicht so schwierig zu handhaben und aufzubewahren wäre, der für viele Färbungen qualitativ bessere Weg.
(1 ) Die Nachteile bei Gefrierschnitten sind z.B. der technische Aufwand der Konservierung
(unverzügliches Einfrieren nach Entnahme), das Problem einer längerfristigen Aufbewahrung (die Lageltemperatur darf nicht überschritten werden), die verhältnismäßig dicken Schnitte (i.d.R. um 10 pm), die Unmöglichkeit, einen gefrorenen Schnitt zu entkalken, etc. Aus diesem Grund ist die Fixierung einer Gewebeprobe ein notwendiger Schritt, um eine dauerhafte und längerfristige Konservierung zu gewährleisten.
(20) Aus diesen Gründen besteht ein erheblicher Bedarf weitere Alternativen bereitzustellen, die
vergleichbare oder sogar bessere Färbbarkeit von Gewebeproben und Schnitten erlauben, und somit die diagnostische Forschung verbessern.
(21) Die erfindungsgemäße Bereitstellung eines alternativen Fixierungsmittels für Gewebeproben aller Art, insbesondere für die Histologie und Immunhistochemie steht vor dem Hintergrund eben dieser Gesamtsituation und stellt sich die Aufgabe zu gewährleisten, dass Gewebeproben aller An¬ bei Einsatz der erfindungsgemäßen Fixierung weiterhin allen Färbetechniken zugänglich sind und wenigstens vergleichbare, wenn nicht bessere Färbeerfolge ermöglichen.
(22) Hierzu stellt die Erfindung eine formalinfreie Lösung bereit, die geeignet ist Gewebeproben aller Art zu fixieren und die Färbbarkeit der Proben zu verbessern. Die erfindungsgemäße Lösung zeichnet sich durch die Tatsache aus, dass durch die vorliegende Säure in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine Gesamt-Aldehydkonzentration von wenigstens 0,5 Mol/1, aber bei Bedarf auch deutlich mehr, freigesetzt werden kann.
(23) Die erfindungsgemäße Lösung beinhaltet hierzu die Komponenten des Anspruches 1. Bevorzugte Ausführungsformen oder Anwendungen sind in den Unteransprüchen ausformuliert.
(24) Insbesondere enthält die erfindungsgemäße Lösung
- wenigstens ein Polyamin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Urotropin, Triazinen, Mono-, Di-, Tri-, Tetra-, Penta- oder Hexamethylolmelamin, Dimethylol-dihydroxyethylenurea, Tetramethylol-acetylendiurea, Dimethylol-propylenurea, Acetoguanamin oder 5,5- Dimethylhydantoin und Mischungen derselben, und
- wenigstens ein Säuerungsmittel ausgewählt aus der Gruppe der freien zwei- oder mehrwertige Säure bestehend aus Oxalsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Succinsäure, Salzsäure, Essigsäure, Propionsäure, Ameisensäure, Mono-, Di-, Tri-, Chloressigsäure, Borsäure,
Phosphorsäure oder Mischungen derselben, dadurch gekennzeichnet dass das Polyamin mit den von der Säure freigesetzten Protonen reagiert und dabei Aldehyde bildet. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen die z. B. Formaldehyd, Glyoxal, Glutaraldehyd, Ethanal oder Propanal bilden und ggf. in der Lage sind diese freizusetzen. (25) Das molare Verhältnis zwischen Konzentration der maximalen freisetzbaren Aldehyde in Mol zu der Konzentration der maximalen freisetzbaren Protonen in Mol ist in der erfindungsgemäßen Lösung 1:0,7 bis 1 : 1,5, vorzugsweise 1 :0,7 bis 1 :0,9, weiter vorzugsweise 1 :0,8 bis 1 : 1 , weiter vorzugsweise 1 :0,9 bis 1: 1 ,2, weiter vorzugsweise 1 : 1 bis 1: 1,4 und/oder weiter vorzugsweise 1 : 1 ,2 bis 1 : 1 ,5 und ist damit so gewählt, dass sich zwischen ,Gesamt freisetzbaren Aldehyd' und .Gesamt aus der Säure freisetzbaren Protonen' ein Verhältnis von mindestens 0,5 und maximal 2 einstellt,
(26) Weiterhin zeichnet sich die erfindungsgemäßen Lösung dadurch aus, dass die Lösung mindestens ein weiteres polymnktionelles Aldehyd ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citral, 3,7- Dimethylocta-2,6~dienal, Geranial, (E)-3,7-Dimethylocta-2,6-dienal, Propanal, Butanal,
Valerianaldehyd, Pentanal, Hexanal, Heptanal, Octanal, Nonanal, Decanal, (2 E)-3-Phenylprop~ 2-enal, Benzaldehyd, Phenylmethanal, Vanilinaldehyd, 4-Hydroxy-3-methoxyphenylmethanal und Mischungen derselben umfasst.
(27) Diese Verbindungen sind vorzugsweise Aldehyde, die noch eine oder mehrere zusätzliche
chemische Funktionsgruppen besitzen. Diese chemischen Funktionsgruppen können ausgewählt sein aus den Folgenden: - Arylgruppe, sei es Phenyl, Naphthyl, Thienyl, indolyl, etc, lineare oder ramifizierte Akyl-, Alkenyl- oder Alkin-Gruppen wie auch dementsprechende halogenierte Gruppen; - Gruppen mit Sauerstoff Hydroxil, Carbonyl, Aldehyd, Halogenformyl, Carbonatester, Carboxilat, Carboxil, Ester, Hydroxiperoxi, Hydroxi, Äther; - Gruppen mit Stickstoff, wie z.B. Carboxamid, Amine, Imine, Imide, Azide, Azo, Cianate, Nitrate, Nitril, Nitrosooxi, Niiroso und Pyridyl; - Gruppen mit Schwefel wie z.B. Sulfidryl, Sulfide, Disulfide, Sulfinyl, Sulfonyl, Sulfino, Sulfate, Thiocyanate, Carbonothyoil; - Gruppen mit Phosphor wie z.B. Phosphino, Phoshono, Phosphat.
(28) Diese Gruppen können einzeln oder mehrfach auftreten, oder auch in Kombinationen
miteinander vorliegen.
(29) Hierbei sind z.B. die Aldehyde mit einer oder mehrere Funktionen, die gewählt sind aus der
genannten Gruppen, sogenannte multifunktionelle Aldehyde, denn sie können sich durch ihre Aldehydfunktion an verschiedenen Stellen der Probe über verschiedene chemische Mechanismen binden und bieten über ihre andere an sich gebundene und mitgetragene chemischen Funktionen Andockstellen für die eingesetzten Farbstoffe, die zur Färbung der Probe verwendet werden. Durch den Zusatz polyfunktioneller Aldehyde werden daher während dem Schritt der Gewebefixierung zusätzliche chemische Funktionsgruppen an die Gewebeprobe gebunden.
(30) Die chemischen Funktionen der multifunktionellen Aldehyde sind so gewählt, dass bestimmte Arten von Farbstoffe besser gebunden werden als andere oder auch derart gewählt, dass bestimmte Arten von Farbstoffe an der Bindung mit der Probe behindert oder abgeschwächt werden. Somit wird durch die unterschiedliche Affinität der Probe, der auch als differenzierter Chemismus der unterschiedlichen Gewebe bezeichnet wird, eine räumliche Differenzierung der Färbbarkeit der Probe erzielt. Der so erzielte Steuermechanismus ist ein Vorteil der Erfindung, mit dem der Farbkontrast der Probe durch den Zusatz der multifunktionelle Aldehyde zusätzlich gesteuert wird, denn durch Bindung dieser Funktionsgruppen an die Gewebeprobe werden zusätzliche Andockungsstellen und Reaktionsstellen für die Moleküle der Farbstoffe bereitgestellt, so dass eine optimale Färbung nicht nur in kürzerer Zeit erreichbar ist, sondern insbesondere auch eine höhere Farbintensität, Brillanz und/oder Kontrast erzielt werden kann.
(31) Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält eine weitere Fixierlösung im Sinne dieser
Erfindung Hexamethylolmelamin, Borsäure, Natriumhydroxid, Phenylmethanal, Tween 20, wobei Hexamethylolmelamin ein Formaldehydabspalter ist, und Phenylmethanal als
polyfunktionelles Aldehyd dient. Die praktische Ausführung zur Herstellung dieser
Zusammensetzung wird in den Beispielen ausgeführt.
(32) Die molare Konzentration des gesamt verfügbaren Aldehyds in der erfindungsgemäßen Lösung, welches sich aus dem Polyamin zusammen mit der Säure bildet, bzw. welches durch das polyfunktionelle Aldehyd erzeugt wird, wird in der erfindungsgemäßen Lösung vorzugsweise auf mindestens 0,5 Mol/1, vorzugsweise 0,6-0,69 Mol/1, weiter vorzugsweise 0,7-0,79 Mol/1, weiter vorzugsweise 0,8-0,89 Mol/1, weiter vorzugsweise 0,9-0,99 Mol/1, weiter vorzugsweise 0,99- 1 ,2 Mol/1 eingestellt. Mit einer solchen Lösung ist eine optimale Fixierung von Gewebeproben gewährleistet, die sowohl die Schneidbarkek der Probe verbessert wie auch positiven Einfluss auf die Färbbarkeit der Probe hat.
(33) Um das Austrocknen der Probe zur vermeiden, kann als weiterer Zusatz eine stark hygroskopische Chemikalie dazugegeben werden, welche ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend
Monopropylenglykol, Dipropylenglykol, Polypropylenglykol, Glyzerin, Pentaerytriol, Sorbitol, Ethylenglykol, Diethylenglykol und Polyethylenglykol.
(34) Um die Oberflächenspannung der Lösung zu reduzieren und die Kriecheigenschaften zu
verbessern kann als weiterer Zusatz ein Tensid dazugegeben werden, welches ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend ethoxyiierte nicht ionische Tenside mit hohen und/oder niedrigen HLB Wert, Polysorbate besonders Polysorbat 20, 40, 60 oder 80, Saponine, Alkalisalze von Dccilsulphate, Decilsulphonate, Dodecilsulfate, Dodecilsulphonate, Dodecilbenzenosulphonate, Oleate, Stearate, Caprate, Caprilate und Betaine. (35) Um die Isotonie und Osmolarität der Lösung anzupassen können auch organische oder anorganische Salze zum Einsatz kommen, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Lithium-, Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Strontium- / -chloride, -sulfate, -acetate, -citrate, -nitrate, - succinate und/oder -formiate.
(36) Um die Fließeigenschaften der Lösung anzupassen, können auch organische oder anorganische Verdickungsmittel zum Einsatz kommen, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Karbomere, Stärke und modifizierte Stärke, Agarose, Dextrose, Methyl-, Ethyl- oder Propyl-Zeüulose, Akryllsäure und PVA.
(37) Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt die angemeldete Lösung in wässriger Form vor.
Weiterhin - gemäß einer weiteren Ausführungsform - werden die Bestandteile der angemeldeten Lösung als wasserfreie Mischung aus kristallinen und/oder wasserfreien Bestandteilen, die in Form von löslichem Pulver oder als lösliche, gepresste Tablette bereitgestellt. Dieser Pulver oder diese Tablette wird durch den Zusatz von Wasser oder eines anderen geeigneten Lösungsmittels oder Mischung daraus aufgelöst, um eine gebrauchsfertige Fixierlösung bereit zu stellen.
(38) Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung ist auch deren pH Stabilität. Die erfindungsgemäße Lösung ist in pH Bereichen von pH 3-8, vorzugsweise pH 3-6 stabil. Diese Stabilität wird durch die Einstellung des molaren Verhältnisses der Amin-Gruppe zur Säure-Gruppen in einem
Verhältnis von annähernd 1 : 1 erreicht. Solange freies Polyamin in der Lösung vorhanden ist, funktioniert dieses als Depot und der pH kann nicht steigen. Diese pH Stabilität beruht auf der starken Pufferkapazität der Polyamine, die in der Regel etwas alkalisch reagieren. Durch die Reaktion des Polyamins, z.B. Urotropin mit dem Proton der Säure (z.B. Zitronensäure), bilden sich ein Aldehyd und das entsprechende Ammoniumsalz. Es stellt sich hierbei ein Gleichgewicht ein, welches von der Dissoziationskonstante der Säure und der Hydrolysekonstante des Polyamins beeinflusst wird und dabei den pH auf ein bestimmtes Niveau - bei ca. pH 4 bis pH 8- einreguliert. Im Fall von Urotropin, kann 1 Mol von Urotropin 6 Mol Protonen verbrauchen, womit schon geringe Mengen von Urotropin oder Polyaminen große Mengen von Säure puffern und damit den pH der Lösung auf einem konstanten Wert gehalten wird.
(39) Durch diese Stabilität können pH Schwankungen nahezu ausgeschlossen werden. So wird z.B. auch eine pH Veränderung durch Bildung von Ameisensäure vermieden und damit sind auch keine„Formalin Pigmente" beim Einsatz der erfindungsgemäßen Lösung zu finden.
Erfreulicherweise sind daher auch dem Fachmann bekannte Zusätze zur Stabilisierung von Lösungen, welche eine Färbungen stören könnten, wie z.B. Methanol und Butanol, nicht nötig. (40) Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung ist die Farbbrillanz und Farbintensität der mit der erfindungsgemäßen Lösung fixierten Proben. So zeigen die Ausführungsbeispiele 4-5 für die exemplarisch durchgeführten Fixierungen eine deutliche Verbesserung der morphologischen Erhaltung und Schneidbarkeit der fixierten Proben. Weiterhin zeigt sich bei den durchgeführten Färbungen, nämlich Hämatoxylin & Eosin, Masson Goidner Trichrom, MSB-Lendrum und Azan nach Geidies, beschrieben in Beispiel 4 und 5, dass durch Einsatz der erfindungsgemäßen Lösung zur Fixierung eine deutliche Verbesserung der Färbbarkeit allgemein und insbesondere der Farbsättigung und der Farbbrillanz erzielt wird. Darüber hinaus sind zahlreiche schwierig zu bearbeitende Gewebe, wie z.B. Gehirn, Haut und Hoden mit der neuen Fixierung deutlich besser zu schneiden und anzufärben.
(41) Es wird angenommen, ohne jedoch durch diese Annahme eine Beschränkung einzuführen, dass die Verbesserung der Färbbarkeit auch schon bei geringem Zusatz der multifunktionalen Aldehyde wie z.B. Citral, 3,7-Dimethylocta-2,6-dienal, Geranial, (E)~3,7-Dimethylocta-2,6-dienal, Propanal, Butanal, Valerianaldehyd, Pentanal, Hexanal, Heptanai, (2 E)-3-Phenylprop-2~enal, Benzaldehyd, Phenylmethanal, Vanilinaldehyd, 4-Hydroxy-3-methoxyphenylmethanal, Heptanai, Octanal, Nonanal, Decanal, und Mischungen derselben darauf zurückzuführen ist, dass diese sich in der Gleichgewichtreaktion aufaddieren.
(42) In der angemeldeten Lösung findet eine solche Gleichgewichtsreaktion statt, bei der das Polyamin mit den Protonen, die von der Säure freigesetzt werden, z.B. in ein Aldehyd übergeht. Die zugegebenen zusätzlichen multifunktionellen Aldehyden summieren sich auf der Aldehydseite auf und können dann auch in der Probe eingebaut werden. Die multifunktionellen Gruppen dieser Aldehyde dienen dabei als zusätzliche Andockstellen für Farbstoffe, die über polare Bindungen, Wasserstoffbrücken oder selbst kovalente Bindung an diese Stellen gebunden werden können, und dadurch die Farbreaktionen der eingesetzten histologischen und/oder immunhistochemischen Färbungen verbessern.
(43) Erfreulicherweise zeigte sich, dass auch weitere Probleme, die bei anderen formalinfreien- Fixierungen bekannt sind, durch die Verwendung der angemeldeten Lösung umgangen oder vermieden werden.
Zu nennen ist beispielsweise die HOPE-Fixierung (Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect), die sich besonders für molekularbiologische Fragestellungen eignet, da durch dieses Fixierungsmittel Nukleinsäuren und Antigenstrukturen besonders gut erhalten werden. Diese Fixierung lässt sich jedoch nur in einer aufwendigen Apparaturen und mit einer aufwendigen Verarbeitungsprozedur durchführen, so dass sie sich nur schwer für die tägliche Routine eignet.
Ein anderes formalinfreies Fixierungsmittel wird von der Firma Anatech als„Prefer-Fixativ" angeboten. Dieses enthält Glyoxal, Ethanol und Puffer; hier liegen bislang aber nur wenige Erfahrungswerte in der histologischen Anwendung vor. Schon das Vorliegen von Alkohol in der Lösung, iässt sie aber für zahlreiche Färbungen ausscheiden.
Ein weiteres Produkt stammt von der Firma Sigma und wird unter der Bezeichnung Accustain vertrieben. Auch hier ist Ethanol der Grundbestandteil des Fixierungsmittels.
(44) Derzeit liegt für keines der alternativen Fixiermittel eine umfassende Prüfung und
wissenschaftliche Evaluierung der Ergebnisse histologischer Färbungen vor. Die Anforderungen an ein formalinfreies Fixiermittel sind dabei primär eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit bisherigen Ergebnissen von formalinfixierten Proben, sowie eine identische oder verbesserte Handhabung in der Routine, identische oder ähnliche Fixierdauern und identische oder bessere Färbeeigenschaften.
(45) Die erfindungsgemäße Lösung erfüllt diese Anforderungen und erlaubt erstmals das Fixieren und Anfärben von formalinfrei fixierten Gewebeproben unter Beibehaltung und sogar deutlicher Verbesserung der Farbsättigung, Farbbrillanz und Farbintensität in den nachfolgend aufgezählten Verfahren: a) Hämatoxylin & Eosin Färbung, unter Verwendung verschiedener
Hämatoxylinlösungen (nach Mayer, Gill, Harris, Weigert, Verhöff, Hansen, etc.) und Eosinlösungen (in wässriger, alkoholischer oder methanolischer Form mit verschiedenen Konzentrationen und Zusätzen von Essigsäure oder anderen pH- senkenden Zusätzen). b) Trichromfärbung wie beispielsweise nach Masson, Masson-Goldner, Azan,
Crossmon, Mallory, Cason, und andere Färbeprotokolle, welche eine ein-, zwei, drei- oder mehrstufige Färbung über Kernfärbungen, Plasmafärbungen und Faserfärbungen erzielen. c) Tri-, Tetra-, Penta- und Polychromatische Übersichts- und Spezialfärbungen, wie beispielsweise Movat Pentachrom, Mollier Vierfachfärbung, van Gieson, Hansen, Weigert und andere Färbungen zur physikalischen oder chemischen Färbung von speziellen Gewebestrukturen. d) Spezialfärbungen bzw. Spezialnachweise von Fasern, Gewebebestandteilen,
Zellkernen, Plasmabestandteilen und chemischen Eigenschaften, wie z.B. Elastica- Färbungen, Aldehydnachweise, Eisennachweise, andere Metallnachweise,
Amyloidnachweise, Fettfärbung, Darstellung von Mucopolysaccariden,
Silberfärbungen und Goldtonierungen, selektive Kernfärbungen, zytoiogische und hämatologische Färbungen, Calciumnachweise, Knochen- und Knorpelfärbungen, Nervenfärbungen, etc.
(46) Für alle erwähnten Färbeverfahren ist auszuführen, dass im Nachgang zu der Fixierung, die im Fixierungsmittel eingelegten Gewebestücke oder mit dem Fixierungsmittel durchtränkten
Gewebestücke, Organe oder ganzen Organismen einer klassischen, laborüblichen
Weiterverarbeitung unterzogen, d.h. sie werden entwässert und anschließend mit Paraffin oder auch anderen Einbettmedien (Celloidin, Acrylate) infiltriert und zu Probenblöcken verarbeitet, die schließlich am Mikrotom geschnitten werden können.
(47) Die Erfindung verbessert hierbei die plastischen Eigenschaften des fixierten Materials, so dass bei der
Verarbeitung zu Dünnschnitten, Schneideartefakte gar nicht oder nur in geringem Maße auftreten, weil zum einen keine Gewebeverhärtung durch„Überfixieren" auftritt und zum anderen die Gewebe nicht so stark schrumpfen, wie bei Formalinfixierungen üblich.
(48) Hierbei zeigt sich im Ergebnis, dass die mit der Erfindung behandelten Gewebestücke sich
vergleichbar, teilweise sogar leichter als formalinfixierte Gewebeproben verarbeiten lassen. Somit ist ein wetterer Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung die Tatsache, dass Gewebeproben die mit dieser Lösung fixiert wurden, hervorragende Schneideigenschaften aufweisen, und bei solchen Geweben die, wenn sie mit formaldchydhaltigcn Lösungen fixiert wurden, schwierig zu schneiden sind (z. B. Gehirngewebe), es zu deutlichen Verbesserungen der Schneideeigenschaften kommt.
(49) Damit werden weniger Artefakte in den histologischen Schnitt eingeführt, was eine wesentliche Verbesserung der mikroskopischen Untersuchung der Probe ermöglicht und damit die Diagnose von histologischen Anomalien und Auffälligkeiten erheblich erleichtert.
(50) Im Ergebnis sind die Färbungen nicht nur identisch, sondern wesentlich kräftiger und besser
differenzierbar, als Färbungen an formalinfixierten Proben, da Farbunterschiede im histologischen Schnitt schärfer und kräftiger sind, als bei formalinfixierten Proben, die Farben selbst sind leuchtender und selektiver für Unterschiede im Chemismus der Gewebe.
(51) Vorteilhaft ist zudem die Gewebeerhaltung. Schrumpfungen treten kaum, und wenn, dann in deutlich geringerem Maße als bei Formalinfixierungen auf. Zellkerne behalten ihre runde Form und lassen sich sehr gut mit üblichen Kernfarbstoffen anfärben. Bis in feinste Strukturen hinein ist eine hervorragende Erhaltung zu beobachten, die sogar der Erhaltung von Fixierungen mit Sublimat- und pikrinsäurehaltigen Fixierungsmitteln gleichkommt.
(52) Vorteilhaft ist weiterhin die einfache Handhabung. Die etablierten Laborroutinen müssten nicht geändert werden, da Fixierzeiten und Anwendung identisch bleiben können. Gewebeproben werden in die Probengefäße mit der Erfindung gegeben und verbleiben dort bis zur
Weiterverarbeitung. Die Fixierzeiten entsprechen denen des Formalin. Längere Fixierungen sind unproblematisch, bzw. sogar vorteilhaft. In keinem Fall aber ist eine ungewünschte Überfixierung der Gewebe bei Behandlung mit der erfindungsgemäßen Lösung zu beobachten. Ferner ist die angemeldete Lösung aus gefahrstoff- und gefah gu frech ι lieber Sicht unbedenklich und kann auch in der Entsorgung gehandhabt werden, wie unbedenklicher Chemikalienabfall.
(53) Im weiterem betrifft die Erfindung auch die Anwendung der Lösung als Konservierungsmittel für makroskopische Präparate, mit unter also ganze Tierkörper oder Leichen, wie sie in der Anatomie- Lehre Verwendung finden. Darüber hinaus findet sie auch Anwendung für die Fixierung und dauerhafte Konservierung von biologischem Probenmaterial in naturkundlichen Museen, zoologischen oder botanischen Sammlungen, Forschungssammlungen und Lehrsammlungen.
(54) Die Erfindung bezieht sich auch auf die Anwendung des Fixierungsmittels für
immunhistochemische Färbungen mit paraffingängigen Antikörpern, ebenso wie für Antikörper, die für Gefrierschnitte oder für Kunststoffpräparate geeignet sind.
Beschreibung der Figuren;
Figur 1: zeigt eine Gegenüberstellung von Färbeergebnissen einer AZAN Färbung an einer Gewebeprobe, nämlich Kleinhirn Ratte, wobei die für Figur 1 A verwendete Probe mit Formalin 4%, gemäß Standardverfahren fixiert wurde und die für Figur 1B verwendete Probe im
identischen Verfahren allerdings mit der erfindungsgemäßen Lösung fixiert wurde. Deutlich ist erkennbar dass Figur 1 B weniger Risse aufweist, eine bessere Erhaltung des Präparates und der Neuronen zeigt sowie eine kräftigere Färbung annimmt.
Figur 2: zeigt eine Gegenüberstellung von Färbeergebnissen einer HÄMATOXYLIN & EOSIN (H&E) Färbung an einer Gewebeprobe, nämlich Hoden Ratte, wobei die für Figur 2A verwendete Probe mit Formalin 4%, gemäß Standardverfahren fixiert wurde und die für Figur 2B verwendete Probe im identischen Verfahren allerdings mit der erfmdungsgemäßen Lösung fixiert wurde. Deutlich ist erkennbar dass Figur 2B klarer umgrenzte Strukturen aufweist, Feinstrukturen besser erhalten sind sowie dass die Probe eine kräftigere Färbung annimmt. Figur 3: zeigt eine Gegenüberstellung von Färbeergebnissen einer MSB LENDRUM Färbung an einer Gewebeprobe, nämlich Hoden Ratte, wobei die für Figur 3A verwendete Probe mit Formalin 4%, gemäß Standardverfahren fixiert wurde und die für Figur 3B verwendete Probe im
identischen Verfahren allerdings mit der erfindungsgemäßen Lösung fixiert wurde. Deutlich ist erkennbar dass in Figur 3B die Differenzierung der Feinstrukturen besser herauskommt sowie dass die Probe eine kräftigere Färbung annimmt.
Figur 4: zeigt eine Gegenüberstellung von Färbeergebnissen einer MOVAT Färbung an einer Gewebeprobe, nämlich Lunge Ratte, wobei die für Figur 4A verwendete Probe mit Formalin 4%, gemäß Standardverfahren fixiert wurde und die für Figur 4B verwendete Probe im identischen Verfahren allerdings mit der erfindungsgemäßen Lösung fixiert wurde. Deutlich ist erkennbar dass Figur 4B klarer umgrenzte Strukturen aufweist, Feinstrukturen (Bronchien und Aviolen) besser erhalten sind sowie dass die Probe eine kräftigere Färbung annimmt.
Figur 5: zeigt eine Gegenüberstellung von Färbeergebnissen einer MASSON TRICHROM Färbung an einer Gewebeprobe, nämlich Zunge Ratte, wobei die für Figur 5A verwendete Probe mit
Formalin 4%, gemäß Standardverfahren fixiert wurde und die für Figur 5B verwendete Probe im identischen Verfahren allerdings mit der erfindungsgemäßen Lösung fixiert wurde. Deutlich ist erkennbar dass Figur 5B eine schärfere Differenzierung der Feinstrukturen aufweist, die Färbung zu kräftiger gefärbten Zellkernen führt und die Probe insgesamt eine kräftigere Färbung annimmt.
Beispiele
Beispiel 1 : Zusammensetzung und Komponenten eines Fixierungsmittels
POS. PRODUKT % G/L Verwendungsbereich
1 Urotropin 4 40 bis zu 20%
2 Zitronensäure 5,43 54,29 bis zu 3 %
3 TWEEN 80 1.43 X 10E-2 0,143 bis zu 5%
4 Monopropylenglycol 2,86 28,57 bis zu 20%
5 (2 E)-3-Phenylprop-2-enal 4,29 X 10E-2 0,429 bis zu 5%
6 SPAN 80 0.71X10E-2 0,07 bis zu 5%
7 H20 oder geeignetes 87,65 876,5 Auffüllen auf 100%
Lösungsmittel.
TOTAL 1000 Beispiel 1.1: Berechnung der molaren Verhältnisse des Fixierungsmittel zur Gewebefixierung
Bei einer Zusammensetzung gemäß Beispiel 1 mit den Komponenten Urotropin und
Zitronensäure berechnet sich das molare Verhältnis wie folgt:
Urotropin setzt bis 6 Mol Formaldehyd aus 1 Mol Urotropin frei. Zitronensäure: setzt bis 3 Mol Protonen aus für 1 Mol Zitronensäure. 1 Mol Zitronensäure (wasserfrei) = 192, 124 g/Mol ~> 192, 124 g; weiterhin entspricht 1 Mol Urotropin = 140, 19 g/Mol => 140, 19 g
Eine Lösung, die 4% Urotropin und 5,5% Zitronensäure (wie in dieses Beispiel 1 vorgeschlagen) enthält, erreicht damit eine molare Konzentration Urotropin von 0,28 M und kann maximal bis 1,71 M Formaldehyd bilden. Ferner ist die molare Konzentration Zitronensäure 0,28 M und kann maximal bis 0,85 M Protonen bilden.
Das bedeutet, dass in der Lösung aus Beispiel Ϊ 0,85 Mol Formaldehyd aus HMTA gebildet werden können und es weiterhin ein Überschuss von HMTA in der Lösung bleibt. Das Molare Verhältnis zwischen gesamt freisetzbaren Aldehyd und gesamt aus der Säure freisetzbaren Protonen ist in diesen Fall ca. 2: 1, wobei zu berücksichtigen ist, das Urotropin im Überschuss vorliegt.
Bei einer Gleichgewichtsreaktion, bei der 0,85 Mol Formaldehyd gebildet werden können, funktioniert die Lösung hervorragend als Fixierlösung für die Histologie (siehe Beispiel 5, sowie Figuren 1 bis 5). .2. Vergleichsrechnung: am Beispiel einer anderen üblichen Lösungen:
Eine bekannte Lösung enthaltend 1 % Hexamethylentetramin (HMTA) und 1% Zitronensäure, weist nach entsprechender Berechnung wie unter Beispiel 1.1. eine molare Konzentration HMTA von 0,07M auf und kann maximal bis 0,42 M Formaldehyd bilden. Die molare Konzentration Zitronensäure ist hier bei 0,052M und kann maximal bis 0,15ό M Protonen bilden.
Das bedeutet, dass bei dieser bekannten Lösung maximal 0,156 Mol Formaldehyd aus HMTA gebildet werden können und ein Überschuss von HMTA in der Lösung bleibt. Das molare Verhältnis zwischen gesamt freisetzbaren Aldehyd und gesamt aus der Säure freisetzbaren Protonen ist in diesen Fall ca. 2,6: 1.
Wenn maximal 0,1 6 Mol Formaldehyd gebildet werde, funktioniert die Lösung NICHT als Fixierlösung für die Histologie, da alle bekannten Nebeneffekte - wie auch im Text oben beschrieben wie auch Schrumpfungen und morphologische Veränderungen bis auf beginnende Degeneration von dem Gewebe auftreten. Die genannten Werte wurden experimentell für HMTA und Zitronensäure bestätigt.
Beispiel 2 : Zusammensetzung und Komponenten einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
Figure imgf000017_0002
Das H examethylolmelamin, im weiteren HMM genannt, geht: folgende Gleichgewichtreaktion ein:
Figure imgf000017_0001
Melamin HMM
Diese Reaktion, läuft am besten bei pH 6-8 ab, weshalb gemäß vorliegender Ausführungsform eine schwache Säure, nämlich Borsäure verwendet wird. Der pH wird mit Natriumhydroxid angepasst. Es können pro Mol HMM -> 6 Mol Formaldehyd freigesetzt werden. Hieraus errechnet sich: 1 Mol HMM 270g
1 Mol Formaldehyd 30g
1 Mol HMM enthält 6 Mol Aldehyd oder 180g
Um eine Lösung mit gesamtfreisetzbarem Formaldehydgehalt von 4%/l zu erhalten, braucht man folglich 40g freisetzbares Formaldehyd oder 60g HMM. Von der Borsäure spalten sich 3 Protonen ab. Borsäure ist darstellbar mit der Formel H3B03 und weist eine Molmasse von 61,83g auf. Um 6 Mol Protonen zu bekommen, braucht man daher 27,5g, mit etwas Uberschuss gerechnet 30g Borsäure, bezogen auf 1000 ml Lösung,
Bei der vorliegenden Zusammensetzung stellt sich ein Verhältnis von Gesamt-freisetzbarem- Aldehyd / Gesamt-freisetzbaren- Protonen von ca. 1 : 1 ein.
Beispiel 3: Weitete alternative Ausführungsformen
Gemäß den oben in Beispiel 1.1. und auch Beispiel 2 dargestellten Berechnungen können weitere alternative Zusammensetzungen zubereitet werden. Die alternativ einsetzbaren Bestandteile sind in nachfolgender Tabelle aufgeführt.
Jede Kombination der Substanzen angegeben unter Position 1 mit den Substanzen aus Position 2 ist darstellbar. Gegebenenfalls werden die Substanzen aus Position 5 hinzu kombiniert z.B. um damit den Anteil an gesamt-freisetzbarem- Aldehyd einzustellen. Erfindungsgemäß muss eine durch diese Kombinationen zusammengestellte Lösung, mindestens 0,5 Mol/1 gesamt freisetzbares Aldehyd aufweisen. Die Substanz Alternativen der Positionen 3 und 4 sowie 6 und 7 sind optional und nach Bedarf kombinierbar.
POSITION ALTERNATIVE KOMPONENTEN
bezogen auf
die Tabelle
in Beispiel 1
1 Urotropin, Triazinen, Dimethylol, Dihydroxyethylenurea, Tetramethylol- acciylendiurea, Mono-, Di-, Tri-, Tetra-, Penta- oder Hexamethylolmelamin, Dimethylol-propylenurea, Acetoguanamin oder 5,5-Dimethylhydantoin oder Mischungen derselben
2 Oxalsäure, Weinsäure, Succinsäure, Salzsäure, Essigsäure, Propionsäure,
Ameisensäure, Mono-, Di-, Tri-, Chloressigsäure, Harnsäure, Zitronensäure, Borsäure, Phosphorsäure, oder Mischungen derselben
3 TWEEN 80, Polysorbate 20, 40, 60 oder 80, Alkaline, Laurilsulfate;
Dodecüsulfate, Dodecilsulfonate, Dodecilbenzenosulfonate; Fettsäuren ethoxyliert; Ionische und nicht-ionische Tenside mit hohem HLB (HLB-Wert (engl Abk.: hydrophilic-lipophilic-balance) beschreibt in der Chemie den hydrophilen und lipophilen Anteil von hauptsächlich nicht-ionischen Tensiden und wurde 1954 von W. C. Griffin vorgeschlagen. Tenside mit einem hohen HLB-Wert bewirken eine gute Benetzung hydrophiler Oberflächen) oder Mischungen derselben
4 Mono-, Di-, oder weitere Poly-Propylenglykole; Glyzerin; Mono-, Di-, oder weitere Poly-Ethylenglycole; Sorbkol, Pentaeritriol, PEG niedermolekular, PEG hochmolekular und Mischung derselben
5 Citral, 3,7-Dimethylocta-2,6-dienal, Geranial, (E)-3,7-Dimethylocta-2,6-dienal,
Propanal, Butanal, Valerianaldehyd, Pentanai, Hexanal, Heptanal, Octanal, Nonanal, Decanal, (2 E)-3-Phenyiprop-2-enal, Benzaldehyd, Phenylmethanal, Vanilinaldehyd, 4-Hydroxy-3-methoxyphenylmethanal und Mischungen derselben
6 SPAWN 80, Polysorbate, Laurilsulfate, Fettsäuren ethoxyliert, ionische, nicht
ionische Tenside mit niedrigen HLB oder Mischungen davon
7 H20; Alkohole; Acetone; Dimethylsulfoxid; Akylcarbonate; polare organische
Lösungsmittel und Mischungen davon
Beispiel 4: Verfahren zur Präparation von histologischen Proben zur mikroskopischen Untersuchung.
Gemäß dem erfinderischen Verfahren sollte die Gewebeprobe so frisch wie möglich in der Fixierlösung z.B. die Lösung gemäß Beispiel 1, gebracht werden. Allgemein üblich ist es dass die Menge der Fixierlösung dem zwanzigfachen des Probenvolumens entspricht und die Fixierzeit abhängig von der Probengröße ist. Je nach Größe bleiben die Proben von 12 bis 36 Stunden, größere Proben auch 72 Std. oder länger in der Fixierlösung liegen. Man geht von einer
Diffusionsdistanz bzw. Eindringgeschwindigkeit von 1 mm in 2-4 Std. aus.
Um die Probe anschließend in Paraffin oder anderen Einschlussmitteln einzubetten ist eine vollständige Entwässerung der Probe notwendig. Zunächst wird die Probe aus der Fixierlösung genommen, in fließendem Wasser gewaschen und in einer Reihe von Alkoholen in aufsteigender Konzentration getaucht. Die Schritte zwischen den Konzentrationsstufen sind hier z.B. 30 - 50 ~ 60— 70— 80— 90— 96 - 100. Als Alkohole werden üblicherweise Ethanol oder Isopropanol verwendet. Im Anschluss an die Entwässerung wird die Probe in einem geeignetes organisches Lösungsmittel getaucht, welches sowohl mit Alkohol, wie auch mit dem Einbettmedium mischbar ist, dann folgt die Infiltration mit dem eigentlichen Einbettmedium (Paraffin) in mehreren Stufen, für jeweils mehrere Stunden (abhängig von der Probengröße). Zum Abschluss wird die Probe wird mit einer kleinen Menge Paraffin in eine passende Form eingegossen. Nachdem der Block erstarrt ist, wird der Block aus der Form entfernt kann dann geschnitten werden. Mit einem geeigneten Mikrotom werden Schnitte in der Dicke von 4-6 μηι hergestellt und diese auf Glasobjektträger aufgezogen.
Die Glasobjektträger mit den Paraffinschnitten können über längere Zeit gelagert werden. l.d.R. jedoch erfolgt eine direkte Weiterverarbeitung, d.h. Färbung. Hier muss zunächst das Paraffin wieder entfernt und der Gewebeschnitt selbst gewässert werden. Es wird die zuvor beschriebene Prozedur in umgekehrter Reihenfolge angewandt, d.h. Herauslösen des Paraffin mit Xylol, anschließend Alkohol 96 %, 90 %, 80 %, 70 %, o. Ä. eine ähnliche Abfolge, bis hin zum Wasser. Erst dann beginnt die Färbung, wobei bei Farbstoffen, die in alkoholischer Lösung vorliegen die Schritte bis zur vollständigen Wässerung entfallen können und die Objektträger direkt in die alkoholische Färbelösung getaucht werden.
Beispiel 5: Beurteilung der morphologischen Erhaltung, Schneid- und Färbbarkeit von
Paraffinpräparaten
Mit Hilfe von klassisch histologischen Färbungen konnte eine diagnostische Auswertung von Schnittproben durchgeführt werden. Die Schnitte wurden aus Geweben angefertigt, welche zuvor entweder in der Lösung aus Beispiel 1 oder in 4%-igen Formalin fixiert wurden. Die qualitative Auswertung erfolgte auf vier exemplarisch ausgewählten Färbungen (1) Hämatoxylin & Eosin (HE), (2) Azan nach Geidies, (3) Masson Goldner Trich.ro m und (4) MSB Lendrum. Die histologisch diagnostische Auswertung erfasst die Parameter Morphologische Erhaltung und
Färbbarkeit der Schnitte. Die Bewertung des Parameters Schneidbarkeit erfolgte während des Schneidevorgangs auf verschiedenen Geweben.
Exemplarisch eingesetzte Färbungen
HÄMATOXYLIN & EOSIN: Die klassische H & E - Färbung verwendet die Farbstoffe Hämatoxylin in der Zusammensetzung nach Mayer und Eosin. Beide Farbstoffe werden in wässriger Lösung (Eosin ggf. auch als alkoholische Lösung) mit einem definierten pH-Wert bzw. einem definierten Säurezusatz angeboten und liefern ein charakteristisches Färbebild. Zellkerne färben sich hier i.d.R. blau-violett an. Hierbei reagiert der Farbstoff Hämatoxylin, der als Alaun- omplex angeboten wird, mit dem Chromatin der Zellkerne. Um einen stabilen, wasser- und alkoholunlöslichen Lack zu erhalten wird diese Verbindung anschließend in Leitungswasser oder in eine mit einwertigen Metallionen versetzten Salzlösung getaucht. Die Eosinlösung wird in wässriger Form auf einen pH-Wert von etwa 4,0 eingestellt, was zu einem charakteristisch leuchtend orangenen Farbbild führt. Eosin bindet in unterschiedlicher Intensität an verschiedene Gewebe- und Zellstrukturen und erlaubt somit eine gute Differenzierung des histologischen Schnittes.
MASSON GOLDNER TRICHROM: Die Masson Goldner Trichrom sowie die Crossmon-Färbung sind ebenfalls klassisch-histologische Färbungen, die als Trichromfärbung mit drei (bzw. vier) Farbstoffen arbeiten. Die Kerne werden auch hier mit Hämatoxylin angefärbt, jedoch nicht mit einem Alaun-Komplex, sondern über einen Eisenkomplex. Dies führt nicht zu einem blau-violett gefärbten Zellkern, sondern zu einem braun-schwarzen Zellkern, der sich sehr deutlich auch gegen blau gefärbte Gewebekomponenten differenzieren lässt. Als zweiter Farbstoff wird eine Mischung aus Säurefuchsin, Poneeau und Azophloxin verwendet, die sich in verschiedener Weise mit unterschiedlichen Gewebebereichen verbindet und es gestattet Zellplasma und andere
intrazelluläre Strukturen zu identifizieren. Dieser Farbstoffkomplex reagiert direkt mit den jeweiligen Gewebestrukturen. Ein weiterer Farbstoff, Orange G ist ein sogenannter Beizfarbstoff, der erst in Gegenwart eines zweiwertigen Metallions, wie es z.B. von Phosphorwolframsäure oder Phosphormolybdänsäure bereit gestellt wird, einen wasser- und alkoholunlöslichen Lack mit bestimmen Gewebestrukturen bildet. Mit diesem Farbstoff lassen sich vor allem Erythrozyten und Muskeln darstellen und deutlich von anderen Geweben unterscheiden. Auch keratinöses Material färbt sich mit Orange G deutlich an. Als vierter Farbstoff wird alternativ Anilinblau oder
Lichtgrün verwendet. Hierbei handelt es sich um klassische Faser farbstoffe, die sich vor allem mit Kollagenen und interzellulären Strukturen verbinden. Ebenso Knorpel- und Knochenmaterial verbindet - je nach Chemismus - mit diesen Farbstoffen. Unterschiedliche Blau- bzw.
Grünintensitäten erlauben schließlich diagnostische Aussagen über die Faserzusammensetzung, wobei Anilinblau i.d.R. das differenziertere Bild ergibt.
MSB-LENDRU : Die MSB-Lendrum-Färbung ist eine der Masson Goldner Trichrom verwandte Färbung, bei der jedoch statt Säurefuchsin-Azophloxin-Ponceau und statt Orange G die Farbstoffe Martiusgelb und Kristallponceau angeboten werden. Im Ergebnis ist ein vergleichbares, jedoch noch weiter differenziertes Bild zu beobachten, wobei die Aussagekraft der MSB-Färbung vor allem für Gefäßstrukturen von besonderem Wert ist, weil hier Muskelstränge, Faseranordnung und Gefäßinnenwände besser differenziert werden, als bei den zuvor genannten
Trichromfärbungen.
AZAN NACH GEIDIES: Die AZAN-Färbung gehört ebenfalls in die Reihe der klassischen
Trichromfärbung. Die ursprüngliche Varainte nach Heidenhain arbeitet in der Vorbehandlung der Schnitte mit Anilinalkohol, Azokarmin zur Kernfärbung, Phosphorwolframsäure zum Beizen und einem Färbegemisch aus Anilinblau und Orange G und dauert mehrere Stunden. Die nach Geidies modifizierte Variante hingegen verzichtet auf Anilinalkohol, verwendet statt des
Azokarmin Kernechtrot und verkürzt die Beizzeiten drastisch. Das Ergebnis der Färbung ist so ähnlich, dass die klassische AZAN-Färbung weitgehend ersetzt werden kann. Die Ergebnisse sind im Wesentlichen mit denen der K asson-Goldner und MSB-Lendrum zu vergleichen. Zellkerne werden durch das in Aluminiumsulfatlösung angebotene Kernechtrot kräftig rot angefärbt und heben sich gut von dem durchgehend blauen Hintergrund ab. Anilinblau und Organge G erzeugen die Gegen- bzw. Hintergrundfärbung (blau) und eine gut differenzierte Färbung der Erythrozyten (Orange) und des Muskelpiasmas (ebenfalls kräftig Orange). Zudem färben sich Kreatin, verhornte Epithelien ebenfalls deutlich orange an. Grundsubstanz und Fasern erhalten durch das Anilinblau verschiedene Blauabstufungen. Das Ergebnis der Anilinblau-Färbung wird insgesamt sehr stark von der Beizdauer beeinflusst.
5.1. Morphologische Erhaltung
Zur Beurteilung der morphologischen Erhaltung auf lichtmikroskopischer Ebene können folgende Parameter herangezogen werden, (A) Fragmentierung des Gewebes (Rissbildungen) sowie (B) die Darstellung der Zellkerne (Nuklei) und (C) der Zellkörper (Somata).
Die Fragmentierung des Gewebes durch die Bildung von einzelnen Rissen oder ausgebreiteten Rissnetzen resultiert aus einer mangelhaften Fixierung und manifestiert sich bei der Streckung des Gewebeschnittes auf dem Warmwasserbad bzw. der Heizplatte sowie während des Färbeprozesses. Im Zuge der wärmebedingten Streckung des Paraffins und somit auch des von Paraffin durchdrungenen und eingehüllten Gewebeschnittes kommt es zu einer physikalischen Belastung des Paraffin/Gewebe- Verbandes, die bei mangelnder Fixierung im Aufbrechen des Gewebes resultieren kann. Die während der Entparaffinierung und Färbung des Gewebeschnittes auftretenden Zug- bzw. Spannungskräfte setzen besonders an diesen während der Streckung bereits strapazierten Gewebestellen an, erweitern diese oder brechen das Gewebe zur Gänze auf. Die Tendenz zur Rissbildung ist proportional zur Hafteigenschaft des verwendeten Objektträgers.
Die Wertung erfolgt zwischen (keine Fragmentierung des Gewebes, 1) sowie (Zellkerne und Zellkörper in ihrer natürlichen Form, 1) und (Gewebe durch Rissbildung zerstört und abgelöst, 4) sowie (Zellkerne eckig und stark eingefallen, Zellkörper massiv geschrumpft mit starker „Hofbildung", 4). Generelle Kriterien
Figure imgf000023_0001
5.2. Schneidbarkeit
Ein weiteres Kriterium in der histologischen Verarbeitung von Gewebeproben ist die sog.
Schneidbarkeit des Gewebes. Die unterschiedlichen Eigenschaften von Fixierungsmitteln resultieren - meist in Abhängigkeit von der Inkubationszeit - in einer unterschiedlichen
Schneidbarkeit bzw. Belastbarkeit des Gewebes. Ein Gewebe kann durch Fixierung z.B. spröde und brüchig (keine Schneidbarkeit, 4) oder aber geschmeidig und widerstandsfähig (hohe Schneidbarkeit, 1) werden. Unterschiedliche Gewebeeigenschaften verschiedener Gewebetypen müssen in der Bewertung berücksichtigt werden.
Generelle Kriterien
Figure imgf000023_0002
5.3. Färbbarkeit
Histologische Färbungen von Gewebeschnitten erlauben, in Abhängigkeit der verwendeten Farbstoffkombinationen oft mannigfaltige Unterscheidungen zwischen einzelnen Zellen aber auch Gewebetypen. Diese in der Human- und Veterinärdiagnostik aber auch in der medizinischen, zoologischen und botanischen Forschung angewandte histologische Differenzialdiagnose basiert auf der Differenzierung von Zellkerntypen aber insbesondere auch auf der Differenzierung von Farbniederschlägen auf Zellen bzw. Geweben. Eine möglichst hohe Farbsättigung, gleichmäßiger Farbniederschlag, gute Kontrastierung (zwischen Zellkern und Zellkörper) sowie eine hohe Farbbrillanz sind deshalb nicht nur wünschenswerte, sondern auch dringend erforderliche Anforderungen an eine Färbung.
Chemische Reaktionen zwischen dem Fixierungsmittel und dem Gewebe beeinflussen nicht nur die Schneidbarkek und die Belastbarkeit des Gewebes sondern auch dessen Färbbarkeit.
Verschiede Fixierungsmittel können, in Abhängigkeit der Inkubationszeit die Färbbarkeit eines Gewebeschnittes verbessern oder aber auch verringern. Um die Färbbarkeit von Geweben zu bestimmen werden folgende Kriterien herangezogen, 1. Farbsättigung, 2. Gleichmäßiger Farbniederschlag, 3. Kontrast zwischen Zeilkern und Zellkörper und 4. Farbbrillanz. Die einzelnen Färbungen müssen getrennt voneinander beurteilt werden, da Färbungen, bzw. deren Komponenten unterschiedlich auf den Einfluss von Fixierungsmitteln reagieren.
Generelle Kriterien
1. Farbsättigung Wertung
Sehr gute Farbsättigung 1
Gute Farbsättigung 2
Mäßige Farbsättigung 3
Mangelhafte Farbsättigung 4
2. Farbniederschlag Wertung
Gleichmäßiger Farbniederschlag ohne Übersättigung 1
Farbniederschlag mit geringen Schwankungen 2
Teils unregelmäßiger Farbniederschlag 3
Vollkommen unregelmäßiger Farbniederschlag 4
3. Kontrast (Zellkern / Zellkörper) Wertung
Sehr guter Kontrast (generell gute Differenzierbarkeit von 1
Kernbestandteilen und/oder Kernmembranen)
Guter Kontrast (größtenteils gute Differenzierbarkeit von 2
Kernbestandteilen und/oder Kernmembranen)
Mäßiger Kontrast (wenig Differenzierbarkeit von 3
Kernbestandteilen und/oder Kernmembranen)
Schlechter Kontrast (keine Differenzierbarkeit von 4
Kernbestandteilen und/oder Kernmembranen)
4. Farbbrillanz Wertung
Sehr hohe Farbbrillanz 1 Hohe Farbbrillanz 2
Niedrige Farbbrillanz 3
Sehr niedrige Farbbrillanz 4
5-4. Auswertung / Ergebnis
Der beschriebene Kriterienkatalog bildet die Grundlage für die anschließende tabellarische Darstellung der Ergebnisse. Von folgenden Geweben wurden nach 24 - stündiger Fixierzeit in der Lösung gemäß Beispiel 1 oder 4% Formalin Schnittproben hergestellt: Gehirn, Herz, Lunge, Niere, Haut und Hoden. Diese wurden dann gleichzeitig mit HE, Azan n. Geidies, Masson Goldner Trichrom und MSB Lendrum gefärbt.
1. Morphologische Erhaltung:
Kriterium Lösung nach Beispiel 1 Formalin
Fragmentierung 1 3
Zellkerne 2 2
Zellkörper 2 2
. Schneidbarkeit:
Gewebetyp Lösung nach Beispiel 1 Formalin
Gehirn 1 2
Herz 2 2
Lunge 2 3
Niere 2 3
Haut 1 2
Hoden 1 2
.a. Färbbarkeit (H & E):
Kriterium Lösung nach Beispiel 1 Formalin
1. Farbsättigung 1 2
2. Farbniederschlag 2 3
3. Kontrast 1 2
4. Farbbrillanz 1 2 .b. Färbbarkeit (Azan nach Geidies):
Kriterium Lösung nach Beispiel 1 Formal in
1. Farbsättigung 1 2
2. Farbniederschlag 2 2
3. Kontrast 2 2
4, Farbbrillanz 1 3
>.c. Färbbarkeit (Masson Goldner Trichrom):
Kriterium Lösung nach Beispiel 1 Formalin
1. Farbsättigung 1 2
2. Farbniederschlag 2 3
3. Kontrast 1 2
4. Farbbrilianz 1 3
.d, Färbbarkeit (MSB Lendrum):
Kriterium Lösung nach Beispiel 1 Formalin
1. Farbsättigung 1 3
2. Farbniederschlag 2 3
3. Kontrast 2 4
4. Farbbrillanz 2

Claims

Ansprüche
Fixierungsmittel für Gewebeproben enthaltend
- wenigstens ein Polyamin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Urotropin, Triazinen, Dimethylol-dihydroxyethylenurea, Mono-, Di-, Tri-, Tetra-, Penta- oder Hexamethyloimelamin, Tetramethylol-acetylendiurea, Dimethylol-propylenurea, Acetoguanamin oder 5,5- Dimethylhydantoin und Mischungen derselben, und
- wenigstens ein Säuerungsmittel ausgewählt aus der Gruppe der freien ein-, zwei- oder mehrwertige Säure bestehend aus Oxalsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Succinsäure, Salzsäure, Essigsäure, Propionsäure, Ameisensäure, Mono-, Di-, Tri-, Chloressigsäure, Borsäure, Phosphorsäure und Mischungen derselben, dadurch gekennzeichnet, dass
das Polyamin mit den von der Säure freigesetzten Protonen reagiert und dabei Aldehyde bildet oder freisetzt, und das molare Verhältnis zwischen der molaren Konzentration des freisetzbaren Aldehyds per Mol Polyamin zu der molare Konzentration der freisetzbaren Protonen per Mol Säure in einem Bereich von 1 :0,7 bis 1 : 1 ,5 liegt.
Fixierungsmittel gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Fixierungsmittel mindestens ein weiteres polyfunktionelles Aldehyd ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citral, 3,7-Dimethylocta-2,6-dienal, Geranial, (E)-3,7-Dimethylocta-2,6-dienal, Propanal, Butanal, Valerianaldehyd, Penfanal, Hexanal, Heptanal, Octanal, Nonanal, Decanal, (2 E)-3- Phenylprop-2-enal, Benzaldehyd, Phenylmethanal, Vanilinaldehyd, 4-Hydroxy-3- methoxyphenylmethanal und Mischungen derselben umfasst.
Fixierungsmittel gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die molare
Konzentration des gesamt verfügbaren Aldehyds in der Lösung mindestens 0,5 Mol/1 beträgt
Fixierungsmittel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass es in wässriger Lösung vorliegt.
Fixierungsmittel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass es auf einen pH-Bereich von 3-8 eingestellt ist.
Fixierungsmittel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass es stark hydrophile Verbindung enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
M n o ρ ropy 1 nglyko 1 , Dipropylenglykol, Polypropylenglykol, Glyzerin, Pentaerytriol, Sorbitol, Ethylenglykol, Diethylenglykol und Polyethylenglykol. (7) Fixierungsmittel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dadurch, dass es ein Tensid enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ethoxylierte nicht: ionische Tenside mit hohen und/oder niedrigen HLB Wert, Polysorbate besonders Polysorbat 20, 40, 60 oder 80, Saponine, Aikalisalze von Decilsulphate, Decilsulphonate, Dodecilsulfate, Dodecilsulphonate und Dodeciibenzenosulphonate, Oleate, Stearate, Caprate, Caprilate und Beta ine.
(8) Fixierungsmittel gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass es als wasserfreie Mischung aus kristallinen oder wasserfreien Bestandteilen, die in Form von löslichen Pulver oder als lösliche gepresste Tablette einem geeigneten Lösungsmittel zugegeben werden, vorliegt.
(9) Verfahren zur Anfärbung von formalinfrei fixierten Gewebeproben dadurch gekennzeichnet, dass
- in einem ersten Schritt die Gewebeprobe mit dem Fixierungsmittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 fixiert wird,
- in einem zweiten Schritt die Gewebeprobe zur Färbung vorbereitet wird und optional geschnitten wird,
- in einem dritten Schritt die Gewebeprobe angefärbt wird, und
- mikroskopisch ausgewertet wird.
(10) Verwendung des Fixierungsmittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Vorbereitung und Fixierung von Gewebeproben für histologische oder immunhistochemische Färbungen der Gewebeprobe.
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