WO2013162199A1 - 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법 - Google Patents

줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법 Download PDF

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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a medium for culturing stem cells, and more particularly, to a medium for culturing stem cells containing a knock-out serum replacement (KOSR) and a method for culturing stem cells using the same.
  • a knock-out serum replacement KOSR
  • stem cells necessary for the treatment can be obtained at low cost without the risk of contamination by heterologous proteins, and thus can be obtained in high purity stem cells, which is useful for cell therapy using stem cells.
  • pluripotent stem cells With the ability to form all organs through proliferation and differentiation were found to be capable of fundamentally solving long-term damage as well as treating most diseases.
  • Stem cells are cells that have the ability of self-replication and differentiate into two or more cells.
  • Totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells can be classified as a multipotent stem cell.
  • Many scientists have suggested the possibility of applying stem cells to almost all organ regeneration of the human body, as well as treatment of Parkinson's disease, which was incurable disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury.
  • the neural stem cells have the ability to differentiate into the neuronal cells (neurons), astrocytes (astrocytes), oligodendrocytes that make up the central nervous system, the stem cells using these neural stem cells
  • neuronal cells neuronal cells
  • astrocytes astrocytes
  • oligodendrocytes that make up the central nervous system
  • the stem cells using these neural stem cells
  • the method of establishing autologous adult neural stem cells by culturing human adult brain tissue can be free from ethical problems compared to other methods using embryonic stem cells or fetal brain tissue, and enables patient-specific cell therapy. It may be an alternative to overcome the limitations of treatment.
  • the present inventors have cultivated stem cells in a medium into which a knock-out serum replacement (KOSR) was introduced, and confirmed that KoSR could be used as a substitute for serum, thereby completing the present invention.
  • KOSR knock-out serum replacement
  • An object of the present invention is to provide a stem cell culture medium capable of obtaining high purity stem cells at low cost without exposure to heterologous proteins.
  • Another object of the present invention to provide a method for culturing stem cells using the culture medium.
  • FIG. 1A shows neural stem cells- (Nestin, Sox1, Sox2), glial cells- (CD44), and astrosite- (GFAP) for adult neural stem cells obtained through primary culture of adult neural stem cells derived from human temporal lobe brain tissue.
  • 1B shows the results of verifying the expression of adult neural stem cell specific marker proteins (Nestin, Sox2, CD133, Hes3) derived from human temporal lobe brain tissues by immunocytochemistry.
  • Figure 2 A shows a schematic diagram of the adult neural stem cell culture process derived from human temporal lobe brain tissue using knockout serum replacement (KoSR).
  • FIG. 2B shows human adult neural lines cultured in each of culture medium (b) containing neural stem cell culture medium (a) containing growth factor (FBS) and growth factor and knockout serum replacement (KoSR). Photographs of the blast cells are shown.
  • FBS growth factor
  • KiSR growth factor and knockout serum replacement
  • 3A shows neural stem cells (Nestin) and astrosite (GFAP) for cells (# 1) cultured in a medium according to the present invention containing knockout serum replacements by concentration (1%, 10%, 20%). ), Oligodendrosite (O4), neuron (Tuj-1) specific marker protein expression of immunocytochemistry (immunocytochemistry) results.
  • a medium containing no knockout serum substitute (KoSR) and containing 0.5% FBS was used as a control.
  • FIG. 3B shows the results of analyzing the expression of Tuj-1, a neuron-specific marker, with respect to the cells of A of FIG. 3 using a flow cytometer (FACS).
  • FACS flow cytometer
  • 3C is a graph showing quantification of FACS analysis data of B of FIG. 3.
  • FIG. 4A shows neural stem cells of cells cultured in a medium according to the present invention (K2) containing knockout serum substitutes (KoSR) at different concentrations (0%: control, 1%, 10%, 20%).
  • K2 knockout serum substitutes
  • KoSR knockout serum substitutes
  • concentrations 0%: control, 1%, 10%, 20%.
  • GFAP astrosite
  • O4 oligodendrosite
  • neurons Tuj-1 specific marker protein expression of immunocytochemistry (immunocytochemistry) results from the results (immunocytochemistry).
  • FIG. 4B shows the result of analyzing the expression of Tuj-1, a neuron-specific marker, with respect to the cells of A of FIG. 4 using a flow cytometer (FACS).
  • FACS flow cytometer
  • 4C is a graph showing quantification of FACS analysis data of FIG. 4B.
  • the present invention relates to a stem cell culture medium containing a basal medium and a knock-out serum replacement (KOSR).
  • KOSR knock-out serum replacement
  • culture medium containing a knockout serum replacement means a culture medium further including “knock-out serum replacement (KOSR)" in a basal medium.
  • the culture medium according to the present invention does not include growth factors such as fetal bovine serum (FBS), bFGF, and EGF, which have been used for culturing conventional stem cells.
  • Fetal bovine seurm which is still widely used in cell and tissue culture, is a complex medium (additive) containing many unknown factors besides hormones, growth factors, and vitamins. It has been reported that it may be the cause of some abnormalities in the calf that occur during and after the development of the embryo after fertilization (see: Fetal bovine serum and its alternatives, BSA and PVA). Impact, abnormal phases, etc.). Therefore, when using a medium containing FBS in culturing human adult or embryonic stem cells, stem cells are exposed to heterologous proteins, and stability is a problem in clinical application of stem cells cultured in such medium.
  • FBS FBS
  • EGF EGF
  • bFGF bFGF
  • the culture medium according to the present invention does not contain FBS, growth factors (EGF, bFGF, etc.), but human adult stem cells cultured in the culture medium are cultured in a form similar to that of conventional culture (see FIG. 2B).
  • the culture medium according to the present invention can replace the culture medium containing the FBS and the growth factor of the high / high concentration used in the past.
  • knockout serum substitutes are amino acids (glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-hydroxyproline, L-serine, L-threonine, L Tryptophan, L-tyrosine, L-valine, vitamins / antioxidants (thiamine, reduced-glutathione, ascorbic acid 2-PO 4 ), trace elements (Ag + , Al 3+ , Ba 2+ , Cd 2+, Co 2+, Cr 3+ , Ge 4+, Se 4+, Br -, I -, F -, Mn 2+, Si 4+, V 5+, Mo 6+, Ni 2+, Rb + , Sn 2+ , Zr 4+ ), protein (iron-saturated, insulin, adipose albumin (AlbuMAX)) may be included (Albumin-associated lipids regulate human embryonic stem cell self-renew
  • the "basal medium” is a basal medium used for stem cell culture, a conventional medium known in the art suitable for stem cell culture, such as DMEM, MEM, K-SFM medium, etc. It can be used, preferably serum-free medium can be used, most preferably a mixture of DMEM: F12 media, B27 supplement and antibiotics can be used.
  • DMEM fetal calf serum
  • F12 media fetal calf serum
  • B27 supplement preferably a mixture of DMEM: F12 media, B27 supplement
  • antibiotics can be used.
  • penicillin / streptomycin Invitrogen
  • penicillin / streptomycin was used as an antibiotic, but the present invention is not limited thereto, and any antibiotic may be used without limitation.
  • the basal medium may be supplemented with additives known in the art to promote the proliferation of the undifferentiated phenotype of human neural stem cells while inhibiting differentiation.
  • the medium may also contain neutral buffers (such as phosphates and / or high concentrations of bicarbonate) and protein nutrients (such as essential and non-essential amino acids such as glutamine) in the isotonic solution.
  • lipids fatty acids, cholesterol, HDL or LDL extracts of serum
  • other components found in most preservative media of this kind (such as insulin or transferrin, nucleosides or nucleotides, pyruvate salts, any ionized form or salt)
  • Sugar sources such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and / or reducing agents such as ⁇ -mercaptoethanol.
  • the medium contains an anti-clumping agent such as Invitrogen's product (Cat # 0010057AE) and the like for the purpose of preventing the cells from adhering to each other, adhering to the container wall, or forming too large a bundle. You may.
  • stem cell refers to the undifferentiated cells of the stage prior to the differentiation (differentiation) to each cell constituting the tissue, the differentiation proceeds to a specific cell by a specific differentiation stimulus (environment).
  • stem cells unlike differentiated cells that have ceased cell division, are capable of self-renewal by cell division and thus proliferation (expansion). It is characterized by having plasticity in differentiation because it can be differentiated into other cells by different environment or differentiation stimulus.
  • These stem cells can be classified into embryonic stem cells and adult stem cells according to their origin, but in the present invention, adult stem cells are used, rather than embryonic stem cells, which have many biological, ethical, and legal problems, and thus have many limitations in clinical applications. It is desirable to.
  • adult stem cells are stem cells extracted from grown body tissues and are primitive cells immediately before they are differentiated into cells of specific organs.
  • Adult stem cells are difficult to proliferate and have a strong tendency to differentiate, but instead can differentiate into tissue-specific progenitor cells inherent in the human body.
  • Adult stem cells can be differentiated to become cells having various properties, and have the ability to generate replacement cells for a wide range of tissues and organs such as the heart, pancreas, nerve tissue, muscle, cartilage, and the like.
  • methods conventional in the art which are appropriate for each tissue, can be used.
  • the obtained specific tissues are separated into single cell bodies by treatment with trypsin solution and / or collagenase and the like, and then cultured in a suitable medium in which growth factors such as bFGF and EGF are added in an appropriate amount. Then, it can be separated by FACS or the like, or a method of separating adult stem cells according to the growth rate.
  • a suitable medium in which growth factors such as bFGF and EGF are added in an appropriate amount.
  • FACS FACS
  • a method of separating adult stem cells according to the growth rate Preferably neural stem cells or neural crest stem cells (NCSCs) can be used.
  • Neural stem cells refers to cells that can perform cell division more than 20-30 times and maintain potency capable of producing neurons and glial cells. Preferably, the cells are capable of performing at least 40, more preferably at least 50, most preferably unlimited cell division.
  • the neural stem cells are defined as multipotent, that is, they can differentiate into multiple neuronal cell types (eg neurons / glia). Neural stem cells can be secured by primary culture of the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS), which can differentiate into glial lineage and neural lineage under specific differentiation conditions. (Sally Temple et al. 2001).
  • NNS neural crest stem cells
  • NCSCs are stem cells that appear temporarily during early embryonic development and are likewise multipotent stem cells.
  • neural stem cells from various sources.
  • the brain may be any one selected from the group consisting of cerebral, hepatic brain, midbrain, cerebellum, soft water, pontoon and spinal cord, preferably derived from the cerebrum, Specific examples may be temporal lobe tissue or hippocampal tissue.
  • Human neural stem cells may be purchased and used commercially, preferably cells obtained from adult human brain tissue may be prepared by culturing in a medium to which the neural stem cell growth factor is added (see Example 1).
  • cells were established through primary culture from temporal lobe tissue obtained through surgical operation of an epileptic patient.
  • temporal lobe tissue obtained through surgical operation of an epileptic patient.
  • cells may be obtained and used from hippocampal tissue.
  • the present invention also provides human adult stem cells with reduced spontaneous differentiation.
  • Neural stem cells cultured in the culture medium according to the present invention is reduced spontaneous differentiation, according to the culture medium according to the present invention can obtain a high purity human adult neural stem cells (see Fig. 3, 4).
  • the present invention provides stem cells, preferably adult neural stem cells, which have reduced spontaneous differentiation ability.
  • Most neural stem cells undergo spontaneous differentiation if they sustain long-term incubation regardless of their tissue or cell type.
  • spontaneous differentiation refers to differentiation phenomena that occur even in a state in which no differentiation is induced by treating differentiation inducing substances (Growth factor, hormone, chemical, etc.) from the outside as a concept distinguished from induced differentiation.
  • “high purity stem cells” refers to stem cells with low spontaneous differentiation ability.
  • Temporal lobe tissues were obtained through surgical surgery of patients with epilepsy (Samsung Medical Center Neurosurgery). (Cells from patient 1 were cell # 1 and cells from patient 2 were cell # 2). Each tissue was washed with PBS within 3 hours after surgery, and then mechanically crushed using surgical scissors or a razor, and collagenase (0.4 mg / ml, Gibco) and DNaseI (0.01-1 mg / ml, Roche) at 37 ° C. Or Papain (10 unit / ml, Sigma), DL-Cystein (400 ng / ml, Sigma) and DNase I (0.01-1 mg / ml, Roche) prepared by mixing the enzyme solution within 1 hour. The cells were then dissociated to single cell level using a serum pipette and passed through a nylon mesh to obtain single cells.
  • the single cell suspension was centrifuged with Percoll (Sigma) concentration gradient to remove red blood cells and dead cells.
  • the final cells obtained were Neurobasal- containing 1% FBS, 1X B27 (using diluted 50X concentrate from Invitrogen), N2 supplement (Gibco), 50 ng / ml bFGF (R & D), 50 ng / ml EGF (R & D).
  • a (Gibco) culture medium or DMEM: F12 (Gibco) culture medium the cells were cultured in a cell culture vessel pretreated with Poly-L-Ornithine (Sigma) to obtain primary cultured neural stem cells.
  • Example 1-1 The neural stem cells obtained in Example 1-1 were fixed using 4% paraformaldehyde (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) or acetone / methanol fixative, and then 15% with PBS containing 0.05% Triton X-100 (Sigma). Permiablization was performed for 5 minutes and the tissue was blocked for 1 hour at room temperature with 5% normal horse serum / 1% normal goat serum (Vector lab.).
  • Nesin neural stem cells
  • Sox1, Sox2 glial cells
  • GFAP astrosites
  • DCX neurons
  • Ki-67 dividing cell specific markers
  • Example 1-1 Adult neural stem cells obtained in Example 1-1 were cultured by an attachment culture method, and then the characteristics of neural stem cells were analyzed using a Human Neural Lineage Analysis Kit (Catalog number: 561526) provided by BD Biosciences. The experiment was performed according to the standard experimental method provided by the company.
  • the cultured cells were washed once with PBS, dissociated into single cells by accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.) treatment, centrifuged to obtain cells, and then in FACS buffer containing 2% of FBS.
  • accutase Innovative Cell Technologies, Inc.
  • BD Cytofix fixation buffer (Catalog number: 554655) and BD Phos flow perm buffer III (Catalog number: 558050) followed by CD44-FITC (Catalog number: 555478), Ki67-AlexaFluor 488 (Catalog number: 561165), Doublecortin-PE (Catalog number: 561505), Sox1-PerCP-Cy5.5 (Catalog number: 561549), Sox2-PerCP-Cy5.5 (Catalog number: 561506), GFAP AlexaFluor (Catalog number: 561470), Nestin-AlexaFluor (Catalog number: 561126) Antibodies were combined and treated.
  • nestin and glial cell-specific marker protein CD44 which are known as specific marker proteins of neural stem cells, were expressed, and other neural stem cell-specific markers Sox1 and Sox2 were expressed at about 2 to 50%.
  • astrosite specific marker protein GFAP and neuron specific marker protein DCX are expressed at a relatively low level (FIG. 1A).
  • Example 1-1 Human adult neural stem cells obtained in Example 1-1 were suspended in Neurobasal-A (Gibco) culture medium containing B27 supplement (Gibco), N2 supplement (Gibco) or DMEM: F12 (Gibco) culture medium, and then Poly- Cell culture vessels pre-treated with L-Ornithine (Sigma) were tested to see if cells cultured in a medium containing FBS and growth factors (existing medium) were also adaptable to the development medium according to the present invention.
  • Neurobasal-A (Gibco) culture medium containing B27 supplement (Gibco), N2 supplement (Gibco) or DMEM: F12 (Gibco) culture medium and then Poly- Cell culture vessels pre-treated with L-Ornithine (Sigma) were tested to see if cells cultured in a medium containing FBS and growth factors (existing medium) were also adaptable to the development medium according to the present invention.
  • Example 1-1 After culturing the human adult neural stem cells obtained in Example 1-1 in a conventional culture medium, and washed the cultured cells once with PBS and then treated with accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.) single cells After dissociation, cells were harvested by centrifugation. The culture was carried out by dividing it into a conventional medium containing 1% FBS and a growth factor and a developed medium containing 10% of knockout hemostatic agent (see FIG. 2A).
  • Example 3 Culture of Human Adult Neural Stem Cells in Medium Containing Various Concentrations of Knockout Serum Substitutes
  • Example 3-2 Characterization of human adult neural stem cells cultured in a culture medium containing a knockout serum substitute
  • Immunostaining was performed on each of the neural stem cells cultured in the culture medium according to the present invention containing knockout serum substitutes by concentration. Specifically, the neural stem cells obtained in Example 3-1 were fixed using 4% paraformaldehyde (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) or acetone / methanol fixative, and then contained 0.05% Triton X-100 (Sigma). Permiablization was performed for 15 minutes with PBS and the tissue was blocked for 1 hour at room temperature with 5% normal horse serum / 1% normal goat serum (Vector lab.).
  • Nesin neural stem cells
  • GFAP astrosite
  • O4 oligodendrosite
  • Tuj-1 neuron specific marker proteins
  • Neural stem cells were characterized using a Human Neural Lineage Analysis Kit (Catalog number: 561526) provided by BD Biosciences. The experiment was performed according to the standard experimental method provided by the company.
  • Example 3-1 the adult neural stem cells obtained in Example 3-1 were washed once with PBS, treated with accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.), dissociated into single cells, and centrifuged to obtain cells.
  • the obtained cells were suspended in FACS buffer containing 2% FBS.
  • FACS buffer containing 2% FBS.
  • Tuj1 Millipore, Catalog number: MAB1637
  • Tuj1 which is known as a lower neuronal cell-specific marker protein
  • stem cells can be cultured without using a heterologous protein such as fetal bovine serum or expensive growth factors (bFGF, EFG). Cell therapy using stem cells is also possible.
  • a heterologous protein such as fetal bovine serum or expensive growth factors (bFGF, EFG).

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Description

줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법
본 발명은 줄기세포 배양을 위한 배지에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 녹아웃 혈청 대체제 (knock-out serum replacement; KoSR)를 함유하는 줄기세포 배양을 위한 배지 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 치료에 필요한 줄기세포를 이종 단백질에 의한 오염 위험 없이, 저비용으로도 고순도의 줄기세포를 획득할 수 있으므로 줄기세포를 이용한 세포치료에 유용하다.
21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.
이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.
특히, 신경 줄기세포는 자기복제능력 및 중추신경계를 구성하는 신경세포(neurons), 성상세포(astrocyte), 핍지세포(oligodendrocyte)으로 분화하는 다분화능력을 가지고 있어, 이러한 신경줄기세포를 이용한 줄기세포의 증식과 분화기전 및 신경계 발달에 관한 기초연구뿐만 아니라, 한번 손상되면 재생되지 않는다고 알려져 있는 신경계질환에서 신경줄기세포의 생물학적 특성을 이용하여 새로운 세포 및 유전자 치료의 가능성에 대한 관심이 증대하고 있다. 또한, 인간 성체 뇌조직 배양을 통한 자가유래 성체 신경줄기세포 확립 방법은 배아줄기세포 혹은 태아 뇌조직을 사용하는 여타의 방법에 비해 윤리적인 문제로부터 자유로울 수 있으며, 환자 맞춤형 세포치료를 가능하게 하여 기존 세포치료의 한계를 극복하는 대안이 될 수 있을 것이다.
이러한 장점을 활용하기 위해 여러 연구자들이 세포의 배양을 시도하고 있지만 인간 성체 신경줄기세포는 기내배양 자체가 어렵고, 또 그 증식능력 또한 제한 되어있어 연구의 답보가 거듭되고 있는 실정이다. 이러한 줄기세포들은 그 배양에 있어서, 특정한 세포적 미세환경(microenvironment) 또는 적소(niche)를 필요로 한다는 것이 줄기세포 생물학의 정설이다. 신경 줄기세포를 선택적으로 배양하는 배양기술도 뉴로스페어(neurosphere) 형성법, 저밀도 배양법, 고밀도 배양법 등이 보고된 바 있으며, 그 외 배아줄기세포 유래, 태아 뇌조직 유래, 인간 성인 뇌조직 유래 성체신경줄기세포에서 성장인자를 첨가하여 배양하는 배양법이 알려져 있다. 저농도의 FBS를 이용한 인간 성체신경줄기세포의 배양법에 관한 발명은 본 연구진이 특허출원한 바 있다(대한민국 출원 제2010-0010116호, 제2010-0010117호). 그러나 현재까지 고가의 성장인자와 소 태아 혈청(Fetal bovine serum)을 사용하지 않으면서 인간 성체 신경줄기세포를 배양할 수 있는 배지 또는 배양법에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 연구진은 2건의 국내 특허 (출원번호 제2010-0010116호, 출원번호 제2010-0010117호) 및 1건의 국제 특허 (PCT/KR2011/000730)에서 성체 신경줄기세포의 일차배양 기법 및 대량 배양 기법을 확립한바 있다. 본 발명자들은 이 기술을 기반으로 고가의 성장인자(Growth factor)를 사용하지 않으면서 이종간 단백질의 오염을 피할 수 있어 임상적용이 가능한 세포 배양 배지를 탐색하였다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포를 녹아웃 혈청 대체제 (knock-out serum replacement; KoSR)가 도입된 배지에서 배양한 결과, KoSR이 혈청의 대체물질로서 이용 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 이종 단백질에 노출됨 없이 저비용으로도 고순도의 줄기세포를 획득할 수 있는 줄기세포 배양배지를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배양배지를 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는데 있다.
도 1의 A는 인간 측두엽 뇌조직 유래의 성체 신경줄기세포의 일차배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포를 대상으로 신경줄기세포- (Nestin, Sox1, Sox2), 교세포- (CD44), 아스트로사이트- (GFAP), 뉴런- (Boublecortin;DCX) 특이적 마커의 발현을 유세포분석기 (FACS)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1의 B는 인간 측두엽 뇌조직 유래의 성체 신경줄기세포 특이적 마커 단백질(Nestin, Sox2, CD133, Hes3)의 발현을 면역세포화학법 (immunocytochemistry)을 통하여 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A는 녹아웃 혈청대체제(KoSR)를 이용한 인간 측두엽 뇌조직 유래의 성체 신경줄기세포 배양 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2의 B는 FBS (fetal bovine serum) 및 성장인자를 함유하는 신경줄기세포 배양 배지(a)와 녹아웃 혈청 대체제(KoSR)를 함유하는 본 발명에 따른 배양배지(b) 각각에서 배양된 인간 성체 신경줄기세포의 사진을 나타낸 것이다.
도 3의 A는 녹아웃 혈청대체제를 농도별 (1%, 10%, 20%)로 함유하는 본 발명에 따른 배지에서 배양된 세포(#1)를 대상으로 신경줄기세포 (Nestin), 아스트로사이트 (GFAP), 올리고덴드로사이트 (O4), 뉴런 (Tuj-1) 특이적 마커 단백질의 발현양상을 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 수행한 결과이다. 대조군으로는 녹아웃 혈청 대체제(KoSR)는 포함하지 않으며, 0.5%의 FBS를 포함하는 배지를 사용하였다.
도 3의 B는 도3의 A의 세포(＃1)에 대하여 뉴런 특이적 마커인 Tuj-1의 발현 유무를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 C는 도 3의 B의 FACS 분석 데이터를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4의 A는 녹아웃 혈청대체제(KoSR)를 농도별 (0%: control, 1%, 10%, 20%)로 함유하는 본 발명에 따른 배지에서 배양된 세포(＃2)를 대상으로 신경줄기세포 (Nestin), 아스트로사이트 (GFAP), 올리고덴드로사이트 (O4), 뉴런 (Tuj-1) 특이적 마커 단백질의 발현양상을 면역세포화학법 (immunocytochemistry)을 수행한 결과이다.
도 4의 B는 도 4의 A의 세포(＃2)에 대하여 뉴런 특이적 마커인 Tuj-1의 발현 유무를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의C는 도 4의B의 FACS 분석 데이터를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명은 일 관점에서, 기본 배지 및 녹아웃 혈청 대체제 (knock-out serum replacement; KoSR)를 함유하는 줄기세포 배양배지에 관한 것이다.
본 발명에서 “녹아웃 혈청 대체제를 함유하는 배양배지”는 기본 배지(basal medium)에서 “녹아웃 혈청 대체제(knock-out serum replacement; KoSR)”가 추가로 포함된 배양배지를 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 배양배지는, 종래의 줄기세포 등의 배양에 사용되던 소 태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), bFGF, EGF와 같은 성장인자를 포함하지 않는다.
현재까지도 세포 및 조직배양에서 많이 사용되고 있는 소태아혈청 (fetal bovine seurm)은 호르몬 (hormone), 성장인자 (growth factor), 비타민 (vitamine) 이외에도 다수의 어떤 잘 알려지지 않은 인자를 포함한 복잡한 배지(첨가제)로 알려져 있으며, 수정란 이식 후 태아의 발육중 및 태어난 직후에 발생되는 송아지에서 나타나는 몇몇 비정상적인 현상들의 원인일 수 있다는 보고가 있다 (참조: 소태아혈청과 이의 대체물질인 BSA, PVA가 복제수정란의 발달에 미치는 영향, 이상기 등). 그러므로 인간의 성체 또는 배아 줄기세포를 배양함에 있어서 FBS를 함유하는 배지를 사용하는 경우, 이종 단백질에 줄기세포가 노출되는바 그러한 배지에서 배양된 줄기세포를 임상적으로 적용하는데 있어서는 안정성이 문제된다. 또한, 사용되는 배지 성분에 따라 줄기세포의 분화, 발현 등이 달려질 수 있음을 고려할 때 추후 보완적 차원에서 아직 규명되지 않은 인자들을 다수 포함하고 있는 FBS를 배양배지 성분으로 사용하는 것은 바람직하지 않다. 또한, EGF, bFGF와 같은 성장인자들은 고가이므로 비용적 측면에서 줄기세포를 대량 배양함에 어려움이 있다.
본 발명에 의한 배양배지는 FBS, 성장인자 (EGF, bFGF 등)를 함유하지 않으나 그 배양배지에서 배양된 인간 성체 줄기세포는 기존 배지에서의 배양 양상과 유사한 형태로 배양되므로 (도 2B 참조), 본 발명에 따른 배양배지는 기존에 사용되던 FBS와 고가/고농도의 성장인자를 함유하는 배양배지를 대체할 수 있다.
본 발명에서, 녹아웃 혈청 대체제 (KoSR)는 아미노산 (글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린), 비타민/항산화제 (티아민, 환원형 글루타치온 (reduced-glutathione), 아스코르브산 2-PO4), 미량원소 (Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, F-, Mn2+, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+, Zr4+), 단백질 (트랜스페린(iron-saturated), 인슐린, 지방과립 알부민 (AlbuMAX))을 포함할 수 있다 (Albumin-associated lipids regulate human embryonic stem cell self-renewal, Francesc R. etc., PLoS ONE 3(1): e1384). 본 발명에서는 Invitrogen사의 제품을 사용하였다 (Catalog number: 10828-028). 상기 녹아웃 혈청 대체제는 본 발명에 따른 배지에 1~20 %의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명에서, “기본 배지(basal medium)”는 줄기세포 배양에 사용되는 기본 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지, 예를 들면 DMEM, MEM, K-SFM 배지 등을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 무혈청 배지를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 DMEM:F12 media, B27 supplement 및 항생제를 혼합한 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 항생제로 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen)을 사용하였지만 이에 제한되지 않으며 통상 대체 가능한 항생제라면 제한없이 사용가능하다.
또한, 상기 기본 배지는 당 업계에 공지된, 인간 신경줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제가 보충될 수 있다. 또한, 배지는 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다. 또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen사 판매 제품(Cat ＃ 0010057AE) 등을 포함할 수도 있다.
본 발명에서 “줄기세포(stem cell)”란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 구분할 수 있는데, 본 발명에서는 생물학적, 윤리적, 그리고 법적인 문제가 많아 임상적용에 제한이 많은 배아 줄기세포가 아닌, 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 “성체 줄기세포 (adult stem cell)”는 성장한 신체조직으로부터 추출해낸 줄기세포로서, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 인체에 내재된 조직 특이적 전구세포로 분화할 수 있다. 성체 줄기세포는 분화하여 다양한 특성을 가지는 세포가 될 수 있고, 심장, 췌장, 신경 조직, 근육, 연골 등과 같은 광범위하게 위치한 조직 및 기관에 대한 대체 세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다. 인간의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 각 조직에 적절한, 당업계에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수득한 특정 조직을, 트립신 용액 및/또는 콜라게나아제 등을 처리하여 단일 세포체로 분리한 후, bFGF, EGF등의 성장인자 (growth factor)를 적합한 양으로 첨가한 적합한 배지에서 배양한 다음, FACS 등으로 분리하거나 성장속도에 따라 성체 줄기세포를 분리하는 방법 등을 사용할 수 있다. 좋기로는 성체 신경줄기세포 (Neural stem cells) 또는 신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells; NCSCs)를 사용할 수 있다.
“신경줄기세포 (Neural stem cells)”는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능 (potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는 50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 다분화능 (multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다. 신경줄기세포는 중추신경계 (Central nervous system: CNS)와 말초신경계 (peripheral nervous system: PNS)의 조직을 일차 배양하여 확보할 수 있으며, 이 세포는 특정 분화 조건에서 glial lineage와 neural lineage 등으로 분화하게 된다(Sally Temple et al. 2001). “신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells; NCSCs)”는 초기 배 발생 과정 중 한시적으로 나타나는 줄기세포로서, 마찬가지로 다분화능 줄기세포이다.
다양한 출처로부터 신경줄기세포를 수득하는 것이 가능하다. 예를 들어 인간 성체 뇌조직으로부터 수득할 수 있는데, 상기 뇌는 대뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 연수, 뇌교 및 척수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 대뇌로부터 유래한 것, 구체적 예로는 측두엽 조직 또는 해마 조직일 수 있다. 인간의 신경줄기세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 바람직하게는 인간 성체의 뇌조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할 수 있다(실시예 1 참조).
본 발명의 일 실시예에서는, 간질 환자의 외과적 수술을 통해 확보한 측두엽 (temporal lobe) 조직으로부터 일차 배양을 통하여 세포를 확립하였다. 그러나, 해마 조직으로부터 세포를 수득하여 사용할 수도 있음은 당업자에게 자명하다.
또한, 본 발명은 자발적 분화능이 감소된 인간 성체 줄기세포를 제공한다. 본 발명에 의한 배양배지에서 배양된 신경 줄기세포는 자발적 분화가 감소되는바, 본 발명에 따른 배양배지에 의하면 고순도의 인간 성체 신경줄기세포를 얻을 수 있다 (도 3, 도 4 참조). 따라서, 본 발명은 자발적 분화능이 감소된 줄기세포, 바람직하게는 성체 신경줄기세포를 제공한다. 대부분의 신경줄기세포는 그 유래조직 또는 세포의 종류에 관계없이 기내배양을 장기간 지속하게 되는 경우 자발적인 분화가 발생한다. 본 발명에서 자발적인 분화란 유도분화(Guided differentiation)와 구별되는 개념으로 외부에서 분화 유도 가능 물질(Growth factor, hormone, chemical등)을 처리하여 인위적으로 분화를 유도하지 않은 상태에서도 일어나는 분화현상을 지칭하며, 본 발명에서 “고순도의 줄기세포”란 자발적 분화능이 낮은 줄기세포를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 본 발명에 따른 배지를 이용한 인간 유래 신경줄기세포의 배양만을 예시하였으나, 유래가 다른 성체 줄기세포를 배양하여도 동일한 효과가 있음은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예
실시예 1: 인간 성체 줄기세포의 획득
1-1: 인간 신경줄기세포의 분리 및 배양
간질 환자의 외과적 수술을 통해(삼성 서울병원 신경외과) 측두엽(temporal lobe) 조직을 수득하였다 (환자 1로부터 얻은 세포는 세포는 세포＃1, 환자 2로부터 얻은 세포는 세포＃2라고 하였다). 각 조직을 수술 후 3 시간 이내에 PBS로 수세한 후 수술용 가위 또는 면도칼 등을 사용해 기계적으로 분쇄하고, 37 ℃ 하에서 Collagenase(0.4 mg/ml, Gibco) 와 DNaseI(0.01-1 mg/ml, Roche) 또는 Papain(10 unit/ml, Sigma), D-L-Cystein(400 ng/ml, Sigma)과 DNaseI(0.01-1 mg/ml, Roche)를 혼합하여 제조한 효소액에 1 시간 이내로 처리하였다. 이후 혈청 피펫을 사용해 단세포 수준으로 해리시킨 후 나일론 메쉬(nylon mesh)를 통과시켜 단일 세포들을 확보하였다.
상기 단일 세포현탁액을 퍼콜 (Percoll, Sigma) 농도 구배 원심분리하여 적혈구 및 죽은 세포들을 제거하였다. 최종 수득한 세포들을 1% FBS, 1X B27 (Invitrogen사의 50X 농축액을 희석하여 사용), N2 supplement(Gibco), 50 ng/ml bFGF(R&D), 50 ng/ml EGF(R＆D)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후, Poly-L-Ornithine(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여, 일차 배양된 신경줄기세포를 수득하였다.
1-2 : 인간 신경줄기세포의 특성 분석
< 면역염색화학법 >
실시예 1-1에서 수득한 신경줄기세포를 4% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) 또는 아세톤/메탄올 고정액을 사용하여 고정시킨 후, 0.05% Triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 15 분간 permiablization을 진행하고 5% normal horse serum/1% normal goat serum(Vector lab.)으로 상온에서 1 시간 동안 조직을 blocking하였다.
이후, 0.01% triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 anti-CD133(Abcam), anti-nestin(Abcam or Millipore), anti-Sox2(R＆D), anti-Hes3(Santa Cruz), anti-GFAP(Sigma or Abcam), anti-Olig2(Millipore), anti-O4(Chemicon), anti-Tuj-I(Millipore) 각각의 항체를 조합하여 처리한 후 4℃에서 overnight로 반응을 시켰다.
그리고, 0.01% triton X-100을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 상온에서 1시간 동안 처리한 1차 항체에 대응되는 anti-mouse-488(BD), anti-mouse-594(BD), anti-rabbit-488(BD), anti-rabbit-594(BD), anti-rat-488(BD), anti-rat-594(BD) 2차 항체를 처리한 후 마지막으로 DAPI(Sigma)를 사용하여 핵 염색을 시행하였고, 최종 형광 발현은 형광현미경(Axiovert, Zeiss)하에서 검증하였다.
그 결과, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, Sox2, CD133, Hes3의 발현을 확인할 수 있었다 (도 1B).
<표면 항원 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis)>
신경줄기세포 (Nestin, Sox1, Sox2), 교세포 (CD44), 아스트로사이트 (GFAP), 뉴런 (DCX) 및 분열세포 특이적 마커 (Ki-67)의 발현을 FACS 분석을 통해 검증하였다.
실시예 1-1에서 수득한 성체 신경줄기세포를 부착배양법을 통해 배양한 다음, BD Biosciences사에서 제공하는 Human Neural Lineage Analysis Kit (Catalog number: 561526)를 사용하여 신경 줄기세포의 특성을 분석하였다. 실험은 회사에서 제공되는 표준 실험 방법에 따라 수행하였다.
구체적으로, 배양된 세포를 PBS 로 1회 수세한 후 accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.) 처리를 통해 단일세포로 해리시킨 후 원심분리를 수행해 세포를 획득한 후 FBS를 2% 함유하는 FACS buffer에 현탁시킨 후, BD Cytofix fixation buffer(Catalog number: 554655) 및 BD Phos flow perm bufferIII(Catalog number: 558050)를 처리 후 CD44-FITC(Catalog number:555478), Ki67-AlexaFluor 488(Catalog number: 561165), Doublecortin-PE(Catalog number: 561505), Sox1-PerCP-Cy5.5(Catalog number: 561549), Sox2-PerCP-Cy5.5(Catalog number: 561506), GFAP AlexaFluor(Catalog number: 561470), Nestin-AlexaFluor(Catalog number: 561126) 항체를 조합하여 처리하였다.
FACS buffer로 1회 수세한 후 유세포 분석기를 이용하여 세포특성을 분석하였다 (BD FACSCalibur).
그 결과, 신경줄기세포의 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin 및 교세포 특이적 마커 단백질인 CD44가 99% 발현됨을 확인하였고, 다른 신경줄기세포 특이적 마커인 Sox1 및 Sox2도 2~50% 정도로 발현됨을 확인할 수 있었다. 한편, 아스트로사이트 특이적 마커 단백질인 GFAP 및 뉴런 특이적 마커 단백질인 DCX는 비교적 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다 (도 1의 A).
실시예 2: 녹아웃 혈청 대체제를 함유하는 배지에서의 배양
실시예 1-1에서 수득한 인간 성체 신경줄기세포를, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후, Poly-L-Ornithine(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 FBS 및 성장인자를 함유하는 배지(기존 배지)에서 배양된 세포가 본 발명에 따른 개발 배지에도 적응 가능한지를 시험해보았다.
구체적으로, 실시예 1-1에서 수득한 인간 성체 신경줄기세포를 기존 배양배지에서 배양한 후, 상기 배양된 세포를 PBS 로 1회 수세한 후 accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.)를 처리하여 단일세포로 해리시킨 후 원심분리를 수행하여 세포를 획득하였다. 이를 1% FBS 및 성장인자를 함유하는 기존 배지와 녹아웃 혈철 대체제를 10% 함유한 개발된 배지에 나누어 배양을 수행하였다 (도 2의 A 참조).
그 결과, 성장인자와 FBS를 함유하지 않는 본 발명에 따른 배양배지에서 인간 성체 줄기세포를 배양하더라도 기존 배지 (도 2B의 왼쪽 사진)에서의 배양 양상과 유사한 형태로 배양되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2B의 오른쪽 사진). 이로부터, 기존 배지에서 배양된 세포가 본 발명에 따른 배지에서도 유사한 형태로 계속 배양될 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 혈청대체제(KoSR)를 함유하는 배지를 사용하면, 고가의 성장인자와 이종 단백질인 소태아혈청을 함유하지 않아도 인간 성체 줄기세포를 효과적으로 배양할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 다양한 농도의 녹아웃 혈청 대체제를 함유하는 배지에서의 인간 성체 신경줄기세포의 배양
실시예 3-1: 녹아웃 혈청 대체제를 농도별로 처리한 배양배지에서의 인간 성체 신경줄기세포의 배양
녹아웃 혈청 대체제를 농도별 (1%, 10%, 20%)로 B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후, 실시예 1-1에서 획득한 성체 신경줄기세포(＃1와 ＃2)를 각각 배양하여 배양된 신경줄기세포를 수득하였다. 대조군은 0.5%의 FBS를 포함하는 배지(KoSR은 포함하지 않음)를 사용하였다.
실시예 3-2: 녹아웃 혈청 대체제 함유 배양배지에서 배양된 인간 성체 신경줄기세포의 특성
< 면역염색화학법 >
녹아웃 혈청 대체제를 농도별로 함유하는 본 발명에 따른 배양배지에서 배양된 신경줄기세포 각각에 대하여 면역염색화학법을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 3-1에서 수득한 신경줄기세포를 4% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) 또는 아세톤/메탄올 고정액을 사용하여 고정시킨 후, 0.05% Triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 15 분간 permiablization을 진행하고 5% normal horse serum/1% normal goat serum(Vector lab.)으로 상온에서 1 시간 동안 조직을 blocking하였다.
이후, 0.01% triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 anti-nestin(Abcam or Millipore), anti-GFAP(Sigma or Abcam), anti-O4(Chemicon), anti-Tuj-I(Millipore) 각각의 항체를 조합하여 처리한 후 4℃에서 overnight로 반응을 시켰다.
그리고, 0.01% triton X-100을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 상온에서 1시간 동안 처리한 1차 항체에 대응되는 anti-mouse-488(BD), anti-mouse-594(BD), anti-rabbit-488(BD), anti-rabbit-594(BD), anti-rat-488(BD), anti-rat-594(BD) 2차 항체를 처리한 후 마지막으로 DAPI(Sigma)를 사용하여 핵 염색을 시행하였고, 최종 형광 발현은 형광현미경(Axiovert, Zeiss)하에서 검증하였다.
그 결과, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin이 강하게 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 3의 A, 도 4의 A).
<표면 항원 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis)>
신경 줄기세포 (Nestin), 아스트로사이트 (GFAP), 올리고덴드로사이트 (O4) 및 뉴런 (Tuj-1) 특이적 마커 단백질의 발현 유무를 FACS 분석을 통해 검증하였다.
BD Biosciences사에서 제공하는 Human Neural Lineage Analysis Kit (Catalog number: 561526)를 사용하여 신경 줄기세포의 특성을 분석하였다. 실험은 회사에서 제공되는 표준 실험 방법에 따라 수행하였다.
구체적으로, 실시예 3-1에서 수득한 성체 신경줄기세포를 PBS로 1회 수세한 후 accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.)를 처리하여 단일세포로 해리 시킨 후 원심분리를 수행하여 세포를 획득하였다. 획득한 세포를 2%의 FBS를 함유하는 FACS buffer에 현탁시켰다. 그리고 BD Cytofix fixation buffer(Catalog number: 554655) 및 BD Phos flow perm bufferIII(Catalog number: 558050)를 처리한 후 Tuj1 (Millipore, Catalog number: MAB1637)에 PerCP-Cy5.5 형광물질을 결합시킨 항체를 처리하였다. 이후, FACS buffer를 이용해 1회 수세한 후 유세포 분석기를 이용해 분석하였다 (BD FACSCalibur).
그 결과, 하위 신경세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Tuj1의 발현이 혈청대체제를 사용한 실험군에서는 낮게 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 3B, 도 4B).
이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따르면, 이종 단백질인 소태아혈청 (fetal bovine serum)이나 고가의 성장인자 (bFGF, EFG)를 사용하지 않아도 고순도의 줄기세포를 배양할 수 있어, 이종 단백질 사용에 의한 오염 위험 없이 저비용으로도 줄기세포를 이용한 세포치료가 가능하다.

Claims (10)

  1. 기본 배지 및 녹아웃 혈청 대체제(knock-out serum replacement; KoSR)를 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기본 배지는 DMEM:F21, B27 supplement 및 항생제로 구성되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양배지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 녹아웃 혈청 대체제(KoSR)는 줄기세포 배양배지에 대하여 1~20%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양배지.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양배지.
  5. 제4항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 성체 뇌 조직 유래인 신경줄기세포(neural stem cells) 또는 신경능선줄기세포 (neural crest stem cells)인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양배지.
  6. 제5항에 있어서, 상기 뇌 조직은 측두엽 조직 또는 해마 조직인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양배지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 자발적 분화능이 감소된 줄기세포의 배양방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 자발적 분화능이 감소된 줄기세포의 배양방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 성체 뇌 조직 유래인 신경줄기세포(neural stem cells) 또는 신경능선줄기세포 (neural crest stem cells)인 것을 특징으로 하는 자발적 분화능이 감소된 줄기세포의 배양방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 뇌 조직은 측두엽 조직 또는 해마 조직인 것을 특징으로 하는 자발적 분화능이 감소된 줄기세포의 배양방법.
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